UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL Influencia del transportador de nitrato NRT1.4/NPF6.2 en la nutrición de potasio en Arabidopsis thaliana MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Laura Morales de los Ríos Martín Directores José Luis Pardo Prieto Francisco Javier Quintero Toscano Madrid © Laura Morales de los Ríos Martín, 2022 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL Influencia del transportador de nitrato NRT1.4/NPF6.2 en la nutrición de potasio en Arabidopsis thaliana MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Laura Morales de los Ríos Martín DIRECTORES José Manuel Pardo Prieto y Francisco Javier Quintero Toscano Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis Consejo Superior de Investigaciones Científicas – Universidad de Sevilla Sevilla, 2021 El presente trabajo se ha realizado en el Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (IBVF), centro mixto del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y la Universidad de Sevilla (US) en el marco de los Proyectos BFU2015-64671-R y RTI2018- 094027-B-100 financiados por la Agencia Estatal de Investigación, dentro del Programa Nacional de Formación de Personal Investigador (BES-2016-077996). Agradecimientos Estas son las últimas páginas que escribo de esta Tesis. Hace cinco años no habría podido imaginar la emoción que hoy me llena al hacerlo, y me reafirmo en la idea de que este trabajo es el fruto de toda la ayuda que he recibido. Seguro que me dejo a alguien, ¡lo siento! En primer lugar, gracias a mis Directores por darme la oportunidad de “jugar” con este rompecabezas. A José Manuel por poner toda su experiencia a mi disposición, por motivar mi curiosidad y por enseñarme el valor y la satisfacción de las cosas bien hechas. A Javier, por remangarse y trabajar a mi lado desde que llegué al laboratorio. Mucho de lo que he aprendido ha sido gracias a tu paciencia, te admiro enormemente. Gracias a Imelda, por tu cariño y ofrecerme tu ayuda sobre todo en esta última etapa de la tesis. A Eduardo, porque si no hubieses empezado el puzle de L14 yo no hubiese escrito esta Tesis, ¡muchas gracias! A Anna Lindahl, por preocuparte por mí con afecto infinito y tener tu despacho siempre abierto. A Raúl, por ser un libro abierto y acompañarme en mi batalla con las construcciones. A Javi (rockero y científico a partes iguales) por acoger a esta madrileña en tu caseta y en tu vida. Tu taza me ha acompañado durante todas las horas de escritura. Gracias infinitas a Anna y a Natalia, por ser SIEMPRE abrazo sincero, café caliente y sabio consejo. Me alegráis la existencia, os quiero amigas. Un immense merci à Dr. Alexis de Angeli, Dr. Benoît Lacombe et Dra. Claire Corratgé- Faillie. Votre aide pendant mon stage dans le B&PMP m’a été précieuse. J’ai pu résoudre cette casse-tête grâce à vous, MERCI BEAUCOUP!! Justyna, Fillippo, Roxanne: the time I spent in Montpellier was amazing, thank you so much!! Paloma, amiga, gracias infinitas por confiar en mí cuando yo misma no lo hacía. Eres pura alegría, te quiero. Si escogí este camino fue porque tuve grandes MAESTROS. Dos personas cuyo amor por la ciencia y la verdad me cautivó y se ganaron a pulso ser mis referentes. Carlos Vicente Córdoba, cuya inteligencia es tan grande como su humildad. Espero que estés orgulloso allá donde estés. María Estrella Legaz, tu vitalidad y fortaleza todavía me guía. Gracias por abrirme las puertas del Lichen Cane Team y darme la oportunidad de aprender de Blanca, Roberto, Mara, Borja y Eva. Todavía recuerdo cuando encontré allí a Elena. Esporita, sabes que tú también tienes la culpa de este amor mío por la ciencia. Clara, Roberto ¡qué bonito que sigamos en este camino de la mano! Está claro que en la ciencia, como en la vida, sola no llegas demasiado lejos. Gracias a Inma, por dejarlo todo para echarme una mano y nunca decir no a una cerveza. A mi Isa, por ser tremendamente noble y buena. Vuestra ayuda merece un millón de líneas. A Fernando, siempre conjuntado y adalid de la sevillanía, me encandila tu espíritu y tu inteligencia. A Pedro, con sus Rayban, porque las fatigas de la Tesis han sido menos fatigas con tu cachondeo GRACIAS. A Lucía, en Suiza pero cerca, por preocuparse siempre por mí. A Gloria porque es divina. A Belén y Tommy, porque me trataron con mucho cariño cuando aterricé en el IBVF. A José Mari, Fran, Miguel, Raquel y Toñi por alegrarme los desayunos. A Tere por tener siempre sonrisas para mí. A Irene por escuchar atenta mis preguntas. A Agradecimientos Pablo por buscarme las Nicotianas más bonitas. A Nuria, ¿cómo me la maravillaría yo sin tu ayuda en la cocina? A Alicia y José Enrique, por su paciencia conmigo y su entusiasmo a la hora de echarme un cable. Becarios, sin vosotros no lo habría conseguido, ya lo sabéis. Un millón de gracias a Ana, por el amor y el arte que pone a todo lo que hace y en especial a nuestra amistad. A Diego, porque me riñe cuando me dejo el tocino del jamón, pero siempre acude con una cerveza, un protocolo científico-técnico o un abrazo inmenso entre las manos. A Mari, porque es poderío y dulzura a partes iguales, porque su despensa de chocolate y su cariño sacan del pozo a cualquiera. A Manuel, por su inteligencia y su sensibilidad, ¿cómo es posible que lo sepas todo? Me siento muy afortunada de teneros en mi vida. Y a los consortes también. Un día descubrí que había vida escaleras arriba del IBVF. Gracias a Myriam, la otra gata por las calles de Sevilla, por tu amor, tu humor y tu compañía en las buenas y no buenas. A Elena y Cristian, por las Cruzcampo, las risas y los abrazos. Gracias también a Paco, Lupe, Bea y Blanca. Me acogisteis como una más, dándome un lugar donde estar segura cuando más lo necesitaba. Gracias por el hueco que siempre tengo en vuestra mesa, os quiero mucho. Por supuesto gracias a mis amigas de toda la vida Adri, Casellas, Flores, Iciar, Ana, Sara e Irene por apoyarme en mis decisiones aunque supongan desviar mi camino. Gracias por quererme en mis luces y aguantarme en mis sombras SIEMPRE. Os echo tanto de menos en Sevilla…A Andrea, Luisa y la pequeña Carlota, por estar chaladas y tener su puerta berlinesa siempre abierta. Vuestra amistad es el premio gordo, Wiwis. ¡Por seguir sumando historias y celebrando nuestros logros toda la vida, os quiero muchísimo! A Raquel, por ese Erasmus a tu lado que cambió mi vida y te hizo mi hermana. Las Mahou siempre saben mejor contigo. A Javi, por diseñar la portada más bonita del mundo y ser magia. Gracias por acompañarme y cuidarme a cada paso, sin importar los kilómetros que nos separen. Sevilla y mis días cambian su luz cada vez que vuelves. Fran, mi amor. Gracias por tu mantra “Laura, si fuese fácil lo haría otro” cada vez que pensé en rendirme. Tu fuerza y tu apoyo me empuja a conseguir todo lo que me propongo. Gracias por soplarme las alas y cogerme fuerte la mano cuando tengo miedo. Eres mi hogar, te quiero. Por último, gracias a mi familia por ser incondicionales de todas mis causas, no sólo esta. Caminar por la cuerda floja es más fácil cuando vosotros estáis debajo sujetando la red. Mamá, gracias por tu fuerza y la pasión que pones en todo lo que haces. Por espantar mis desconfianzas y mis indecisiones, eres mi suerte. Papá, gracias por tu calma y tu constancia. Por cuidarme, ya sabes que tus desayunos y un crucigrama contigo son mi mejor terapia. Kike, mi espíritu libre, mi ojo derecho, mi persona favorita, te admiro. Y Mar, gracias por llenarlo todo de ternura desde que has llegado. Ojalá os sintáis tan orgullosos de mi como yo lo estoy de pertenecer a esta familia. A mis cuatro abuelos: Julián, Lolita, Manolo y Carmen. Porque su abrazo y su historia es mi mayor fortuna. Índice de contenidos Índice de contenidos Resumen/Abstract ..................................................................................................... 25 Introducción............................................................................................................... 33 El potasio como nutriente .............................................................................................. 35 Proteínas transportadoras de potasio ........................................................................... 36 Canales de potasio .................................................................................................... 36 Co-transportadores de potasio ................................................................................. 40 Principales sistemas absorción de potasio por las raíces ............................................... 45 Distribución de potasio en la planta .............................................................................. 46 Mecanismos de detección y señalización del hambre de potasio ................................. 48 Eventos y moléculas señalizadoras del hambre de potasio ...................................... 49 El KSN (o K+-Sensing Niche) ....................................................................................... 54 Mecanismos de regulación post-traduccional de la toma de potasio en raíces ............ 55 Capacidad de formación de heterómeros. ............................................................... 55 Modificaciones postranscripcionales ........................................................................ 56 El nitrato como nutriente y molécula señalizadora ....................................................... 59 Proteínas transportadoras de nitrato ............................................................................ 60 Familia NRT1/NPF ..................................................................................................... 61 Familia NRT2 ............................................................................................................. 64 Canales SLAC/SLAH ................................................................................................... 64 Canales y Transportadores CLC ................................................................................. 65 Distribución in planta de nitrato .................................................................................... 65 Entrada de nitrato a través de las raíces ................................................................... 65 Transporte acrópeto y basípeto raíz-tallo ................................................................. 66 Entrada de nitrato en las hojas ................................................................................. 67 Desarrollo de semillas ............................................................................................... 67 Vacuolas .................................................................................................................... 67 Mecanismos de señalización de nitrato ......................................................................... 68 Nodos de interacción nitrato-potasio ............................................................................ 70 Regulación por CBL1/9-CIPK23 ................................................................................. 71 Transporte coordinado de nitrato y potasio a la parte aérea ................................... 72 Acoplamiento del transporte de nitrato y potasio en células guarda ...................... 73 Índice de contenidos Objetivos ................................................................................................................... 75 Materiales y Métodos ................................................................................................ 79 1 Material biológico ................................................................................................ 81 1.1 Bacterias: cepas, medios y condiciones de cultivo ......................................... 81 1.2 Levaduras: cepas, medios y condiciones de cultivo ........................................ 83 1.3 Material vegetal .............................................................................................. 87 1.4 Ovocitos de Xenopus laevis ............................................................................. 91 2 Métodos ............................................................................................................... 93 2.1 Purificación y análisis del ADN ........................................................................ 93 2.2 Purificación y análisis del ARN ...................................................................... 100 2.3 Fosforilación in vitro de fragmentos de la proteína NRT1.4/NPF6.2 ............ 103 2.4 Manipulación de microorganismos ............................................................... 105 2.5 Análisis de la estructura radicular de A. thaliana ......................................... 109 2.6 Ensayo in vitro de bioluminiscencia .............................................................. 110 2.7 Análisis del contenido iónico de A. thaliana ................................................. 112 2.8 Análisis de hormonas en A. thaliana............................................................. 114 2.9 Two-Electrode Voltage Clamp (TEVC) ........................................................... 115 2.10 Acumulación 15N en ovocitos ................................................................... 118 2.11 Herramientas bioinformáticas ................................................................. 119 Resultados ............................................................................................................... 121 Capítulo 1: Obtención de mutantes afectados en la expresión del gen reportero HAK5:LUC. ........................................................................................................... 123 1.1 Procedimiento de obtención de mutantes, primeras generaciones ............ 123 1.2 Caracterización de líneas LOK (Loss of K+-response) ..................................... 127 1.3 Caracterización de la línea COK (Constitutive K+-response) .......................... 130 1.4 Secuenciación e identificación de mutaciones en L14. ................................. 131 1.5 Análisis de hormonas en las líneas L14 ......................................................... 136 1.6 Purgado de mutaciones en L14 ..................................................................... 138 Capítulo 2: Estudio de la mutación AKT1W135Z y de las mutaciones ligadas a ella en la línea L14 ....................................................................................................................... 139 2.1 AKT1 (AT2G26650) ........................................................................................ 140 2.2 VPS2.1 (AT2G06530) ..................................................................................... 144 2.3 PMT1 (AT2G16120) ....................................................................................... 144 Índice de contenidos 2.4 GGPPS4 (AT2G23800) ................................................................................... 145 2.5 FUC1 (AT2G28100) ........................................................................................ 145 2.6 GLR2.7 (AT2G29120) ..................................................................................... 146 2.7 PARP1 (AT2G31320)...................................................................................... 148 2.8 CDF4 (AT2G34140) ........................................................................................ 148 2.9 ERH1 (AT2G37940)........................................................................................ 150 Capítulo 3: Estudio de la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M ........................................ 153 3.1 Comprobación del fenotipo mutante para NRT1.4/NPF6.2 in planta .......... 155 3.2 Localización celular de NRT1.4/NPF6.2 ........................................................ 156 3.3 Expresión de NRT1.4WT y NRT1.4V210M en levaduras ..................................... 157 3.4 Ensayos de acumulación de 15N en ovocitos de Xenopus laevis ................... 162 3.5 Regulación post-traduccional de NRT1.4/NPF6.2 ......................................... 166 Capítulo 4: Implicación de NRT1.4/NPF6.2 y AKT1 en la distribución de nitrato y potasio en A. thaliana.......................................................................................... 170 4.1 Efecto de la pérdida de función de NRT1.4/NPF6.2 en la transcripción de HAK5 170 4.2 Efecto de las mutaciones en AKT1 y NRT1.4/NPF6.2 en la distribución total de potasio y nitrato ...................................................................................................... 171 Discusión ................................................................................................................. 177 Influencia del transportador NRT1.4/NPF6.2 en la señalización del hambre de potasio ........................................................................................................................... 180 NRT1.4/NPF6.2 no transporta potasio .................................................................... 182 NRT1.4/NPF6.2 podría transportar hormonas ........................................................ 182 NRT1.4/NPF6.2 podría comunicarse con canales y transportadores de potasio ... 184 El transportador NRT1.4/NPF6.2 podría actuar como un sensor de nitrato en la parte aérea................................................................................................................... 186 El residuo NRT1.4/NPF6.2V210 es clave para la cinética del transporte de nitrato de la proteína .............................................................................................................. 186 Posible función del residuo V210 ............................................................................ 187 Consecuencia de la mutación en la línea de Arabidopsis L14 ................................. 189 Aplicación en la agricultura de la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M ........................... 190 Conclusiones ............................................................................................................ 191 Índice de contenidos Anexos .................................................................................................................... 195 Anexo 1: Cebadores ...................................................................................................... 197 Anexo 2: Vectores......................................................................................................... 203 Anexo 3: Filogenia y alineamiento NRT1.1- NRT1.4 ..................................................... 205 Anexo 4: Abreviaturas .................................................................................................. 209 Bibliografía .............................................................................................................. 215 Índice de contenidos Índice de tablas Tabla I 1: Localización celular y función de los principales canales y transportadores de potasio presentes en A. thaliana. ........................................................................ 43 Tabla M 1: Cepas de E. coli utilizadas ................................................................................. 81 Tabla M 2: Cepas A. tumefaciens ........................................................................................ 81 Tabla M 3: Composición del medio LB modificado de bacteria .......................................... 82 Tabla M 4: Composición del medio YEP .............................................................................. 82 Tabla M 5: Cepas de S. cerevisiae ....................................................................................... 83 Tabla M 6: Cepas de H. polymorpha ................................................................................... 84 Tabla M 7: Composición del medio YPD de levadura ......................................................... 84 Tabla M 8: Composición del medio AP de levadura ........................................................... 85 Tabla M 9: Composición del stock de oligoelementos 1000X ............................................ 85 Tabla M 10: Composición del stock de vitaminas 100X ...................................................... 86 Tabla M 11: Composición del medio YNB de levadura ....................................................... 86 Tabla M 12: Composición del medio YGNH para H. polymorpha ....................................... 86 Tabla M 13: Composición del medio YG para H. polymorpha ............................................ 87 Tabla M 14: Líneas de A. thaliana utilizadas ....................................................................... 87 Tabla M 15: Composición del medio LAK en condiciones de nitrato controlado. .............. 88 Tabla M 16: Composición del medio LAK en condiciones de potasio controlado.. ............ 89 Tabla M 17: Composición tampón de activación ................................................................ 91 Tabla M 18: Composición del medio ND96 pH 7,4 ............................................................. 92 Tabla M 19: Composición de la solución I (GTE) ................................................................. 93 Tabla M 20: Composición de la solución II .......................................................................... 94 Tabla M 21: Composición de la solución IV ........................................................................ 94 Tabla M 22: Composición del tampón TE ........................................................................... 94 Tabla M 23: Composición del tampón de extracción ......................................................... 95 Tabla M 24: Mezcla de reacción para PCR del kit MyTaq™ DNA Polymerase .................... 96 Tabla M 25: Condiciones de reacción de amplificación con MyTaq™ DNA Polymerase ... 97 Tabla M 26: Mezcla de reacción para PCR del kit VELOCITY DNA Polymerase ................... 97 Tabla M 27: Condiciones de reacción de amplificación del kit VELOCITY DNA Polymerase ............................................................................................................................................. 97 Índice de contenidos Tabla M 28: Composición de los tampones de electroforesis de ADN ............................... 98 Tabla M 29: Mezcla de reacción para RT-qPCR ................................................................. 101 Tabla M 30: Reacción de amplificación de RT-qPCR ......................................................... 101 Tabla M 31: Mezcla de reacción para la síntesis de ARNc ................................................ 102 Tabla M 32: Composición del medio 2 x YTA .................................................................... 103 Tabla M 33: Composición del Tampón Laemmli 4X .......................................................... 104 Tabla M 34: Composición del gel de acrilamida ................................................................ 104 Tabla M 35: Composición del tampón de electroforesis .................................................. 104 Tabla M 36: Composición de la solución de tinción Coomassie ....................................... 105 Tabla M 37: Composición de decoloración ....................................................................... 105 Tabla M 38: Composición de la mezcla de transformación de S. cerevisiae ..................... 106 Tabla M 39: Composición del tampón TED ....................................................................... 107 Tabla M 40: Composición del tampón STM ...................................................................... 107 Tabla M 41: Composición del spray de luciferina 1 mM ................................................... 111 Tabla M 42: Configuración del programa Living Image® .................................................. 111 Tabla M 43: Composición de los medios Na100 y K100 ................................................... 118 Tabla 1. 1: Contenido de potasio en líneas LOK. ............................................................... 127 Tabla 1. 2: Mutaciones halladas en la línea L14-1 a lo largo del cromosoma 2.. .............. 132 Tabla 1. 3: Niveles hormonales en las plantas de las líneas HAK5:LUC y L14-1. ............... 138 file:///E:/7-TESIS/MAQUETACIÓN/Tesis%20Laura%20Morales%20de%20los%20Rios%20Martin%20(con%20documentos%20UCM%20insertos)%2020211216%20v8%20INDICE%20MANUAL.docx%23_Toc90596734 file:///E:/7-TESIS/MAQUETACIÓN/Tesis%20Laura%20Morales%20de%20los%20Rios%20Martin%20(con%20documentos%20UCM%20insertos)%2020211216%20v8%20INDICE%20MANUAL.docx%23_Toc90596736 Índice de contenidos Índice de figuras Figura I.1: Organización de las células radiculares y vías de absorción de sustancias a través de las raíces……………………………………………………………………………………………………...36 Figura I.2: Modelos topológicos de los principales canales de potasio de A. thaliana……...38 Figura I.3: Modelos topológicos de los principales transportadores de potasio de A. thaliana……………………………………………………………………………………………………………44 Figura I.4: Contribución de los diferentes canales y transportadores de potasio a la adquisición de potasio por las raíces de A. thaliana en función de la disponibilidad de potasio en el medio……………………………………………………………………………………..46 Figura I.5: Patrones de localización y función de los principales canales y transportadores de potasio en A. thaliana…………………………………………………………………………………..47 Figura I.6: Mecanismos de sensing de hambre de potasio…………………………………...............54 Figura I.7: Transición entre los estados dimérico y monomérico del transportador NRT1.1/NPF6.3 dependiente de la disponibilidad de nitrato de la fosforilación por CIPK23………………………………………………………………………………………………………………63 Figura I.8: Patrones de expresión de los principales canales y transportadores de nitrato en A. thaliana………………………………………………………………………………………………………..66 Figura I.9: Mecanismo de señalización Calcio-CPK-NLP implicado en la señalización de nitrato………………………………………………………………………………………………………………69 Figura I.10: Esquema de los principales transportadores y canales que median los flujos ionicos en la membrana plasmática de las células guarda…………………………………74 Figura M.1: Representación esquemática de los principales canales, transportadores y bombas de sodio y potasio de S. cerevisiae………………………………………………………83 Figura M.2: Esquema de la reacción de la luciferasa……………………………………………………..111 Figura M.3: Representación esquemática de la técnica TEVC en ovocitos………………….….116 Figura M.4: Protocolo de pulsos utilizado en las medidas de TEVC realizadas con ovocitos inyectados con el canal AKT1…………………………………………………………………….……117 Figura M.5: Protocolo de pulsos utilizado en las medidas de TEVC realizadas con ovocitos inyectados con el transportador NRT1.4/NPF6.2…………………………………………….117 Figura 1.1: Esquema de mutagénesis química con EMS para la obtención de líneas con respuesta alterada a potasio……………………………………………………………………….….124 Figura 1.2: Expresión del gen reportero HAK5:LUC en plántulas de las líneas HAK5:LUC, L14 y BC1F1……………………………………………………………………………………………………………126 Índice de contenidos Figura 1.3: Contenido de potasio en líneas LOK de A. thaliana……………………………………..128 Figura 1.4: Contenido depotasio Rb+ en líneas LOK de A. thaliana………………………………..129 Figura 1.5: Contenido de potasio en líneas COK de A. thaliana…………………………………….130 Figura 1.6: Frecuencia alélica de SNPs a lo largo del cromosoma 2 en la línea mutante L14 tomando como referencia la secuencia del ecotipo Col-0 (WT)………………………132 Figura 1.7: Modelo esquemático de la proteína AKT1……………………………………………………133 Figura 1.8: Contenido de K+ y Rb+ en líneas COK de A. thaliana……………………………………..134 Figura 1.9: Contenido de Rb+ en líneas L14……………………………………………………………………135 Figura 1.10: Expresión del gen endógeno HAK5 en las líneas HAK5:LUC, akt1-2 y L14…..136 Figura 1.11: Producción de etileno y contenido de potasio en las líneas HAK5:LUC, akt1-2, L14-2-1 y L14-2-3……………………………………………………………………………………………137 Figura 1.12: Expresión de HAK5:LUC en plántulas de la línea L14-1-6 desde la generación F1 a F7………………………………………………………………………………………………………………..139 Figura 2.1: Corrientes representativas de AKT1 y AKT1(W135Z) medidas por TEVC en ovocitos de X. laevis……………………………………………………………………………………….141 Figura 2.2: Modelo del tetrámero formado por canales AKT diseñado a partir de la cristalización del canal AKT de animales…………………………………………………………142 Figura 2.3: Caracterización de la interacción funcional de AKT1(WT) con AKT1(W135Z) en sistemas heterólogos……………………………………………………………………………………..143 Figura 2.4: Análisis de la mutación en GLR2.7 encontrada en la línea L14………………...….147 Figura 2.5: Tinción con yoduro de propidio (A) y lugol (B) de raíces de HAK5:LUC y L14…………………………………………………………………………………………………………………149 Figura 2.6: Alineamiento de parte del dominio PAP2, conservado en varios homólogos funcionales de la proteína AtERH1…………………………………………………………………150 Figura 2.7: Expresión de los genes HAK5 y PR1 en las líneas WT (HAK5:LUC) y L14……….151 Figura 3.1: Estructura esquemática de la proteína NRT1.4/NPF6.2……………………………….154 Figura 3.2: Contenido de nitrato en peciolo y lámina de las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt1.4- 2 y L14……………………………………………………………………………………………………………155 Índice de contenidos Figura 3.3: Localización subcelular de NRT1.4-GFP (A) y CBL1-OFP (B) en células de la epidermis foliar de N. benthamiana………………………………………………………….……156 Figura 3.4: Expresión de NRT1.4 y NRT1.4 (V210M) en la levadura H. polymorpha….….…158 Figura 3.5: Localización subcelular de NRT1.4-GFP y NRT1.4 (V210M)-GFP en S. cerevisiae……………………………………………………………………………………………………….159 Figura 3.6: Análisis de la capacidad de transporte de potasio de los transportadores NRT1.4/NPF6.2, NRT1.4V210M y NRT1.5/NPF7.3 mediante el crecimiento de S. cerevisiae (TTE9.3) ……………..……………………………………………………………..………….160 Figura 3.7: Análisis de la capacidad de transporte de potasio de los transportadores NRT1.4/NPF6.2, NRT1.4V210M y NRT1.5/NPF7.3 mediante el crecimiento de S. cerevisiae (AXT3K)………………………………………………………………………………………….161 Figura 3.8: Acumulación de 15N en ovocitos inyectados con agua (Control), NRT1.4/NPF6.2 o NRT1.4(V210M)…………………………………………………………………………………………..163 Figura 3.9: Acumulación de 15N en ovocitos inyectados con agua (Control), NRT1.4/NPF6.2 o NRT1.4(V210M) en presencia de distintos pH………………………………………………164 Figura 3.10: Acumulación de 15N en ovocitos inyectados con agua (Control), NRT1.4/NPF6.2 o NRT1.4(V210M) en presencia de distintas concentraciones de potasio………………………………………………………………………………………………………..…165 Figura 3.11: Representación tridimensional de la estructura del dominio poro de NRT1.4/NPF6.2……..……………………………………………………………………………………….167 Figura 3.12: CIPK23 fosforila NRT1.4/NPF6.2 en el residuo Thr98 in vitro……………….…….168 Figura 3.13: Acumulación de 15N en ovocitos inyectados con agua (Control) o con las distintas combinaciones de ADNc indicadas………………………………………………..…169 Figura 4.1: Representación de la localización de los genes AKT1 (AT2G26650) y NRT1.4/NPF6.2 (AT2G26690) dentro del cromosoma 2………………………………….170 Figura 4.2: Expresión del gen endógeno HAK5 en las líneas WT (HAK5:LUC), akt1-2, nrt1.4- 2 y L14……………………………………………………………………………………………………………171 Figura 4.3: Imagen representativa del crecimiento de las líneas WT, akt1-2, nrt1.4-2 y L14…………………………………………………………………………………………………………………172 Figura 4.4: Concentraciones de nitrato (A) y potasio (B) en raíz y parte aérea de las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt.4-2 y L14……………………………………………………………………..173 Figura 4.5: Concentraciones de nitrato (A) y potasio (B) en raíz y parte aérea de plantas de las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt1.4-2 y L14…………………………………………………….175 Índice de contenidos Figura D.1: Topología del giro beta presente entre los dominios TM5 y TM6 en el transportador NRT1.4/NPF6.2 (Izquierda) y NRT1.4/NPF6.2 (V210M) (Derecha)……………………………………………………………………………………………………….187 Figura D.2: Topología del posible dímero formado por NRT1.4/NPF6.2………………………..188 Figura A.1: Relaciones evolutivas de los 53 miembros de familia de proteínas NRT1/NPF de A. thaliana……………………………………………………………………………………………………..205 Figura A.2: Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de NRT1.1/NPF6.3 y NRT1.4/NPF6.2……..……………………………………………………………………………………….206 Resumen/Abstract Resumen 27 Introducción El potasio y el nitrógeno son nutrientes esenciales para las plantas, y su absorción y transporte deben estar coordinados. El potasio es el catión más abundante en los tejidos de las plantas bien alimentadas. Está implicado en el control del potencial eléctrico de membrana, la homeostasis de pH y la regulación de la presión osmótica. El nitrógeno es un componente esencial de los aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos, y normalmente es adquirido a través de la toma y metabolización del nitrato, que sirve además como molécula señalizadora (Clarkson & Hanson, 1980; Hawkesford et al., 2011; Pettigrew, 2008; Zörb et al., 2014). Las plantas pueden percibir los niveles de potasio y nitrato en el suelo para ajustar su adquisición y transporte de una forma apropiada. Los niveles de toma de potasio y nitrato del suelo están correlacionados y son favorecidos el uno por el otro (Raddatz et al., 2020). Este efecto puede ser explicado por la mejora del balance de cargas durante la toma y su distribución a larga distancia, y por el hecho de que el potasio induce la activación de enzimas implicadas en la asimilación de nitrato. Sin embargo, aún no se sabe demasiado sobre las influencias directas que produce un ion en el transporte del otro (Coskun et al., 2017). Objetivos La presente Tesis Doctoral tiene como objeto principal identificar y entender los mecanismos moleculares y las proteínas que subyacen en la regulación de la nutrición de potasio en la planta modelo Arabidopsis thaliana. A razón de este objetivo principal se proponen los siguientes objetivos parciales: 1. Caracterizar líneas mutantes con respuesta alterada al hambre de potasio, producidas por mutagénesis química y seleccionadas en base a la expresión anómala del gen reportero HAK5:LUC. 2. Identificar las mutaciones subyacentes y caracterizar el o los genes alterados involucrados en la nutrición de potasio. 3. Esclarecer cómo dichas mutaciones puntuales afectan a la actividad de las proteínas codificadas y analizar su participación en la nutrición vegetal, concretamente en la homeostasis de potasio de forma directa o indirecta. 4. Estudiar la sinergia existente entre el transporte de potasio y nitrato. Resumen 28 Resultados La línea L14 se seleccionó por su expresión anormalmente alta del gen reportero HAK5:LUC en condiciones de suficiencia de potasio. Esta línea posee una mutación deletérea en el canal de potasio de baja afinidad AKT1 (AKT1W135Z), que causa la pérdida de función de la proteína y una mutación de ganancia de función en el transportador de nitrato de baja afinidad NRT1.4/NPF6.2 (NRT1.4V210M). En este trabajo, las proteínas NRT1.4/NPF6.2 silvestre y NRT1.4V210M se expresaron en ovocitos de Xenopus, en la levadura asimiladora de nitrato Hansenula polymorpha y en cepas de Saccharomyces cerevisiae defectuosas para los transportadores que gobiernan eltransporte de potasio. Nuestros resultados sugieren que la mutación NRT1.4V210M mejora el transporte de nitrato en sistemas heterólogos, e indican que la proteína NRT1.4/NPF6.2 influye en la absorción y distribución de potasio, aunque no parece ser capaz de transportar potasio. También mostramos que NRT1.4/NPF6.2 es una diana de la quinasa CIPK23, que controla tanto el uso de nitrógeno como la nutrición de potasio en Arabidopsis. Esta interacción provoca una reducción de la tasa transporte de baja afinidad del transportador. Conclusiones 1. Una mutagénesis química con EMS sobre semillas de Arabidopsis ha conducido al aislamiento de la línea L14, que posee una expresión semiconstitutiva del gen reportero HAK5:LUC y una alteración en la nutrición de potasio. El análisis genético de esta línea ha conducido a la identificación de varias mutaciones en un fragmento de 852 kb del cromosoma 2. 2. La mutación del triptófano 135 a codón de parada en AKT1 presente en la línea L14 implica un truncamiento de la proteína y la pérdida de función del canal de potasio. El péptido truncado de AKT1 no es capaz de afectar la función de la proteína AKT1 silvestre ni, posiblemente, la de otros canales tipo Shaker presentes en la línea L14. 3. Las mutaciones puntuales halladas en la línea L14 en los genes VPS2.1 (AT2G06530), PMT1 (AT2G16120), GGPPS4 (AT2G23800), FUC1 (AT2G28100), GLR2.7 (AT2G9120), PARP1 (AT2G31320), CDF4 (AT2G34140) y ERH1 (AT2G37940) no afectan a la función de sus proteínas codificantes, lo que descarta su implicación en el fenotipo de L14. 4. El fenotipo más severo de la línea mutante L14 en comparación con un mutante de pérdida de función ha podido ser atribuido a la presencia de una segunda mutación en la proteína transportadora de nitrato NRT1.4/NPF6.2. 5. El transportador NRT1.4/NPF6.2 se localiza en la membrana plasmática, transporta nitrato y no transporta potasio per se cuando se expresa en sistemas heterólogos. Resumen 29 No obstante, un mutante de pérdida de función de NRT1.4/NPF6.2 manifiesta deficiencias en la nutrición de potasio, especialmente en raíces con baja disponibilidad de nitrato. 6. La quinasa CIPK23 fosforila in vitro el residuo treonina 98 de NRT1.4/NPF6.2, equivalente al residuo treonina 101 de NRT1.1/NPF6.3 que también es fosforilado por CIPK23. La interacción del complejo CBL1-CIPK23 con NRT1.4/NPF6.2 in vivo produce una disminución de la tasa de transporte de nitrato en el rango de baja afinidad en ovocitos de Xenopus laevis. 7. La mutación valina 210 a metionina en NRT1.4/NPF6.2 presente en la línea L14 implica una ganancia de función. En ovocitos, la expresión del transportador NRT1.4/NPF6.2V210M produce una mayor tasa de transporte de nitrato en el rango de baja afinidad, independientemente del pH y de la concentración de potasio presente en el medio. La proteína mutante confiere una mayor capacidad de crecimiento que la proteína silvestre cuando ambas se expresan en el mutante ynt1 de la levadura Hansenula polymorpha. 8. El fenotipo exacerbado de L14 con respecto al mutante simple akt1-2 se debe por tanto a la combinación de dos mutaciones: la pérdida de función del canal de potasio AKT1 debida a la mutación W135Z y la ganancia de función del transportador NRT1.4/NPF6.2 producida por la mutación V210M. In planta, esta combinación de mutaciones produce la alteración aditiva de la distribución de potasio, lo cual afectaría a la nutrición de potasio y a la expresión del transportador de potasio HAK5. Abstract 30 Introduction Potassium and nitrogen are essential nutrients, and their absorption and distribution within the plant must be coordinated for optimal growth and development. Potassium is not incorporated into organic matter, and hence it is the most abundant cation in tissues of well-fed plants, constituting between 2 to 10% of the dry weight of the plant (Leigh, 2001). Potassium is involved in control of membrane electrical potential, pH homeostasis and the regulation of cell osmotic pressure, whereas nitrogen is an essential component of amino acids, proteins, and nucleic acids. Nitrate is often the primary nitrogen source, but it also serves as a signalling molecule to the plant (Clarkson & Hanson, 1980; Hawkesford et al., 2011; Pettigrew, 2008; Zörb et al., 2014). Plants can sense potassium/nitrate levels in soils and adjust accordingly the uptake and root-to-shoot transport to balance the distribution of these ions between organs. In most plant species, the uptake rates of potassium and nitrate from the soil are positively correlated and to enhance one another (Raddatz et al., 2020). This effect can be explained by the improved charge balance during nutrient uptake and long-distance transport and by the potassium-induced activation of the enzymes involved in nitrate assimilation. However, little is known about the direct influences produced by one ion on the transport of the other (Coskun et al., 2017). Objectives The main objective of this project is to identify and understand the molecular mechanisms and proteins that underlie the regulation of potassium nutrition in Arabidopsis thaliana. Based on this primary objective, the following partial objectives are proposed: 1. Characterize mutant lines with altered response to potassium availability, produced by chemical mutagenesis and selected by the abnormal expression pattern of HAK5:LUC reporter gene. 2. Identify the underlying mutations and characterize the altered gene(s) possibly involved in potassium nutrition. 3. Analyze how these point mutations could affect the activity of the encoded proteins and evaluate their participation in plant nutrition, specifically in potassium homeostasis. 4. Study the synergies between potassium and nitrate transport Abstract 31 Results The L14 line was selected by an unusual HAK5 expression pattern, i.e. de-repressed expression in high-K+ conditions. This line has a deleterious mutation in the low-affinity potassium channel AKT1 (AKT1W135Z), which causes loss of protein function, and a gain-of- function mutation in the low-affinity nitrate transporter NRT1.4/NPF6.2 (NRT1.4V210M). In this work, the wild-type NRT1.4/NPF6.2 and the NRT1.4V210M protein were expressed in Xenopus oocytes, the nitrate-assimilating yeast Hansenula polymorpha and in strains of Saccharomyces cerevisiae defective in transporters governing potassium uptake and efflux. Our results suggest that mutation NRT1.4V210M enhanced nitrate transport at least in heterologous systems, and indicates that the Arabidopsis NRT1.4/NPF6.2 protein affects potassium uptake and root-shoot partitioning, even though NRT1.4/NPF6.2 gives no indication of being able to transport potassium with and without accompanying nitrate. We also show that NRT1.4/NPF6.2 is a target of the CIPK23 kinase that coordinately controls nitrogen use and potassium nutrition. The interaction with CBL1-CIPK23 complex leads to the reduction of low-affinity transport activity of NRT1.4/NPF6.2. Conclusions 1. Chemical mutagenesis with EMS on Arabidopsis seeds has led to the isolation of the L14 line, which has a semi-constitutive expression of the HAK5:LUC reporter gene and therefore an alteration in potassium nutrition. Genetic analysis of the L14 line resulted in the identification of several mutations circumscribed to an 852 kb fragment within chromosome 2. 2. AKT1W135Z mutation implies the loss of potassium channel function. Likewise, we showed that AKT1W135Z peptide was not able to affect the function of the canonical AKT1 protein, and likely unable of alter the function of other Shaker-like channels. 3. The point mutations found in the genes VPS2.1 (AT2G06530), PMT1 (AT2G16120), GGPPS4 (AT2G23800), FUC1 (AT2G28100), GLR2.7 (AT2G9120), PARP1 (AT2G31320), CDF4 (AT2G34140) and ERH1 (AT2G37940) in the L14 line did not affect the function of coding proteins, which discards their involvement in L14 phenotype. 4. The more severe phenotype of the L14 mutant line, compared to the loss-of-function mutant akt1-2, has been attributed to the presence of a second mutation in the nitrate transporter NRT1.4/NPF6.2, located in the plasma membrane. Abstract 32 5. NRT1.4/NPF6.2 carries nitrate and is not able to transport potassium when expressed in heterologous systems. However, the NRT1.4/NPF6.2 knock-out mutant manifests deficiencies in potassium nutrition, especially in roots with low nitrate availability. 6. Kinase CIPK23 phosphorylates NRT1.4/NPF6.2T98 in vitro, which is equivalent to NRT1.1/NPF6.3T101. The interaction between CBL1-CIPK23 complex and NRT1.4/NPF6.2 in vivo leads to the reduction of low-affinity transport activity of NRT1.4/NPF6.2 in Xenopus oocytes. 7. NRT1.4/NPF6.2V210M implies a gain-of-function. NRT1.4/NPF6.2V210M expression in oocytes produced a higher rate of nitrate transport in the low affinity range than the wild-type protein, regardless of the pH or the concentration of potassium present in the medium. Likewise, NRT1.4/NPF6.2V210M conferred greater growth capacity than the wild-type protein when expressed in the mutant ynt1 line of Hansenula polymorpha, affected in the uptake of nitrate from the medium. 8. The exacerbated phenotype of L14 line compared to akt1-2 mutant is due to the combination of two events: the loss of function in AKT1 potassium channel, caused by W135Z mutation; and the gain of function in NRT1.4/NPF6.2 nitrate transporter, produced by the V210M mutation. In planta, this combination induces additive effects in potassium distribution, which could affect potassium nutrition and also the expression of the high affinity transporter HAK5. https://www.linguee.es/ingles-espanol/traduccion/synergistic.html Introducción Introducción 35 El potasio como nutriente El potasio es un macronutriente esencial para las plantas junto con nitrógeno y fosfato. En plantas bien nutridas, el potasio constituye el 2-10% del peso seco debido a que no es metabolizado, al contrario que los compuestos nitrogenados y los fosfatos que sí se incorporan en materia orgánica (Leith & Wyn Jones, 1984). El potasio está implicado en multitud de procesos básicos para el desarrollo vegetal, tales como la activación de enzimas, el balance de cargas, el control del potencial eléctrico de membrana, el control del pH celular y el mantenimiento de la turgencia (Clarkson & Hanson, 1980; Hawkesford et al., 2011; Pettigrew, 2008; Zörb et al., 2014). Mientras que la concentración de potasio en el suelo varía ampliamente entre 0,01 y 20 mM, en el citoplasma de la mayoría de las células vegetales se mantiene constante en torno a 80 - 100 mM (Maathuis & Sanders, 1993; Walker et al., 1996). Dentro de las células, las vacuolas funcionan como reservorios dinámicos de potasio de los que disponer durante el desarrollo vegetal (Leidi et al., 2010; Martinoia et al., 2012), por lo que la concentración de potasio vacuolar puede variar ampliamente desde 5 mM hasta 150 mM, según mediciones directas realizadas con microelectrodos en raíces de cebada (Walker et al., 1996). En hojas, la concentración de potasio en vacuolas es superior y puede llegar a 230 mM (Leigh, 2001). El potasio es absorbido a través de las raíces. En general, la raíz primaria se organiza en cuatro zonas: zona apical, zona meristemática o de división celular, zona de elongación y zona de maduración o de diferenciación (Petricka et al., 2012). La disponibilidad de nutrientes influye en la organización y diferenciación de las células radiculares y su falta conduce a un retraso en el crecimiento vegetal (Li et al., 2017; Zhang et al., 2020). La entrada de nutrientes, incluido el potasio, tiene lugar a través de las células epidérmicas y corticales de las raíces, concretamente en los pelos radicales localizados en la zona de diferenciación. Los nutrientes minerales tienen que pasar algunas capas celulares para alcanzar el xilema. Este transporte ocurre a través de la rizodermis, capas de células del córtex, la endodermis y las células del parénquima que rodean el tejido vascular. La ruta apoplástica se interrumpe en la banda de Caspari, compuesta por lignina y suberina, que se extiende logitudinalmente alrededor de la estela limitando el paso de potasio y otros elementos hasta el xilema (Barberon, 2017). Para alcanzar la estela, el potasio debe circular por la vía simplástica, que transcurre por el continuum de citoplasmas interconectados por plasmodesmos que se extiende desde la rizodermis hasta la estela (Figura I.1). El mantenimiento de la homeostasis de potasio es fundamental para la supervivencia vegetal. Cambios relativamente pequeños en la concentración de este ion en el medio producen grandes cambios a nivel de potencial eléctrico de membrana, que a su vez inicia cascadas de señales que conducen a la activación de sistemas de entrada de potasio (Nieves-Cordones, et al., 2014 a), respuestas a salinidad (Leidi et al., 2010; Shabala, 2017), activación de la respuesta inmune (Brauer et al., 2016) y muerte celular programada Introducción 36 (Demidchik et al., 2010). Por lo tanto, no es sorprendente que exista un elevado número de genes que codifiquen canales y transportadores de potasio con distintas propiedades que permitan el transporte de este catión en función de concentraciones variables del nutriente, tejido y tipo celular (Tabla I.1) (Gierth & Mäser, 2007; Lebaudy et al., 2007). Proteínas transportadoras de potasio Canales de potasio Canales tipo Shaker Los canales de potasio tipo Shaker son canales tetraméricos cuyas subunidades se distribuyen alrededor de un poro central. Su actividad responde a cambios en el potencial eléctrico de membrana. Cada subunidad consta de 6 segmentos hidrofóbicos transmembrana, con una región de aminoácidos cargados positivamente en el cuarto segmento que actúa como un sensor de voltaje. Entre el quinto y el sexto segmento transmembrana aparece el dominio que actúa como poro selectivo, que contiene un motivo altamente conservado GYGD clave para la selectividad por potasio (Jegla et al., 2018; Nieves-Cordones et al., 2014 a). Este ordenamiento se suele indicar como 1P/6TM Figura I.1: Organización de las células radiculares y vías de absorción de sustancias a través de las raíces. La vía apoplástica comprende los espacios intercelulares y se interrumpe en la endodermis, donde se localiza la banda de Caspari. A partir de este punto, las sustancias continúan hacia el interior de las raíces a través de la vía simplástica. La vía simplástica discurre a través del continuum de citoplasmas interconectados por plasmodesmos. R: Rizodermis, C: Córtex, EN: endodermis, P: Periciclo, X: Xilema. Introducción 37 (Figura I.2). Cada subunidad α tiene una región C-terminal larga, que incluye varios dominios funcionales: una región C-linker que transduce cambios conformaciones que regulan el canal y probablemente determine su localización en la membrana (Jegla et al., 2018); un dominio conservado homólogo al dominio de unión a nucleótidos cíclicos (CNBHD) cuya función no es unir cNMP sino mediar la interacción entre las subunidades dentro del tetrámero; un dominio ankirina (que aparece sólo en algunos de estos canales) que media la interacción con otras proteínas; y un dominio KT/KHA rico en residuos ácidos e hidrofóbicos que está implicado en la tetramerización de los canales y en su localización en la membrana (Daram et al., 1997; Dreyer et al., 2004). Estos canales se localizan en la membrana plasmática (Hedrich et al., 2012), mediando la mayor parte de las corrientes selectivas de potasio dependientes del potencial de membrana. Se agrupan en tres subfamilias en función de su dependencia del potencial eléctrico de membrana para el transporte. En Arabidopsis thaliana se han identificado los siguientes canales en cada familia: • Canales rectificadores de entrada activados por hiperpolarización (Inward- Rectifying Shaker K+ Channels o KIR): AKT1, AKT5, AKT6 (o SPIK), KAT1 y KAT2. AKT1 se localiza en raíces mediando la entrada de potasio en la planta y también en células guarda donde su función aún no está clara (Nieves-Cordones et al., 2012). KAT1 y KAT2 se localizan en células oclusivas (Pilot et al., 2001). AKT5 y AKT6 se expresan en el tubo polínico (Mouline et al., 2002). AKT1 y KAT1 se activan a voltajes negativos y son fuertemente independientes de la concentración del potasio. • Canales débilmente rectificadores (Weakly-Rectifying): AKT2/3. Localizado en las células del floema, donde media la carga y descarga de potasio por su capacidad de transporte bidireccional (Marten et al., 1999). • Canales rectificadores de salida activados por despolarización (Outward-Rectifying Shaker K+ Channels o KOR): GORK y SKOR. SKOR se localiza en el cilindro vascular de la raíz, donde media la descarga de potasio desde las células parenquimáticas al xilema (Gaymard et al., 1998). GORK se localiza en las células oclusivas (células guarda) donde es fundamental para el cierre estomático, y en los pelos radicales (Hosy et al., 2003). Son dependientes tanto del voltaje como de la concentración externa de potasio, por lo que sólo se abren en condiciones favorables para la salida de potasio (Hedrich et al., 2012; Johansson et al., 2006). • Canales silentes: KC1 (o KAT3). No presenta actividad de transporte per se pero regula negativamente la función de los canales Kin modulando su dependencia de voltaje mediante la formación de heterotetrámeros (Jeanguenin et al., 2011). Introducción 38 Figura I.2: Modelos topológicos de los principales canales de potasio de A. thaliana. P: dominio poro; CNBHD: dominio homólogo al dominio de unión a nucleótidos cíclicos; ANK: ankirina; KHA; dominio rico en residuos ácidos e hidrófobos, CaM: dominio de unión a calmodulina. Figura adaptada de Ragel et al. (2019) Introducción 39 Canales TPK (‘Twin Pore Channels’) y KCO Los canales TPK de plantas poseen cuatro dominios transmembrana y dos dominios de poro (2P/4TM) (Figura I.2). Los dominios de poro poseen la secuencia conservada GYGD, lo que les confiere selectividad por el potasio (Mäser et al., 2002). Son necesarios cuatro dominios de poro para que el canal funcione correctamente, por lo que se ha propuesto que estos canales forman homodímeros (Voelker et al., 2010). El canal KCO3 tiene similitud de secuencia con los TPK pero sólo tiene un dominio de poro y dos transmembranas (1P/2TM). Algunos miembros de esta familia poseen dos dominios EF-hand para la unión de calcio en el C-terminal (Uehara et al., 2020), lo que está en consonancia con su activación en condiciones de elevado calcio en el citosol (Ward & Schroeder, 1994). Estos canales son en gran medida independientes de voltaje y están regulados por calcio y pH. Esta familia posee seis miembros en Arabidopsis (TPK1-5 y KCO3) que se localizan en la membrana vacuolar (Dunkel et al., 2008), a excepción de TPK4 que se localiza en la membrana plasmática de los granos de polen (Becker et al., 2004). TPK3 además de en la vacuola se localiza en la membrana de los tilacoides donde contribuye a mantener la electroneutralidad (Carraretto et al., 2013). Canales Catiónicos No Selectivos (NSCC) Estos canales se han descrito tanto en membrana plasmática como en tonoplasto. El canal TPC1 (Two-Pore Channel) se localiza en el tonoplasto de las células vegetales, es poco selectivo para el potasio y ha sido identificado como responsable de las corrientes de tipo SV o ‘Slow-Vacuolar type’ debido a que tiene una activación lenta que depende de la disminución del potencial de membrana y del aumento en la concentración de calcio (Guo et al., 2016). Se inhibe por bajo pH luminal y bajos niveles de calcio. Está formado por dos bloques con 6 dominios transmembrana y un dominio de poro cada uno (1P/6TM), semejantes a los canales tipo Shaker (Guo et al., 2016). Ambos bloques se unen a través de un dominio EF-hand de unión de calcio (Figura I.2). El calcio citosólico favorece la apertura del canal (Patel et al., 2016). Además, en la región N-terminal albergan sitios de fosforilación que pueden estar implicados en la regulación de su funcionamiento (Kintzer & Stroud, 2016). Los canales NSCC de células vegetales catalizan flujos de cationes a través de la membrana plasmática. Estos canales muestran selectividad de cationes sobre aniones, pero no discriminan fuertemente entre cationes (Demidchik et al., 2002), aunque algunos tienen preferencia en el transporte de potasio frente a sodio o calcio (Kronzucker & Britto, 2011). En lo referente a la nutrición de potasio, contribuyen al transporte de baja afinidad. Se agrupan en tres familias en función de su respuesta a los cambios en el potencial eléctrico de membrana: Activados por despolarización (Depolarization-Activated, DA- Introducción 40 NSCCs), que median flujos de salida de potasio; activados por hiperpolarización (Hiperpolarization-Activated HA-NSCCs); e insensibles al voltaje (Voltage-Insensitive, VI- NSCCs), que pueden dirigir flujos de entrada de potasio cuando los canales de potasio selectivos están inhibidos o no se expresan (Demidchik, 2014; Demidchik & Maathuis, 2007). A la familia HA-NSCC pertenecen los canales activados por nucleótidos cíclicos o CNGCs (Cyclic Nucleotide-Gated Cation channels) (Demidchik et al., 2002). Tras ser activados por AMPc o GMPc (Leng et al., 2002) median la entrada de cationes en la célula (Balagué et al., 2003). Estructuralmente son parecidos a los canales tipo Shaker (1P/6TM) y presumiblemente funcionan como tetrámeros. Cada subunidad está formada por seis dominios transmembrana (TM), con cargas positivas en el TM4 y un dominio de poro, diferente al canónico GYGD por lo que tienen baja discriminación entre el potasio y el sodio (Szczerba et al., 2009). La región a través de la cual se une el nucleótido cíclico está localizada en el extremo carboxilo terminal junto con un dominio de unión a calmodulina (Köhler et al., 1999; Köhler & Neuhaus, 2000). Los 20 miembros de la familia GLR (Glutamate-Like Receptors) de Arabidopsis también pertenecen a la familia HA-NSCC. Por su similitud con los iGLR de animales se ha inferido que su estructura consta de cuatro dominios transmembrana y dos dominios extracelulares de unión al ligando (2P/4TM) (Lam et al., 1998). Los ligandos para estas proteínas in planta son aún poco conocidos. En Arabidopsis por el momento se han identificado a GLR1.1 y GLR1.4 como canales permeables a potasio (Tapken & Hollmann, 2008). Co-transportadores de potasio Transportadores HAK/KUP/KT La familia de transportadores HAK/KUP/KT (High-Affinity Potassium/K+ UPtake/K+ Transporter) participa no solo en la captación de potasio y su translocación, sino también en la adaptación a estreses, la regulación del potencial osmótico y el control de la morfología de la raíz (Li et al., 2018). Curiosamente, esta familia no aparece en el reino animal, lo que indica que ha evolucionado para la adaptación de organismos sésiles en un entorno cambiante (Ashley et al., 2006). Estructuralmente poseen algunos atributos comunes a todos ellos: un dominio hidrofóbico que contiene entre 10-14 segmentos transmembrana y tres dominios citosólicos (N-terminal, C-terminal y un lazo citosólico entre el segundo y tercer transmembrana más largo, aproximadamente 70 residuos, que el resto de segmentos que conectan los otros transmembranas) (Gierth & Mäser, 2007). La región del poro no ha sido descrita aún con suficiente detalle estructural, y se está trabajando en la identificación de Introducción 41 los dominios imprescindibles en el transporte (Santa-María et al., 2018), aunque se especula que la región localizada entre los TM2-3 contribuye a determinar la afinidad (KM) de cada transportador (Figura I.3). Funcionalmente son simportadores K+/H+, lo que les confiere una gran capacidad para la acumulación de potasio al energizarse tanto por la fuerza protón-motriz (dos unidades de pH entre apoplasto y citoplasma) como por el potencial eléctrico de membrana (negativo en el interior) (Rodriguez-Navarro & Rubio, 2006; Scherzer et al., 2015). Se expresan en todos los tejidos de la planta. La mayoría de los transportadores caracterizados están en la membrana plasmática, aunque pueden aparecer en otros compartimentos celulares como tonopasto (Jaquinod et al., 2007) y endomembranas (Rigas et al., 2013) . Se trata de una familia funcionalmente diversa, clasificada en función de la homología de su secuencia dentro de cinco clados filogenéticos y que en Arabidopsis cuenta con 13 miembros (Santa-María et al., 2018). Los transportadores del clado I, al que pertenece el transportador HAK5 (Gierth et al., 2005; Rubio et al., 2000), llevan a cabo el transporte de potasio de alta afinidad (Nieves-Cordones et al., 2016 b). Los pertenecientes al clado II se caracterizan por una gran diversidad en cuanto a propiedades del transporte y roles fisiológicos (Elumalai et al., 2002; Rigas et al., 2001). A este clado pertenecen KUP6 y KUP8, que parecen mediar la salida de potasio hacia el xilema en las raíces (Osakabe et al., 2013). De los clados III y IV existe poca información disponible por el momento. Por otra parte, el transportador KUP7 perteneciente al clado V media la adquisición de potasio en las raíces a concentraciones moderadas de este ion (Han et al., 2016). Transportadores CPA Los transportadores de tipo CPA (Cation-Proton Antiporter) conforman un extenso grupo de transportadores, muchos de los cuales están implicados en la homeostasis de cationes monovalentes y la regulación del pH celular (Tsujii et al., 2020). Dentro de la superfamilia CPA se distinguen la familia CPA1, que incluye transportadores vegetales de tipo NHX, y la familia CPA2 que incluye a los trasportadores KEA y CHX, todos ellos transportadores de potasio. Por lo general, los intercambiadores CPA1 son electroneutros, que no afectan al potencial eléctrico de la membrana, mientras que en la familia CPA2 coexisten transportadores electroneutros y electrogénicos. Los transportadores CPA1 de la subfamilia NHX (Na+/H+ eXchanger) conforman una familia de 8 miembros en Arabidopsis: los NHX1-4 se localizan en tonoplasto, NHX5-6 en endosomas y NHX7-8 en membrana plasmática (Bassil et al., 2011 a; Bassil et al., 2011 b; McCubbin et al., 2014; Quintero et al., 2002; Reguera et al., 2015). Aunque incialmente fueron descritos como antiportadores Na+/H+ por su similitud con sus homólogos en animales y bacterias, sólo NHX7/SOS1 es selectivo para sodio (Shi et al., 2002; Quintero et al., 2011). NHX8 se ha descrito como un intercambiador Li+/H+ (An et al., 2007), pero es Introducción 42 muy probable que también transporte sodio, de igual manera que NHX7/SOS1 puede aceptar litio. Por el contrario, para los antiportadores vacuolares (NHX1-4) y endosomales (NHX5-6) se ha demostrado que son poco selectivos entre sodio y potasio y que in planta se comportan fundamentalmente como antiportadores K+/H+ (Barragan et al., 2012; Bassil et al., 2019; Jiang et al., 2010; Leidi et al., 2010; Venema et al., 2002). La proteína NHX1 de Arabidopsis contiene un dominio de unión a la proteína CML18 (Calmodulin-Like 18) en su región C-terminal citosólica (Figura I.3) que podría estar también presente de las otras tres isoformas vacuolares (NHX2-NHX4; resultados no publicados). La selectividad Na+-K+ en el transporte de NHX1 de Arabidopsis podría estar regulada por la interacción con CML18 (Yamaguchi et al., 2005). En la familia CPA2 se distinguen otras dos subfamilias, los transportadores KEA (K+- Efflux Antiporter) y los transportadores CHX (Cation H+ eXchanger) (Chanroj et al., 2012). Las proteínas KEA presentan 12 dominios transmembrana y poseen un dominio Na+/H+ en la región N-terminal y un dominio KTN (K+ Transport Nucleotide binding domain) C-terminal al que se podría unir NADP(H) o ATP/ADP para regular la conductancia al potasio del transportador (Chanroj et al., 2012). Estudios funcionales han determinado la capacidad de los transportadores KEA (KEA1-6) para transportar potasio con un flujo bidireccional (KEA1, 3 y 5) o con flujo de entrada (KEA4 y 6) al menos en S. cerevisiae. KEA1-3 están implicados en la regulación del transporte de electrones fotosintético y en el desarrollo de los cloroplastos (Kunz et al., 2014). Por otra parte, KEA4-6 regulan el pH en condiciones de estrés salino mediante su expresión en endomembranas de las células radiculares (Zhu et al., 2018). Por su parte, los transportadores CHX parecen mediar un antiporte de K+ (Na+)/H+ (Sze et al., 2004). Poseen entre 10 y 12 dominios transmembrana con un C-terminal de tamaño variable que parece implicado en su correcta localización celular y en la regulación del transportador (Chanroj et al., 2013) (Figura I.3). Arabidopsis cuenta con 28 miembros de esta familia, de los cuales 18 se expresan durante el desarrollo del polen y sólo 6 de ellos se expresan en tejidos vegetativos (Sze et al., 2004). Se distribuyen en cinco clados filogenéticos, de los que el IV es el mejor caracterizado en Arabidopsis. A él pertenecen los transportadores CHX17 y CHX20 (Maresova & Sychrova, 2006; Padmanaban et al., 2007), que se localizan en endomembranas y parecen ser capaces de transportar potasio en sistemas heterólogos. En el clado VII se encuentra el transportador de alta afinidad CHX13, localizado en la membrana plasmática del polen y la zona de elongación radicular, que podría estar implicado en la toma de potasio en condiciones de deficiencia de este ion (Zhao et al., 2015). Introducción 43 Tabla I 1: Localización celular y función de los principales canales y transportadores de potasio presentes en A. thaliana. Gen Familia Localización Función AKT1 Canal Shaker Membrana plasmática de raíces Toma de potasio AKT2/3 Canal Shaker Membrana plasmática de floema Regulación carga y descarga de potasio en el floema KAT1/KAT2 Canal Shaker Membrana plasmática de células oclusivas Apertura estomática AKT5/AKT6 Canal Shaker Membrana plasmática de tubo polínico Elongación del tubo polínico KC1 Canal Shaker Membrana plasmática de raíces Toma de potasio en combinación con AKT1 SKOR Canal Shaker Cilindro vascular de la raíz Carga de potasio en el xilema en las raíces GORK Canal Shaker Membrana plasmática de células oclusivas Cierre estomático HAK5 HAK/KUP/KT Membrana plasmática de raíces Toma de potasio de alta afinidad KUP6/KUP8 HAK/KUP/KT Membrana plasmática de raíces y células guarda Salida de potasio en las raíces y el estoma. Inhibición de la formación de raíces laterales dependientes de ABA y auxina KUP7 HAK/KUP/KT Membrana plasmática de raíces Toma de potasio TPK1 TPK Tonoplasto en células oclusivas Salida de potasio de las vacuolas TPK3 TPK Tonoplasto y membrana tilacoidal Mantener electroneutralidad TPK4 TPK Membrana plasmática de granos de polen Elongación del tubo polínico NHX1/NHX2 CPA1 Tonoplasto Llenado de vacuolas NHX5/NHX6 CPA1 Endosomas Regulación del pH luminal KEAs CPA2 Membrana plasmática y tilacoidal Correcto funcionamiento fotosintético CHX13 CPA2 Membrana plasmática de polen y zona de elongación radicular Toma de potasio CHX21/CHX23 CPA2 Membrana plasmática de granos de polen Elongación del tubo polínico Introducción 44 Figura I.3: Modelos topológicos de los principales transportadores de potasio de A. thaliana. CML18D: dominio de unión a la proteína CML18, KTN: K+ Transport Nucleotide binding domain. Figura adaptada de Ragel et al. (2019). Introducción 45 Principales sistemas absorción de potasio por las raíces El sistema de toma de potasio a través de las raíces representa una cinética bifásica compleja en respuesta a la concentración exterior de potasio (Epstein et al., 1963). Existen al menos dos sistemas de transporte descritos y bien estudiados para la toma de potasio, que se corresponden con sistemas de alta y de baja afinidad que trabajan a baja (< 1 mM) y alta (> 1 mM) concentración de potasio, respectivamente (Nieves-Cordones et al., 2014 a; Ragel et al., 2019). Estos sistemas de transporte no son solo diferentes en cuanto a la concentración externa a la que operan, sino que también catalizan el flujo de potasio a través de la membrana utilizando distintos mecanismos. La toma de potasio de alta afinidad es un proceso 'activo' (en contra del gradiente electroquímico del potasio) mediado por transportadores simportes H+/K+ de estequiometría probable 1:1 que implica la disipación del gradiente de protones transmembrana generado por la H+-ATPasa (Maathuis et al., 1997; Maathuis & Sanders, 1994), por lo que son electrogénicos y altamente despolarizantes. Algunos de estos transportadores son sensibles a iones competidores como el NH4 + o el Na+ (Hoopen et al., 2010). Por el contrario, los canales iónicos tanto específicos de potasio como no selectivos median la toma de baja afinidad en un proceso 'pasivo', cuya actividad depende de un potencial electroquímico del potasio favorable (Alemán et al., 2011; Britto & Kronzucker, 2008). Los principales participantes en la captura de potasio por las raíces de Arabidopsis han sido identificados gracias a la utilización de líneas de inserción de ADN-T y mediante su expresión en sistemas heterólogos, fundamentalmente la levadura Saccharomyces cerevisiae. Su funcionamiento en plantas también puede distinguirse con el empleo de inhibidores selectivos. De esta forma se ha identificado al transportador de potasio de alta afinidad HAK5 (Rubio et al., 2000) y al canal AKT1 (Lagarde et al., 1996; Sentenac et al., 1992) como los principales componentes que contribuyen a la toma de potasio en Arabidopsis. Recientemente también se ha descubierto la implicación del transportador KUP7 en la toma de potasio, cuya afinidad por el ion es menor a la de HAK5 (Han et al., 2016). El flujo de entrada de potasio es mediado por una u otra proteína en función de la concentración externa del catión (Figura I.4). El transportador de potasio de alta afinidad HAK5 es el único sistema que media la absorción de potasio a concentraciones externas menores a 10 µM (Gierth et al., 2005; Santa-María et al., 2018). A concentraciones entre 10 y 100 µM, la absorción de potasio también es llevada a cabo por el canal AKT1 y el transportador KUP7, que además de mediar la carga potasio al xilema también está implicado en la absorción de potasio. Entre 100 y 200 µM, HAK5 y AKT1 son los únicos responsables de la absorción de potasio (Alemán et al., 2011; Rubio et al., 2010). A concentraciones externas superiores a 200 µM, la función de HAK5 no es relevante, y AKT1 contribuye mayoritariamente a la entrada de potasio (Nieves-Cordones et al., 2016 b). Entre 1 y 10 mM de potasio exterior, AKT1 actuaría junto con otros sistemas, probablemente los canales de cationes no selectivos (NSCC; Pottosin & Dobrovinskaya, Introducción 46 2014). Por encima de los 10 mM de potasio en el suelo se contempla la acción de otros sistemas de transporte no identificados, dado que los dobles mutantes hak5 akt1 no muestran ningún fenotipo en comparación con el WT a esa concentración de potasio en el medio (Rubio et al., 2010). Varios estudios sugieren que los sistemas candidatos a llevar a cabo la absorción de potasio en este doble mutante podrían pertenecer a la familia de canales CNGCs (Li et al., 2005), a la familia CHX (Zhao et al., 2008), o a la familia de canales regulados por glutamato o GLR (White & Karley, 2010). Distribución de potasio en la planta Una vez el potasio ha sido absorbido a través de los canales y transportadores descritos en el apartado anterior, este nutriente se transporta a los tejidos de la estela de la raíz para ser conducido a la parte aérea a través del xilema. El canal SKOR se expresa en los tejidos de la estela y media la salida de potasio desde las células del parénquima de la raíz hacia el xilema (Gaymard et al., 1998; Ivashikina et al., 2001). NRT1.5/NPF7.3, inicialmente caracterizado como transportador de nitrato, también lleva a cabo este proceso, especialmente bajo condiciones de falta de potasio (Li et al., 2017), así como el transportador KUP7 (Han et al., 2016) (Figura I.5). Figura I.4: Contribución de los diferentes canales y transportadores de potasio a la adquisición de potasio por las raíces de A. thaliana en función de la disponibilidad de potasio en el medio. Figura adaptada de Nieves-Cordones et al. (2014). Introducción 47 Una vez cargado en el xilema, el potasio se distribuye a la planta completa. El transportador NRT1.8/NPF7.2 parece estar implicado en la descarga de potasio del xilema a las células de la parte aérea (Li et al., 2017; Li et al., 2010). En los tejidos fuente, donde hay mayor disponibilidad de ATP, las bombas de protones del floema establecen un gradiente eléctrico que es utilizado para cargar el floema con potasio a través de canales de potasio como AKT2/3 (Dreyer et al., 2017; Dreyer & Blatt, 2009). En el floema, el potasio es el catión más abundante y estimula la carga de azúcares a este tejido (Peel & Rogers, 1982). A través del floema, el potasio se transporta desde los tejidos fuente a los tejidos sumidero (mecanismo conocido como source-to-sink transport), en un proceso en el que participa AKT2 (Figura I.5). El papel de este canal es dual, puesto que media la carga de potasio en los tejidos fuente y su descarga en los órganos sumidero. En este proceso es crucial su regulación post-traduccional (Gajdanowicz et al., 2011). Figura I.5: Patrones de localización de los principales canales y transportadores de potasio en A. thaliana. Las flechas indican la dirección del flujo de potasio. En raíces y hojas, el xilema se marca en azul y el floema en rojo. En las células guarda la vacuola se marca en amarillo. Figura adaptada de Lebaudy et al. (2007). Introducción 48 Por otra parte, el potasio juega diversos papeles en la parte aérea. Está implicado en el funcionamiento de los cloroplastos y, por tanto, en el correcto rendimiento fotosintético de la planta. En este contexto participan proteínas de la familia KEA (Wang et al., 2017; Zhu et al., 2018). El potasio también es fundamental en el movimiento estomático, donde el papel de KAT1/2, AKT1/2 y de GORK es fundamental, mediando la entrada y salida de potasio respectivamente de las células guarda (Figura I.5) (Hosy et al., 2003; Szyroki et al., 2001), además de la actividad de NHX1 y NHX2 en el llenado de las vacuolas de las células oclusivas (Andrés et al., 2014). En las células del polen, el potasio es fundamental para la elongación del tubo polínico. Algunos canales AKT y TPK junto con transportadores CHX (CHX21 y 23) se localizan en la membrana plasmática de esta célula y contribuyen a la correcta polarización y dirección del tubo polínico hacia el óvulo (Lu et al., 2011). Por último, el principal reservorio de potasio en todos los órganos y tejidos de la planta se localiza en las vacuolas celulares. El potasio se almacena en este orgánulo por encima de sus requerimientos nutricionales, tanto en raíces como en parte aérea. El almacenamiento en vacuolas necesita de la coordinación en el tonoplasto de bombas de protones y de transportadores de potasio. En Arabidopsis, la entrada está mediada principalmente por NHX1 y NHX2 (Andrés et al., 2014; Barragan et al., 2012; Bassil et al., 2011 b), con una contribución minoritaria de NHX3 y NHX4 (Bassil et al., 2019), mientras que los canales TPC1 y los TPKs median la salida de potasio de la vacuola, en un proceso bien coordinado por complejos CIPKs/CBLs (CBL-Interacting Protein Kinases/Calcineurin B- Like) y CPKs (Calcium-dependent Protein Kinases) (Tang et al., 2020). Mecanismos de detección y señalización del hambre de potasio Dado que las plantas son organismos sésiles, la capacidad de percibir (sensing) la concentración de nutrientes en el medio y adaptar su comportamiento a su disponibilidad es fundamental para la supervivencia. Las raíces de las plantas son las estructuras que contactan directamente con el suelo, por lo que una deficiencia de potasio se detecta en primer lugar en este órgano. Varios estudios sugieren que el movimiento de entrada de potasio a través de diversas proteínas de membrana como CHX13 (Zhao et al., 2008) o AKT1 (Gierth et al., 2005) podría actuar como el mecanismo sensor del déficit de potasio, aunque un sensor celular de potasio propiamente dicho, similar al transceptor NRT1.1/NPF6.3 para nitrato (Ho et al., 2009), no ha sido todavía descrito. Como consecuencia de este estímulo se genera una amalgama de respuestas moleculares con diferencias espacio-temporales. Las señales moleculares conocidas hasta el momento que regulan la respuesta al déficit de potasio son el incremento del calcio citosólico, la alteración de diferentes hormonas (como etileno y jasmonato) y la producción de especies reactivas del oxígeno. Juntas, estas señales por una parte influyen en el Introducción 49 desarrollo morfológico de la planta (Hodge, 2004; Sustr et al., 2019) y por otra parte conducen a la regulación transcripcional y postranscripcional de los sistemas de toma de potasio. De todos ellos destaca la fuerte inducción de HAK5 en las raíces, por lo que la monitorización de la expresión de este gen es una buena herramienta para registrar el sensing de la disponibilidad de potasio (Jung et al., 2009) (Figura I.6). Tratar de explicar la totalidad de estas señales y los fenómenos adaptativos que causa el déficit de potasio excede el propósito de esta Introducción. Por ello, sólo realizaremos una breve descripción de las señales implicadas específicamente en la regulación de HAK5 en las raíces de Arabidopsis thaliana, que constituye un tema central en esta Tesis (Figura I.6). Las rutas de señalización descritas a continuación convergen y guardan en ocasiones efectos sinérgicos, por lo que es necesario mantener una visión integradora de este fenómeno. Eventos y moléculas señalizadoras del hambre de potasio Hiperpolarización de la membrana plasmática La diferencia de potencial eléctrico (EM) a ambos lados de las membranas de una célula refleja la energía disponible en la misma para procesos de transporte. El potencial eléctrico de membrana se genera por H+-ATPasas, que consumiendo ATP bombean protones al exterior. Como consecuencia se genera una diferencia de potencial eléctrico (negativo en el interior) y un gradiente de pH (ácido en el apoplasto). Independientemente del estado nutricional en la planta, cualquier cambio en la concentración de potasio o de otros nutrientes como el nitrato afecta inmediata y reversiblemente al potencial de membrana celular (Maathuis & Sanders, 1993). Como el EM puede variar rápidamente es necesario que la planta disponga de mecanismos para controlarlo. Este control es llevado a cabo principalmente por los canales de potasio IRK y ORK descritos anteriormente en esta Introducción. En hongos se ha estimado que por cada dos protones extruidos entre un potasio para impedir una rápida hiperpolarización de la membrana (Rodríguez-Navarro, 2000). Además de ser el catión más relevante para el mantenimiento del EM, el potasio lleva a cabo una regulación dual de la actividad de la ATPasa. La unión directa de potasio a la ATPasa estimula su actividad bioquímica, y por otra parte ejerce una regulación indirecta evitando que el potencial de membrana alcance un nivel tal que haga estallar a la célula. La salida de protones es compensada por la entrada de potasio a través de canales activados cuando el potencial de membrana alcanza un valor crítico de polarización. El flujo de entrada de potasio origina una despolarización de la membrana, mientras que una baja concentración externa de potasio produce una hiperpolarización de la membrana celular (Spalding et al., 1999). La hiperpolarización de la membrana plasmática es considerada el Introducción 50 evento primario provocado por la deficiencia de potasio (Nieves-Cordones et al., 2008), y conduce a la activación de canales de entrada de potasio dependientes de voltaje, como AKT1, a la activación de canales de calcio dependientes de voltaje (Sanders et al., 2002), y en última instancia inducen la transcripción de HAK5 (Gierth et al., 2005). Sin embargo, se ha observado que para la aparición de la actividad transportadora mediada por la proteína HAK5 en tomate es necesaria una deficiencia real de potasio en la célula y que la hiperpolarización de la membrana plasmática no es suficiente per se para que se active el transporte, aunque sí para inducir la transcripción de HAK5 (Nieves-Cordones et al., 2008). Calcio Al margen de su importancia como nutriente, el calcio juega un papel fundamental como mensajero secundario en todos los organismos eucariotas, incluidas las plantas (Berridge et al., 2000). Su concentración en el citoplasma ronda los 200 nM en condiciones normales (Bush, 1995), pero es modificada de forma transitoria y finamente regulada en respuesta a distintos tipos de estímulos (Zhu, 2016). Las señales de calcio son específicas de cada tipo de estímulo para generar respuestas apropiadas al mismo (Kudla et al., 2018) y se conocen como ‘firmas’ de calcio. En concreto, la respuesta al hambre de potasio genera dos cascadas de calcio que difieren en su localización espacial y temporal (Behera et al., 2017). La primera consiste en un aumento rápido y transitorio del calcio en el citosol en la región postmeristemática de la raíz (sobre todo en el tejido vascular y la endodermis) en el primer minuto de exposición al hambre de potasio, seguido de una vuelta a los niveles basales de concentración dentro de los 7 minutos siguientes. Este evento inicial probablemente corresponde a la rápida hiperpolarización de la membrana plasmática en ausencia de un flujo de entrada de potasio. El aumento de calcio citosólico se produce por su entrada en la célula a través de canales regulados por voltaje. La segunda cascada se ha detectado en las raíces después de varias horas (18 h), y ha sido descrita como un incremento sostenido del calcio citosólico en la zona de elongación y de diferenciación de pelos radicales. Esta segunda señal probablemente refleja una caída efectiva de los niveles de potasio citosólico y se ha propuesto que esta segunda ola contribuye a las respuestas adaptativas a largo plazo, así como la regulación fina de la actividad de las proteínas que median la entrada de potasio en la raíz. En Arabidopsis han sido identificadas cinco familias encargadas de mediar la entrada de calcio en el citosol: CNGCs (Zelman et al., 2012), GLRs (Lacombe et al., 2001; Price et al., 2012), TPC1 (Morgan & Galione, 2014), MCs (MeChanosensitive channels) (Kurusu et al., 2013) y OSCAs (reduced hyperOSmolarity-induced CAlcium) (Yuan et al., 2014). Algunos de estos canales permeables a calcio son activados por señales ROS (Reactive Oxygen Species) extracelulares que producen las NADPH oxidasas (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Introducción 51 PHosphate oxidases) localizadas en la membrana plasmática (Demidchik & Maathuis, 2007; Laohavisit et al., 2012). La rápida subida del calcio libre se contrarresta por la acción de cuatro familias de transportadores de calcio que restauran los niveles del ion en el citosol. Estos transportadores se localizan en la membrana plasmática o en el retículo endoplásmico, y utilizan ATP o gradientes de protones como fuente de energía para impulsar el flujo de calcio en contra de su gradiente de concentración. Tal es el caso de las familias ACAs (Autoinhibited Ca2+-ATPases), ECAs (ER-type Ca2+-ATPases), P1-ATPases y CAX (CAlcium eXchangers) (Bose et al., 2011). En general, las señales de calcio son decodificadas por proteínas capaces de unir este ion a través de sus motivos EF-hand (Day et al., 2002). Entre estos sensores se encuentran las calmodulinas (CaM) y las Calmodulin-Like (CML) (Zielinski, 1998), las proteínas quinasas dependientes de calcio o CDPK (Calcium Dependent Protein Kinases) (Harmon et al., 2000) y las proteínas CBL (Calcineurin B-Like) (Kudla et al., 1999) entre otras. Estas últimas forman complejos con la familia de quinasas CIPK (CBL Interacting Protein Kinases), que cuenta con 26 miembros en A. thaliana, con los que cada CBL interacciona de manera preferencial y específica (Batistič et al., 2010). En el caso del potasio, la interacción de CBL1 y CBL9 con CIPK23 conduce a la fosforilación de AKT1 y HAK5 (Ragel et al., 2015; Xu et al., 2006), además de otras proteínas relacionadas con la nutrición de nitrato y la homeostasis de hierro, magnesio y amonio (Ródenas & Vert, 2021). Probablemente, esta activación post- traduccional de la proteína HAK5 por CBL1/9-CIPK23 como consecuencia de la elevación del calcio citosólico en respuesta a un déficit sostenido de potasio explique la observación realizada en tomate de que la hiperpolarización de la membrana plasmática es necesaria para inducción transcripcional de HAK5 pero no suficiente para la activación del transporte mediado por la proteína HAK5 (Nieves-Cordones et al., 2008). Este asunto se tratará posteriormente en esta Introducción. Especies Reactivas del Oxígeno o ROS Las especies reactivas de oxígeno o ROS (Reactive Oxygen Species) se producen como productos del metabolismo aerobio. Por su carácter altamente reactivo pueden provocar daños oxidativos en la célula, por lo que las plantas cuentan con diversos mecanismos para evitar la acumulación de estas sustancias. Sin embargo, en otras circunstancias actúan como moléculas de señalización implicadas en multitud de procesos biológicos tales como la defensa frente a patógenos, la muerte celular programada y el control estomático (Huang et al., 2019). Las ROS también se acumulan en respuesta al hambre de potasio, nitrógeno y fósforo (Sadhukhan & Koyama, 2019). En respuesta a estrés, las plantas producen ROS mediante la activación de diversas NADPH oxidasas y peroxidasas (Kärkönen & Kuchitsu, 2015). Las NADPH oxidasas o RBOH Introducción 52 (Respiratory Burst Oxidase Homologs) son complejos enzimáticos de membrana plasmática que inician la producción de anión superóxido (O2 -) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Se ha observado que la producción de ROS a través de la NADPH oxidasa RBOHC/RHD2 regula la expresión de HAK5 en condiciones de hambre de potasio, además de otros genes como el transportador KEA5 y otras peroxidasas (Shin & Schachtman, 2004). Por otra parte, también se ha visto que la peroxidasa de tipo III RCI3 (Rare Cold Inducible gene 3) está implicada en la generación de ROS y en la activación de la transcripción de HAK5 en las raíces de plantas sometidas a hambre de potasio (Kim et al., 2010). Al igual que otras peroxidasas tipo III, RCI3 sería secretada a la pared celular (Llorente et al., 2002) donde generaría ROS extracelulares que podrían activar los canales permeables a calcio localizados en la membrana plasmática mencionados en el apartado anterior (Demidchik & Maathuis, 2007; Laohavisit et al., 2012). Etileno El etileno (C2H4) es una fitohormona en estado gaseoso que está involucrada en diversos procesos vegetales, así como en la señalización de estrés tanto bióticos como abióticos. Se ha observado que entre 6 y 30 horas tras la exposición de A. thaliana a condiciones de hambre de potasio se produce la síntesis de esta hormona mediante la activación de la transcripción de enzimas implicadas en su formación (Shin & Schachtman, 2004). Además, análogos del etileno como el ACC o el etefón (ácido 2-cloroetilfosfónico) son capaces de inducir la transcripción de HAK5 incluso en condiciones de nutrición suficiente mediante algún mecanismo mediado por ROS (Jung et al., 2009), lo que sugiere la implicación de esta hormona en la señalización del hambre de potasio. En los últimos años ha sido descrita molecularmente la cascada de señalización en respuesta a etileno en Arabidopsis (Merchante et al., 2013; Schachtman, 2015; Shakeel et al., 2013). En ausencia de etileno, los receptores localizados en el retículo endoplásmico reprimen activamente la respuesta a la hormona (Hua & Meyerowitz, 1998) mediante la activación de la quinasa CTR1 (Constitutive Triple Response-1) (Kieber et al., 1993), que fosforila e inhibe a la proteína EIN2 (Ethylene Insensitive-2) (Alonso et al., 1999) (Figura I.6). En presencia de etileno, los receptores se inactivan mediante cambios conformacionales, impidiendo que CTR1 actúe, lo que conduce a la desfosforilación de EIN2. Como consecuencia, el dominio C-terminal de EIN2 se transloca al núcleo (Wen et al., 2012), activando la síntesis del factor de transcripción EIN3/EIL1 (An et al., 2010), que regula positivamente la expresión de genes implicados en la respuesta a etileno o de ERFs (Solano et al., 1998). Los ERFs son factores de transcripción que se unen a las GCC-box presentes en los promotores de los genes inducibles por etileno, regulando su expresión (Nakano et al., 2006). Uno de estos factores de transcripción ERF es RAP2.11, cuya expresión se induce en condiciones de bajo potasio de forma dependiente de etileno y ROS en las raíces. Se ha Introducción 53 observado que RAP2.11 es capaz de unirse al promotor de HAK5 y activar su transcripción, así como la de genes de NADPH oxidasas y CBLs (Kim et al., 2012). Además, también activa la síntesis de cuatro factores de transcripción relacionados con el crecimiento radicular en condiciones de bajo potasio (Hong et al., 2013) lo que convierte a este factor de transcripción en un posible amplificador de la respuesta a hambre de potasio. Auxina La auxina IAA (ácido indolacético) es una hormona derivada del triptófano cuya acción es fundamental en los procesos de crecimiento vegetal (Saini et al., 2013). Se sintetiza principalmente en el ápice de la parte aérea y se transporta a la raíz a través de los tejidos vasculares (Teale et al., 2006), aunque también puede generarse localmente en el centro quiescente de las raíces (Brumos et al., 2018). En condiciones de falta de potasio se inhibe su transporte a las raíces, lo que impide el crecimiento radicular (Cao et al., 2006; Shin et al., 2007) y conduce a la acumulación de esta hormona en el cilindro vascular de la parte aérea (Vicente-Agullo et al., 2004). Arabidopsis cuenta con numerosos transportadores de entrada y salida de auxina en las raíces. Uno de ellos es PIN1, cuya correcta localización depende del transportador de potasio TRH1/KUP4 (Figura I.6). Prueba de ello es que los mutantes deficientes trh1 tienen graves problemas en el desarrollo de pelos radicales y gravitropismo (Rigas et al., 2013; Vicente-Agullo et al., 2004). Un estudio reciente indica que TRH1/KUP9 también funciona como un facilitador del eflujo de auxina, mediando el cotransporte de potasio y auxina desde el lumen del retículo endoplásmico al citoplasma para mantener la actividad meristemática en el centro quiescente de la raíz y el crecimiento de la raíz en condiciones de falta de potasio (Zhang et al., 2020). Además, la señalización por auxina está implicada en la transcripción de canales de potasio mediada por los factores de respuesta a auxina o ARFs (Auxin Response Factors). Uno de estos ARF (ARF2) regula negativamente la transcripción de HAK5 en condiciones de potasio suficiente al unirse directamente al motivo AuxREs presente en el promotor de HAK5 (Figura I.6). En cambio, en condiciones de potasio insuficiente ARF2 es fosforilado, lo que impide su unión al promotor de HAK5 (Zhao et al., 2016). Otras fitohormonas Además del etileno y la auxina, el ácido jasmónico (Armengaud et al., 2004; Troufflard et al., 2010), ABA (Kim et al., 2009), las citoquinas (Nam et al., 2012) y las giberelinas (Oliferuk et al., 2017) están implicadas en la señalización de la disponibilidad de potasio, afectando a la expresión de genes, la disminución del crecimiento de la raíz primaria y de raíces laterales, y al aumento del número y crecimiento de pelos radicales. Las vías de estas hormonas se entrecruzan y producen cierta sinergia que asegura la Introducción 54 ejecución de respuestas precisas al estrés que supone la falta de potasio tal y como ilustran diversas publicaciones (Cai et al., 2014; Guo & Ecker, 2004). El KSN (o K+-Sensing Niche) Dada la complejidad de la respuesta al hambre de potasio, la coordinación de la misma debe ser finamente regulada. Recientemente ha sido descubierto un nicho sensor de potasio o KSN (K+-Sensing Niche) formado por células Figura I.6: Mecanismos de sensing de hambre de potasio. La falta de potasio induce una hiperpolarización de la membrana plasmática, que supone uno de los primeros eventos de señalización de hambre de potasio. Esta hiperpolarización activa la expresión de HAK5. Además, el bajo potasio produce una señal de etileno, así como la generación de ROS que también inducen la expresión de HAK5. La falta de potasio también está relacionada con el incremento de calcio citosólico, probablemente por la activación de canales de calcio de la membrana plasmática y endomembranas. Por otra parte, el factor de transcripción ARF2 regula negativamente la transcripción de HAK5 en condiciones de suficiencia de potasio, mientras que en hambre de potasio este factor se fosforila, impidiendo su unión al promotor de HAK5. Introducción 55 meristemáticas/posmeristemáticas de la raíz, que orquestaría la respuesta a este estímulo en concreto (Wang et al., 2021). Las células del KSN funcionarían como un nodo integrador, desde donde se coordinaría tanto la respuesta a corto como a largo plazo al hambre de potasio. Además, la secuencia de señalización del KSN sirve para ilustrar a pequeña escala el sofisticado engranaje de señales que tiene lugar en la raíz para llevar a cabo las respuestas adaptativas a hambre de potasio. Se ha propuesto el siguiente mecanismo sensor de potasio en el KSN: cuando disminuye el potasio en el medio, el contenido de potasio de las células del KSN decae rápidamente, en los primeros 60 segundos, y se mantiene a esos niveles hasta 48 horas si la planta sigue expuesta al estímulo. La disminución de la disponibilidad de potasio desencadena la hiperpolarización de la membrana plasmática, lo que a su vez produce la activación instantánea de los canales de calcio. Esta subida en los niveles de calcio citosólico activa la transcripción de CIF2, un péptido hormonal que conduce a la formación y activación mediante fosforilación del complejo con actividad quinasa SGN3-SGN1. Estas quinasas activan distintas NADPH oxidasas que participan en la formación de ROS involucradas en las respuestas celular y tisular. Concretamente, SGN3-SGN1 activa por una parte a RBOHC y RBOHD, imprescindibles para activar la transcripción de HAK5 en condiciones de falta de potasio, y por otra parte también activa RBOHF que participa en la formación de la banda de Caspari. Mecanismos de regulación post-traduccional de la toma de potasio en raíces La toma de potasio a través de las raíces tiene varias capas de regulación. El sistema de alta afinidad, fundamentalmente mediado por HAK5, tiene una regulación transcripcional como se ha visto en el apartado anterior. La carencia de diversos nutrientes puede dar lugar a una inducción transcripcional de HAK5, sin embargo, solo el hambre de potasio es capaz de activar la acción de ciertos canales y transportadores (Nieves-Cordones et al., 2019; Raddatz et al., 2020; Ragel et al., 2019). Por ello, la regulación post-traduccional es fundamental para la adquisición de potasio. Capacidad de formación de heterómeros. La heteromerización es un mecanismo de regulación de los canales de potasio (Lebaudy et al., 2008; Sharma et al., 2013). Este fenómeno permite generar canales de potasio con diversas propiedades en cuanto a su cinética de activación y dependencia del voltaje, lo que otorga cierta flexibilidad a las células para responder a los estímulos del medio. Introducción 56 Como se ha comentado en apartados anteriores, los canales tipo Shaker funcionan como tetrámeros. La subunidad α de KC1 se expresa en las células del córtex, la epidermis y los pelos de las raíces; es silente por sí sola pero interactúa con los canales AKT1, AKT2, KAT1 y KAT2 (Reintanz et al., 2002). Los heterotetrámeros AKT1/KC1 son los mejor estudiados hasta el momento. Aunque AKT1 tiene la capacidad de inhibir el flujo reversible de potasio para evitar la pérdida del nutriente cuando el gradiente electroquímico es de salida (rectificación de entrada o inward-rectification), el alto potencial de membrana que se genera en ausencia de potasio externo puede mantener el canal AKT1 abierto y provocar la pérdida de potasio celular. La interacción con KC1 regula la dependencia de voltaje de AKT1 desplazándolo hacia potenciales de apertura más electronegativos lo que previene la pérdida de potasio en condiciones de bajo potasio (Geiger et al., 2009 a). Modificaciones postranscripcionales Fosforilación por quinasas Existen tres familias de quinasas implicadas en la regulación de la actividad de los sistemas de transporte de potasio: la familia CDPK/CPK (Calcium-Dependent Protein Kinase), la familia SnRK2 (SNF1-Related protein Kinase 2) y la familia SnRK3 o CIPK (Calcineurin B-like-Interacting Protein Kinase). Todas ellas regulan los sistemas de transporte de potasio en respuesta a diferentes estímulos, tales como deficiencia de potasio, sequía, estrés osmótico y salinidad (Chérel & Gaillard, 2019). La familia CDPK/CPK cuenta con treinta y cuatro miembros en Arabidopsis. En su C- terminal contienen un dominio CaM-LDs (Calmodulina Like Domain) que posee motivos EF- hand de unión a calcio. Cuando los niveles de calcio en el citosol son bajos, las quinasas se autoinhiben. El aumento del calcio citosólico provoca la unión de calcio al dominio EF-hand, que conduce a cambios conformacionales que cesan la auto-inhibición (Boudsocq & Sheen, 2013). Las familias de proteín quinasas SnRK2 y SnRK3 poseen dos dominios bien diferenciados en todos los miembros de la familia: un dominio N-terminal catalítico, conservado entre proteínas (42-45% de identidad); y un dominio C-terminal regulador (Halford & Hey, 2009). La regulación sobre el dominio N-terminal es común a todos los miembros y supone el mecanismo de activación/inactivación de la actividad de la proteína. En cambio, el dominio C-terminal presenta marcadas diferencias entre familias, lo que permite que la regulación de la actividad sea muy variable y genera diferentes rutas regulatorias para cada proteína. La familia SnRK2 posee 10 miembros en Arabidopsis. Uno de ellos, OST1, se ha identificado como un regulador positivo de los movimientos del estoma dependientes de Introducción 57 ABA. Mediante su interacción con KAT1 y SLAC1 favorece el cierre estomático en respuesta a esta hormona, provocando la inactivación del canal de potasio y la activación del canal aniónico SLAC1 (Acharya et al., 2013). La familia SnRK3 o CIPK necesita de su interacción con las proteínas CBL (Calcineurin B-Like) para activarse. Existen 26 CIPKs y 10 CBLs en Arabidopsis thaliana, cada una con su perfil de expresión y localización celular. Por ser fundamentales en la regulación de la toma de potasio en raíces se explicarán con más detalle. El dominio N-terminal de las CIPKs contiene un dominio quinasa serina/treonina, con un lazo de activación que contiene entre 1 y 3 residuos fosforilables por otras quinasas de rango superior y desconocidas en gran parte (Shen & Yen, 2009). Por ejemplo, se ha demostrado que las quinasas GRIK1/2 (Geminivirus Rep-Interacting Kinase) fosforilan y activan a SnRK1.1 y a SnRK3.11/CIPK24/SOS2 (Barajas-Lopez et al., 2018). La fosforilación de los residuos en el lazo de activación conduce a un cambio conformacional imprescindible para la reacción de catálisis y la activación de la quinasa (Nolen et al., 2004). Por otra parte, el dominio regulador C-terminal de las SnRK3/CIPK está formado por un dominio autoinhibidor de 21 aminoácidos (NAF/FISL) y un dominio PPI (Protein-Phosphatase Interaction). La interacción de la CBL con el dominio NAF de la CIPK suprime su autoinhibición (Albrecht et al., 2001; Chaves-Sanjuan et al., 2014; Halfter, 2000). Se ha sugerido que las variaciones en la secuencia del motivo NAF podrían ser las responsables de la especificidad de la interacción CBL-CIPK (Sánchez-Barrena et al., 2013). El dominio PPI es el responsable de la interacción con fosfatasas, implicadas en la regulación negativa de su actividad (Ohta et al., 2003). Las proteínas CBL son sensores de calcio. La unión de calcio provoca un cambio conformacional que les permite interaccionar con sus proteínas diana, activándolas y reclutándolas al sitio de acción (Sánchez-Barrena et al., 2013). Estudios recientes exploran la posibilidad de que las CBL posean distintas afinidades por el calcio para llevar a cabo respuestas específicas (Beckmann et al., 2016). Las proteínas CBL poseen dominios de unión a calcio consistente en 4 estructuras EF-hand y un dominio PFPF, donde un residuo de serina conservado es fosforilado por las CIPKs (Du et al., 2011). Para ser completamente activa, la CBL debe ser fosforilada por la CIPK con la que interacciona (Hashimoto et al., 2012). Algunas CBL poseen el motivo N-terminal MGCxxxS/T, donde ocurren modificaciones lipídicas que controlan su capacidad de asociarse a las distintas membranas celulares y dictan su localización subcelular (Batistič & Kudla, 2012; Song et al., 2018; Villalta et al., 2021). Además, algunas CBL son capaces de interaccionar directamente con proteínas transportadoras de potasio. Tal es el caso de CBL1, 4, 9 y 10, que son capaces de interaccionar con AKT1 para modular su actividad (Grefen et al., 2010; Ren et al., 2013). Una de las SnRK3/CIPK más estudiadas es CIPK23, que en su asociación con CBL1/9 es fundamental para la regulación de la toma de potasio en raíces. La disminución del potasio en el medio genera un aumento en la concentración citosólica de calcio (Wang et al., 2021). El calcio citosólico activa a CBL1/9 y posibilita su interacción con CIPK23. La miristoilación N-terminal de las CBL1 y 9 dirige el complejo CBL1/9-CIPK23 a la membrana Introducción 58 plasmática, donde fosforila tanto a AKT1 como a HAK5 (Ragel et al., 2015; Ródenas & Vert, 2021; Xu et al., 2006). La activación de HAK5 produce un incremento en la afinidad y la Vmax del transporte de potasio, asegurando la entrada de potasio a la célula a concentraciones por debajo de 0,1 mM (Nieves-Cordones, et al., 2014; Ragel et al., 2015), mientras que la fosforilación de AKT1 resulta en una activación del canal (mayor probabilidad de apertura), lo que maximiza el influjo de potasio (Xu et al., 2006). Como se ha mencionado anteriormente, AKT1 y HAK5 median la entrada de potasio en las raíces, pero actúan a diferentes concentraciones exteriores de potasio, por lo que la coordinación entre ambos debe ser precisa. La posibilidad de que actúen uno u otro probablemente se deba a que CIPK23 tiene distintos niveles de activación en función de qué factores conduzcan a su fosforilación por otras quinasas y a la unión de CBL (Barajas- Lopez et al., 2018; Chaves-Sanjuan et al., 2014). Así, una falta intermedia, no severa, de potasio podría producir una CIPK23 parcialmente activada, lo que es congruente con la activación de AKT1 (que maximiza el influjo de potasio) pero no de HAK5, mientras que una falta severa de potasio conduce a la transcripción de HAK5, la completa activación de CIPK23 y la fosforilación de HAK5, lo que produce un incremento en la afinidad y la Vmax del transporte de potasio, asegurando la entrada de potasio dentro de la célula a concentraciones por debajo de 0,1 mM (Ragel et al., 2015). La regulación que CBL1/9-CIPK23 lleva a cabo sobre HAK5 no se limita a su fosforilación para activarla. Este complejo parece estar implicado también en el tráfico del transportador hasta la membrana plasmática. HAK5 se detecta en el retículo endoplásmico de plantas crecidas en condiciones de suficiencia de potasio, mientras que la falta de potasio conduce a la aparición de HAK5 en la membrana plasmática (Qi et al., 2008). En este transporte también parece estar implicada la proteína Raf-like MAPKK quinasa llamada ILK1 (Integrin-Linked Kinase 1), que interacciona con CBL9 y promueve la maduración y el transporte de HAK5 del retículo endoplásmico a la membrana plasmática (Brauer et al., 2016). Interacción con fosfatasas y otras proteínas Las fosfatasas 2C (PP2Cs) son fosfatasas serina/treonina dependientes de Mg2+ y Mn2+ que juegan un papel relevante en el transporte de potasio mediante su interacción con canales o con complejos con actividad quinasa como CBL/CIPK (Chérel & Gaillard, 2019). Existen varios ejemplos de esa influencia: AIP1/HAI2 interacciona con AKT1, lo que provoca su inhibición en ovocitos de Xenopus (Sung et al., 2007); la fosfatasa PP2CA interacciona con AKT2/3 (Chérel et al., 2002; Vranová et al., 2001) y GORK (Lefoulon et al., 2016). Por otra parte, el canal silente de tipo Shaker KC1 es regulado por SYP121 y VAMP721, dos proteínas SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor protein Introducción 59 Attachment protein Receptor) que promueven la apertura del canal heteromérico AKT1/KC1 posibilitando la absorción de potasio (Zhang et al., 2015). SYP121 podría estar implicada también en la modulación del tráfico vesicular de AKT1 a la membrana plasmática (Grefen et al., 2010). Recientemente se ha encontrado una interacción proteína-proteína entre canales aniónicos y canales de potasio en el contexto del movimiento estomático. Los canales aniónicos SLAC1 y SLAH3 (responsables del cierre estomático) interactúan directamente con el canal KAT1 (principal partícipe de la apertura estomática), inhibiendo su actividad durante el cierre del estoma (Zhang et al., 2016). El nitrato como nutriente y molécula señalizadora El nitrato y el amonio son las dos principales fuentes de nitrógeno en las plantas. Bajo condiciones aerobias, el nitrato es la forma predominante en la que el nitrógeno se encuentra en el suelo. La concentración de nitrato en el suelo es muy variable, y puede abarcar desde 0,1 mM hasta 20-30 mM en suelos fertilizados. El nitrato entra principalmente en las células en combinación con protones a través de transportadores de las familias NRT (Nitrate Transport) NRT1/NPF y NRT2 (Raddatz 2020). La actividad de transporte de los transportadores de nitrato caracterizados se fomenta al disminuir el pH de la solución externa, y se suprime al aumentar el pH (Miller et al., 2007). Sin embargo, los medios excesivamente ácidos son tóxicos para algunas plantas, por lo que este balance es complicado (Fan et al., 2017; Fang et al., 2016). El nitrógeno es un macronutriente que forma parte de múltiples compuestos orgánicos como aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos (Mengel et al., 2001). Para ser incorporado a los aminoácidos, el nitrato tiene que reducirse a nitrito por la nitrato reductasa presente en el citosol. Luego el nitrito es reducido a amonio por la nitrito reductasa en plástidos o cloroplastos, para ser posteriormente incorporado a los aminoácidos a través de la vía GS-GOGAT (Glutamine-synthetase - glutamate synthase) (Wang et al., 2018). Tanto el exceso de nitrito como de amonio es tóxico para las plantas, por lo que estos pasos de asimilación deben estar coordinados a nivel celular con la toma de nitrógeno y el estatus del carbono, que es el andamio para la síntesis de aminoácidos. Además de macronutriente, el nitrato sirve también como una molécula señalizadora que regula numerosos procesos: induce la germinación de las semillas (Alboresi et al., 2005), favorece la expansión foliar (Walch-Liu et al., 2000), regula el desarrollo de las raíces laterales (Zhang & Forde, 2000), coordina la expresión de genes relacionados con el transporte y asimilación de nitrato (Wang et al., 2000) o con el metabolismo de aminoácidos, nucleótidos y otros nutrientes (como el carbono, sulfato, fosfato y hierro) (Wang et al., 2003), por lo que es necesaria una red de regulación génica jerarquizada capaz de orquestar las respuestas correctamente (Ristova et al., 2016). Introducción 60 El nitrato regula una respuesta transcripcional llamada Respuesta Primaria a Nitrato o PNR (Primary Nitrate Response), que se induce por nitrato y no requiere la síntesis de proteínas de novo (Wang et al., 2004). Esta respuesta puede inducir la expresión de genes rápidamente, alcanzando un pico aproximadamente a los 30 minutos. La PNR induce la activación de genes y proteínas implicadas en la asimilación de nitrato (NIR de nitrito reductasa, NIA1 y NIA2 de nitrato reductasa), transportadores de nitrato de la familia NRT1/NPF y NRT2, y genes implicados en la ruta de las pentosas fosfato, glicólisis y otros que proporcionan esqueletos carbonados y poder reductor. Otra respuesta al nitrato bien caracterizada es el desarrollo radicular o RSA (Root-System Architecture), que implica la iniciación y elongación de las raíces laterales, el crecimiento de pelo radical y el desarrollo de la raíz primaria. Para adquirir nitrato eficientemente, la señalización local y sistémica de nitrato tiene que estar integrada a través de comunicación a larga distancia que permita orquestar el crecimiento de las raíces en respuesta a la concentración desigual de nitrato en el suelo. Es necesario tener en cuenta que estas respuestas no son de todo o nada, sino que la magnitud y especificidad de la misma depende directamente de la concentración de nitrato en el suelo. Así, la RSA es una respuesta plástica: la ausencia de nitrato detiene el crecimiento de la raíz, mientras que un nivel moderado de nitrato promueve la elongación de las raíces laterales y niveles altos de nitrato atenúan dicha elongación (Liu et al., 2020). Proteínas transportadoras de nitrato Para lidiar con las concentraciones variables de nitrato en el suelo, en los tejidos y en el interior celular, las plantas cuentan con multitud de proteínas transportadoras. Hasta el momento se han identificado cuatro familias de proteínas capaces de transportar nitrato: NRT1/NPF (Nitrate transporter 1/ Peptide transporter Family), NRT2, CLC (Cloride channel family) y SLAC/SLAH (SLow Anion Channel-associated 1). Sólo 24 de los 73 genes que pertenecen a estas 4 familias codifican para transportadores de nitrato (Fan et al., 2017). Las plantas han desarrollado sistemas de transporte de alta afinidad (HATS, High- Affinity Transport System, con KM en el rango µM) y sistemas de transporte de baja afinidad (LATS, Low-Affinity Transport System, con KM en el rango 2 – 12 mM) para la adquisición y distribución de nitrato. Cuando la concentración externa de nitrato es alta (p.e., >1 mM), se utilizan los sistemas LATS, mientras que los sistemas HATS son inducidos y activados a concentraciones bajas de nitrato (Crawford & Glass, 1998; Glass et al., 1992). Dos familias de proteínas, NRT1/NPF y NRT2 han sido identificadas como responsables del LATS y el HATS respectivamente. La excepción a esta regla es NRT1.1/NPF6.3, que es un transportador con un amplio rango de afinidad por el nitrato además de un transceptor (transportador y sensor) de nitrato en función de su estado de fosforilación; y NRT2.7, que a pesar de pertenecer a la familia NRT2 manifiesta una afinidad baja por el nitrato (Chopin et al., 2007; Orsel et al., 2002; Tsay et al., 2007). Tanto los NRT1/NPF como los NRT2 parecen transportar nitrato acoplado a protones para mantener el transporte del nutriente Introducción 61 sin tener en cuenta las limitaciones termodinámicas impuestas por el gradiente de nitrato a través de la membrana biológica (Orsel et al., 2002; Paulsen & Skurray, 1994). En las raíces, cuatro transportadores NRT2 (NRT2.1, NRT2.2, NRT2.4 y NRT2.5) dirigen el 95% del transporte de nitrato de alta afinidad, mientras que NRT1.1/NPF6.3 y NRT1.2/NPF4.6 son los responsables del transporte de baja afinidad (Cerezo et al., 2001; Kiba et al., 2012; Kiba & Krapp, 2016; Lezhneva et al., 2014; Li et al., 2007). Familia NRT1/NPF NRT1 pertenece a la familia NPF (Nitrate transporter 1/Peptide transporter Family), que incluye también proteínas de bacterias, hongos y animales. Comparten cierta homología en su secuencia, que ha supuesto la base para su organización en clados diferentes (Léran et al., 2014; Wen et al., 2020). Esta homología no tiene correlación con su selectividad por diferentes sustratos. Cada NPF posee 2 números en su identificación: el primer número hace referencia al clado al que pertenece y el segundo número a la posición filogenética dentro de este clado. El segundo número no implica relaciones, localización cromosomal ni orden de caracterización dentro del grupo (Léran et al., 2014). Estructuralmente, los NPF poseen 12 dominios transmembrana, y los NPFs vegetales poseen además un largo lazo hidrofílico entre los segmentos transmembrana TM6 y TM7 (Tsay et al., 2007). La estructura atómica de NRT1.1/NPF6.3 ha sido parcialmente resuelta (Parker & Newstead, 2014; Sun et al., 2014), y este lazo contiene tres residuos conservados cargados positivamente, Arg264-Arg266-Lys267, que podrían estar implicados en estabilizar el homodímero en el lado intracelular. La estructura de NRT1.1/NPF6.3 muestra dos agrupaciones estructurales (bundles) con topología similar pero distintas funciones. El dominio (bundle) N-terminal está muy conservado en la familia y en él aparecen los residuos relacionados con la unión de protones, mientras que el dominio C-terminal presenta una mayor variabilidad que se ha relacionado con el reconocimiento de los distintos y variados sustratos que esta familia es capaz de transportar (Parker & Newstead, 2014). La familia NPF cuenta con 53 miembros en Arabidopsis thaliana. Estas proteínas pueden transportar una amplia variedad de sustratos, entre los que se encuentran dipéptidos, nitrato, nitrito, cloruro, glucosinolatos y aminoácidos, así como varias hormonas vegetales como auxina (IAA), ácido abscísico (ABA), jasmonatos (JAs) y giberelinas (GAs) (Corratgé-Faillie & Lacombe, 2017). De ellas, sólo 17 proteínas han sido identificadas como transportadores de nitrato hasta el momento (Fan et al., 2017; Léran et al., 2015). Estos transportadores manifiestan el mismo comportamiento: las corrientes son mayores a pH ácido y se cree que la estiquiometría de este flujo es 1 NO3 -: 2 H+. De los 17 NPFs que transportan nitrato, 12 son transportadores de entrada, dos son transportadores de salida (NPF2.3 y NPF2.7), y tres son bidireccionales al menos cuando se han testado en Introducción 62 ovocitos de X. laevis (NRT1.4/NPF6.2, NRT1.1/NPF6.3 y NRT1.5/NPF7.3). Además de transportar nitrato, alguno de ellos también puede transportar otros sustratos, como glucosinolatos, ABA, auxina o nitrito (Corratgé-Faillie & Lacombe, 2017). Resulta complicado encontrar generalidades en la estructura compartidas entre todos los NPF que transportan nitrato. Por ejemplo, mientras que el residuo His356 es necesario para el transporte de nitrato llevado a cabo por NRT1.1/NPF6.3 (Newstead, 2017; Parker & Newstead, 2014; Sun et al., 2014), no está conservado en la mayoría de los NPF que transportan nitrato y sólo se conserva en algunos miembros vegetales de la familia (Hu et al., 2015; Wen et al., 2017). Por otra parte, el motivo ExxER está altamente conservado en la familia NPF, y se ha sugerido que es un componente estructural esencial para la unión de protones acoplada al transporte de los NPF (Jørgensen et al., 2017; Solcan et al., 2012). Por lo tanto, no se puede concluir a priori que un NPF es un transportador de nitrato basándose exclusivamente en su secuencia de aminoácidos. NRT1.1/NPF6.3, su papel fundamental en las raíces NRT1.1/NPF6.3/CHL1 es el transportador de nitrato más estudiado (Parker & Newstead, 2014; Sun & Zheng, 2015; Tsay et al., 2007). NRT1.1/NPF6.3 se expresa en la membrana plasmática de células de la raíz, donde media la entrada de nitrato o auxina (Bouguyon et al., 2015; Krouk et al., 2010); en los estomas, donde tiene una función en la movilidad de las células guarda (Ohta et al., 2003) y en otros tipos celulares localizados en la parte aérea (Guo et al., 2001). NRT1.1/NPF6.3 ha sido caracterizado como un transportador de nitrato de afinidad dual (Ho & Frommer, 2014; Liu et al., 1999). En condiciones de alta disponibilidad de nitrato (>1 mM), NRT1.1/NPF6.3 se comporta como un transportador de baja afinidad (Km aprox 4 mM). Sin embargo, cuando la concentración exterior de nitrato decae por debajo de 1 mM, NRT1.1/NPF6.3 es fosforilado por CIPK23 en su residuo Thr101, lo que provoca un cambio del transportador hacia la alta afinidad (Km aprox 40 µM) (Ho et al., 2009; Liu et al., 1999). Esta treonina está conservada en algunos miembros de la subfamilia NPF6, como los homólogos en maíz ZmNPF6.6 (residuo Thr104), ZmNPF6.4 (residuo Thr106) o el transportador de Arabidopsis NRT1.4/NPF6.2 (residuo Thr98). La alteración de estos residuos tiene diferentes efectos en función del transportador o del sustrato que mueva: los mutantes fosfomimético (T104D) y fosfodeficiente (T104A) de ZmNPF6.6 poseen una Km por el nitrato inferior a la de la proteína canónica; mientras que los mutantes ZmNPF6.4T106A y ZmNPF6.4T106D carecen de la saturación del transporte de cloruro presente en la versión silvestre del transportador (Wen et al., 2017). La estructura cristalina de NRT1.1/NPF6.3 revela un dímero, cuyo dinamismo de acoplamiento y desacoplamiento se cree que es controlado a través de la fosforilación del Introducción 63 residuo Thr101 por CIPK23 (Ho et al., 2009; Parker & Newstead, 2014; Sun et al., 2014) (Figura I.7). Se ha sugerido que NRT1.1/NPF6.3 no fosforilado es un transportador de nitrato de baja afinidad que funciona como un dímero, mientras que el transporte de alta afinidad es llevado a cabo por los monómeros fosforilados de la proteína. Rashid et al. (2019) propone que, en presencia de concentraciones bajas de nitrato, la unión de nitrato por un sólo monómero de NRT1.1/NPF6.3 conduce a la disociación del dímero y expone el residuo Thr101. Este residuo queda entonces disponible para la fosforilación por CIPK23, que conduce a la estabilización del estado monomérico del transportador. Por el contrario, a altas concentraciones de nitrato la unión del sustrato a ambos monómeros simultáneamente estabiliza el dímero y disminuye la exposición de Thr101 a CIPK23. NRT1.1/NPF6.3 permanecería entonces en su conformación dimérica de baja afinidad por el nitrato. Por tanto, sería la baja disponibilidad del sustrato lo que induciría el cambio de fase de dímero a monómero. Este cambio a monómero favorece la fosforilación para estabilizar la nueva conformación, que también produce una señal de calcio que refuerza la señal de bajo nitrato, estimulando la actividad de CIPK23 dependiente de CBL1-9 (Rashid et al., 2020). La aportación de NRT1.1/NPF6.3 como transportador de alta afinidad en la raíz es minoritaria, ya que el 95% del transporte de alta afinidad se cubre por los transportadores pertenecientes a la familia NRT2 localizados en la raíz. Por ello, el cambio de afinidad de NRT1.1/NPF6.3 in planta resulta controvertido y ha sido negado por otros autores que restringen esta transición de NRT1.1/NPF6.3 a su papel señalizador de la disponibilidad de nitrato (Noguero et al., 2018; Wen & Kaiser, 2018). Figura I.7: Transición entre los estados dimérico y monomérico del transportador NRT1.1/NPF6.3 dependiente de la disponibilidad de nitrato de la fosforilación por CIPK23. El acoplamiento y desacoplamiento del dímero genera ondas específicas de calcio que activan a la kinasa CIPK23, lo que influye en el estado de fosforilación del transportador. Adaptación de Rashid et al. (2020). Introducción 64 Además de transportar nitrato, NRT1.1/NPF6.3 dirige el desarrollo de la raíz o RSA en respuesta a la disponibilidad de nitrato por medio de su capacidad para transportar auxina (Mounier et al., 2014; Remans et al., 2006). En este transporte también participa la quinasa CIPK23 y la fosfatasa 2C ABI2, y se conocen algunos residuos claves en NRT1.1/NPF6.3 para llevar a cabo esta actividad, como Pro492 (necesario para que el transportador alcance la membrana plasmática) o Thr101, la diana de CIPK23 (Bouguyon et al., 2015; Bouguyon et al., 2016). Cuando hay poco nitrato disponible en el medio, el complejo CBL1/9-CIPK23 fosforila NRT1.1/NPF6.3, que media la salida de auxina del primordio lateral de raíces, lo que reprime el desarrollo de raíces laterales. Sin embargo, la presencia de nitrato en el medio activa ABI2, que defosforila el complejo CBL1/9-CIPK23, evitando la fosforilación de NRT1.1/NPF6.3 e inhibiendo la toma de auxina dependiente de este transportador, lo que estimula el desarrollo de raíces laterales. Además, ABI2 también es necesaria para la expresión de NRT2.1 (Léran et al., 2015). Familia NRT2 Las proteínas de la familia NRT2 pertenecen a la superfamilia MFS (Major Facilitator Superfamily). También tienen 12 dominios transmembrana formados por alfa hélices, y un lazo citoplásmico central (Forde, 2000). Como se ha mencionado, los NRT2 llevan a cabo el transporte de alta afinidad de nitrato (a excepción de NRT2.7), y no se les conoce otro sustrato por el momento. La afinidad por el nitrato de estos transportadores se localiza en el rango micromolar, saturándose entre los 0,2-0,5 mM. En Arabidopsis, esta familia cuenta con al menos 7 miembros (Miller et al., 2007). Todos, salvo NRT2.7, necesitan la acción de la proteína NAR2.1 (Nitrate Assimilation Related protein) para colocarse en la membrana plasmática y mantener la estabilidad de la proteína (Kotur et al., 2012). Están implicados en la toma de nitrato del suelo, en el transporte al floema (Kiba et al., 2012), en la regulación del nitrato en semillas (Chopin et al., 2007) y en la interacción planta-microbio (Dechorgnat et al., 2012; Kechid et al., 2013). Canales SLAC/SLAH Esta familia de canales aniónicos está compuesta por 5 miembros en Arabidopsis, SLAC1 y SLAH1-4 (SLAC Homolog 1-4) (Krapp et al., 2014). En general, estas proteínas se localizan en la membrana plasmática, a falta de determinar la localización subcelular de SLAH4 (Negi et al., 2008). SLAC1 y SLAH3 se localizan en las células guarda, donde llevan a cabo la salida de nitrato y cloruro necesaria para el cierre estomático en respuesta a ABA (Geiger et al., 2011). SLAH3 también se expresa en las células del mesófilo (Demir et al., 2013), en los granos de polen y en el tubo polínico de Arabidopsis (Gutermuth et al., 2013). SLAH2, que transporta únicamente nitrato, se expresa en las células de la estela de las Introducción 65 raíces donde probablemente facilite la entrada de nitrato en el xilema (Maierhofer et al., 2014). La expresión de SLAH1 y SLAH4 también se circunscribe al cilindro vascular, como atestiguan los experimentos llevados a cabo con el gen reportero GUS en Negi et al., (2008) y Zheng et al., (2015). Canales y Transportadores CLC Las proteínas CLC (ChLoride Channel) constituyen una ubicua y extensa familia de transportadores que median el transporte dependiente de voltaje de cloro (animales) y otros aniones (nitrato en plantas) en todas las membranas celulares. Estas proteínas pueden funcionar como canales de aniones o como intercambiadores anión/H+ aunque todas ellas comparten una estructura similar. Sus funciones principales son el transporte aniónico para el balance eléctrico celular y del potencial eléctrico de membrana, y para el control del pH. La familia de transportadores CLC cuenta con 7 miembros en Arabidopsis, CLCa-g, todos ellos localizados en membranas intracelulares (Nedelyaeva et al., 2020). La selectividad por cloruro o nitrato se debe principalmente a la presencia de serina o prolina en su filtro de selectividad (Bergsdorf et al., 2009; Wege et al., 2010). El motivo GSGxPE en este dominio determina el transporte de cloro, mientras que la secuencia GPGxPE confiere especificidad por nitrato. Los transportadores CLCa–CLCc y CLCg se localizan en tonoplasto. La proteína CLCa funciona como un antiporte 2 NO3 -/1 H+ y es un componente principal en la acumulación de nitrato en las vacuolas (Chopin et al., 2007; De Angeli et al., 2006; Monachello et al., 2009). La proteína CLCc se expresa preferentemente en células guarda donde contribuye a los movimientos estomáticos (Jossier et al., 2010). Distribución in planta de nitrato Entrada de nitrato a través de las raíces Cuatro transportadores NRT2 (NRT2.1, NRT2.2, NRT2.4 y NRT2.5) (Kiba et al., 2012; Kiba & Krapp, 2016; Lezhneva et al., 2014; Orsel et al., 2002) y dos transportadores NRT1/NPF (NRT1.1/NPF6.3 y NRT1.2/NPF4.6) son los principales componentes de la toma de nitrato de alta y baja afinidad respectivamente en las raíces de Arabidopsis (Figura I.8). Estas proteínas se localizan en la membrana plasmática, y su contribución al transporte de nitrato depende del estadío del desarrollo y de los niveles de nitrato en la planta. NRT2.1, localizado en las células de la epidermis y las células corticales de raíces maduras, es el componente principal de HATS en multitud de condiciones (Li et al., 2007). Su expresión es dependiente de la disponibilidad de nitrato y se regula por diferentes condiciones: se induce por nitrato, formando parte del transporte de alta afinidad inducible (Filleur & Daniel-Vedele, 1999), se reprime por altas concentraciones de nitrato o nitrógeno (Krouk et al., 2006; Muños et al., 2004) o se expresa brevemente en respuesta a la deficiencia de Introducción 66 nitrato (Cerezo et al., 2001; Crawford & Glass, 1998). NRT2.2 parece seguir el mismo patrón de expresión que NRT2.1. En cambio, NRT2.4 se expresa en condiciones de hambre de nitrato de larga duración, se localiza en la epidermis de las raíces laterales y su afinidad permite captar las pequeñas cantidades de nitrato que queden en el suelo (Kiba et al., 2012). El nitrato también se puede excretar de las raíces a través de NPF2.7/NAXT1, localizado en las células corticales de la raíz (Segonzac et al., 2007). La función biológica de esta pérdida aún se desconoce. Transporte acrópeto y basípeto raíz-tallo Para ser transportado a la parte aérea, el nitrato tiene que cargarse en los vasos del xilema en la raíz y ascender con el flujo xilemático dirigido por la transpiración. Esta función la llevan a cabo NRT1.5/NPF7.3 y NPF2.3, que se expresan en las células del periciclo que Figura I.8: Patrones de expresión de los principales canales y transportadores de nitrato en A. thaliana. Las flechas indican la dirección del flujo de nitrato. En raíces y hojas el xilema se marca en azul y el floema en rojo. Figura adaptada de Wang et al. (2018). Introducción 67 rodean al protoxilema (Lin et al., 2008; Taochy et al., 2015). Por el contrario, NRT1.8/NPF7.2 y NRT1.9/NPF2.9, expresados en las células parenquimáticas del xilema y en las células acompañantes, son los responsables del flujo de nitrato hacia las células de la raíz (Li et al., 2010; Wang & Tsay, 2011) (Figura I.8). En condiciones de estrés (salinidad, sequía, o presencia de cadmio) la expresión de NRT1.5/NPF7.3 en las raíces disminuye y se reduce la carga de nitrato al xilema que sólo es mediada por NPF2.3, mientras que la expresión de NRT1.8/NPF7.2 aumenta en las raíces para fomentar la vuelta de nitrato a esta zona. Este mecanismo coordinado se conoce como SINAR (Stress-INitiated Allocation to Roots), es importante para la aclimatación al entorno de la planta y se regula mediante ácido jasmónico y etileno (Zhang et al., 2014). Entrada de nitrato en las hojas Una vez en la parte aérea, el nitrato puede ser almacenado o asimilado. En la nervadura del peciolo se localiza NRT1.4/NPF6.2, un transportador bidireccional que regula el almacenamiento de nitrato en el peciolo y el flujo hacia la lámina, donde contribuye a la expansión celular (Chiu et al., 2004). Por otra parte, la movilización de nitrato de las hojas maduras a los tejidos en desarrollo es fundamental para el crecimiento de la planta bajo condiciones de hambre de nitrato. En las hojas maduras, NRT1.7/NPF2.13 y NRT2.4 están implicados en la carga del nitrato en el floema de las hojas senescentes (Fan et al., 2009; Kiba et al., 2012). La transferencia de nitrato del xilema al floema también es crucial para este proceso, y es llevada a cabo por NRT1.12/NPF1.1 y NRT1.11/NPF1.2, que se expresan en las células acompañantes de las nervaduras de las hojas expandidas (Hsu & Tsay, 2013) (Figura I.8). Desarrollo de semillas NRT1.6/NPF2.12, NPF5.5 y NPF2.7 se localizan en el tejido vascular de las sílicuas, asegurando la entrada de nitrato en las semillas en desarrollo (Almagro et al., 2008). Vacuolas Una vez en el lugar de destino, el nitrato puede ser asimilado o almacenado en las vacuolas (Martinoia et al., 2012). El transportador de nitrato de baja afinidad NRT2.7 y el antiportador CLCa han sido identificados como los principales responsables de la entrada de nitrato en las vacuolas. Introducción 68 Por otra parte, NPF5.11, NPF5.12 y NPF5.16 también se localizan en el tonoplasto y probablemente medien la salida de nitrato de las vacuolas (He et al., 2017). NRT2.7, localizado en el tonoplasto, se expresa en las semillas secas y probablemente promueva la entrada de nitrato en la vacuola (Chopin et al., 2007) (Figura I.8). Mecanismos de señalización de nitrato Se han identificado diversas moléculas implicadas en la señalización de nitrato, incluido el transceptor (transportador y receptor) NRT1.1/NPF6.3, señales de calcio, proteín quinasas y varios factores de transcripción (Liu et al., 2020). Sin embargo, la percepción de nitrato regula en última instancia una plétora de respuestas fisiológicas, por lo que la propagación de la señal tiene varios niveles y no en todos ellos se conocen los factores implicados. Además, la respuesta a nitrato es muy dinámica y altamente específica a nivel celular y tisular, de modo que es necesaria la implicación de moléculas capaces de trasladarse a lo largo de toda la planta (Walker et al., 2017). En primer lugar, los niveles de nitrato externo son percibidos por el transceptor NRT1.1/NPF6.3, cuya influencia se ha confirmado tanto en la respuesta PNR como en la arquitectura de la raíz (Bouguyon et al., 2015; Ho et al., 2009). En un estudio llevado a cabo por Wang et al. (2009) se observó que la mutación en el gen NRT1.1/NPF6.3 provocó la regulación anormal de 113 genes implicados en la respuesta a nitrato. Como hemos mencionado anteriormente, la proteína NRT1.1/NPF6.3 posee un largo lazo citosólico entre sus dominios transmembrana 6 y 7, que se ha propuesto como un sitio de docking para que otras proteínas interaccionen con él y regulen la actividad de NRT1.1/NPF6.3 (Sun et al., 2014). Sin embargo, dada la magnitud de la respuesta a nitrato no se descarta la implicación de otros sensores aún desconocidos. Por otra parte, el transportador NRT2.1 parece implicado en la iniciación de raíces laterales (Malamy & Ryan, 2001). A través de la acción de NRT1.1/NPF6.3, el nitrato genera un crecimiento gradual de calcio en el citosol y el núcleo celular. La intensidad y duración de esta firma de calcio es diferente en función del tejido radicular (Liu et al., 2017), aunque su detección es complicada con las técnicas actuales. En la generación de esta señal parece estar implicada la fosfolipasa C (PLC) mediante un mecanismo que aún se desconoce (Riveras et al., 2015). En principio, la presencia de nitrato activaría a PLC, que produce diacilglicerol e inositol fosfato-3 (IP3) a partir de los fosfatidil inositoles fosfato PI(4,5)P2 en plantas (Kanehara et al., 2015). El IP3 liberado es capaz de regular canales selectivos de calcio en eucariotas (Berridge, 2016), lo que favorecería el incremento de calcio citosólico. Esta señal de calcio se transmite a través de las quinasas dependientes de calcio CPK10, CPK30 y CPK32, que fosforilan al factor de transcripción NLP7 (probablemente en la Ser205) (Liu et al., 2017), lo que permite que NLP7 permanezca en el núcleo. NLP7 modula la transcripción de genes implicados en la PNR y en el desarrollo de las raíces, así como de Introducción 69 una serie de factores de transcripción como bZIP1, TGA1 o TCP20 imprescindibles para la regulación de ambos procesos (Vidal et al., 2020) (Figura I.9). Figura I.9: Mecanismo de señalización Calcio-CPK-NLP implicado en la señalización de nitrato. El nitrato desencadena el aumento gradual y transitorio de calcio transitorio en el citosol y el núcleo. La fosfolipasa C (PLC) parece estar implicada en esta señal, y generaría IP3 que regularía canales selectivos de calcio. El aumento de calcio activa las proteínas kinasas sensoras de calcio (CPK), que luego fosforilan al factor de transcripción NLP7 entre otros, reteniéndolos en el núcleo. Estos factores de transcripción modulan la expresión de genes implicados en la PNR y el desarrollo radicular, así como la transcripción de otros factores de transcripción. Figura de Liu et al., (2020) Introducción 70 La señal de calcio también activa una repuesta mediada por proteínas CBL con capacidad de interacción con la membrana plasmática (CBL1, CBL4, CBL5, CBL8 y CBL9), que sería necesaria no solo para la activación de canales, transportadores y bombas de protones, sino también para la correcta localización de los mismos en la membrana plasmática (Chu et al., 2021). Así mismo, el calcio también es fundamental para la activación de los módulos CBL1/9-CIPK23 y CBL1-CIPK8, que fosforilan al transceptor NRT1.1/NPF6.3 regulando positivamente su actividad. En respuesta a baja disponibilidad de nitrato, CIPK23 actúa como un regulador negativo de la PNR, porque la fosforilación en el residuo NRT1.1/NPF6.3T101 desencadena la respuesta primaria a un nivel bajo (Ho et al., 2009). Por otra parte, CIPK8 actúa como un regulador positivo de la PNR, induciendo la expresión de NRT1.1/NPF6.3 mediante la fosforilación de dianas desconocidas (Hu et al., 2009). En cambio, regula negativamente respuestas de nitrato a largo plazo, como el crecimiento de las raíces (Asim et al., 2020). La integración de la señalización de nitrato a larga distancia es fundamental para regular su asimilación y el desarrollo de la planta. El nitrato se distribuye de forma heterogénea en el suelo. Como resultado, algunas partes de la raíz se localizan en ‘parches’ (patches) con poco nitrato, mientras que el resto se puede situar en zonas ricas en nitrato. La señal de demanda de nitrógeno se transmite desde la zona con poco nitrógeno al sitio con mayor concentración de nitrógeno para favorecer la proliferación de raíces laterales en esas zonas, la expresión de NRT2.1 y la toma de nitrato (Remans et al., 2006). Una de estas vías de señalización implica a los péptidos CEP1 (C-terminally Encoded Peptide 1). Estos péptidos se generan en la zona pobre en nitrógeno de las raíces, se secretan y viajan a través del xilema hasta la parte aérea, donde son reconocidos por los receptores con actividad quinasa CEPR1 y CEPR2 (C-terminally Encoded Peptide Receptor). La expresión de estos receptores está finamente regulada por la escasez de nitrato de una forma independiente a CEP1, y favorecen la producción de CEP1, que viaja a través del floema hasta las raíces. Allí, induce la transcripción de NRT2.1 exclusivamente en las raíces localizadas en suelo con nitrógeno suficiente mediante un mecanismo desconocido (Ohkubo et al., 2017). De esta forma, se asegura que la energía necesaria para la adquisición de nitrato no se desperdicia en regiones con escasez de este nutriente. Nodos de interacción nitrato-potasio Clásicamente, se ha considerado que el nitrato juega un papel fundamental como contra-ión del potasio facilitando su toma, su almacenamiento en las vacuolas y su distribución entre raíces y parte aérea (Engels & Marschner, 1993; Raddatz et al., 2020; Ródenas et al., 2017; Zhang et al., 2010). Por lo tanto, los niveles de adquisición de potasio y nitrato suelen estar correlacionados positivamente, ya que sus niveles deben estar balanceados (Coskun et al., 2017). Bajo condiciones de suficiencia nutricional, se incentiva el co-transporte potasio-nitrato desde la raíz a la parte aérea, mientras que en el caso Introducción 71 contrario, bajo condiciones nutritivas limitantes, el transporte de ambos nutrientes está restringido (Drechsler et al., 2015; Lin et al., 2008; Meng et al., 2016). Además, el potasio induce la activación de enzimas implicadas en la asimilación de nitrato (Coskun et al., 2017). Además de actuar como balanceadores de carga, el sensing de potasio y nitrato convergen en varios puntos. A nivel transcripcional, se ha demostrado que concentraciones bajas de nitrato en el suelo producen una hiperpolarización de la membrana, que conduce a la inducción de la transcripción de HAK5 incluso en situaciones de disponibilidad de potasio (Rubio et al., 2014), aunque su activación postranscripcional es totalmente dependiente del déficit de potasio. Por otra parte, la acumulación de ROS y variación de las concentraciones de calcio citosólico también ha sido descrita en ambos casos (Du et al., 2019; Kim et al., 2010; Riveras et al., 2015). En las secciones sucesivas se profundizará en algunos de estos nodos de conexión. Regulación por CBL1/9-CIPK23 En cuanto a la regulación post-traduccional, tanto proteínas transportadoras de potasio como de nitrato son controladas en algunos casos por las mismas proteínas reguladoras, en concreto el módulo CBL1/9-CIPK23 (Ródenas & Vert, 2021). CIPK23, en su asociación con CBL1/9, es fundamental para regulación de la toma de potasio en raíces. Como hemos comentado anteriormente, la disminución del potasio en el medio genera un aumento en la concentración citosólica de calcio, que es percibida por CBL1/9 y posibilita su interacción con CIPK23. Ello activa CIPK23 y la conduce a la membrana plasmática, donde fosforila tanto a AKT1 como a HAK5, favoreciendo la toma de potasio en condiciones de insuficiencia del nutriente. Por otra parte, CBL1/9-CIPK23 también media la fosforilación del transceptor NRT1.1/NPF6.3 (Ho et al., 2009; Léran et al., 2015). En condiciones de bajo nitrato se genera una ola de calcio, el cual se une a CBL9 o CBL1, que interaccionan con la quinasa CIPK23 provocando la fosforilación de NRT1.1/NPF6.3 en el residuo T101. La fosforilación de este residuo es determinante para el mantenimiento de la conformación monomérica de la proteína, y repercute tanto en su función como transportador como en su función como sensor. Recientemente se ha confirmado que NRT1.1/NPF6.3 se coordina con canales y transportadores de potasio como HAK5 o AKT1 localizados en la epidermis y el córtex de las raíces, así como en la vasculatura central para mejorar la toma y la distribución de potasio respectivamente. Se ha observado que la expresión de NRT1.1/NPF6.3 en raíces se incentiva por tratamientos de bajo potasio, aunque el mecanismo es desconocido, y dicha expresión parece fundamental para que las plantas resistan a la deficiencia de potasio bajo suficiencia de nitrato (Fang et al., 2020). El candidato principal para llevar a cabo esta coordinación sería el módulo CBL1/9-CIPK23 que, además de coordinar la toma y Introducción 72 distribución de nutrientes, podría influir en la morfología radicular mediante su interacción con AKT1 y NRT1.1/NPF6.3 (Kellermeier et al., 2014). Por tanto, CBL1/9-CIPK23 se postula como un nodo o hub que regula la nutrición en plantas (Dong et al., 2021; Ródenas & Vert, 2021), puesto que además de interaccionar con HAK5, AKT1 y algunos NPFs, CIPK23 modula la actividad de sistemas de transporte implicados en la adquisición de NH4 + y hierro (Straub et al., 2017; Tian et al., 2016). En este sentido tiene gran importancia la especificidad de las ‘firmas de calcio’ producidas en respuesta a diferentes deficiencias nutricionales para coordinar la función de CIPK23, aunque aún no están claros sus niveles y frecuencias. Por ejemplo, la señal de calcio producida por potasio aparece bajo condiciones de falta de nutriente, pero no cuando hay suficiente. En cambio, las señales de calcio asociadas a nitrato aparecen durante la suplementación con el mismo, pero no durante su ausencia (Kudla et al., 2018). Otra explicación puede ser la formación de microdominios diversos en la membrana plasmática, que favorecerían la especificidad de CIPK23 en el reconocimiento de la proteína adecuada para el estímulo (Chu et al., 2021). Transporte coordinado de nitrato y potasio a la parte aérea El transporte de nitrato a la parte aérea es fundamental, ya que una parte importante de la asimilación de nitrato tiene lugar en tejidos fotosintéticos dado que el poder reductor necesario para este proceso proviene de la fotosíntesis (Krapp, 2015; Searles & Bloom, 2003). Para mantener constante el balance de cargas a lo largo de la planta, es recomendable que el nitrato llegue al xilema acompañado de un catión. La carga de cationes al xilema está regulada por el canal de salida de potasio SKOR, que media la salida de potasio al xilema al despolarizarse la membrana plasmática, así como por el transportador NRT1.5/NPF7.3 (Drechsler et al., 2015). La expresión de ambas proteínas se regula positivamente por un aporte de nitrato. En el caso de NRT1.5/NPF7.3, el factor de transcripción MYB59 se une al promotor de NRT1.5/NPF7.3 favoreciendo su expresión en condiciones de suficiencia nutricional. En cambio, cuando las plantas están sujetas a deficiencias nutricionales, la expresión del gen MYB59 es reprimida, lo que impide la acumulación del transcrito de NRT1.5/NPF7.3 (Du et al., 2019). Bajo condiciones limitantes de nitrato, se ha visto que NRT1.5/NPF7.3 afecta a la carga de potasio en el xilema (Drechsler et al., 2015). Además, se ha sugerido que cataliza el intercambio H+/K+ para favorecer la carga de potasio en el xilema de Arabidopsis, por lo que a pH externo ácido (como el propio del flujo xilemático), NRT1.5/NPF7.3 facilitaría la salida de potasio hacia el xilema (Li et al., 2017). Sin embargo, los ensayos de crecimiento llevados a cabo en cepas de levadura deficientes para los sistemas de transporte de potasio no muestran una complementación de los fenotipos cuando se expresa en ellos el transportador NRT1.5/NPF7.3 (Drechsler et al., 2015). Este resultado negativo indica que Introducción 73 NRT1.5/NPF7.3 es incapaz de promover la salida de potasio cuando su gradiente electroquímico se dirige hacia adentro y la energía aportada proviene de la fuerza protón motriz, comportamiento que sería esperable para un intercambiador K+/H+. A pesar de la controversia en cuanto al mecanismo de transporte de NRT1.5/NPF7.3, el consenso alcanzado es que este transportador afecta al balance potasio/nitrato en el flujo xilemático, tal y como atestiguan los ensayos in planta en los que el mutante nrt1.5 muestra niveles significativamente inferiores de potasio en la parte aérea (Li et al., 2017). Acoplamiento del transporte de nitrato y potasio en células guarda Las células guarda representan un ejemplo paradigmático de cómo el transporte de nitrato y de potasio están funcionalmente ligados a nivel molecular (Raddatz et al., 2020). Los estomas consisten en un par de células guarda que cambian su turgencia de forma dinámica y reversible para ajustar el tamaño del poro que conforman. Esto se logra mediante la entrada y salida masiva de potasio, nitrato, cloro y malato, así como la biosíntesis de otros compuestos orgánicos (Eisenach & De Angeli, 2017; Hedrich & Shabala, 2018). Las células guarda tienen un pH en el citoplásma de 7,5-7,8 al que la H+-ATPasa presenta baja afinidad. La apertura estomática se inicia por la activación de la H+-ATPasa AHA1 por luz azul, roja o auxina (Assmann et al., 1985; Schroeder et al., 2001), lo que genera un gradiente de protones que conduce a la hiperpolarización de la membrana plasmática. Esta hiperpolarización activa canales rectificadores de entrada de potasio, como KAT1 y KAT2, que inducen el flujo de entrada pasivo de potasio al citoplasma. La entrada de potasio despolariza parcialmente la membrana, lo que favorece la entrada de aniones orgánicos e inorgánicos (cloro y nitrato) acoplada a protones en la célula guarda (Eisenach & De Angeli, 2017; Jezek & Blatt, 2017). NRT1.1/NPF6.3 es uno de estos transportadores aniónicos (Guo et al., 2003). La entrada de potasio, cloro y nitrato junto con la producción de malato provoca a su vez un influjo de agua, que hincha las células guarda y abre el poro del estoma. Las quinasas CPKs participan en el movimiento estomático mediante la regulación de los canales KAT1/2 (Ronzier et al., 2014) y GORK (Corratgé-Faillie et al., 2017; van Kleeff et al., 2018). Durante esta apertura, fosfatasas PP2C interactúan con alguna de estas quinasas, suprimiendo su actividad por defosforilacion. Una de ellas es la fosfatasa ABI1, que también interactúa directamente con SLAC1, reprimiendo su activación (Figura I.10). En sentido contrario, la ausencia de luz o el déficit hídrico promueven el cierre estomático mediante la síntesis de la hormona ABA, promueven el cierre del estomático. Por una parte, la activación de los receptores de ABA produce cambios conformacionales que permiten la interacción de los receptores con fosfatasas PP2C (ABI1, ABI2, HAB1, etc.), reprimiendo su actividad enzimática (Ma et al., 2009). Por otra parte, la activación de los receptores de ABA se relacionan con un aumento del óxido nítrico, que conduce a una elevación del calcio citosólico (Chen et al., 2016). El fin de la represión ejercida por las PP2C así como un aumento en el calcio citosólico permite la activación de quinasas de tipo CPKs Introducción 74 y OST1. Estas quinasas fosforilan y activan los canales aniónicos SLAC1 y SLAH3 e inhiben a los canales de entrada de potasio KAT1 (Geiger et al., 2010; Geiger et al., 2011; Lee et al., 2009; Vahisalu et al., 2008). Como resultado de la salida de aniones a través de SLAC1 y SLAH3 se produce una despolarización de la membrana plasmática, que activa al canal de salida de potasio GORK conduciendo a la salida de agua de las células guarda (Waadt et al., 2008) (Figura I.10). Figura I.10: Esquema de los principales transportadores y canales que median los flujos ionicos en la membrana plasmática de las células guarda. A la izquierda, abertura de los estomas; al lado derecho, cierre de estomas. Aparecen difusos los sistemas que se encuentran inactivos en cada caso. NO: óxido nítrico, P representa fosforilación. Figura adaptada de Raddatz et al. (2020) Objetivos Objetivos 77 La presente Tesis Doctoral tiene como objeto principal identificar y entender los mecanismos moleculares y las proteínas que subyacen en la regulación de la nutrición de potasio en la planta modelo Arabidopsis thaliana. A razón de este objetivo principal se proponen los siguientes objetivos parciales: 1. Caracterizar líneas mutantes con respuesta alterada al hambre de potasio, producidas por mutagénesis química y seleccionadas en base a la expresión anómala del gen reportero HAK5:LUC. 2. Identificar las mutaciones subyacentes y caracterizar el o los genes alterados posiblemente involucrados en la nutrición de potasio. 3. Esclarecer cómo dichas mutaciones puntuales afectan a la actividad de las proteínas codificadas y analizar su participación en la nutrición vegetal, y más concretamente en la homeostasis de potasio de forma directa o indirecta. 4. Estudiar la sinergia existente entre el transporte de potasio y nitrato. Materiales y Métodos Materiales y Métodos 81 1 Material biológico 1.1 Bacterias: cepas, medios y condiciones de cultivo 1.1.1 Escherichia coli Para la amplificación de plásmidos se han utilizado distintas estirpes de E. coli, recogidas en la Tabla M.1. Las cepas DH5α y Top10 se utilizaron para propagación de ADN plasmídico. La cepa XL10-Gold se utilizó para amplificación de plásmidos vacíos del sistema GatewayTM. Las cepas Rosetta™ 2 (DE3)pLysS y BL21 se utilizaron para la síntesis y purificación de proteínas. Tabla M 1: Cepas de E. coli utilizadas Cepa Genotipo Origen de la cepa One Shot® TOP10 F-, mcrA, (mrr-hsdRMS-mcrBC), 80lacZM15, lacX74, recA1, ara139, (araleu)7697, galU, galK, rpsL, (StrR), endA1, nupG> Invitrogen™ Life Technologies DH5α F- supE44 hsdR17 (rK-rK+) recA1 girA96 (Nalr) endA1 thi-1 relA1 D(lacZYA-argF) (Ø80lacZDM15) U169 Servicio de Cultivos (IBVF, CSIC) XL10 Gold Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 re1A1 Hte lac {F´proAB laclq ZΔM15 Tn10 (tetR) Amy CamR} Strategene® Rosetta™ 2 (DE3)pLysS BL21: F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3) pLysSRARE2 (CamR) Novagen 71403 BL21 F- ompT (lon) hsdS(rB-mB-, una E. coli B) con DE3 Servicio de Cultivos (IBVF, CSIC) 1.1.2 Agrobacterium tumefaciens Las cepas de A. tumefaciens que se utilizaron para la expresión transitoria de distintas proteínas en Nicotiana bethamiana se recogen en la siguiente Tabla: Tabla M 2: Cepas A. tumefaciens Cepa Genotipo Referencia GV3101 RifR, pMP90 (pTiC58DT-DNA) Koncz & Schell (1986) Materiales y Métodos 82 p19 pBin61-p35S:p19 Voinnet et al., (2003) 1.1.3 Medios utilizados para el cultivo de bacterias Para el cultivo de las cepas de E. coli y A. tumefaciens se utilizó el medio Luria- Bertani (LB) modificado, sustituyendo la sal sódica original por KCl (Tabla M.3). Todos los medios preparados se esterilizaron en autoclave, en condiciones de sobrepresión de 1 atmósfera y 120C durante 20 minutos, salvo excepción que será indicada en cada caso. En los casos en que fuese necesario, se suplementó el medio con el antibiótico selectivo correspondiente: ampicilina (100 mg l-1), kanamicina (50 mg l-1), espectinomicina (50 mg l- 1), rifampicina (150 mg l-1). El cultivo de E. coli se realizó a 37C en condiciones de oscuridad y el de A. tumefaciens a 28C. En el caso de cultivo en medio líquido además se incubó en agitación constante (200 r.p.m.). Tabla M 3: Composición del medio LB modificado de bacteria Compuesto Concentración Extracto de levadura 0,5 % (p/v) Triptona 1 % (p/v) KCl 1 % (p/v) Agar Bacteriológico* 1,5 % (p/v) *Se añade para la preparación de medio LB sólido. Para preparar los inóculos de A. tumefaciens también se utilizó medio YEP (Tabla M.4) con los antibióticos correspondientes: 150 mg l-1 de rifampicina, 50 mg l-1 de kanamicina o 50 mg l-1 de espectinomicina. Las bacterias se incubaron durante 48 horas a 30C. Tabla M 4: Composición del medio YEP Compuesto Concentración Extracto de levadura 1 % (p/v) Bacto peptona 1 % (p/v) KCl 0,5 % (p/v) Agar Bacteriológico* 1,5 % (p/v) *Se añade para la preparación de medio YEP sólido. Para el mantenimiento a largo plazo de las cepas de E. coli y A.tumefaciens que contenían plásmidos de interés se almacenó a -80C una suspensión de células en medio de cultivo con un 20% de glicerol estéril. Materiales y Métodos 83 1.2 Levaduras: cepas, medios y condiciones de cultivo 1.2.1 Saccharomyces cerevisiae Las cepas utilizadas se describen en la siguiente Tabla: Tabla M 5: Cepas de S. cerevisiae Cepa Genotipo Referencia TTE 9.3 Mata trk1 trk2 ura3 leu2 trp1 ade2 enal::HIS3::ena4 Bañuelos et al., (1995) AXT3K MATα, ena1Δ::HIS3::ena4Δ, nha1::LEU2, nhx::KanMX ura3-1, trp1, ade2-1, can1-100 Quintero et al., (2002) La cepa TTE 9.3 es deficiente en los transportadores de entrada de potasio TRK1 y TRK2, y en las bombas de salida de sodio ENA1-ENA4 (Bañuelos et al., 1995). AXT3K es la cepa resultante de eliminar las ATPasas de sodio ENA1-ENA4, el antiportador Na+,K+/H+ Nha1 de membrana plasmática y el antiportador Na+/H+ endosomal NHX1 (Quintero et al., 2002). Ambas cepas se han utilizado para la caracterización de sistemas implicados en el transporte de potasio (Figura M.1). Figura M.1: Representación esquemática de los principales canales, transportadores y bombas de sodio y potasio de S. cerevisiae. Adaptación de Locascio et al. (2019) Materiales y Métodos 84 1.2.2 Hansenula polymorpha La levadura H. polymorpha es capaz de asimilar nitrato y utilizarlo como fuente de nitrógeno. Los genes necesarios para la toma y asimilación de nitrato están organizados en un cluster de genes (GeneBank #AJ223294) que codifican el transportador de nitrato de alta afinidad YNT1, la nitrato reductasa YNR1, la nitrito reductasa YNI1, así como dos activadores transcripcionales Zn(II)2Cys6 (YNA1/2) (Pérez et al., 1997; Silvestrini et al., 2015; Siverio, 2002). Por ello se utilizó este organismo para la caracterización de sistemas implicados en la absorción de NO3 -. Las cepas utilizadas se describen en la siguiente tabla: Tabla M 6: Cepas de H. polymorpha Cepa Genotipo Referencia NCYC495 leu2::p18B1(LEU2) ura3::pBSURA3 (URA3) Sudbery et al., (1988) Δynt1::URA3 leu2::p18B1(LEU2) ura3::pBSURA3 (URA3), Δynt1::URA3 Pérez et al., (1997) 1.2.3 Medios y condiciones de cultivo de levaduras En las sucesivas tablas de este apartado se describen los distintos medios empleados para el cultivo de levaduras. La esterilización de estos medios se llevó a cabo en autoclave durante 20 minutos a 120C de temperatura y 1 atmósfera de presión. El volumen empleado para el crecimiento en medio líquido fue de 5 ml de medio en tubos de inóculo de 50 ml, los cuales se mantuvieron en agitación constante (200 r.p.m.) en estufas a 30C (S. cerevisiae) ó 37C (H. polymorpha) durante 24-72 horas en función del ensayo realizado. Para determinar el grado de crecimiento de los cultivos se midió la absorbancia de los mismos a 660 nm en un lector de microplacas Thermo Scientific™ Varioskan™ LUX. En cuanto al crecimiento en medio sólido, las placas se incubaron a 30C (S. cerevisiae) o 37C (H. polymorpha) durante 24-72 horas en función del ensayo realizado. El crecimiento y la propagación de levaduras se realizaron en medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) (Sherman, 1991) tal y como se describe en la siguiente tabla: Tabla M 7: Composición del medio YPD de levadura Compuesto Concentración Extracto de levadura 1 % (p/v) Peptona 2 % (p/v) Materiales y Métodos 85 Glucosa 2 % (p/v) Agar Bacteriológico* 1,5 % (p/v) * Se añade para la preparación de medio YPD sólido Para algunos ensayos de caracterización de transporte de potasio en S. cerevisiae se utilizó medio YPD con higromicina B. En esos casos, el antibiótico se añadió al medio YPD una vez autoclavado y atemperado a 60C para lograr una concentración final del antibiótico en el medio de 25 o 50 µg ml-1. También se utilizó medio YPD pH 5,5 con distintas concentraciones de potasio (0 ó 1,5 M). Para prepararlo se añadió al medio YPD MES 50 mM, se ajustó el pH hasta 5,5 con HCl y se adicionó 1,5 M de potasio a partir de una solución de KCl. Otro de los medios utilizados en los ensayos de crecimiento de levaduras en bajo potasio fue el medio Arginina-Fosfato (AP) (Rodriguez-Navarro & Ramos, 1984) cuya composición se detalla en las Tablas M.8, M.9 y M.10. El medio se suplementó con la concentración de KCl o KNO3 indicada en cada caso (entre 1 y 50 mM). Tabla M 8: Composición del medio AP de levadura Compuesto Concentración H3PO4 85 % 8 mM L-Arginina 10 mM MgSO4 2 mM CaCl2 0,2 mM Glucosa 20 % (p/v) Oligoelementos (1000X)* 1 % (v/v) Vitaminas (100X)** 1 % (v/v) Agar Bacteriológico† 1.5 % (p/v) *Oligoelementos (Stock 1000X) ver tabla X **Vitaminas (Stock 100X) ver tabla X. Se añadieron tras la esterilización del medio † Se añadió para la preparación de medio AP sólido Tabla M 9: Composición del stock de oligoelementos 1000X Compuesto Concentración H3BO3 50 mg l-1 CuSO4 4 mg l-1 KI 10 mg l-1 MnSO4 · H2O 40 mg l-1 Na2MoO4 · 2 H2O 20 mg l-1 ZnSO4 · 7 H2O 4 mg l-1 FeSO4 50 mg l-1 Materiales y Métodos 86 Tabla M 10: Composición del stock de vitaminas 100X Compuesto Concentración Tiamina (Vit. B1) 4 mg/100 ml Ácido nicotínico (Vit. B3) 4 mg/100 ml Ácido pantoténico (Vit. B5) 4 mg/100 ml Piridoxina (Vit. B6) 4 mg/100 ml Biotina (Vit. B7) 2 mg/100 ml La solución de vitaminas se esterilizó mediante filtración Como medio selectivo para S. cerevisiae y H. polymorpha, se utilizó YNB (Sherman et al., 1986), excluyendo los nucleótidos o aminoácidos apropiados para la selección de los transformantes. Tabla M 11: Composición del medio YNB de levadura Compuesto Concentración YNB 0,17 % (p/v) (NH4)2SO4 0,5 % (p/v) Glucosa 2 % (p/v) Auxotrofías según requerimientos † Agar Bacteriológico* 1,5 % (p/v) * Se añade para la preparación de medio YNB sólido †Histidina 40 mg l-1; leucina 60 mg l-1; triptófano 40 mg l-1; uracilo 40 mg l-1; adenina 20 mg l-1; metionina 20 mg l-1 Para los ensayos de crecimiento de levaduras en condiciones de bajo nitrato se utilizaron los medio YGNH e YG (Martin et al., 2008). Su composición se especifica en las Tablas M.12 y M.13. El medio se suplementó con la concentración de KNO3 indicada en cada caso, dependiendo del ensayo. Tabla M 12: Composición del medio YGNH para H. polymorpha Compuesto Concentración YNB 0,17 % (p/v) NH4Cl 5 mM Glucosa 2 % (p/v) Agar Bacteriológico* 1,5 % (p/v) * Se añade para la preparación de medio YGNH sólido Materiales y Métodos 87 Tabla M 13: Composición del medio YG para H. polymorpha Compuesto Concentración YNB 0,17 % (p/v) Glucosa 2 % (p/v) Agar Bacteriológico* 1,5 % (p/v) * Se añade para la preparación de medio YG sólido Para su mantenimiento, los cultivos fueron refrescados cada 15 días en placas nuevas y se mantuvieron a 4C. Para la conservación de levaduras a largo plazo se prepararon suspensiones celulares de glicerol al 20 %, que fueron conservadas a -80C. 1.3 Material vegetal 1.3.1 Arabidopsis thaliana Las plantas de Arabidopsis utilizadas en esta tesis pertenecen al ecotipo Columbia (Col-0). Las líneas utilizadas durante la investigación se recogen en la Tabla M.14. El mutante L14 se obtuvo por mutagénesis química de plantas HAK5:LUC con etil- metanosulfonato (EMS) y fue caracterizado mediante mapping-by-sequencing (James et al., 2013) por el equipo del Dr. Magdy Mahfouz (KAUST, Arabia Saudí). El procedimiento se detalla en el Capítulo 1 de Resultados. Tabla M 14: Líneas de A. thaliana utilizadas Línea Características Origen o referencia HAK5:LUC Promotor de HAK5 fusionado al gen reportero de la luciferasa En Jung et al., (2009), la línea HAK5:LUC akt1-2 Mutante por inserción de ADN-T Rubio et al., (2008) nrt1.4-2 Mutante por inserción de ADN-T (Chiu et al., 2004), línea WiscDsLox322H05. Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC; Nottingham University, UK) L14 Línea obtenida por mutagénesis química con EMS Dr. Magdy Mahfouz (KAUST, Arabia Saudí) Materiales y Métodos 88 1.3.1.1 Cultivo y crecimiento Las plantas se cultivaron en cámaras de cultivo (Aralab) en condiciones de ciclo largo (fotoperiodo de 16 horas de luz / 8 horas de oscuridad) o ciclo corto (fotoperiodo de 8 horas de luz / 16 horas de oscuridad), manteniendo constante la temperatura (20C luz / 18C oscuridad), humedad relativa (70 %) y la intensidad lumínica (120-140 µmol m-2 s-1). 1.3.1.2 Esterilización de semillas Las semillas de Arabidopsis se esterilizaron en cabinas de flujo laminar (Telstar A- H) con una mezcla desinfectante de lejía comercial al 0,5 % y SDS al 0,1 % durante 10 minutos. A continuación, se sometieron a tres lavados con etanol al 70 % y otros tres lavados con agua esterilizada a fin de eliminar de su superficie la mezcla desinfectante. Las semillas quedaron suspendidas en el agua del tercer lavado y se vernalizaron a 4C y oscuridad durante 72 horas para sincronizar su germinación. 1.3.1.3 Cultivo hidropónico Se prepararon cultivos hidropónicos en aquellos experimentos en los que fue preciso crecer las plantas en condiciones de nitrato o potasio controladas (Gibeaut et al., 1997). Las semillas de Arabidopsis thaliana se vernalizaron durante 72 horas a 4C en oscuridad. Después se colocaron en microtubos Eppendorf de 1,5 ml sin tapa ni punta, que contenían lana de roca húmeda en su interior. Los microtubos se colocaron en cubetas de 9 l que contenían la solución nutritiva Long Ashton modificada (solución LAK, composición en las Tablas M.15 y M.16) (Barragan et al., 2012). Los nutrientes se disolvieron en agua desionizada y el pH se ajustó a 5,3 con NaOH. Los cubos se colocaron en cámara de cultivo (Aralab) en ciclo corto (para retrasar la floración de las líneas y favorecer el crecimiento de sus raíces), en ciclo largo o en invernadero. La solución nutritiva se cambió cada semana y se utilizó una bomba de acuario para mantener la aireación adecuada del medio. Tabla M 15: Composición del medio LAK en condiciones de nitrato controlado. Las concentraciones necesarias de nitrato se añadieron a partir de una solución stock 1 M de Ca(NO3)2. COMPUESTO CONCENTRACIÓN MACRONUTRIENTES KH2PO4 1 mM MgSO4 · 7 H2O 1 mM CaCl2 2 mM MICRONUTRIENTES Fe2+ Sequestrene 138-Fe 100 µM Materiales y Métodos 89 MnSO4 · H2O 15 µM CuSO4 · 5 H2O 10 µM ZnSO4 · 7 H2O 1 µM H3BO3 30 µM (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O 0,03 µM Tabla M 16: Composición del medio LAK en condiciones de potasio controlado. Las concentraciones necesarias de nitrato se añadieron a partir de una solución stock 0,5M de K2SO4. COMPUESTO CONCENTRACIÓN MACRONUTRIENTES KH2PO4 0,1 mM MgSO4 · 7 H2O 1 mM Ca(NO3)2 · 4 H2O 2 mM MICRONUTRIENTES Fe2+ Sequestrene 138-Fe 100 µM MnSO4 · H2O 15 µM CuSO4 · 5 H2O 10 µM ZnSO4 · 7 H2O 1 µM H3BO3 30 µM (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O 0,03 µM 1.3.1.4 Cultivo in vitro Para el cultivo in vitro de plantas se utilizaron placas de Petri estériles con medio sólido MS 0.5x con sacarosa (Murashige & Skoog, 1962) o medio sólido LAK (Tablas M.15 y M.16) en función del experimento. La esterilización de los medios se realizó en autoclave durante 20 minutos a 120C de temperatura y 1 atmósfera de presión. En los casos en que fuera necesario, los medios se suplementaron con antibióticos a las concentraciones apropiadas. 1.3.1.5 Cultivo en suelo El crecimiento de Arabidopsis en suelo se llevó a cabo para la propagación de líneas y recolección de semillas. Las plantas se cultivaron en cámaras de cultivo de ciclo largo. Se utilizó substrato vegetal Compo® Sana Universal y se regaron con agua corriente. 1.3.1.6 Recolección de semillas Al brotar las inflorescencias, las plantas se protegieron con colectores de semillas comerciales Aracons™ (Arasystem-Betatech) y se mantuvo el riego habitual. Al presentar Materiales y Métodos 90 silicuas maduras se detuvo el riego y las plantas se colocaron en cámaras de día largo, humedad relativa 70 % y temperatura 22-20C Cuando la desecación fue total, se recogieron las inflorescencias y se recolectaron las semillas por apertura mecánica de las silicuas y tamizaciones sucesivas. 1.3.1.7 Cruzamiento de Arabidopsis thaliana La línea BC1F1 heterocigota se obtuvo por cruzamiento mediante polinización dirigida de individuos homocigotos de las líneas HAK5:LUC y L14. Ambas líneas parentales crecieron en suelo en semilleros individuales dentro de cámaras de cultivo en día largo. Todo el proceso se realizó bajo una lupa SteREO Discovery.V8 (Zeiss). Se eligieron un grupo de botones florales en el ápice de una de las inflorescencias de la planta que fuese a ser receptora del polen (parental femenino). De esos botones, se eliminaron las flores maduras (por ser fruto de la autofecundación) y se seleccionaron capullos cuyos pétalos sean apenas visibles. Se extirparon sus sépalos, pétalos y estambres inmaduros con la ayuda de unas pinzas (Dumoxel nº5) esterilizadas con alcohol etílico al 70 %, quedando presente sólo el gineceo del parental femenino. En cuanto a la planta utilizada como parental masculino, se tomaron estambres maduros de flores abiertas en los que los granos de polen eran visibles. Con las pinzas, se presionaron los estambres maduros contra el pistilo asegurándose de que los granos de polen quedan adheridos al estigma. Los cruzamientos tuvieron lugar en ambas direcciones (ambas líneas se utilizaron como parental masculino y femenino). La planta fecundada permaneció en una cámara de cultivo de día largo con riego frecuente hasta la maduración de la silicua, momento en el que se recogieron las semillas. 1.3.2 Nicotiana benthamiana Se utilizaron plantas de N. benthamiana para la expresión transitoria de proteínas. Las semillas de N. benthamiana se sembraron en macetas de forma individual con una mezcla 1:3 de perlita Europerl® y turba Compo® Sana Universal esterilizada en el autoclave a 120C y 15 psi durante 20 minutos para prevenir la aparición de plagas. Una vez sembrada en sustrato previamente humedecido se cubrieron las macetas con film transparente, que se retiró una vez las plantas habían germinado. Las plantas crecieron en cámara de cultivo en condiciones de día largo. 1.3.2.1 Transformación por infiltración con A. tumefaciens Para la agroinfiltración de N. benthamiana se siguió el protocolo descrito por Waadt et al., (2008). Se inoculó una colonia de A. tumefaciens portadora de la construcción de Materiales y Métodos 91 interés en 2 ml de medio LB suplementado con los antibióticos necesarios y se incubó 16- 24 horas a 30C en agitación constante. Transcurrido este tiempo, se midió la DO600nm y se calculó el volumen necesario para obtener una DO600nm de 0,5. La cepa p19 se ajustó a una DO600nm de 0,3. Los volúmenes calculados de cada cepa de Agrobacterium de interés se mezclaron en un tubo Falcon y se centrifugaron a 6000 r.p.m. durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 1 ml de tampón de activación (Tabla M.17). A continuación, se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 3 horas con agitaciones esporádicas hasta la infiltración. Finalmente, se infiltró la mezcla con la ayuda de una jeringuilla a través del envés de las hojas de plantas de 5 o 6 semanas convenientemente regadas. Tras 48 horas, el envés de las hojas infiltradas se observó con un microscopio confocal LSCM FLUOVIEW FV3000 (Olympus, Japón) del Servicio de Microscopía del IBVF-CSIC. Tabla M 17: Composición tampón de activación Compuesto Concentración MES 10 mM MgCl2 10 mM Acetosiringona 150 1.4 Ovocitos de Xenopus laevis Los ovocitos de Xenopus laevis se han utilizado como sistema de expresión heterólogo de algunos de los canales y transportadores estudiados en esta tesis. Los ribosomas, ARNt y otros componentes propios de esta célula se utilizan para la expresión de ARN exógeno tras su inyección en el ovocito (Theodoulou & Miller, 1995). Este sistema ha permitido llevar a cabo el TEVC (Two-Electrodes Voltage Clamp) y la cuantificación intracelular de nitrógeno marcado (15N). 1.4.1 Preparación ovocitos Para los ensayos de TEVC, los ovocitos se solicitaron a la empresa Ecocyte Biosciene. Para la cuantificación intracelular de 15N se utilizó un pool de ovocitos obtenidos a partir de un lóbulo ovárico de una rana hembra adulta. Dicho lóbulo ovárico se sometió a una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente con colagenasa D (Roche Diagnostics) para separar los ovocitos. A continuación, se llevó a cabo un cribado por el que se seleccionaron los ovocitos simétricos, en estados V y VI (1.0-1.3 mm de diámetro) (Baker et al., 2007) para ser inyectados. Los ovocitos se mantuvieron en medio ND96 a 20C de 1 a 4 días, hasta la inyección de ARN complementario (ARNc). Materiales y Métodos 92 Tabla M 18: Composición del medio ND96 pH 7,4 Compuesto Concentración NaCl 96 mM KCl 2 mM MgCl2 1,8 µM CaCl2 1 mM Na-piruvato 2,5 mM HEPES 5 mM * Ajustar pH a 7,4 con TRIS 1M 1.4.2 Inyección de ARN complementario Los capilares para la inyección se obtuvieron gracias al puller MODEL p1000 (Sutter Instrument). A continuación, el capilar se rellenó con aceite mineral (Sigma-Aldrich) y se cargó con los ARNc obtenidos a partir de transcripción in vitro (Mat y Met, 2.2.3). Se inyectaron en los ovocitos con el inyector Nanoliter 2010 (WPI) colocado bajo una lupa (modelo PZMIII-BS, WPI). Para los experimentos de electrofisiología se inyectaron 50 nl con 12:8:8 ng del ARNc de AKT1:CIPK23:CBL1 o bien 50 nl con 30 ng de NRT1.4/NPF6.2 silvestre (NRT1.4/NPF6.2WT) o mutante (NRT1.4/NPF6.2V210M). Para el ensayo de acumulación de 15N se inyectaron 30 nl con 10 ng de cada ARNc (NRT1.1/NPF6.3, NRT1.4/NPF6.2, NRT1.4V210M, CIPK23 y CBL1). Una vez inyectados, los ovocitos se mantuvieron en placas de Petri con solución ND96 con gentamicina (50 µg ml-1; Sigma-Aldrich) a 17C durante 48-72h. Materiales y Métodos 93 2 Métodos 2.1 Purificación y análisis del ADN Todo el material de vidrio, tubos de centrífuga, microtubos, material plástico y soluciones utilizados en estas técnicas se esterilizaron en autoclave a 120C durante 20 minutos y 1 atmósfera de sobrepresión antes de su uso. En el caso de las soluciones termolábiles, se esterilizó el material por filtración a través de un filtro con tamaño de poro de 0,22 µm. Todas las soluciones se prepararon con agua desionizada MilliQ (Millipore®). 2.1.1 Extracción de ADN 2.1.1.1 Purificación de ADN plasmídico de E. coli Para la extracción de los plásmidos de E. coli se llevó a cabo el método de lisis alcalina descrito por (Sambrook & Russell, 2001). Purificación de ADN plasmídico a pequeña escala (MINIPREP) Se inoculó una colonia aislada en 4 ml de medio LB líquido suplementado con el antibiótico necesario en cada caso (Tabla M.2) y se incubó durante 16-18 horas a 37C en agitación (200 r.p.m.). Las células se recogieron en microtubos Eppendorf de 2 ml por centrifugación a 13000 r.p.m. durante 1 minuto y se resuspendieron en 100 µl de la solución I (Tabla M.19). A continuación, se añadieron 200 µl de la solución II (Tabla M.20) mezclándola suavemente por inversión y se incubó 2-3 minutos en hielo. Posteriormente se añadieron 150 µl de la solución III (acetato sódico pH 4,8) y se mezcló nuevamente por inversión. La mezcla se incubó en hielo durante 20 minutos. Transcurrido el tiempo de incubación se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un microtubo limpio, se añadió 1 ml de etanol absoluto, se incubó durante 10 minutos en hielo y se centrifugó de nuevo. El precipitado obtenido se resuspendió en 100 µl de la solución IV (Tabla M.21) y se añadieron a 200 µl de etanol absoluto. La mezcla se incubó durante 10 minutos en hielo y se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 10 minutos. El precipitado se dejó secar y se resuspendió en 30 µl de Tris: EDTA pH 8,0 (Tabla M.22). Tabla M 19: Composición de la solución I (GTE) Compuesto Concentración Tris-HCl (pH 8,0) 25 mM EDTA (pH 8,0) 10 mM Glucosa 1 % (p/v) Materiales y Métodos 94 Tabla M 20: Composición de la solución II Compuesto Concentración NaOH 0,2 N SDS 10 % Tabla M 21: Composición de la solución IV Compuesto Concentración AcNa pH 4,8 60 mM Tris-HCl pH 8,0 30 mM Tabla M 22: Composición del tampón TE Compuesto Concentración Tris/HCl pH 7,5 25 mM EDTA pH 8,0 1 mM Cuando el ADN purificado iba a ser utilizado para operaciones que requerían un grado de pureza más elevado, se utilizó el kit comercial de purificación de ácidos nucleicos GenElute™ Plasmid Kit de Sigma Aldrich, siguiendo las instrucciones indicadas por el fabricante. Purificación de ADN plasmídico a gran escala (MAXIPREP) Una colonia de las células de E. coli transformada con el plásmido de interés se inoculó en 100 ml de medio LB líquido suplementado con el antibiótico de selección correspondiente y se incubó entre 16-18 horas a 37C y agitación constante (200 r.p.m.). El cultivo se centrifugó a 6000 r.p.m. durante 5 minutos, y las células se resuspendieron en 5 ml de GTE (Tabla M.19) y 0,1 ml de lisozima al 5 % (p/v). La suspensión celular se incubó a temperatura ambiente y agitación suave durante 5 minutos, tras lo cual se añadieron 10 ml de solución II (Tabla M.20), mezclándose por inversión durante 5 minutos. Al lisado celular se añadió 7,5 ml de acetato de potasio 3 M pH 4,8, se mezcló por inversión suavemente y se incubó en hielo durante 30 minutos, con el objetivo de precipitar las proteínas y el ADN cromosómico. Transcurrido este tiempo, se centrifugó a 10000 r.p.m. durante 15 minutos. Para eliminar completamente los restos celulares, el sobrenadante se filtró utilizando una tela filtradora comercial Miracloth (Calbiochem). A la solución filtrada se añadieron 15 ml de isopropanol y se incubó a -20C durante al menos 20 minutos, precipitando así los ácidos nucleicos. Los tubos se centrifugaron entonces a 10000 r.p.m. durante 10 minutos, y el precipitado se resuspendió en 2,5 ml de TE (Tabla M.22). Posteriormente, se añadieron 2,5 ml de LiCl 6 M a la mezcla y se incubó en hielo durante 5 minutos, precipitando el ARN presente. Se centrifugaron las muestras a 10000 r.p.m. durante 10 minutos, y el sobrenadante se traspasó a un nuevo tubo y se Materiales y Métodos 95 añadió un volumen de isopropanol. Tras 20 minutos en hielo se centrifugó de nuevo con las mismas condiciones. Tras dejar secar el precipitado, se resuspendió en 750 µl de TE y se traspasó a un microtubo Eppendorf de 2 ml, donde se añadió 10 µl de ARNasa al 1 % (v/v) y se incubó a 37C durante 10 minutos. A continuación, se añadieron 750 µl de una solución de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 3 minutos. Se recuperó el sobrenadante y transfirió a un nuevo microtubo Eppendorf de 2 ml, donde se añadieron 750 µl de una solución de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y se centrifugó de nuevo a 13000 r.p.m. durante 3 minutos. La fase acuosa se recuperó en un nuevo microtubo y se añadieron 75 µl de acetato sódico 3 M y 750 µl de isopropanol. La mezcla se incubó durante 20 minutos en hielo, se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 10 minutos, se retiró el sobrenadante y se disolvió el precipitado en 200 µl de TE (Tabla M.22). El plásmido se precipitó en 700 µl de etanol: acetato de amonio 7.5 M (6:1) y se incubó a -20C durante al menos 20 minutos. Tras ese periodo, se centrifugó la mezcla durante 10 minutos a 13000 r.p.m., se descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado con 500 µl de etanol al 70 %. Tras una centrifugación durante 5 minutos a 13000 r.p.m. se dejó secar el ADN plasmídico y se resuspendió en 200 µl de TE. 2.1.1.2 Extracción de ADN genómico de Arabidopsis thaliana Para la purificación del ADN genómico de A. thaliana se siguió el método descrito por Edwards et al. (1991). Se tomaron alrededor de 100 mg de hojas frescas de roseta, se introdujeron en un microtubo Eppendorf de 1,5 ml y se procedió a su rotura mecánica con la ayuda de émbolos plásticos estériles. Rápidamente se añadieron 400 µl de tampón de extracción previamente calentado a 65C (Tabla M.23) y se homogeneizó la muestra con ayuda de un vórtex. Se añadieron 600 µl de una mezcla de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y se incubó a 65C durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo, se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 15 minutos. El precipitado se lavó con alcohol etílico al 70 %, se dejó secar y se resuspendió en 50 µl de agua MilliQ® estéril. Tabla M 23: Composición del tampón de extracción Compuesto Concentración Tris-HCl (pH 8,0) 220 mM EDTA (pH 8,0) 25 mM NaCL 250 mM SDS 0,5 % (w/v) Materiales y Métodos 96 2.1.2 Cuantificación de ADN El ADN se cuantificó mediante un espectrofotómetro comercial Nanodrop© ND- 1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.1.3 Amplificación de ADN por PCR convencional Para la amplificación de los genes estudiados en esta Tesis Doctoral se utilizó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction). Este método enzimático consiste en la replicación in vitro de secuencias específicas de ADN (conocido como molde) para la obtención de millones de moléculas a partir de escasa cantidad de ADN. 2.1.3.1 Cebadores de oligonucleótidos Los cebadores necesarios para amplificar los fragmentos de ADN mediante PCR se diseñaron utilizando la herramienta bioinformática Primer-Blast. Las secuencias de los cebadores utilizados se recogen en el Anexo 1: Cebadores. 2.1.3.2 Condiciones de reacción Se utilizó la enzima comercial MyTaq™ DNA Polymerase de BIOLINE. Los componentes de la reacción aparecen en la Tabla M.24. El ciclo estándar de amplificación se recoge en la Tabla M.25. Tabla M 24: Mezcla de reacción para PCR del kit MyTaq™ DNA Polymerase ADN molde 10 – 500 ng Tampón Taq 5 x 10 µl Cebadores 10 µM MyTaq™ DNA Polymerase 1 µl Agua MilliQ® Hasta 50 µl Materiales y Métodos 97 Tabla M 25: Condiciones de reacción de amplificación con MyTaq™ DNA Polymerase Temperatura Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 95C 1 minuto 1 Desnaturalización 95C 15 segundos 25-30 Alineamiento 45 – 65C * 15 segundos Extensión 72C † Extensión final 72C 10 segundos 1 *La temperatura de alineamiento depende de los cebadores utilizados †El tiempo de extensión depende del tamaño del fragmento a amplificar. Entre 15-30 segundos por kb. En los casos en que era imprescindible que el ADN amplificado no presentara mutaciones se utilizó la polimerasa de alta afinidad comercial VELOCITY DNA Polymerase de BIOLINE, que posee actividad correctora de errores. Los componentes de la reacción aparecen en la Tabla M.26. El ciclo estándar de amplificación se recoge en la Tabla M.27. Tabla M 26: Mezcla de reacción para PCR del kit VELOCITY DNA Polymerase ADN molde 10 – 500 ng Tampón Hi-Fi Taq 5 x 10 µl Mezcla dNTP 10 µM 5 µl Cebadores 10 µM VELOCITY DNA Polymerase 1 µl Agua MilliQ® Hasta 50 µl Tabla M 27: Condiciones de reacción de amplificación del kit VELOCITY DNA Polymerase Temperatura Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 98C 2 minutos 1 Desnaturalización 98C 30 segundos 25-30 Alineamiento 50 – 68C * 30 segundos Extensión 72C † Extensión final 72C 4 minutos 1 *La temperatura de alineamiento depende de los cebadores utilizados. †El tiempo de extensión depende del tamaño del fragmento a amplificar (30 segundos por kb). Los productos de PCR necesarios para las construcciones se clonaron utilizando los sistemas pSpark® DNA cloning system (Canvax) o Zero Blunt® PCR cloning kit (Invitrogen™), siguiendo las instrucciones del fabricante. Materiales y Métodos 98 2.1.3.3 PCR de colonias bacterianas Para realizar una primera criba en la selección de transformantes de E. coli se realizó una reacción de PCR utilizando como molde biomasa bacteriana, obtenida de las placas de siembra. Los componentes de la reacción aparecen en la Tabla M.24, sustituyendo el ADN molde por la colonia a analizar. Las condiciones de reacción se recogen en la Tabla M.25, con la salvedad de que en este caso es necesaria una desnaturalización inicial de 5 minutos para asegurar la lisis bacteriana y la liberación del ADN molde a amplificar. 2.1.4 Electroforesis de ADN en geles de agarosa La electroforesis de ácidos nucleicos se llevó a cabo según se describe en (Sambrook & Russell, 2001). El ADN se analizó en geles horizontales de agarosa al 0,8-2 % (p/v) preparados con TBE 0,5X o TAE 1X (Tabla M.28) en el caso de necesitarse mayor eficiencia en la purificación de las bandas de ADN, añadiendo 0,5 µg ml-1 de bromuro de etidio para visualizar el ADN a la luz UV. A las muestras se les añadió tampón de carga de ADN 6X y se dispusieron en los pocillos del gel. El gel se sumergió en el mismo tampón utilizado para su preparación y se aplicó un voltaje entre 70-120 V. El tamaño de los fragmentos se estimó por comparación con un marcador de peso molecular comercial (1kb DNA Ladder, Invitrogen™) o con ADN del fago ʎ digerido con HindIII. Para fotografiar los geles se utilizó un sistema ChemiDoc™ XRS (Bio-Rad, California, EE. UU.) y el análisis de las bandas se hizo con el software Quantity One® (Bio-Rad). Tabla M 28: Composición de los tampones de electroforesis de ADN TBE 10X TAE 50X Tris Base 108 g l-1 Tris Base 242 g l-1 Ácido Bórico 55 g l-1 Ácido acético glacial 5,71 % (v/v) EDTA pH 8,0 10 mM EDTA pH 8,0 50 mM 2.1.5 Purificación de ADN El ADN se purificó directamente de los productos de PCR o bien de las bandas de interés recortadas del gel de TAE y se purificaron utilizando el kit comercial ISOLATE II Gel and PCR (Bioline) siguiendo las instrucciones del fabricante. Materiales y Métodos 99 2.1.6 Manipulación enzimática del ADN 2.1.6.1 Digestión del ADN con enzimas de restricción Las digestiones de ADN con endonucleasas de restricción se realizaron utilizando los tampones y las condiciones de digestión recomendadas por el fabricante para cada enzima. Se prepararon soluciones de ADN de entre 50-100 ng µl-1, 1 U de enzima por µg de ADN y el tampón correspondiente en un volumen total de entre 25-50 µl. La mezcla de digestión se incubó durante el tiempo de máxima actividad de cada enzima a la temperatura correspondiente. La digestión conjunta de varias enzimas se realizó con el tampón en el que ambas presentaran las mejores actividades de corte. Si no fuese posible, se realizaron digestiones escalonadas ajustando las condiciones de reacción a cada caso. 2.1.6.2 Defosforilación de los extremos 5’ del ADN Se eliminaron los grupos fosfato de los extremos 5’ de los plásmidos utilizados como vectores de clonación para evitar su religación. Se añadieron 1-2 U de fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Roche) a los plásmidos previamente digeridos y se incubó la mezcla a 37C durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo se añadieron 4 µl de EDTA 0,5 M pH 8,0 y 10 µl de SDS 10 % y se incubó a 65C durante 10 minutos para inactivar la fosfatasa alcalina. Los plásmidos se purificaron con un kit comercial tal y como se describe en el apartado 2.3.6. 2.1.6.3 Ligación de fragmentos de ADN Para la ligación de fragmentos de ADN se preparó una reacción de 20 µl de volumen final que contenía 1 U de ligasa T4 (Invitrogen™) y 4 µl del tampón de ligación (5X) con una proporción de inserto: vector de 3:1 con respecto a su peso molecular (se hizo uso de la herramienta https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation para calcularlo). Se incubó durante 16-18 horas a temperatura ambiente, y se inactivó la enzima calentando la mezcla a 65C durante 10 minutos. Para la transformación de bacterias o levaduras se utilizaron 10 µl de la reacción de ligación previamente enfriadas a 4C. https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation Materiales y Métodos 100 2.1.6.4 Secuenciación de ADN Las reacciones de secuenciación de ADN fueron realizadas, con los cebadores correspondientes para cada caso, por la empresa de secuenciación STABVida (Campus FCT UNL, Portugal) 2.2 Purificación y análisis del ARN 2.2.1 Extracción de ARN vegetal y síntesis de ADNc La extracción de ARN de A. thaliana tanto para la cuantificación de la expresión génica por PCR en tiempo real; así como para las construcciones de vectores de planta, levadura y bacteria se realizó con el kit comercial de extracción ISOLATE II RNA Plant Kit de Bioline siguiendo las instrucciones del fabricante. El material vegetal se congeló inmediatamente al adicionar N2 líquido tras recogerse. A continuación, se trituró en un mortero con una maza añadiendo N2 para mantener la muestra congelada hasta que el material fue homogéneo. La concentración de las muestras de ARN y su calidad se determinaron con el sistema Nanodrop© ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). Para la obtención del ADNc a partir del ARNm se realizó una RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction). Para ello se utilizó el kit comercial QuantiTect® Reverse Transcription Kit de QIAGEN, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc se generó utilizando la retrotranscriptasa Quantiscript y una mezcla optimizada de oligo-dT y cebadores aleatorios que permiten la síntesis de ADNc desde todas las regiones del ARNm, incluyendo el extremo 5’. Si las muestras iban a ser utilizadas posteriormente en una qPCR, el volumen de ARNm de cada reacción se ajustó para obtener en todas ellas una concentración de ADNc idéntica. 2.2.2 Cuantificación relativa de la expresión génica La expresión relativa de los genes de interés de esta Tesis se realizó mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real o RT-qPCR (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction). Esta técnica se basa en la detección y cuantificación de los niveles de ARNm de un gen de interés (gen diana), permitiendo la estimación de sus niveles de expresión mediante la generación de fluorescencia en la reacción de amplificación. Para ello es imprescindible la presencia del ADNc sintetizado a partir de las muestras de ARNm a analizar, cebadores concretos para los genes diana (Anexo 1: Cebadores) y un agente intercalante (en este caso SYBR® Green) para generar la fluorescencia. Materiales y Métodos 101 Para la RT-qPCR se utilizó el kit iQ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad) que contiene los componentes necesarios (ADN polimerasa, fluorescente SYBR® Green, MgCl2) y un termociclador iQ™5 (Bio-Rad). Las reacciones se prepararon a 4C en placas de 96 pocillos PCR® Microplate (Axygen INC.) selladas con un film óptico autoadhesivo para evitar la evaporación durante la reacción. Los componentes añadidos a cada reacción (con un volumen final de 10 µl) se recogen en la Tabla M.29. Los ciclos de reacción de amplificación se muestran en la Tabla M.30. Tabla M 29: Mezcla de reacción para RT-qPCR ADNc 0,5 µg iQ™ SYBR® Green supermix (2X) 5 µl Mezcla de cebadores forward y reverse (10 µM) 1 µl Agua MilliQ® Hasta 10 µl Tabla M 30: Reacción de amplificación de RT-qPCR Temperatura Tiempo Ciclos Activación enzimática 95C 10 minutos 1 Desnaturalización 95C 15 segundos 30-35 Hibridación-amplificación 60C 1 minuto Como se ha mencionado anteriormente, la técnica RT-qPCR muestra una cuantificación relativa de la expresión de un gen, ya que se compara la cantidad del ARNm de un gen diana respecto a la cantidad de ARNm de un gen constitutivo cuyos valores de expresión no varían en ninguna condición experimental. El valor fundamental de esta cuantificación es el CT (Threshold Cycle), que se define como el ciclo de la PCR en el que la señal de fluorescencia cruza la línea umbral, y se relaciona con la detección del producto de PCR acumulado. Este punto aparece en la fase exponencial de la reacción, lo que permite establecer una relación lineal entre el logaritmo del cambio fluorescencia y el número de ciclos. Los niveles de expresión se determinaron mediante el método del CT comparativo (Método 2-ΔΔCT) (Livak & Schmittgen, 2001). En él se comparan directamente los CT del gen diana y el gen constitutivo (ΔCT) en cada muestra, y posteriormente se comparan los ΔCT de la muestra problema con respecto a la muestra de referencia. Los cálculos se describen a continuación: A partir de los valores CT de cada muestra tanto para el gen diana como para el gen endógeno se obtiene el valor ΔCT: ΔCT = CT (gen diana) - CT (gen endógeno) Una vez obtenidos los valores ΔCT para cada muestra y condición se calcula el valor ΔΔCT: Materiales y Métodos 102 ΔΔCT = ΔCT (muestra problema) - ΔCT (muestra de referencia) Finalmente se calcula el valor FC (‘Fold Change’): FC = 2(-ΔΔCt) Este valor permite conocer la expresión relativa del gen de interés con respecto al gen endógeno: • FC = 1: Expresión similar del gen diana en las condiciones control y las condiciones problema. • FC < 1: Represión del gen de interés en las condiciones problema • FC > 1: Inducción del gen de interés en las condiciones problema 2.2.3 Síntesis de ARNc mediante transcripción in vitro (IVT) 10 µg del ADN insertado en el plásmido de ovocitos se linealizaron por digestión enzimática (Mat y Met 2.1.6.1). A continuación, se añadieron 30 µl de agua MiliQ, 100 µl de una mezcla fenol/cloroformo/ alcohol isoamílico (25:24:1) y se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 5 minutos. Se recuperó la fase superior y transfirió a un nuevo microtubo Eppendorf de 2 ml, donde se añadió el mismo volumen de una solución de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y se centrifugó de nuevo a 13000 r.p.m. durante 5 minutos. La fase superior se recuperó en un nuevo microtubo y se añadieron 1/10 del volumen de acetato sódico 3 M pH 5,2 y dos volúmenes de etanol. La mezcla se incubó durante 30 minutos a -20C, se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 15 minutos, se retiró el sobrenadante y se disolvió el precipitado en 500 µl de etanol 70% y se volvió a centrifugar en las mismas condiciones. Tras la centrifugación, se retiró el sobrenadante y se dejó secar el precipitado, para posteriormente añadirle agua miliQ hasta alcanzar una concentración entre 0,5 y 1 µg µl-1. Para generar el ARNc se utilizó el kit HiScribe T7 ARCA mRNA (New England Biolabs). Cada mezcla de reacción (Tabla M.31) se preparó en un volumen final de 30 µl y se incubó durante 1 hora a 37C. Tabla M 31: Mezcla de reacción para la síntesis de ARNc ADN 2,5 µg 2X ARCA/NTP Mix 5 µl T7 RNA polimerasa Mix 1 µl Los productos de la transcripción se purificaron por precipitación con LiCl y etanol: se añadieron 25 µl de la solución de LiCl incluida en el kit a la mezcla de reacción y se incubaron a -20C durante al menos 30 minutos. A continuación, se centrifugaron a 4C durante 30 minutos, precipitando el ARN que posteriormente se lavó con 500 µl de etanol 70% frío. Tras retirar el etanol, el precipitado se disolvió en 22 µl de agua MilliQ®. Materiales y Métodos 103 2.3 Fosforilación in vitro de fragmentos de la proteína NRT1.4/NPF6.2 2.3.1 Purificación de proteínas de E. coli Para la purificación del fragmento de la proteína NRT1.4/NPF6.2 (F92-F102) con la treonina 98 nativa (T98) o mutada (T98A) se transformó la cepa de E. coli Rosetta™ 2 (DE3)pLysS con la región de aminoácidos NRT1.4F92 a NRT1.4F102 unido a GST en el plásmido pGEX4T1. A partir de un transformante se preparó un cultivo líquido de medio LB y se incubó durante toda la noche a 37C y 150 r.p.m. A continuación, se tomaron 2,5 ml del cultivo y se añadieron a 50 ml de 2 x YTA + 100 mg l-1 de ampicilina y se incubaron a 37C y 150 r.p.m. Tabla M 32: Composición del medio 2 x YTA Compuesto Concentración Triptona 16 % (p/v) Extracto de levadura 10 % (p/v) NaCl 5 % (p/v) Cuando el medio alcanzó una DO600nm de 0,6-0,8 se indujo la proteína mediante la adición de 0,1 mM de IPTG (Sigma). Tras 24 horas de inducción, el cultivo se centrifugó 20 minutos a 5000 r.p.m. y las células se resuspendieron en 10 ml de tampón 1xPBS (20 mM Tris-HCl pH 7,8, 150 mM NaCl). A continuación, las células se lisaron en frío utilizando un sonicador Branson Digital Sonifier con 3 pulsos de 30 segundos con un descanso de 1 minuto y un 20 % de amplitud. Al lisado se le añadió PMSF 1mM y se centrifugó durante 10 minutos a 4C y 10.000 r.p.m. para descartar los restos celulares que quedaron en el precipitado. Las proteínas contenidas en el sobrenadante se purificaron por cromatografía de afinidad. Se utilizó para ello el sistema Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare Bio- Sciences). El extracto de proteínas se incubó con 300 µl de la matriz, que había sido previamente equilibrada con tampón 1xPBS, durante 16 horas a 4C en agitación constante. Las proteínas no unidas a la matriz se retiraron tras un lavado con 5 ml de 1xPBS y otro con 2 ml de Tris-HCl 20 mM pH 7,5. La proteína de interés fue eluída de la matriz utilizando 300 µl de Tris-HCl 20 mM, 25 mM glutatión (GSH), pH 7,5. Se recogieron entre 5 y 8 fracciones de 50 µl de proteína purificada. 2.3.2 Electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) Los extractos de proteínas y las fracciones purificadas se analizaron mediante geles SDS-PAGE según el protocolo descrito en Sambrook (2001). A cada muestra se añadió Materiales y Métodos 104 tampón Laemmli 4X. Para la electroforesis se utilizó el sistema Mighty Small SE 250 (GE Healthcare Bio-Sciences), a 20 mA durante aproximadamente 1 hora. Tabla M 33: Composición del Tampón Laemmli 4X Compuesto Concentración Tris-HCl pH 6,8 250 mM SDS 4 % (p/v) β-mercaptoetanol 10 % (p/v) Glicerol 40 % (v/v) Azul de bromofenol 100 µg ml-1 Tabla M 34: Composición del gel de acrilamida Gel separador 12% (Vf = 15 ml) Gel concentrador 5% (Vf = 5 ml) Agua Mili-Q 4.9 ml Agua Mili-Q 3,4 ml 30% Acrilamida 6 ml 30% Acrilamida 0,83 ml 1.5 M Tris-HCl pH 8,8 8,8 ml 1 M Tris pH 6,8 0,63 ml 10% SDS 0,15 ml 10% SDS 0,05 ml 10% APS 0,15 ml 10% APS 0,05 ml TEMED 0,006 ml TEMED 0,005 ml Tabla M 35: Composición del tampón de electroforesis Compuesto Concentración 10X Tris Base 250 mM Glicina 1,94 M SDS 1 % (p/v) *El pH se ajustó a 8,3 2.3.3 Tinción Coomassie Las proteínas contenidas en los geles de acrilamida se tiñeron en dos etapas según el protocolo de Bradford (1976). En primer lugar, el gel se incubó en solución de tinción Coomassie con agitación suave a temperatura ambiente durante al menos 1 hora. Una vez eliminada la solución de tinción, el gel se incubó en una solución de decoloración hasta que aparecieron las bandas nítidas de proteína sin tinción de fondo en el gel. Materiales y Métodos 105 Tabla M 36: Composición de la solución de tinción Coomassie Compuesto Concentración Ácido acético glacial 50 % (v/v) Metanol 10 % (v/v) Azul brillante de Coomassie R-250 0,25 % (p/v) Tabla M 37: Composición de decoloración Compuesto Concentración Ácido acético glacial 10 % (v/v) Metanol 10 % (v/v) 2.3.4 Fosforilación in vitro Alrededor de 2 µg de los sustratos formados por las proteínas recombinantes GST:NRT1.4 (F92-F102) o de caseína (Duchefa) fueron fosforilados in vitro por el dominio kinasa de la proteína CIPK23 (CIPK23-ΔC-T190D) (Chaves-Sanjuan et al., 2014) en 20 µl de buffer (20mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM MgCl2, 1 mM DTT). Las reacciones comenzaron con la adición de ATP (0,5 mM con 20 µCi de [γ-32P] ATP), se incubaron a 30C durante 30 minutos y se pararon con 5,5 µl de tampón Laemmli 5X. Las alícuotas se cargaron en un gel SDS- PAGE 12% que se reveló por autorradiografía mediante un sistema Cyclone® Plus (Perkin Elmer). 2.4 Manipulación de microorganismos 2.4.1 Transformación de bacterias 2.4.1.1 Trasformación E. coli por choque térmico Las células competentes de E. coli One Shot® TOP10, DH5α y XL10 Gold fueron transformadas por choque térmico (Hanahan, 1983). Se añadieron 10-100 ng del ADN plasmídico a un volumen aproximado de 100 µl de células transformantes en un microtubo Eppendorf de 1,5 ml, que se incubó durante 30 minutos en hielo y a continuación se introdujo en un baño a 42C durante 40 segundos. Tras el choque térmico se colocó en hielo durante 2 minutos, se añadió 1 ml de medio LB (Tabla M.2) y se incubó durante 1 hora a 37C. Las células se recuperaron tras una centrifugación a 13000 r.p.m. durante 1 minuto y se extendieron en placas de LB suplementadas con el antibiótico apropiado con la ayuda de bolas de vidrio estériles de 4 mm de diámetro. Las placas se incubaron durante 16-24 horas en oscuridad a 37C. Materiales y Métodos 106 2.4.1.2 Trasformación E. coli y A. tumefaciens por electroporación Para la transformación de células competentes de E. coli Rosetta™ 2 (DE3) pLysS se añadieron 10-100 ng del ADN plasmídico a un volumen aproximado de 100 µl de células transformantes y se transfirió la mezcla a una cubeta de electroporación (2 mm, BioRad). La solución se sometió a un pulso eléctrico de 2,5 kV en un sistema de electroporación Micro Pulser (Bio-Rad). Inmediatamente se añadió 1 ml de medio LB líquido y se agitó la muestra durante una hora a 37C a 200 r.p.m. A continuación, las bacterias se sembraron en placas de LB sólido suplementadas con los antibióticos correspondientes y se incubaron 16 h aproximadamente en oscuridad a 37C. Para la transformación de células competentes de A.tumefaciens se añadieron 50 ng de ADN a 100 µl de células transformantes y se transfirió la mezcla a una cubeta de electroporación. La solución se sometió a un pulso eléctrico de 2,2 kV. Inmediatamente se añadieron 2 ml de medio YEP (Tabla M.4) y se incubó la muestra durante 3 horas a 30C. Finalmente, las bacterias se sembraron en placas de LB suplementadas con los antibióticos correspondientes y se incubaron aproximadamente 24 horas en oscuridad a 30C. 2.4.2 Transformación de levaduras 2.4.2.1 Saccharomyces cerevisiae La transformación de S. cerevisiae se ha llevado a cabo siguiendo el método de acetato de litio/PEG (Gietz & Schiestl, 2007). Se inoculó una colonia de la estirpe a transformar en 25 ml de medio YPD (Tabla M.5), suplementado con 50 mM de potasio en el caso de utilizar la cepa TTE9.3, y se incubó entre 16-18 horas a 30C en agitación constante a 200 r.p.m. Tras alcanzar una DO600nm de 1,5-2 (por encima de 1,5 x 107 células), el cultivo se centrifugó 5 minutos a 2500 r.p.m., se retiró el sobrenadante y se lavaron las células en tres pasos con agua estéril, centrifugándose entre cada paso. Tras una última centrifugación se resuspendieron las células en 500 µl y se distribuyeron en microtubos Eppendorfs de 1,5 ml alícuotas de 100 µl. Cada alícuota se centrifugó durante 30 segundos a 13000 r.p.m., se retiró el sobrenadante y se añadió la mezcla de transformación recogida en la Tabla M.38. Tabla M 38: Composición de la mezcla de transformación de S. cerevisiae Compuesto y concentración Volumen PEG 3350 (50 % p/v) 240 µl LiAc 1.0 M 36 µl Carrier DNA desnaturalizado (2,0 mg ml-1) 50 µl Vector de DNA 2 µg Materiales y Métodos 107 Las células con la mezcla de transformación se incubaron a 42C. Transcurridos 45 minutos, se centrifugó 5 minutos a 13000 r.p.m. y se retiró el sobrenadante. Tras resuspender las células en 100 µl de agua estéril se extendieron distintos volúmenes (20 µl-200 µl) en placas de medio selectivo suplementadas con la auxotrofía apropiada con la ayuda de bolas de vidrio estériles de 4 mm de diámetro. Las placas se incubaron 2-4 días en oscuridad a 30C. 2.4.2.2 Hansenula polymorpha La transformación de H. polymorpha se ha llevado a cabo por electroporación (Sudbery et al., 1988). Las centrifugaciones de este protocolo se hicieron a 2.500 x g, 5 minutos y temperatura ambiente salvo excepciones mencionadas. Previamente a la electroporación fue necesaria la preparación de las células. Se inoculó una colonia de la estirpe a transformar en 5 ml de medio YPD (Tabla M.5) y se incubó 16-18 horas a 37C en agitación constante (200 r.p.m.). A continuación, se recogieron 2 ml del cultivo, se añadieron a 100 ml de medio YPD y se incubaron durante 5 horas en las mismas condiciones hasta que el cultivo alcanzó una DO600 de 1,5-2. Las células se recogieron tras una centrifugación, se diluyeron en 25 ml del tampón TED (Tabla M.39) y se incubaron durante 15 minutos a 37C en agitación constante a 200 r.p.m. Las células recogidas tras una centrifugación se lavaron dos veces con tampón STM frío (Tabla M.40) (la primera con un volumen de 100 ml y la segunda con 25 ml) seguidos de sendas centrifugaciones a 4C. Las células se resuspendieron en 250 µl de tampón STM y se repartieron en microtubos Eppendorf de 1,5 ml en alícuotas de 60 µl. Tabla M 39: Composición del tampón TED Compuesto Concentración Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM EDTA (pH 8,0) 50 mM Dithiothreitol DTT 25 mM Tabla M 40: Composición del tampón STM Compuesto Concentración Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM Sacarosa 270 mM MgCl2 1 mM Cada alícuota se transformó con hasta 4 µl de DNA (entre 2 y 5 µg), se colocó en una cubeta de electroporación de 2 mm y fue sometida a un pulso de 50 µF, 129 Ω y 1,5 kV (7,5 Materiales y Métodos 108 kV/cm). Inmediatamente se añadieron 940 µl de medio YPD, se recogió la muestra en un microtubo Eppendorf de 2 ml y se incubó a 37C y agitación constante (200 r.p.m.) durante 1 hora. Transcurrido ese tiempo, los microtubos se centrifugaron, las células se diluyeron en 1 ml de agua estéril y posteriormente se extendieron distintos volúmenes de las mismas (20 µl, 100 µl o 200 µl) en placas de medio selectivo YNB (Tabla M.9) suplementadas o no con la auxotrofía apropiada, con la ayuda de bolas de vidrio estériles de 4 mm de diámetro. Las placas se incubaron 2-4 días en oscuridad a 37C. 2.4.3 Caracterización de levaduras 2.4.3.1 Análisis fenotípico por tamaño de colonias Saccharomyces cerevisiae Para comprobar la capacidad de transportar potasio y el sentido de este transporte del transportador de nitrato NRT1.4/NPF6.2WT y NRT1.4/NPF6.2V210M se utilizó como sistema heterólogo la levadura S. cerevisiae. La capacidad de los distintos transformantes de S. cerevisiae de crecer en diferentes concentraciones de potasio se determinó mediante la observación del crecimiento de colonias en distintos medios de cultivo (dot-spot en inglés). Para llevar a cabo este experimento se utilizó el vector pYPGE_GFP-A206K (Anexo 2: Plásmidos) con los genes de NRT1.4WT o NRT1.4V210M. Las cepas W303 (WT), 9.3 y AXT3K se transformaron mediante el método de acetato de litio/PEG (Mat y Met 2.4.2). Una vez transformadas, se realizaron inóculos de una de las colonias de cada cepa en 4 ml de medio YPD (YPD + 50 mM de KCl en el inóculo de la cepa 9.3) y se incubaron a 30C y agitación constante (200 r.p.m.) durante 16-18 horas. Tras comprobar que los inóculos hubieran alcanzado la saturación (DO600nm ≈ 1) se recogió una alícuota de 1 ml del cultivo, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 2 minutos y se retiraron cuidadosamente 900 µl del sobrenadante para no arrastrar material celular. Las células se sometieron a tres lavados consecutivos con 900 µl de agua estéril, evitando el arrastre de células. Tras los lavados se comprobó que la DO600nm de todas las alícuotas eran iguales (absorbancia a 600 nm alrededor de 1) y se prepararon soluciones seriadas decimales (1:10, 1:100, 1:1.000). En placas de medio YPD + higromicina B, AP e YPD (pH 5,5) de distintas concentraciones de KCl se sembraron gotas de 5 µl en orden de mayor a menor concentración celular. Estas placas se incubaron a 30C de 48 a 72 horas y se fotografiaron después con una cámara Canon EOS D700. Hansenula polymorpha Para comprobar la capacidad de transportar nitrato de NRT1.4/NPF6.2WT y NRT1.4/NPF6.2V210M se utilizó como sistema heterólogo la H. polymorpha. Materiales y Métodos 109 Se utilizaron los vectores pYNR-EX NRT1.4WT y pYNR-EX NRT1.4V210M (Anexo 2: Plásmidos). La cepa Δynt1::URA3 se transformó mediante electroporación (Mat y Met 2.2.2). Una vez transformada, se realizaron inóculos con una de las colonias en 4 ml de medio YGNH (Tabla M.12) y se incubaron a 37C y agitación constante (200 r.p.m.) durante 24 horas. Tras comprobar que los inóculos han alcanzado la saturación (DO660nm ≈ 1), se recogió una alícuota de 1 ml de cultivo, se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 2 minutos y se retiraron cuidadosamente 900 µl del sobrenadante para no arrastrar material celular. Las células se resuspendieron en 900 µl de agua estéril y sometieron a tres lavados sucesivos con agua estéril. Tras los lavados se comprobó que la DO600nm de todas las alícuotas eran iguales (valores de absorbancia a 600 nm alrededor de 1) y se prepararon soluciones seriadas decimales (1:10, 1:100, 1:1000). En placas de medio YG + 0.5 mM KNO3 (Tabla M.13) o de medio YGNH se sembraron gotas de 5 µl en orden de mayor a menor concentración celular. Estas placas se incubaron a 37C de 48 a 72 horas y se fotografiaron después con una cámara Canon EOS D700. También se analizó el crecimiento de la levadura en medio líquido. Las cepas transformadas con pYNR-EX NRT1.4WT o pYNR-EX NRT1.4V210M (Anexo 2: Plásmidos) se crecieron en 2 ml de medio YGNH y se incubaron a 37C y agitación constante (200 r.p.m.) durante 24 horas. Tras comprobar que los cultivos han alcanzado la saturación (DO660nm ≈ 1) se recogió una alícuota de 1 ml de cultivo, se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 2 minutos y se retiraron 900 µl del sobrenadante con cuidado de no arrastrar material celular. Las células se resuspendieron en 900 µl de agua estéril y sometieron a tres lavados sucesivos con agua estéril. Tras los lavados se comprobó que el crecimiento de todos los cultivos era igual (valores de absorbancia a 600 nm alrededor de 1). De cada cultivo se recogieron 5 µl y se añadieron a un tubo de inóculo estéril de 10 ml con 1,995 ml de medio YG + 0,5 mM KNO3 o de medio YGNH. Estos cultivos se denominaron dilución 1. En otro tubo, se preparó una dilución centesimal (1:100) a partir de la dilución 1 y se incubaron ambos a 37C y agitación constante (200 r.p.m.) durante 48 horas. Para cuantificar el crecimiento de los cultivos, se colocaron alícuotas de 200 µl en una microplaca de 96 pocillos (Greiner bio- One) y se midió su DO660nm en un lector de microplacas Thermo Scientific™ Varioskan™ LUX a las 24 y 48 horas. 2.5 Análisis de la estructura radicular de A. thaliana Para visualizar la organización de las células de la columela de las raíces de las líneas HAK5:LUC y L14 se sembraron semillas esterilizadas en placas de medio MS 0,5x con sacarosa que se colocaron en posición vertical en cámaras de cultivo de día largo. Materiales y Métodos 110 2.5.1 Tinción con yoduro de propidio (IP) Se analizó la estructura de las células de la columela mediante una tinción con yoduro de propidio. Plántulas de 5 días se incubaron con yoduro de propidio 10 µM (Sigma Aldrich) durante 1 minuto en oscuridad y se lavaron dos veces con H2O MilliQ (Millipore®) durante 1 minuto. Las raíces se visualizaron en un microscopio confocal TCS SP2 (Leica Microsystems), del Servicio de Microscopía del IBVF (CSIC) con una  de excitación de 540 nm y  de emisión de 600-650 nm. 2.5.2 Tinción con Lugol Para analizar el contenido en amiloplastos de la columela de las raíces se realizó una tinción con Lugol. En primer lugar, los tejidos se clarificaron utilizando el protocolo de Malamy & Benfey, (1997) modificado. Plántulas de 5 días se incubaron en HCl 0,24 N (preparado en metanol al 20 %) a 57C durante 15 minutos. A continuación, se colocaron en una solución de NaOH al 7% (preparada en metanol al 60 %) y se incubaron a temperatura ambiente. Transcurridos 15 minutos las raíces se rehidrataron en baños sucesivos de 5 minutos en etanol al 40 %, 20 % y 10 %. Una vez clarificados, las plántulas se colocaron en una solución de Lugol (Sigma Aldrich) durante 5 minutos. Tras un lavado en agua desionizada se observaron inmediatamente en el microscopio de epifluorescencia Zeiss Axioscope. 2.6 Ensayo in vitro de bioluminiscencia La luciferasa de luciérnaga es uno de los genes reporteros más utilizados para el estudio de la expresión génica in vivo en plantas transgénicas, debido a su elevada sensibilidad y su sencillo manejo. Se trata de una proteína monomérica de aproximadamente 61 kDa que no requiere de ningún procesamiento para su actividad. Una de las estrategias para monitorizar la expresión de un gen de interés en respuesta a un determinado estrés consiste en la utilización de líneas transformadas con construcciones que poseen el gen de la luciferasa bajo la regulación del promotor del gen de interés (gen diana). De esta forma, todo aquel estímulo que incite a la expresión del gen diana provocará la interacción dinámica de los factores de transcripción con el promotor y por tanto la transcripción del gen reportero. Una vez transcrita y procesada, la luciferasa cataliza la carboxilación oxidativa de su sustrato, la luciferina, produciendo bioluminiscencia (Figura M.2). Si la reacción está optimizada se puede establecer una relación directa ente la luz producida por la reacción de quimioluminiscencia y la actividad transcripcional de, en este caso, el promotor del gen HAK5. Materiales y Métodos 111 Para la detección de bioluminiscencia se utilizó el equipo IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences), que posee una cámara CCD altamente sensible capaz de alcanzar los -90C necesarios para el ensayo. Los datos se analizaron mediante el programa Living Image® 4.2 (Caliper Life Science). La expresión del gen reportero de la luciferasa en las líneas de A. thaliana se registró siguiendo el protocolo establecido por Chinnusamy et al, (2002). Las semillas se esterilizaron, y tras permanecer 48 horas a 4C se sembraron en placas de medio LAK de 0,1 mM o 4 mM de KCl (Tabla M.16). Las placas se colocaron en cámaras de cultivo de día largo. El ensayo se realizó con plántulas de 3, 5 o 9 días dependiendo del experimento. En el momento del ensayo, las placas se pulverizaron con una solución de 1 mM de luciferina (Thermo Fisher Scientific) (Tabla M.41) y se incubaron en oscuridad durante 5 minutos para evitar interferencias ocasionadas por la fluorescencia natural de la clorofila. Transcurrido ese tiempo, se tomó la imagen de bioluminiscencia con los parámetros establecidos en la Tabla M.42. Tabla M 41: Composición del spray de luciferina 1 mM Compuesto Volumen 100 mM D-Luciferina 100 µl 0,01 % Tritón X-100 9,9 ml Tabla M 42: Configuración del programa Living Image® Exposición Ajustar hasta alcanzar máximo de RLU de 600 Binning Medium F/Stop 1 Emission filter Open Figura M.2: Esquema de la reacción de la luciferasa. Una vez sintetizada en la célula, la luciferasa cataliza la carboxilación oxidativa de su sustrato, la luciferina, produciendo bioluminiscencia Materiales y Métodos 112 La intensidad de la luminiscencia se cuantificó en regiones de interés o ROI (Region Of Interest) localizadas en las raíces de las plántulas. En cada experimento, estas regiones tuvieron la misma superficie con el objetivo de poder comparar plántulas crecidas en distintas placas de Petri. En primer lugar, la intensidad se midió mediante unidades relativas de luminiscencia o RLU (Relative Luminiscence Units), que son proporcionales al número de fotones detectados en un píxel que inciden sobre la cámara CCD, independientemente de su procedencia. Esta medida relativa es necesaria para la configuración del programa de análisis, cuyos parámetros (principalmente el tiempo de exposición) se ajustan hasta alcanzar un máximo de RLU máximo de 600 cuentas. A continuación, el modo de visualización de los datos de luminiscencia se cambió a Radiance, que es una medida absoluta de los fotones emitidos por el sujeto de estudio. Se mide en fotones/s/cm2/sr, o número de fotones por segundo que sale de un centímetro cuadrado de tejido e irradia en un ángulo sólido de un estereorradián. 2.7 Análisis del contenido iónico de A. thaliana 2.7.1 Preparación de muestras 2.7.1.1 Para distribución in toto Las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt1.4-2 y L14 de A. thaliana crecieron en cultivo hidropónico en medio LAK en condiciones variables de nitrato y/o KCl (Tabla M.15 o M.16) durante 5 semanas. Transcurrido este tiempo se recogieron 6 plantas de cada línea, se seccionaron en raíz y parte aérea, y cada parte se colocó en un tubo Eppendorf de 2 ml. Rápidamente, las muestras se pesaron (Peso fresco) y se colocaron en una estufa a 65C. A las 72 horas se volvieron a pesar (Peso seco), se añadieron 30 µl de agua MilliQ (Millipore®) por cada 10 mg de peso seco y se incubaron a 75C durante 2 horas. A continuación, las muestras se centrifugaron a 13000 r.p.m. durante 1 minuto, se recogió el sobrenadante y se almacenó a -20C durante al menos 16 horas. Para la cuantificación de nitrato mediante método colorimétrico se utilizaron 5 µl de las muestras de raíces o bien 5 µl de una dilución decimal (1:10) de las muestras procedentes de parte aérea. Para la cuantificación de potasio mediante ICP-OES se utilizaron 10 ml de una dilución 1:100 de las muestras de raíces y parte aérea 2.7.1.2 Para distribución foliar La preparación de las muestras para la medida de nitrato foliar se realizó siguiendo el método expuesto por Chiu et al. (2004) modificado para referenciar el contenido de peso Materiales y Métodos 113 fresco al contenido de proteínas solubles (ensayo Bradford, kit Bio-Rad Protein Assay). Se tomaron tres hojas de roseta de plantas independientes de las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt1.4-2 y L14 de A. thaliana crecidas durante 3 semanas en suelo. Las hojas se diseccionaron en peciolo y lámina, se pesaron y se colocaron en microtubos Eppendorfs de 2 ml a los que se añadieron 300 µl por cada 10 mg de material vegetal. Las muestras se homogeneizaron con émbolos de plástico previamente esterilizados y se centrifugaron a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió y se congeló a -20C durante al menos 16 horas. Se utilizaron 5 µl de una dilución decimal (1:10) de las muestras de peciolos y lámina para la cuantificación de nitrato mediante método colorimétrico. 2.7.2 Medida de nitrato por análisis colorimétrico Los niveles de nitrato se determinaron siguiendo el protocolo establecido por Cataldo et al., (1975) y modificado para trabajar con volúmenes pequeños por José María Colmenero (IRNAS, CSIC). El análisis colorimétrico de este método se basa en la capacidad del complejo formado por la nitración del ácido salicílico bajo condiciones de alta acidez (H2SO4) para absorber luz a un máximo de absorbancia de 410 nm en soluciones básicas (NaOH 4,75 M). La absorbancia del cromóforo es directamente proporcional a la cantidad de nitrato presente en la muestra. Las reacciones se llevaron a cabo en una microplaca de 96 pocillos (Greiner bio- One). En cada pocillo se añadieron 20 µl de salicilato al 10 % y 5 µl de muestra, pipeteando suavemente para mezclar los reactivos. A continuación, se añadieron 200 µl de NaOH 4,75 M lentamente y se incubó la microplaca en oscuridad durante media hora. Cuando en el ensayo se utilizaron muestras procedentes de material fresco (peciolos y láminas) fue necesario un blanco para cada muestra para minimizar el efecto que pudiese tener el contenido en pigmentos de cada planta en la medida. El blanco se preparó con 20 µl H2SO4 en lugar de salicilato al 10 %. Para muestras procedentes de material seco se utilizó un blanco único para todas las muestras, realizado con 5 µl de H2O en lugar de la muestra. Como patrón se utilizaron concentraciones entre 0 y 60 µg de nitrato (a partir de una solución de KNO3 2,4 g · l-1). La absorbancia se midió a 410 nm en un lector de microplacas Thermo Scientific™ Varioskan™ LUX. 2.7.3 Medida de potasio por espectroscopía de emisión atómica (ICP- OES) El plasma de acoplamiento inductivo o ICP (Inductively Coupled Plasma) es una fuente de ionización que junto a un espectrofotómetro de emisión óptico (OES, Optical Emision Spectrometry) constituye el equipo de ICP-OES. Se trata de una técnica analítica Materiales y Métodos 114 que permite la cuantificación de elementos químicos a nivel de traza en muestras en solución. Las muestras a analizar son nebulizadas, y el aerosol formado es transportado por argón a una antorcha de plasma. El plasma proporciona energía térmica a la muestra, llevándola a estados energéticos excitados. Al cesar la energía la muestra tiende a recuperar su estado fundamental, emitiendo espectros de radiación con una longitud de onda que es característica del elemento que la compone. Los espectros son dispersados por la red de difracción del aparato y el detector sensible a la luz se encarga de medir las intensidades de las líneas. La intensidad de las diferentes líneas de emisión es proporcional a la concentración de los elementos, que pueden procesarse por un sistema informático y cuantificarse utilizando curvas de calibrado apropiadas. El contenido en potasio de las muestras procedentes de parte aérea y raíz de Arabidopsis se analizó gracias al equipo Icap-7200 ICP-OES Duo (Thermo Fisher Scientific), presente en el Servicio de Espectroscopía del Instituto de Materiales de Sevilla (cicCartuja, CSIC). 2.7.4 Ensayo de toma de rubidio Para caracterizar la capacidad de absorción de potasio por las raíces de Arabidopsis en el rango de alta afinidad se ha determinado la capacidad de las raíces de absorber rubidio (Rb+), análogo del potasio, presente en el medio de incubación. Plantas crecidas durante cuatro semanas en cultivo hidropónico con medio LAK 1 mM de KCl se transfirieron a la misma solución nutritiva sin potasio durante 72 horas. Transcurrido este periodo, las plantas se incubaron durante 1 hora en medio LAK sin potasio al que se añadió 50 µM Rb+. De haberse modificado los tiempos de incubación se apuntará en el experimento en cuestión. A continuación, las raíces se sumergieron en CaSO4 1 mM frío durante 5 minutos. Inmediatamente se secaron las raíces con papel de filtro, se cosecharon la raíz y la parte aérea por separado y se determinaron los pesos frescos. Tras secar el material vegetal a 60C durante 3 días se determinaron también los pesos secos. La concentración de Rb+ en raíces y parte aérea se determinó mediante Espectroscopía de Absorción Atómica en el Servicio de Cromatografía Líquida (IRNAS, CSIC). 2.8 Análisis de hormonas en A. thaliana 2.8.1 Cuantificación de etileno liberado Para determinar el contenido de etileno liberado se recogieron 100-600 mg de plantas cultivadas durante 3 semanas en medio LAK (1 mM KCl), se pesaron y se introdujeron en viales de cristal de 12 ml de capacidad. Los viales se sellaron y el contenido de etileno liberado se midió a las 24 h por cromatografía de gases. Se inyectó 1 ml del gas Materiales y Métodos 115 del vial en un cromatógrafo de gases GC2010 Shimadzu equipado con una columna alúmina activada y un detector de ionización de llama. Las temperaturas del horno y el detector se mantuvieron a 80 y 150C respectivamente (Castellano y Vioque, 2002). 2.8.2 Cuantificación de hormonas Para determinar el contenido en giberelinas A1 y A4, la auxina ácido indol-acético, ácido abscísico, ácido jasmónico y ácido salicílico se recogieron plantas adultas de las líneas L14-1 y HAK5:LUC cultivadas durante 13 días en medio LAK (4 mM KCl). Una vez cosechadas se congelaron, liofilizaron y el contenido en hormonas se analizó mediante un equipo de UHPLC-espectrometría de masas (Q-Exactive, ThermoFisher Scientific) presente en el Servicio de Cuantificación de Hormonas Vegetales (IBMCP, CSIC; http://www.ibmcp.csic.es/es/servicios/cuantificacion-hormonas-vegetales). 2.9 Two-Electrode Voltage Clamp (TEVC) Con el objetivo de analizar el transporte iónico a través de distintos canales y transportadores de Arabidopsis thaliana, se ha utilizado la técnica electrofisiológica TEVC (Two-Electrode Voltage Clamp) en combinación con la expresión en el sistema heterólogo de ovocitos de Xenopus laevis. Esta técnica consiste en el siguiente proceso: cuando el electrodo sensor de voltaje (E) detecta una diferencia con el voltaje deseado (Vc), el amplificador genera inmediatamente una corriente opuesta a esa diferencia, que es inyectada en el ovocito a través del electrodo de corriente (i) para mantener el valor del potencial de membrana, Vm, constante. El potencial de membrana, por tanto, cambia inmediatamente al valor deseado (Vc). La corriente aplicada para mantener el potencial de membrana en el ovocito es directamente proporcional al flujo de corriente a través de la proteína transportadora en la membrana del ovocito (Guan et al., 2013) (Figura M.3). Los ovocitos se colocaron en una cámara de registro RC-1Z (Warner Instruments, Hamden) que se rellenó uniformemente con las soluciones pertinentes en cada experimento. Los microelectrodos se prepararon con capilares de borosilicato (Kwik-Fill™, Word Precision Instruments) en el puller MODEL P1000 (Sutter Instruments) y se rellenaron de solución KCl 3M. Tanto el microelectrodo de voltaje (E) como el de corriente (I) se colocaron en micromanipuladores M3301-M3-L y M3301-M3-R (WPI). Antes de comenzar las medidas los electrodos se sumergieron en la solución de ensayo y el gradiente de potencial se ajustó a cero. A continuación, se insertaron en los extremos del ovocito bajo controlando el proceso tanto por microscopía como por señal acústica. El microelectrodo de referencia se conectó al amplificador y se sumió en la cámara de medida, cerca del Materiales y Métodos 116 ovocito. Posteriormente, se midió el potencial de membrana de los ovocitos en la configuración whole-cell. El ordenador en el que se recogieron las medidas estaba conectado a amplificador Turbo TEC 10CX (NPI Electronics GmbH, Alemania). Los diferentes protocolos de voltaje y la adquisición de datos se llevaron a cabo con el programa PatchMaster (HEKA Electronik, Alemania) y con el sistema de adquisición de datos LIH 8+8 (HEKA Electronik), respectivamente. Los datos recogidos se analizaron con los programas Excel (Microsoft) e IGOR (WaveMetrics). 2.9.1 Protocolos de voltaje En las medidas de canal AKT1, para la medida de corrientes representativas (corrientes estacionarias, ISS) se utilizó el siguiente protocolo de voltaje: a partir de un voltaje inicial (VH) de -20 mV (500 ms), se aplicaron pulsos decrecientes de voltaje de 20mV desde +60 a -180 mV. Las corrientes estacionarias se recogieron al final de estos pulsos de 2000 ms de duración. Finalmente se aplicó un pulso de -60 mV (500 ms) (Figura M.4). Figura M.3: Representación esquemática de la técnica TEVC en ovocitos. Cuando el electrodo sensor de voltaje (E) detecta una diferencia con el voltaje deseado (Vc), el amplificador genera inmediatamente una corriente opuesta a esa diferencia, que es inyectada en el ovocito a través del electrodo de corriente (i) para mantener el valor del potencial de membrana, Vm, constante. El potencial de membrana, por tanto, cambia inmediatamente al valor deseado (Vc). La corriente aplicada para mantener el potencial de membrana en el ovocito es directamente proporcional al flujo de corriente a través de la proteína transportadora en la membrana del ovocito. Materiales y Métodos 117 En las medidas del transportador NRT1.4/NPF6.2 se midieron corrientes (3 a 4 ovocitos para cada condición) con pulsos decrecientes de voltaje de 20 mV desde +60 a - 180 mV de 1000 ms de duración. Las corrientes estacionarias se recogieron al final de estos pulsos. Finalmente se aplicó un pulso de -40 mV de 400 ms de duración (Noguero et al., 2018) (Figura M.5). Figura M.4: Protocolo de pulsos utilizado en las medidas de TEVC realizadas con ovocitos inyectados con el canal AKT1. A partir de un voltaje inicial (VH) de -20 mV (500 ms), se aplicaron pulsos decrecientes de voltaje de 20mV desde +60 a -180 mV. Las corrientes estacionarias se recogieron al final de estos pulsos de 2000 ms de duración. Finalmente se aplicó un pulso de -60 mV (500 ms). Figura M.5: Protocolo de pulsos utilizado en las medidas de TEVC realizadas con ovocitos inyectados con el transportador NRT1.4/NPF6.2. A partir de un voltaje inicial (VH) de -20 mV se aplicaron voltajes desde +60 a -180 mV de 1000 ms de duración. Las corrientes estacionarias se recogieron al final de estos pulsos. Finalmente se aplicó un pulso de -40 mV de 400 ms de duración Materiales y Métodos 118 2.9.2 Soluciones utilizadas Para la caracterización electrofisiológica de AKT1 se utilizó una solución compuesta por 1mM MgCl2, 2mM CaCl2 y 100 mM KCl; tamponada con 10 mM Tris/MES hasta un pH 7,4. En el caso de las medidas de corriente de NRT1.4/NPF6.2 se utilizó una solución compuesta por 220 mM de manitol, 1mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Tris/MES pH 6.0 a la que se añadió 0, 10 o 50 mM de KNO3. 2.10 Acumulación 15N en ovocitos Tres días después de la inyección de ARNc, tanto los ovocitos inyectados como aquellos control (no inyectados) se incubaron durante 2 horas en 2 ml de medio ND96 (pH 5,5) que contenía entre 0,1 y 30 mM de 15N-nitrato (abundancia atómica 15N: 99,9%). Para los experimentos a diferente pH, el medio ND96 se ajustó a pH 5,5 (MES), 6,5 (MES) o 7,5 (HEPES). Para los experimentos a diferentes concentraciones de potasio, se combinaron las soluciones K100 (1,8 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 100 mM KCl, 5 mM MES) y Na100 (1,8 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 5 mM MES) pH 5,5 (TRIS) en distintas proporciones (Tabla M.43) para mantener constante la fuerza iónica de la solución. Los ovocitos se lavaron 5 veces en 15 ml de medio ND96 (pH 5,5) a 4C y se colocaron en recipientes individuales para secarse a 65C durante 24 h. Tabla M 43: Composición de los medios Na100 y K100 Na100 K100 0 mM K+ 100 ml 0 ml 2 mM K+ 98 ml 2 ml 50 mM K+ 50 ml 50 ml Las muestras fueron analizadas por espectrometría isotópica de masas (Analizador Elemental Vario-PYROcube acoplado a un espectrómetro de masas IsoPrime Precision, Elementar). Después de la combustión a 920C en presencia de oxígeno y de CuO, las moléculas de gas resultantes de la muestra (principalmente H2O, CO2, N2 y óxidos de nitrógeno) se transportan por un vector de flujo de gas (helio ultrapuro) hacia un horno de reducción donde los óxidos de nitrógeno se reducen a N2 en presencia de cobre a 600C (reacción de Dumas). El H2O producido se retiene en columnas de SICAPENT (Merk). Los gases presentes se introducen en una columna TPD (Temperature Programmed Desorption), que el N2 atraviesa directamente mientras otros gases quedan atrapados a la columna. Un detector de conductividad térmica (TCD) permite la cuantificación de N total. El N2 es analizado a continuación por espectrometría de masas para determinar las abundancias isotópicas del 15N. Materiales y Métodos 119 2.11 Herramientas bioinformáticas Para acceder a la información actualizada de secuencias se han utilizado diferentes recursos web: TAIR (https://www.arabidopsis.org/), para la información sobre A. thaliana; UNIPROT (https://www.uniprot.org/), para la información sobre proteínas; T-DNA Express (http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress), para la consulta de secuencias de ADN-T. Para el manejo de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas se han utilizado las herramientas bioinformáticas presentes en el paquete DNA Star (DNASTAR, Inc. Madison), Snapgene® (GSL Biotech LLC) y el software MEGA-X. El portal http://bar.utoronto.ca/ se utilizó para obtener información de diferentes categorías, como proteómica, filogenia, niveles de expresión, etc. La herramienta BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) se utilizó para buscar similitud entre secuencias para encontrar genes o proteínas homólogas entre especies, así como para identificar miembros de una misma familia de genes. Para predecir la localización subcelular de proteínas se utilizaron las herramientas disponibles en el portal https://www.psort.org/ . Los cebadores se diseñaron sirviéndose de la herramienta PRIMER BLAST, dentro de los recursos del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) y se comprobó la presencia de primer-dimer o estructuras secundarias gracias al servicio de Thermo Fisher Scientific Multi Primer Analyzer. La síntesis de cebadores fue realizada por la empresa Sigma-Aldrich (MERCK KGaA). Algunas figuras se han realizado con la herramienta informática BIORENDER. Para los análisis estadísticos se utilizó el programa IBM® SPSS® Statistics v.26 para Windows (IBM Corporation). La comparación entre valores medios se realizó mediante ANOVA (Test de Tukey) o Test t-Student utilizando un p-valor menor de 0.05 salvo en los casos en los que se indique lo contrario. https://www.arabidopsis.org/ https://www.uniprot.org/ http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress http://bar.utoronto.ca/ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi https://www.psort.org/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Resultados Resultados 123 Capítulo 1: Obtención de mutantes afectados en la expresión del gen reportero HAK5:LUC. En un trabajo colaborativo entre los laboratorios del Dr. José Manuel Pardo (IBVF, CSIC-USE) y del Dr. Magdy Mahfouz (KAUST, Arabia Saudí) se abordó el aislamiento de mutantes de Arabidopsis thaliana con una respuesta alterada a la disponibilidad de potasio. Se eligió la mutagénesis química con metanosulfonato de etilo (EMS) porque, en contraposición a la inserción de ADN-T como mutágeno, el tratamiento con EMS permite la generación de cambios puntuales en el genoma que pueden favorecer la ganancia de función de reguladores o de miembros de familias multigénicas relacionados con la nutrición de potasio, así como ocasionar mutaciones no deletéreas en genes esenciales en este proceso. La mutagénesis se realizó sobre una línea de Arabidopsis Col-0 portadora de un gen reportero consistente en el promotor del gen HAK5 de Arabidopsis fusionado transcripcionalmente al gen LUC, codificante del enzima luciferasa, en adelante HAK5:LUC, descrita previamente (Jung et al., 2009). La transcripción del gen HAK5 nativo se induce en condiciones de déficit de potasio, nitrato o fosfato, aunque la actividad bioquímica de toma de potasio en el rango de alta afinidad dependiente de la proteína HAK5 sólo se estimula en condiciones de déficit de potasio (Planes et al., 2015). La expresión del gen reportero HAK5:LUC recapitula la inducción transcripcional de HAK5 en respuesta al déficit de potasio (Jung et al., 2009). Por tanto, la mutagénesis de la línea reportera HAK5:LUC permite el rastreo de mutantes afectados en la expresión de HAK5 mediante la monitorización de la bioluminiscencia provocada por la reacción de la luciferasa en presencia de su sustrato luciferina. Con esta aproximación experimental se pretendía descubrir nuevos reguladores y transportadores iónicos relacionados con la nutrición de potasio en Arabidopsis thaliana. 1.1 Procedimiento de obtención de mutantes, primeras generaciones Se mutagenizaron 2,5 g de semillas de la línea HAK5:LUC con metanosulfonato de etilo (EMS) al 0,3%. Este agente químico introduce cambios de C por T y G por A (Kim et al., 2006). Las semillas resultantes (M1), heterocigotas para las mutaciones inducidas, se germinaron en suelo y las plantas M1 se autopolinizaron para producir semillas M2. A continuación, las plantas M2 se agruparon en contingentes de 30 individuos y se recogieron sus semillas M3. Las germínulas M3 se inspeccionaron por bioluminiscencia en placas de Petri con el medio descrito por Jung et al. (2009). Este medio es una reformulación de la receta de Murashige y Skoog (MS) para contener distintos niveles de KCl. El rastreo genético se realizó con alto (5 mM) o bajo (0,1 mM) contenido de KCl. Se registraron dos tipos de fenotipo: 1) expresión constitutiva de HAK5:LUC en condiciones de suficiencia de potasio (mutantes COK, de Constitutive K-response), o bien 2) falta de inducción de HAK5:LUC en condiciones de hambre de potasio (mutantes LOK, de Loss of K-response). Resultados 124 Aquellas germínulas M3 que mostraron un fenotipo COK o LOK se transfirieron a tierra y se propagaron por autofecundación. Las semillas de cada planta se recogieron individualmente para generar líneas M4, que se volvieron a ensayar. Veinte semillas M4 de cada línea mutante se sembraron de nuevo en medio MS modificado con 0,1 ó 5 mM de KCl. Se repitió el ensayo de bioluminiscencia y se confirmó una línea COK (L14) y dos líneas LOK (L71 y L117). En las plantas M4 con fenotipo mutante se realizó una PCR diagnóstica seguida de secuenciación del amplicón para confirmar que la mutagénesis química no había afectado al gen HAK5. Los mutantes que cumplieron esta característica se trasplantaron en tierra para su propagación y obtención de semillas M5 que se transfirieron al grupo del IBVF para su caracterización detallada en relación con la nutrición de potasio. (Figura 1.1) Figura 1.1: Esquema de mutagénesis química con EMS para la obtención de líneas con respuesta alterada a potasio. (CONTINUACIÓN EN LA SIGUIENTE PÁGINA) Resultados 125 Figura 1.1: CONTINUACIÓN. Esquema de mutagénesis química con EMS para la obtención de líneas con respuesta alterada a potasio. Resultados 126 Para analizar con más detalle la dominancia o recesividad y la segregación de las mutaciones seleccionadas, las plantas M5 se cruzaron con su parental HAK5:LUC. Las plantas resultantes de este retrocruzamiento (back-cross; BC1F1) son heterocigotas para las mutaciones causantes del fenotipo y homocigotas para el gen reportero. En los mutantes COK, si los heterocigotos BC1F1 manifiestan bioluminiscencia al sembrar en alto potasio, la mutación o mutaciones causantes del fenotipo son dominantes; si no es así son recesivas. En los mutantes LOK, si los heterocigotos no expresan el gen reportero HAK5:LUC al sembrar en bajo potasio la mutación o mutaciones causantes del fenotipo son dominantes; si no es así son recesivas. En estos ensayos la línea COK L14 se comportó como semidominante, ya que las plantas BC1F1 presentaban bioluminiscencia en sus raíces en medio con 4 mM de KCl, aunque en menor medida que el mutante L14 (Figura 1.2). Las mutaciones presentes en las líneas LOK L71 y L117 se comportaron como recesivas en el retrocruzamiento BC1F1. El análisis de la segregación del fenotipo de los descendientes BC1F2 indicó que las mutaciones COK y LOK se comportaban como monogénicas (segregación 1:3). Las plantas BC1F2 que mostraban fenotipo se pasaron a tierra y se autofecundaron para producir semillas M6, con cuyas germínulas se realizó de nuevo un ensayo de bioluminiscencia y se seleccionaron las plántulas con fenotipo mutante, que serían homocigotas para la mutación causante del fenotipo. Como resultado de este rastreo genético se seleccionaron finalmente dos sublíneas de cada una de las tres líneas mutantes obtenidas. De la línea L14 se propagaron las sublíneas L14-2-1 y L14-2-3 con fenotipo COK. Con fenotipo LOK se seleccionaron las sublíneas L71-10-13-1, L71-10-19-8, L117-7-16-2 y L117-7-20-4. Para simplificar la notación, a partir de este punto las sublíneas COK L14-2-1 y L14-2-3 pasarán a denominarse L14-1 y L14-3, respectivamente, mientras que las Figura 1.2: Expresión del gen reportero HAK5:LUC en plántulas de las líneas HAK5:LUC, L14 y BC1F1 . Las plantas crecieron en medio LAK 4 mM de K+. Se analizó la expresión del gen reportero en los individuos de la F1 del cruzamiento de la línea L14 (generación M5) con su parental HAK5:LUC, así como la expresión en los parentales. Se cuantificó la señal en un área de igual superficie (ROI) en el ápice radicular de individuos analizados de las líneas L14 y BC1F1, obteniéndose unos valores de radiancia (p/s/cm2/sr) de 3,2±0,7 (x106) para la línea L14 (n=7), de 2,2±0,6 (x106) para la línea BC1F1 (n=7) y de 3,4±0,3 (x104) para la línea HAK5:LUC (n=3). Resultados 127 sublíneas LOK L71-10-13-1, L71-10-19-8, L117-7-16-2 y L117-7-20-4 serán L71-1, L71-8, L117-2 y L117-4. 1.2 Caracterización de líneas LOK (Loss of K+-response) Se analizó el contenido de potasio en plantas de las cuatro sublíneas mutantes LOK (L71-1, L71-8, L117-2 y L117-4) crecidas durante 3 semanas en cultivo hidropónico con medio LAK suplementado con 1 mM KCl, en invernadero y con ciclos día 14 h, 23C /noche 10 h, 20C. A continuación, se transfirieron a medio líquido LAK suplementado con 1 mM ó 10 mM de KCl, se incubaron durante 10 días en las mismas condiciones ambientales, y se recogieron para analizar los parámetros de crecimiento y los contenidos en potasio. Los resultados se muestran en la Figura 1.3. Las líneas mutantes LOK (L71 y L117) presentaron un crecimiento menor de la parte aérea comparadas con la línea parental HAK5:LUC en ambas condiciones de potasio, mientras que los resultados de crecimiento de las raíces fueron más heterogéneos ya que sólo dos sublíneas, L71-8 y L117-4, presentaron un menor crecimiento de raíz. Tanto en 1 mM como en 10 mM de KCl no hubo diferencias en los contenidos de potasio de la parte aérea entre las líneas mutantes y el control HAK5:LUC. En cambio, el contenido de potasio en raíces de las plantas mutantes fue significativamente inferior al de la línea control en 1 mM de KCl, pero estas diferencias desaparecieron en plantas crecidas en 10 mM de KCl. Tratamiento Línea Parte aérea Peso fresco (g) Raíz Peso fresco (g) Tallo K+ (mM) Raíz K+ (mM) Ratio K+ Tallo/Raíz 1 mM KCl HAK5:LUC 0,91±0,07 0,73±0,14 59,6±4,2 78,5±2,8 0,74±0,06 71-8 0,68±0,08 0,40±0,09 43,7±1,3 54,3±0,8 0,80±0,03 71-1 0,59±0,08 0,74±0,16 51,3±2,7 48,2±2,6 1,07±0,07 117-2 0,64±0,05 0,88±0,17 49,0±5,4 50,5±2,3 0,97±0,07 117-4 0,48±0,15 0,29±0,29 50,5±9,4 52,8±5,5 0,96±0,11 10 mM KCl HAK5:LUC 0,44±0,09 0,18±0,06 146,4±16,4 116,7±8,8 1,25±0,19 71-8 0,35±0,06 0,30±0,07 131,6±2,4 120,0±5,3 1,10±0,06 71-1 0,28±0,06 0,32±0,08 140,7±6,1 119,1±3,3 1,19±0,07 117-2 0,33±0,03 0,42±0,06 166,9±13,8 124,4±5,5 1,36±0,16 117-4 0,36±0,02 0,50±0,01 155,6±5,9 118,4±2,9 1,32±0,06 Tabla 1. 1: Contenido de potasio en líneas LOK. Las líneas crecieron durante 3 semanas en medio LAK 1 mM. A continuación se colocaron en LAK a 1 mM o 10 mM durante 3 días. Tabla con valores medios ± SD del peso fresco y contenido de potasio Resultados 128 Estos resultados demuestran que el rastreo genético realizado ha resultado en la selección de mutantes con niveles alterados de potasio en las raíces. También son coherentes con un déficit en la toma de potasio en los mutantes LOK en condiciones de disponibilidad moderada de potasio (1 mM), que es subsanable cuando la disponibilidad es muy alta (10 mM KCl). El hecho de que los mutantes LOK presenten una menor inducción del gen reportero HAK5:LUC en condiciones de bajo potasio al mismo tiempo que presentan menores contenidos de potasio en sus raíces sugiere que estos mutantes están afectados en la percepción o respuesta a unas condiciones en las que la disponibilidad de potasio puede ser limitante para el crecimiento. Para comprobar esta hipótesis, las plantas LOK se sometieron a ayuno de potasio y se midió su capacidad para tomar rubidio (Rb+) de una solución externa con 50 µM RbCl (Mat & Met 2.7.4). El fundamento de este experimento es que al incubar las plantas en una solución nutritiva libre de potasio durante 3-4 días, el 'hambre' de potasio dispara el mecanismo de alta afinidad de toma de potasio dependiente de HAK5, que se puede medir como la toma de Rb+ desde soluciones con concentraciones Figura 1.3: Contenido de potasio en líneas LOK de A. thaliana. Las líneas crecieron durante 3 semanas en medio LAK 1 mM. A continuación, se colocaron en LAK a 1 mM o 10 mM durante 3 días. Diagrama de barras de los valores medios del contenido en potasio para las líneas LOK ± SD (n=3-4). Estadístico t-Student para comprobar las diferencias entre cada línea mutante y HAK5:LUC (***p <0,01). Resultados 129 en el rango µM (Gierth et al., 2005). Los resultados mostrados en la Figura 1.4 indican que cuando las plantas de las líneas L17 y L117 se sometieron a hambre de potasio durante 3 días y a continuación se transfirieron a una solución de 50 µM RbCl, las sublíneas L71-1 y L71-8 mostraron una menor capacidad para tomar Rb+ en el rango de alta afinidad. Los resultados con las sublíneas L117-2 y L117-4 fueron menos concluyentes, aunque volvió a observarse que éstas tenían un menor contenido de potasio en sus raíces comparadas con la línea control HAK5:LUC. Figura 1.4: Contenido de potasio Rb+ en líneas LOK de A. thaliana. Las plantas crecieron durante 30 días en medio LAK. A continuación, se lavaron sus raíces con agua, se ayunaron de potasio durante 4 días y se colocaron en un medio con 50 µM RbCl durante 1 hora. Las barras muestran el valor medio ± SD (n=4-5). Estadístico t-Student para comprobar las diferencia entre la línea control (HAK5:LUC) y las líneas mutantes (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p <0,001). Resultados 130 1.3 Caracterización de la línea COK (Constitutive K+-response) Al igual que con las líneas LOK, se midieron los niveles de potasio en los tejidos de plantas de las sublíneas L14-1 y L14-3 con fenotipo COK (Constitutive K-response). La Figura 1.5 muestra los parámetros de crecimiento y contenido de potasio en tallos y raíces de plantas L14-1 y L14-3 crecidas durante 30 días en cultivo hidropónico en medio LAK con 1 mM KCl en invernadero y con ciclos día 14 h, 23C /noche 10 h, 20C. Ambas líneas se comportaron homogéneamente y mostraron un crecimiento reducido del tallo y de la raíz en comparación con la línea control HAK5:LUC. Además, y a diferencia de las líneas LOK, los niveles de potasio en tejidos fueron menores tanto en los tallos como en las raíces de las plantas mutantes. Figura 1.5: Contenido de potasio en líneas COK de A. thaliana. Las plantas crecieron durante 30 días en medio LAK 1 mM. (A) Gráfica con valores medios ± SD del peso seco de roseta y raíz de las dos sublíneas L14. (B) Diagrama de barras de los valores medios ± SD (n=6-8) del contenido en potasio para las líneas COK. Estadístico t-Student para comprobar las diferencias entre cada sublínea mutante y HAK5:LUC (*p <0,1 **p <0,05, ***p <0,01). Las diferencias entre mutantes no son significativas en ningún caso. Resultados 131 Esta disminución generalizada del contenido de potasio en plantas L14, junto con la facilidad del análisis de su fenotipo COK (expresión semiconstitutiva del gen reportero HAK5:LUC) y la coherencia de comportamiento de las dos sublíneas, llevó a la priorización de la línea L14 para la identificación de la mutación o mutaciones subyacentes. 1.4 Secuenciación e identificación de mutaciones en L14. Para la identificación del gen afectado en la línea mutante L14 se siguió la estrategia de mapping-by-sequencing (Candela et al., 2015; James et al., 2013). Se eligió este procedimiento en lugar del más clásico de cruce con un ecotipo diferente con polimorfismos naturales para el mapeo genético (p. e. out-cross con el ecotipo Landsberg) porque la mutación causal del fenotipo y el gen reportero HAK5:LUC debían estar presentes en ambos parentales. Además, el procedimiento mapping-by-sequencing permite una identificación molecular de las mutaciones mucho más rápida que por el procedimiento tradicional de mapeo. Se constituyeron las poblaciones de mapeo con germínulas L14-1 de la generación M6. Se sembraron en condiciones de alto potasio y se realizó un ensayo de bioluminiscencia. Se seleccionaron las germínulas que manifestaron el fenotipo COK, aproximadamente 60 individuos, y se secuenciaron con un equipo Illumina HiSeq 4000, con una cobertura de 20-35x lecturas simples para identificar los polimorfismos nucleotídicos (Single Nucleotide Polymorphisms o SNPs) con respecto a la secuencia de referencia depositada en la base de datos perteneciente al ecotipo Col-0 del parental HAK5:LUC. Estos polimorfismos serían atribuibles a la acción del agente mutagénico. A continuación, se buscaron en la población con fenotipo mutante las posiciones génicas que presentaran SNPs mutantes con una frecuencia alélica del 100% y que además tuvieran una baja o nula frecuencia del SNP silvestre. La mayoría de las mutaciones halladas en el análisis genómico de la línea L14 se agrupaban en un fragmento de 852 kb en el cromosoma 2 (Figura 1.6). Las mutaciones y su frecuencia se muestran en la Tabla 1.2. El hecho de que algunos polimorfismos registraran una frecuencia del 100% de nucleótidos mutados respecto a la secuencia de referencia, pero a su vez todavía se encontrara aproximadamente un 40% de coincidencias con la secuencia silvestre en esas mismas posiciones indica que la población secuenciada era una mezcla de individuos mutantes homocigotos y heterocigotos que manifestaban el fenotipo COK, lo que es coherente con el carácter semidominante de la mutación subyacente en la línea L14. Como se describe más en detalle en el Apartado 1.6, la línea L14 se purgó durante varias generaciones para eliminar mutaciones deletéreas para su crecimiento, pero conservando su fenotipo COK. Durante ese proceso las mutaciones descritas en la Tabla 1.2 se consiguieron en homocigosis. Resultados 132 Tabla 1. 2: Mutaciones halladas en la línea L14-1 a lo largo del cromosoma 2. En la tabla se representan la posición genómica del cambio de base, el cambio de aminoácido que implica, las frecuencias de los alelos (SNP) en las poblaciones mutante y silvestre, los genes en los que se enmarcan las mutaciones y la proteína a la que afectan. Posición genómica Cambio de aminoácido En población mutante Gen Proteína Frecuencia alelo mutante Frecuencia alelo silvestre 2590275 S/L 77,2 42,5 AT2G06530 VPS2.1 3625116 - 78,1 Ausente AT2G08986 Desconocida 6407909 E/Q 87,2 39,8 AT2G14910 Desconocida 6997367 G/E 75,8 57,4 AT2G16120 PMT1 7918254 D/N 85,2 54,3 AT2G18193 Desconocida 8313166 P/S 88,06 Ausente AT2G19160 Actividad transferasa 8350250 G/R 87,14 Ausente AT2G19240 Desconocida 8442256 S/F 92,5 48,57 AT2G19490 RECA2 8641087 R/H 98,55 41,94 AT2G20010 Desconocida 8972235 - 95,38 36,11 AT2G20840 Familia SCAMP 10132001 G/E 100 Ausente AT2G23800 GGPPS4 10541983 - 100 45,45 AT2G24755 Desconocida 10784032 G/S 100 39,7 AT2G25320 TRAF-like 11334975 W/Z 100 39,2 AT2G26650 AKT1 Figura 1.6: Frecuencia alélica de SNPs mutantes y silvestres a lo largo del cromosoma 2 en la línea mutante L14 tomando como referencia la secuencia del ecotipo Col-0 (WT). La línea Col-0 es parental de las línea L14 y HAK5:LUC. Los puntos significan mutaciones respecto a la secuencia patrón y los cuadrados la presencia de alelos silvestres en esas mismas posiciones. Resultados 133 11348616 V/M 100 37,5 AT2G26690 NRT1.4/NPF6.2 11975562 P/L 100 39 AT2G8100 FUC1 12515358 - 100 41,7 AT2G29120 GLR2.7 12604568 S/F 100 56,5 AT2G29360 NAD(P)- binding 12707166 V/V 100 43,96 AT2G29740 UGT71C2 13111313 K/K 100 40,3 AT2G30770 CYP71A13 13357371 R/H 98,25 42,31 AT2G31320 PARP1 14414283 E/K 87,1 Ausente AT2G34140 CDF4 15743149 G/D 85,51 52,94 AT2G37510 RNA-binding 15878483 P/L 86,4 41,9 AT2G37940 ERH1 Entre las mutaciones encontradas destaca la presente en el gen AKT1, que codifica para un canal de potasio previamente implicado en la nutrición de potasio de Arabidopsis (Hirsch et al., 1998). La mutación presente en la línea L14 supone la introducción de un codón de parada en la posición correspondiente al triptófano 135 de la proteína AKT1, lo que presumiblemente implicaría su pérdida de función (Figura 1.7). Junto con el transportador HAK5, el canal AKT1 es una de las principales vías de adquisición de potasio por las raíces de Arabidopsis (Nieves-Cordones et al., 2016 b) por lo que, en principio, la mutación de AKT1 podría conducir a la activación prematura y sostenida de HAK5 (y del gen reportero HAK5:LUC) para suplir la deficiencia sistémica de potasio provocada por la pérdida de función de AKT1. Para comprobar esta hipótesis, se midió la toma de Rb+ en el rango µM en plantas ayunadas y no ayunadas de las sublíneas L14-1 y L14-3 en comparación con el mutante akt1-2. Esta mutación resulta de la inserción de ADN-T en la zona codificante del gen AKT1 Figura 1.7: Modelo esquemático de la proteína AKT1. TM: dominio transmembrana; CNBD: dominio con homología de secuencia con bolsillos de unión de nucleótidos cíclicos; ANK: ankirina; KHA; dominio rico en residuos ácidos e hidrófobos necesario para la interacción entre las subunidades que constituyen un canal funcional. Resultados 134 y se considera que genera pérdida de función (Rubio et al., 2008). Como se muestra en la Figura 1.8 – A y B, las plantas L14-1 y L14-3 crecidas durante 30 días en medio hidropónico LAK con 1 mM KCl en invernadero y con ciclos día 14 h, 23C /noche 10 h, 20C y ayunadas de potasio durante 3 días tenían un porte mucho menor que las plantas control, como ya se ha mostrado antes (Figura 1.5), pero también en comparación con las plantas akt1-2. El contenido de potasio en los tallos de las plantas L14-1 y L14-3 fue igual o ligeramente superior al de las plantas akt1-2, respectivamente. En cambio, los niveles de potasio en las raíces de L14-1 y L14-3 fueron mucho menores que los del control HAK5:LUC y el mutante akt1-2 (Figura 1.8 - D). En esas condiciones experimentales, la mutación akt1-2 condujo a una pequeña activación de la toma de Rb+ en el rango µM, ilustrativo del transporte de alta afinidad de HAK5, pero esta respuesta fue mucho más robusta en las líneas L14-1 y L14-3 donde los contenidos de Rb+ fueron significativamente superiores a los medidos en las plantas control y akt1-2 (Figura 1.8 – E). Figura 1.8: Contenido de K+ y Rb+ en líneas COK de A. thaliana. Las plantas crecieron durante 30 días en medio LAK (1 mM K+). A continuación, se lavaron sus raíces con agua, se ayunaron de potasio durante 3 días y se transfirieron a un medio con 50 µM RbCl durante 1 hora. Las barras muestran un valor medio ± SD (n=4 plantas) de los pesos secos de roseta (A), raíz (B), contenido hídrico (C), contenido en potasio (D) y contenido en rubidio (E). Estadístico ANOVA (Test de Tukey) para comprobar la diferencia entre líneas. Diferentes letras identifican grupos estadísticamente diferentes con p <0,05. Resultados 135 Para comprobar si el sistema de alta afinidad de toma de potasio estaba ya conectado de manera constitutiva en las plantas de la línea L14, el experimento se repitió en las mismas condiciones, pero sin un ayuno de potasio previo a la transferencia a la solución de 50 µM de RbCl y con plantas crecidas en 1 mM ó 4 mM de KCl. Como puede observarse en la Figura 1.9, las plantas L14-1 y L14-3 crecidas en 1 mM de KCl volvieron a mostrar una capacidad de toma de Rb+ muy superior a las de las plantas HAK5:LUC y akt1- 2 sin ayuno previo, incluso aunque los contenidos de potasio en las plantas mutantes no era mucho menor al de las plantas control en esas condiciones. Esta activación constitutiva del sistema de transporte dependiente de HAK5 se canceló al subir el suplemento de KCl en el medio LAK de 1 mM a 4 mM (Figura 1.9, nótese la diferente escala en los contenidos de Rb+ en plantas crecidas en 1 mM ó 4 mM de KCl). Figura 1.9: Contenido de Rb+ en líneas L14. Las plantas crecieron durante 25 días en medio LAK (1 mM KCl). Posteriormente se transfirieron al mismo medio o a medio LAK con 4 mM KCl. Tras 11 días, las plantas de transfirieron, después de lavar las raíces con agua, a medio LAK sin KCl suplementado con 50 µM de RbCl. Tras 2 horas se recogieron las plantas, se lavaron las raíces con agua fría y se determinaron los niveles de K+ en tallos (columnas verdes) y raíces (columnas grises), y el contenido de Rb+ en raíces. Se muestran los valores de la media y la desviación estándar (n= 3 plantas). Estadístico ANOVA (Test de Tukey). Las diferentes letras indican valores estadísticamente diferentes en cada una de las determinaciones con p <0,05. Resultados 136 Esta activación del sistema de toma de potasio de alta afinidad se pudo confirmar también mediante el análisis la expresión del gen endógeno HAK5 por RT-qPCR (Mat&Met 2.2.2) en condiciones de hambre (0,1 mM) y suficiencia (4 mM) de potasio en las líneas silvestre (HAK5:LUC), el mutante akt1-2 y el mutante L14-1. Las plantas crecieron durante 5 semanas en cámara de cultivo en condiciones de día corto (día 8 h, 20C /noche 16 h, 18C). Para la detección de HAK5 se utilizaron los cebadores qHAK5 fwd y qHAK5 rev. Como control para la normalización se utilizaron los cebadores qUBQ fwd y qUBQ rev para amplificar el gen UBQ10 (Anexo 1: Cebadores). Tal y como se muestra en la Figura 1.10, la expresión de HAK5 fue significativamente superior en el mutante simple akt1-2 y en la línea L14 en comparación con el parental HAK5:LUC en condiciones de baja disponibilidad de potasio. Además, en condiciones de suficiencia de potasio, la expresión del gen HAK5 era significativamente superior en la línea L14 con respecto a las otras dos líneas. 1.5 Análisis de hormonas en las líneas L14 La deficiencia en la nutrición de potasio se señaliza en parte a través del incremento de la producción de etileno (Schachtman, 2015; Shin & Schachtman, 2004). Además, los datos obtenidos por Jung y colaboradores (2009) relacionan el aumento de la expresión de HAK5 en condiciones de hambre de potasio con la activación de componentes de la vía de señalización de etileno. Para comprobar este extremo, plantas control HAK5:LUC, del mutante akt1-2 y de las sublíneas L14-1 y L14-3 se crecieron en medio hidropónico LAK con 1 mM de KCl (ciclo noche-día: temperatura 21-23C, fotoperíodo 12h/12h) durante 3 semanas, tras lo cual 4-5 plantas de cada genotipo se encapsularon individualmente en viales herméticos durante 24 horas y se mantuvieron en las mismas condiciones climáticas para la determinación de la producción de etileno (Mat & Met 2.8.1) y de los contenidos Figura 1.10: Expresión del gen endógeno HAK5 en las líneas HAK5:LUC, akt1-2 y L14. La expresión se cuantifica en las raíces de plantas crecidas durante 5 semanas en medio LAK suplementado con 0,1 ó 4 mM de KCl. Como gen de referencia se utilizó UBQ10 y como muestra de referencia para ambas condiciones la expresión de HAK5 en HAK5:LUC a 0,1 mM de KCl. Estadístico ANOVA (Test de Tukey, n=3), p <0,05. Resultados 137 de potasio en cada una de ellas. Como se recoge en la Figura 1.11, los resultados mostraron que aunque el contenido de potasio era menor en las tres líneas mutantes en comparación con el control, sólo las plantas akt1-2 mostraron un incremento en la producción de etileno, que fue poco significativo estadísticamente en comparación con las plantas control HAK5:LUC (p=0,248, test t-Student, n=4) pero diferentes en relación a los niveles de etileno en las plantas L14-1 y L14-3 (p=0,046 y p=0,094, respectivamente) debido a que, sorprendentemente, las plantas L14 mostraron un comportamiento opuesto a akt1-2, con una tendencia hacia la menor producción de etileno que las plantas control. Por otra parte, la producción de ácido jasmónico también se ha relacionado con la señalización del estatus nutricional de potasio en Arabidopsis. Condiciones limitantes de potasio suponen un significativo incremento en la expresión de genes relacionados con la biosíntesis de ácido jasmónico. Por tanto, se comparó el perfil de las principales hormonas (giberelinas A1 y A4, la auxina ácido indol-acético, ácido abscísico, ácido jasmónico y ácido salicílico) de la sublínea L14-1 con el parental HAK5:LUC. Se analizó el contenido de tres plantas de cada línea crecidas durante 3 semanas en medio LAK con 1 mM de KCl (ciclo noche-día: temperatura 21-23C, fotoperíodo 12h/12h). Los resultados mostrados en la Tabla 1.3 indican que efectivamente había una mayor producción de ácido jasmónico en Figura 1.11: Producción de etileno y contenido de potasio en las líneas HAK5:LUC, akt1-2, L14-2- 1 y L14-2-3. Las plantas crecieron en medio LAK con 1 mM KCl durante 3 semanas, tras lo cual 4-5 plantas de cada genotipo se encapsularon individualmente en viales herméticos durante 24 horas que se mantuvieron en las mismas condiciones para la determinación de la producción de etileno. A continuación, fueron procesadas para determinar los contenidos de potasio en cada una de ellas. Las barras muestran un valor medio ± SD de la cantidad del contenido en etileno o potasio. Estadístico ANOVA (Test de Tukey) con valor p <0,10 para los niveles de etileno y valor p <0,01 para los contenidos de potasio. Las letras indican las medias con diferencias estadísticamente significativas. Resultados 138 las plantas L14-1 que en las control HAK5:LUC (p=0,005, t-test de Student, n=3). Las diferencias en los contenidos para las otras hormonas también resultaron significativamente diferentes (GA4, p=0,004; GA1, p=0,016; IAA, p=0,016; ABA, p=0,013; SA, p=0,003). Es notable que los contenidos de ácido salicílico se multiplicaron por 10 en las plantas L14-1 en comparación con HAK5:LUC mientas que los niveles de los ácidos abscísico y jasmónico sólo se duplicaron. En conjunto, estos resultados muestran que las plantas mutantes L14 presentan un fenotipo coherente con una deficiencia en AKT1 (activación del gen reportero HAK:LUC en condiciones no inductoras en el parental silvestre, menores contenidos de potasio, activación de la toma de Rb+ en alta afinidad), pero también confirman que el fenotipo de las plantas L14 es más severo que el de un mutante de pérdida de función en el canal AKT1 (akt1-2). Además, también se diferenciaban en la producción de etileno que va normalmente asociada a una deficiencia en potasio. Estas diferencias fenotípicas de las plantas L14 con plantas akt1-2 abrían dos posibilidades: 1) la proteína AKT1 truncada en el residuo W135, que conserva los dos primeros segmentos transmembrana del canal AKT1, sería capaz de interaccionar con otros canales tipo Shaker y alterar su función; o bien 2) otra de las mutaciones presentes en la línea L14 también estuviera contribuyendo al fenotipo COK. Ambas posibilidades se abordarán a lo largo del Capítulo 2 de Resultados. 1.6 Purgado de mutaciones en L14 La observación de las plantas correspondientes a la línea L14 recibida de KAUST puso de manifiesto una gran heterogeneidad de crecimiento y vigor entre individuos, dando lugar a una población de aspecto heterogéneo. Posiblemente esta diversidad se debía a la presencia de mutaciones deletéreas, no necesariamente asociadas funcionalmente al fenotipo COK, pero sí próximas genéticamente a la mutación causante del fenotipo COK y que por lo tanto estuvieran segregando parcialmente ligadas con ella. El alto número de mutaciones encontradas en el fragmento de 852 kb en el que mapea la mutación o mutaciones causantes del fenotipo COK de L14 indica una alta frecuencia de mutagénesis Tabla 1. 3: Niveles hormonales en las plantas de las líneas HAK5:LUC y L14-1. Las plantas crecieron s en medio LAK con 1 mM KCl durante 3 semanas. Los valores representan las medias y desviaciones típicas, expresados en ng g-1 de peso fresco (n=3 plantas de cada genotipo). ND, no detectable Resultados 139 por EMS. Por tanto, y para facilitar la identificación de la o las otras mutaciones presentes en la línea L14 y que también contribuían al fenotipo COK más extremo que el esperado de la mutación W135Z en AKT1, se abordó primero un purgado de mutaciones deletéreas no asociadas al fenotipo COK de la línea L14. Con el objetivo de asegurar la obtención de una línea que mantuviese el fenotipo COK de la línea L14 y el vigor suficiente para facilitar su propagación y la reproducibilidad de los resultados en los ensayos posteriores, se sembraron alrededor de 50 semillas de la generación M6 de las sublíneas L14-1 y L14-3 en tierra. Estas plantas crecieron durante 21 días en cámara de cultivo en condiciones de ciclo largo. A las tres semanas se analizó su crecimiento y se seleccionaron los individuos de mayor vigor. Así, se seleccionó la planta L14-1-6, que se autofecundó y se confirmó el mantenimiento de las mutaciones identificadas por mapping-by-sequencing mediante amplificación por PCR y secuenciación del amplicón en los genes VPS2.1 (AT2G06530), PMT1 (AT2G16120), GGPPS4 (AT2G23800), AKT1 (AT2G26650), NRT1.4 (AT2G26690), FUC1 (AT2G28100), GLR2.7 (AT2G9120), PARP1 (AT2G31320), CDF4 (AT2G34140), ERH1 (AT2G37940) (los cebadores utilizados aparecen en el Anexo 1: Cebadores). Las semillas obtenidas de la planta L14-1-6 se sembraron de nuevo en tierra, y se eligió de nuevo el individuo de crecimiento más robusto para la autofecundación. Este procedimiento se repitió hasta alcanzar la séptima generación de semillas fruto de la autofecundación. En la Figura 1.12 se muestran los ensayos de bioluminiscencia llevados a cabo para asegurar la expresión de HAK5:LUC en condiciones de suficiencia de potasio en las generaciones F1 a F7 de la línea L14-1-6. La expresión de HAK5:LUC en germínulas crecidas en medio LAK con 1 mM de potasio fue una constante en las raíces de las sucesivas generaciones de la línea L14, asegurando así la preservación del fenotipo COK en las plantas finalmente seleccionadas. Figura 1.12: Expresión de HAK5:LUC en plántulas de la línea L14-1-6 desde la generación F1 a F7. Las plantas crecieron en medio LAK 1 mM de posio durante 5 días. A continuación, se analizó la expresión del gen reportero HAK5:LUC. Resultados 140 Capítulo 2: Estudio de la mutación AKT1W135Z y de las mutaciones ligadas a ella en la línea L14 2.1 AKT1 (AT2G26650) AKT1 es un canal de potasio tipo Shaker. Consta de 6 segmentos transmembrana (TM), siendo los cuatro primeros los responsables de su activación por voltaje. El TM4, rico en residuos con carga positiva, sería el sensor del potencial eléctrico de la membrana. La región comprendida entre el TM5 y el TM6 conforma la región del poro y contiene un motivo GYGD altamente conservado, clave para la selectividad del potasio (Very y Sentenac, 2003). El extremo C-terminal citosólico está implicado en la regulación del canal y posee tres dominios reconocidos: un dominio con homología de secuencia con bolsillos de unión de nucleótidos cíclicos (CNBD), seguido de un dominio tipo ankirina a través del cual interacciona con el complejo quinasa CBL1-CIPK23 y favorece la activación completa del canal AKT1, y un dominio característico (KHA) conservado en la familia de transportadores de potasio regulados por voltaje en plantas y que es necesario para la interacción de las cuatro subunidades que componen un canal funcional (Sánchez-Barrena et al., 2020; Sung et al., 2007; Xu et al., 2006). En este contexto, la mutación hallada en el gen AKT1 del mutante L14 supone un cambio de triptófano por un codón de parada en la posición 135 (AKT1W135Z). El resultado de esta mutación es una proteína truncada, que conserva únicamente los dominios transmembrana TM1 y TM2. Ante la pérdida de función de una de las dos proteínas fundamentales en la entrada de potasio, la expresión anómala de HAK5:LUC en L14 podría producirse para asegurar los niveles de potasio suficientes en la planta. Sin embargo, como se muestra en el Capítulo 1 de Resultados, el fenotipo del mutante L14 es más severo y en algunos aspectos no coincidente (p.e. producción de etileno) con el del mutante akt1-2 de pérdida de función por inserción de ADN-T. Para esclarecer si la mutación AKT1W135Z presente en L14 es de alguna manera la causante de su fenotipo diferencial con akt1-2, se ha analizado la actividad y propiedades de la proteína mutante AKT1W135Z en sistemas heterólogos. Análisis de la funcionalidad del péptido AKT1W135Z En primer lugar, se analizó la capacidad de AKT1W135Z de transportar potasio mediante la expresión del ADNc correspondiente en el sistema de expresión heteróloga Xenopus laevis en combinación con TEVC (Mat y Met, 2.9). Los ovocitos se estimularon mediante un protocolo de pulsos eléctricos a distintos potenciales de membrana (Mat y Met, 2.9.1) y se compararon las corrientes producidas en los ovocitos inyectados con la versión silvestre (AKT1) o la versión mutante de la proteína (AKT1W135Z) en un medio de ensayo con 100 mM de KCl pH 7,4. Los ovocitos inyectados con AKT1 + CIPK23 + CBL1 Resultados 141 mostraron corrientes de entrada de potasio activada a voltajes hiperpolarizantes de una magnitud aproximada de 6 µA -180 mV, mientras que aquellos inyectados con la proteína mutante AKT1W135Z + CIPK23 + CBL1, mostraron una corriente inferior a 1 µA al mismo voltaje (Figura 2.1). Esta segunda corriente presenta una magnitud similar a las corrientes endógenas de ovocitos inyectados con agua (dato no mostrado), lo cual sugiere que la proteína AKT1W135Z no llega a la membrana plasmática o carece de actividad transportadora. Figura 2.1: Corrientes representativas de AKT1 y AKT1(W135Z) medidas por TEVC en ovocitos de X. laevis. El medio de ensayo contenía 100 mM de KCl. (A) Registro de corrientes en ovocitos que expresan las proteínas CIPK23, CBL1 y el canal silvestre (AKT1) o mutado (AKT1-W135Z) en respuesta a una rampa de potenciales de membrana entre -180 y +60 mV. (B) Curva de corrientes vs voltaje en estado estacionario correspondientes a los ovocitos recogidos en la figura (A): AKT1+CIPK23+CBL1 (puntos negros) o AKT1(W135Z) +CIPK23+CBL1 (puntos grises). Resultados 142 AKT1 funciona como un canal tetramérico, compuesto por 4 unidades α situadas alrededor de un poro central (Zimmermann & Sentenac, 1999). Los canales Shaker de la misma subfamilia pueden unirse y formar estructuras heterotetraméricas (Figura 2.2). Uno de los canales heterotetramérico mejor estudiados es el formado por AtAKT1 y AtKC1 (Duby et al., 2008). La interacción de KC1 con AKT1 inhibe las corrientes mediadas por AKT1 debido a que modifica negativamente la dependencia de voltaje de AKT1, lo que evitaría la pérdida de potasio en condiciones de bajo potasio (Wang et al., 2010). Como se ha expuesto en el Capítulo 1 de Resultados, las diferencias fenotípicas encontradas entre los alelos akt1-2 y AKT1W135Z podrían deberse a que la proteína AKT1 truncada en el residuo W135 fuera capaz de interaccionar con otros canales tipo Shaker y alterar su función, o bien que algunas de las otras mutaciones presentes en la línea L14 contribuye a su fenotipo con características adicionales a las que confiere la pérdida de actividad de AKT1. Para comprobar la primera hipótesis se coexpresó el péptido AKT1W135Z con la proteína canónica AKT1 en la estirpe de S. cerevisiae TTE9.3 (Mat Y Met 2.4.2). La estirpe TTE9.3 carece de los principales transportadores de entrada de potasio en su membrana plasmática (TRK1 y TRK2), lo que la convierte en un sistema propicio para analizar fenotipos relacionados con el transporte de este ion. Como se observa en la Figura 2.3 ̶ A, la expresión de AKT1 en la estirpe TTE9.3 complementó su fenotipo de falta de crecimiento en bajo potasio. Además, este crecimiento no se alteró con la coexpresión de la proteína mutante AKT1W135Z. Estos resultados sugieren AKT1 W135Z no afecta al transporte llevado a cabo por el canal AKT1 canónico. Este mismo resultado también se obtuvo mediante un abordaje diferente. Las corrientes representativas encontradas en ovocitos de Xenopus laevis que expresan el canal AKT1 con o sin AKT1W135Z fueron de similar magnitud (Figura 2.3 ̶ B). La Figura 2.3 ̶ C corresponde a la corriente media a -180 mV obtenida para cada caso. Figura 2.2: Modelo del tetrámero formado por canales AKT diseñado a partir de la cristalización del canal AKT de animales. Cada monómero se representa en un color, con el dominio de poro en el centro. Resultados 143 Figura 2.3: Caracterización de la interacción funcional de AKT1(WT) con AKT1(W135Z) en sistemas heterólogos. (A) Transformantes de la cepa TTE9.3 expresando la proteína AKT1 sola o junto con AKT1(W135Z) se inocularon en placas con medio AP suplementado con 50 mM ó 1 mM de KCl. (B) Corrientes en ovocitos de Xenopus laevis que expresan las proteínas CIPK23, CBL1 y el canal canónico AKT1 sólo o con AKT1(W135Z) en presencia de 100 mM KCl en respuesta a una rampa de potenciales de membrana (desde -180 hasta +60 mV). (C) Corrientes instantáneas recogidas a -180 mV en los ovocitos que expresan CIPK23, CBL1 junto con AKT1 (n=5), AKT1(W135Z) (n=4), AKT1 + AKT1(W135Z) (n=4) o control no inyectado (n=2). Estadístico ANOVA (Test de Tukey) para comprobar las diferencias entre grupos a cada una de las concentraciones testadas. Las letras muestran diferencias entre grupos con un nivel de significación p <0,05. Resultados 144 Los resultados en S. cerevisiae y Xenopus laevis sugieren que el péptido AKT1W135Z no es capaz de transportar potasio, ni tampoco altera el transporte de la proteína canónica AKT1. Dado que es incapaz de modificar la función de AKT1, con cuya estructura tetramérica tendría las máximas probabilidades de asociarse al ser una proteína enteramente homóloga, cabe suponer que tampoco alteraría la función de otros canales tipo Shaker en la línea L14. Tras estos análisis, la hipótesis alternativa para explicar las diferencias fenotípicas entre la línea L14 y el mutante akt1-2 es la influencia de otra de las mutaciones halladas en L14. Por ello se han analizado las proteínas previamente caracterizadas y que de manera apriorística pudieran estar relacionadas de alguna manera con la nutrición de potasio según la información disponible en las bases de datos https://www.arabidopsis.org/ y https://www.uniprot.org/. 2.2 VPS2.1 (AT2G06530) La mutación puntual que posee la línea L14 en el gen VPS2.1 provoca un cambio de la serina 4 a una leucina (VPS2.1S4L). La proteína VPS2.1 (Vacuolar Protein Sorting 2.1) forma parte de la estructura ESCRT-III (Endosomal Sorting Complex Required for Transport). Este complejo está implicado en la formación de cuerpos multivesiculares o MVB (Multivesicular Body) en las células vegetales y su correcto ensamblaje a las vacuolas líticas es fundamental para la degradación de proteínas de membrana (Winter & Hauser, 2006). El complejo ESCRT-III está formado por la interacción directa de las proteínas VPS20.1, SNF7.1, VPS2.1 y VPS4. Los componentes del complejo ESCRT-III normalmente poseen varios homólogos, con posibilidad de redundancia funcional (Cai et al., 2014). Sin embargo, los mutantes vps2.1 son letales en estado embrionario. A diferencia de sus homólogos VPS2.2 y VPS2.3, cuyos mutantes por inserción de ADN-T sólo muestran defectos leves en el crecimiento, la función de VPS2.1 es necesaria a lo largo de la embriogénesis (Katsiarimpa et al., 2011). Ante esta circunstancia, cabe esperar que si la mutación VPS2.1S4L en homocigosis causase la alteración de la función de la proteína, dicha alteración provocaría la letalidad de la línea L14. 2.3 PMT1 (AT2G16120) La mutación en el gen PMT1 (Polyol/Monosaccharide Transporter 1) provoca un cambio de aminoácido de una glicina a ácido glutámico (PMT1G299E). PMT1 se encuentra separado por una región intergénica de 6.602 nucleótidos de su homólogo PMT2. Ambos genes comparten el 93,6 % de identidad en su secuencia de aminoácidos, y posiblemente sean fruto de una duplicación génica en un evento reciente en la evolución de Arabidopsis. Además de compartir gran parte de su secuencia, PMT1 y PMT2 comparten propiedades funcionales y localización celular. Su expresión en S. cerevisiae y Xenopus laevis ha revelado https://www.arabidopsis.org/ https://www.uniprot.org/ Resultados 145 que esta proteína lleva a cabo el simporte electrogénico y dependiente de voltaje de protones con fructosa/xylitol principalmente. Ambos se expresan en los granos de polen, el tubo polínico y células jóvenes del xilema, localizaciones en las que es necesario el aporte de carbono orgánico en la célula para asegurar la obtención de energía (Klepek et al., 2010). No se ha descrito el fenotipo de ningún mutante knock-out para PMT1, pero dado el grado de homología que guarda con PMT2 y su función y patrón de expresión semejantes cabría esperar que la deficiencia de uno de los dos transportadores fuera compensada por su homólogo. 2.4 GGPPS4 (AT2G23800) La mutación en el gen GGPPS4 consiste en el cambio de una glicina por un glutamato en el aminoácido 250 (GGPPS4G250E). La proteína GGPPS4, antes GGPPS2 (Okada et al., 2000), pertenece a la familia de las preniltransferasas GGPPS (GeranylGeranyl Diphosphato Synthase). Se trata de enzimas que participan en la síntesis de isoprenoides. A pesar de que comparten alrededor de un 55% de identidad en su secuencia, los miembros de la familia GGPPS son variados en cuanto a su función y localización (Wang et al., 2016). Concretamente, GGPPS4 se localiza en el retículo endoplásmico de células florales y del procámbium de las raíces (Okada et al., 2000; Zhu et al., 1997), donde cataliza la formación de GGPP (GeranylGeranyl Diphosphato) en la vía MVA (Mevalonic Acid pathaway) para la formación de diterpenoides citosólicos. Resulta esperable que los mutantes para proteínas dentro de la misma vía de señalización tengan fenotipos semejantes. Los mutantes nulos para algunas proteínas de la vía MVA (ggpps11 y lew1-2) provocan letalidad embrionaria o esterilidad (Ruiz-Sola et al., 2016; Zhang et al., 2008), salvo que su función sea altamente redundante en Arabidopsis. Tal es el caso de las enzimas FPPS1 y 2 (proteínas implicadas también en la vía MVA), cuyos mutantes nulos simples fpps1 y fpps2 no presentan fenotipo precisamente por esa redundancia funcional (Closa et al., 2010). No se han obtenido mutantes nulos para GGPPS4 ni para otras proteínas de esta vía por la escasa viabilidad de los embriones. Además, el aminoácido GGPPS4G250 no pertenece a los dominios descritos como necesarios para la unión específica a sustrato ni a los dominios catalíticos (Beck et al., 2013; Kopcsayová & Vranová, 2019). Cabría esperar que si la mutación GGPPS4G250E provocase la alteración de su función el destino de la línea L14 hubiese sido semejante al de los mutantes letales. 2.5 FUC1 (AT2G28100) La mutación encontrada en el gen FUC1 (α1,3-FUCosidase) consiste en un cambio de prolina por leucina en el aminoácido 227 (FUC1P227L). FUC1 es una α-L-fucosidasa cuya Resultados 146 función es liberar el residuo t-fucosil de la cadena lateral del xiloglucano, que es uno de los principales componentes de la pared celular primaria (De la Torre et al., 2002). Los mutantes deficientes para esta proteína no manifiestan ningún defecto en su desarrollo, a pesar de acumular el sustrato de la enzima (Kato et al., 2018). Debido a este hecho y a su función asociada al desarrollo de la pared celular se ha descartado su implicación en el fenotipo de L14. 2.6 GLR2.7 (AT2G29120) El papel señalizador del glutamato en plantas es aún poco conocido pero prometedor. Se ha investigado su implicación en diversos procesos fisiológicos, tales como la germinación, la determinación de la arquitectura radicular y la respuesta a estrés biótico y abiótico (Jin et al., 2019; Kong et al., 2015; Qiu et al., 2020). Los receptores de glutamato de plantas (GLRs, Glutamate Receptor-like Channel) comparten un elevado porcentaje de homología en su secuencia de aminoácidos con los receptores de glutamato ionotrópicos de animales (iGluRs). Dicha homología alcanza entre el 16 y 63% en la región del dominio transmembrana 1 y 4 y los dominios de unión a ligando (GlnH2 y GlnH2) (Lam et al., 1998). En animales, los iGluRs forman canales catiónicos no selectivos activados por glutamato (NSCCs, Non Selective Cation Channels), que catalizan la entrada de Na+ y/o Ca2+ en las células (Dingledine et al., 1999). En Arabidopsis, se ha visto que el glutamato despolariza la membrana plasmática e incrementa la concentración de calcio en el citosol (Dennison & Spalding, 2000; Meyerhoff et al., 2005), así como que los antagonistas de los iGluRs bloquean estos efectos. Dadas las semejanzas mencionadas, es posible que la función de la proteína GLR2.7 esté relacionada con el transporte iónico a través de la membrana plasmática. La mutación puntual que posee la línea L14 en el gen GLR2.7 consiste en un cambio de citosina por tirosina en el primer intrón, a 254 pares de bases aguas abajo del final del primer exón y a 765 pares de bases aguas arriba del segundo exón. Dicha mutación no afecta a los nucleótidos identificados como necesarios para el correcto splicing del ARNm, localizados en los extremos 3’ y 5’ del intrón y entre 40 y 15 pb aguas arribas del extremo 3’ del intrón (Clancy, 2008). Sin embargo, dada la influencia que podría tener un transportador iónico en el fenotipo de L14 se decidió analizar el efecto de esta mutación. Para descartar la posibilidad de que la mutación afectara al procesamiento y maduración del ARNm del gen GLR2.7 en las plantas L14 se analizó la expresión de GLR2.7 mediante RT-qPCR (Mat y Met, 2.2.2). Como se ilustra en la Figura 2.4 ̶ A, si el ARNm de GLR.7 se procesa correctamente, el amplicón resultante de la RT-qPCR con los cebadores 1 y 3 tendrá un tamaño de 74 pb y se detectará su amplificación mediante RT-qPCR. En cambio, si no se procesa correctamente a causa de la mutación puntual en el intrón, el amplicón con los cebadores 1 y 3 tendrá un tamaño de 1 kb y no será detectable mediante esta técnica, mientras que el amplicón con los cebadores 1 y 2 tendría un tamaño de 84 pb Resultados 147 y sí se detectaría. En la Figura 2.4 ̶ B se observa que el producto de la amplificación con los cebadores 1 y 3 es detectable tanto en la línea silvestre HAK5:LUC como en la línea L14. Por otra parte, el producto de la amplificación con los cebadores 1 y 2 es prácticamente indetectable en ambas líneas. Por tanto, el patrón de expresión no difiere entre la línea silvestre y mutante, por lo que se deduce que la mutación en el gen GLR2.7 no afecta a su transcripción y no contribuye al fenotipo de L14. Figura 2.4: Análisis de la mutación en GLR2.7 encontrada en la línea L14. (A) Localización de los cebadores qGLU Fwd (cebador 1), qGLU Rev (cebador 3), qGLU Rev2 (cebador 2) dentro del gen GLR2.7. (B) Niveles de expresión de los distintos amplicones en muestras de parte aérea de plantas de la línea L14 y HAK5:LUC crecidas en sustrato en condiciones de día largo durante 20 días. Como gen de referencia se utilizó UBQ10 y como muestra calibrador HAK5:LUC con los cebadores 1+3. Las barras muestran los valores medios de Log2 (FC) ± SD (n=3). Estadístico t-Student (p <0,05) realizado entre HAK5:LUC y L14 para cada condición, ns= no significativo. Resultados 148 2.7 PARP1 (AT2G31320) Otra de las mutaciones halladas en la línea L14 provoca un cambio de arginina por histidina en el aminoácido 391 del gen PARP1 (PARP1R391H). La proteína PARP1, al igual que su homólogo PARP2, es una ADP-ribosa polimerasa que participa en la reparación del ADN. Activada tras la rotura de la cadena de ADN, cataliza la adición de ADP-ribosa a proteínas nucleares, utilizando NAD+ como sustrato. Este proceso activa la maquinaria de reparación del ADN (Pines et al., 2013). Ambas proteínas se han visto implicadas en la respuesta a estrés abiótico (Vanderauwera et al., 2007); sin embargo, no se ha publicado hasta el momento ningún resultado que relacione esta proteína explícitamente con la homeostasis iónica o la nutrición de potasio. Recientes estudios señalan que los mutantes simples (parp1, parp2) y dobles (parp1- parp2) no muestran ningún fenotipo bajo condiciones de estrés (Rissel et al., 2017). En la publicación referida se especula con la idea de que puede ser debido a una redundancia funcional de las dos proteínas PARP, así como a la acción de otras proteínas ajenas a la familia, pero con función semejante que no habrían sido aún caracterizadas. Por lo tanto, cabría esperar que incluso provocando la mutación PARP1R391H una alteración de la función de la proteína, dicho efecto podría ser compensado por la acción de otras proteínas de función semejante. 2.8 CDF4 (AT2G34140) La mutación puntual que posee la línea L14 en el gen CDF4 consiste en un cambio de aminoácido de ácido glutámico a lisina (CDF4E140K). CDF4 (Cycling Dof Factor 4) es un factor de transcripción. Puede actuar como activador o represor de la transcripción, dependiendo del promotor al que se una. Pertenece a la familia de proteínas DOF (DNA-binding with One Finger). Esta familia participa en procesos de desarrollo de Arabidopsis, tales como la floración, la respuesta a luz, la progresión a lo largo del ciclo celular y la respuesta a nitrato entre otros. En el caso de CDF4, el dominio DOF se sitúa en entre los aminoácidos 60 y 109, mientras que la región crítica para la actividad transcripcional reside en el extremo C- terminal. Recientemente se ha observado que este factor de transcripción promueve la senescencia foliar a través de un mecanismo que implica la acción de ABA y ROS (Xu et al., 2020). Previamente, CDF4 había sido identificado como un factor de transcripción de localización nuclear. En raíces, CDF4 promueve la diferenciación de las células de la columela, y su represión por WOX5 (Wuschel Homeobox) es fundamental para mantener la pluripotencialidad en las células que conforman el centro quiescente (Pi et al., 2015). Es esta última localización celular el aspecto más interesante en lo relativo a esta Tesis, y en la que nos centraremos para analizar la implicación de esta proteína en la nutrición de potasio. Resultados 149 Aunque no se ha descrito previamente el fenotipo en raíces de ningún mutante nulo para la proteína CDF4, cabe esperar que tenga un fenotipo de desorganización celular semejante al que posee un mutante con expresión constitutiva de WOX5. Esta desorganización celular podría afectar a la distribución de los transportadores iónicos en el extremo apical de la raíz, así como al transporte de potasio hacia el xilema. Para confirmar si la mutación CDF4E140K afecta a la diferenciación de la raíz del mutante L14 se ha analizado su estructura radicular mediante tinción con yoduro de propidio y su contenido de amiloplastos mediante una tinción con lugol en plántulas silvestres y L14 de 5 días crecidas en medio ½ MS en condiciones de día largo (Mat y Met, 2.5.2). En la Figura 2.5 ̶ A se muestra una imagen representativa de los extremos apicales de las líneas silvestre y L14. En ambas se observa el centro quiescente (CQ) y una columela (C) organizada y diferenciada. Así mismo, tras la tinción con lugol se observa la formación de amiloplastos organizados en las células de la columela de ambas líneas (Figura 2.5 ̶ B y C). Por lo tanto, la mutación CDF4E140K no afecta al desarrollo radicular y no parece probable que contribuya al fenotipo del mutante L14. Figura 2.5: Tinción con yoduro de propidio (A) y lugol (B) de raíces de HAK5:LUC y L14. Se han analizado pántulas de 5 días crecidas en medio ½ MS. Centro quiescente (CQ), columela (CO). Las imágenes recogidas en la figura (A) fueron tomadas con un microscopio confocal TCS SP2 (Leica Microsystems), con una ʎ de excitación de 540 nm y λ de emisión de 600-650 nm. Las imágenes de la figura (B) fueron tomadas con un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axioscope. La barra representa 40 μm. Resultados 150 2.9 ERH1 (AT2G37940) La proteína ERH1 (Enhancing RPW8-MEDIATED Hr-like cell death 1) cataliza uno de los principales procesos en la biosíntesis de esfingolípidos en Arabidopsis thaliana, y su función como ICPS (Inositol Phosphoryl Ceramide Synthase) está altamente conservada en el reino animal y protista. Las ceramidas están implicadas en la integridad estructural de las membranas celulares, actúan como mensajero secundario y podrían estar implicadas en la muerte celular programada en respuesta a patógenos. La línea L14 posee una mutación puntual en este gen que provoca un cambio de aminoácido de prolina a leucina (ERH1P154L). La prolina 154 está conservada en las proteínas homólogas a ERH1 en otros vegetales, como se recoge en la Figura 2.6, pero no en el reino animal ni protozoo. El fenotipo de las plantas con pérdida de función de ERH1 ha sido descrito por Wang et al. (2008). Los mutantes erh1 manifiestan activación de la respuesta hipersensible de muerte celular en tejido aéreo y una acumulación significativa de ácido salicílico con respecto a la línea silvestre. En lo relativo a la homeostasis de potasio, la acumulación de ácido salicílico y sus derivados también se ha descrito en plantas sometidas a hambre de potasio y en el triple mutante hak5 akt1 cipk23 (Cui et al., 2021). Además, en el análisis de hormonas de la línea L14-2 descrito en esta Tesis (Tabla 1.3) se obtuvieron niveles de ácido salicílico 9 veces superiores a los de la línea silvestre. Por todo ello, la mutación ERH1P154L podría estar involucrada en la expresión de HAK5:LUC en condiciones de suficiencia de potasio en la línea L14 a través de una vía que implicaría al ácido salicílico (SA). Para comprobar esta hipótesis se ha medido la expresión del gen PR1 como marcador de la respuesta al SA (Blanco et al., 2009) y de HAK5 mediante RT-qPCR en plántulas de HAK5:LUC y L14 (Mat & Met, 2.2.2). Las plantas crecieron 20 días en día largo en medio MS 1x. A continuación, se trasplantaron a placas de MS 1x suplementado con 0,5 mM de SA. Tras 24 horas se recogieron las plántulas completas, la parte aérea o las raíces para realizar la RR- qPCR. Los cebadores utilizados para amplificar PR1 y HAK5 se recogen en el Anexo 1: Cebadores. Figura 2.6: Alineamiento de parte del dominio PAP2, conservado en varios homólogos funcionales de la proteína AtERH1. Las secuencias se han alineado con el programa MegAlign (DNAstar), utilizando el método Clustal-W. Los residuos idénticos están marcados en negro, y los altamente conservados en azul. La flecha roja marca la prolina 154, mutada en la línea L14. Resultados 151 Figura 2.7: Expresión de los genes HAK5 y PR1 en las líneas WT (HAK5:LUC) y L14. Tras 24 horas en placas de MS 1x con o sin 0,5 mM de SA se recogieron las plántulas completas (A), la parte la parte aérea (B) o las raíces (C) para la RT-qPCR. Como gen de referencia se utilizó UBQ10 y como muestra calibradora la expresión de HAK5 o PR1 en WT-0 mM de SA. Estadístico t-Student (p <0,05) para comprobar las diferencias estadísticas entre WT y L14 (n=3) para cada una de las condiciones testadas. Resultados 152 Los resultados se recogen en la Figura 2.7. Los niveles de expresión de PR1 en condiciones control (-SA) en la línea L14 no mostraron diferencias significativas con respecto a la línea silvestre en plántulas, raíces o tejido aéreo a pesar de la presencia constitutiva de SA en los tejidos de L14 (Tabla 1.3). Esto podría deberse a una desensibilización de la planta ante un estímulo hormonal constante, como se ha visto para la hormona ABA (Ali et al., 2020); o a una falta de estímulos complementarios al ácido salicílico para mantener la expresión de PR1. Por otra parte, la adición exógena de SA no implicó una inducción de la expresión de HAK5 en plántulas ni en raíces, ya que los niveles de transcripción se mantuvieron constantes independientemente de la concentración de SA en el medio en la línea WT. Los resultados sugieren que la mutación ERH1P154L no contribuye al fenotipo del mutante L14. Resultados 153 Capítulo 3: Estudio de la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M Los resultados del Capítulo anterior indican que ni la mutación AKT1W135Z ni el resto de mutaciones ligadas a ésta son las responsables del fenotipo exacerbado de la línea L14 en comparación con la línea akt1-2. En cambio, sí se pudo concluir que, muy probablemente, la mutación del gen NRT1.4/NPF6.2 contribuye al fenotipo del mutante L14, como se muestra a continuación. El transportador de nitrato NRT1.4/NPF6.2 se expresa en la parte aérea de plántulas y plantas adultas de A. thaliana, y está implicado en la acumulación foliar de este nutriente. Actúa como una compuerta entre el peciolo (reservorio natural de nitrato foliar) y la lámina, en la que tiene lugar su asimilación o almacenamiento en vacuolas. En este contexto, los mutantes knock-out para esta proteína (nrt1.4-2, Figura 3.1 ̶ B) presentan una fuga de nitrato hacia la lámina que se relaciona además con un fenotipo de ensanchamiento de las hojas (Chiu et al., 2004), lo que sugiere que la distribución de nitrato en las hojas influye en la expansión foliar. NRT1.4/NPF6.2 pertenece a la familia NRT1/NPF, concretamente a la subfamilia NPF6 (Léran et al., 2014) de la que también forma parte el transceptor (transportador y receptor) de nitrato NRT1.1/NPF6.3. La estructura más común en esta familia consiste en 12 dominios transmembrana unidos por pequeños lazos intermedios (Figura 3.1). Los miembros vegetales de la familia NPF poseen además un largo segmento hidrofílico entre los dominios transmembrana 6 y 7, y un extremo C-terminal citosólico de longitud variable (Tsay et al., 2007). De los 53 miembros de la familia NPF de Arabidopsis, se ha reportado actividad de transporte de nitrato en 17 de ellos (Hsu & Tsay, 2013; Léran et al., 2014). NRT1.4/NPF6.2 es uno de estos transportadores, y gracias a ensayos de electrofisiología llevados a cabo en ovocitos de X. laevis se ha podido catacterizar como un transportador de NO3 -/(n)H+ electrogénico de estequiometría desconocida, de baja afinidad y con actividad transportadora a pH 5,5 (Chiu et al., 2004). Además, se ha concluido mediante expresión en ovocitos que NRT1.4/NPF6.2 lleva a cabo un transporte bidireccional de nitrato (Boursiac et al., 2013), aunque esta bidireccionalidad no ha sido confirmada aún in planta. La mutación puntual que posee la línea L14 en el gen NRT1.4/NPF6.2 provoca un cambio de la valina 210 a una metionina (NRT1.4V210M). Este aminoácido se localiza entre los dominios transmembrana TM5 y TM6 (Figura 3.1). Como se ha mencionado anteriormente, NRT1.4/NPF6.2 es el miembro de la familia NPF con mayor grado de homología en su secuencia con el transceptor NRT1.1/NPF6.3, cuya investigación en los últimos años ha conducido al hallazgo de diversos residuos fundamentales para la función de los NPF. Por ejemplo, los residuos R264, R266 y K267 de NRT1.1/NPF6.3 (localizados en el lazo entre los TM6 y TM7) y el motivo ExxER son necesarios para el transporte de nitrato y protones, respectivamente, y están altamente conservados en la familia NPF (Jørgensen et al., 2015; Solcan et al., 2012; Sun et al., 2014), incluido el transportador NRT1.4/NPF6.2 Resultados 154 (Anexo 3: Filogenia y alineamiento NRT1.1-NRT1.4). En cambio, el residuo H236 es fundamental para el transporte de nitrato de NRT1.1/NPF6.3 (Newstead, 2017; Parker & Newstead, 2014; Sun et al., 2014) pero no aparece en los miembros próximos de la subfamilia NPF6, y sólo se encuentra en algunos miembros vegetales de la familia entre los que no se incluye NRT1.4/NPF6.2 de Arabidopsis (Hu et al., 2015; Wen et al., 2017). Hasta el momento no se ha confirmado implicación alguna del residuo NRT1.1/NPF6.3V215, equivalente a NRT1.4/NPF6.2V210, en las propiedades de transporte iónico. En este contexto y dada la manifiesta implicación del transporte de nitrato en la homeostasis de potasio (Raddatz et al., 2020) la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M es una digna candidata de estudio para esclarecer el fenotipo alterado de respuesta a potasio de la línea L14. Figura 3.1: Estructura esquemática de la proteína NRT1.4/NPF6.2. (A) La línea mutante de Arabidopsis L14 posee un cambio de la valina 210 por metionina (marcado con flecha roja) (B) Representación esquemática de la inserción de ADN-T en el mutante nrt1.4-2, descrito en Chiu et al (2004). Las cajas representan los exones. Las zonas negras constituyen la zona codificante y las blancas las no codificantes. Resultados 155 4.1 Comprobación del fenotipo mutante para NRT1.4/NPF6.2 in planta En primer lugar, para comprobar el efecto de la mutación V210M en NRT1.4/NPF6.2 in planta se reprodujeron algunos de los experimentos llevados a cabo por Chiu y colaboradores (2004) con el mutante de pérdida de función nrt1.4-2, con modificaciones. Se cuantificaron los niveles de nitrato en el peciolo y lámina de las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt1.4-2 y L14 (Mat y Met 2.7) en hojas de roseta de plantas de 3 semanas crecidas en sustrato en cámara de cultivo de día largo (16h, 20C día / 8h, 18C noche; 70% HR). Las hojas se diseccionaron en peciolo y lámina, se pesaron y homogeneizaron. Para la cuantificación de nitrato mediante método colorimétrico (Mat y Met 2.7.2) se utilizaron 5 µl de una dilución decimal de las muestras de peciolo y lámina. La cantidad de nitrato se referenció a los µg de proteína soluble (Bradford et al., 1976). Los contenidos de nitrato y la relación peciolo/lámina se recogen en la Figura 3.2. Como se observa, las líneas HAK5:LUC, akt1-2 y L14 poseen entre 1,5 y 2,5 veces más nitrato en el peciolo que en la lámina foliar, mientras que en el mutante nrt1.4-2 esta relación se ve menguada, lo que se manifiesta en un mayor flujo de nitrato a la lámina foliar en detrimento del contenido en el peciolo (p=0,119 en HAK5:LUC vs nrt1.4-2 para peciolo en Figura 3.2 – B), tal y como había sido descrito previamente (Chiu et al., 2004). Los resultados obtenidos indican por una parte que la falta de función de AKT1 no afecta a la distribución del nitrato foliar y, por otra parte, que la mutación NRT1.4V210M no tiene asociación con un fenotipo de falta de función del transportador. Figura 3.2: Contenido de nitrato en peciolo y lámina de las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt1.4-2 y L14. Se diseccionaron el peciolo y la lámina de hojas de plantas de 3 semanas crecidas en sustrato y se analizó el contenido de nitrato mediante el método colorimétrico. Los histogramas muestran la media +/- SD (n=3). (A) Relación peciolo/lámina en las cuatro líneas. (B) Contenido total en peciolo y lámina. Estadístico ANOVA (Test de Tukey), ***p <0,01), ***p <0,01. Resultados 156 4.2 Localización celular de NRT1.4/NPF6.2 A continuación, se analizó la localización celular precisa de NRT1.4/NPF6.2. En Chiu y colaboradores (2004) se especula con dos posibles mecanismos para justificar la pérdida de nitrato en el peciolo de los mutantes nrt1.4-2. Por una parte, NRT1.4/NPF6.2 podría localizarse en la membrana plasmática y llevar a cabo la recuperación de NO3 - del xilema. Por otra parte, el transportador podría localizarse en el tonoplasto y regular la entrada de nitrato en la vacuola, orgánulo en el que se acumula alrededor del 99% del nitrato libre en las células vegetales (Martinoia et al., 1981). Para elucidar esta cuestión se realizó la expresión transitoria del transportador NRT1.4/NPF6.2 con una fusión C-terminal de GFP en células foliares de N. benthamiana. Tras 48 horas después de la infiltración de células de A. tumefaciens portadoras de las construcciones pGWB605-NRT1.4-GFP y pGPTV-CBL1- OFP (Anexo 2: Plásmidos) como marcador de membrana plasmática se analizó la distribución celular de dichas proteínas mediante microscopía confocal (Mat y Met, 1.3.2). La Calcineurin B-like 1 (CBL1) es reclutada a la membrana plasmática tras su N- miristoilación en el residuo Gly2 y su palmitoilación en Cys3. Tal y como se observa en la Figura 3.3, el análisis de la intensidad de la fluorescencia en el canal verde (GFP) y rojo (OFP) muestra que NRT1.4/NPF6.2 se localiza en la membrana plasmática de las células de N. benthamiana, en perfecto solapamiento con CBL1-OFP. Por lo tanto, NRT1.4/NPF6.2 influye en la distribución de nitrato foliar a través de su recuperación del xilema. Figura 3.3: Localización subcelular de NRT1.4-GFP (A) y CBL1-OFP (B) en células de la epidermis foliar de N. benthamiana. La fluorescencia de GFP y OFP se analizó 48 horas después de la agroinfiltración mediante microscopía confocal. (C) El transportador NRT1.4/NPF6.2 colocaliza con CBL1 en la membrana plasmática (D) Medida de la intensidad de la fluorescencia producida por la proteína GFP (verde) y OFP (rojo) a lo largo de un transecto de interés (barra de color blanco en C) que se considera representativo. Resultados 157 4.3 Expresión de NRT1.4WT y NRT1.4V210M en levaduras Conocida la localización celular, se analizó cómo podría afectar la mutación NRT1.4V210M al transporte de nitrato. Para ello las versiones silvestre y mutante del transportador NRT1.4/NPF6.2 se expresaron en la levadura Hansenula polymorpha. Esta levadura posee la capacidad de absorber nitrato del medio y asimilarlo en materia orgánica (Siverio, 2002), debido a la presencia en su genoma de los genes YNT1, YNR1 e YNI1 que codifican proteínas con actividades de transporte de nitrato, nitrato reductasa y nitrito reductasa respectivamente. La proteína YNT1 es el único sistema de absorción de nitrato en Hansenula, lo que convierte al mutante de pérdida de función Δynt1::URA en una herramienta adecuada para evaluar la capacidad de transporte de nitrato de proteínas heterólogas (Martin et al., 2008). Los ADNc codificantes de las proteínas NRT1.4WT y NRT1.4V210M se insertaron en el vector pYNR_EX, bajo el control del promotor del gen YNR1 de Hansenula. Las construcciones pYNR_EX NRT1.4WT y pYNR_EX NRT1.4V210M (Anexo 2: Plásmidos) se linearizaron con la enzima BstII, y con ellas se transformó la cepa Δynt1::URA3 por electroporación (Mat y Met 2.4.2). Alrededor de 20 colonias portadoras de las construcciones se seleccionaron por prototrofía para leucina ya que el plásmido integrativo porta el marcador selectivo LEU2. Para confirmar la integración de los plásmidos se extrajo el ADN de las colonias de H. polymorpha según el protocolo de Looke et al., (2011) y se amplificó una región de 745 pb utilizando los oligos NRT1.4-E y NRT1.4-P1 (Anexo 1: Cebadores). Posteriormente se analizó su crecimiento en medio líquido YGNH (cuya fuente de nitrógeno proviene del amonio) e YG+0,5 mM KNO3 (Mat y Met 2.4.3.1). El crecimiento de 5 transformantes a las 48 horas, expresado como DO660nm, se recoge en la Figura 3.4. Las colonias transformadas con el transportador mutante NRT1.4V210M mostraron un crecimiento mayor al de aquellas transformadas con la versión silvestre de la proteína. Estas diferencias eran significativas con un valor estadístico p=0,086 (t-Student, NRT1.4WT vs NRT1.4V210M), debido probablemente a la amplia distribución intrapoblacional de los datos. Este resultado apunta a que la mutación V210M podría provocar un aumento de la actividad del transportador de nitrato NRT1.4/NPF6.2. La familia de transportadores NRT/NPF puede transportar una amplia variedad de sustratos, incluidos dipéptidos, nitrato, nitrito, cloruro, glucosinolatos, aminoácidos y ciertas hormonas. Estas capacidades se han comprobado en sistemas de expresión heterólogos como ovocitos, levaduras y células de insectos; y aunque las evidencias halladas apuntan a que la mayoría de los NPF son capaces de transportar más de un sustrato, los mecanismos de transporte no han sido aún descritos en detalle (Corratgé- Faillie & Lacombe, 2017). Recientemente se ha descrito que las proteínas NRT1.5/NPF7.3 y NRT1.8/NPF7.2, inicialmente descritas como transportadoras de nitrato, tienen la capacidad de funcionar como antiportadores de potasio acoplado a protones (H+/K+) mediando la salida del potasio celular (Li et al., 2017). Así, NRT1.5/NPF7.3 y NRT1.8/NPF7.2 Resultados 158 podrían regular no solo la carga de nitrato en el xilema, sino también el transporte de potasio en momentos de deficiencia de este nutriente (Drechsler et al., 2015; Du et al., 2019; Li et al., 2017). El mecanismo por el que NRT1.5/NPF7.3 y NRT1.8/NPF7.2 podrían funcionar como antiportadores H+/K+ es controvertido (Raddatz et al., 2020), pero parece evidente que NRT1.5/NPF7.3 afecta al balance homeostático entre nitrato y potasio en el xilema (Li et al., 2017; Lin et al., 2008). Con estos antecedentes y a pesar de haber sido descrito como un transportador de nitrato, si NRT1.4/NPF6.2 transportara potasio, por ejemplo, en un simporte nitrato/potasio en vez de nitrato/protón, la alteración de su función podría ser la causa directa del fenotipo de la planta L14. Para averiguar si la tasa de transporte de nitrato de NRT1.4/NPF6.2 podría mejorarse disponiendo de potasio como cosustrato, se analizó la actividad de NRT1.4/NPF6.2 en mutantes de S. cerevisiae defectuosos en la captación y en la salida de potasio. En estos experimentos se incluyó NRT1.5/NPF7.3 como control. Las distintas cepas se transformaron con los plásmidos pYPGE-NRT1.4WT-GFP y pYPGE-NRT1.4V210M-GFP. Estas construcciones permiten la expresión de una fusión traduccional entre las proteínas NRT1.4/NPF6.2 y GFP a partir del promotor fuerte y constitutivo PGK1. Las colonias transformadas y seleccionadas por prototrofía para el uracilo se incubaron en medio YPD Figura 3.4: Expresión de NRT1.4 y NRT1.4 (V210M) en la levadura H. polymorpha. Colonias individuales de la cepa parental NCYC495 (YNT1), y de los mutantes Δynt1 transformados con el vector vacío (VECTOR) o con el ADNc de NRT1.4/NPF6.2 silvestre (NRT1.4) o mutante (V210M) se crecieron a 37°C en medio YGNH en agitación. Tras 24 horas los cultivos alcanzaron una DO660nm ~ 1, se lavaron, se realizó una dilución milesimal (FD 1:1000) y se incubaron durante 48 horas a 37°C en medio YG + 0,5 mM de nitrato (A) o en medio control YGNH (B). Los histogramas de cajas encuadran los valores de la DO660 ± SD (n=5) y otros parámetros estadísticos (las X representan la media de los valores, la línea horizontal central representa la mediana, los bigotes representan la varianza esperada de los datos). Estadístico t-Student para comprobar diferencias estadísticas entre NRT1.4 y V210M (*p <0,1). Resultados 159 suplementado con 50 mM de KCl durante 16 horas en agitación constante. En primer lugar, se confirmó mediante microscopía de fluorescencia que tanto NRT1.4WT como NRT1.4V210M se expresan en la membrana plasmática de la levadura (Figura 3.5). A continuación, se realizaron soluciones decimales seriadas a partir del cultivo de origen y se determinó la capacidad de las distintas cepas de levadura de crecer en distintos medios suplementados con varias concentraciones de KCl y KNO3 (Mat y Met 2.4.3.1). Se ensayó la captación de potasio dependiente de nitrato en la cepa de levadura TTE9.3 (trk1 trk2), defectuosa en el sistema principal de entrada de potasio en la célula e incapaz de crecer en 0,1 mM de potasio. Como control positivo se utilizó la construcción pRS415-AKT1. Como se observa en la Figura 3.6, la expresión de NRT1.4WT o NRT1.4V210M en la levadura no fue capaz de restaurar el crecimiento de células TTE9.3 en medio AP suplementado con 0,1 mM ó 10 mM de potasio. El crecimiento de estos transformantes no superó el del control con vector vacío, independientemente de si el potasio se adicionó como sal de cloruro o nitrato. Este resultado indica que ni NRT1.4/NPF6.2 (WT o V210M) ni NRT1.5/NPF7.3 median la captación de potasio dependiente de nitrato en S. cerevisiae. Figura 3.5: Localización subcelular de NRT1.4-GFP y NRT1.4 (V210M)-GFP en S. cerevisiae. Células de la estirpe AXT3K o TTE9.3 fueron transformadas con los ADNc correspondientes y cultivadas durante 24 horas en medio YPD a 28°C. Imágenes de microscopía de epifluorescencia (izquierda) y campo claro (derecha) para visualizar la expresión de GFP (microscopio Zeiss Axioscope equipado con un filtro Chroma 41018 (excitador HQ470/40, emisor HQ500LP). La fluorescencia fue predominante en la membrana plasmática y vacuolas de la célula. La escala corresponde a 5 μm. Resultados 160 Posteriormente, probamos si NRT1.4/NPF6.2 o NRT1.5/NPF7.3 podrían mediar la salida de potasio. Ambas proteínas se expresaron en la cepa de levadura AXT3K (ena1- ena4, nha1, nhx1) que carece de las bombas de (Na+, K+) ENA1 a ENA4 y del intercambiador K+, Na+/H+ NHA1 (Figura 3.7). Estas proteínas se sitúan en la membrana plasmática, median la salida de potasio y son necesarias para tolerar altas concentraciones externas de potasio (Quintero et al., 2002). La ausencia de crecimiento de los transformantes en medio YPD pH 5,5 suplementado con 1,5 M de KCl apunta a que NRT1.4/NPF6.2 tampoco media la salida de potasio al exterior celular en la levadura (Figura 3.7 - A). La cepa AXT3K también es deficiente para el intercambiador Na+, K+/H+ NHX1 localizado en la vacuola y en Figura 3.6: Análisis de la capacidad de transporte de potasio de los transportadores NRT1.4/NPF6.2, NRT1.4V210M y NRT1.5/NPF7.3 mediante el crecimiento de S. cerevisiae (TTE9.3). El crecimiento de las levaduras se testó en diferentes medios. Las levaduras crecieron durante 3-4 días a 28°C. Gotas de la estirpe TTE9.3 (trk1 trk2), defectuosa en el sistema principal de entrada de potasio en la célula, transformadas con NRT1.4, V210M o NRT1.5 no recupera el fenotipo silvestre (transformante AKT1) en medio AP suplementado con distintas concentraciones de KCl o KNO3. Resultados 161 compartimentos prevacuolares, lo que se traduce en una sensibilidad a higromicina B. Ni NRT1.4/NPF6.2 ni NRT1.5/NPF7.3 modificaron la sensibilidad a higromicina B (Figura 3.7 - B), por lo que ni NRT1.4/NPF6.2 ni NRT1.5/NPF7.3 complementaron la función de NHX1 en la vacuola. Figura 3.7: Análisis de la capacidad de transporte de potasio de los transportadores NRT1.4/NPF6.2, NRT1.4V210M y NRT1.5/NPF7.3 mediante el crecimiento de S. cerevisiae (AXT3K). Las levaduras crecieron durante 3-4 días a 28°C. Gotas de la estirpe AXT3K (ena1-ena4, nha1, nhx1), que carece de las bombas de (Na+, K+) ENA1 a ENA4 y del intercambiador K+/H+ NHA1. Las colonias transformadas con NRT1.4/NPF6.2, V210M o NRT1.5 no recuperan el fenotipo silvestre de la levadura W303 (control positivo) crecida en medio YPD suplementado con 1,5 M KCl (B) o concentraciones crecientes de higromicina B (C). En resumen, no se ha podido observar ningún efecto del trasportador NRT1.4WT ni NRT1.4V210M en los flujos de potasio en la levadura S. cerevisiae, ya sea para captación, salida o compartimentación vacuolar de este ion. Aunque una explicación admisible a este respecto es que NRT1.4/NPF6.2 carece de actividad de transporte de potasio, es sabido que Resultados 162 las caracterizaciones funcionales de transportadores y canales de plantas en sistemas heterólogos son a veces infructuosas debido a las incompatibilidades existentes entre especies (Dreyer, 1999). Esto se ha reportado para el ya mencionado NRT1.5/NPF7.3, cuya expresión en levaduras no muestra fenotipo claro asociado con el transporte de potasio, a pesar de haberse observado transporte de este ion en ovocitos de Xenopus (Li et al; 2017) mediante la técnica NMT/MIFE (Noninvasive Microelectrode Ion Flux Estimation; Shabala et al., 2013). Por lo tanto, se hacía necesaria la utilización de otro método para confirmar o no la capacidad de NRT1.4/NPF6.2 de transportar potasio. 4.4 Ensayos de acumulación de 15N en ovocitos de Xenopus laevis La cuantificación del isótopo estable no radiactivo 15N en ovocitos de Xenopus laevis ha ayudado a la caracterización del transporte de nitrato marcado isotópicamente con 15N de la mayoría de los NPF. Durante el desarrollo de esta Tesis se ha llevado a cabo una colaboración con los equipos del Dr. Alexis De Angeli y Dr. Benoît Lacombe (BPMP, Montpellier) con el objetivo de caracterizar el transporte de NRT1.4/NPF6.2 y NRT1.4V210M. En primer lugar, para comprobar el efecto de la mutación NRT1.4V210M sobre el transporte de nitrato se reprodujo el experimento llevado a cabo por Leran y colaboradores (2015). Contingentes de 15 ovocitos fueron inyectados con ARNc de NRT1.4WT y NRT1.4V210M y se incubaron durante 2 horas en medio ND96, pH 5,5, que contenía entre 0,1 y 30 mM 15NO3 - y 2 mM de potasio. Tras sucesivos lavados con ND96 pH 5,5, los ovocitos se secaron a 65C durante 24 horas y se analizó su contenido en 15N mediante espectrometría isotópica de masas (Mat y Met 2.10). Los resultados de este análisis se recogen en la Figura 3.8. La mutación NRT1.4V210M ocasionó la acumulación de aproximadamente el doble de 15N en el interior de los ovocitos incubados con 30 mM de nitrato con respecto a aquellos que expresaban la versión silvestre del transportador. Por tanto, la mutación puntual V210M parecía alterar la velocidad de transporte de la proteína NRT1.4/NPF6.2. Por otra parte, la acumulación de 15N en ovocitos disminuyó a medida que se redujo la concentración de nitrato en el medio desde 30 mM a 0,5 mM (Figura 3.8 ̶ B), lo cual concuerda con la actividad de un transportador de nitrato de baja afinidad activo en el rango milimolar. En la literatura existente, la KM descrita para NRT1.4/NPF6.2 es 2,5 mM (Chiu et al., 2004), siendo típicos valores entre 2 y 12 mM en los transportadores de nitrato de baja afinidad de la familia NPF (Corratgé-Faillie & Lacombe, 2017). Con los datos obtenidos no es posible llevar a cabo con certeza un ajuste Michaelis-Menten, dado que no se logra la saturación en el transporte a 30 mM de NO3 - (Figura 3.8 ̶ C), pero se pueden estimar afinidades de KM= 51,90 mM para NRT1.4WT y KM= 31,3 mM para NRT1.4V210M, lo que implicaría un aumento de la afinidad por nitrato causada por la mutación V201M. Resultados 163 Figura 3.8: Acumulación de 15N en ovocitos inyectados con agua (Control), NRT1.4/NPF6.2 o NRT1.4(V210M). Los ovocitos fueron incubados en medio ND96 pH 5,5 con 30 mM de nitrato marcado (A) o con concentraciones decrecientes de nitrato marcado. (B) Los histogramas muestran los valores medios ± SD (n=6-8 ovocitos). Estadístico ANOVA (Test de Tukey) para comprobar las diferencias entre grupos a cada una de las concentraciones testadas. Las letras muestran diferencias entre grupos con un nivel de significación p <0,05. (C) Representación Michaelis-Menten para los valores de acumulación de 15N en NRT1.4/NPF6.2 Y NRT1.4 (V210M) representados en la gráfica B. Resultados 164 Como se ha mencionado al inicio de este Capítulo, el transportador NRT1.4/NPF6.2 es más activo en medio ácido (pH 5,5), reduciéndose el transporte a medida que el pH del medio aumenta, lo que es indicativo de un transporte de nitrato dependiente de protones externos. Para comprobar si la mutación V201M alteraba la dependencia del pH exterior, en un segundo experimento los ovocitos fueron incubados durante 2 horas en medio ND96 con 30 mM 15NO3 - y pH 5,5, pH 6,2 o pH 7. En el caso de NRT1.4/NPF6.2, la acumulación de 15N en el ovocito disminuyó conforme el medio se acercaba a pH neutro, tal y como había sido descrito previamente para otros transportadores de nitrato miembros de la familia NRT1/NPF. En este sentido, los ensayos de TEVC llevados a cabo en ovocitos con algunos transportadores de nitrato NPF han demostrado que, en condiciones externas ácidas, la adición de nitrato induce corrientes negativas a potenciales de membrana negativos. Este comportamiento es una prueba de un influjo de cargas positivas, lo que sugiere que estos transportadores son simportes electrogénicos NO3 -/(n)K+ y la carga positiva neta del transporte pertenece al H+. En el caso de la proteína mutante NRT1.4V210M la acumulación de nitrato disminuyó a pH 6,2 respecto a pH 5,5, pero aumentó de nuevo a pH 7,0 (Figura 3.9), manifestando un comportamiento errático que impide observar una tendencia en el transporte de nitrato dependiente de protones. A la vista de estos resultados no podemos concluir que la mutación NRT1.4V210M altere la dependencia del pH, pero podemos apuntar que la capacidad de transporte de la proteína mutante se mantiene en niveles significativamente superiores a los de NRT1.4WT a cualquiera de los pH ensayados. Figura 3.9: Acumulación de 15N en ovocitos inyectados con agua (Control), NRT1.4/NPF6.2 o NRT1.4(V210M) en presencia de distintos pH. Los ovocitos fueron incubados en medio ND96 con 30 mM de nitrato marcado a distintos pH (5,5, 6,2 y 7,0). Las barras muestran los valores medios ± SD (n=6-8 ovocitos). Estadístico ANOVA (Test de Tukey) para comprobar las diferencias entre grupos a cada una de las concentraciones testadas. Las letras muestran diferencias entre grupos con un nivel de significación p <0,05. Resultados 165 Tras los ensayos llevados a cabo en S. cerevisiae decidimos comprobar de nuevo y mediante otro sistema heterólogo si la concentración de potasio influye en algún sentido en la función de NRT1.4/NPF6.2 y si la mutación NRT1.4V210M implica alguna diferencia en el transporte. En este caso, los contingentes de 10 ovocitos fueron incubados durante 2 horas en medio ND96 con 30 mM 15NO3 -, pH 5,5 y diferentes concentraciones de potasio. Al igual que en los experimentos anteriores, tras sucesivos lavados con ND96 pH 5,5, los ovocitos se secaron a 65C durante 24 horas y se analizó su contenido en 15N mediante espectrometría isotópica de masas. En la Figura 3.10 se observa que los ovocitos que expresaban NRT1.4V210M acumularon más 15N en su interior con respecto a los inyectados con NRT1.4WT, independientemente de la concentración de potasio en el medio. Los resultados obtenidos para NRT1.4WT concordaron con la bibliografía existente al mostrar una inhibición de la toma de nitrato a altas concentraciones (50 mM) de potasio, significando que NRT1.4/NPF6.2 funcionaría como un cotransporte NO3 -/H+, y que concentraciones crecientes de potasio en el medio podrían interferir con la captación de protones necesaria para el transporte. En cuanto a la acumulación de 15N en NRT1.4V210M, mientras que el transporte de nitrato por NRT1.4WT se inhibe con 50 mM de KCl, no sucede lo mismo en el mutante. Estos resultados ponen de manifiesto otra diferencia catalítica entre NRT1.4V210M y su control silvestre, aunque las bases moleculares y sus consecuencias sean de momento desconocidas. Figura 3.10: Acumulación de 15N en ovocitos inyectados con agua (Control), NRT1.4/NPF6.2 o NRT1.4(V210M) en presencia de distintas concentraciones de potasio. Los ovocitos fueron incubados en medio ND96 pH 5,5 con 30 mM de nitrato marcado y distintas concentraciones de potasio (0, 2 y 50 mM de KCl). Las barras muestran los valores medios ± SD (n=6-8 ovocitos). Estadístico ANOVA (Test de Tukey) para comprobar las diferencias dentro de cada contingente (Control, NRT1.4/NPF6.2 ó NRT1.4-V210M) para cada una de las concentraciones de potasio testadas, ***p <0,001. Resultados 166 En conjunto, los datos obtenidos con los ensayos de acumulación de 15N conducen a la conclusión de que la mutación NRT1.4V210M confiere un incremento en el transporte de nitrato con respecto al control en cualquiera de las condiciones ensayadas, es decir, independientemente de la concentración extracelular de nitrato, de potasio o la acidez del medio. 4.5 Regulación post-traduccional de NRT1.4/NPF6.2 En general, la regulación post-traduccional de los transportadores de nitrato es poco conocida, siendo la más notable la mediada por el complejo kinasa CBL1/9-CIPK23 de NRT1.1/NPF6.3 (Ho et al., 2009). La estructura cristalina de NRT1.1/NPF6.3 revela un homodímero, y se cree que el acoplamiento y desacoplamiento de los monómeros es controlado por la disponibilidad de sustrato y la fosforilación del residuo NRT1.1T101 por CBL1/9-CIPK23 (Ho et al., 2009; Parker & Newstead, 2014; Sun et al., 2014; Tsay et al., 2011). Este residuo está conservado entre los ortólogos de NRT1.1/NPF6.3 en plantas. Cuando no está fosforilado, NRT1.1/NPF6.3 actúa como un transportador de nitrato de baja afinidad que funciona como un dímero. Cuando disminuye la concentración de nitrato exterior se genera una señal de calcio, que es percibida por los sensores de calcio CBL1 o CBL9, y conduce a la fosforilación de NRT1.1/NPF6.3 por parte de CBL1/9-CIPK23, lo que provoca la disociación del dímero. Los monómeros fosforilados de NRT1.1/NPF6.3 actúan como transportadores de alta afinidad. La fosforilación de NRT1.1T101 no sólo está implicada en el cambio de afinidad del transportador, también dirige la función sensora de NRT1.1/NPF6.3 en la activación de respuestas específicas relacionadas con la nutrición de nitrato. De hecho, algunas publicaciones apuntan a que la implicación de NRT1.1/NPF6.3 como transportador de alta afinidad no es altamente representativa en el conjunto de transportadores de alta afinidad, en los que se incluyen las proteínas NRT2 (Glass & Kotur, 2013; Wen & Kaiser, 2018). Sin embargo la fosforilación de T101 es fundamental para el crecimiento de Arabidopsis a bajas concentraciones de nitrato (Ye et al., 2019), lo que sugiere que NRT1.1/NPF6.3 fosforilado probablemente actúe como un sensor de nitrato en lugar de como un transportador a bajas concentraciones de este nutriente. En este sentido, se ha observado que la fosforilación del residuo T101 es necesaria para la regulación de desarrollo lateral de las raíces o la represión de la transcripción del transportador de alta afinidad NRT2.1 cuando la concentración de nitrato extracelular es suficiente (Bouguyon et al., 2015; Ho et al., 2009). La treonina T98 de NRT1.4/NPF6.2, localizada al comienzo del tercer dominio transmembrana de la proteína, es equivalente al residuo T101 de NRT1.1/NPF6.3, (Figura 3.11 ̶ A). Dada la similitud en la secuencia de NRT1.4/NPF6.2 con NRT1.1/NPF6.3 (Anexo 3: Filogenia y alineamiento NRT1.1-NRT1.4) y la importancia de la fosforilación en la función de la proteína se planteó la posibilidad de que el mismo mecanismo de regulación post-traduccional sería posible para NRT1.4/NPF6.2 a través de este residuo. Para Resultados 167 comprobar esta hipótesis, en primer lugar se clonó el fragmento de NRT1.4/NPF6.2 que codifica una región de 10 aminoácidos que contenía la treonina 98 (desde F92 a F102) en el plásmido pGEX4T1 para obtener una fusión C-terminal a GST. También se clonó el mismo fragmento con la mutación T98A para anular la presumible fosforilación de este residuo por CIPK23. Ambas proteínas recombinantes GST:NRT1.4 y GST:NRT1.4(T98A) (Anexo 2: Plásmidos) se purificaron y se utilizaron como sustratos para la kinasa hiperactiva CIPK23- ΔC-T190D en un ensayo de fosforilación in vitro (Mat y Met 2.3). La proteína silvestre CIPK23 es inactiva in vitro, pero se puede activar mediante la eliminación del dominio autoinhibidor C-terminal y la mutación fosfomimética T190D en el lazo de activación (CIPK23-ΔC-T190D) (Chaves-Sanjuan et al., 2014; Sánchez-Barrena et al., 2020). Tras detener la reacción de fosforilación, las proteínas se separaron en un gel SDS-PAGE al 12,5%. La radiactividad incorporada a las proteínas resueltas en el gel se reveló por autorradiografía, que junto con la tinción con Coomassie se muestran en la Figura 3.12. Como se puede observar, la banda correspondiente a GST:NRT1.4 aparece marcada en la autoradiografía y esta señal desaparece cuando el residuo T98 es mutado a alanina en GST:NRT1.4(T98A). Este resultado indica que NRT1.4/NPF6.2 es fosforilado en T98 por CIPK23-ΔC-T190D. Figura 3.11: Representación tridimensional de la estructura del dominio poro de NRT1.4/NPF6.2 (A) Segmentos transmembrana del 1 al 5 (TM1-TM5), modelado a partir de la estructura cristalina de NRT1.1/NPF6.3 (código PDB 4oh3B) utilizando la herramienta Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org). El residuo Thr98, localizado en el TM3, está representado con esferas (B) Vista del residuo Thr98 en el TM3 y alineamiento de aminoácidos de NRT1.1/NPF6.3 y NRT1.4/NPF6.2 alrededor de la posición Thr101 de NRT1.1/NPF6.3, diana de CIPK23. Resultados 168 Figura 3.12: CIPK23 fosforila NRT1.4/NPF6.2 en el residuo Thr98 in vitro. (A) Fosforilación in vitro del fragmento de NRT1.4/NPF6.2 desde F92 a F102, unido a GST, en presencia de [γ-32P]ATP y la quinasa CIPK23-ΔC-T190D. La caseína y GST se han utilizado como control de la fosforilación. Después de la reacción de fosforilación, las proteínas se separaron en un gel 12,5% SDS-PAGE y la radiactividad incorporada se analizó por autoradiografía (paneles de la izquierda). La tinción Coomassie (CBB) se muestra en los paneles a la derecha. Los paneles denominados CIPK23-ΔC- T190D muestran la autofosforilación de la quinasa. (B) Experimento similar al mostrado en el panel B, incluyendo el fragmento NRT1.4 (F92-F102)-GST con la mutación T98A (GST-T98A) para demostrar el sitio de fosforilación de CIPK23. Para comprobar el efecto in vivo de esta modificación post-traduccional se coexpresaron los transportadores NRT1.4WT y NRT1.4V210M junto con CIPK23 y CBL1 en ovocitos de Xenopus laevis. Tras incubarse durante 2 horas en medio ND96 pH 5,5 que contenía 30 mM 15NO3 -, los contingentes de ovocitos se lavaron con ND96 pH 5,5, se Resultados 169 secaron a 65C durante 24 horas y se analizó su contenido en 15N mediante espectrometría isotópica de masas (Mat y Met 2.10). Como se muestra en la Figura 3.13, la coexpresión con CBL1-CIPK23 produjo una disminución en la acumulación de 15N en ovocitos en el rango de baja afinidad. Esta disminución en la acumulación de 15N en ovocitos ya había sido reportada anteriormente para NRT1.1/NPF6.3 cuando se coexpresaba con CBL9-CIPK23, y se había identificado con una disminución del transporte de baja afinidad en favor de un aumento en la toma de nitrato de alta afinidad (Ho et al., 2009). Figura 3.13: Acumulación de 15N en ovocitos inyectados con agua (Control) o con las distintas combinaciones de ADNc indicadas. Los contingentes de ovocitos se incubaron en medio ND96 pH 5,5 - 30 mM de nitrato marcado. Las barras muestran los valores medios ± SD (n=6-8 ovocitos). Estadístico t-Student tras comprobar diferencia estadística de NRT1.4/NPF6.2 y NRT1.4 (V210M) con el control. ***p <0,001, **p <0,05. Resultados 170 Capítulo 4: Implicación de NRT1.4/NPF6.2 y AKT1 en la distribución de nitrato y potasio en A. thaliana Los experimentos llevados a cabo en sistemas heterólogos y recogidos en los Capítulos 3 y 4 de Resultados demuestran que la línea L14 tiene mutaciones puntuales con efecto en la actividad de dos proteínas: la mutación AKT1W135Z produce la pérdida de función del canal de potasio y la mutación NRT1.4V210M ocasiona un incremento de su actividad de transporte de nitrato. Los genes que codifican para ambas proteínas (AKT1: AT2G26650; NRT1.4/NPF6.2: AT2G26690; Figura 4.1) se encuentran muy próximos dentro del cromosoma 2 de Arabidopsis thaliana. Por este motivo, durante el desarrollo de esta tesis no ha sido posible la obtención de líneas aisladas con cada una de las mutaciones. Debido a este hecho, los experimentos presentados a lo largo de este Capítulo se han llevado a cabo con la línea control HAK5:LUC, los mutantes knock-out akt1-2 (Rubio et al., 2008) y nrt1.4-2 (WiscDsLox322H05; Chiu et al., 2004) y el doble mutante L14. El objetivo de los experimentos descritos a continuación es deducir el papel que podría jugar el transportador NRT1.4/NPF6.2 en la distribución de nitrato y potasio, así como en su señalización. 4.1 Efecto de la pérdida de función de NRT1.4/NPF6.2 en la transcripción de HAK5 La línea L14 fue seleccionada por mostrar un fenotipo de respuesta alterada de la expresión de HAK5:LUC en condiciones de suficiencia de potasio. Como se ha mencionado en el Capítulo 3, la mutación AKT1W135Z provoca el truncamiento de la proteína a partir del aminoácido 135. Sin embargo, el fenotipo del mutante L14 es más severo y en algunos aspectos no coincidente (p.e. producción de etileno, niveles de expresión endógena del gen HAK5) con el del mutante akt1-2 de pérdida de función por inserción de ADN-T. Por lo Figura 4.1: Representación de la localización de los genes AKT1 (AT2G26650) y NRT1.4/NPF6.2 (AT2G26690) dentro del cromosoma 2. Resultados 171 tanto, era necesario comprobar si el transportador NRT1.4/NPF6.2 está implicado en la transcripción del transportador de potasio de alta afinidad HAK5. Para ello, se analizó la expresión de este gen mediante RT-qPCR (Mat y Met, 2.2.2) en condiciones de hambre (0,1 mM potasio, 2 mM nitrato) y suficiencia (4 mM potasio, 2 mM nitrato) de potasio en plántulas de 7 días de las líneas silvestre (HAK5:LUC) y los mutantes akt1-2, nrt1.4-2 y L14. Los niveles de HAK5, expresados como Log2(FC) se muestran en la Figura 4.2. La expresión de HAK5 endógeno fue significativamente superior en las líneas mutantes en comparación con el parental HAK5:LUC en condiciones de baja disponibilidad de potasio, siendo el mutante simple nrt1.4-2 el que mayor expresión del gen manifestó. En condiciones de suficiencia de potasio no existen diferencias significativas entre las plántulas de las cuatro líneas. Estos resultados concuerdan con los de un experimento similar mostrado en la Figura 1.10 y apuntan a una posible influencia del transportador de nitrato NRT1.4/NPF6.2 en la inducción de la expresión de HAK5 en hambre de potasio, y por lo tanto a una implicación de la mutación NRT1.4V210M en el fenotipo de selección de L14. 4.2 Efecto de las mutaciones en AKT1 y NRT1.4/NPF6.2 en la distribución total de potasio y nitrato Para esclarecer si la función de AKT1 y NRT1.4/NPF6.2 afectaba a la distribución general de potasio y nitrato se determinaron las concentraciones de estos nutrientes en los tejidos de las cuatro líneas. Seis plantas de 5 semanas de cada genotipo, crecidas en cultivo Figura 4.2: Expresión del gen endógeno HAK5 en las líneas WT (HAK5:LUC), akt1-2, nrt1.4-2 y L14. La expresión de los genes se midió en plántulas crecidas durante 7 días en medio LAK suplementado con 0,1 ó 4 mM de KCl. Los niveles de expresión se muestran como el Log2(FC) de HAK5 respecto al gen UBQ10, y respecto a la muestra de referencia (expresión de HAK5 en la muestra WT-0,1 mM de KCl) según el método comparativo de CT. Se representa la media de tres réplicas biológicas. Las barras con diferentes letras muestran diferencias significativas con un p <0,05 (ANOVA, Test de Tukey). Resultados 172 hidropónico con 1 mM de potasio y 4 mM de nitrato, se recogieron y se diseccionaron en raíz y parte aérea. En primer lugar, se analizó el crecimiento de las cuatro líneas en las condiciones mencionadas. Como se aprecia en la Figura 4.3, mientras que el peso seco de plantas enteras de la línea L14 es ligeramente inferior al del resto (a p =0,417 con respecto al silvestre, Test de Tukey), el porte de las plantas de la línea nrt1.4-2 fue significativamente superior al del resto de líneas (p <0,05, Test de Tukey). Este último dato es congruente con el mayor tamaño de las hojas del mutante nrt1.4-2 crecido en sustrato descrito previamente (Chiu et al., 2014). Posteriormente se secaron y se prepararon las muestras (Mat y Met 2.7.1) para la cuantificación de nitrato (Mat y Met 2.7.2) y de potasio (Mat y Met 2.7.3) presentes en ellas. Los niveles de nitrato en la roseta fueron semejantes en todas las líneas (alrededor de 10 mg por g de peso seco), mientras que en las raíces se observó una disminución en el contenido en las líneas mutantes akt1-2 y L14 con respecto al control, pero no en nrt1.4-2 (Figura 4.4 ̶ A). En cuanto al contenido de potasio (Figura 4.4 ̶ B), los niveles en la parte aérea fueron similares en las líneas control y L14 (alrededor de 40 mg g-1 PS), mientras que se apreciaron diferencias significativas entre las líneas mutantes nrt1.4-2 (≈50 mg g-1 PS) y akt1-2 (≈30 mg g-1 PS). En las raíces, L14 tiene un decremento más intenso en cuanto al contenido de potasio que akt1-2 (valor estadístico akt1-2 vs L14 p=0,071, Test de Tukey), siendo los niveles de ambos significativamente inferiores a los del control y nrt1.4-2. Figura 4.3: Imagen representativa del crecimiento de las líneas WT, akt1-2, nrt1.4-2 y L14. Las plantas crecieron en cultivo hidropónico con solución LAK 1 mM de K+, 4 mM de NO3 -durante 5 semanas en condiciones de día corto. (A) Imagen representativa de plantas de las cuatro líneas. (B) Medida del peso seco de plantas enteras. Se representa la media de seis réplicas biológicas ± SD. Estadístico ANOVA (Test de Tukey). Diferentes letras muestran diferencias significativas con un p <0,05. Resultados 173 Figura 4.4: Concentraciones de nitrato (A) y potasio (B) en raíz y parte aérea de las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt.4-2 y L14. Las plantas crecieron en cultivo hidropónico con solución LAK 1 mM de K+, 4 mM de NO3 - durante 5 semanas en condiciones de día corto. La figura (C) muestra la relación de concentraciones en la roseta y en la raíz para ambos nutrientes. Se representa la media de seis réplicas biológicas. Las barras con diferentes letras muestran diferencias significativas con un p <0,05, ANOVA, Test de Tukey. Resultados 174 Las diferencias más significativas entre la línea L14 con respecto a la línea control y los mutantes simples se encuentran a nivel de la relación parte aérea-raíz (Figura 4.4 ̶ C). La proporción de nitrato roseta/raíz guarda una relación entre 2 y 3 en la línea control y los mutantes simples, mientras que en el mutante L14 hay siete veces más nitrato en la roseta que en la raíz. Igualmente, la relación roseta/raíz para el contenido de potasio tiene un valor de 0,5 en la línea control y mutantes simples, mientras que en L14 es cuatro veces superior. En conjunto, estos resultados apuntan a que la línea L14 no sufre un déficit de nitrato, sino problemas en su distribución: aunque las raíces de este mutante almacenan menos nitrato que el control, los niveles de nitrato en la parte aérea son similares (Figura 4.4 ̶ A), de lo que se deduce que L14 envía a la parte aérea una parte mayor del nitrato captado. En cuanto al potasio, los niveles en raíz de este ion son los esperables para un mutante nulo akt1 (véanse niveles semejantes en akt1-2 y L14 en la Figura 4.4 ̶ B) no siendo así en la roseta, donde L14 acumula más cantidad de potasio que akt1-2. Estas diferencias poco significativas entre akt1-2 y L14 se acentúan al analizar la relación roseta/raíz para el contenido tanto de potasio como de nitrato (Figura 4.4 ̶ C). La distribución anómala de nutrientes en las plantas L14 podría ser consecuencia por tanto de la mutación NRT1.4V210M, que confiere una ganancia de función de la proteína y presumiblemente favorece la movilización de nitrato a la parte aérea, arrastrando consigo el potasio necesario para la compensación de cargas iónicas en el transporte. Para comprobar si la disminución de la concentración de nitrato disponible altera la distribución de ambos nutrientes en los cuatro genotipos, el experimento se repitió con tres plantas de 5 semanas de cada línea, crecidas en cultivo hidropónico con 1 mM de potasio y 0,5 mM de nitrato. La reducción del contenido de nitrato en el medio disminuyó la concentración de nitrato tanto en la roseta como en las raíces de las cuatro líneas. En estas condiciones (0,5 mM NO3 -), sólo la línea L14 mostró un déficit significativo con respecto a la línea control (Figura 4.5 ̶ A). En cuanto a los niveles de potasio (Figura 4.5 ̶ B), el contenido en las rosetas se redujo en todas las líneas con respecto a las condiciones de suficiencia de nitrato (en 4 mM de nitrato se sitúan entre los 30 y los 50 mg g-1 PS, en 0,5 mM de nitrato entre los 20 y los 40 mg g-1 PS), siendo en este caso la línea akt1-2 la que mostró un contenido significativamente inferior al resto de líneas. Las líneas nrt1.4-2 y L14 presentaron una menor concentración de potasio en las raíces (p = 0,07 en HAK5:LUC vs nrt1.4-2 y HAK5:LUC vs L14). A diferencia de lo que se observaba a 4 mM de nitrato (en el que las líneas akt1-2 y L14 poseían niveles significativamente inferiores de potasio) la línea akt1-2 no acusó alteraciones en los niveles de potasio en las raíces cuando el nitrato era limitante. Resultados 175 Figura 4.5: Concentraciones de nitrato (A) y potasio (B) en raíz y parte aérea de plantas de las líneas HAK5:LUC, akt1-2, nrt1.4-2 y L14. Las plantas crecieron en cultivo hidropónico con solución LAK 1 mM de K+, 0,5 mM de NO3 - durante 5 semanas en condiciones de día corto. La figura (C) muestra la relación de concentraciones en la roseta y en la raíz para ambos nutrientes. Se representa la media de seis réplicas biológicas. Las barras con diferentes letras muestran diferencias significativas con un p <0,05, ANOVA, Test de Tukey. Resultados 176 En cuanto a la partición roseta/raíz (Figura 4.5 ̶ C), en condiciones de bajo nitrato (0,5 mM) la línea L14 tenía 5 veces más nitrato en la roseta que en la raíz, mientras que en el resto de líneas la proporción roseta/raíz es de 2:1 para este nutriente. En lo referente a la distribución de potasio en estas condiciones, la línea L14 tiene una relación roseta/raíz semejante a la del mutante nrt1.4-2. Ambas líneas tienen una mayor proporción de potasio en la roseta con respecto a la línea HAK5:LUC, mientras que en el mutante simple akt1-2 la relación roseta/raíz es aún menor que en la línea silvestre. En resumen, la anomalía en la distribución de nutrientes manifestada por la línea L14 en condiciones control (1 mM K+, 4 mM NO3 -) se mantiene para el nitrato en condiciones limitantes de este nutriente (1 mM K+, 0,5 mM NO3 -), pero no afecta significativamente a la distribución de potasio. Por otra parte, el comportamiento de la línea akt1-2 asegura unos niveles adecuados en las raíces en detrimento de una exportación de potasio a la parte aérea. Discusión Discusión 179 Un rastreo genético en Arabidopsis thaliana conducente al aislamiento de mutantes que presentaran una alteración del patrón de expresión del gen reportero HAK5:LUC ha resultado en el aislamiento de la línea mutante L14. Esta línea presentaba una expresión más elevada del gen reportero en condiciones de suficiencia de potasio (4 mM) con respecto a la línea parental. El análisis del fenotipo de plantas F1 producidas por retrocruzamiento de la línea L14 con su parental HAK5:LUC indicó el carácter semidominante de la(s) mutacione(s) presente(s) en L14. Las plantas heterocigóticas F1 se autopolinizaron para obtener la generación F2 segregante en la que se seleccionaron plantas que de nuevo mostraban el fenotipo característico de L14 de expresión incrementada del reportero HAK5:LUC en condiciones de suficiencia de potasio. Estas plantas F2 se agruparon y sus genomas combinados se secuenciaron y compararon con el ecotipo parental Col-0 para detectar las variaciones o polimorfismos de secuencia (SNP) que pudieran corresponder con la(s) mutacion(es) causativa(s) del fenotipo L14. Entre las mutaciones encontradas durante la secuenciación destaca una mutación puntual en el canal de potasio AKT1, que produce el cambio del triplete codificante de W135 por un codón de parada (AKT1W135Z). Esta mutación provoca la síntesis de una proteína truncada; un péptido que, como se observa en la Figura 2.1, carece de actividad transportadora en ovocitos de Xenopus. La pérdida de función de AKT1 podría justificar por sí misma la expresión incrementada del gen reportero HAK5:LUC en la línea L14, lo que configuraría la mutación AKT1W135Z como un nuevo alelo akt1-3. Sin embargo, como se muestra en el Capítulo 1 de Resultados, el fenotipo de L14 es más severo y en algunos aspectos no coincidente (p.e. producción de etileno) con el del mutante akt1-2 de pérdida de función por inserción de ADN-T. Esta observación sugiere dos hipótesis: el péptido AKT1W135Z podría ser capaz de interaccionar con otros canales tipo Shaker y alterar su función, o bien algunas de las otras mutaciones presentes en la línea L14 contribuye a su fenotipo con características adicionales a las que confiere la pérdida de actividad de AKT1. Para abordar la primera hipótesis se coexpresó el péptido AKT1W135Z con la proteína canónica AKT1 en la estirpe de S. cerevisiae TTE9.3, carente de los principales transportadores de toma de potasio, y en ovocitos de Xenopus laevis. En ambos casos se comprobó que el péptido AKT1W135Z no modifica la actividad del canal canónico cuando se coexpresa con él, como se observa en la Figura 2.3. Por lo tanto, el fenotipo diferencial de L14 con respecto al mutante simple akt1-2 (Figura 1.8, Figura 1.9, Figura 1.10), así como la expresión anómala del gen reportero HAK5:LUC en condiciones de suficiencia de potasio (Figura 1.12) debe estar asociada a la influencia de otra de las mutaciones identificadas en L14. Para explorar esta segunda hipótesis se analizaron las mutaciones encontradas en proteínas previamente caracterizadas y que de manera apriorística pudieran estar relacionadas con un efecto en la nutrición de potasio según la información disponible en las bases de datos https://www.arabidopsis.org/ y https://www.uniprot.org/. Se descartó https://www.arabidopsis.org/ https://www.uniprot.org/ Discusión 180 la influencia de la mayoría de mutaciones puntuales encontradas en L14 mediante diferentes estrategias. El análisis de la estructura radicular de L14 descartó al factor de transcripción CDF4 (Figura 2.5). Por otra parte, mediante RT-qPCR se excluyó la posibilidad de que la mutación en un intrón de GLR2.7 afectase al procesamiento y maduración del ARNm (Figura 2.4), así como que la mutación en ERH1 fuese la causante de los altos niveles en ácido salicílico y de la expresión anómala de HAK5:LUC en la línea mutante (Figura 2.7). Finalmente, en estudio de la bibliografía disponible sobre las proteínas VPS2.1, PMT1, FUC1 y PARP1 condujo al descarte de su papel en el fenotipo de L14. Tras descartar el efecto de estas mutaciones la búsqueda de candidato se circunscribió a la mutación puntual NRT1.4/NPF6.2V210M. Los análisis en ovocitos de Xenopus laevis y Hansenula polymorpha detallados en el Capítulo 3 de Resultados han demostrado un efecto de la mutación V210M en la actividad de la proteína. Dada la manifiesta implicación del transporte de nitrato en la homeostasis de potasio (Raddatz et al., 2020) dicho efecto podría afectar al sensing, la adquisición o distribución de potasio en la línea L14. La línea L14 se configura pues como un mutante doble que acusa una pérdida de función en el canal de potasio AKT1 y una ganancia de función en el transportador de nitrato NRT1.4/NPF6.2. Los resultados obtenidos con la línea L14 ofrecen interpretaciones complejas. Como se ha mencionado en el Capítulo 5 de Resultados, ambos genes se encuentran a una distancia génica tal que la segregación de mutaciones resulta complicada al tratarse de un evento improbable y con un análisis fenotípico laborioso. Por lo tanto, la estrategia a seguir durante esta discusión será, por una parte, poner de manifiesto la influencia del transportador NRT1.4/NPF6.2 en la nutrición de potasio, y por otra parte perfilar al residuo NRT1.4V210 como clave para la cinética del transporte de nitrato por la proteína y su efecto en la nutrición de potasio y el fenotipo del mutante L14. Influencia del transportador NRT1.4/NPF6.2 en la señalización del hambre de potasio La proteína NRT1.4/NPF6.2 de Arabidopsis ha sido descrita como un transportador de nitrato dependiente de pH, probablemente mediante un simporte NO3 -/H+, que controla el flujo de nitrato en el peciolo para regular el metabolismo de nitrato en la hoja (Chiu et al., 2004). En el desarrollo de esta tesis hemos demostrado mediante la expresión en Nicotiana benthamiana que la proteína se localiza en la membrana plasmática (Figura 3.3). A pesar de haber sido reportadas corrientes eléctricas en los ensayos de electrofisiología mediante TEVC en ovocitos de Xenopus llevados a cabo por Chiu y colaboradores (2004), nuestro grupo y otros laboratorios han encontrado que esta proteína es silente en este tipo de ensayo (Noguero et al., 2020). Esto puede ser debido a que NRT1.4/NPF6.2 es un transportador que lleva a cabo un simporte electroneutro NO3 -/H+, y que las condiciones Discusión 181 experimentales utilizadas por Chiu y colaboradores (2004) resultaran en la estimulación de transportadores propios del ovocito (Efthymiadis et al., 1993). Además de en el peciolo, NRT1.4/NPF6.2 también se expresa (en orden decreciente de abundancia de ARNm) en las células guarda, en el periciclo de raíz, en los centros quiescentes del ápice radicular y en el tejido vascular de la parte aérea (https://genevisible.com/tissues/AT/Ensembl%20Gene/AT2G26690). Este patrón de expresión amplio puede ser compatible con los roles fisiológicos adicionales que hemos hallado en este trabajo. La expresión de NRT1.4/NPF6.2 en las raíces podría explicar algunos de los resultados obtenidos con el análisis de plantas mutantes con pérdida de función de NRT1.4/NPF6.2. Por una parte, permite a NRT1.4/NPF6.2 influir en la expresión del gen endógeno HAK5 de forma local en condiciones de hambre de potasio. Tal y como se observa en la Figura 4.2, el mutante knock-out nrt1.4-2 tiene niveles significativamente superiores del transcrito HAK5 cuando se analiza la expresión en plántulas de 7 días crecidas en medio LAK 0,1 mM de KCl con respecto a las líneas silvestre, akt1-2 y L14. Por el contrario, en medio con 4 mM de potasio la abundancia del transcrito HAK5 fue menor en el mutante nrt1.4-2 que en los otros genotipos ensayados. Por otra parte, la presencia de NRT1.4/NPF6.2 en raíces podría explicar las diferencias en el contenido de nitrato y potasio del mutante nrt1.4-2 con respecto a la línea control. Cuando el nitrato en el medio se redujo a 0,5 mM, el mutante nrt1.4-2 mostró un contenido de potasio en las raíces más bajo que el control silvestre (p=0,079 en HAK5:LUC vs nrt1.4, ANOVA Test de Tukey; Figura 4.5 – B). Esto sugiere un efecto positivo de NRT1.4/NPF6.2 en el transporte de potasio en condiciones de bajo nitrato para asegurar unos niveles suficientes de potasio. En cambio, los niveles de nitrato en las raíces del mutante nrt1.4-2 son semejantes a los del control, probablemente porque la asimilación de nitrato podría haber cancelado las pequeñas diferencias en el contenido de nitrato entre genotipos. En otras palabras, es posible que un aumento en la toma de nitrato no se refleje adecuadamente en un mayor contenido neto en los tejidos debido a su asimilación en materia orgánica, mientras que una menor toma de nitrato se vería reflejada, o incluso magnificada, por el mismo motivo. En condiciones de suficiencia de ambos nutrientes, la ausencia de NRT1.4/NPF6.2 conduce al incremento en el contenido de potasio en la parte aérea (Figura 4.4 – B). El bajo contenido de nitrato en el peciolo del mutante nrt1.4-2 en favor de una acumulación en la lámina (Figura 3.2) está en consonancia con este hecho. Un mayor flujo de nitrato a la lámina (donde probablemente esté siendo asimilado) precisa de un incremento en los niveles de potasio en la parte aérea del mutante para asegurar el balance de cargas y la expansión celular de las células de la lámina (Figura 4.4 – B). Estos resultados evidencian el impacto de la función del transportador NRT1.4/NPF6.2 en las raíces, y sugieren un rol para esta proteína en la nutrición de potasio en nuestras condiciones experimentales. A la vista de estos resultados, las diferencias en el Discusión 182 contenido de potasio entre los genotipos ensayados (AKT1 NRT1.4, akt1-2 NRT1.4, AKT1 nrt1.4-2 y AKT1W135Z NRT1.4V210M) pueden ser atribuidas a una alteración del transporte de nitrato, por la íntima relación que guardan estos nutrientes en Arabidopsis (Raddatz et al., 2020). NRT1.4/NPF6.2 no transporta potasio Al menos otras tres proteínas de la familia NPF de Arabidopsis (NRT1.1/NPF6.3, NRT1.5/NPF7.3 y NRT1.8/NPF7.2) inciden en la nutrición de potasio. La influencia de NRT1.4/NPF6.2 en la homeostasis de potasio no está relacionada con su capacidad para transportar este ion. Los experimentos llevados a cabo en las cepas de S. cerevisiae deficientes para el transporte de potasio, expuestos en el Capítulo 3 de Resultados, demuestran la incapacidad del transportador vegetal NRT1.4/NPF6.2 para complementar la ausencia de transportadores de potasio en la membrana plasmática o vacuolar de la levadura (Figura 3.6, Figura 3.7). La expresión de NRT1.4/NPF6.2 en ovocitos de X. laevis incubados a 0 y 2 mM de potasio no mostraron diferencias significativas en la acumulación de 15N, lo que está en consonancia con la incapacidad de la proteína para transportar potasio (Figura 3.10). Por otra parte, los ovocitos incubados en medio ND96 suplementado con 30 mM 15N y 50 mM de potasio mostraron una disminución en la acumulación de 15N. Este hecho apunta a que NRT1.4/NPF6.2 funcionaría como un cotransporte NO3 -/H+, por lo concentraciones crecientes de potasio en el medio podrían interferir con la captación de protones necesaria para el transporte. La influencia de NRT1.4/NPF6.2 en la homeostasis de potasio debe seguir por tanto otra vía. Puede deberse a i) su capacidad de transportar otro sustrato, como hormonas, capaces de alterar la respuesta a la disponibilidad de potasio o ii) NRT1.4/NPF6.2 podría afectar, al igual que NRT1.1/NPF6.3, al transporte de potasio mediante la comunicación directa o indirecta con canales y transportadores de potasio. Estas dos posibilidades de discuten a continuación con más detalle. NRT1.4/NPF6.2 podría transportar hormonas Los miembros de la familia NPF muestran una amplia gana de sustratos, entre los que figura nitrato, nitrito, cloruro, dipéptidos y hormonas (auxina, ácido abscísico, giberelinas, jasmónico, glucosinolatos) (Wang et al., 2018). Algunos de estos transportadores son incluso capaces de aceptar más de un sustrato, por ejemplo nitrato/auxina, nitrato/ABA, nitrato/glucosinolatos o GA/JA (Corratgé-Faillie & Lacombe, 2017). Cómo la familia NPF ha evolucionado para reconocer esta variabilidad de sustratos es materia de especulación actualmente (Jørgensen et al., 2017). Discusión 183 Al menos dos publicaciones han establecido relaciones filogenéticas entre los miembros de la familia NPF de varias especies (Léran et al., 2014; Wen et al., 2020). Sin embargo, la semejanza estructural o pertenencia a la misma subfamilia no es un argumento suficiente para concluir qué aminoácidos son fundamentales para la función de la proteína o para dilucidar qué tipo de sustrato transporta (Léran et al., 2014), por lo que las predicciones basadas en la secuencia de aminoácidos deben ser tomadas con cautela. Los transportadores NPF de plantas surgieron a partir de procesos de amplificación y neofuncionalización de genes (Von Wittgenstein et al., 2014). La ganancia de función del transporte de nitrato aparentemente se produjo de forma independiente en diferentes subfamilias NPF. Por esa razón, los transportadores NPF que transportan nitrato aparecen en la mayoría de subfamilias y a menudo están filogenéticamente más relacionadas con NPF que transportan otros sustratos. Por ejemplo, el análisis de la estructura cristalina de NRT1.1/NPF6.3 indica que el residuo His356 es imprescindible para la unión y transporte de nitrato (Parker & Newstead, 2014; Sun et al., 2014). Sin embargo, otros miembros de la familia NPF que transportan nitrato muestran una variabilidad sustancial en los residuos presentes en posiciones equivalentes a esta, conservándose solamente en NRT1.1/NPF6.3, NPF8.4 y NPF5.11. Por otra parte, el motivo ExxERF en el dominio transmembrana TM1 de NRT1.1/NPF6.3 es importante para la unión y el simporte de nitrato y protones. Este motivo se encuentra en todos los miembros de la familia NRT1, pero no en NRT1.5/NPF7.3 ni NRT1.8/NPF7.2, lo que sugiere que su actividad de transporte necesita de un mecanismo energizante alternativo al acoplamiento con protones (Sun et al., 2014). Estas particularidades reflejan la dificultad de inferir la función de los NPF basándose exclusivamente en su secuencia proteica. Ya ha sido demostrado mediante electrofisiología que NRT1.4/NPF6.2 no es capaz de transportar dipéptidos (Chiu et al., 2004). Así mismo, los ensayos de doble híbrido modificados para detectar transporte de hormonas llevados a cabo por Chiba y colaboradores (2015) con 45 de las 53 proteínas NPF de Arabidopsis muestran la incapacidad de NRT1.4/NPF6.2 para el transporte de ABA, GAs y JA-Ile en sus condiciones experimentales. Sin embargo, el transporte de auxina aún no se ha analizado para esta proteína. Algunos NPF han mostrado ser capaces de llevar a cabo este transporte, como el transceptor NRT1.1/NPF6.3 (Krouk et al., 2010); o bien de su precursor IBA (ácido indol-3- butírico) como es el caso de NRT1.5/NPF7.3 (Watanabe et al., 2020). Como hemos mencionado en la Introducción de esta tesis, ambas proteínas influyen en el transporte de potasio en Arabidopsis, por lo que esta hipótesis podría ser digna de desarrollo. En la publicación firmada por Chiu y colaboradores (2004) aparte de encontrar una acumulación de nitrato en la lámina en detrimento del peciolo se observan hojas significativamente más anchas que las de la línea control. En este caso, la explicación que se propone es que las hojas crecen en este sentido debido a la acumulación de nitrato en la lámina. Sin embargo, este fenotipo podría estar influido por más factores. La forma de Discusión 184 las hojas está finamente regulada por el establecimiento de tres ejes asimétricos: el eje próximo-distal, el eje adaxial-abaxial y el eje medio-lateral. La conformación de estos ejes se dirige por la expresión de diversos genes que forman gradientes de concentración, así como por la concentración desigual de auxina a lo largo del eje adaxial-abaxial que implica a los factores de respuesta a auxina ARF2/3/4 (Guan et al., 2017; Horiguchi et al., 2006; Qi et al., 2014). NRT1.4/NPF6.2 se expresa en la nervadura central de las hojas, por lo que podría tener implicación en el establecimiento de ejes foliares. En el hipotético caso de que NRT1.4/NPF6.2 transportase auxina, una distribución desigual de esta hormona en el mutante nrt1.4-2 podría justificar las diferencias en el ancho foliar reportadas por Chiu (2004). Por otra parte, ARF2 regula negativamente la transcripción de HAK5 en condiciones de potasio suficiente al unirse directamente al motivo AuxREs presente en el promotor de HAK5. Esta represión es dependiente de la concentración de potasio, pero independiente de la presencia de auxina (Zhao et al., 2016). Sin embargo, otros estudios prueban la influencia de auxina en la acción reguladora que ARF2 lleva a cabo en la parte aérea (Lim et al., 2010). De nuevo, si NRT1.4/NPF6.2 transportara auxina esto podría afectar a la actividad de ARF2 de forma sinérgica a como lo hace la falta de potasio, lo que podría conducir a una regulación anómala de la expresión de HAK5, como hemos comprobado para el mutante nrt1.4-2 (Figura 4.2). NRT1.4/NPF6.2 podría comunicarse con canales y transportadores de potasio Como se ha mencionado en la Introducción, NRT1.1/NPF6.3 además de actuar como sensor de nitrato es necesario para el crecimiento de la planta en condiciones limitantes de potasio (Fang et al., 2020). Los mutantes knock-out para NRT1.1/NPF6.3 muestran problemas en el transporte de potasio de la raíz a la parte aérea y los mutantes dobles analizados (nrt1.1-1/akt1, nrt1.1-1/hak5-3, nrt1.1-1/kup7 y nrt1.1-1/skor2) revelan interacciones fisiológicas entre NRT1.1/NPF6.3 y varias proteínas transportadoras de potasio de las raíces. Los análisis indican que estas interacciones son dependientes del consumo de protones asociado al simporte H+/NO3 - mediado por NRT1.1/NPF6.3, que afectan a la operatividad de los canales y transportadores de potasio AKT1, HAK5, KUP7 y SKOR, relevantes para la toma y el transporte a la parte aérea de este ion en condiciones de potasio limitante. Además de esta interacción, tanto la actividad de NRT1.1/NPF6.3 como la de HAK5 y AKT1 está regulada por la quinasa CIPK23 en combinación con CBL1 y CBL9 (Ródenas & Vert, 2021), lo que supone otro nodo de interacción entre ambas vías como hemos apuntado en la Introducción. El mutante simple nrt1.4-2 no ve comprometido el transporte de potasio a la parte aérea en condiciones de suficiencia nutricional, incluso se ve favorecido (Figura 4.4-B). Discusión 185 Habiéndose descartado que la proteína lleve a cabo el transporte de potasio per se, otra posibilidad de implicación en la nutrición de potasio podría deberse a una actividad y/o regulación coordinada de las proteínas transportadoras de potasio y de nitrato, como se acaba de describir para NRT1.1/NPF6.3. En apoyo de esta hipótesis podemos tener en cuenta que NRT1.4/NPF6.2 es el homólogo más cercano a NRT1.1/NPF6.3 en la familia NPF de Arabidopsis, y mantiene aminoácidos equivalentes a dos residuos clave en la regulación de la actividad de NRT1.1/NPF6.3 (Anexo 3: Filogenia y alineamiento NRT1.1-NRT1.4): la prolina P492 y la treonina T101 (Maghiaoui et al., 2021). En NRT1.1/NPF6.3, la mutación P492L desacopla la función de entrada de nitrato del sensing del nutriente, debido a la imposibilidad de la proteína mutante de localizarse en la membrana plasmática (Bouguyon et al., 2015). Por su parte, el estado de fosforilación de la T101 controla el acople o desacople alostérico de los monómeros de NRT1.1/NPF6.3, lo que afecta al transporte de nitrato y a su papel en la PNR (Bouguyon et al., 2015; Ho et al., 2009; Liu & Tsay, 2003). En este sentido, como se observa en la Figura 3.12, CBL1-CIPK23 fosforila NRT1.4/NPF6.2 en el residuo T98, que es equivalente al T101 de NRT1.1/NPF6.3. En el caso de NRT1.1/NPF6.3, la fosforilación de este residuo desencadena el cambio entre los modos de baja y alta afinidad (Liu & Tsay, 2003), aunque dicho fenómeno ha sido puesto en entredicho. Publicaciones recientes muestran que la fosforilación de NRT1.1/NPF6.3 produce una disminución en el transporte de 15N en el rango de baja afinidad. Por otra parte, los ovocitos inyectados con los mutantes NRT1.1T101D y NRT1.1T101A también ven reducida su capacidad de acumulación de 15N (Noguero et al., 2018) lo que indica que la proteína puede poseer otros residuos susceptibles de fosforilación. En cualquier caso, esta disminución en el transporte de nitrato en presencia de CBL1- CIPK23 también se reproduce para el transportador NRT1.4/NPF6.2. Los resultados de la coexpresión del transportador con CBL1-CIPK23 en ovocitos de Xenopus muestran una reducción en la acumulación de 15N cuando los ovocitos se incuban en 30 mM de nitrato, es decir, una disminución del transporte en el rango de baja afinidad (Figura 3.13), presumiblemente debida a la fosforilación en el residuo T98. El hecho de que CIPK23 (quinasa implicada en la estimulación de la toma de potasio y la regulación del transporte de nitrato) interaccione con NRT1.4/NPF6.2 tanto in vitro (Figura 3.12) como in vivo (Figuras 3.13), unido al menor contenido en potasio hallado en las raíces del mutante nrt1.4-2 en condiciones de bajo nitrato (Figura 4.5 – B), apunta a que la reducción del transporte de nitrato de NRT1.4/NPF6.2 en presencia de CIPK23 en ovocitos podría reflejar la necesidad de reajustar los sistemas de toma de potasio y el transporte de nitrato para regular finamente ambos nutrientes con el fin de mantener la electroneutralidad en la célula. Discusión 186 El transportador NRT1.4/NPF6.2 podría actuar como un sensor de nitrato en la parte aérea El residuo T101 también se considera fundamental para el papel de NRT1.1/NPF6.3 como sensor de nitrato. Como hemos apuntado en la Introducción, NRT1.1/NPF6.3 es considerado como el sensor principal de nitrato, que gobierna una amplia gama de respuestas a este nutriente. Entre estas respuestas se encuentran la PNR y los cambios transcripcionales a largo plazo, el crecimiento y desarrollo de la raíz y la parte aérea, la germinación, la floración y la tolerancia a distintos estreses abióticos (Maghiaoui et al., 2021). En este aspecto, el mutante no fosforilable NRT1.1/NPF6.3T101A conserva su capacidad de transportar nitrato, pero es incapaz de llevar a cabo correctamente su función como sensor. Por el contrario, el mutante fosfomimético NRT1.1/NPF6.3T101D posee menor capacidad de transporte pero es capaz de llevar a cabo las respuestas asociadas al nitrato (Bouguyon et al., 2015; Zhang et al., 2019) En lo referente al transportador NRT1.4/NPF6.2, ha quedado reportada su influencia en el transporte de nitrato al peciolo (Chiu et al., 2004); así como su capacidad para ser fosforilado por CIPK23 (Figura 3.11 y Figura 3.12). La fosforilación del residuo T98 podría actuar de forma semejante a la fosforilación de NRT1.1/NPF6.3T101, regulando tanto su capacidad de transporte como su posible acción como sensor. Teniendo en cuenta la magnitud de la respuesta a nitrato en Arabidopsis, es esperable que exista más de un sensor de este nutriente. De esta forma, mientras que NRT1.1/NPF6.3 actúa regulando principalmente la entrada de nitrato en las raíces y la vasculatura, NRT1.4/NPF6.2 podría ser un buen candidato para controlar la entrada de nitrato en el peciolo y las hojas. El residuo NRT1.4/NPF6.2V210 es clave para la cinética del transporte de nitrato de la proteína La mutación NRT1.4/NPF6.2V210M produce modificaciones catalíticas en la actividad del transportador. Los datos obtenidos con los ensayos de acumulación de 15N en ovocitos, recogidos en el Capítulo 3 de Resultados, conducen a la conclusión de que la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M confiere un incremento en el transporte de nitrato con respecto al control en cualquiera de las condiciones ensayadas, es decir, independientemente de la concentración extracelular de nitrato (Figura 3.8 – B), potasio (Figura 3.10) o la acidez del medio (Figura 3.9). El aumento en el transporte de nitrato no sólo se ha demostrado en ovocitos, sino también en la levadura asimiladora de nitrato H. polymorpha como se recoge en la Figura 3.4 – A. Este aumento de la capacidad de transporte de nitrato (ganancia de función) explicaría por qué la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M se comporta genéticamente como semidominante en el mutante L14, donde se combina con la mutación AKT1W135Z de pérdida de función del canal. Discusión 187 Posible función del residuo V210 El análisis de la secuencia primaria indica que NRT1.4/NPF6.2 posee la estructura clásica de los NPF, con 12 dominios transmembrana unidos por lazos peptídicos cortos y un lazo largo hidrofílico entre los transmembrana TM6 y TM7 (Newstead et al., 2011). El elevado grado de homología en las secuencias de NRT1.4/NPF6.2 y NRT1.1/NPF6.3 (54% de identidad, 72,3% de homología en la secuencia; Anexo 3: Filogenia y alineamiento NRT1.1-NRT1.4) permite inferir su estructura. En base a la modelización de la estructura terciaria de NRT1.4/NPF6.2, el residuo V210 de NRT1.4/NPF6.2 se localiza en un lazo extracelular entre los dominios transmembrana TM5 y TM6. No se localiza en el poro por el que se transporta el nitrato, ya que los residuos implicados en la unión de nitrato se sitúan en los TM4 y TM10 (Wen & Kaiser, 2018). Como se observa en la Figura D.1, la mutación NRT1.4/NRT1.4V210M resultaría en la aparición de una metionina próxima al triptófano W314 y a la tirosina Y205 con las que podría interaccionar mediante puentes Met-Aro (Metionina-residuos Aromáticos) (Weber & Warren, 2019). Además, debido a la proximidad del residuo M206 éste también podría participar en dichas interacciones. Los puentes Met-Aro son interacciones hidrofóbicas poco estudiadas hasta el momento, para las que se conocen diversas funciones entre las que destaca la estabilización de los giros β en las estructuras proteicas (Tatko & Waters, 2004), además de estar a veces implicadas en el reconocimiento de proteínas cuando se localizan en una superficie expuesta de la proteína (de Las Rivas & Fontanillo, 2010; Weber & Warren, 2019) o en la protección de la metionina frente a oxidación (Aledo et al., 2015). Figura D.1: Topología del giro beta presente entre los dominios transmembrana TM5 y TM6 en el transportador NRT1.4/NPF6.2 (Izquierda) y NRT1.4/NPF6.2 (V210M) (Derecha). Se señalan los aminoácidos Y205, M206 y W314. El intercambio de una valina por una metionina en la posición 210 en el mutante NRT1.4/NPF6.2 (V210M) podría favorecer la formación de interacciones Met-- Aro en la estructura. Discusión 188 Por otro lado, dadas las semejanzas en la secuencia entre NRT1.1/NPF63 y NRT1.4/NPF6.2, es muy probable que NRT1.4/NPF6.2 pueda formar un homodímero. La modelización del posible dímero de NRT1.4/NPF6.2 basada en la estructura de NRT1.1/NPF6.3 sitúa al residuo NRT1.4/NPF6.2V210 espacialmente cerca de los aminoácidos equivalentes a los que contribuyen a las superficies de interacción entre los protómeros que forman el homodímero de NPF6.3/NRT1.1, los resíduos V229, S233 y T111 (Rashid et al., 2018; Sun & Zheng, 2015). Por tanto, la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M podría dar lugar a nuevas interacciones entre aminoácidos, que podrían ser capaces de estabilizar el giro β entre los dominios transmembrana TM5 y TM6. Esto podría producir un cambio en la topología del transportador, favoreciendo la disposición espacial del TM6, en una inclinación tal que contribuyera a una mayor estabilidad del dímero y por tanto favorecer el transporte de baja afinidad. Por lo anteriormente mencionado, la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M podría alterar la forma en la que interactuarían los protómeros del dímero provocando un cambio alostérico en su actividad que podría justificar los resultados obtenidos (Figura D.4). De ser así, el equilibrio entre monómero y dímero podría verse desplazado en favor de la conformación de baja afinidad, lo que podría impulsar una mayor tasa de transporte en este rango de concentración de nitrato. Figura D.2: Topología del posible dímero formado por NRT1.4/NPF6.2. A la derecha se muestra una vista aumentada de la zona de interacción entre ambos monómeros (TM6 del monómero 1 con TM3 del monómero 2), con la representación en esferas de la valina 210. Discusión 189 Consecuencia de la mutación en la línea de Arabidopsis L14 Como se ha apuntado al inicio de esta Discusión, el trabajo con la línea L14 de Arabidopsis thaliana arroja resultados cuya interpretación es compleja. Se trata de un mutante doble, que acusa una pérdida de función en el canal de potasio AKT1 debido a la mutación W135Z y una ganancia de función en el transportador NRT1.4/NPF6.2 por la mutación V210M. Mientras que la pérdida de función puede ser compensada por otras proteínas con función redundante, la ganancia de función produce funciones nuevas y puede ser genéticamente dominante. De visu, la combinación de ambas mutaciones produce una línea con un crecimiento pobre en condiciones de suficiencia de potasio, con rosetas y raíces de menor tamaño al de las líneas WT y los mutantes simples akt1-2 y nrt1.4-2 (Figura 4.3, Figura 1.8 – A, B), lo cual concuerda con una alteración en la nutrición mineral que compromete su desarrollo. La alteración de la señal de hambre de potasio se evidencia tanto por la expresión del gen HAK5:LUC en suficiencia de potasio (medio LAK con 1-4 mM de K) en todas las generaciones analizadas de la línea L14 (Figura 1.12), como por los niveles de expresión de HAK5 endógeno superiores al control y a akt1-2 (Figura 1.10). Esta expresión del transportador de alta afinidad HAK5 se relaciona con un aumento de la toma de rubidio en las raíces en condiciones de suficiencia de potasio (Figura 1.8 – E), por lo que no sólo aumenta la transcripción del transportador sino también su actividad. La arquitectura genética del doble mutante L14 también dificulta la interpretación de los resultados referentes al perfil hormonal de esta planta. Por una parte, el aumento en la expresión de HAK5 en la línea L14 no se relaciona con un incremento en la concentración de etileno en plántulas (Figura 1.11). Esta característica es divergente con respecto al fenotipo de la línea mutante simple akt1-2, pero se desconoce si es atribuible a la ganancia de función del transportador NRT1.4/NPF6.2. En las raíces, elevadas concentraciones de nitrato en el suelo se relacionan con un aumento de la concentración de etileno (Tian et al., 2009), que afecta a la arquitectura de las raíces, así como de la expresión de NRT1.1/NPF6.3 y NRT2.1 (Vega et al., 2019). Por lo tanto, parece evidente que el etileno forma parte de la señalización de nitrato, aunque se desconoce en qué sentido podría estar variando en presencia de la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M. Por otra parte, tanto el ABA como el JA y el SA presentan niveles superiores en la línea L14 con respecto a los del WT (Tabla 1.3). Este resultado sí es concordante con una señalización canónica de hambre de potasio, pero al desconocer los niveles en el mutante simple akt1-2 no es posible concretar si existen diferencias entre este mutante knock-out y L14, y si éstas serían atribuibles a la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M. Este mismo criterio es aplicable a la diferencia en los niveles de IAA, que son superiores en la línea L14 (5,40 ± 1,3 ng g-1) con respecto a la línea silvestre (3,1 ± 0,1 ng g-1). La relación existente entre nutrición y niveles hormonales es fundamental en los organismos sésiles, como atestiguan diversas publicaciones (Hodge, 2004; Kellermeier et al., 2014; Krouk, 2016; Zhang et al., 2020). Sin Discusión 190 embargo, la implicación de los sistemas de transporte de estos nutrientes en la síntesis hormonal en algunos casos no está bien caracterizada En cuanto a los niveles de nitrato y potasio en la planta, L14 posee una alteración en la partición de ambos nutrientes en condiciones de suficiencia, manifestada en una fuga de nitrato y potasio a la parte aérea (Figura 4.4 – C). La presencia de NRT1.4/NPF6.2V210M hiperactiva en la estela de la raíz favorecería la entrada de nitrato en el xilema para su traslocación a la parte aérea, que motivaría la entrada de potasio para compensar las cargas. En condiciones de suficiencia de potasio y bajo nitrato (1 mM K+; 0,5 mM NO3 -), L14 mantiene una mayor proporción de nitrato en la parte aérea (Figura 4.5 – C), probablemente por la mayor actividad de NRT1.4/NPF6.2V210M, aumentando así la llegada de este nutriente a los tejidos más demandantes del mismo. En cuanto al potasio, los niveles disminuyen en las raíces, aunque de una forma poco significativa (p = 0,07 en Test de Tukey; Figura 4.5 – B), lo que favorece una alteración de la distribución del nutriente en la planta (Figura 4.5 – C) y fomenta la expresión del gen endógeno HAK5 y del reportero HAK5:LUC. En conjunto, los resultados obtenidos en el estudio del comportamiento de la línea L14 en los aspectos mencionados indican la implicación de la proteína NRT1.4/NPF6.2 en la homeostasis de potasio, manifestada en el fenotipo diferencial hallado en esta línea L14 con respecto al mutante simple akt1-2. Aplicación en la agricultura de la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M El efecto de la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M en la actividad del transportador de nitrato abre la posibilidad de aplicar este hallazgo a la agricultura. El transportador NRT1.1/NPF6.3, con el que NRT1.4/NPF6.2 guarda gran similitud en cuanto a su secuencia, es uno de los principales sistemas de toma de nitrato en las raíces (Tsay et al., 2007; Wang et al., 2012). Este transportador ha sido postulado como una herramienta para mejorar el uso eficiente de nitrógeno o NUE (Nitrogen-Use Efficiency) en los cultivos, y el diseño de plantas transgénicas o genéticamente editadas basado en los conocimientos moleculares sobre el funcionamiento y regulación de NRT1.1/NPF6.3 en el transporte de nitrato podría contribuir a ello. En este contexto, la mimetización de la mutación NRT1.4/NPF6.2V210M en NRT1.1/NPF6.3 podría suponer un incremento de su tasa de transporte, que podría conducir a un mejor aprovechamiento del nitrato presente en el suelo. Esta optimización de los recursos podría conducir a una reducción de la fertilización de los suelos, y en última instancia a una disminución de la eutrofización de las aguas que provoca el exceso de nutrientes, lo que tendría un efecto beneficioso en la agricultura en un sentido tanto ecológico como económico. Conclusiones Conclusiones 193 Las conclusiones de esta Tesis Doctoral se enumeran a continuación: 1. Una mutagénesis química con EMS sobre semillas de Arabidopsis ha conducido al aislamiento de la línea L14, que posee una expresión semiconstitutiva del gen reportero HAK5:LUC y una alteración en la nutrición de potasio. El análisis genético de la línea L14 ha dado lugar a la identificación de una serie de mutaciones circunscritas a un fragmento de 852 kb dentro del cromosoma 2. 2. La mutación del triptófano 135 a codón de parada en AKT1 presente en la línea L14 implica un importante truncamiento de la proteína y la pérdida de función del canal de potasio. Así mismo, se ha demostrado que el péptido truncado de AKT1 no es capaz de afectar la función de la proteína AKT1 silvestre ni, posiblemente, la de otros canales tipo Shaker presentes en la línea L14. 3. Las mutaciones puntuales halladas en la línea L14 en los genes VPS2.1 (AT2G06530), PMT1 (AT2G16120), GGPPS4 (AT2G23800), FUC1 (AT2G28100), GLR2.7 (AT2G9120), PARP1 (AT2G31320), CDF4 (AT2G34140) y ERH1 (AT2G37940) no afectan a la función de sus proteínas codificantes, lo que descarta su implicación en el fenotipo de L14. 4. El fenotipo más severo de la línea mutante L14 en comparación con un mutante de pérdida de función akt1-2 ha podido ser atribuido a la presencia de una segunda mutación en la proteína transportadora de nitrato NRT1.4/NPF6.2 como partícipe del fenotipo alterado al hambre de potasio. 5. El transportador NRT1.4/NPF6.2 se localiza en la membrana plasmática, transporta nitrato y no transporta potasio per se cuando se expresa en sistemas heterólogos. No obstante, un mutante de pérdida de función de NRT1.4/NPF6.2 manifiesta deficiencias en la nutrición de potasio, especialmente en raíces con baja disponibilidad de nitrato. 6. La quinasa CIPK23 fosforila in vitro el residuo treonina 98 de NRT1.4/NPF6.2, equivalente al residuo treonina 101 de NRT1.1/NPF6.3 que también es fosforilado por CIPK23. La interacción del complejo proteín quinasa CBL1-CIPK23 con NRT1.4/NPF6.2 in vivo produce una disminución de la tasa de transporte de nitrato en el rango de baja afinidad en ovocitos de Xenopus laevis. Conclusiones 194 7. La mutación valina 210 a metionina en NRT1.4/NPF6.2 presente en la línea L14 implica una ganancia de función. En ovocitos, la expresión del transportador NRT1.4/NPF6.2 con dicha mutación produce una mayor tasa de transporte de nitrato en el rango de baja afinidad independientemente del pH y de la concentración de potasio presente en el medio de incubación. Así mismo, la proteína mutante es capaz de conferir mayor capacidad de crecimiento que la proteína silvestre cuando ambas se expresan en el mutante ynt1 de la levadura Hansenula polymorpha afectado en la toma de nitrato del medio. 8. El fenotipo exacerbado de L14 con respecto al mutante simple akt1-2 se debe por tanto a la combinación de dos mutaciones: la pérdida de función del canal de potasio AKT1 debida a la mutación W135Z y la ganancia de función del transportador NRT1.4/NPF6.2 producida por la mutación V210M. In planta, esta combinación de mutaciones produce la alteración aditiva de la distribución de potasio, lo cual afectaría a la nutrición de potasio y a la expresión del transportador de potasio de alta afinidad HAK5. Anexos Anexos 197 Anexo 1: Cebadores GENOTIPADO LÍNEA L14 NOMBRE SECUENCIA DE 5’ A 3’ OBJETIVO HAK5 fwd TTCGCATTTCAGCGGTTTGG Amplificación del gen HAK5 HAK5 rev AAAGGCAAGGGTAACAGCGA AKT1 fwd TGGGAGGCTTTCCTAGTGGT Amplificación del gen AKT1 AKT1 rev TGCAAAAATGCTCTGGTTGGT FUC1 fwd TGGAGCTAAAGGAGACGGAG Amplificación del gen FUC1 FUC1 rev AGGCTCAGTGTCACCATCT GGSP fwd TTTGGGCGGTGAGAGAATTG Amplificación del gen GGPPS4 GGSP rev AATTATGGCGCCAAGAACCG CDF4 fwd GTGTCGTGGTTGGTATGCTTG Amplificación del gen CDF4 CDF4 rev ACGATTGACCGTCGGAGTAAC VPS2.1 fwd CTCGATTTTTCAACTCCGATCAAAG Amplificación del gen VPS2.1 VPS2.1 rev CACAGATCCGACAAGAGACG PMT1 fwd TCCGAATAAAAAGAGCGCTGG Amplificación del gen PMT1 PMT1 rev CGATGAAGAGAGTCTTGACAAC PARP1 fwd GGTATGGGTTAGGTTAGATGTGG Amplificación del gen PARP1 PARP1 rev CTCCTTGAGGAGTCAGTTGC Anexos 198 ERH1 fwd GTGAGGTAAATCAACTGAGATACG Amplificación del gen ERH1 ERH1 rev CATAAACAAACAAAGAAATGCC qGLU Fwd CACCACGAGACTTGCGATTC Amplificación del gen GLR2.7 qGLU Rev GGTCCAAGGCTGCAGATGAG NRT1.4 fwd P2 AATTGGCACATGCAGGTTCTT Amplificación del gen NRT1.4/NPF6.2 NRT1.4 rev P1 GCACAACGGGACTTCCTTGG GENOTIPADO LÍNEA akt1-2 NOMBRE SECUENCIA DE 5’ A 3’ OBJETIVO LBb1 GCGTGGACCGCTTGCTGCAAC Extremo izquierdo ADN-T LP akt1-2 AATGGTTGGTGATCAACTTTTG Identificación de la inserción de ADN-T en el gen AKT1 RP akt1-2 GGCTTTCTCAAGAACCCAAAC GENOTIPADO LÍNEA nrt1.4-2 (WiscDsLox322H05) NOMBRE SECUENCIA DE 5’ A 3’ OBJETIVO P745 AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC Extremo izquierdo ADN-T NRT1.4 Fwd GATGAACCTATCTCAAAGATTTCACGTTT Identificación de la inserción de ADN-T en el gen NRT1.4/NPF6.2 NRT1.4 Rev AGAAGAGTCCAGTGCTCATAGTTTTCATT RT- qPCR NOMBRE SECUENCIA DE 5’ A 3’ OBJETIVO qUBQ Fwd GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG Amplificación del transcrito UBQ10 qUBQ Rev AAAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT Anexos 199 qGLU Fwd CACCACGAGACTTGCGATTC Amplificación del transcrito GLR2.7 qGLU Rev GGTCCAAGGCTGCAGATGAG qGLU Rev2 AGACAGAGAAGGAACGAACCTG qHAK5 Fwd TCGGCTAAGTACGAGGGACA Amplificación del transcrito HAK5 qHAK5 Rev AAAGGCAAGGGTAACAGCGA qPR1 fwd GGCCTTACGGGGAAAACTTA Amplificación del transcrito PR1 qPR1 rev CTCGCTAACCCACATGTTCA CEBADORES PARA CONSTRUCCIONES QUE CONTIENEN AKT1 NOMBRE SECUENCIA DE 5’ A 3’ OBJETIVO XmaI AKT1 fwd TTTCCCGGGATGAGAGGAGGGGCTTTGTTA Amplificación de AKT1W135Z utilizando como molde ADNc de una planta Col-0. Inserción en p414-GPD y pNB1u EcoRI AKT1 rev GGGGAATTCCTAAGAACGCAAGTACTTAAATGCAAT CTG CEBADORES PARA CONSTRUCCIONES QUE CONTIENEN NRT1.4/NPF6.2 NOMBRE SECUENCIA DE 5’ A 3’ OBJETIVO NRT1.4-E ATGGAGAGCAAAGGGAGTTGGA Amplificación de NRT1.4/NPF6.2 (WT y V210M) utilizando como molde ADNc de una planta Col-0. Inserción en pSpark™ NRT1.4-F TCAGCAGTCTTCAACTGAAAATC Anexos 200 attB1-NRT1.4- tobacco GTACAAAAAAGCAGGCTtcATGGAGAGCAAAGGG AGTTG Amplificación de NRT1.4/NPF6.2 sin codón de parada utilizando como molde ADNc de una planta Col- 0. Inserción en pDONRTM201 (Invitro Life Technologies) attB2-NRT1.4- tobacco ACAAGAAAGCTGGGTcGCAGTCTTCAACTGAAAAT CCC attB1- adapter GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT attB2- adapter GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT NRT1.4-E ATGGAGAGCAAAGGGAGTTGGA Amplificación de NRT1.4/NPF6.2 utilizando como molde el plásmido pSpark- NRT1.4. Inserción en el vector pYPGE15-GFP NRT1.4-XhoI GTGGATCCCTCGAGAGCAGTCTTCAAC SalI NRT1.4 ATCAGGGTCGACATGGAGAGCAAAGGGAGTTGG Amplificación de NRT1.4/NPF6.2 utilizando como molde el plásmido pSpark- NRT1.4. Inserción en el vector pYNR_EX SpeI NRT1.4 GCCGCACTAGTGGATCCTGATTCAGC NRT1.4-E ATGGAGAGCAAAGGGAGTTGGA Comprobación inserción NRT1.4 en H. polymorpha NRT1.4-P1 GCACAACGGGACTTCCTTGG Anexos 201 FOSFORILACIÓN IN VITRO NRT1.4/NPF6.2 NOMBRE SECUENCIA DE 5’ A 3’ OBJETIVO BamHI Phe92- Phe102 CGCGGATCCTTCCTGGGTCGTTTCAAAACCATCGGTA TCTTCTGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCG Amplificación de NRT1.4F92-F102 con la mutación T98A utilizando como molde el vector pGEX4T1. Phe92-Phe102 PstI GTTGCCATTGCTGCAGGCATCG T98A Fwd CGCGGATCCTTCCTGGGTCGTTTCAAAGCAATCGGT ATCTTCT GACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCG Amplificación de NRT1.4F92-F102 utilizando como molde el vector pGEX4T1. Phe92-Phe102 PstI GTTGCCATTGCTGCAGGCATCG Anexos 203 Anexo 2: Vectores VECTOR ORGANISMO REFERENCIA / CARACTERÍSTICAS p414GPD AKT11-134 Bacteria S. cerevisiae p414GPD se describe en Mumberg et al. (1995). AKT11-134 se introduce entre XmaI- EcoRI. Promotor GPD3. AmpicilinaR/TRP1. pRS415 AKT1 Bacteria S. cerevisiae Digestión de pFL61-AKT1 (Sentenac et al., 1992) con XbaI-BglII para extraer el cassette de expresión. Inserción en pRS415 tras digestión del plásmido con XbaI-BamHI. Promotor PGK1. AmpicilinaR/LEU2. pNB1u AKT11-134 Bacteria Ovocitos Xenopus pNB1u se describe en Nour-Eldin et al. (2006). AKT11-134 se ha introducido entre los sitios EcoRI-XbaI. Promotor T7. AmpicilinaR pNB1u AKT1 Bacteria Ovocitos Xenopus (Sánchez-Barrena et al., 2020) Promotor T7. AmpicilinaR p414GPD CIPK23/CBL1 Bacteria S. cerevisiae (Ragel et al., 2015) Promotores GPD3 y PGK1 . AmpicilinaR/TRP1. pGEMKN CIPK23 Bacteria Ovocitos Xenopus (Geiger et al., 2009 b) Promotor T7 y SP6. AmpicilinaR pGEMKN CBL1 Bacteria Ovocitos Xenopus (Held et al., 2011) Promotor T7 y SP6. AmpicilinaR pGPTVII- CBL1-OFP Bacteria N. benthamiana (Batistič et al., 2010) Promotor CaMV35S. KanamicinaR p416GPD NRT1.5 Bacteria S. cerevisiae (Li et al., 2017). Promotor GPD3. AmpicilinaR/URA3 Anexos 204 VECTOR ORGANISMO REFERENCIA / CARACTERÍSTICAS pYPGE15 NRT1.4 (WT o V210M)- GFP Bacteria S. cerevisiae pYPGE15 se describe en Brunelli & Pall (1993). GFP (A206K) se ha introducido en el plásmido entre los sitios XhoI-KpnI. Posteriormente, NRT1.4 se introduce entre los sitios SmaI-XhoI. Promotor PGK1. Ampicilina/URA3 pNB1u NRT1.4 (WT o V210M) Bacteria Ovocitos Xenopus pNB1u se describe en Nour-Eldin et al. (2006). pSpark-NRT1.4 (WT o V210M) se digiere con StuI-BamHI, para extraer el ADNc. Inserción en pNBu1 entre los sitios SmaI-BglII. Promotor T7. AmpicilinaR pYNR_EX NRT1.4 (WT o V210M) Bacteria H. polymorpha pYNR_EX se describe en Martin et al. (2008). Inserción NRT1.4 (WT o V210M) en el vector pYNR_EX entre SalI/SpeI. Promotor YNR1. AmpicilinaR. LEU2. pGWB605 NRT1.4 Bacteria N. benthamiana pGWB605 se describe en Nakamura et al. (2010). Inserción de NRT1.4 mediante reacción LR entre pDONRTM201-NRT1.4 y pGWB605. Promotor CaMV35S. EspectinomicinaR, EstreptomicinaR pGEX4T1 NRT1.4 Bacteria El fragmento NRT1.4F92-F102 se introduce entre los sitios BamHI/PstI de pGEX4T1 (Amersham). Promotor tac. AmpicilinaR. pGEX4T1 NRT1.4 (T98A) Bacteria El fragmento NRT1.4F92-F102 con la mutación T98A se introduce entre los sitios BamHI/PstI de pGEX4T1 (Amersham). Promotor tac. AmpicilinaR. Anexos 205 Anexo 3: Filogenia y alineamiento NRT1.1-NRT1.4 Figura A.1: Relaciones evolutivas de los 53 miembros de familia de proteínas NRT1/NPF de A. thaliana. Las relaciones se infirieron utilizando el método Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987). Se muestra el árbol óptimo. El porcentaje de réplicas de árboles en los que los taxones asociados se agruparon de la misma manera (bootstrap test, 500 réplicas) se muestra junto a los nodos de las ramas. El árbol está diseñado a escala (escala en la parte inferior de la figura). Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método basado en la matriz de Dayhoff (Dayhoff et al., 1972). Todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias se han eliminado. Hubo un total de 720 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X. La posición de NRT1.1/NPF6.3 y NRT1.4/NPF6.2 está señalada con una flecha roja. Anexos 206 Figura A.2: Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de NRT1.1/NPF6.3 y NRT1.4/NPF6.2. Se ha utilizado el método Clustal Omega (MegAlign). Los residuos de función conocida en NRT1.1/NPF6.3 mencionados a lo largo de esta Tesis se han enmarcado en un cuadrado rojo. (CONTINÚA EN LA SIGUIENTE PÁGINA) Anexos 207 Anexos 209 Anexo 4: Abreviaturas ABA Ácido abscísico ACAs Autoinhibited Ca2+-ATPases ACC Ácido 1–aminociclopropano–1–carboxílico ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc ADN complementario ADN-T ADN Transferente ADP Adenosín difosfato ANOVA Análisis de la varianza AP Medio Arginina-Fosfato APS Persulfato de amonio ARF Auxin Response Factor ARN Ácido ribonucleico ARNm ARN mensajero ATP Adenosín trifosfato Ca2+ Calcio CaM Calmodulina cAMP Monofosfato de adenosina cíclico CAX CAlcium eXchangers CBL Calcineurin B-Like CDPK Calcium Dependent Protein Kinases CEP C-terminally Encoded Peptide CHX Cation H+ eXchanger CIPK CBL-Interacting Protein Kinase CLC Cloride channel family CNBHD Dominio homólogo al de unión de nucleótidos cíclicos CNCG Canales activados por nucleótidos cíclicos Col-0 Arabidopsis thaliana cv Columbia silvestre COK Constitutive K+-response Anexos 210 CPA Cation-Proton Antiporter CPK Calcium-dependent Protein Kinases CT Threshold Cycle CTR Constitutive Triple Response DMSO Dimetil sulfóxido DTT Ditiotreitol ECAs ER-type Ca2+-ATPases EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EIN Ethylene Insensitive EMS Metanosulfonato de etilo ERF Ethylene response factor GA Giberelina GFP Proteína verde fluorescente GLR Canales activados por glutamato GS-GOGAT Glutamine-synthetase - glutamate synthase GTP Guanosin trifosfato H+ Protones HCl Ácido clorhídrico HAK5:LUC Gen reportero consistente en el promotor del gen HAK5 fusionado transcripcionalmente al gen LUC, codificante del enzima luciferasa HAK5:LUC Línea de Arabidopsis Col-0 portadora del gen reportero HAK5:LUC HAK/KUP/KT High-Affinity Potassium/K UPtake/K Transporter HATS High-Affinity Transport System HEPES 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid HR Humedad relativa IAA Auxina ICP-OES Inductively Coupled Plasma - Optical Emision Spectrometry IP Yoduro de propidio IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido JA Jasmonato Anexos 211 K+ Potasio KEA K+-Efflux Antiporter KSN K+-Sensing Niche KTN K+ Transport Nucleotide binding domain kb Kilobases LAK Solución nutritiva Long Ashton modificada LATS Low-Affinity Transport System LB Medio Lysogenic Broth Li+ Litio LOK Loss of K+-response M Molar MAPK Mitogen Activated Protein-Kinase MCs MeChanosensitive channels MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid MFS Major Facilitator Superfamily Mg2+ Magnesio Mn2+ Manganeso MS Medio Murashige y Skoog Na+ Sodio NADPH Fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido NCBI National Center for Biotechnology Information NHX Na+/H+ eXchanger NO3 - Nitrato NRT1/NPF Nitrate transporter 1/ Peptide transporter Family NSCC Canales de cationes no selectivos OFP Proteína naranja fluorescente OSCAs Reduced hyperOSmolarity-induced CAlcium pb Pares de bases PBS Tampón fosfato sódico PCR Polymerase Chain Reaction Anexos 212 PEG Polietilenglicol PNR Primary Nitrate Response PPI Protein-Phosphatase Interaction Rb+ Rubidio RBOH Resporatory Burst Oxidase Homolog RCI Rare Cold Inducible gene RLU Relative Luminiscence Units ROI Region Of Interest ROS Especies reactivas de oxígeno r.p.m Revoluciones por minuto RSA Root-System Architecture RT-qPCR PCR cuantitativa de transcripción reversa SA Ácido salicílico SD Desviación estandar SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Electroforesis con SDS-Poliacrilamida SINAR Stress-INitiated Allocation to Roots SLAC/SLAH SLow Anion Channel-associated 1) SNARE Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor protein Attachment protein Receptor SNP Single Nucleotide Polymorphisms o polimorfismos nucleotídicos SnRK SNF1-Related protein Kinase TAE Tampón Tris-Ácido acético- EDTA para electroforesis Taq polimerasa Polimerasa de ADN de la bacteria Thermus aquaticus TBE Tampón Tris-Bórico-EDTA para electroforesis TBS Tampón Tris-salino TEMED N’, N’, N’, N’-Tetrametil-1,2-diaminometano TEVC Two Electrodes Voltaje Clamp TM Dominio transmembrana Tm Temperatura media de hibidación del oligonucleótido Anexos 213 TPC1 Two-Pore Channel TPK Twin Pore Channels TRIS Tris-(hidroximetil)-aminometano U Unidad de actividad enzimática UV Ultravioleta YEP Medio Yeast-Peptone YG Medio Yeast-Glucose YGNH Medio Yeast-Glucose-Amonium YNB Medio Yeast-Nitrogen-Base YPD Medio Yeast-Peptone-Dextrose Bibliografía Bibliografía 217 Acharya, B. 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