UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Dpto. de BIOQUIMICA Y BIOLOGíA MOLECULAR ESTUDIO DEL MECANISMO DE ACCION DE LA CITOTOXINA a-SARCINA ~uuhmflhuuhII * 5309541632 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE y ván &~en~ GXb~Q&2»~& TESISDOCTORAL JOSEMIGUEL MANCI-IEÑO GOMEZ ( Madrid, Enerode 1995 INDICE 1 INDICE ABREVIATURAS INTRODUCCION ANTECEDENTES BASICOS ACERCA DE LA a-SARCINA Su descubrimientoy caracterizaciónfuncional Suestructura Su produccióncomoproteínarecombinante Su interaccióncon vesículasmodelo Su citotoxicidad INFORMACION ADICIONAL 3 4 5 7 9 10 TRANSLOCACION DE TOXINAS PROTEICASCON DIA- NAS INTRACELULARES A TRAVES DE MEMBRANAS Mecanismode acciónde la toxina de la difteria Mecanismode acciónde la exotoxinaA de Pseudomo- nas aeruginosa Ricina: modelode proteínainactivante de ribosomas REQUISITOS ESTRUCTURALES PARA LA TRANSLOCA- ClON DE PROTEíNAS A TRAVES DE MEMBRANAS EN SISTEMAS CELULARES 15 Relacionesestructura-funciónen la transiocación teínastóxicas a través de membranas FUSION DE MEMBRANAS de pro- 21 PARTE EXPERIMENTAL Materiales Purificaciónde la cr-sarcina Espectrosde absorciónen la región uy-visible Espectrosde dicroísmocircular Espectrosde fluorescencia Medidasde polarizaciónde fluorescencia Espectrosde absorciónen el infrarrojo Formaciónde vesículasde fosfolípidos Ensayosde unión proteína-vesícula Ensayosde agregaciónde vesículas Ensayosde mezclade lípidos Estudiosde permeabilidadde membrana 23 • . . 24 24 24 25 25 25 • . . 25 • . . 26 26 26 27 • . . 28 .1 2 3 lo 10 12 13 OBJETIVOS 16 18 INDICE II Ensayosde mezclade contenidosacuosos Medidasde dispersiónde luz a 900 mediantetécnicasde flujo detenido Calorimetríadiferencialde barrido Encapsulaciónde tripsina en vesículasde fosfolípidos Digestióntríptica intravesicularde a-sarcina Encapsulaciónde tRNA en vesículasde fosfolípidos Degradaciónde tRNA encapsuladopor cy-sarcina Fotomarcajede cx-sarcina Microscopiaelectrónica Reduccióny carboxiamidometilaciónde a-sarcina Análisis de aminoácidos Digestionesproteolíticas Ensayode actividadribonucleasade la a-sarcina Alineamientoy comparacionesde secuenciasde aminoácidos. Predicciónde estructurassecundarias Determinaciónde los contenidosde estructurasecundariaapar- tir de los espectrosde CD y de FTIR Síntesisy purificacióndel péptido aS(116-139) RESULTADOS Y DISCUSION 29 29 31 32 32 32 33 33 33 34 34 34 34 35 35 36 37 1. Agregaciony mezclade lipidos de vesiculasde dimiristoilfosfatidil- sermapor a-sarcina Unión de a-sarcinaa vesículascompuestaspor DMPS Agregaciónde vesículasde DMPS por a-sarcina Efectode la a-sarcinasobre el comportamientotermotrópicode DMPS Discusión 2. Translocaciónde a-sarcinaa través de la bicapalipídica de vesícu- las de asolectina Fotomarcajehidrofóbico de la a-sarcina Degradaciónde tRNA encapsulado Digestión de a-sarcinapor tripsina intravesicular Discusión 3. Predicciónde Jaconformaciónde la proteínaa-sarcrna:modeJoes- tructural paraexplicar la interacciona-sarcina-membranas Resultados Discusión 4. Estudiocinético de la agregacióny mezclade lípidos de vesículasde PG y PS producidaspor a-sarcina:medidasde dispersiónde luz median- te técnicasde flujo detenidoy medidasde transferenciade energíade fluorescencia • . . 38 38 • . . 39 42 46 53 • . 53 • . 55 57 58 62 • . . 62 70 74 INDICE III Medida de las velocidadesiniciales de agregaciónde vesículas por técnicasde flujo detenido 74 Medidasde las velocidadesde mezclade lípidos por transferen- cia de energíapor resonancia 77 Discusión 83 5. Caracterizaciónespectroscópicade la a-sarcinareduciday carboxia- midometilada.Análisis de los requerimientosestructuralesparala in- reracciónhidrofóbicacon bicapaslipídicas 89 Caracterizaciónespectroscópicade la a-sarcinareduciday car- boxiamidometilada 89 El trifluoroetanol promueveunaconformaciónen la a-SRCes- pectroscópicamentesimilar a la adquiridapor la asarcinanativa . . . 92 La a-SRCinteraccionacon vesículascompuestaspor fosfolípi- dos ácidos 94 Los residuosde triptófano de la a-SRCse transfierena un me- dio de menorpolaridad tras interaccionarcon vesículasde fosfo- lípidos 98 La cx-sarcinanativa y la cr-SRC muestrandiferentesconforma- ciones tras la interacciónconbicapaslipídicas. Estudiosde es- pectroscopiade infrarrojo 100 Discusión 100 6. Desnaturalizacióntérmicade la a-sarcina:desestabilizaciónde la pro- teína inducidapor la unióna membranas 105 Estudiosde la desnaturalizaciónde la a-sarcinamediantecalori- metría diferencialde barrido (DSC) 105 Estudiosde la desnaturalizacióntérmicade la a-sarcínamedian- te espectroscopiade infrarrojo 109 Estudiosde la desnaturalizacióntérmicade la a-sarcinamedian- te espectroscopiade fluorescencia 114 Discusion 115 7. Interaccióncon membranasdel péptidosintéticoaS(116-139) corres- pondientea la región (116-139)de la secuenciade la cv-sarcina 120 Caracterizaciónespectroscópicadel péptidosintéticoaS(116-139) . 120 Interaccióndel péptido aS(116-139) convesículasde fosfolípidos . 122 Cambiosconformacionalesdel péptido aS(1l6-l39) inducidospor la interaccióncon vesículaslipídicas 129 Discusión 129 CONCLUSIONES 134 BIBLIOGRAFíA 136 ABREVIATURAS 1 ANT ANTS BSA CD DMPG DMPS DOPG DPH DPX DTT %ET FT-IR NBD-PE PA PAGE-SDS PC PC-’ PC-II PE VG PI PS Rh-PE SDS TFE TMA-DPH TPCK Uy-VIS aSRC ALT antraceno ácido 1 -aminonaftaleno-3,6,8-trisulfónico albúminade suerobovino dicroísmo circular dimiristoilfosfatidilglicerol dimiristoilfosfatidilserina dioleilfosfatidilglicerol 1 ,6-difenil-1,3,5-bexatrieno bromurode N , N’ -p-xililen-bis piridinio ditiotreitol porcentajede transferenciade energíapor resonancia infrarrojo por transformadade Fourier N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)-dimiristoilfosfatidiletanolamina ácido fosfatídico electroforesisen gelesde poliacrilamidaen presenciade SDS fosfatidilcolina 1 -palmitoil-2-(2-azido-4-nitrobenzoil)-sn-glicero-3-IjI-Ijfosfocolma 1 -miristoil-2-[ 12-(4-azido-2-nitrofenil)amino]dodecanoil-sn-glicero-3- [‘4Cj-fosfocolina fosfatidiletanolamina fosfatidilglicerol fosfatidil inosito] fosfatidilserina N-(7-lisaminarodamina8 sulfonil)-diacilfosfatidiletanolamina dodecilsulfatosódico trifluoroetano] 1 -(4(trimetilamino)fenil)-6-fenil-1,3,5-hexatrieno tosil-fenil-clorometilcetona ultravioleta-visible cx-sarclnareduciday carboxiamidometilada incrementode entalpía INTRODUCCION INTRODUCCION 3 ANTECEDENThS BASICOS ACERCA DE LA a-SAlICINA Su descubrimiento y caracterizaciónfuncional La a-sarcinaes una proteínasecretadapor el hongoAspergillusgiganteusMDH 18894, que fue inicialmente detectadadurante un programade búsquedade agentes antibióticos-antitumoralesllevado a cabopor el Departamentode la Salud de Michigan (Olson y Goerner, 1965; Olson et al., 1965). Esta proteína resultó muy eficaz en la inhibicióndel crecimientode diferentestumoresinducidosen animales(Olsony Goerner, 1965; Olson et al., 1965; Goldin et al., 1966), comoel sarcoma180 y carcinoma755 de acuerdo con la nomenclaturaoriginal. Su nombre hacereferenciaprecisamentea sus propiedadesantisarcoma.A pesarde suactividadantitumoral,el uso terapéuticode la a- sarcinano resultaclínicamentesatisfactoriodebidoa su elevadacitotoxicidad, cuyabase molecularse• relacionóposteriormentecon la inhibición de la síntesisde proteínas(Roga a al., 1971; Fernández-Puentesy Vázquez, 1977; Conde et al., 1978; Hobden y Cundliffe, 1978; Schindlery Davies, 1977; Endo y Wool, 1982). La a-sarcinainactiva ribosomaseucarióticospor la hidrólisis de un único enlace fosfodiesterentre las bases 64325 y A4326 de la moléculade rRNA 28S, localizadoen unaregión muy conservada evolutivamente(Brosinsetal., 1980; Endo yWool, 1982; Endoetal., 1983; Wool. 1984; Wool a al., 1990). Estaactividadribonucleasaha resultadomuy útil en estudiossobrela estructuradei ribosoma(Wool, 1984; Wool e: al., 1990; WooJ et al., 1992). Estudiosacercade los efectosde la a-sarcinasobresistemascelularesparecieron revelar que la proteína sólo muestracitotoxicidadcontra células infectadaspor virus (Fernández-Puentes,1980; Carrasco y Esteban, 1982; Muñoz et al., 1985; Otero y Carrasco,1987). El tratamientoconalgunosionóforos(Alonsoy Carrasco,1981; Alonso y Carrasco,1982; Otero y Carrasco,1987), confosfolipasaC (Oteroy Carrasco,1988) o con ATP extracelular (Oteroy Carrasco, 1986) produceuna permeabilizaciónde las células de mamíferoa la a-sarcina.Por estasrazones,la a-sarcinafue consideradaun inhibidor de la biosíntesisde proteínasen sistemaslibres de célulaso bienen sistemasde célulaspreviamentepermeabilizadas.En estebloquede estudiosla cr-sarcinafue empleada comosondaparacomprobarel estadode permeabilizaciónde las membranas,puestoque no seencontróningún receptorde membranapropio de la proteína. Hoy día la a-sarcinaseconsiderauna proteínainactivantede ribosomas(RIP) de tipo 1 (D’Alessio et al., 1991).Estegrupode proteínasse caracterizapor sucapacidadde inactivar catalíticamentelos ribosomas,con la consiguienteinhibición de la síntesisde proteínas(Stirpe e: al., 1992). Así, tal y comootras RIP, la a-sarcinase ha empleado INTRODUCCION 4 recientementeparala preparaciónde inmunotoxinas,en dondela toxicidad de la proteína seacoplaa la especificidadde un anticuerpofrenteaun determinadoantígeno(Wawrzyn- czak eral.. 1991; Pastaneral., 1992). Las capacidadesdemostradaspor la a-sarcina tienen obviamenteun soporte estructural. En estesentido, la secuenciade aminoácidosde la a-sarcinasedeterminéen 1983 (Saccoa al., 1983), observándoseun alto gradode similitud con la secuenciade la ribonucleasa(RNasa)U2 de Ustilagosphaerogena(Satoy Uchida, 1975). Aunqueambas proteínasmuestranactividad ribonucleolítica, difieren en cuantoa la especificidadde sustrato(la a-sarcinahidroliza un únicoenlacefosfodiesteren el ribosoma,mientrasque la RNasaU2 digiere extensivamenteel RNA) y en cuantoa la capacidadde entraren células(la RNasaU2 no poseetal capacidad). Suestructura La a-sarcinasecomponede unacadenapolipeptídicade 150 aminoácidos(Sacco a al., 1983). Es una proteínade carácterbásico,que contieneentreotros 20 residuosde usina,4 argininas,8 histidinas, 11 residuosde ácidoaspárticoy 6 deácidoglutámico. Por lo tanto, aproximadamenteun 30% de los residuossoncargados,mientrasque otro 40% son residuospolaressin carga.La a-sarcinaha de considerarsepor todo ello como una proteínaaltamentepolar. Estehecho quedareflejado en el perfil de hidropatía,en donde la mayor partede la cadenapolipeptídicaexhibeun carácterexpuesto(Martínezdel Pozo et al., 1988). Es de destacarque no se observansegmentosde la secuenciaque puedan considerarse.potencialmenteimplicados en interaccioneshidrofóbicas con membranas (SaccoetaL, 1983). Solamentetres regionesde la proteína,los segmentoscomprendidos entre los residuos1-6, 95-100 y 120-140, presentanvaloresde hidropatíaque pueden sugerir cierto carácter no expuesto.Dos de estas regiones se encuentranconectadas medianteun puentedisulfuro. De hecho,uno de los dospuentesdisulfuro queposeela ct- sarcina(el que apareceentrelos residuosde cisteina6 y 148) acercaespacialmentea los extremosamino y carboxilo terminales(Saccoet al., 1983). La cz-sarcinacontiene8 residuosde tirosina. Experimentosde titulación llevados a cabo midiendo la absorcióna 295 nm del ion tirosinato, revelan que seis tirosinas presentanun pK de 10.2, mientrasque el restovienencaracterizadaspor un pK de 11.4. Segúnesto, los seisprimerosresiduosdetirosinaposeeríanun mayorgradodeexposición que el resto (Martínezdel Pozoet al., 1988). La proteínaexhibecinco transicionesinducidaspor pH, segúnsederivadeestudios INTRODUCCION 5 de espectroscopiade fluorescenciay dicroísmocircular (CD) (Martínezdel Pozo a al., 1988).Las transicionesqueseproducenapH 2.5 ya 10.2 sontransicionesdesnaturalizan- tes, de acuerdocon las medidasde CD en el ultravioleta lejano. La transicióndetectada a pH 11.4 ha sido relacionadacon la ionizaciónde residuosde tirosina con un bajo grado de exposición.La transiciónobservadaapH 4.5 se haasignadoa la protonaciónde grupos carboxilo adyacentes a los residuos de tirosina, ya que es solamentela emisión de fluorescenciade estefluoróforo la que resultaafectadaen estatransición. La ausenciade cambiosen la señalde dicroísmo, tanto en el ultravioleta lejano comoen el cercano,en esta transición apuntahacia el carácter local de la misma. Finalmente, la transición detectadaa pH 8.0, tanto por espectroscopiade fluorescenciacomo por CD se ha relacionadoconla desprotonacióndel grupoa-aminode la proteína.En estesentido,cabe destacarel hecho de que uno de los dos residuos de triptófano de la proteínaestá localizadoen la posición 4 de la cadenapolipeptídica. La a-sarcinaes una proteínaa//3 con un significativo contenidoen giros ~3,según sededucede los estudiosde espectroscopiade infrarrojo y de dicroísmocircular (Gasset e: al., [99119.El trifluoroetanol, agenteque promuevela formación de enlacespor puentesde hidrógenointracatenarios,aumentael contenidoen a-hélice hastaun 40% (Gassetet al., 1991b). Colato sódico y octilglucósido, ambos detergentesno des- naturalizantes,no producenmodificacionessignificativas en las propiedadesespectros- cópicasde la proteína,resultadoqueestáde acuerdoconla bajaafinidad quemuestranlas proteínashidrosolublespor los detergentes(Tanford, 1980). Detergentesaniónicos, tales comoel dodecilsulfatosódico(SDS),producencambiosespectralesen la región delenlace peptídico,cambiosquesonconsistentesconun aumentodel contenidoen a-hélice(Gasset e:al., 1991b). Cabedecirqueestos mismosefectosse hanobservadosobreotrascadenas polipeptídicas(Jirgensons,1980). Su produccióncomoproteínareconibinante La producción de proteínasrecombinantesfacilita los estudiosrelativos a las relacionesestructura-función,sobretodo cuandosepuedenobtenermutantesdirigidos. En estesentido,ya existensistemasrecombinantesde expresióndel gende la a-sarc¶na.La secuenciade nucleótidosde su cDNA, incluyendola de supéptidoseñal,aparecióen 1990 (Oka cal., 19%),consiguiéndosela produccióndea-sarcinarecombinanteenE. col¿dos añosmástarde(Okaa al., 1992). El cDNA quecodificapara la a-sarcinasin su residuo N-terminal se ha ligado con la secuenciaque codifica parael péptido señal¿‘la de la 13- lactamasadeE. coil, consiguiendoexportarsela proteínaal periplasma.Estaconstrucción, con la que se evita la posible acción tóxica de la proteínasobre los ribosomasdel INTRODUCCION 6 organismoproductor, permite obtenera-sarcína en un rendimientode 0.65 mg/l de cultivo. La proteínarecombinanteobtenidade esta maneraresultó ser totalmenteactiva en cuantoa su capacidadde inactivaciónde los ribosomas(Oka e: al., 1992). El residuo alaninaN-terminal, ausenteen estaforma recombinante,no resultapor lo tantoesencial para la actividad ribonucleolíticade la proteína,aunquepodría ser relevantepara las interaccioneshidrofóbicasen las que participa la proteína.De hecho, tal y como se ha indicadoanteriormente,uno de los tres segmentosmáshidrofóbicosde la &-sarcinaresulta ser el comprendidoentrelos residuos 1-6. La producciónde a-sarcinarecombínantese ha conseguidotambiénmedianteel vector de secreciónpiNlíl OmpA2 (Henzeet al., 1990; Ghrayebet al., 1984). En este caso, el gen de la cx-sarcina sintetizadoquímicamente,se fusionó tras la secuenciaque codifica parael péptido señalde la proteínaOmp A de E. cali. En estesistema,aunque la eliminacióndel péptidoseñaleracorrecta,la proteínarecombinanteno era liberadaal medio extracelular tras un choque osmótico(lo esperablesi la proteínahubierasido exportadaal espacioperiplásmico),por lo que el rendimientode producciónde la toxina resultó muy bajo (Henzee: al., 1990). Recientementese ha desarrolladootro sistemade expresiónen E. cali para la producciónde cx-sarcina(Lacadenaaal., 1994). Este sistemase basaen la utilizaciónde un vector,el pINPG-aS,muy similaral ya descritoanteriormente(Ghrayebet al., 1984). En estecaso, la construccióncodificapara una a-sarcinacon el péptido señal de la Omp A modificado; los residuosVal-18 y Gln-20 del péptido nativose reemplazaronpor Ser y Leu, respectivamente.Este péptido señalmodificadosuponeuna mejoraconsiderable en el procesamientopost-traduccionalde las proteínasa las que se encuentrafusionado cuandose las comparacon el comportamientodel péptido señal nativo (Henze et al., 1990; Lacadenaer al., 1994). La producciónde cy-sarcinarecombinantese llevó a cabo con cultivos de células de E. cali RB791 transformadascon el plásmido anterior, induciéndosesuexpresióncon IPTG 2 mM. Tras unaprimeracentrifugaciónse procede a la separaciónde las célulasdel medio. Estasfueron sometidasa choqueosmótico y de nuevo centrifugadas;el sobrenadanteobtenido tras esta centrifugación se considerala fracciónperiplásmica.La fraccióncitoplésmicaseobtieneresuspendiendoy sonicandoel sedimentode la centrifugaciónanterior. La a-sarcinaapareceen la fracción soluble, periplásmicae intracelular,purificándosetal y comose ha descritoanteiormence.Aunque la mayor partede la proteínano seencuentraen forma soluble (Lacadenae: al., 1994), el rendimientofinal es de 1.5 mg/l de cultivo. Esta proteínarecombinantepurificada resulta indistinguible a la aisladadirectamentedel hongo, tanto desdeel punto de vista estructuralcomo funcional, segúnlos siguientescriterios: composicióny secuenciadel INTRODUCCION 7 extremo amino terminal, movilidad electroforética, comportamiento por HPLC, inmunorreactividady propiedadesespectroscópicasy, finalmente,resulta ser activa en cuantoa su capacidadde inactivaciónde ribosomas. Su interaccióncon vesículasmodelo La cv-sarcinainteraccionaconvesículasmodelo (Gassete: al., 1989, 1990, 199k, 1991b; Oñaderraaal., 1989, 1993).De la interacciónresultaun complejoproteína:lípido que puede ser aislado mediantecentrifugaciónen gradientede sacarosa(Gassete: al., 1989). La proteína muestrauna elevadaafinidad por fosfolípidos ácidos, de hecho la constantede disociaciónes del ordennanomolar.La formaciónde estoscomplejospuede seguirseexperimentalmentemidiendoel aumentode Jaabsorcióna 360 nm queseproduce tras la adición de cx-sarcinaa una suspensiónde vesículaslipídicas. Esteaumentode la absorciónseexplicaentérminosde agregaciónde vesículas.La extensiónde la agregación es dependientede la relaciónproteína/lípido,alcanzándosela saturacióna una relación molar50:1 lípido/proteína.La interacciónrequierefosfolípidosácidosparaquetranscurra. Así, vesículasPG/PCsólo sonagregadascuandoel porcentajede PG (fosfolípido ácido> essuperioral 10%. Por lo tanto, la interaccióntiene un claro componenteelectrostático; de hecho,un aumentode la fuerza iónica del medio determinauna disminución en la extensiónde la agregación. La interacciónde la a-sarcinaconvesículasdeterminaunaproteccióndela proteína frente a Ja hidrólisis tríptica(Gassetetal., 1989; Ofiaderraeta!., 1989).En presenciade vesículassólamenteun 30% de la proteínaresultadigeridaen condicionesen las que la digestiónseria total en ausenciade vesículas.Por lo tanto, la mayor partede la proteína permaneceintacta,de acuerdocon los resultadosde análisiselectroforético,a pesardel alto contenidoen residuosde lisina y arginina. La agregaciónde vesículasinducidapor a-sarcinadisminuyea medidaque el pH del medio aumenta,presentándoseuna transición caracterizadapor un pK de 8.0. Tal como se ha dicho anteriormente,la a-sarcinamuestra una transición conformaciona] centradaalrededorde este pK (Martínez del Pozo a al., 1988). Esta transición se ha relacionadoconla desprotonacióndel grupo a-amino,ya quela transicióndesnaturalizante de la proteína,debidaa la desprotonaciónde los residuosde lisina y tirosina, ocurrea pH máselevados(pK 10.2). Ya queparecepocoprobableque la interacciónproteína-vesícula seamantenidapor un único grupo cargado,otras fuerzasdebenestar implicadasen este proceso.Aun así, no puededescartarsela participaciónde ionizacionesde otro tipo de residuos,comopor ejemplo, residuosde histidina. INTRODUCCION 8 La emisiónde fluorescencia,tantode los residuosde triptófanocomode tirosina, resulta incrementarsepor la interaccióncon vesículas,no produciéndosedesplazamiento del máximo de emisión. Mientras que la emisión de fluorescenciade los residuosde tirosina no resultaespecialmentesensiblea la polaridad de su microentorno,la de los residuosde triptófano silo es. La ausenciade desplazamientosdel máximode emisión de fluorescencia de la y-sarcina tras la interacción con vesículas es indicativo de la conservacióndel microentornode tales fluoróforos, De esta forma, el aumentoen la intensidadde fluorescenciaha sido interpretadocomo unadisminucióndel apagamiento estáticode la proteína,posiblementepor una protecciónfrente a los grupos polarizables responsablesde tal apagamiento.La disminuciónde esteapagamientopodríaser producto de interaccioneshidrofóbicas(Gassetet al., 1991b). Los efectosde la a-sarcinaenel comportamientotermotrópicode las vesículasde fosfolípidos se ha interpretadoen términos de disminución del número de fosfolípidos implicados en la transición desdela fasegel a líquido cristalino (Gasseta aL, 1991a). Estos resultadossehanobtenidomedianteestudiosde calorimetríadiferencialde barrido y de anisotropíade la emisiónde fluorescenciade vesículasdedimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) marcadascon la sonda1,6-difenil-1,3,5- hexatrieno(DPH). Asimismo, estos resultadossugierenla existenciade un componente hidrofóbico en la interacción, lo cual fue corroboradopor experimentosde marcajecon sondashidrofóbicas fotoactivables.Se han empleadodos sondasdiferentes,una de las cualesportael grupo reactivofotoactivablea nivel de la cabezapolarde los fosfolipidos, mientrasque la otra lo porta a nivel del carbonoC12 de la cadenade ácido graso. La a- sarcinaresultamarcadaconambassondas,lo cual muestrala accesibilidadde la proteína atalessondas,estoes, la a-sarcinapenetraal interior hidrofóbicode la bicapa(Gasseta al., 1991a). La a-sarc¡naproducefusiónde vesículaslipídicas(Gassete: al., 1990). La mezcla de lípidos de diferentes vesículas se ha detectadomidiendo la disminución de la tranferenciade energíapor resonanciaque se produceentre dos sondasfluorescentes incorporadasen una población de vesículas,cuandoéstas se incubancon un excesode vesículassin marcaje y con a-sarcma.Esta mezclade lípidos tambiénse ha detectado observandola formaciónde vesículasmixtas de DMPG y DPPG, tras la incubación de vesículasde DMPG y vesículasde DPPGcon a-sarcina(Gassete: al., 1990). Estudios de microscopiaelectrónicapor criofracturatambiénmuestranla capacidadfusogénicade la cv-sarcina.Tras la incubaciónde vesículasunilamelarescon a-sarcinaaparecengrandes estructurasmultilamelares;a una relaciónsaturante50:1 (lípido/proteína)se observala apariciónde estructurasplanas, indicandoque el procesode fusión probablementese ha INTRODUCCION 9 completado (Collier, 1982). Tal modificación covalente va a suponer la inactivación del EF-2. con la consiguienteinhibición en la síntesisde proteínas.Recientemente,se ha propuestoque la toxina producela degradacióndel ADN nuclear (Changa al., 1989; Lessnick e: al., 1990); sin embargo,no sepuededescartarla posibilidadde la presenciade una nucleasa contaminante(Johson, 1990; Wilson e: al., 1990). La proteínaha sido caracterizadaespectroscópicamentea pH neutro (Collins y Collier, 1985; Blewitt et al., 1985; Cabiauxe: al., 1989). Asimismo, seha determinado su estructuratridimensionala 2.5 A de resoluciónmediantedifracción de rayos-X (Choe et al., 1992). Sin embargo, tras la observaciónde que la disminución del pH en los endosomasera el desencadenantede la inserción y translocaciónde la toxina en la membranadel endosoma(Drapery Simon, 1980; Sandvigy Olsnes,1980),se realizaron numerososestudiossobre el efectoque la acideztiene en la estructurade la proteínay en la capacidadde interaccióncon vesículas modelo (London, 1992). Asimismo, otro desencadenantede la realizaciónde estudioscon vesículasmodelo fue el descubrimiento de que la toxina diftérica penetraal interior celular directamentedesdela membrana plasmáticatras unadisminucióndel pH del medio extracelular(Sandvigy Olsnes,1980. 1 98 1). La existenciade cambiosconformacionalesinducidosporpH ácidoha sidopuesta de manifiestopor estudiosde CD y sensibilidada proteasas(Hu y Holmes, 1984), así comopor fluoresencia(Blewitt et aL, 1984, 1985) e infrarrojo (Collins y Collier, 1985; Blewitt e: al., 1985; Cabiaux e: al., 1989). El cambio conformacionales altamente cooperativo, con una transición centrada en torno a pH 5.0 a 230C. Este cambio conformacionalsuponeunaexposición de regioneshidrofóbicas al disolvente, lo cual conducea la agregaciónmasivade la proteínasi en el medio no hay bicapaslipídicas (Collins y Collier, 1987), o bien a la interaccióncon micelasde detergente(Sandvigy Olsnes,1981) o con vesículasde fosfolípidos (Ru y Holmes, 1984; Zalmany Winieski. 1984; Montecuccoe: aL, 1985). El comportamientoconformacionalde la proteínase ha explicadoconsiderandoque la transición estructuralácida es esencialmentede carácter desnaturalizante(Zhao y London, 1986). A consecuenciade la interacciónconvesículas modelo se producela inserciónde la proteínaal interior hidrofóbico de la bicapa, tal y como se deriva de estudiosde fotomarcaje (Hu y Holmes, 1984; Zalman y Winieski, 1984; Montecuccoe: al., 1985). En estos estudiosse demuestraque tanto el fragmento A comoel B son marcadospor diferentessondasfotoactivableslocalizadasen la región de las cabezaspolaresasícomoen el núcleohidrofóbicode la bicapa.En bicapasplanas, la toxina, íntegra o sólo su fragmentoB, forma canalesiónicos de bajaconductancia, requiriéndoseparaello másde unamoléculade toxina por canal, así comola presencia defosfolípidosácidos(Donovanetal.,1981, 1982; Hoch eta!., 1985). Latoxinadiftérica INTRODUCCION 12 tambiénforma canalesjónicos en la membranaplasmáticade células vivas (Sandvigy Olsnes,1988; Papini eral., 1988). Sin embargo,no se ha encontradocorrelaciónalguna entre la formación de este poro y la inhibición de la síntesis proteica, lo cual sería esperable si el poro fuese un prerequisito para la translocaciónde la cadena A al citoplasma. Este fragmentoseencuentraunido al restode la proteínamedianteun puentedisulfuro (Cys 265-Cys287), que ha de ser reducidopara liberar el fragmentoy permitir su translocaciónal interior celular (Ogata e: al., 1990). Ciertasmutacionespuntualesen el sitio de ataqueproteolíticoeliminan la citotoxicidadde la proteína(Jinno e: al., 1989). Del mismo modo, mutacionesen los residuosCys 265 y Cys 287 determinanunapérdidaen la citotoxicidadde la proteína(Edwardse: al., 1989; Madshusy Collier, 1989>. El dominio III tiene dos funciones.Por una parte, en él residela actividadADP- ribosilante(Siegalí etal., 1991; Chaudharye: al., 1990) y, por otra, poseeunasecuencia C-terminal quedirige a la toxinaendocitadahaciael retículo endoplésmico(Ogatae: al,, 1990). Esta secuenciaC-terminal, REDL, se asemejaa la secuenciaKDEL que está implicada en proporcionarla capacidaddepermanenciade las proteínasque la poseenen el retículo endoplásmico(Munro y Pelham,1987). Es de destacarel hechoque otras dos toxinas, la cadenaA de la toxina del cólera y la toxina termolábil de E. cali (Spicer y INTRODUCCION 13 Noble, 1982; Mekalanosel al., 1983), poseenestamismasecuencia.Considerandoestos resultadosse ha propuestoun modelo de acciónde estatoxina (Pastanet al., 1992).Tras la unión a la superficiecelular, la toxina penetraal interior celular medianteun proceso de endocitosismediadapor receptor. En las vesículasendocíticasla proteínasufre un cambioconformacionalinducido por pH ácido y un procesamientoproteolítico(Jiang y London, 1990: ldzioreket al., 1990). El fragmentode 37 kDa quedalibre en el lumendel endosomatras la reduccióndel puentedisulfuro (Cys 265-Cys 287), produciéndosesu transporte al rrans Golgi mediante el tráfico vesicular y, de allí hasta el retículo endoplásmico.Unavez allí y mediantela maquinariade translocaciónde la célulaalcanza el citosol en dondecatalizala ADP-ribosilacióndel factor EF-2. Este modelo, aunquees muy especulativo,resultacoherentecon los resultadosproducidospor todos los estudios bioquímicosy genéticosrealizados. Ricina: modelo de proteína¡nactivantede ribosomas Lasproteínasinactivantesde ribosomas(RIP) son una familia de proteínastóxicas que inactivanespecíficae irreversiblementelos ribosomas(Lord e: al., 1994). Un grupo de RIP, las RIP de tipo 1, son proteínasmonoméricasde alrededor30 kDa de peso molecular y, frecuentemente,glicosiladas(Lord e: al., 1991). Otro tipo de proteínas inactivantes,las RIP de tipo II, estáncompuestaspor dos cadenaspolipeptidicasunidas por un puentedisulfuro. Mientras una de estascadenasposeela capacidadde unión a un receptorde membrana,generalmenteun galactósído,la otra poseela actividadcatalítica. La ricina es, entrelas RIP de tipo II, la proteínamejor caracterizada,estructural y funcionalmente.La proteínanativa ha sido cristalizada,determinándosesu estructura tridimensionala2.5 Á de resolución(Montfort e:al., 1987; Katzin et al., 1991; Rutenber a al., 1991; Rutenbery Robertus, 1991), y a 2.3 A la de la cadenaA recombinante (Mísnae: al., 1993). Asimismo, para determinarel sitio catalíticode la cadenaA se ha cristalizadoun complejoentreéstay un análogode sustrato(Monzingoy Robertus,1992). De este modo, se ha visto que el anillo de purina quedaentredos residuosde tirosina (Tyr-80 y Tyr- 123), mientras que el residuode triptófano 211, aunqueno parecehacer contactosdirectos con la adenina,es importanteparael mantenimientode la conformación del centro activo. La estructurade la cadenaB se puededefinir como formadapor dos dominios homólogos que, probablemente,se han originado por duplicación génica (Rutenbery Robertus, 1991). Cada dominio a su vez, está formado por cuatro sub- dominios.La estructuraglobal de la estacadenaposeería6 sitios de unióna galactosa,de los cualessólo son activos 2. El genestructuralde la ricina ha sidodonadoy secuenciado(Lamb et al., 1985), y formas recombinantes,tanto de la subunidadA (O’Hare el al., 1990; Frankel e: al., 1989>comode la subunidadB (Richardsone:al., 1988a, 1988b; Vitteta y Yen, 1990) han sido expresadasen bacterias,levaduras,células de mamíferoy oocitos de Xenopus.La estrategia más comúnmenteempleadapara la expresión de la toxina en sistemas heterólogoses la de producir las dos cadenasindependientementepara posteriormente obtener la toxina biológicamenteactiva tras la asociaciónde las cadenas(Lord et al., 1994). En la situacióndi vivo el genestructuralcodificapara un precursordenominado pre-pro-ricinaque, tras la eliminaciónde un segmentoN-terminal, originarála pro-ricina (Richardsone:al., 1989)que, a suvez, tras la eliminacióndel péptidoconectivoentrelos dos fragmentosdefinitivos , originará la forma biológicamenteactiva (Harley y Lord, INTRODUCCION 14 1985). La cadenaA poseeactividad N-glicosidasa,responsablede la inactivaciónde los ribosoniasmediantela eliminación de la adenina4324 de la molécula rRNA 28S (Endo e: al., 1987). La cadenaB poseedos dominios de unión a galactosa,cadauno de los cualestiene a su vez tres sitios de unióna tal azúcarde los que sólo uno esactivoen cada dominio (Rutenbery Robertus, 1991). La ricina penetraal interiorcelular medianteprocesosdependientese independien- tes de clatrina (Lord ej al., 1994). Los componentesde membranacon residuos de galactosa,ya sean glicoproteinaso glicolípidos, actúancomo receptorespara la toxina (Lord e: aL, 1994). Gran númerode evidenciasapuntanhacia la implicación de la red transdel aparatode Golgi en la entradade la toxina (Sandviget al., 1992; van Deurs et al., 1993; Pelhamet al., 1992);de hecho, la inhibición del transportede vesículasaesta red supone la protección de la célula frente a la toxina (van Deurs e: al., 1993). Asimismo, el tratamientocon BrefeldinaA, drogaque desorganizael aparatode Golgi, protege frente a la intoxicación, no sólo por ricina sino también por otras toxinas, incluyendola toxina Shiga (Sandvige: al., 1991; Yoshidae: al., 1991). Finalmente,se ha demostradoque existe transporte retrógrado desde el Golgi hasta el retículo endoplásmico(Sandviget al., 1992),aunqueno seha determinadoque tal transporteesté implicado en la intoxicación por ricina (Sandvigy van Deurs, 1994). En algúnmomento duranteel transportevesicular, la cadenaB facilita, directao indirectamente,la entrada de la cadena A al citosol, siendola región de unión a galactosala implicada en ello (Kozlov er al.. 1988). Tras la entradade la cadenaA al citosol, éstaejercesu acciónN- glicosidasasobre la molécularRNA 28S, produciendola liberaciónde la adenina4234, inactivandoirreversiblementea] ribosoma(Endoe: aL, 1987) Finalmentecabedecir que el mecanismode entradade la toxina Shiga.causade la disentería,compartenumerosascaracterísticascon el descritopara la ricina (Sandvig y van Deurs, 1994). En este caso sí se ha demostradosin embargoque el transporte retrógradopuedeser necesariopara la intoxicaciónpor estatoxina(Sandvigetal., 1992). Las RIP de tipo 1 comoya se ha dicho, estáncompuestaspor una única cadena polipeptidicaque carecede un dominio de unión a un receptor.Estehechova a suponer que estasproteínasseanmenostóxicas comparadascon las RIP de tipo II (Stirpe et al., 1992).Aun así,algunassonespecialmentetóxicasparaalgunostipos de células,comopor ejemplo, macrófagos(Barbieri y Stirpe, 1982) y trofoblastos(Chang et al., 1979; Wang et al., 1986; Yeung er al., 1988), posiblementedebidoa su altaactividadpinocitica. La elevadaactividadcitotóxicasobre los trofoblastoses la causade la capacidadabortivade numerosasRIP de tipo 1 como, por ejemplo, la tricosantina(Yeung e: al., 1988), la saporina(Stirpeej al., 1983), la momordina(Barbieri e:al., 1980) y, enmenorextensión, la gelonina(Stirpe e:al., 1980). La a-sarcinasehademostradocitotóxicaparanumerosas líneas tumoraleshumanas(Turnayej al., 1993>. Asimismo, numerosasRIP de tipo 1 de plantasresultanseragentesantivirales,tanto en tejidos vegetalescomoen tejidosanimales (Aron e Irvin, 1980; Foá-Tomasia al., 1982). La actividad antiviral de estasproteínas se ha relacionadocon un aumentoen la permeabilidadal citoplasmade las células infectadaspor virus. Estamayoraccesibilidades debidaa los cambiosque sufre la célula en las propiedadesde permeabilidadde la membranaplasmática(Readyeral., 1986). La gran eficaciacatalíticade las RIP de tipo 1 las haceexcelenteselementospara la preparaciónde inmunotoxinas. En este sentido, las inmunotoxinas con gelonina, INTRODUCCION 15 saporina,PAP, briodina o momordinason máseficacesincluso que las realizadascon la cadenaA de la ricina (Lambert et al., 1988). REQUISITOS ESTRUCTURALES PARA LA TRANSLOCACION DE PROTEINAS A TRA VES DE MEMBRANAS EN SISTEMAS CELULARES Ciertasproteínaspuedentransiocarseatravésde membranascelularesmedianteun procesopost.-traduccional(Eilers y Schatz, 1986; Schatz, 1986; Rothmanny Konberg, 1986; Zimmermanny Meyer, 1986). Estefenómenono sóloseha demostradoqueocurre en membranasdel retículoendoplásmico(Waltereral., 1984; Schatz,1986), sino también en membranasbacterianas(Saier e: al., 1989),mitocondriales(Verner y Schatz, 1988) y de cloroplastos y glioxisomas (Ellis y Robinson, 1987). Del mismo modo, toxinas proteicas completamenteplegadas y estables en solventes acuosos son capacesde translocarsea travésde la membranade los organismosdiana (Montecuccoet al. 1991; Parkery Pattus, 1993). Cómounaproteínacompletamenteplegada,solubleen un entornoacuoso,escapaz de insertarsey, en algunoscasos,translocarseatravés de membranas,suponehoy díauno de los principales retos en la química de proteínas (Rothmann y Konberg, 1986; Montecuccoe: al., 1991; Parkery Pattus, 1993). Estudiossobre translocaciónde proteínasllevadosa cabo en sistemaslibres de células,han determinadoque uno de los requisitosnecesariosparaque un polipéptidose transloquea travésde membranases que éstedebesufrir un procesode desplegamiento, debeperder la estructuraterciaria estable(Randalíy Hardy, 1986; Eilers et al., 1988). Este hecho ha llevado a definir lo que se conocecomo estructuracompetentepara la translocaciónde un polipéptido(Cheny Douglas,1987; Meyer, 1988; Kumamoto, 1991). Así, la estabilizaciónde una estructuraterciaria estableen unaproteínaimpide que ésta pueda translocarse. Eilers y Schatz (1986) demostraronque la enzima citosólica dihidrofolatoreductasa(DHFR) con un péptidoseñal mitocondrial en su extremoamino terminal no eraimportadaal interior de la mitocondriacuandoéstaeraestabilizadafrente a la digestióntríptica por unión de metotrexato(o cualquierotro derivadode folato) o mediante la introducción de puentesdisulfuro internos (Vestweber y Schatz, 1988; Vestwebere: al., 1989). En ausenciade tal tipo de ligandos estabilizantesla proteínaera eficazmentetranslocadaal interior mitocondrial.Asimismo, la translocacióndel citocromo c quedabloqueadapor la estabilizaciónqueprovocala unióndel grupo hemo(Hay e: al., 1984>. La necesidadde unaconformaciónparcialmentedesplegadapara que tenga lugar el procesode translocaciónen sistemascelularespuedededucirseigualmentede estudios con proteínashíbridasentreunaproteínacompetentepara translocarsey una proteína,o un fragmento de la misma, que adoptaun plegamientoestable. Así, la fusión de un fragmentode la enzimacitosólicaiS-galactosidasade E. colí, que adoptauna estructura terciariaestable,bloqueatotalmentela transiocacióndel precursorde la fosfatasaalcalina, tambiénde E. cotí, proteínaqueper seescompetentepara la translocación(Lee e: al., ~989).Las mismasconclusionessederivandel estudiode la translocaciónde la proteína de unión de fosfato PhoE de E. cotí (Pagése: al., 1984; Anba e: al., 1986>; de la translocaciónde la proteínade uniónde maltosade E. coY (Randalíy Hardy, 1986),etc. En estamisma línea, se hanconseguidoatraparciertasproteínasen etapasintermediasdel procesode translocación,es decir, con las cadenaspolipeptídicastransitoriamenteunidas a membranas.En todos los casosestudiadosla cadenapolipeptídicase encontrabaen un INTRODUCCION 16 estadono nativo, desplegado,muy sensiblea proteolisis(Schleyery Neupert,1985; Eilers y Schatz, 1986; Vestweber y Schatz, 1988; Vestweber et al., 1989). Una cadena polipeptídicaha de perderpor lo tanto su estructuraterciariaestable,esdecir, sufrir una desnaturalizaciónparcial,paraquepuedaser translocadaatravésde la membranacelular. De los resultadosanterioressederiva la necesidadlógica de ciertosfactoresen el interior celular que mantenganel estadode competenciapara la translocaciónde las proteínasque van a ser exportadas(Meyer, 1988).Tales factoresproteicosque modulan el estadoconformacionalde las cadenaspolipeptídicasse han denominadochaperones, término inicialmentepropuestopor Laskey y Earnshaw(1980). Actualmente,se define chaperónmoleculara unaproteínaque se une y estabilizaa un confórmeroinestablede otraproteínay que medianteunaunióny disociacióncontroladafacilita el destinocorrecto de la proteínasustrato,ya seaésteel plegamientocorrecto, la formación de estructuras oligoméricas,el transportea compartimentossubcelulares,o el control de su actividad (Hendrick y Hartí, 1993). Para llevar a cabo tales funciones los chaperoneshan de reconocerelementosestructuralesde las proteínaspresentesúnicamenteen el estadono nativo. Relacionesestructura-función en la transiocación de proteínas tóxicas a través de membranas Numerosasproteínasque son segregadasa] medio extracelularhan de insertarse y atravesarunabicapalipidica paraejercersu acciónbiológica. Ciertastoxinas proteicas poseendianascitoplasmáticas,por lo quenecesariamentehande alcanzarel citosol para llevar acabosu accióntóxica(Montecuccoe:al., 1991; Olsnese: al., 1993).Los aspectos relativos a los requerimientosestructuralesnecesariospara queestas proteínasinterac- cionen con membranasy, como consecuenciade ello, se inserteny/o transloquena su través,suponen,al igual que los procesosanteriormentedescritos,partedel problemade cómo una proteína hidrosoluble atraviesa membranas(Rothmann y Konberg, 1986; Montecuccoet al., 1991; Parker y Pattus, 1993). Granpartedel conocimientoque se poseeactualmenteen esteterrenosehaobtenidograciasa la resoluciónde las estructuras tridimensionalesde estastoxinas. En estesentido, se conocenlas estructurastridimen- sionalesde la toxina de la difteria de Corynebacteriumdiph:heriae(London, 1992; Olsnes e: al., 1993; Parkery Pattus, 1993), del dominio formador del porode la colicinaA de Escherichiacoli (Parkeret al., 1989; Parkere: al., 1990; van der Goot et al., 1991), de la 3-endotoxinade Bacillus :huringiensis (Li e: al., 1991) y de la exotoxina A de Pseudomonasaeruginosa(Pastanet al., 1992). Sehanencontradosimilitudesestructuralesentreestasproteínas,quehanpermitido postular un mecanismosimilar de inserción en la membranaque podría poner de manifiestopautascomunesparalastoxinasbicatenariaso multicatenarias(Parkery Pattus, 1993). La estructurabásicade estas proteínasestá formadapor una agrupaciónde a- hélices (entre 7 y 10) organizadasen trescapas.Cadacapaestá formadapor 2 ó más hélicesantiparalelas,algunasde las cualesestántotalmenteprotegidasdel disolvente.En todos los casos,hay al menosdos a-hélicesque por su naturalezahidrofóbicay por su longitud se puede afirmar que podrían atravesar la bicapa lipídica, si se orientan perpendicularmenteal plano de la membrana.Este plegamientocomún representauna forma soluble de empaquetamientopara hélices hidrofóbicaso anfipáticasque, pr se, tienen la capacidadde insertarseen membranas(Epand, 1993). Esta similitud en estas INTRODUCCION 17 proteínasconsideradasno semanifiestaanivel de estructuraprimariapor lo que se sugiere podríaser producto de una evoluciónconvergente. La conversión de una forma hidrosoluble a otra forma de membranaconlíeva reestructuracionesen las toxinas anteriores.La existenciade cambiosconformacionales en la toxinadiftéricaa consecuenciade unadisminuciónde pH (condiciónqueha de darse para que la cadenaA de la misma se transloque)se ha determinadopor aumentode sensibilidada proteasasy estudiosde dicroísmocircular (Hu y Holmes, 1984), así como por técnicasde fluorescencia(Blewitt et al., 1984). En esteestudiosedemuestraque el cambio conlúrmacionalviene acompañadode un aumentode hidrofobicidad que, en ausenciade membranaspuedeconducir a una agregaciónmasivade la proteína(Collins y Collier, 1987). El comportamientode la proteínadesnaturalizadatérmicamentea pH 7.0, en cuantoa la capacidadde interaccionarcon membranasresultaser comparableal que demuestrala proteínacuandose encuentraa pH ácido; esto es, el cambioconfor- macionaldisparadopor disminucióndePH se puedeasemejara un cambiodesnaturalizante (Zhao y London, 1986). Sin embargo,las estructurasde estasformasde la proteínason diferentesentre si y, a su vez, claramentedistintas de la estructura de la proteína desnaturalizadapor cloruro de guanidinio. Este comportamientoconformacionalse ha explicadoconsiderandoque algúndominio de la toxina tiene propiedadescaracterísticas de estadode “molten globule’, estadoque se reconocehoy día como importante en fenómenos de plegamiento desplegamientode proteínas, incluyendo procesos de translocacióna travésde membranas(Pheil e: al., 1986; Ptitsyn, 1987; Bychkovae: al., 1988; Baum et al., 1989; Goto y Fink, 1989; Martin et al., 1991). Este estado se caracterizaporposeerunacompactacióny contenidoen estructurasecundariasimilara los mostradospor el estadonativo, pero sin unaestructuraterciaria definidasegúnse deriva de estudiosde dicroísmocircular (Ptitsyn, 1987). Conclusionessimilaresa las descritas parala toxinade la difteria sehan determinadopara las colicinas(Lakey e: al., 1994), en dondede nuevo se alude a característicaspropias del glóbulo fundido para explicar el comportamientoconformacionalde la colicina A (van der Goot et al., 1991), así como para la exotoxina A (Farahbakhshej al., 1987; Farahbakhshy Wisnieski, 1989). En el casodel fragmentoformadordel porode la colicina A, se hademostradoque su capacidad de inserción en la bicapaes pH dependiente,de modo que es mayor a pH ácido. La variación de la constantecinética de inserción se correlaciona con la apariciónde un estadocon propiedadestípicas del glóbulo fundido (van der Goot e: al., 1991>. Las relacionesestructura-funciónen las toxinas monocatenariasen cuantoa la interaccióncon membranasestán peor caracterizadasque en los casos anteriores.De cualquiermodo, en algunaetapadel procesode internaciónal citosol ha de darseuna interacciónproteína-membranagraciasa la cual seva a producir el pasode estaproteína al interior celular. En este sentido, se ha demostradoque proteínas hidrosolubles monocatenariassometidasa pH ácido sufren cambiosconformacionalesque determinan una exposición de regiones hidrofóbicas merced a las cuales pueden desestabilizar membranasmodelo e inducir su fusión. Este hecho seríasimilar al que apareceen las toxinasbicatenarias.Así, estefenómenoseha demostradocon el citocromoc (Gadet al., 1982),clatrina(Hong e:al., 1985), insulina(Fariase:al., 1985), lisozima (Arvinte e: al., 1986), a-lactalbúmina(Kim y Kim, 1986). Este procesode interacción con vesículas modelopodría indicar que, al igual que con las toxinas bicatenariaso multicatenarias, variaciones en los parámetrosfisicoquímicos del entorno pueden inducir cambios estructuralesen éstasque las capacitepara interaccionarcon membranas.Harter et al. INTRODUCCION I8 (1988>sugierenque los marcajesconsondasfotoactivablesutilizadosen sus experimentos reflejan unapropiedadgeneralde unaproteínaque secaracterizapor “un estadocompacto con estructuraterciaria fluctuante (Dolgikh et al., 1981, 1984). Recientemente,se ha estudiadola interacciónde la ricina, asícomosuscadenasA y B independientemente,con vesículasmodelode PC y DOPC (Ramalingametal., 1994). En estetrabajosedemuestra que la cadenaA interaccionacon membranasde una forma dependientedel pH, de modo que su inserción de ambases mayor a pH ácido. Interesantemente,su hidrofobicidades mayor en condiciones ácidas debido un cambio conformacional que determina la exposiciónde la regiónaltamentehidrofóbica,en concreto, la región comprendidaentre los residuos247-257(Ramalingame: al.. 1993; Houston, 1982). En cualquiercaso, Los requerimientosestructuralesde las proteínasmonocatenarias paraque interaccionencon membranasno se han caracterizadoaún en detalle. Quizás, tales requerimientosestructuralesque permiten la interacción con membranasesten directamente relacionados con la capacidadde estas proteínas para desestabilizar membranasy translocarsea su través. FUSION DE MEMBRANAS Las membranasbiológicas se caracterizanpor su estabilidady por su carácter dinámico (Gennis, 1989). La estabilidad es un requisito necesariopara un elemento biológico que estrictamentedefine o delimita diferentes compartimentosfuncionalesy estructurales.Por otra parte, el dinamismo poseeríael mismo rango de necesidad, considerandoqueen todosloscompartimentosbiológicosdefinidospor membranasexisten procesosde transportede materia, o de información, en sentido amplio, entreel exterior y el interior, o bien, son elementosque participanen procesosque implican fusión y/o fisión de membranas(Blumenthal, 1987; Wilschut, 1991). La integraciónde estasdos propiedadeshacendel procesode fusión un fenómenode carácter]ocal, desdeun punto de vista espacial, en el que se producen estados intermedios, a menudoreversibles, resultadode la acciónde proteínasespecíficas.La energíarequeridaparael fenómenode fusión, característicade los propios componentesde la membrana, se emplea para modificar la organizaciónde los lípidos de membranade forma tal que se establezcala continuidadacuosay lipídica unavez finalizadoel procesode fusión (Zimmerbergej al., 1993). Granpartedel conocimientode los posiblesmecanismosde fusión de membranas y de interacciónproteína-lípidosederivade la investigaciónde sistemasmodeloen los que se empleanvesículaslipídicas o liposomas(Wilschut y Hoekstra, 1984, 1986; Szoka, 1987). El empleode sondasfluorescentesasociadasavesículashapermitidoel desarrollo de ensayoscinéticos,requisitoesencialpara la determinaciónde mecanismosmoleculares de interacciónproteína-lípido(Dúzgúnesy Wilschut, 1993; Hoekstray Dúzgúnes,1993). La fusión de membranasimplica necesariamenteel abandonotransitorio de la estructura definida por la bicapa lipídica (Hui et al., 1981; MacDonald, 1990). Independientementede la naturalezadel intermedio de fusión, debeexistir unafuentede energíaparaque se originetal transición;el estudiode las fuerzasqueseestablecenentre dos bicapasestá por ello directamenterelacionadocon el procesode fusión (Helm y lsraelachvili, 1993). La mayor partedel conocimientoa este respectoseha obtenidoa partir de estudiosde agregaciónde liposomas(Nir e: al., 1983; Dúzgúnese: al., 1985; INTRODUCCION 19 Bentz y Ellens, 1988), de la medida directade las fuerzasentre bicapasadsorbidasen superficiesde mica (Horn, 1984; Marra et al., 1985) y de las fuerzas existentesentre vesículasmultilamelares(Mcíntosh y Simon, 1986; Rand, 1981) El procesoglobal de fusión se puededividir en dos etapasdiferentes:agregación y desestabilizaciónde las bicapas(Walter y Siegel, 1993). Lasfuerzas implicadasen este procesocomprenden:(1) fuerzaselectrostáticaso de Coulomb, (2) fuerzasatractivasde Van der Waals y (3) fuerzasrepulsivasde hidratación(Nir y Bentz, 1978; Rand, 1981; Mclntosh, 1986; Helm y Israelachvili, 1993).Unacondiciónsuficientepara la formación de un agregadoestablede vesículases la existenciade al menosun mínimo local de energía libre de interacciónentre las vesículas (mínimo secundario),que es función esencialmentede las interaccioneselectrostáticasy las fuerzas de Van der Waals (Wilschut, 1991). Por otraparte, paraqueseproduzcael contactomolecularentrebicapas han de vencerselas fuerzasrepulsivasde hidratación,que comienzana ser significativas a distancias comprendidasentre 2 y 3.5 nm, dependiendode la naturalezadel lípido implicado. Se ha postuladootra fuerza de atracciónen sistemasde PE en la que la formaciónde enlacespor puentesde hidrógenopor moléculasde aguaentre las bicapas que interaccionanseríael factor clave (Randet al., 1988). En general, las proteínaso péptidos puedeninducir agregacióny/o fusión de liposomas mediantevarios mecanismos(Hong et al., 1991). Independientementedel mecanismo,proteínaso péptidos han de interferir en las fuerzasexistentesentre las vesículas,ya seadisminuyendola repulsiónelectrostáticao disminuyendola repulsiónpor hidratación(Hoekstray Kok, 1989; Hong et al., 1991).En cualquiercaso, la agregación de vesículasestaráinfluida por interaccioneslípido-proteína,en dondeunasólamolécula de proteínasirve de puenteentre las dos vesículasa agregar; o bien, lo estarápor interaccionesproteína-proteína,en dondeun agregadode moléculasde proteínaactúa como puente(Lampeet al., 1983; Hongeral., 1991). Otra posibilidadquetambiénse ha considerado,es que proteínaso péptidosafectenlas propiedadesde la superficie de las vesículasde modo tal que establezcaninteraccioneslípido-lípido como directorasde la agregación(Hong e: al., 1991). Un sistema modelocaracterizadoen detalle es el de la fusiónde vesículasinducidopor poli-lisina (Stollery y Vail, 1978; Gad ej al., 1982). La poli-lisina induce fusión de liposomascompuestospor PS; la condición óptima de este procesose producecuandose maximizael númerode sitios vesícula-péptido-vesículay cuandola carganetadel agregadoescero. Por lo tanto, la neutralizaciónde cargasparece esencialparael fenómenode fusión. De un modo similar, péptidosnaturalestales comola melitina y la polimixina B inducenfusión de vesículasácidas(Eytan y Almary, 1983; Hong y Vacquier, 1986). En estos casos el carácteranfipático de los péptidos les capacitapara incorporarsea las bicapas, mientras que sus extremos policatiónicos actuarían de “puente’ entre las vesículas;de nuevo, la fusión esóptima en condicionesen las que la neutralizaciónde cargases máxima (Hong y Vacquier, 1986). La neutralizaciónde cargases también necesariaen el procesode agregacióninducidapor la proteínabásicade la mielina (Lampe y Nelsestuen, 1982). La disminución de la carga positiva neta de la proteína por fosforilación o eliminaciónde residuosde argininadisminuyesu capacidadde agregación (Cheifetz y Moscarello, 1985). En este caso, la agregación sólo ocurre cuando los liposomasse encuentransaturadosde moléculasde proteína, lo cual es indicativo de la existenciade un “puente” proteína-proteínaentre las vesículas(Lampe ej al., 1983). INTRODUCCION 20 La agregación de vesículas inducida por proteínas y péptidos no conduce necesariamentea fusión a no ser que se produzcauna desestabilizaciónde la bicapa (Batenburgeral., 1985; White, 1992; Yoshimurae:al., 1992; Zimmerberget al., 1993). La penetraciónen el interior hidrofóbico afectaríadirectamentea la movilidad de los lípidos, posibilitandola adopciónde estructurasno lamelaresque puedenconducirafusión (Hong er al.. 1991; Zimmerberge: al., 1993). Numerososresultadosen estesentido se derivande los estudiosde fusión de membranasinducido por los denominadospéptidos de fusión de proteínasvirales (Lear y DeGrado, 1987; Rafalsky et al., 1991; Dúzgúnes y Shavnin, 1992; White, 1992; Stegmanny Helenius, 1993: Wilschut y Bron, 1993: Rapaporty Shai, 1994>. En algunos de estos sistemas modelo se demuestraque la desestabilizaciónde membranaaunsiendoun requisitonecesariopara inducir fusiónpuede no ser un requisito suficiente (Rapaportet al., 1993). Así, péptidos incorporadosen el interior hidrofóbico de las bicapascaracterizadospor niveles reducidosen su contenido de &-hélice, aun peturbandolas bicapasno inducíanfusión. Aparentemente,la capacidad de un péptidoparaadoptarunaestructuraen a-héliceestambiénun requisitoparaque éste seacompetentea la hora de inducir fusión. Esteresultadoha sido obtenidocon péptidos derivadosde la hemaglutininadel virus de la gripe (proteínaresponsableinequívocamente de la fusión con membranasplasmáticas)(Lear y DeGrado, 1987; Whartoneral., 1988; Rafalsky eta!., 1991>, así como con péptidosanfipáticos modelo (Parenteeta!., 2988: Lee et al., 1992). La eliminaciónde la estructurahelicoidal de estospéptidos mediante introducción de residuosde prolina (Lee e: al., 1992) o por la sustitución de dos L- aminoácidospor sus enantiómerosD-aminoácidos(Rapaporter al., 1993) determinala pérdidade la capacidadfusogénicadel péptido. En términosmásgeneralesse puededecir que la capacidadfusogénicade péptidos dependede la integraciónde factores estruc- turales, talescomoestructurasecundariaen a-hélice,gradode penetraciónen la bicapa, capacidadde autoagregación,y propiedadesfuncionales tales como capacidadde agregaciónde vesículasy de desestabilizaciónde membranas(Rapaporty Shai, 1994). OBJETIVOS OBJETIVOS 22 El hecho de que la a-sarcinasea una proteína citotóxica implica que este polipéptidoposee,al menos,dosfunciones:unamuy específicaactividadribonucleolítica. y la capacidadparaaccederal interior de las célulassobrelas queactúa.Paradesentrañar el mecanismomolecular de esta última cabría pensaren la existenciade receptores proteicospara la toxina. Perono hay ningún indicio de que los haya.Es más, el hechode que la a-sarcinasea capazde interaccionarcon vesículaslipídicas de fosfatidilglicerol puedesugerir que el accesode la proteínaal interior celular estémediadopor interaccio- nes con fosfolípidosde la membrana.Conestasperspectivas,los objetivosplanteadosen estafasehan sido los siguientes: * Análisis de la posible interacciónde la a-sarcinacon fosfatidilserina, como fosfolípido ácido de mayor abundanciaen las membranasbiológicas que los ya analizadosfosfatidilgliceroles. * Estudio de la accesibilidadde la proteínaal medio intravesicular,al objeto de valorar si susefectossobrebicapaspuedenresultaren una translocaciónoperativa en sistemasmodelo. * Modelizaciónde la interacciónconvesículasmodelo. * Análisis de las relacionesestructura-funciónen lo que se refierea la capacidad de la a-sarcinapara interaccionarcon membranas. PARTE EXPERIMENTAL PARTE EXPERIMENTAL 24 Materiales El cultivo inicial deAspergillusgiganteasMDH 18894,apartir del cual sepurifica la &-sarcina fue cedidoporel Dr. YaetaEndode YamanashiMedical College(Japón).Los fosfolípidos sintéticos dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidilserina (DMPS). dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), los fosfolípidos marcadosfluorescentemente N-(7-nitro-2~1 .3-benzoxadiazol-4-il)-dimiristoilfosfatidiletanolamina(NBD-PE) y N-(7- lisaminarodaminaB sulfonil)-diacilfosfatidiletanolamina(Rh-PE),así comoel fosfolípido natural fosfatidilserinade cerebrobovino (PS), fueron suministradospor Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, USA>. Los fosfolípidos fosfatidilglicerol de huevo (PC) y fosfatidilcolina de huevo (PCh) fueron de Sigma (St. Louis, MO, USA). La asolectina aislada de semilla de soja y posteriormentepurificada fue cedida por el Dr. C. Montecuccode la Universidadde Padua(Italia). La sondafluorescente1 ,6-difenil-l,3,5-hexatrieno(DPH), fue proporcionadapor Aldrich (Milwaukee, WIS, USA>, mientrasque suderivadotrimetilamonio-DPH(TMA- DPI-I), así como el ácido 1-aminonaftaleno-3,6,8-trisulfónico(ANTS) y su apagador bromurode N,N’-p-xililen-bis-piridinio (DPX), así comoantraceno(ANT) lo fueronpor Molecular Probes(Fugene,OR, USA). Los lípidos fotoactivables 1-palmitoil-2-(2-azido-4-nitrobenzoil)-sn-glicero-3- IH]fosfocolina(PCI>yl-miristoil-2-f12-(4-azido-2-nitrofenil)amino]dodecanoil-sn-glicero- 3-[’4C]-fosfocolina (PCII) fueronsintetizadosen el laboratoriodel Dr. C. Montecucco. La tripsina tratadaconTPCK fue de Merck (Darmstadt,Alemania), la clostripaina fue de Millipore Co. (Freehold,NJ, USA) y el inhibidor de tripsinade clarade huevofue de Boebringer (Mannheim,Alemania). Purificaciónde la ar-sarcina Los procedimientosde purificación estánbasadosen los inicialmente descritos (Olson y Goerner,1965; Olsonej al., 1965). El hongoAspergillusgigan:eussecreceen un medio líquido (2% almidón de maíz, extractode ternera 1.5%, peptona2% y cloruro sódico 0.5%) a 300C durante 70-90 horas. La producción de a-sarcinase registra midiendo la absorbanciaa 280 nm y el pH del medio de cultivo, así como mediante PAGE-SDS. Alcanzadoel momento de máximaproducción,el medio extracelulares separadodel micelio y dializadoexhaustivamentefrente atampónfosfato 50 mM, pH 7.0, La a-sarcinase purifica mediantecromatografíade intercambio iónico con una resma Amberlita IRC-50,seguidade sucesivascromatografíasdepenetrabilidad,en concreto,un Biogel PíO y un Biogel P2. La proteínapurificadase obtiene con un rendimientoque oscila entre5-50 mg/l de cultivo. Espectrosde absorciónen la regiónUY-visible Lasmedidasespectroscópicasserealizaronen un espectrofotómetroBeckmanDU-7 a una velocidadde barridode 300 nm/min. Paraello seemplearoncubetasde cuarzode pasosópticosde 0.1 y 1.0 cm, dependiendodel volumeny concentraciónde la muestra. La concentraciónde a-sarcinase determinó considerandoun coeficiente de extinción E0’~(28O nm, 1 cm)= 1.34 (Gavilaneset al., 1983). PARTE EXPERIMENTAL 25 Espectrosde dicroísmocircular Los espectrosde dicroísmocircular(CD) fueron realizadosen un dicrógrafoJobin Yvon Mark III equipadocon un arcode xenonde 250 W. Las disolucionesde proteína se analizaronen cubetasde 0.01 y 0.05 cm de pasoóptico en la región del Uy-lejano (longitudes de onda inferioresa 250 nm) y de 1 cm en el Uy-próximo (320-250 nm), respectivamente.Los resultadosseexpresancomovaloresde elipticidadmolarpor residuo de aminoácido(Om~,) en unidadesde gradox cm2 x dmo[’, tomandopara la a-sarcina113 como peso molecularpromedio por residuo (Saccoe: al., 1983). La concentraciónde proteínaempleadapara las medidasen las regionesdel Uy-lejanoy del Uy-próximo se mantuvocomprendidaen los intervalosrespectivos0.1-0.5mg/ml yO.5-l mg/ml. Porotra parte, la concentraciónde péptidoempleadaestuvocomprendidaentre0.5 y 1 mg/ml. En esteúltimo caso, las medidasen presenciade vesículaslipídicas o micelasde detergente, se realizaronsiempreen una cubetade 0.01 cm de paso óptico. La concentracciónde proteína fue determinadapor medidas de absorción, o bien mediante análisis de aminoácidos,y las concentracionesde péptidosmedianteanálisisde aminoácidos. Espectrosde fluorescencia Los espectrosde fluorescenciafueron realizadosen un espectrofluorimetroSLM Aminco 8000Cequipadocon un arcode xenonde 450 W, empleandocubetasde 0.2 ó 0.4 cm de pasoóptico. Las medidasfueron realizadasa250Có 370C. Las anchurasderendija fueron de 4 nm, tanto parael haz de excitacióncomoparael haz de emisión. El voltaje de los canalesde ajustóencadacaso de modo que la señal recibidaseencontrósiempre entre los límites aconsejados.Cuando fue necesario,para evitar los efectos de la dispersiónde luz debidaa la turbidez de las mezclasproteína-vesículas,se emplearon polarizadoresde calcita G]an-Thompson (el polarizador de excitación se orientó horizontalmente (900) y el de emisión verticalmente (00); en cualquier caso, la absorbanciade la muestraa la longitud de ondade excitaciónnuncafue superiora 0.06. Todos los espectrosde emisión de fluorescenciadeproteínasobtenidosfueroncorregidos por el factor instrumentaldel aparato. Medidas de polarización de fluorescencia Las medidasde polarización de fluorescenciase han llevado a cabo en un espectrofluorímetroSLM Aminco 8000C en cubetasde 0.2 cm de pasoóptico. Los polarizadoresempleados, tanto para la excitación como para la emisión, fueron polarizadoresde calcitaGlan-Thompson.Las vesículasempleadasfueron marcadascon l,6-difenil-l,3,5-hexatrieno(DPH), o bien con su análogotrimetilamonio-DPH(TMA- DPH) de acuerdoa Gavilanesejal. (1985). La relaciónDPH/lípido o TMA-DPH/lípido fue 1/1000ó 1/100, respectivamente.El tampónempleadofue Mops SOmM, NaCí 0. IM, EDTA lmM, pH 7.0, siendola concentraciónde lípido de 80 ng/mL. Tras la excitación a 365 nm, se midieron simultáneamentelas componenteshorizontal y vertical de la radiaciónemitida a 425 nm por DPH o TMA-DPH; los resultadossonproporcionadosen forma de valoresde polarizacióno de anisotropíade fluorescencia. Espectrosde absorciónen el infrarrojo Las medidasde absorciónen el infrarrojo fueronrealizadasen un espectrofotóme- PARTE EXPERIMENTAL 26 tro Nicolet 520 FT-IR. La muestrade proteínao de complejolípido-proteínafue dispuesta entre dos ventanasde CaE, empleandoseparadoresde tetión de 50 ~im. Todos los tamponesempleadosparala disolución de las muestrasfueron preparadosen presenciade D,O. Previamentea la toma de datos se procedea la termostatizaciónde la cámarade observaciónmediantela acciónde un bañocirculante,así comoa la eliminacióndel vapor de aguade la misma cámaragraciasa un compresorde aire seco (Balston). Para cada ensayoseadquieren216 barridos tantode referencia(aire)comode muestra.Los barridos de promediany se apodizancon la función 1-Iapp-Gentzel,obteniéndoseunaresoluciónde 2cm’. Los interferogramasde la muestray de los disolventessetransformanen espectros de transmitancia,serelativizancon el espectrode referenciay se transformanposterior- mente en espectrosde absorbancia.La contribución de los disolventesse elimina del espectrooriginal de la muestramediantesustraccióndigital. Formaciónde vesículasde fosfolipidos El protocolo de formaciónde vesículaslipidicas empleadosuponela hidratación de una películalipidica obtenidapor evaporacióna vacíode una disoluciónorgánicadel fosfolípido (cloroformo/metanol 2:1). La hidratación se realiza durante 1 h a una temperaturasuperiora la temperaturadetransición de fasedel fosfolípido (Tu,); en el caso de emplearunamezclade fosfolipidos, la temperaturade hidrataciónfue siempresuperior a la del fosfolípido queposeemayorTm. El tampónempleadodependiódel ensayoquese pretende realizar. La suspensiónde lípidos formada tras la etapa de hidratación, constituidapor vesículasmultilamelares,sesometea cinco ciclos sucesivosde extrusión en un Extruder(Lipex Biomembranes)a travésde dos filtros de policarbonatode 100 nm de diámetro de poro. Con esta metodologíase consigue una población de vesículas unilamelaresconun diámetropromediocentradoalrededordel diámetrodel porodel filtro (Mayer ej al., 1985, 1986; Hopeej al., 1985). Ensayosde unión proteína-vesícula Los estudiosde unióndea-sarcinaavesículaslipídicassellevaronacabomediante dos metodologías:ultrafiltración y ultracentrifugación. En ambos casos las muestras correspondientesa diferentes relacioneslípido-proteínase incubarona 370 (420C para DMPS) durante1 benMops SOmM, NaCí 0.1 M, EDTA lmM, pH 7.0; la concentración de lípido empleadafue de 160~M. En la separacióndel complejolípido-proteínarealizada medianteultrafiltración se emplearonfiltros Millipore SJGVLO4NS de 0.22 micras de diámetrode poro; tras la filtración sedeterminóel contenidoen proteínay fósforo del filtrado. El contenidode fósforo en ésteeranulo, así como tambiénlo era la retenciónde proteína libre en el filtro, según ensayoscontrol sin vesículas. En el caso de la ultracentrifugación,el complejolípido-proteínasecentrifugóen unaAIR-FUGA (Beckman Airfuge) empleandoun rotor tipo A-95. La centrifugaciónserealizóa 160000x g (90000 rpm) durante45 mm a 40C. Tras la ultracentrifugaciónse determinó el contenido en fósforo y enproteínadel sobrenadante.En las condicionesdel ensayolasedimentaciónde proteínalibre enausenciade vesículases nula, así como la presenciade vesículasen el sobrenadante(estoúltimo sedeterminóusandofosfolípidos marcadosradiactivamente). Ensayosde agregaciónde vesículas Los estudiosde agregaciónde vesículasde fosfolípidossellevaronacabomidiendo PARTE EXPERIMENTAL 27 la variaciónde absorcióna 360 nm de una suspensiónde vesículasde fosfolípidos recién preparadastras añadir a-sarcina. Las medidasse realizaronen un espectrofotómetro Beckman DU-8 equipado con portacubetas termostatizado. En todos estudios se consideraroncontrolesenausenciade proteína.Los ensayosserealizaronen Mops 5OmM, NaCí 0.1 M, EDTA [mM, pH 7.0 a 37’C (420C para DMPS). Ensayosde mezclade lípidos La mezclade lípidos de membranasse estudiómediantemedidasde la variación de la transferenciade energíade resonancia(Struck eta!.. 1981). Para ello seemplearon vesículasqueconteníanincorporadasen la bicapalas sondasfluorescentesNBD-PE y Rh- PE al 1% y 0.6%,respectivamente.De acuerdoconesteesquemaexperimental,la mezcla de reacciónconteníauna población de vesículascompuestapor vesículasmarcadasy vesículas no marcadasa una relación 1:9 ó 1:1. En la situación inicial las sondas fluorescentesseencuentranen la bicapaa unadensidadsuperficial tal quehay unaelevada transferenciade energíade resonanciaentreellas(el NBD-PE actuaríacomodonantey la Rh-PE como aceptor). La disminución de la densidadsuperficial de sondas como consecuenciade la fusión con bicapascarentesde ellas se traduceen una disminución lineal de la eficaciade la transferenciade energíaentrelas sondas. En un tipo de medidas se han realizadoespectrosde fluorescenciaen estado estacionariode preparacionesde vesículasy a-sarcinaincubadasdurante1 h en Mops 50 mM, NaCí 0.1 M. EDTA 1 mM, pH 7.0, a 370C (420C, paraDMPS). Los medidasse realizaronsegúnse ha descritopreviamenteen el apartado“Espectrosde fluorescencia”. Los espectrosde emisión obtenidosexcitandola muestracon radiación de 450 nm de longitud de ondamostraronmáximosde emisióncentradosalrededorde530 nm y 585 nm, correspondientesa la emisión de NBD-PE y Rh-PE, respectivamente.La eficacia de transferenciasedefinió como (%ET)= (1-F/F 0) 100 dondeE y E0 son la intensidadde fluorescenciaa 530 nm en presenciay en ausenciade Rh-PE,respectivamente. De un modosimilar al anterior, se ha estudiadola cinéticade la mezclade lípidos. Así, seregistró la variaciónde la emisión de fluorescenciaa 530 nm, para excitacióna 450 nm, en modocontinuo. En estecaso,semanejóunarelaciónvesículasmarcadasa no marcadasde 1:1 (Wilschut et al., 1985; Walter y Siegel, 1993); en caso de variar esta proporciónse hande introducir los factoresdeprobabilidadespecíficosparacadarelación con el fin de corregir los porcentajesde fusión, considerandolos ciclos de fusión silenciosos,estoes, ciclos que no originanvariaciónen la señalde fluorescencia.En este caso particular, sólo la fusión entre vesículasmarcadasy no marcadasproduce tal variación. Considerandola definición anteriorpara eficaciade transferenciade energía tendríamosque (%ET)1= 1-I(Fs3Ú)o~%fl/(F330)o%JU1] 100 (%ET)2= 1-[(F530%3% fl/(F530)Q%~,j 100 para vesículasconteniendo1% NBD-PE y 0.6% Rh-PE y vesículascon 0.5% NBD-PE y 0.3% Rh-PE, respectivamente.La variación total de %El en estas condiciones experimentalesserá: PARTE EXPERIMENTAL 28 ~áET= (%ET)1 - (%ET)2 Por tanto, cuandoen el ensayo 1:1 se hayaproducidoel 100% de fusión, el AET será el anterior, que se correlacionacon un AF530 cuyovalor es: = (F530)03% ~, — (F530)0% Rh Ahora bien,el 100% de dímerossehabráformadocuandola variaciónde F53<, sea la mitad de la anterior, ya que la probabilidadde que seproduzcafusión entrevesículas que producedilución de sondases 0.5 (sólo entremarcadasy no marcadas).Por tanto, el 100% de dimerosse correlacionacon un zXF530 cuyo valor es: = De estemodo, el porcentajede dímerosformadoa un tiempo t será % dímeros= <1(F53), - (F530ft6~ ~j/(áF530/2)} 100 y la velocidaddel procesosera y = d(%dímeros)/dt Peroestavelocidadestáimplícitamentedivididapor la concentraciónde lípido total en el ensayo. En efecto, AF530 es proporcionala la concentraciónde lípido total (al aumentarestaconcentracióntambiénaumentala concentraciónde sondasy por lo tanto su intensidadde fluorescencia,si no hayefectode filtro interno, queno lo debehaberen este intervalo de concentraciones). Por ello si se quiereestudiarel ordende la reacciónde formaciónde dímerosde fusión respecto a la concentraciónde lípido hay que anular la participación de la concentraciónde lípido en el valor de y, o lo quees igual, eliminar la normalizaciónque lleva implícita. Paraello hay dos posibilidades: * estudiarla variaciónde log [y x (lípido>] vs log [(lípido)] * estudiarla variación de log y vs log [(lípido)] siendo y = d[(F530)~ — (FS30ft6%jIdt cuya pendienteseráel orden de reacción. Estudiosde permeabilidaddemembrana Los estudiosde los efectosque sobrela permeabilidadde membranasejercela a- sarcinase han llevadoa cabomidiendo la liberacióndel fluoróforo ácido 1-aminonaftale- no-3,6,8-trisulfónico(ANTS), previamenteencapsuladojunto con su apagadorbromuro de N,N ‘-p-xililen-bis piridinio (DPX), desdeel interioracuosode vesículasde fosfolípidos (Ellens e: al., 1985; Parenteet al., 1990; Murata e: al., 1992). El protocologeneral fue el siguiente: la película de fosfolípido formada tras secar a vacío una disolución clorofórmica del mismo, se hidrata durante1 it a 37 0C en Tris lOmM, NaCí 2OmM, PARTE EXPERIMENTAL 29 ANTS 12.5mM y DPX 4SmM, pH 7.5, a unaconcentraciónde fosfolípido de lmg/mL. La suspensiónde vesículasmultilamelaresformadasde estamanerase sometea cinco ciclos de congelacióndescongelacióncon nitrógeno líquido. Se ha demostradoque este proceso incrementala eficacia de encapsulaciónde solutos hidrofilicos. Así, de una situación inicial en la que no existe una distribución de equilibrio transmembrana!,y la eficacia de encapsulaciónparael solutoes muy baja, se llega a eficaciasde atrapamiento de hastael 30% (Mayer et al., 1985, 1986; Hope ej al., 1985). Posteriormente,esta suspensiónse sometea cinco ciclos de extrusiónparaobtenervesículasunilamelares,tal y como seha descritoanteriormente.La separacióndel material no encapsuladoserealizó mediantecromatografíade penetrabilidadempleandouna columna de SephadexG-75 (Pharmacia),equilibradaen tampónTris 10 mM, NaCí 0.1 mM, EDTA 1 mM, pH ‘7.5. Las medidasde fluorescenciaserealizaronen un espectrofluorímetroSLM Aminco SOOOC equipadoconpolarizadoresGlan-Thompson(ver apartadoanterior “Ensayosde mezclade lípidos’t). Los espectrosde emisión de fluorescenciamostraron un máximo centrado alrededorde 510 nm. El espectrode emisiónde fluorescenciade Las vesículasen ausencia de a-sarcina. situación consideradacomo 0% de liberación, se caracterizapor una fluorescenciaremanentemuy baja(menordel 4% de la fluorescenciacorrespondienteal 100% de liberación) debido a que el ANTS se encuentraapagadopor el DPX en el interior de las vesículas; el 100% de liberación se consiguemediante la lisis de las vesículascon Triton X-100 1% concentraciónfinal. En estasituación el apagamientode fluorescenciadel ANTS por el DPX ha desaparecido. Ensayosde mezcladecontenidosacuosos Los estudiosde mezcladecontenidosacuosossehanrealizadoempleandoel mismo sistemaANTS/DPX, en donde,del mismo modo queen el ensayoanterior, se registrala cinéticade variaciónde intensidadde fluorescenciadel ANTS. En estecasosepreparan dos poblacionesde vesículas:i) vesículasque contienenANTS 25 mM (la hidrataciónde las vesículasserealiza en tampónTris 10 mM, pH 7.5, ANTS 25 mM, CINa 40 mM) y u) vesículascon DPX 90 mM (el tampónde hidrataciónesTris 10 mM, pH 7.5, con DPX 90 mM). Las vesículasseprepararonsegúnel métododescritoanteriormentede extrusión con filtros de 0.1 ~m de diámetro, previos ciclos de congelación-descongelación.Las vesículasasí formadassesepararondel materialno encapsuladomediantecromatografía de penetrabilidadenSephadexG-75(Pharmacia),equilibradoen tampónTris 10 mM, pH 7.5, CINa 0.1 M, EDTA 1 mM. Los ensayosde mezcla de contenidosacuososse realizaronañadiendola proteínao péptido a unapoblaciónde vesículasformadapor unas conteniendoANTS y otras DPX, en una relación (1:1). La mezclade los contenidos acuososde vesículasde diferente cipo determinauna disminución en la intensidadde fluorescenciadel ANTS debidoal apagamientoocasionadopor DPX. La pérdidade la integridadvesicular tras los ciclos de fusión determinala liberaciónde los complejos formados,con la consiguienterecuperaciónde la intensidadde fluorescenciadel ANTS (Dúzgúnesy Wilschut, 1993; Ellens ej al., 1985; Wilschut, 1991). Medidas de dispersión de luz a 900 mediante técnicasde flujo detenido Las medidasde intensidadde luz dispersadaa 900 fueronrealizadasen un aparato de flujo detenidoI-li-tech CanterburySF-40equipadocon una fuentede luz halógenade 50 W. La longitud de onda de la radiación incidente fue de 360 nm, midiéndose la radiacióndispersadaconun fotomultiplicadorPM-60. La constantede tiemposeleccionada 30PARTE EXPERíMENTAL fue de 33 ms. Las disolucionesde proteínay las suspensionesde vesiculasempleadasen los ensayosfueronsiemprepreparadasen el momento,considerandoque lasconcentracio- nesefectivaseran las de la cámarade observación,es decir, las resultantesde la mezcla 1:1 de los dos medios.Las velocidadesiniciales de agregaciónsedeterminarona partir del tramolineal de variaciónde la intensidadde luz dispersada(en un intervalode 0.5 sí Los valoresproporcionadosson el promediode 6 medidassecuenciales.La contribución de las vesículaspor sí solas setuvo en cuentacon los respectivoscontrolesen ausencia de proteína. En las medidasde intensidadde luz dispersadaa 900 se cumple: l=é3(dn/dc en los primerosinstantesdel proceso,estoesválido puesaunquepuedavariaralgoel peso molecularde [aestructuradispersante,C no lo haríatanto ya queapareceen g/litro y no en concentraciónmolar. Segúnla ecuaciónb: (dI/dt)~0 = a (dM¡dt)1~0 PARTE EXPERIMENTAL 31 = l~ = a siendoM~ el pesomolecularde las vesículasqueson el solutodispersantea t=0 a = (d1/dt)~0 = (10/Mg) (dM/dt)~~<> (c) El procesode agregaciónde vesículasinducidapor la proteínasepuedeconsiderar como: —* ya que lo que se va a medir, 1, dependedel peso molecular de lo que dispersa. La velocidaddel procesoserá: y = (dM/dt)~0 = k C0 velocidad inicial en dondek es la constantede velocidaddel procesoy C0 la concentraciónen gil de las vesículas,ya que vamosa medir intensidadde luz dispersaday éstaes proporcionala concentraciónen g/l y no concentraciónmolar. Segúnla ecuaciónc: y = (dMIdt)10 = (d1/dt)~0 ‘ (M~,/I0) = k k = (dI/dt)~0 ‘ (M~/I0) . (lIC0) = 1/V0 siendoy0 la concentraciónmolar inicial de vesículas k = (dI/dt)~=0 / (~ . y0) Esta última expresiónes la utilizadapor Lampe et al. (1983) Calorimetría diferencial de barrido Las medidasdecalorimetríadiferencialde barrido (DSC) sellevarona caboen un calorímetro Microcal MC-2 DSC (Microcal Inc.: Northampton, MA, USA) a una velocidad de barrido de 0.5 0K/min (300C/h) y una presión constantede 2 atm. La adquisiciónde datosasí comosu análisisserealizó medianteel softwareDA-2 y Cpcalc. Las funciones de excesode capacidadcalorífica se obtuvierontras la sustracciónde la línea basey la correcciónpor el tiempo de respuestainstrumentalsegúnprocedimientos descritos anteriormente(López Mayorga y Freire, 1987). Todas las medidas se han realizado en tampón Mops 50 mM, pH 7.0, con NaCí OMM y EDTA 1 mM. Los complejosproteína-lípidose prepararonen la propia célula calorimétrica,mezclandola cantidadapropiadade cadauno de los componentes,incubándosela muestra1 h a 370C. PARTE EXPERIMENTAL 32 Encapsulación de tripsina en vesículasde fosfolip¡dos El protocolo de formación de vesículaslipídicas que contienenen su interior tripsina activa fue el siguiente:una película de lípido obtenidamedianteevaporacióna vacíode unadisoluciónorgánicade asolectinao de PC de huevofue hidratadacon tampon Mops 50 mM, pH 7.0 que contieneNaCí 0. M y tripsina pretratadacon TPCK. La concentraciónde lípido es de 10-20 mg/ml y la de tripsina es de 8-10 mg/ml. La hidratación se realiza a 370C durante 1 it, agitando la disolución en vórtex hasta resuspendertotalmentela película lipídica. La disolución fue posteriormentesometidaa congelación con nitrógeno líquido, descongelándoseposteriormentea temperatura ambiente;esteprocesode congelación-descongelaciónserepitió 5 veces.Finalmente,esta disolución fue sometidaa 5 ciclos de extrusiónen un Extruder a través de 2 filtros de policarbonatode 100 nm de diámetro de poro, obteniéndosede esta forma vesículas unilamelares(ver apartadoFormaciónde Vesículas de Fosfolípidos). El material no encapsuladoseseparóde las vesículasmediantecromatografíaen columnasde Sephadex G-75 dispuestas en jeringuillas desechables; las vesículas se eluyeron mediante centrifugaciónde las mismas(500xgdurante2 mm). La tripsina no encapsuladase eluyó posteriormenterepitiendoel proceso. Digestióntríptica intravesicularde a-sarcina La digestiónde a-sarcinase realizó añadiendocx-sarcina(10 pg) a0.2 ml de una disolución de liposomasque contienentripsina en Mops 50 mM, pH 7.0, NaCí 0.1 M a una relación lípido-proteínaadecuada.La presenciade inhibidor de tripsina de clara de huevo(13.6 jxM) enel exteriorvesicularimpidecualquieractividadtrípticaextravesicular. Esta disolución se incuba a 370C parándosela digestión a los tiempos considerados medianteadiciónde un volumende acetona/etanol(1:1) a -200C. Lasmuestrasseagitaron vigorosamentedurante15 mm a 40C,manteniéndoseposteriormentea -200Cduranteuna noche. El precipitado de proteína libre de lípido formado de esta forma se secó y redisolvió en un volumen adecuadode tampón de aplicación de electroforesis para posterior análisis en gelesde poliacrilamidaal 15%. Tras la tinción de los geles éstos fueron sometidosa densitometradoen un espectrofotómetroBeckman DU-8. El área comprendidabajo el pico correspondientea la a-sarcinafue empleadopara estimar el porcentagede proteínano degradada.Los controlesde 100% de degradaciónseobtuvieron mediante la adición de Triton X-100 (1% concentraciónfinal) a una disolución de vesículas con tripsina pero en ausenciade inhibidor en el medio extravesicular. La actividadde la tripsinaempleadafue inicialmencecomprobadaregistrandola hidrólisis del sustratocromogénicoVal-Leu-Lys-p-nitroanilida-2HCImediantemedidasde absorcióna una longitudde ondade 405 nm. Encapsulaciónde tRNA en vesículasde t?osfolípidos El procesode formaciónde vesículases idéntico al descritoen el apartadoanterior de Encapsulaciónde Tripsina en Vesículasde Fosfolípidos. En este caso,el tampónde hidratación de las vesículas contiene tRNA de levadura (Sigma; tipo X-s) a una concentraciónde 3-5 mg/ml. Las vesículas se separarondel material no encapsulado medianteciclos de centrifugacióna 127000xg en una Airfuge (Beckman>empleandoun rotor A-95. El sedimentofinal fue resuspendidoen un volumenadecuadode Mops 50 mM, pH 7.0, NaCí OMM. PARTE EXPERIMENTAL 33 Degradación dc tRNA encapsuladopor a-sarc¡»a Diferentesvolúmenesde unadisoluciónde a-sarclna0.17 mM seañadena 0.2 ml de unadisoluciónde vesículasde asolectinao de PCde huevoen Mops 50 mM, pH 7.0, NaCí 0.1 M. La disolución se incuba durante 3 it. a 370C tras lo cual se añadeun volumende HCIO 4 al 10% quecontieneacetatode uranilo al 0.25% (p/v) y BSA (0.2 mg/mi>. La disolución resultantese mantuvo en hielo durante 30 mm tras lo cual se centrifugaa 3000xgdurante20 mm a 4 0C. Posteriormentese mide la absorbanciaa 260 nm de los sobrenadantesen un espectrofotómetroBeckmanDU-7. Tal valor es funciónde la concentraciónde oligonucleótidossolubles en ácido producidos por la actividad ribonucleolítica de la a-sarcina. Los blancos para estas medidas fueron muestrasde vesículastratadasde la misma forma pero a las queno se añadióproteína.Esteanálisis estábasadoen el empleadoparamedir actividadribonucleasade a-sarcinafrente aRNA purificado de levadura(Martínezdel Pozo e: al., 1989). Fotomarcaje de a-sarcina La formacióndevesículasconfosfolípidosfotoactivablesparaposteriorfotomarcaje de cv-sarcinasellevó acabobajo luz roja de la siguienteforma: en primer lugar, seformé una película lipidica medianteevaporaciónen corriente de nitrógenode una mezclade lípidos en cloroformo:metano) 1:1 (y/y) más las sondas PCI (1-palmitoil-2-(2-azido-4- nitrobenzoil)-sn-glicero-3-[3HJfosfocolina) y PC2 (1-miristoil-2-[ 12-(4-azido-2-nitro- fenil)amino]dodecanoil-sn-glicero-34’4C]-fosfocolina).A continuación las películas se redisolvieronen dietiléter, volviéndoseasecarposteriormenteen corrientede nitrógeno. La relaciónmolar PCI/lípido total fue de 0.006%, siendola radiactividadtotal deSx l0~ dpm; para la sondaPCI1 la relación molar fue de 0.018% y la radiactividadfue 1 x 1O~ dpm. Tras la eliminaciónde las trazasorgánicasla mezclalipídica sedisolvió en tampón Mops 50 mM, pH 7.0, NaCí 0.1 M, sometiéndosea sonicaciónen bañodurante30 mm a unatemperaturasuperiora la de transiciónde fasedel lípido. Los complejosa-sarcina lípido se formaronpor adiciónde a-sarcina(20 ¡xg) a la disoluciónde vesículasmarcadas, incubándosela mezcladurantelii a 370C. A continuaciónlas muestrasse irradiaron con una lámparauy de larga longitud de onda UVL-56 Ultraviolet Products(Montecucco, 1988) durante10 mm a temperaturaambientey con un filtro de cristal. La proteínase recuperómedianteextracciónconetanolal 70% paraposterioranálisisen PAGE-SDS.A continuaciónlos geles sedividieron en rodajasde 2 mm de espesor,quese incubaron independientementedurante12 it con300 gl de solubilizadorde tejidos PackardSoluene 350. El contajede radiactividadse realizóen un contadorde centelleoBeckmanLS-3801, tras la adiciónde 4 ml de líquido de centelleoPackardInstagele incubacióndurante6 h. Microscopiaelectrónica Lasvesículasde fosfolípidos sepreparancomoseha indicadoanteriormente(véase Formación de VesículasLipídicas) a una concentraciónde 2.5 mg/ml. Las mezclas péptido-vesículassepreparanpor incubaciónde la correspondientecantidadde cadauno de ellos, segúnse indicaen cadacaso. Sobreuna gotade la muestraaanalizarse deposita una rejilla de cobre recubiertade Formvar-carbono,sobre la que previamentese realizó una descargaeléctrica en un “glow-discharge”. El sistema se mantiene en estas condicionesdurante2 mm, tras lo queseprocedea secar el excesode muestracon un papel de filtro. La rejilla con la muestra se incuba con ácido fosfotúngstico al 2% PARTE EXPERIMENTAL 34 (peso:volumen),pH 7.0 durante5 mm. Tras secarla rejilla seobservaen un microscopio electrónicode transmisiónZeiss EM 902 (Jena,Alemania). Reduccióny carboxiamidometilaciónde Út-sarcina Los puentesdisulfuro de la cv-sarcina se redujerony carboxiamidometilarondel siguientemodo: una disoluciónde cx-sarcina(10 mg/mí) en tampón de desnaturalización (Tris-HCI 1.0 M, EDTA 2 mM, clorurode guanidinio6 M, pH 8.0) se mantienea 370C durante1 it, tras lo cual se añadeditiotreitol sólido hastaunaconcentraciónfinal de 25 mM (exceso10 vecesmolar sobreresiduosde cisteina). Tras ser gaseadacon nitrógeno, la disoluciónse mantienea370Cdurante90 mm. Finalmente,y tras añadiriodoacetamida sólida hastauna concentraciónfinal de 250 mM, la disolución se incubaen oscuridada 370C durante60 mm. La proteínaasí tratadase purifica medianteunacromatografíade penetrabilidaden una columnade Biogel P2 (2 x 15 cm) equilibradaen ácido acético50 mM. Las fracciones con proteína se recogen y se liofilizan. La extensión de la modificaciónseverifica medianteanálisis de aminoácidos. Análisis de aminoácidos Los análisis de BeckmanModel 6300. (0.2 ml volumentotal) proceso,las muestras (Savant), lavándose hidrolizadossecosse aminoácidosse han llevado a cabocon un analizadorautomático Las muestrassehidrolizaronen HCI 5.7 N con fenol 0.1% (p/v) durante24 it a 1 100C, en tubos Pyrex cerradosa vacio. Tras este sesecana vacíoconun sistemade centrifugaciónavacíoSpeed-Vac posteriomentedos veces con 0.2 ml de agua destilada. Los disolvieronen 50 ¡tI de tampón Na-S (Beckman). Digestionesproteoliticas Digestión por clostripaina: previamentea la digestión, la enzimaha de activarse incubándoladurante2-3 h en ditiotreitol (DTT) 7.6 mM, CaCI 2 2.03 mM (Giles et al., 1979). Posteriormente,la a-sarcina, o cualquier forma modificada de la misma, se disuelveen Tris-HCI 0.1 M, NaCí 0.1 M, Dfl 1 mM, CaCI2 1 mM, pH 7.0, a una concentraciónde 1-5 mg/ml. La enzimaseañadeaestadisolucióna unarelaciónproteína- enzimade 50:1, manteniéndosela digestióndurante5 h a 37 0C. Digestión por tripsina: la proteínaa digerir se disuelve en 50 mM), NaCí 0.1 M, pH 7.5, a unaconcentracióncomprendida tripsina, disueltaen el mismo tampón a una concentraciónde 1 anterior disolución de modo que se obtengauna relación50:1 digestiónse mantienea 370C duranteun mínimode 3 h. Tris 50 mM (o Mops entre1-5 mg/ml. La mg/mí, se añadea la (proteína/enzima).La Ensayo de actividad ribonucleasa de la a-sarcina La actividad ribonucleasaespecíficade la a-sarcinase ha puestode manifiesto medianteun ensayoque haceuso de un usadode reticulocitosde conejo (Promega),tal y comose ha descritopreviamente(Lamy y Davies, 1991; Lacadenae: al., 1994). Este lisado (50 ¡tI) fue tratadocon cx-sarcinanativa, o cona-sarcinamodificadaquímicamente (40 ng), en tampónTris-HCI 40 mM, KCI 40 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5, durante15 mm a temperaturaambiente.La reacciónse paró por la adición de 0.25 ml de Tris-HCI PARTE EXPERIMENTAL 35 50 mM, SDS 0.5% (p/v), pH 7.5. incubándosela mezcladurante5 mm a temperatura ambiente. La extracción de RNA se realizó con fenol/cloroformo/alcohol isoaniílico (24:24:1) y, posteriormente,precipitadacon etanol. Este RNA se analizó en gelesde agarosaa] 2.4% y se reveló por tinción con bromurode etidio de acuerdoconprotocolos estándar. Alineamientoy comparacionesde secuenciasde aminoácidos.Predicciónde estructurassecundarias Los alineamientosy comparacionesde secuenciasde residuosde aminoácidosse han llevado a cabo de acuerdo al algoritmo desarrolladopor Needíemany Wunsch empleandoel programaALIGN (Doolittle y Feng, 1990). La predicciónde estructuras secundariasse ha basadoen las secuenciasde aminoácidospreviamentedescritas. La predicciónde giros fi se ha llevado a cabosegúnChou y Fasman(1978) y Gavilaneser al. (1984). Los elementosestructuralesde a-hélicey estructurafi se han predichosegún el métodode Gibrateral. (1987). Los árbolesfilogenéticosse han construidoconsideran- do la matriz de distancia y el orden de ramificación de acuerdoal programaPAPA (Doolittle y Feng, 1990). Los perfiles de flexibilidad se han obtenidoutilizando los parámetrosaportadospor Karplus y Schulz (1986) de acuerdoal programaEPIPLOT (MenéndezArias y Rodríguez, 1990). El alineamientode estructurasde proteínas fue realizado con el programa lnsight II de BIOSYM manejandolas coordenadasde las correspondientesestructurascristalinas obtenidasdel Banco de Datos de Proteínasdel Laboratorio Nacionalde Brookhaven(ProteinData Bank) (Berstein et al., 1977; Abola eral., 1987). Determinaciónde los contenidos de estructura secundaria a partfr de los espectrosde CD y de fl?IR Los cálculosde los diferentesporcentajesde estructurasecundariade proteínaso péptidosa partir de espectrosde dicroísmocircular se han llevadoa caboempleandoel método CCA (‘convex constraintanalysis’) de Perczel ej al. (1991). Dicho método no haceuso de datos referentesa estructurasproteicasdeterminadasmediantedifracciónde rayos-X, así como de espectrosde referencia. La desconvoluciónde los espectros experimentalesproporcionaespectroscomponentesbásicosprácticamenteidénticosa los consideradoscomo tales y que se han derivadode estudiosde polipéptidos modelo de estructuraconocida. La determinaciónde estructurassecundariasa partir de la bandaamida1’ de los espectrosde infrarrojo se ha llevado a cabo según Goormaghtighet al. (19%, 1993). Brevemente, la región correspondientea la bandaamida 1’ del espectrose sometea desconvolucióndeFourierempleandounacurvaLorentzianapara la desconvolucióny una Gaussianaparala apodización(Kauppinene: al., 1981). La evaluacióncuantitativade los diferentescomponentesde la bandaamida1’ (exclusivamenteel intervalo comprendido entre los númerosde onda 1700 cm’ y 1600 cm’) reveladospor la desconvoluciónse llevó a caboempleandoun ajuste iterativo de mínimoscuadradosa curvasLorentzianas. Previamenteal ajuste, se sustraela línea base (una línea que conectaa través de las ordenadasa 1700 cm’ y 1600 cm’). Los parámetrosiniciales del ajuste son los especificadosen Goormaghtighe: al. (1990). La proporciónde una estructurasecundaria particularseconsideracomola proporción entreel áreade las bandascuyos máximosse PARTE EXPERIMENTAL 36 encuentranlocalizadosen la región que se asignaa tal estructuray el árearesultantede la sumade todaslas bandasindividualescuyos máximos seencuentrenentre 1689 cm’ y 1615 cm’. Síntesisy purificación del péptidoaS(116-139) El péptido ha sidosintetizadocon el extremoC-terminalen forma de amidaen un sintetizadorde péptidosautomáticomúltiple (AMS 422, Abimed) empleandoprocedimien- tos de síntesis de fase sólida y química estándarFmoc en una base de 25 ¡tmoles. La síntesis se llevó a cabo en una resma N-a-Fmoc-DMP[(4-(2’,4’-dimetoxifenil-Fmoc- amino-metil)-fenoxij(Novabiochem),con aminoácidosFmoc-protegidosactivadosin situ conPyBOP(benzotriazol-1 -il-oxi-tris-pirrolidinofosfoniohexa-fluorofosfato)en presencia de N-metil morfolina y 20% piperidina/dimetilformamidapara la desprotección.Los gruposde protecciónpara las cadenaslateralesson: tBu (serma,treoninay tirosina), pmc (arginina),Trt (cisteínae histidina) y Boc (lisina). El péptidofue liberadode la resmacon etanoditiol al 2.5% (King ejal., 1990) comosecuestrante,precipitadoy lavadoconmetil- ten-butil éter, extraídocon aguay liofilizado. El péptido fue posteriormentesometidoa purificaciónmediantetécnicasde HPLC de fase invertida en unacolumnaUltraspitere- ODS C18 (LOxiSO mm) con un gradientelineal agua/acetonitrilo35%, amboscon ácido trifluoroacético (0.1%). El peso molecular estimado mediante espectrometríade bombardeoatómicofue 2660,siendoel teórico2659. La composiciónde aminoácidosdel péptido purificado se correspondiócon la teórica. La concentraciónde péptido se determinó medianteanálisis de aminoácidosy por medidasde absorción a 278 nm, empleandoun coeficientede extinción molar a pH 7.0 de 2700 M’ cm’. Los análisisde aminoácidosse llevarona cabocomose ha indicadoanteriormente. RESULTADOS Y DISCUSION RESULTADOSY DISCUSION 38 1. AGREGACION Y MEZCLA DE LIPIDOS DE VESICULAS DE DIIMIRIS- TOILFOSFATIDILSERINA POR a-SARCINA Unión de oe-sarcina a vesículascompuestaspor DMPS La unión de la toxina a-sarcina a vesículasunilamelares grandes de DMPS se ha estudiadomediante u]trafiltración y ultracentrifugación. Los resultados obtenidosen ambos casosson comparables, lo cual significa que la interacción entre proteína y vesículano se ve afectadasignificativamente por ambos procesos.Los datos de unión han sido analizados considerando la existenciade un equilibrio de interacción comoel indicado (Gassete:al., 1989): proteína(P) + “sitios libres lipídicos” ~ PL~. Este modelo de unión considera la existencia de una constante de disociación aparente, Kd y un parámetro, n, que definiría el número de moléculasde fosfolípido que seven afectadaspor moléculade proteína. La ecuaciónque relaciona estosparámetros es: UPU = Kd~ n/(P1 - P~) + n en donde P~ y P~ son la concentración de proteína unida y total, respectivamente; mientrasque L~ es la concentración total de lípido. La representación de (L~/PJ frente a - P) permite calcular Kd y n (figura 1). Los valoresde estos parámetrosderivados de las medidasde uniónrealizadasa42”C, temperaturasuperiora la de transiciónde fase de la DMPS, son: Kd= 34O~ M, y n= 37. Del análisis realizadoa una fuerza iónica elevada,0.3 M NaCí, se deduceque no hay unión de la proteínaa las vesículasen el intervalode relacionesmolaresproteína/lípidoestudiado.Estemismoestudiosehallevado a caboconvesículasmixtas compuestaspor DMPG y DMPS a unarelaciónmolar 1:1. Los parámetrosobtenidosmedianteun análisiscomoel anteriorsonn= 54 y Kd= 1.9 106 M. Cabedecir quela definiciónde sitio lipídico de unión, espuramenteoperativa;el númeron que lo caracterizada ideadel númeromediode lípidos que seven modificados por moléculadeproteína,por lo que, comotal, el “sitio de unión” no se constituyecomo unarealidadfísica definida. RESULTADOS Y DISCUSION 39 0.05 ojo -a 0 1~ 0.15 (P,/La 100 — E 5Q~- 20 0.2 0.6 te 10~ Figura 1. Unión de «-sarcina a vesículas unilamelares de DMPS. (A) Representación de la relaciónentreproteínauniday lípido total (P,,/L~) frentea la relaciónproteínatotal y lípido total (P,/14.Loscírculos(@) representanresultadosobtenidosmedianteensayosdeultrafiltración, mientrasquelos triángulos (A) son los obtenidosmedianteultracentrifugación.(B) Análisis de los datos de acuerdo a la ecuación L4PU = Kn/(P~-P3+n Agregación de vesículasde DMPS por a-sarcina Tras el procesode unión a las vesículas, la a-sarcina agregalas vesículasde DMPS según se deduce del aumento de la absorción aparente a 360 nm (ÁA3~ ,~») de una dispersión de vesículas tras la adición de la proteína. Como puedeverse en la figura 2 el es dependientedel tiempo y de la relaciónproteína-DMPS.El tiempo que se requiereparacompletarsela reacciónesde 40 mm para la menorrelaciónproteína/lípido empleada,produciéndoseel 80% del aumentoen los primeros20 mm. El máximo incre- mento de absorción se producea una relación 35:1 (DMPS/a-sarcina),resultadoque coincidecon la máxima capacidadde las vesículasde unir a-sarcinasegúnse deriva de los resultadosanterioresde unión. 24 - 8 A o 22 ¾. 6 5 RESULTADOS Y DISCUSION 40 02 -0.2 0,1 01 Figura 2. Agregaciónde vesículasdeDMPS inducidapora-sarcina.(A) Aumentode la absorcióna 360 nm producidopor la interacciónde a-sarcinacon vesículasde DMPS. La titulación de las vesículasde DMPS (30 nniolestotalesde fosfolípido) serealizóen tampónMops 50 mM, pH 7.0 conteniendoNací 0.1 M, EDTA ímM, a 420C. La mezclade reacción(1 mi) se analizó en cubetasde cuarzode 1 cm de pasoóptico. Se representanlos incrementosde absorcióna 360 nm paracadarelaciónproteína/lípido(AA~ ) se representanfrentea los nmoles de proteínaañadida.Los resultadossonlos promediosde tresensayosindependientes.Recuadro: porcentajedevariacióndeabsorcióna360nm a diferentesconcentracionesdeNaCí correspondien- tes a una relación molar DMPS/a-sarcina(30:2). La normalizaciónse realiza considerandoel incrementoproducidoobtenido a 0.1 M NaCí como 100%. (B) Efectode la fuerza iónica sobre la cinéticade variaciónde absorcióna 360 nm tras la interacciónentrecx-sarcinay vesículasde DMPS. La mezclade reaccióncontienevesículasde DMPS (30 ninolesdefosfolípido total) y 2.2 nmolesde a-sarcinaen tampónMops 50 mM, pH 7.0 con NaCí 0.1 M y EDTA 1 mM. A los correspondientestiempos, indicados medianteflechas, se añaden 30 ¡tI de una disolución concentradade NaCí de modo quese incrementasu concentraciónen el medio hasta0.4 M. La agregacióndevesículasde DMPS esdependientede la fuerza jónicadel medio (figura 2, recuadro), de modo que un aumentoen esta última inhibe el procesode agregación.De hecho,el máximo~A 3~ producidoa 0.3 M NaCí esun 5% del que se producea 0.1 M. Considerandolos anterioresresultadosde unióna 0.3 M NaCí hade RESULTADOS Y DISCUSION 41 concluirseque la inhibición de la agregaciónes consecuenciade la ausenciade unión de a-sarcinaa vesículas;es decir, la inhibición no se produceen etapasposterioresde interacciónentrecomplejosproteína-vesícula.Estecomportamientoescaracterísticode un procesode agregaciónparael que las interaccioneselectrostáticassonesenciales.Ahora bien, tal y como seponede manifiestoen la figura 2B, los complejos a-sarcina-DMPS no sedisociancompletamentecuandola fuerza iónica del medio se incrementahastaun valor de 0.4 M NaCí por adiciónde un pequeñovolumende unadisoluciónconcentrada r 0.3— 0.2— 01 Figura 3. Variación de la anisotropía de fluorescencia (r) de vesículas de DMPS marcadas conDPH frente a la temperatura (0C).Los perfilesdetransiciónde fasecorresponden a diferentesrelacionesmolareslípido/proteína: (1) DMPS; (2) 100:1; (3) 50:1; (4) 30:1. Los estudiosse llevaron a caboen Mops 50 mM, pH 7.0 conteniendoNaCí 0.1 M y EDTA 1 mM. La concentracióntotal defosfolípido fue de 80 ¡tgImI. La sondafluorescenteDPH se encontraba a unarelaciónDPH/DMPSde 1:1000enpeso.Los valoresde anisotropíadeterminadosparacada temperaturase determinarontrasestabilizarse¡a muestra10 mm a dichatemperatura.Los valores representanel promediodetres determinacionesindependientes. 2 1 4 3 2 1 25 30 35 40 450c RESULTADOS Y DISCUSION 42 de NaCí (30pl en 1 ml total). Es más, la reversiónprogresivamentedisminuyea medida que la agregacióntiene lugar. En conjunto, esteresultadoindicaría que tras unaprimera etapade interacciónelectrostáticaentrea-sarcinay DMPS, seproduciríaninteracciones no reversiblespor fuerza iónica. La adición de a-sarcinaa complejos preformadosa-sarcina-DMPSestablesen condicionessaturanteslípido/proteínano inducecambiosen la absorciónde la muestra. Sin embargo,la adición de vesículas,hastaalcanzarel doble de la concentracióninicial, determinaun nuevoaumentoen la absorciónaparente(un 60%del inicial aproximadamen- te). Estos resultadosindicaríanque en condicionessaturanteslípido/proteínano existen vesículaslibres, aunquesí sepuedenincorporarnuevasvesículasa los complejos. Efecto de la a-sarcinasobreel comportamientotermotrópicode DMPS Sehan estudiadolos efectosque tienela a-sarcmnasobrela transiciónde faseentre el estadogel y líquido cristalino de la DMPS con la finalidadde un posterioranálisisde la interacción a-sarcina-DMPS.Este estudio se ha realizado empleando las sondas fluorescentes DPH y TMA-DPH, que registrarían los efectosde la proteína a nivel de la región de las cadenasde acilo de las bicapasy a nivel de la regiónde las cabezas polares,respectivamente(Lentz e: al., 1976; Prendergastet al., 1981). En la figura 3 apareceun resumende los resultadosobtenidosadiferentesrelacionesmolaresDMPS/a- sarcina,empleandola sondaDPI-I (los resultadosobtenidoscon la sondaTMA-DPH son similares). La proteínadisminuyela amplitudde la transiciónsin modificar la temperatura de la misma (TÉ,,), 350C en nuestrascondicionesexperimentales,hasta una relación saturante(30:1) DMPS/ct-sarcina.La proteínaafectaal estadofísico de los lípidos tanto por encimacomo por debajode la temperaturade transición (figura 4). El grado de anisotropíade fluorescenciade ambassondasdisminuyea una temperaturainferior a la Tm, es decir,cuandoel fosfolípido seencuentraenestadogel, mientrasque aumentaen estadolíquido cristalino. Esto es, la a—sarcinaaumentael ordende las moléculasde fosfolípido cuando éste se encuentraen estado líquido cristalino, mientras que lo disminuyecuandoseencuentraen estadogel. Estosresultadospuedeninterpretarsecomo producto de una penetración de la a-sarcina en la bicapa mediante interacciones hidrofóbicas. Estemismo estudioseha realizadoa alta fuerza iónica (0.3 M NaCí). En estecaso, laa-sarcinano modificael comportamientotermotrópicode la DMPS, lo cual estáde acuerdocon la ausenciade uniónen estasmismascondiciones. RESULTADOS Y DISCUSION 43 0.11 0.36 re 0.10 0.35 0.09 0.34 0.08 0.33 Figura 4. Variación de la anisotropía de fluorescencia (r) de vesículas de DMPS marcadas con DPH frente a la relación molar a-sarcina/DMFS (Ii). Los valores de anistropia de fluorescenciade DPH por encima(S) y por debajo(a) de la temperatura de transición de fase del fosfolípido puro (35 0C) serepresentanfrente a la relaciónmolar a-sarcina/DMPS(R). El efectode la a-sarcinasobreel comportamientotermotrópicode DMPS se ha estudiado también mediantecalorimetría diferencial de barrido (DSC). La proteína disminuyeaproximadamenteen un 30% el AH asociadoa la transicióntérmica,sin variar la T~, (figura 5), lo cual estaríade acuerdocon los resultadosobtenidosmediantelos estudiosdeanisotropíade fluorescencia. La a-sarcinadesestabilizalas membranasde DMPS, induciendomezclade lípidos entrediferentesvesículastal y comosededucede los ensayosdevariaciónde transferen- cia de energía. Así, la adición de a-sarcinaa una mezclade vesículascompuestapor vesículasmarcadascon las sondasfluorescentesNBD-PE y Rh-PEy vesículassin marcaje a una relación molar (1:9), produceun aumentode la intensidadde fluorescenciadel NBD-PE (donante)y simultáneamenteunadisminuciónde la intensidadde fluorescencia de la Rh-PE (aceptor) (figura 6). La disminución en la transferenciade energíaes dependientede la concentracióndea-sarcina(figura 7). El porcentajede transferenciade energía(%ET) disminuye desdeun 80% inicial hasta un 25% a una relación molar DMPS/a-sarcinade 140:1.Dichadisminucióncorrespondea unadilución de la densidad superficial del aceptorde 10 veces (recuadrofigura 7). La adición de a-sarcinaa una 0.01 0.02 0.03 R RESULTADOS Y DISCUSION 44 poblaciónde vesículasmarcadasfluorescentementeno producecambioalgunoen la señal de fluorescencia,por lo que, en principio, los cambiosen el tamañode las vesículastras la interacciónconcx-sarcina,no interfierenen la medida.Lo mismo podríadecirsede la posibledispersiónprovocadapor la turbidezde la muestra.De todo ello sederiva que la variación en la señal de fluorescenciaes debidaa unamezclade lípidos entredistintas vesículasy posterior difusión de las sondasfluorescentesen el plano de las vesículas resultantes. 9= 90 80 70 Figura 5. Variación relativa del incremento de entalpí a (AH) frente a la relación molar a-sarcina/DMIPS (R). Los valoresde AH sehancalculadocomoel áreabajo el pico de variación dela capacidadcalorimétricacon la temperaturaasociadaa la transiciónde fasede la DMPS. Los valoressehanreferidoal obtenidocon DMPS en ausenciadeproteína.Las muestrasseprepararon en tampón Mops 50 mM, pH 7.0, conteniendoNaCí 0.1 M y EDTA lmM. Los valores representanel promediode tres medicionesindependientes. La existenciade mezcla de lípidos entre diferentesvesículas puede derivarse asimismode medidasde polarizaciónde fluorescenciade una población de vesículasde DMPG y DMPS ambasmarcadascon DPH. La figura 8 muestrala transición de fasede una disolución de dichas vesículas a una relación molar (1:1). Se observan dos transiciones,la primerade las cualeses debidaa las vesículasde DMPG (T,,~ 230C) y la segundaa las de DMPS (Tm= 350C). La adiciónde a-sarcinaelimina estecomporta- miento determinandola apariciónde unaúnicatransicióncon una T,,,= 280C (figura 8), lo cual corresponderíaa unabicapamixta DMPG-DMPS.Cuandoen estemismo sistema 0.01 0.02 R 0.03 RESULTADOS Y DISCUSION 45 se empleanrelacionesno saturantesde a-sarcina/lípidose observa,junto a la principal transicióncorrespondientealas vesículasmixtas,unapequeñatransición que corresponde- ría a vesículasde DMPS. Cuando el sistemaestácompuestopor vesículasde DMPS y vesículasde DMPC no seobserva la aparición de una transición intermedia lo cual está de acuerdocon la ausenciade interacciónconfosfolípidos neutros(Gassetel al., 1989). F 12 8 4 Figura 6. Efecto de la a-sarcina sobre la variación de transferencia de energía entre las sondas NBD-PE Y Rli-PE incorporadas en vesículas de DMIPS. Se mezclaron vesículas de DMPS marcadas con las sondas fluorescentes NED-PE y Rh-PE (a una relación molar DMPS/NBD-PE/Rh-PE de 98:1:0.6) con vesículas no marcadas a una relación (1:9) en tampón Tris 50 mM, pH 7.0 conteniendoNaCí 0.1 M y EDTA lmM. La concentracióntotal de lípido es de 142 gM. A esta población de vesículas se añade a-sarcina hasta alcanzar diferentes relaciones lípido/proteína: (a) sin a-sarcina; (tI) 475:1; (c) 325:1; (d) 230:1; (e) 155:1; (1’) 95:1; (g) 60:1. El espectro (g) es el obtenido con vesículas compuestas por DMPS/NBD-PE (100:0.1). Los espectros de emisión se obtuvieron tras incubar la muestra 60 mm a 42 0C, empleandounalongitud de onda de excitación dc 450 nni. La intensidad de fluorescencia (F) se expresa en unidades arbitrarias. 520 560 600 nm RESULTADOS Y DISCUSION 46 DISCUSION Los resultados obtenidos demuestran que la toxina cr-sarcina interacciona con vesículasunilamelaresgrandesde DMPS a pH neutroy baja fuerzaiónica 0.1 M NaCí, produciendosuagregacióny mezclade lípidos. Las primerasetapasde la interacciónson esencialmentede carácterelectrostático,tal comolo demuestrala dependenciade la unión con la fuerza jónica. Los ensayosde unión llevados a cabo a 0.3 M NaCí indican la ausencia de unión. Los procesosderivadosde la interacciónentrela a-sarcinay vesículas, evidentemente,no seobservanen estascondiciones;no seobservaagregaciónni mezcla de lípidos, así como efectossobre el comportamientotermotrópico. Sin embargo, la interacciónentrela citotoxinay las vesículasde DMPS no esexclusivamentede carácter %RET 80 60 40 20 Figura 7. Mezcla de lípidos entre vesículas de DMPS inducida por a-sarcina. Efecto de la a-sarcina sobre el porcentaje de transferenciade energía(%ET) entrelas sondasNBD-PE Y Rh-PE (ver parte experimental) frente a la concentración de a-sarcina (nnio]es/ml>. Los espectros de emisión de fluorescencia se obtuvieron tras incubar la muestra60 mm a 42 0C. La concentración total de DMPS es 142 ¡tM. Recuadro: variación del porcentaje de transferencia de energía entre las sondas NBD-PE y kh-PE frente a la densidad superficial de Rh-PE. Las medidas han sido realizadas a una concentración constante de 1 ‘7v. 2.0 Inflo] RESULTADOS Y DISCUSION 47 electrostático, como lo demuestra el hecho de que una vez producida la interacción ésta no revierte totalmente al aumentar la fuerzaiónica. En estesentido,el ÁA3~1,,,, producido comoconsecuenciade la agregaciónde vesículasde DMPS por la cr-sarcina no alcanza línea base tras aumentarla fuerza iónica hasta0.3 M NaCí. Asimismo, la existenciade interaccionesno iónicassededucede los efectosqueejerce la proteínasobrela transición térmicade los lípidosentrela fasegel y líquido cristalino. La disminuciónde la amplitud de la transición ha de interpretarsecomo que un porcentajede moléculasde fosfolípido no participanen la transicióncooperativa. 0.3 02 0.1 Figura 8. Variación de anisotropía de fluorescencia DPI! de vesículas de DMPS-DPH y vesículas de DMiPG-DPH. Perfiles detransiciónde fasedeunadisoluciónde vesículasformada por vesículasde DMPS y vesículasde DMPG a unarelaciónmolar (1:1>. Las relacionesmolares lípido/proteína firron: (1) en ausenciade a-sarcina;(2) 100:1; (3) 30:1. Los análisis se llevaron a caboen tampónMops 50 mM, pH 7.0, conteniendoNací 0.1 M y EDTA 1 mM. r RESULTADOS Y DISCUSION 48 La existenciademezcladelípidos entrediferentesvesículasde DMPS inducidopor la a-sarcinaconlíevanecesariamenteunaprevia desestabilizaciónde membranas,lo cual sugiere fuertemente la presenciade interaccionesno iónicas. Estos resultados son cualitativamenteigualesa los obtenidoscon el fosfolípido DMPG (Gasseta al., 1989, 1990). La similitud de efectosproducidospor la a-sarcinasobre las vesículasde DMPG y de DMPS sepuedenexplicarconsiderandoel carácterácido de ambosfosfolípidos, 100 80 60 40 20 Figura 9. Efectos producidos por a-sarcina en vesículas de DMPS a diferentes relacionesproteína/lípido(P~/LJ. (U) Unión, (@) agregacióny (A) mezclade lípidos. Los valores se expresan como porcentajes (%) de: la máxima unión observada, la máxima agregación (calculadaa partir del máximo aumentode abosrcióna360 nm) y máxima mezcla de lípidos (calculadaa partir de la máximadisminuciónde la transferenciade energía). 0.01 0.02 0.03 RESULTADOS Y DISCUSION 49 ambosposeenla misma carga neta, así como teniendoen cuentaque poseenla misma forma y tamaño. Sin embargo,la constantede disociaciónderivadade los ensayosde unión es diferentepara uno y otro: 3.10.6 M paraDMPS y 6.108 M paraDMPG. Estas constantesde disociaciónaparentessehancalculadoconsiderandola situacióndeequilibrio “proteínalibre” + “sitios lipídicos de unión” ~ “proteínaunida”. Sepuedeargumentar que este formalismoes esencialmenteválido parala unión de proteínasextrínsecasa la superficiede membranas,ya que el equilibrio consideraque la proteínase intercambia entrelos sitios lipídicosy la faseacuosa.Sin embargo,en la interacciónentrea-Sarcina y lípidos existeun componentehidrofóbico, relacionadocon la inserciónde la proteínaen la bicapa. Independientementede este razonamiento,este tratamiento resulta útil en términoscomparativos,aportandodiferenciasen cuantoa la afinidadde la proteínafrente a DMPS y DMPG. Existen,por todo ello, otros factoresque intervienenen la interacción apartede los puramenteelectrostáticos. Ambos fosfolípidos poseenla mismascadenasde acilo y carganetaa pH neutro, sin embargo,sondiferentesen términosde capacidaddeestablecerpuentesde hidrógeno (Boggs a al., 1980, 1986). La fosfatidilserinapresentapuentesde hidrógenoa nivel de la cabezapolarqueno estánpresentesen el fosfatidilglicerol (PG). La fosfatidilserina(PS) poseedos grupos cargadosnegativamentey otro positivamente.Un grupo con carga negativa podría establecerinteraccioneselectrostáticascon grupos catiónicos de la proteína, mientras que el otro podría participar en el establecimientode puentesde hidrógeno con otras moléculasde fosfo]ípido. De hecho,se ha afirmadoque el grupo fosfato está implicado en la formación de puentesde hidrógenocon el grupo amino de otras moléculas de fosfolípidos (Boggs et al., 1986), aunqueesto no ha sido puestode manifiestoinequívocamentepuesel grupocarboxilo tambiénpuedeparticiparen la red de puentesde hidrógeno. La carga neta negativa de las moléculas de PS determina la existencia de repulsión electrostática entre ellas, Jo cual tiene como consecuencia un debilitamiento de la red de puentesde hidrógeno intermoleculares(Cevc et al., 1981; Koshy y Boggs, 1983; Boggs et al., 1984). La neutralizaciónde las cargasnegativasde la PS debido a la interacción con grupos básicos de la a-sarcinapuede tenercomo consecuenciaun debilitamientoo un reforzamientode dicha red de puentesde hidrógeno. La consideraciónde estasdos posibilidadesimplica una diferenteinteraccióncon los dos gruposnegativosde la cabezapolar de la PS.Esto seha sugeridocomoexplicaciónde la interacción entre la gentamicinay la PS, donde el policatión parece interaccionar preferentementecon el grupo fosfato más que con el carboxilo (Chung a al., 1985). El reforzamientode los puentesde hidrógenotras la interaccióncon a-sarcinapermitiríaun mayor empaquetamientode las moléculasde PS y, posiblemente,una mayor limitación en cuantoa la capacidadde interacciónproteína-lípido,lo cual se manifestaríaen una RESULTADOS Y DISCUSION 50 menorafinidad relativa. Asimismo, la interacción entre la a-sarcina y PS puedeprovocar un debilitamientoen la capacidadde formaciónde puentesde hidrógenode éstaúltima, en el casode que la interacciónelectrostáticaseprodujeseentregrupos catiónicosde la proteínay los grupos de la fosfatidilserinaimplicados en la formaciónde dichos puentes de hidrógeno.Sin embargo,esteúltimo tipo de interacciónno esprobablequeseproduzca debidoa que la interacciónde la proteínacon DMPG, fosfolípido queno puedeestablecer puentesde hidrógeno interlipídicos,es distinta a la observadacon DMPS. Por lo tanto, el reforzamientode la red de puentesde hidrógenotras la interacciónes, de las dos hipótesis manejadaspara explicar la menor afinidadpor la DMPS que por DMPG, la hipótesismásplausible.Ahorabien, los puentesde hidrógenoentrediferentesmoléculas de fosfolípido puedeocurrir a través de unamoléculade aguacomopuenteintermedio (Teissie et al., 1990). Estas moléculasde aguaformarían toda una red de puentesde hidrógeno cuya contribución a las interaccionesconproteínasno es bienconocida(Síater et al., 1993). La interaccióndediferentespéptidosseñalconfosfolipidosácidosseha explicado considerandola capacidadde éstos de establecerpuentesde hidrógeno. Un análisis estereoquimico revela que la formación del complejo lípido-péptido tiene como consecuenciala neutralizaciónde cargasy, por lo tanto, unadisminuciónde la hidrofilia del mismo (Kajavaa al., 1991). Estecomplejoimplica la formación del máximo número de puentesde hidrógenoentrela cabezapolardel fosfolípido y los gruposaceptores/dona- dores del péptido. Así, los complejos péptido señal-PGo péptido señal-PA son los preferiblespara una insercióndel péptidoen la bicapalipídica puescontienenel mínimo númerode grupos formadoresde puentesde hidrógenolibres (Kajava aal., 1991). Esta minimización ha de producirsepues las cadenasde acilo de los fosfolípidos no pueden participar en la formación de este tipo de enlace. Los puentesde hidrógenohan de saturarse,por lo tanto, intermolecularmente,entrela proteínay moléculasde fosfolípido, o intramolecularmente,induciéndosela formaciónde estructurasordenadasen la proteína (Kennedy, 1978). Se ha determinadoasimismo, que la actividad de translocaciónde proteínas en vesículasderivadasde membranasde una cepade E. coIl deficiente en la síntesisde PG era considerablementemenor que la mostradapor la cepasilvestre (De Vrije et al., 1988). La actividadde transiocaciónse restaurópor la incorporaciónde este fosfolípido graciasa la actividadde proteínastransferidorasde lípidos (Kusters et al., 1989). Cuandose comparala extensiónde la agregacióny de la mezclade lípidos, con la unión de a-sarcinaa las vesículas se puede observar un aspectointeresante.Los resultadosde las figuras3 y 8 sepuedenanalizartras su respectivanormalización,por lo RESULTADOS Y DISCUSION 51 que los tres procesospuedencompararseparacadarelaciónmolar proteína/lípido(figura 9). Así, la mezclade lípidos se saturaa unarelaciónmolar proteína/lípidoqueconstituye sólamenteun 20% de la unión total que puedellegara producirse.La máximaagregación seproduceaproximadamentecuandola uniónha alcanzadoun 50%. Estasobservaciones sugierenla existenciade al menosdos tipos diferentesde unión, los cualespodríanestar relacionadoscon la diferente interacciónen términosde puentesde hidrógeno.Uno de estostipos de sitiossesaturaríaa una relaciónmolar bajaproteína/lípido(1:150) y estaría directamente implicado en la inducción de mezcla de lípidos (o desestabilizaciónde membrana). El otro tipo de sitios, de menor afinidad, sería responsable de la uniónde la mayor parte de la proteína. La mezcla de lípidos promovida por la a-sarcinaentre vesículasde DMPG se saturaa un porcentajedeuniónsimilar al observadoconvesículas de DMPS; sin embargo, el máximo de agregacióny unión se producea relaciones proteína/lípidomenoresque las determinadasparaDMPS. Esto último tambiénestaríade acuerdo con la existenciade dos tipos de sitios de unión. En el caso de la unión a vesículasdeDMPS la neutralizaciónde cargasdebidoaal saturaciónde los sitios de unión de mayorafinidad tendríacomoconsecuenciaunapotenciaciónen la formacióndepuentes de hidrógeno,lo cual tendría,a suvez, la consecuenciade unadisminuciónen la afinidad de los restantessitios de unión. En este sentido, se ha observadoque la unión de una proteínaa una bicapapuedemostrarun comportamientoaparentementeanticooperativo, ya que la densidadde cargassuperficialesdisminuyea medidaqueseproducela uniónde la proteínaa la misma (Devaux y Seigneuret,1985). Un comportamientosimilar al descrito para la a-sarcinase ha observadoen la interacciónentrela proteínabásicade la mielina y vesículasde PS (Ramsayaal., 1986).En estecaso,una de las primerasetapas de la interacción, segúnse deriva de estudioscalorimétricos,estácaracterizadapor la formaciónde enlacesrelativamentefuertesentrela proteínay la vesícula(Ramsayet al., 1986).La caracterizaciónde esteúltimo sistemamedianteestudiosde difracciónde rayos X permiteobtenerconclusionessimilares (Sedzika al., 1984). Finalmente, este tipo de interaccionespuedenteneralgún tipo de relevanciaen cuantoa la situacióniii vivo, esdecir, en cuantoa las interaccionesqueocurrena nivel de la membranaplasmáticade las células diana sobre las que actúa la a-sarcina. En realidad, la membranaplasmáticaes unaestructurade carácterdinámico desdeel punto de vistaespacialy temporal.La composiciónlipidica de éstapuedevariar comorespuesta a variaciones ambientalesde modo que la célula puede desarrollar sus funciones fisiológicasen condicionesóptimas.Las diferenciasobservadasen la interacciónentre la a-sarcinay vesículasde PG y PS pudieratenersignificadobiológico. Desdeestepunto de vista, las células tumoralesposeenun mayor contenidode PS en la monocapaexterna de la membranaplasmáticaquesuscorrespondientescélulasno transformadas(Connoret RESULTADOS Y DISCUSION 52 al., 1989; Utsugieta!., 1991; Zachowsky, 1993).Estehechopodríaestarrelacionadocon la actividad antitumoral que demuestrala a-sarcinay que fue la primera actividad determinadaparala proteína(Goldin et al., 1966). RESULTADOS Y DISCUSION 53 2. TRANSLOCACION DE a-SARCINA A TRA VES DE LA BICAPA LIPIDICA DE DE Fotomarcajehidrofóbicode la rr-sarcina Con la finalidad de estudiar la posible inserción de la a-sarcina en el interior hidrofóbico de las bicapas de asolectina(PC 24%, PE 39%, PS 19%, PA 6%, PI 1%, lisoderivados9%, otros fosfolípidos2%) sellevaron a cabo experimentosde fotomarcaje empleandovesículasqueposeentrazas de dos tipos de fosfolípidos fotoactivables (figura 10). Cuandoa estos fosfolípidos se los sometea iluminación con luz UV de longitud de onda larga se produce la generaciónde intermediarios reactivos capacesde marcar moléculasvecinas. PC-> poseeel grupo fotoactivable(nitroarilazida)próximo al grupo polar, por Jo quetal reactivoserviríade sondade la región cercanaa las cabezaspolares de los fosfolípidos. PC-II poseeel grupo fotoactivablea nivel del carbono12 de las cadenasde acilo de los ácidosgrasos,por lo que sirve de sonda del núcleo hidrofóbico de la bicapa. La capacidadde tales sondaspara discriminar entre regionesde proteínas insertadas en la bicapa, a diferentes niveles, de regionesqueno lo estánhasidopuestade manifiestoanteriormente(Bisson y Montecucco,1985, 1986; Montecucco,1988). o O—P0’\N (&H) ~ ¿o e o o c=O oto N Q 3 NO 2 o It P-o N(’tH ~ s PC II Figura 10. Estructura de los fosfolípidos que portan los grupos fotoactivables. (PC-I) 1 -palmitoil-2-(2-azido-4-nitroenzoil)-sn-glicerol-3-flI-fl-fosfocolina; (PC-II) 1 -miristoil-2-{ 12-4(4- azido-2-nitrofenil) amino] dodecanoilj}-sn-glicerol-3-[’4C]-fosfocolina. O NO 2 . Tal comoapareceen esta figura, a las 4 horas de incubación ya puede observarse unasustancialdegradacióndecx-sarcina(figura 13, pocillo 2). La degradacióndea-sarcina,en las condicionesexperimentalesempleadas,sólopuede deberse a la digestión intravesicular catalizada por tripsina, ya que cualquier traza de proteasa que pudiese haberalcanzadoel medioextravesicularestaríatotalmenteinhibida. Este hecho quedaconfirmadopor los siguientescontroles: i) una relación 2:1 en peso inhibidor/tripsina es suficiente para inhibir totalmente a la proteasapresenteen el medio n 1- o c 60— u 40— 20- h Figura 14. Cinética de la degradación de nc-sarcina por tripsina encapsulada. Se incubó a-sarcina (2.9 gM) con vesículasde asolectinaque contenían tripsina en su interior, en 0.2 ml de Mops 50 mM, pH 7.0 con NaCí 0.1 M, bajo las condiciones especificadasen la parte experimental.El porcentajede proteínano degradadapara cadatiempo fue evaluadomediante análisis densitométrico de los geles de poliacrilamida correspondientes.Los valores son el promediode cuatro medidasindependientes. e e e e e ¡ ¡ 4 8 12 16 20 24 RESULTADOS Y DISCUSION 58 extravesicular(enestosensayosseempleaunarelación 15-20:1); u) la incubacióncona- sarcina de los sobrenadantesobtenidosde los lavados de las vesículas no induce su degradacióntríprica; iii) no seobservadegradaciónde a-sarcinacuandolas vesículasse lisan conTriton X-I0O (figura 13, pocillo 4), lo cual significaquela tripsina encapsulada seríainhibidatotalmentesi estuvieraen el medioextravesicular.En ausenciade inhibidor de tripsina la lisis de las vesículas con Triton X-l0O determina la digestión total de a- sarcina(figura 13, pocillo 6>. Si estosexperimentossellevana cabocon vesículasde PC, con las que no interaccionala a-sarcina(Gassetet al., 1989, 1990), no se observa degradaciónintravesicular (figura 13, pocillo 3; controles en los pocillos 5 y 7). El volumenencapsuladopor vesículasde PC de huevoes, sin embargo,menor queel de las vesículas de asolectina (Hope er al., 1985), con lo que la menor cantidadde tripsina encapsuladapodríaexplicarel hechode no observarseuna degradacióntotal de a-sarcina cuando las vesículasson lisadas con Triton X-100 y en el medio no está presenteel inhibidor de tripsina (figura 13, pocillo 7). Este resultadodescartaa su vez cualquier posibilidad relativa a la adsorción inespecífica de tripsina en la superficie de las vesículas lipídicas. Asimismo, se requieren aproximadamente 24 horas de incubación para observarse una degradación tríptica total de a-sarcina a una relación en peso de 50:1 (a- sarcina/tripsina> en ausenciade vesículas,aun cuando el contenidoen lisina más arginina de estaproteína esrelativamente alto (15% del contenido toral de aminoácidos). Por otra parte, otra seriede experimentosde digestionestrípticasdea-sarcinademuestranque las vesículas la protegenfrente a la proteolisis extravesicular.De hecho en estas últimas condicionesno seobservadegradacióntotal de a-sarcina(Oñaderraet al., 1989). En la figura 14 aparecela dependenciacon el tiempode la digestióndea-sarcina por tripsina encapsulada.A las 24 h prácticamentetoda la proteínaha sido digerida.Un análisisde esteprocesomedianteelectroforesisen gelesde poliacrilamidaen presenciade SDS aparece en la figura 15. La intensidadde la bandacorrespondientea la a-sarcina disminuye con el tiempo, lo cual reafirma la accesibilidadde la proteínaa la tripsina intravesicular. DISCUSION La a-sarc¡naseclasificacomo una proteína inactivante de ribosomas de tipo ¡ (RIP 1) (D’Alessio et al., 1991). Estas proteínas están constituidas por una sola cadena polipeptídica,que en numerososcasosseencuentraglicosilada(Lord et al., 1991). Las RIPs de tipo II sin embargoestáncompuestaspor dos cadenaspolipeptídicas,una de las cualesposeela capacidadde unióna un receptorde membrana(Lord a al., 1994>.Ambos RESULTADOS Y DISCUSION 60 tes,siendola causade la citotoxicidad la inhibición de la síntesisde proteínas(Turnay et al., 1993). En cualquiercaso, la citotoxicidadde las RIPs de tipo 1 es menor que las de tipo II debido a la ausenciaen las primeras de una cadena polipeptídica especializadaen la unión a un receptor de membrana(Stirpe ez al., 1992). En este sentido, se ha demostradoque la cx-sarcina tiene la capacidadde interaccionar con vesículas de fosfolípidos (Gassetet al., 1989, 1991a),produciéndosecambiosconformacionalesen la proteína(Gasseta al., 1991b), que sehan explicadoen términosde unacombinaciónde interaccioneselectrostáticase hidrofóbicas. Tales interaccionesse han sugeridocomo implicadasen el procesode translocaciónde la proteínaa travésde la membranacelular. Enestesentido,seha propuestoquelas proteínastranslocadasensistemascelularesdeben pasara través de la membranapor un entornohidrofilico de naturalezaproteica(Gorlich a al.. 1992; Vestwebera al., 1989). Sin embargo,el papelexactoquejueganlos lípidos en la translocación de proteínas no se conoce, llegando a proponerse procesos de translocacióna través de la bicapalipídica sin el auxilio de proteínascatalizadoras(von Heijne y Blomberg, 1979: Wickner, 1979; Engelmany Steitz, 1981). Los experimentos mostrados aquí pretenden demostrar la capacidad de la a-sarcina de translocarsea travésde la membranaplasmáticade vesículasmodelo de asolectina,lo cual sería una prueba directa de la capacidad intrínseca de la proteína para actuar sobre membranas y. como consecuencia de ello, translocarsea su través. Los ensayosde fotomarcajeaporraninformación sobrela inserción de proteínasen membranassiempre que los reactivos fotoactivablesdiscriminen inequívocamenteentre las regiones de la proteínainsertadasde las que no lo están(Harter a al., 1988). En este sentido, se ha comprobado que las sondas empleadas en estos experimentos son adecuadas para ello (l3isson y Montecucco, 1985, 1986; Papini et al., 1987; Montecucco, 1988). Los resultadosobtenidosconel sistemaa-sarcina- vesículasde asolectina,sonuna evidencia experimentalde la inserciónde la proteínaen la bicapa.Esta inserciónno sólo se limitaría a la región de la cabezapolar de los fosfolípidos (marcaje positivo con PC-I) sino que se extiendería a la región de las cadenas de acilo de los mismos (marcajepositivocon PC-II). Además,la a-sarcinaescapazde digerir tRNA encapsuladoen las vesículas,así comode ser digerida por tripsina encapsulada.Estas dos series de ensayos aportan sólidas evidencias del paso de la proteína al interior vesicular. En la primera serie de ensayos,la translocaciónse ha registradoempleandola actividad ribonucleolítica de la a-sarcinacomo marcador. El tRNA encapsuladoen el interior vesicular es accesible a la proteína añadida al medio extravesicular si ésta consigue penetrar al interior en estado enzimáticamente activo. Sin embargo, la observaciónde digestión de iRNA no es una pruebainequívocade entradaal interior vesicularpuesen RESULTADOS Y DISCUSION 6J estecaso, existe la posibilidadde liberaciónde estamoléculaa! mediotras la interacción de la ct-sarcinacon las vesículas.En nuestrascondicionesexperimentalesestaposibilidad no puederesolversepuesno se ha inhibido la actividad ribonucleasaextravesicular. En la segunda serie de experimentos se ha empleado la actividad triptica intravesicular como indicador de translocación. En este caso, la a-sarcina añadida extravesicularmentees accesiblea la tripsina intravesicularsi la toxina es capazde pasar a través de la bicapa lipídica. Las condiciones experimentales en esta segunda serie de ensayospermiten descartartodaposibilidadde digestióntrípticaextravesicular,por lo que la digestión de a-sarcinasignificaría inequívocamenteque éstaha pasadoa través de la membrana.En la escalade tiempo en la que sedesarrollanlos ensayos,la inhibición de la tripsina que pudiera encontrarse extravesicularmente es tal que aun liberándose toda la tripsina encapsulada desde el comienzo de la incubación con a-sarcina ésta no se digeriría. La capacidad de la cx-sarcina de acceder al interior vesicular depende de la naturaleza del lípido empleado, de hecho, la cx-sarcina no es digerida por tripsina encapsuladaen vesículasde PC de huevo ni resultamarcadapor sondasincorporadasen tales vesículas(Gassetet al., 1991a>, todo lo cual está de acuerdocon la ausenciade interacciónentre a-sarcinay vesículasneutras(Gassetej al., 1989). Un requerimientode lípido similar se ha determinado para la translocación del apocitocromoc en sistemas modelo (Rietveld et al., 1986). Asimismo, los requerimientos en cuanto al componente lipídico de diferentes toxinas para translocarseen condicionesóptimas son variados (Sandvigy Olsnes, 1980; Tomasi y Montecucco, 1981). RESULTADOS Y DISCUSION 62 3. PREDICCION DE LA CONFORMACION DE LA PROTEINA a-SARCINA: MODELO ESTRUCTURAL PARA EXPLICAR LA [NThRACCION a-SARCINA- MEMBRANAS. La c~-sarcinaexhibeun elevadogradode similitud de secuenciacon otrasproteínas inactivantes de ribosomas de Aspergillus (86% de identidad con mitogilina y restrictocina, ambas de A. restrictasy 85% conel alergeno1 (Asp fi) de A. fumiganis)(figura 16). Sin embargo, esta similitud estructural es de escasa utilidad para el análisis de la conformación de la a-sarcinaya que no existen datos de la estructuratridimensional de estas tres proteínas.Pero la a-sarcinamuestratambiénun alto gradode similitud de secuenciacon otras ribonucleasas(RNasas>.Hay al menostres subfamiliasde RNasasmicrobianasde las que la RNasa Ti, barnasa y RNasa St son los representantes característicos (Nakamura 10 20 30 40 SAÑG AVThTCLNDQKNPKTNRYETICRLLYNQNKAESNSHHAPLSDGKTGSSYPH MITO ATWTCINQQLNPKTNKWEDKRLLYNQARAESNSHHAPLSDGKTGSSYPH FUVh ATWTCINQQLNPKTNKWEDKRLLYNQAKAESNS~PLSLGKTGSSYPH **** * * ****** * ******* 60 70 80 90 SARG WFTNGYDGDGKLPKDRTPIRFGKSDCDRPPKHSRLGNGKTDHnLEFPTF MITO WFThGYDGNGKLIKGRTPIKFGKADCDRPPKJiSQNCMGY~DHnLEFPTF FUT41 WFTNGYDGNGKLIKGRTPIRFGKAflCDRPPKESQNGMGxnnHy)4~~pp~~ ************ * ******** ********* * ** 110 120 130 140 SARG PDGHDYKFDSKKPXENPGPARVIYTYPNKVFCGIIAI!TKENQGELKLCSE MITO FDGHDYKFDSKK?KENPGPARVIYTYPNXVFCGIIA3QRGUQGDLRLCSH EGMI PDGHDYKFDSKKPKEDPGPARVIYTYPNKVFCGIIABQRGNQGDLRLCSH *************** ********************* *** * **** Figura 16. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de ot-sarcina (SARC) (Sacco a aL, 1983), mitogilina (MITO) (Fernández-Luna el al., 1985) y alergeno Mp (.1 (FUMI) ~Moserel aL, 1992). La numeración de las secuencias se establece con respecto a la de la a- sarcina. Los residuosde aminoácidosconservadosen las tres proteínas están marcados con el símbolo (*). La secuenciade aminoácidosde la restrictocinase diferenciade la correspondiente a la mitogilina en un solo aminoácido: en la restrictocinaapareceuna serma en la posición26 (Lépez-Otín ezal., 1984),mientras que en la mitogilina es una Asn. RESULTADOS Y DISCUSION 63 1 1 ACDYTC GSNCYSSSDV STAQAAGYQLEEflGETVGSNSYPH RNC2 ncnrrc GSECYSASAV SLAQSAGYQLQSAGQSVGRSRY?H RN1~S ESCEYTC GSTCYWSSDV SAAXAXGYSLYESGDTI flDYPH KNP? ACAATC GTVCflSSAI SSAQAAGYNLYSThD~V SNYPH ESATTC GSTNYSASQV RAAMAACQYYQNDDSAGSTTYPH RNL’1 EGGVSVNC GGTYYSSTQV NRAINNA KSGQYSSTGYPH P1U32 CDIPQSTNC GGNVYSNDDI NTAIQGALflDVM~GD& PDFYPH SARO AVTWTCLNDQnWKTNKYETXRLLYNQ~XSNSflAPLSDGXTGSSYPH 0 000* 00 * 0 0 0 0 0 oo~~ e 1 1 1 1 A 1 RNAT ¡(Y NNYEG FDPS VS sri YEWPIL RNC2 QY E~YEG FNPP VS GWZr YEWPIL RNI’1S EY EflYEG EIiPP VS GV! YEYPIM RNFB nr HNYEG WFP VS GV! YEFPIL RNF1 TY NNYEG FD~P VD GPY QEFPIL RNU VI NNYEG FDFSDY CD GPY XEYPLK RNfl2 QY ‘IDEAS DQrTLC CG - PGSW SEFPLV SARC WFTNGYDGDGXLPKGRTPIXFGXSDCDRPPRHSIWGNGXTDEYLLEFPTF coaco 0 00 0 ~ 1. 1 A0 REAT SSGDVY SG GSPGADRVV?N SNNQLAGVITHTG ASGNNFVECT RNC2 SSGSTY NG GGPGADRVVFN DNDELAGLITHTG ASGDGFVACY RNMS SnYDVY TG GSPGALRVIFD GDDELAGVITHTG ASGDCFVACSSS pypg KSGKVY TG SSPGADRVIFN DDDELAGVITHTG ASGNNFVACT RNFI SG GVY TG GSPGALRVVIN TNCEYAGAITHTG ASGNNFVACSGTN RNTJ1 TSSSGY TG GSPGALRVVYDSNDGTFCGAITHTG ASGNNFVQCSY RIII’2 YNGPYY SSRDNCSPGPDRVIYQTNTGEFCATVTETGAASYDGFTQCS SARC PDG1~YKFnSXXPXENPGPARVImP~VYCGIIAETX DQGELSLCSZ 00 * ** **0o O cO000** 0 *0 Figura17. Alineamiento múltiple de secuencias de diferentes ribonucleasas fúngicas. Alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidosde a-sarcina(Saccoet al., 1983) (SARC), RNasa TI de Aspergillusoryzae(Takahashi, 1985) (RNAT), RNasa C2 de Aspergillusclavatus (Bezborodovaet al., 1983) (RNC2), RNasaFI deFusariumnionlilforme (Hyrabayaskiy Yoshida, 1983) (RNFI), RNasaMs deAspergillus saltol (Watanabe et al., 1982) (RNMS). RNasaPbl de Penic¡llium bevicompactum(Shlyapnikov e: al., 1984) (RNPB), RNasa Ul (Takahashi y Hashimoto, 1988) (RNU1) y RNasaU2 (Kanayay Uchida, 1986) (RNU2). ambasde Ustilago spherogena.Los residuosconservadosen las 8 proteínasaparecenmarcadoscon el símbolo (*). Los residuosde la a-sarcinaconservadoso querepresentansustitucionesconservativasenal menos otras 2 proteínasaparecenmarcadoscomo (O). Se hanconsideradolas siguientesequivalencias: Trp = Tyr Phe; Ala = Gly; Ser = Thr; Val = He; Asn = Gín Mp Glu; Arg Lys. (S) residuos que participan en la catálisis; (A) residuosque interaccionancon la molécula de fosfato: (~) residuosqueinteraccionancon la basedel nucleotido;(fil) residuos que interaccionan con la moléculade ribosa. La funcionalidaddelos residuosesde la RNasaTI. RESULTADOS Y DISCUSION 64 etal., 1982).La a-sarcinamuestraun significativo gradode similitud con las subfamilias representadaspor la barnasay la RNasa St, aunqueeste grado es menor que el que presentacon las proteínasde la subfamiliade la RNasaTI. En la figura 17 apareceun alineamientomúltiple de la secuenciade la a-sarcina y las secuenciasde todaslas RNasasde la subfamiliade la RNasaTi conocidashastael momento.De acuerdoconestealineamientohay 15 posicionesidénticasen las 8 proteínas consideradas.Teniendoen cuentalas equivalenciasde carácterconservativoindicadasen la figura 17, la cx-sarcinaposeeríahasta50 residuosde aminoácidosconservadosen tres o más secuencias.Asimismo de los datos de la figura 17 se puedeafirmar tambiénque sólo 7 residuos conservadosen las proteínasde la subfamiliade la RNasaTI sufren cambiosno conservativosen la a-sarcina:Gly por Lys-14; Ala por Lys-29; Asp por Ala- 120; Thr por Ala-136; Gly por Lys-139; Ala por Glu-140 y Phe por Leu-145 (para la numeraciónsetomacomoreferenciala secuenciade la a-sarcina).Estoscambiossuponen un aumentonetode la cargapositivade la a-sarcinacon respectoal restode las proteínas consideradas.La similitud de secuenciade aminoácidosentrela a-sarcinay el restode las ribonucleasasfúngicasse extiendea prácticamentela mitad de la moléculade las RNasas ya que la a-sarcinacontieneaproximadamente40 residuosmásque las otrassietepro- R=:A: —C— RNC2 —~~= 2 KNNS RNPB RNF1 RNhJ 1 RNJ2 e— S kRO 6—c Gr—c 8’—c —sé 6—e —c—11 24C ~82 5I~ CV 87 c 53 54 76’ Figura 18. Distribución de los puentes disulfuro de las RNasas de la figura 17. Patronesde puentesdisulfuro de las 8 proteínasconsideradas.Los residuosdecisteinasealinean de acuerdoa los resultadosde figura 17. ‘l03 ---‘103 - 1 —‘103-e— —‘113• e— ~132 ‘148e— RESULTADOSY DISCUSION 65 teínas. Tal similitud comprende a los residuos localizados en el centro activo de la RNasa Ti (figura 17). Es importante resaltar que el Asp-15 de la RNasa TI, implicado en la coordinación de un átomo de calcio estaría sustituido por Arg-22 en la a-sarcina. El carácterno conservativode estasustitucióndescartaríala capacidadde uniónde esteion por la ~-sarcina.A este respecto,se ha verificado que la a-sarcinano une tales iones (Martínez del Pozo ej al., 1989). Los puentesdisulfuroseconstituyencomoimportantesrestriccionesconformaciona- les en las proteínas.Lasochoproteínasconsideradasposeendospuentesdisulfuro,excepto la RNasaU2, queposeetres. De acuerdoconel alineamientolas cisteinasimplicadasen estospuentesdisulfuro se localizaríanen posicioneshomólogas(figura 17). En la figura RNasaC2 RNasa Figura 19. Arbol filogenético de las ribonucleasasfúngicasconstruido a partir de de la matriz de distancia calculada con el programa ALIGN (Doolittle y Feng, 1990). El porcentajede desviaciónestándares 5.89. La distanciase expresaen unidadesrelativas. RNasa U2 - SARCl N A RESULTADOS Y DISCUSION 66 18 aparece un resumen del patrón de puentes disulfuro de las secuencias consideradas. Las ocho proteínas exhiben un puente disulfuro que acerca en el espacioalos extremosamino y carboxilo terminal. El segundopuentedisulfuro de la a-sarcinaseríaequivalenteal presenteen la RNasaUI y U2 (figura 18). El árbol filogenéticocalculadoa partir de la comparaciónde secuenciasaparece en la figura 19. Aunque la a-sarcinaaparecedistantecon respectode la mayoríade las proteínas debido a que presentaunos 40 aminoácidosmás, todas las proteínasestán relacionadas. Tres proteínasde la subfamiliade la RNasaTI, la RNasaTi, la RNasaFi y la RNasa Ms, están caracterizadasen términos de su estructuracristalina. Por lo tanto, puedenser útiles a la hora de predecir la conformaciónde la a-sarcina.La estructura tridimensionalde la RNasaTI (Pacee: al., 1991) es la mejor caracterizadade todasellas; asimismo, recientementese han determinadolas de la RNasaMs y la de la RNasaFi (Nonakae: al., 1993; Vassylyevet al., 1993), encontrándoseque todas ellas son muy similares. Un alineamientode las estructurasde estas ribonucleasasconsiderandolas coordenadasespacialesde sus C~ revela que las estructurasson coincidentesen una extensióndel 90% (los rms son menoresde 0.75 A) (figura 20). De acuerdocon la similitud observadaentre la a-sarcinay estegrupo de proteínas,el siguienteestudiode predicciónpara la estructurade la a-sarcinase basaen la estructurade estasribonuclea- sas. El alineamientode la secuenciade aminoácidosde la a-sarcinase ha llevado a cabo considerandolas regionesquecontienenelementosde estructurasecundariacomunesa las estructurasde las ribonucleasas(figura 20). Posteriormentese ha llevado a cabo la predicciónde estructurasecundaria. En la a-sarcinasepredicela presenciade 15 giros ¡3. Con la finalidad de asignar dichosgiros en la proteínaseconsideranlos siguientescriterios: los giros ¡3 predichosque serianhómólogosa lospresentesen la estructuratridimensionalde la RNasaTi seaceptan (6 en total); los giros ¡3 predichos en la estructurade la a-sarcinaen regiones no homólogasa regionesde la RNasaTi tambiénse aceptan(6 en total); sedescartanlos giros ¡3 homólogosa los predichosen la RNasaTi pero que no aparecencomotalesen la estructuratridimensionalde la misma (1 del total). Estasconsideracionesdan cuenta, por lo tanto, de 13 de los 15 giros predichos.Encuantoa los otros 2 giros ¡3, setiene que tener en cuentaque en la RNasaTi sepredicen10 giros 13 de los cualessólo 8 aparecen realmenteen la estructuracristalinade la proteínalibre (Paceet al., 1991),apareciendo uno más(en las posiciones1-5) cuandola proteínaseencuentraformandoun complejocon 2’AMP o 2’GMP (l-lakoshimael al., 1992). El otro giro ¡3 sobrepredichoen la RNasaTi RESULTADOS Y DISCUSION .1 SAR? N DQR NP RNA? A C RN>4S E S RNF1 E sZL~1 E-1 0* * —~2 &t K T N Y: Y ~E T Y: R L L G £ Wc~xsls s n y s G 5 70 Y wks ny s ~ ~FT~E’ SJ[A 5 0 V R E-2 * * * * YNQNKA TAQAAG AA KA Y: G AAANAA A- 1 * SAR? ESNSHHA RNA? ~SG RNPI D PLSDGK E TV DTT D TA * * * TGSSY GSNSY DDY G SS TY * * 2 G Y NNYE G EDYEG NNXEG SA?? KLPRGRTPI RNA? RNT’IS RNEi ¡ se aproxima razonablementeal derivado de Ja predicciónteórica (22%). Medianteespectroscopiade infrarrojo seobtienenvaloresde 17% de estructura ¡3 y 23% de láminas ¡3 de baja frecuencia(Gassete: al., 1991b). Las regiones extra de la a-sarcina serían regiones expuestas de la proteína, claramente relacionadas con “loops”, en las cuales el único elemento de estructura secundariaregular serían giros ¡3. Previsiblemente,por su carácter superficial, estas regionesno introduciríanalteracionessignificativas en el plegamientode la proteínaen comparacióncon la RNasaTi. De la figura 20 puedendeducirsefácilmentelas equivalenciasentrelos elementos de estructurasecundariapresentesen la RNasaTí y los predichosen la estructurade la a-sarclna.Asimismo,puedenobservarsedos discrepanciassignificativas,ambasrelativas a las doscadenas¡3 de tres residuos.El segmentoB2 en la RNasaTI no seprediceen la a-sarcina,mientrasquesí sepredice un segmento¡3 en una región extrade la a-sarcina (residuos69-71). Probablemente,la cadenaB-2 también estépresenteen la a-sarcina, RESULTADOSY DISCUSION 70 segúnse puedederivarde la similitud de secuenciaenestaregión. Aún así, la posibilidad de un error en la interpretación,no modificaríala validezdel modelo de plegamiento,ya que estacadena¡3 estáimplicadaen la denominadalámina ¡3 “menor” de las ribonucleasas fúngicas (Nonaka et al., 1993). Finalmente, se ha llevado a cabo el análisis de flexibilidad para la secuencia de la a-sarcina(figura 21). Aquellos residuosde aminoácidospresentesen la . DISCUSION La cx-sarcinainteraccionaconvesículascompuestaspor fosfolípidosácidos(Gasset e: al., ~989;Gassete: al., 1990; Gassete: al., 1991a, 1991b; Oñaderra et al., 1993). A consecuenciade estainteracciónseproducela agregacióny fusión de talesvesículas.El análisis de estos efectosha revelado la presenciaen la interacción de un componente electrostáticoy de un componentehidrofóbico. El primero es fácilmenteexplicablesi se considerala naturalezabásica de la a-sarcina(Sacco et al., 1983), mientras que el segundono lo es a priori, teniendoen cuentaque en la secuenciade la a-sarcinano aparecensegmentoslo suficientementehidrofóbicos que puedan dar cuenta de una interacciónhidrofóbicaconel núcleode las membranas.Sin embargo,tales interacciones hande ocurrir y, esmás,han de explicarseen el contextodel procesode translocaciónde proteínasa travésde las membranas,puestoque la a-sarcinaescapazde translocarse,en condicionesen las que dicho proceso dependeexclusivamentede la proteína, a través de vesículas modelo de asolectina (Oñaderra e: al., 1993). Obviamente, el plegamientode la cadenapolipeptídicade la a-sarcinadebeser tal que origine la apariciónde uno o varios núcleos hidrofóbicos de suficiente envergaduracomo para estar implicados en tales interaccioneshidrofóbicas.El estudiode prediccióntiene comofinalidad, por lo tanto, el buscartalesnúcleoshidrofóbicosoriginadosaconsecueniadel plegamientode la proteína. La a-sarcinamuestraun significativo gradode similitud de secuenciacon varias ribonucleasasfúngicas.Entre los residuoslocalizadosen posicioneshomólogasno sólose encuentranlos implicadosenel mecanismocatalítico,sino tambiénlos residuosde cisteina que formanpartedel puentedisulfuro que acercalos extremos N y C-terminalesde la cadenapolipeptídica.Estopodríaquererdecirque la restricciónconformacionalimpuesta por tal puentedisulfuro se mantieneen estegrupo de proteínas.Ya ha sido determinada RESULTADOS Y DISCUSION 71 la estructura cristalina de tres de estas ribonucleasas fúngicas. Las estructuras de la RNasa Ti y la de la RNasaMs son muy similares (Pacee: al., 1991; Nonaka e: al., 1993), mientras que la RNasa Fi muestra [igerasdiferencias con la de la RNasa TI. Estas diferencias están relacionadas con la organización de los puentes disulfuro y parecen estar limitadas a la región definida por los residuos 81-84 (Vassylyev e: al., 1993). Por todo ello, estegrupo de ribonucleasasfúngicas puederazonablementetomarsecomomodelo parael plegamientode la cadenapolipeptídicade la a-sarcina.Tomandocomo base los resultadosde losestudiosdepredicción,la estructuratridimensionalde la a-sarcinapodría no ser muy diferentea la de la RNasaTI. Comoprincipaleselementosestructuralesde la a-sarclnaestarían,al menos, 6 cadenas¡3 y una a-hélice, los mismos motivos que aparecenen la estructuracristalina de la RNasaTi, aun existiendo diferencias en la secuenciade aminoácidos.Los giros ¡3 predichospara la a-sarcinasepuedenrelacionar de un modo relativamentedirectocon los presentesen la RNasaTi. Por lo tanto, sepuede proponerque el plegamientode la cadenapolipeptídicade la a-sarcinaessimilar al de la RNasaTi. Segúnlos resultadosde esteestudio,la distanciaentrelos C~ de los residuos de cisteinaimplicados enel puentedisulfuro (Cys-6 Cys-148)de la a-sarcinaseríade 4.5 A, igualmentea la RNasaTI. La similitud del segundopuentedisulfuro de la a-sarcina es másdifícil de analizarpuestoque uno de los residuosde cisteinaimplicadosaparece en una región extrade la a-sarcina(posición 76). La región limitada por este “loop” contienea la mayoríade los residuosextrade la a-sarcina,por lo que la modelización resultamás delicada.Aun así, si seconsiderael alineamientomúltiple de secuenciasde la figura 17, los residuosde Cys-76y Cys-132de la a-sarcina,seríanequivalentesa los residuosVal-52 y Ala-87 de la RNasaTi; la distanciaentrelos C” de talesresiduosde la RNasaTI seríade 5.9 Á, distanciaquepermitela formaciónde un puentedisulfuro. De acuerdocon este modelo, la estructurade la a-sarcinaestaríacompuestapor un núcleocentral de cadenas/3 muy similar al presenteen la estructurade la RNasaTi (la lámina ¡3 mayor de las ribonucleasas fúngicas; Nonaka e: al., 1993). La principal característicade estenúcleo ¡3 es la presenciaen él de las cuatrohebras¡3 mayoresde la RNasaTi (Pacee: al., 1991). Precisamente,estascuatrocadenas¡3 se encuentranentre las regionesde mayorgradode similitud entrelas dos proteínas,lo cual proporcionaaún mássolidez al modelopropuesto. La lámina ¡3 que correspondería a la a-sarcina aparece en la figura 22. Esta estructuraposeela característicade definir un núcleohidrofóbico. Ambassuperficiesde la láminacontienenaminoácidosconcadenaslateraleshidrofóbicasaexcepcióndel Glu-96 y Arg-121; sin embargo,estosdos residuos,junto con la His-SO, son los potencialmente implicadosen el mecanismode catálisis. Por lo tanto, estassuperficiesson buenos RESULTADOSY DISCUSION ‘72 A1 54 120 Figura22. Lámina ~antiparalelaformada por la cuatro hebras fi más conservativas de la a-sarcina (b, d, e, y f de la figura 20). Los residuos en negrita aparecena un lado de la lámina ¡3, mientras que el resto lo hacenhacia el otro lado. Los residuosen círculos son los implicados en la catálisis en la RNasa TI. Los númerosrepresentanla posiciónen la secuencia. Las flechasindican los extremosC-terminalesde cadasegmento. candidatoscomoparticipantesen las interaccioneshidrofóbicasentrela a-sarcinay las membranaslipídicas. El plegamientotridimensionalde la a-sarcinaoriginaria un núcleo hidrofóbicoqueexplicaría las interaccioneshidrofóbicascon las vesículas. Según la similitud de secuenciaencontradaentre la a-sarcinay la RNasa Ti, preisamenteen el núcleo¡3, potencialmenteresponsablede la interacciónhidrofóbicacon membranas,cabríaesperarqueesta últimaproteínainteraccionasecon vesículas.Esto no seha observadohasta la fecha; sin embargo, hay que resaltar una diferencia clara entre ambas proteínas:mientrasque la RNasaTi es una proteínaácida, la a-sarcinaes una w L r F L 130 T F y G F N RESULTADOS Y DISCUSION 73 proteínabásica.Tal y comose ha indicadoanteriormente,la diferenciamássignificativa entre ambas proteínas es la presencia de regionesextra en la a-sarcina. Estas regiones extrason “íoops” que contienenun excesode cargapositiva. Es más, Lys-21, Lys-22, y Lys-29estaríacercanasentresí, en la superficiede la a 4 > •~ ‘o ~ 4> c> 4.> ~ ~ ~ ~ E ~ 4 > 4> — a> g<~ E ~ ‘— o ~ ‘~ e O 4> ~, ~ ~ 4 > ’~ ~ e a> ~ ~-‘j 4 > t.. ‘.4 -, 0 ~ ‘~ ~ .e- ~. ~ ~ e — - t ~ ~ cg ~ — ‘ 4> U ~ 4> a> t E > -~ ‘--‘4 -~ c~ 4> - ~ C~. 4) .~ 4> c~ ~ •~ e ~ cC ~ ’-’ E ~ e 2 ~ ~ ? a = ~E- ~ o a> . c¿ ‘; ~ o - ¡ ¿ a > < e ~> ~ z •~ ~ O u ~ ~ ~ e j -~ ~ t ~ z s ~ 3 ~ o — E - zu ~ z ~ > o ~ a> ~ re;-, 4> y e r-- ~ d a L .’-~ o 4 > O E ~ ts — ‘.4 4> •~ ~ > O ‘~ -~ ~ ~ re 4 > 4 > ~ o j O e 4> E - -— o ~ ~ C ~ 4> 0 0 te ,~ ~4> O ,~ — ~ E - ~ A -’ ~tj ~ 4> O s o “~ o ~t o e ”- 4 > 4 > ~ > lj a> ~ 4 > (U L N ) u~~I c’J — o — ci a-,o RESULTADOSY DISCUSION ‘7,7 miento del dímero de vesículas están implicadas interacciones proteína-proteína. La cinética de agregación obtenida con vesículas de fosfolípidos naturales (PG o PS) es claramente distinta a la obtenida con vesículas de fosfolípidos sintéticos (DMPG o DMPS) (figura 23A). Mientras queconestosúltimos seobservancurvassaturables,en el primer casoseobservaunadisminuaciónprogresivade la intensidadde luz dispersada, siendoestadisminuciónmenospronunciadacuantomenoresla concentraciónde vesículas. Este comportamientoya ha sido observadoanteriormenteen otros sistemas,y explicado en términosde la formaciónde grandesagregadosque reduciríanel númerode partículas dispersantes,con la consiguientedisminucióndel pasoóptico efectivo(DúzgUnesa aL, 1981). Sin embargo,tambiéntendríaque considerarseque la dependenciaangularde la dispersiónde luzparagrandesagregadospodríasersignificativa,aunqueparalas vesículas monómericasésta sea mínima (Wei et al., 1982). Las diferentescinéticas observadas podrían indicar que los complejos formados entre la a-sarcinay las vesículas de fosfolípidos naturales y los sintéticosson diferentes,a pesarde que la primeraetapadel procesodeagregaciónvengacaracterizadapor un mismoordende reacción.Estediferente comportamientoentrelos fosfolípidos naturalesy los sintéticostambiénsepuedededucir de los resultados obtenidos estudiando los valores de absorción a 360 nm de una suspensiónde vesículaslipídicas y a-sarcinaen situaciónde equilibrio (figura 25). Tanto para DMPG como para DMPS se obtienencurvas hiperbólicas, con un tramo inicial prácticamentelineal (Gassete: al., 1989), lo cual no seobservaconfosfolípidosnaturales. Es más, los valores de absorciónobtenidoscon DMPG o DMPS son mayores que los obtenidos con PG o PS, tal y como se espera de las curvas de dispersión. Medidas de las velocidadesde mezcla de lípidos por transferenciade energía por resonancia El proceso de mezcla de lípidos producido por la a-sarcina se ha analizado midiendo la variación de la transferenciade energía por resonanciade un sistema compuestopor vesículasmarcadascon 1% NBD-PE (donante)y 0.6% Rh-PE (aceptor) y por vesículasno marcadasen proporción 1:1. El estudiocinético seha llevadoa cabo paravesículasde diferentecomposiciónlipídica. Las figuras4 y 5 resumenlos resultados obtenidosconvesículasde DMPG. La adiciónde a-sarcinaproducemezclade lípidos tal comosededucedel incrementoen la intensidadde fluorescenciadel NBD-PE. La figura 26 muestrala cinéticade mezclade lípidos obtenidaparaunaconcentracióndeDMPG 150 $M y concentracionesde cx-sarcinacomprendidasentre 1 y 10 gM. Todas las curvas muestranun comportamientosigmoideo,resultadode un retrasoen el comienzodel pro- RESULTADOS Y DISCUSION 78 012 010 008 006 004 002 Figura 25. Aumento de la absorción a 360 nm de disoluciones de vesículas de diferentes tipos de lípidos tras la adición de ot-sarcina. Representación del incremento de absorcióna 360 nm de disolucionesde lípidos trasal adicióndea-sarcinafrentea la concentración de ésta (gM): (1) vesículasde PG de huevo(75 MM); (2) PS de cerebrobovino (75 gM); (3) DMPG (30 gM); (4) DMPS (30 gM). La cinéticade variación de absorciónde las diferentes muestras(1 ml volumen total) sedeterminóencubetastermostatizadasde 1 cm depasoóptico. Los valoresrepresentadosson los obtenidostrasla estabilizaciónde dichovalor de absorción.Estos son el promedio de tres diferentesmedidas. ceso. Esto sugierela existenciade un estadointermedio previo al procesode mezclade lípidos propiamentedicho. La velocidad máxima de mezcla de lípidos, calculadadel segmentolineal de las curvasde la figura 26, sealcanzatras un periodode tiempo que varíacon la concentracióndea-sarcina;así,cuantomayoresla concentraciónde proteína, menoresdicho periodode tiempo. Este estudiose ha llevadoa cabopara diferentes concentracionesde DMPG (entre 15 y 150 SM). Las velocidadesmáximascalculadasde estemodoparadiferentesconcentracionesde cr-sarcinay deDMPG aparecenen la figura 27A. Estas curvas tienden a saturarsea una concentraciónde a-sarcinade 10 pM aproximadamente.Por lo tanto, las velocidadesde mezclade lípidosa estaconcentración 0.1 0.2 0.3 QA PROTEINA (MM) RESULTADOS Y DISCUSION 79 de a-sarcina se han considerado como valores saturantes. Estas velocidades, en unidades de intensidad de fluorescencia por segundo, se han convertido en unidades de porcentaje de dínieros fusionados por segundo {%fd/s) para poder hacer una comparación directa, indenpendientementede las diferentes concentraciones de sondas fluorescentes para cada concentración de lípido. Los resultados aparecen en la figura 278. Es evidente que las velocidades máximas saturantescorrespondena un valor constantede %fd por segundo para todo el intervalo de concentraciones de DMPG considerado (entre 15 y 150 MM). Para calcular el orden de reacción del proceso de mezcla de lípido con respecto a la concentración de vesículas, los datos de la figura 27A se han representado como valores de (velocidad de formación de dímeros x concentración) vs (concentración), en una representación doble logarítmica. El resultado es una recta de pendiente uno (recuadro lo 8 6 & 4 2 Figura26. Estudio cinético de la variación de transferencia de energía producido por a-sarcinaen un sistemade vesículas de DMPG. La variación de la intensidad de fluorescencia a 530 tun trasexcitacióna 450 nm (F5~~) medidaen unidadesarbitrarias,serepresentafrente al tiempo (s>. Todos los registroscorrespondena una misma concentraciónde DMPG (150 ~iM), apareciendola concentraciónde a-sarcinaindicadaencadacaso. La disolucióndevesículasestaba formada por dos subpoblaciones:vesículas marcadas(NBD 1%; Rh 0.6%) y vesículas flO marcadas,en proporciónmolar (1:1). Los experimentosse realizarona 37 0C. figura 278), lo cual indica que la reacción de mezcla de lípidos es de primer orden respectoa la concentraciónde fosfolípidos. Esteresu]tadoes el esperadosi el procesode fusióncomotal seproducea partir de un complejode vesículasagregadascuyaformación 10 20 30 40 50 60 70 80 s RESULTADOS Y DISCUSION 80 no es cinéticamente limitante respecto al proceso de desestabilización de las membranas propiamente dicho. El carácter sigmoideo de las cinéticas de mezclade lípidos es dependientede la relación proteína/lípido. En la figura 28A aparecen las cinéticas de variación de intensidad de fluorescencia de NBD-PE para diferentes relaciones molaresproteína¡DMPG.A la mayor relación considerada aparece un comportamiento hiperbólico, mientras que a medida que la relación proteína/lípido disminuye las cinéticas van siendo progresivamente sigmoideas. Este hecho sugiere que en el estado intermedio responsable del comportamien- to sigmoideo están implicadas interacciones proteína-proteína. Para obtener información sobre este proceso se ha definido el parámetro t11= como el tiempo necesariopara alcanzarse el 50% de la máxima variación de fluorescencia. La representación de los 60 50 40 30 20 lo log (DMPG) 1.0 1.4 1,8 O 2.8~ ci Figura 27. Velocidades de mezcla de lípidos producidas por a-sarcina sobre vesículas de DMPG. Representaciones de las velocidades de mezcla de lípidos (medida en unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia a 530 nm tras excitación a 450 nm, F5~ nm’ por segundo; F5~ ~~/s)frente a la concentración de proteína (M). Las concentraciones totales de lípido aparecen en cada trazo (15, 60, 105 y 150 gM). Las velocidades se han calculado a partir del tramo lineal de cada cinética, tales como las que aparecen en la figura 26. <8) Representación de las velocidades máximas de mezcla de lípidos expresadas como (%fdIs)~±50(véasemateriales y métodos) frente a la concentración de lípido (M). (Recuadro) Representación logarítmica de ((%fd/s),~¡DMPG)g M)l frente a la concentración de DMPG (MM). 2.0 32 u: 2 4 6 8 10 30 60 90 120 PROTEINA 106 (M) DMPG 106 (M) RESULTADOS Y DISGUSION 81 valores obtenidos de Los t112 frente a las inversas de las concentraciones de cx-sarcina (figura 28B) es una recta, lo cual sugiere que el proceso es de segundo orden respecto la concentraciónde proteína. Este tipo de ensayo también se ha realizado con vesículas compuestas por DMPS. La figura ‘9A muestra las cinéticas de mezclade lípidos para70 MM DMPS y diferentes concentraciones de a-sarclna (entre 5 y 20 MM). El proceso es sensiblemente más lento que el observado con vesículas de DMPG (figura 26). En la figura 29B apareceuna representación de las velocidades máximas frente a la concentraciónde proteína. Las velocidades máximas tienden a saturarse a una concentración de a-sarcina de 20 MM para 80 60 40 20 hp . l0~6 0fl4 0.08 0.12 016 (M’) 200 loo 120 8 t112 s 4 Figura 28. Cinéticas de variación de intensidad de fluorescencia a 530 nm nor- malizada, tras excitación a 450 nm. (A) La intensidadde fluorescencia(en unidadesarbitrarias, pero las mismasque las consideradasen las figuras 4 y 5) se expresancomo porcentajede la correspondientevariaciónmáximapara cadaconcentracióndefosfolípido (%F), con la finalidad de podercompararlas diferentescinéticasrealizadascondiferentesconcentracionesde lípido. Se representa%F530 nm frente al tiempo (s). Los cuatro trazos que aparecencorrespondena diferentesconcentracinesde DMPG (15, 60, 105, 150 gM) parauna concentraciónde a-sarcina (lO gM). (B) Representaciónde los valoresde tl/2 (s) frente a la inversade la concentraciónde cx-sarcina (hP) (M-l), para una concentración de DMPG (150 gM). (C) representación similar a (B) pero con resultados obtenidos con vesículas de DMPS (70gM). Los experimentos con DMPG se realizaron a 37 0C, mientras que con DMPS se empleó 420C. 5 10 15 20 s 02 0.4 0.6 0.8 82RESULTADOS Y DISCUSION 70 MM DMPS. Sin embargo,paramayoresconcentracionesde lípido serequierenmayores concentracionesde cx-sarcina. En la figura 29C apareceun resumende los resultados obtenidos para concentracionesde cx-sarcina de 10 y 20 ~M para un intervalo de concentracionesde DMPS entre70 y 285 gM. La velocidad de mezcla de lípido en unidadesde %fd/s disminuye a medida que aumenta la relación lípido/proteína. Este resultado está de acuerdocon los datos de unión de &-sarcina a este tipo de lípido. A concentracionesmayoresde 100 pM de DMPS, las vesículasno estánsaturadaspor la proteína en el intervalo de concentraciones empleado debido a la más baja afinidad relativa por este tipo de fosfolípido que por DMPG. La mezcla de lípidos también se ha estudiadocon vesículas compuestas por fosfolípidos naturales,PG de huevoo PS de cerebrobovino. En las mismascondiciones que paraDMPS, no se ha detectadomezclade lípidos paraPS bovina, mientrasque para PG de huevosí, pero a una velocidad3000vecesmenorque para DMPG. 8 E 4 2 DMPS 1O’~ (34) Figura 29. Estudio cinético de la mezcla de lípidos producida por a-sarcina con vesículas de DMPS. (A) Cinética de variación de intensidad de fluorescenciaa 530 nm tras excitación a 450nnu (F5~ ~) (medida en unidadesarbitrarias,pero las mismasque lasconsideradas anteriormente).Todos los trazoscorrespondena una misma concentraciónde DMPS (70 gM), siendo las concentracionesde a-sarcinalas queaparecenindicadas.Se empleóuna mezcla(1:1) de vesículas marcadas (NBD 1%; Rh 0.6%) y vesículas no marcadas. (B) Velocidades de mezcla de lípidos medidas en unidaddesde F534, m=sfrente a la concentraciónde a-sarcina (M). La concentraciónde fosfolípido fue 70 gM. Las velocidadessecalcularona partir del tramo lineal de lascorrespondientescinéticas(A). (C) Dependencia de los valores máximos de velocidad de mezcla de lípidos correspondientesa dos concentracionesde a-sarcina(10 y 20 ~M) en unidades de (%ftl/s) frente a la concentración de DMPS (M). Todos los experimentos se llevaron a cabo a 420C. PROTEINA. 10 610 05 10 —1 0>10 5 O -5 -10 -15 FIgura 31. Espectrosde emisión de fluorescenciay dicroísmocircular de oe-SRC en presencia de TFE. (A) Espectrosde dicroísmo circular en el UV-lejano (región del enlace peptídico) de la a-sarcina nativa ( ) y de la a-SRC (---) en presenciade 65% TFE. Los valoresdeelipticidad se expresanen unidadesde grados-cn9dmoW.(B) Espectrosde dicroísmo circular en el Uy-próximo (regiónde los residuosaromáticos)de la a-sarcinanativa ( ) y de la a-SRC(---) (espectros1 y 3 enausenciadeTFE; espectros2 y 4 enpresenciade 65% TEE). Las unidadesde elipticidad son las mismasque las de la parteA. (C) Espectrosde emisión de fluorescenciade la a-sarcinanativa( ) y a-SRC(---) paraexcitacióna295 nm, enpresencia de65% TFE. Las unidadesdeintensidaddefluorescenciason las mismasquelas de la figura 30). sin apreciarsecambioalgunoen la posicióndel máximodeemisión. En la a-sarcinanativa no seobservatransferenciade energíaentrelos residuosde tirosinay triptófano (Martínez 210 220 230 240 nm 260 280 300 nm -lo F 320 340 360 380 nm del Pozo a al., 1988), por lo tanto, el aumentode la intensidadde fluorescenciade los RESULTADOS Y DISCUSION 92 residuosde tirosina no puedeatribuirse a la eliminaciónde tal proceso.Podríadeberse, sinembargo,a unadisminucióndel apagamientoestáticoproducidopor gruposadyacentes a las tirosinascomoconsecuenciadel cambioconformacionalproducidopor la modifica- ción química.Un aumentosimilar en intensidadde fluorescenciaseha observadoen la a- sarcinaaconsecuenciade unatransicióndesnaturalizanteinducidapor pH ácido (Martínez del Pozoet al., 1988). En lo que se refierea la emisión de los residuosde triptófano,en la a-sarcinanativaseobservandos máximos,unoa 325 nm y otro a 335 nm (figura 30C, espectro4). La apariciónde un único máximoen el espectrode emisión de fluorescencia de la a-SRC,así comoel hechode que aparezcadesplazadohaciael rojo comparadocon los de la a-sarcinanativa,es indicativo dequeambosfluoróforos hanpasadoa un entorno de mayorpolaridad,lo cualescaracterísticode unaproteínadesnaturalizada.La intensidad de fluorescenciade la a-SRCsemultiplicaaproximadamente3 vecesen comparacióncon la de la a-sarcinanativa. Un aumentosimilarseobservaen unatransiciónconformacional queocurreapH 8.0 y que seatribuyea la desprotonacióndel grupoa-NH2 de la proteína (Martínezdel Pozo el al., 1988). En resumen, todos los datos espectroscópicosindican que la a-SRCesunaproteínadesnaturalizada.Este hechoescorroboradoa su vezpor la pérdidade actividad ribonucleasa.La a-sarcinanativa, cuandoactúa sobre el RNA ribosómico28S,produceun fragmentode aproximadamente400 nucleótidos,el fragmento a, por la hidrólisis de un único enlacefosfodiéster(Wool et al., 19%). Estefragmento no esproducidopor la a-SRCen condicionesexperimentalesen las que silo producela a-sarcmnanativa. Finalmente,cabedecir que las característicasespectroscópicasde la a- SRC novarían,al menosduranteunasemana,cuandola proteínaseincubaa4 0Có 37”C. Por todo ello, la a-SRCpuedeconsiderarseuna proteínadesnaturalizadaestableque no sufreun procesode replegamiento. El trifluoroetanolpromueveuna conformación en la a-SRC espectroscópica- mente similar a la adquirida por la a-sarcina nativa El trifluoroetanol (TFE) es un agenteque promuevela formación de puentesde hidrógeno intramolecularesen polipéptidos, disminuyendoel número de este tipo de interaccionesentrelos enlacespeptídicosy el disolvente(Nelson y Kallenbach,1986); la consecuenciade esto es la generaciónde estructurassecundariasordenadasen dichos polipéptidos.El efectodel TFE sobre las estructurassecundariasde la a-sarcinanativay la a-SRCseha estudiadomediantedicroísmocircular (CD) y fluorescencia.En presencia de TFE ambasproteínasmuestranun espectrode CD similar, tanto en la región del UV- lejanocomoenel UV-próximo, asícomoun espectroparecidodeemisiónde fluorescencia (figura 31). Los espectrosde CD en la regióndel enlacepeptídico,corresponderíana una RESULTADOS Y DISCUSION 93 Figura 32. Agregacióny mezcla de lípidos de vesículas de fosfolípidos por ~-SRC. (A) Aumento de la absorción a 360 nm (~A3~ ~) producidopor la interac- ción de la ty-SRC con vesículas de DMPG (30 nmoles) a diferentes relaciones molares. Los resultados representanel promedio de tres medidasindependientes.(B) Efecto de la cx-SRC sobrela eficacia de la transferencia de energía (%ET) entre las sondasNBD-PE (dona- dor) y Rh-PE(aceptor)incorpora- das en vesículasunilamelaresde DMPG (DMPG/NBD-PE/Rli-PEa unarelaciónmolar 98.4:1:0.6).El ensayose realizó con una propor- ción de vesículasmarcadasa no marcadasde (1:9), siendola con- centracióntotal de fosfolípido 150 (gM). E- estructurasecundariacompuestapor un 15% a-hélice, 17% lámina fi antiparalela,17% giro /3 y 51% estructurairregular, deacuerdoal métodode ajustede Perezelet al. (1991). (P/L) . 102 RESULTADOS Y DISCUSION 94 Por lo tanto, el TFE aumenta el contenido de a-hélice de la a-SRC. Las semejanzasespectroscópicasexistenteshan de interpretarsecomoque tanto la estructura secundariacomoel microentornode los cromóforosde ambasproteínassonmuy similares tras la adiciónde TFE. Por lo tanto, en condicionesen las que sepromuevenlos puentes de hidrógenointramoleculares,la a-sarcinanativay la a-SRCadoptanunaconformación similar, aunqueesta última proteínacarecede puentesdisulfuro. El efectodel TFE al estabilizarlos elementosde estructurasecundariaordenadapareceríadependerpor lo tanto de la secuenciade aminoácidos;el disolventeinduciría una estructurasecundariapor la que la cadenapolipeptídicaposeedeterminadapropensión(Sónnichseríaal., 1992). Esto es lo que pareceocurrir con la a-sarcina,por lo que ha de concluirse que los puentes disulfuro no suponenrealmenteuna restricciónen tal propensión. La a-SRC interacciona con vesículascompuestaspor fosfolipidosácidos La a-sarcinanativainteraccionaconvesículascompuestaspor fosfolípidos ácidos. Se ha procedidoa comprobarsi la a-SRCposeetal capacidad.Cuandose añadea-SRC a una dispersión de vesículasde DMPG se produceun aumentoen la wrbidez de la muestradebidoa la agregaciónde las vesículas.La cinéticadeesteprocesode agregación se ha estudiadomidiendo la variaciónde la absorciónde dicha muestraa 360 nm (AA3«, r.tot En la figura 32A serepresentala variacióndel AA3~ ~ frente a la concentraciónde a-SRC.El efectosesaturaa unarelaciónmolar aproximadade 0.04:1proteína/fosfolípi- do. La a-sarcinanativaproduceun efectosimilar y, bajo estas mismascondicionesla saturaciónse observaa una relación molar 0.02:1 proteina/fosfolípido(Gasseta al., 1989). Caberesaltarel hecho de quea las correspondientesrelacionesde saturaciónel producidopor la a-SRCes 1.5 vecesmayor que el producidopor la a-sarcina nativa. Al igual que la proteína nativa, la a-SRC no producecambio alguno en la absorciónde unamuestracompuestapor vesículasde fosfolípidos neutrosde DMPC. La cr-SRC desestabilizabicapasde DMPG promoviendomezclade lípidos entre diferentesvesículasde estefosfolípido, tal y comosedetectamedianteel ensayoclásico de variaciónde transferenciade energía(Struck et al., 1981) (figura 32B). El porcentaje de transferenciade energíadisminuyea medidaqueaumentala concentraciónde a-SRC, observándosela saturacióna unarelación0.01:1 proteina/fosfolípido.Esteresultadoes el mismo que el obtenidoconla a-sarcinanativaen estasmismascondicionesexperimen- tales (Gassetet al., 19%). Cuandose comparanlas figuras 3A y 3B en términos de relación molar proteina/fosfolípido, puedeconcluirse que se produce agregaciónde vesículas fusionadas, pues los áA3~~1,» no se hansaturadoa relacionesproteina/fosfolípido RESULTADOS Y DISCUSION 95 %L/s 80 0.8 60 0.6 40 0.4 20 0.2 80 60 40 t0.~ 20 O.6Z 02 Figura 33. Mezcla de lípidos y liberación de contenidos acuosos de vesículas de PG de huevoinducidopor «-SRC.(A) Liberaciónde contenidosacuososde vesículasde PG de huevo inducida por a-SRC, registradacomoaumentoen la emisión de fluorescenciade ANTS (véase parteexperimental).Se representala extensiónde la liberación(e), expresadacomoporcentaje de liberación ((%)L], así como las velocidadesiniciales del proceso (A), expresadascomo [(%)L]/s,frente a la cantidad de a-SRC presenteen el ensayo (nmoles). Las vesículasse encontrabanen Tris 10 mM, pH 7.5 conteniendoNaCí 0.1 M y EDTA 1 mM a unaconcentración de 0.1 mg/ml. (U) Cinéticasde mezclade lípido (a) y liberaciónde contenidos(b) de vesículasde PG de huevo (0. 1 mg/mi) inducidos por a-SRC (5 timoles). Los valores se expresancomo porcentajesde la variación máxima de cada ensayo (véase parte experimental). Recuadro: representaciónde los datosde la gráfica (U) de acuerdocon la expresiónln[l00/(l0O-%)] frente a tiempo (s), siendo(%) los valoresde la gráfica . Cuandose comparala cinéticade esteprocesocon la de liberación de contenidosacuosos,se puedeobservarqueesteúltimo procesoes, o biencoincidente en el tiempoal primero, o bienposterior.Es esperableobservarun retrasode la liberación de contenidoscon respectoa la mezclade lípidos si la interaccióntranscurrea través de una primera etapaen la que se forman estructurasen las quese mantienela integridad vesicular (no hay variacionesde procesosindican que tal retraso considerandoln(100/(100-%)jvs. mezclade lípidos es un proceso agregaciónde vesículasno es la análisis similar para las cinéticas velocidaddel procesodisminuiría acuerdocon esto, la mezc]a de conlíeva liberación de contenidos se desarrollala mezclade lípidos, 33B). permeabilidad de membrana). Las cinéticas de ambos no existe (figura 33B). Si las cinéticas se comparan tiempo(recuadrofigura 33B). sepuedeconcluir que la de primer orden, lo cual, a su vez, significa que la etapalimitante del procesoglobal de interacción. Un de liberaciónde contenidosindica que la constantede a medidaqueéstetranscurre(recuadrofigura33B). De lípidos promovidapor la a-SRCes un procesoque acuososdesdelas primerasetapas,aunqueuna vez que la liberaciónde contenidosse retarda(recuadrofigura El análisisde los efectosde una proteínasobreel comportamientotermotrópicode las vesículasproporcionainformación sobre la posible naturalezade las interacciones proteína-vesícula.La implicaciónde componenteshidrofóbicosyio electrostáticosen una interacciónpuedededucirsede estetipo de estudios.La cr-SRCmodificael comportamien- to termotrópicode las vesículasde fosfolípidos ácidos, no observándoseefectoalguno sobre vesículasde fosfolípidos neutros como fosfatidilcolina. La a-SRCdisminuye la amplitud de la transición de fase entreel estadogel y el estado líquido cristalino de vesículas de DMPG marcadas con la sonda DPH, de modo dependiente de la relación RESULTADOS Y DISCUSTON 97 proteína/lípido(figura 34A). La a-SRC tiende a eliminar dicha transición de fase sin afectar significativamenteal valor de la temperaturaa la que éstatiene lugar. Relaciones molaresmayoresque 10:1 (lípido/proteína)ya no modifican el perfil de la variaciónde anisotropía.Estos resultadossugierenque la a-SRCinduce una desorganizaciónde las Figura34. Efectode la ~- SRC sobre la transición de fase de vesículaslipídicas. (A) Varia- ción de la anisotropíade fluores- cencia de vesículas de DMPG- DPH tras la interaccióncona-SRC a las siguientes relaciones molares 02 DMPG/cx-SRC: (1) DMPG sólo; (2) 100:1; (3) 50:1; (4) 10:1. Los estudios se realizaron en Mops SO mM, pH 7.0 conteniendo NaCí 0.1 M y EDIA 1 mM. La concentra- ción de fosfolípido tte 80 gglrnl, 0.1 siendo1:1000 la relaciónen peso DPH/DMPG. Los valores son los promediosde tres medidas inde- pendientes.(B) Efectode la a-SRC sobre la transición de fase de vesículas de DMPG estudiada mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Los termogra- mas corresponden a las siguientes relaciones molares lípido/proteína: (a) DMPG solo; (b) 400:1; (c) 200:1; (d) 100:1 y (e) 50:1. La concentraciónde lípido tlie de 0.3 mg/ml. Las muestras se sometieron aun ciclo previo decalentamiento- enfriamiento. Los perfiles mostra- dos se obtienen posteriormente a una velocidad de barrido de 30 no encontrándosediferen- cias con ciclos posteriores. r 03 30 RESULTADOS Y DISCUSION 98 cadenasde acilo de los fosfolípidos, modificandosu gradode movilidad, lo cual estaría de acuerdocon una penetraciónde la proteínaen las bicapas. El efectode la a-SRCsobrela transicióntérmicade las vesículasha sidoanalizado tambiénmediantecalorimetríadiferencialde barrido (DSC). Los resultadosobtenidoscon mezclasde DMPC y a-SRCa diferentesrelacionesproteína/lípidoaparecenen la figura 348. La proteínadeterminauna disminucióndel valor de AH (calculadaa partir del área bajo la curva de capacidadcalorífica) asociadaa la transición de fase del fosfolipido. Asimismo, el aumentode la relaciónproteína/lípidosuponetambiénun aumentoen la anchurade la bandaque define la transición, de un modo similar al observadoen las transicionesanalizadasmedianteestudiosdepolarizaciónde fluorescenciade DPH. Estos resultadossugierenque la proteínaejerce una importantedesorganizaciónde la bicapa lipídica, impidiendoa un elevadoporcentajede moléculasde fosfolípido participaren la transiciónde fase. Un análisisde estosresultadosen términosde la ecuación AH/AH0 = 1-N~(P/L) en dondeAH0 es el cambiode entalpíaasociadoa la transición del lípido en ausenciade la proteínay (P/L) es la relaciónproteína/lípido,proporcionaun valor de N~ = 60, siendo esteparámetroen númeromedio de moléculasde fosfolípido afectadaspor una molécula de proteína.Resultadossimilares se han obtenidocon vesículasde DMPS. Los residuos de ti-iptófano de la a-SRC se transfieren a un medio de menor polaridad tras interaccionar con vesículasde fosfolípidos La emisiónde fluorescenciadel grupo indol de los residuosde triptófano es muy sensiblea la constantedieléctricadel entornoen el que se encuentran.El espectrode emisiónde fluorescenciade la a-SRC se modifica significativamentetras la interacción con vesículas de fosfolípidos. La figura 35 muestraun resumende los resultadosobtenidos con vesículasde DMPG. La interacción de la a-SRC con estas vesículasproduceun desplazamientohaciael azul en la posicióndel máximode emisión de fluorescencia(ver recuadro de la figura 35), desplazándoseéstedesdelos 345 nm hasta330 nm. Asimismo, se observa un aumentoen el rendimientocuántico de la proteína, multiplicándosela intensidadde fluorescenciade la proteína por un factor de 3 tras la interacción. La saturaciónde estos cambios se producea una relación lípido/proteínade 125:1. El aumentodel rendimientocuánticode la proteínapodríadebersea una protecciónde los fluoróforos frente a los grupos polarizables responsablesdel apagamientode la RESULTADOSY DISCUSION 99 fluorescenciade estosresiduos.Estasobservacionessepuedeninterpretaren términosde una transferenciadel grupo indol de los residuosde triptófano a un entornode menor polaridadtras la interacciónconvesículaslipídicas. Estanuevalocalizaciónde los grupos indol también puede deducirse de los resultados derivados del apagamientode la fluorescencia de los mismos residuos de triptófano, llevado a cabo por antraceno incorporado en la bicapa. Esta molécula puede considerarse localizada en la región de las cadenasde acilo, segúnsepuedederivarde su carácterhidrofóbico(Uemuraet al., 1983). El espectrode emisión de fluorescenciadel grupo indol solapacon el de absorcióndel antraceno,por lo que entreellos puedeexistir transferenciade energía(Uemura et al., 1983). El antracenoincorporadoen vesículasde DMPG apagala emisiónde fluorescencia de la a-SRC,produciéndoseun aumentosimultáneoen la emisióna 400 nm (figura 36). La transferenciade energíaentreambosfluoróforos aumentaa medidaque lo hace la nm 4 340 3 330 4 3 2 2330 ~1 ~0 3 (L/P) . I0~ Figura 35. Efecto de las vesículas de DMPG sobre la emisión de fluorescencia de a- SRC.Representaciónde la intensidadde fluorescenciaa 330 nm para excitacióna 275 nm (@) y de la longitud de onda del máximo de emisión de fluorescencia(a) con respectola relación lípido/proteína (L/P). Los resultados son los promedios detresmedidasindependientes,empleando unaconcentraciónconstantede proteína.Recuadro:espectrosde emisiónde fluorescenciade a- SRC (a) y DMPG/a-SRC a una relación 150:1(b). Las muestrasfrieron preparadasen Mops 50 mM, pH 7.0, con NaCí 0.1 M y EDTA 1 mM. En todaslas medidasseemplearonpolarizadores con el fin de evitar los efectos de la posible dispersión de luz. b a 1 2 RESULTADOSY DISCUSION 100 relaciónantraceno/proteína,saturándoseel valor de tal transferenciatantocon la relación DMPG/proteínacomocon larelaciónantraceno/proteína(figura 36A y 36B). La magnitud de la transferenciaes de un ordensimilar al observadocon la cardiotoxinaJI (Batenburg ezt al., 1985), melitina(Batenburget al., 1987) o el péptido Boc-Trp-Phe-OET(Uemura et al., 1983). La a-sarcina nativa y la a-SRC muestran diferentes conformaciones tras la interacción con bicapaslipídicas. Estudios de espectroscopiade infrarrojo. El efectode las vesículas lipídicas sobre la estructurasecundariade la a-SRCse ha examinadomedianteFTIR ya quela turbidezde la mezclaa-SRC-vesículasimpide una caracterizaciónestructural mediante técnicas de dicroísmo circular. La validez de la espectroscopiade infrarrojo paracaracterizarla estructurasecundariade las proteínasestá bien reconocida(Goormaghtighy Ruysschaert,1991). En la figura 37 aparecela banda amida1’ del espectrode infrarrojo de la a-SRC,en presenciay en ausenciade vesículas, tras desconvolución.Un posterior ajuste para determinar las bandascomponentesdel espectrono pudorealizarsede un modo fiable puesel resultadode la desconvolucióndel espectrode la a-SRC no presentómáximos definidos. Un incrementoen el factor de resolucióno unadisminuciónde laanchurade bandaLorentzianano hizosino incrementar el carácter asimétrico del espectrosin conducira una diferenciaciónde las bandas.Tras la interaccióncon vesículas,la a-SRCsufre un cambioconformacionalsegúnse deriva del cambioen la bandaamida1’. El espectrode diferencia puedeobservarseen la figura 37. Las bandas negativasdan cuenta de los elementosde estructuraperdidos tras la interacción,mientrasque los positivosdaríancuentade los ganados.Deeste modo,la a- SRC en presenciade vesículasde DMPG tendríamayor contenidoen a-hélice y giros, mientrasque perderíaestructura/3. Estapérdidacorroboralapresenciapreviade estetipo de estructuraen la a-SRClibre, tal y comosededucedel espectrodeCD. De acuerdocon medidasde FTIR la a-sarcinanativaaumentasu contenidoen a-hélicetras interaccionar con vesículas(Gasseta al., 1991b). DISCUSION La interacciónde la a-sarcinacon vesículaslipídicas viene caracterizadapor una combinaciónde factoreselectrostáticose hidrofóbicos (Gasseta al., 1991a, 1991b). El componenteelectrostáticode la interacciónes fácilmenteexplicableen términos de una neutralizaciónde cargasentrelas cabezaspolaresde los fosfolípidos cargadosnegativa- RESULTADOS Y DISCUSION 101 mente y residuos de carácter básico de la a-sarcina. El componente hidrofóbico sin embargo, no se explica a priori fácilmente debido a que la proteína carece de regiones de secuencia de una hidrofobicidad significativa. En este sentido, el modelo predictivode la conformaciónde la a-sarcinapredice la existenciade un núcleohidrofóbico formadopor cuatro cadenas/3, potencialmenteresponsablede la interacciónhidrofóbica. Ahora bien, yo 30 20 10 30 20 10 (ANT/DMPG)~ 10~ 1 2 3 4 Figura 36. Apagamiento de la emisión de fluorescenciade los residuosde triptófano dela a-SRC por antraceno incorporado en vesículasde DMPG. El efectodel antraceno(ANT) se evalúaconsiderandouna eficacia aparentede transferenciade energía(%), definida como (%)=[l-(F/F0)] 100, dondeF y 1% sonla intensidadde fluorescenciaa 340 nm, paraexcitación a 295 nm, enpresenciay ausenciadeANT, respectivamente.(A) Las medidasde (%) se realizaron tras incubar una mezcla de a-SRC(1.47 gM) y vesículasde DMPG-ANT durantelh a 37 0C, a dos relaciones lípido/proteína: 188:1(A) y 70:1 (e). (E) Representaciónde eficaciaaparentede transferenciade energía(%) frente a la relaciónmolar ANT/a-SRC. 2 4 6 8 (ANT/PROTEINA) RESULTADOS Y DISCUSION 102 o 2 cie -o 1-~o cn .0 Figura37. Estructurasecundariade la a-SRC en presenciay ausenciade vesículas lipídicas. (A) Región de [abandaamida 1’ del espectrode FTIR de a-SRC en ausencia(1) y presencia (2) de vesículas de DMPG a una relación molar lípido/proteínade 150:1. (B) espectro diferencia (espectro 2 menosespectro1). La desconvoluciónde los espectrossehizo empleando un factor de aumento de resolución K de 2 y una anchura mediade bandaLorentzianade 30 cm~’. Las muestras se prepararonen ventanasde CaF2 mezclando 10 pi de a-SRC (5 mg/ml en d- tampón: Mops 50 mM, pH 7.0, con NaCí 0.1 M, EDTA 1 mM en 020) y d—tampón o la correspondiente cantidad de DMPG en tampón. Las correcciones por el efectos isotópico sobre el pH flO fueron consideradas.Las regionesde la banda amida 1’ correspondientesa los diferentes elementos de estructura secundaria considerados fueron: 1662-1645cm’, a-hélice;1689-1682y 1637-1613, estructura ¡3; 1644-1637,estructurano ordenada;1682-1662,giros ¡3 (Goormaghtigh etal., 1990). los efectos producidos por una proteína pueden deberse bien a su conformaciónnativabien a la conformación inducida por el ligando tras la interacción. Es decir, las regiones de la a-sarcinaresponsablesde la interacciónhidrofóbica(potencialmentee! núcleo/3> pueden estar presentes en la forma nativa de la proteína o bien inducirse al interaccionarcon bicapas.El hechode quela a-sarcinasufracambiosconformacionalesal interaccionarcon bicapaslipídicas(Gasseta al., 1991b)no permitediferenciarestasdosposibilidades.Una forma de a-sarcinadesnaturalizadapodría proporcionarinformación valiosa sobre este punto. 1680 1660 1640 1620 número de onda (cm’) RESULTADOSY DISCUSION 103 La a-sarcinadesnaturalizadatérmicamentesufre un procesode renaturalización parcial (Martínezdel Pozoaal., 1988),por lo quesu empleono resultaadecuadoen este estudio. Asimismo, el uso de agentes desnaturalizantes que han de emplearse simultánea- mente con las vesículas, se descarta por los efectos que éstos podríancausar sobre las membranas. La simple reducción de los puentes disulfuro de la a-sarcinano se empleó tampoco, debido a que posibles reacciones de oxidación pudieran conducir a la renaturalizaciónde la proteína. La reduccióny carboxiamidometilaciónde la a-sarcina determinauna modificaciónquímica establee irreversible en la proteína,por lo que se consideróadecuada.La iodoacetamida,al no introducir cambiosen la carga netade la proteínatras la modificación,seprefirió al iodoacetato,que introducecargasnegativas. La caracterizaciónespectroscópicade la a-SRCmuestracambiosen las bandasde absorcióny emisiónde los residuosdetriptófanotípicasde un polipéptidodesnaturalizado. Esto quedaconfirmadopor los resultadosde dicroísmo circular, tanto en el UV-lejano como en el UV-próximo. Deestemismoestudiosederivaque la cx-SRC retienealgunos elementos de estructura secundaria: giros y cadenas43. No obstante,este resultadono resultasorprendenteen el sentidode quenumerosasproteínasdesnaturalizadasconservan una fracción significativade estructurasecundaria(Montelioney Scheraga,1989; Shortle, 1993). La a-SRC interacciona con vesículas de fosfolípidos ácidos, de un modo similar al de la a-sarcina nativa. La agregaciónde vesículas observadase relaciona con la capacidadde la proteínapara disminuir la repulsión electrostáticaentre las vesículas medianteuna neutralizaciónde cargas. El que se conservela capacidadde agregación podríaexplicarsefácilmenteconsiderandoque la reduccióny carboxiamidometilaciónde la a-sarcinano introduce,previsiblemente,cambiosen la carganetade la proteína.Ahora bien, de este resultado ha de concluirse que dicha capacidadde agregaciónno es dependientede la conformaciónnativade la proteína.Asimismo, la a-SRCno interacciona convesículasde fosfolípidos neutrosde fosfatidilcolina,auncuandola desnaturaJización de la proteínasuponela exposiciónal disolventeacuosode residuoshidrofóbicos. Esto significaría que tales residuosno puedenconsiderarsecomo la fuerzaconductorade la interacciónconvesículas,sinoquecomoetapapreviaa la interacciónhidrofóbicahayotra de carácterelectrostáticoque seconvierteen un requisito previo inicial. Al igual que la a-sarcinanativa, la a-SRC poseela capacidadde desestabilizar bicapaslipídicas. La a-SRCproducemezclade lípidos asícomo liberaciónde contenidos acuosos. Igualmente, la proteína disminuye la amplitud de la transición de fase del fosfolípido, según se deriva de estudiosde calorimetríadiferencial de barrido. Estos RESULTADOSY DISCUSION 104 resultados, junto con el hechode observarsetransferenciade energíaentrelos residuosde triptófanoy antracenoincorporadoen las bicapas,indicanun pasode la proteínaal interior hidrofóbico. Por lo tanto, la a-sarcinanativa y la a-SRCinteraccionanhidrofóbicamente con membranasaunque su conformación es diferente. En este sentido, el modelo estructuralde la conformaciónde la a-sarcinapredice la existenciaen la proteínanativa de un núcleohidrofóbico formadopor cinco cadenas~3,que pudieraestar implicado en la interacciónconmembranas.La a-SRCconservaelementosde estructurasecundariasegún se deriva de los resultadosde CD y de FTIR. En concreto,el porcentajede estructura¡3 determinadoresultaser del 20%. Una hipótesisquepuedemanejarseen este sentidoes que la a-SRCconservadicho núcleo,lo que la habilitaríaparainteraccionarhidrofóbica- mentecon membranas.Contrariamenteaesterazonamiento,no puededescartarseel hecho de que la interacciónde la cx-SRC con membranasseaun procesoinespecíficotípico de proteínasdesnaturalizadas.En oposicióna estaafirmaciónsepodríadecir que la a-SRC es unaproteínasolubley estable,en la queno se ha observadofenómenosde agregación, incluso a concentracioneselevadas.En este sentido, se ha comprobadoque numerosas proteínashidrosolubles interaccionancon vesículaslipídicas a pH ácido, condicionesen las que dichasproteínassufren unaexposiciónde residuoshidrofóbicos.En estecasosin embargo,dichas proteínasagreganintensamenteen ausenciade vesículas(Hong et al., 1985; Kim y Kim, 1986; Harter et al., 1988). En resumen, los resultadosobtenidosindicaríanqueno serequierelaconformación nativa de la a-sarcina para que existan interaccioneselectrostáticasconvesículasmodelo, ya que la a-SRC posee la capacidad de interaccionarelectrostáticae hidrofóbicamentecon membranas. Los elementosestructuralesqueposeeestaproteínamodificadala capacitarían paraello; dichoselementosde estructurasecundariadeterminadosseríanestructura¡3 y giros. RESULTADOS Y DISCUSION 105 6. DESNATURALIZACION TERMICA DE LA a-SARCINA: DESESTABILIZA- ClON DE LA PROThINA INDUCIDA POR LA UNION A MEMBRANAS Estudios de la desnaturalización de la a-sarcina mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) En la figura 38 aparece un resumen de las curvas de DSC obtenidas para la desnaturalización térmica de la a-sarcina y para la desnaturalización de diferentes complejos a-sarcina-vesículas de fosfolípido, empleandouna velocidadde barrido de O.50C.minl. El termogramacorrespondientea la proteínasola exhibe un único pico altamentesimétricocentradoen torno a los 52.60C,temperaturaque correspondea la de desnaturalizacióntérmica de la a-sarcina. La temperaturadel máximo de capacidad calorífica, Tm, esdependientede la velocidadde barrido; de hecho, la Tm determinadaa una velocidad de barrido de 1.00C~min’ es 1.50C mayor que la determinada anteriormen- te. La dependencia de la Tm con la velocidad de barrido sugiere que el proceso estudiado podríaestarcontroladocinéticamente(Freirea al., 1990). Sin embargo,el estudiose ha llevado acaboa unavelocidadbaja(0.50Cmin’)confines comparativos.La desnaturali- zación térmica de la a-sarcinase caracterizapor un cambiode entalpíaaparente(AH2 de 136 kcakmoL’ (tabla II), sin considerar la corrección por la entalpía de ionización del tampón. Este valor normalizado por masa de proteína (8 cabgl es similar a los obtenidos para otras proteínashidrosolubles(Murphy et al., 1992; Haltia a al., 1994) lo cual sugiere que la desnaturalizacióntérmica de la cx-sarcina afectaa la totalidad de la molécula. El cambio de capacidad calorífica estimado(Murphy y Freire, 1992) asociado a la denaturalizacióntérmica de la a-sarcinaes 1380 cal~mol’K’, por lo que la desnaturalizacióntérmica de la proteína viene probablementeacompañadade una hidrataciónde granpartede la proteína.La relaciónentrela entalpíade van’t Hoff, AH~, y la entalpíacalorimétricaAH~ 1 (~H~IAH~)es 1. 1, lo cual sugiereque la desnaturaliza- ción de la proteínapuededescribirsecomo una transiciónentredos estados(Privalov, 1979; Sturtevant,1987). La reversibilidaddel procesoseha estudiadomedianteun nuevo ciclo de calentamientotras enfriar y estabilizar la muestradespuésdel primer ciclo. El porcentaje de ÁH~ recuperadoes función tanto de la temperaturamáximaalcanzadaen el primer ciclo comodel tiempo de estabilizaciónprevio al segundociclo. El porcentaje de áH~ recuperado es un 70% del inicial cuando la temperatura máxima es 70 0C y la muestrasemantiene2 h a 100Cantesdel segundociclo. Nosehanempleadotemperaturas superiores a 700C por la posible inducciónde modificacionescovalentesen la molécula de proteína (Sturtevant, 1987; Freirea al., 1990). RESULTADOS Y DISCUSION 106 50 oc o-o •< 30 40 60 70 Figura 38. Termograinasde la ct-sarcinaen disolución y unidaa diferentestipos de vesículasde PG. Representacióndel excesodecapacidadcalorífica (AC~) frentea la temperatura, de la a-sarcina endisolución(A) y unidaa vesículasde DMPO (B). DOPO(C) y de PO dehuevo (D), a una relación molar lípido/proteína de 200:1. La barrarepresentaunacapacidadcalorífica de 10 kcal~K’mol’, La velocidad de barrido fue de 30”C~lí’. Los experimentosse han llevado a cabo a una concentración constantede proteína(1 mg/mí) entampónMops 50 mM, PH 7.0. con NaCí 0.1 M y EDTA 1mM. El estudio de los efectosdel PG sobrela desnaturalizacióntérmicade la a-sarcina se ha estudiadoempleando mezclas proteína-lípido a una relación molar (1:200). Considerandoque la relaciónproteína/lípidosaturantees (1:50) (Gassetet al., 1989), en las condiciones anteriores toda la proteína se debe encontrar unida, por lo que las variaciones observadasen los termogramasno estarán relacionadascon diferentes proporcionesentreformaslibres y unidasde cv-sarcina. Esteanálisiscalorimétricoes, sin o T ic kcal K1 moV1 A RESULTADOSY DISCUSION 107 embargo, complejo debido a la formación de grandes agregados de vesículas y complejos de fusión inducidos por a-sarcina (Gasseter aL, 1989, 1990). En las condiciones empleadas para las medidas calorimétricas la precipitación de los complejos se produce en pocos segundos, por lo que la interacción a-sarcina-lípido se realizó en la propia célula calorimétrica. Este tratamientono debieraafectara la desnaturalizaciónde la proteínaya que la temperatura de incubación es de 370C, muy por debajo de la Tm determinada anteriormente. Sin embargo, este procedimiento supone el manejo de un sistema con una interfase sólido-líquido en la célula que puede constituir una fuente de error en las medidas de los parámetros termodinámicos considerados. En [afigura 38 aparecen sólamente las regiones de temperaturaselevadasde los termogramascorrespondientesa los complejos a-sarcina-PG.A temperaturasinferiores a 300Clos termogramasestándominadospor la transicióntermotrópicadel lípido (Gasset et al., 1991).Sepuedeobservarque el DMPG modificael termogramade desnaturaliza- ción de la a-sarcina(figura 38B), apareciendoun únicopico asimétricocaracterizadopor unaTmde 49.10C. El valor calculadodeAH~ es77 kcal~moP,sensiblementeinferior al obtenido paralaproteínaen disolución(tablaII). Esteresultadosugierequeladesnaturali- zacióntérmicade la proteínaunidaa vesículasno afectaa la totalidadde la molécula.La estabilidadde una proteínase sueledefinir como la diferenciade energíalibre entrela formanativay la formadesnaturalizada.Por lo tanto, la disminucióntanto de la Tm como del incremento de entalpíacalorimétricaasociadoa la desnaturalizacióntérmicade la a- sarcina, esunaevidenciade la desestabilizaciónde la forma unidaa membranasde la a- sarcina, comparadacon la forma libre, no unida. El valor de AH~jAH~ calculadopara la transiciónanterioresde2.7. hechoque, junto con la agudezay carácterasimétricodel picoendotérmicodel termograma,sugieren que el procesono puedeser descritocomo una transiciónentredos estados,pudiendo ocurrir procesosdeagregaciónde la proteína,ya seaentreestadosplegadoso desnaturali- zados,o bien,entreambasformas(Sturtevant,1987). En estesentido,el análisiscinético de las primeras etapasdel procesode agregaciónde vesículas inducida por a-sarcina revelala implicaciónde interaccionesproteína-proteínaen la formacióndetalesagregados (véase Estudio cinético de la agregacióny mezclade lípidos de vesículasde PO y PS producidaspor a-sarcina:medidasde dispersióndeluz mediantetécnicasde flujo detenido y medidasde transferenciade energíade fluorescencia).Hay, sin embargo,otrasposibles explicacionespara el hechode que AH~ > AH~ en el procesode desnaturalización térmicade unaproteína,comopuedenser, la existenciade intermediosen la desnaturaliza- ción del tipo “molten globule” (Xie et al., 1991), o erroresen la determinaciónde la concentraciónde proteína(1-tu et al., 1992). Estaúltima posibilidadpuededescartarseen RESULTADOS Y DISCUSION 108 nuestro caso ya que la concentración de a-sarcina se determina rutinariamente mediante análisis de aminoácidos y por medidas espectroscópicas. Por otro lado, hasta hoy día no hay ningún indicio sobre la existencia de un intermedio “moRen ~ en el plegamientode la ~-sarcina.La existenciade un estado estable tras la desnaturalización de la proteína(Privalov y Potekhin, 1986) o una situaciónexperimental en condiciones de no equilibrio (Freire y Biltonen, 1978), pueden también explicar una desviación del comportamiento definido por una transición entre dos estados.Otra posibleexplicaciónde este comportamiento puede derivarse de la existencia de diferentes formasde a-sarcina unida a membrana; de hecho se observa un comportamiento dual cuandose consideran otros tipos de PC. Así, el termograma de la cv-sarcina unida a vesículas de DOPO (a una relación molar proteína/lípidode 1:200), viene caracterizado por una T1~ y por un zSH~1 menores que los de la cx-sarcina en disolución, así como por un ensanchamiento u z o ‘ti e 1680 1650 1620 1680 1650 1620 númerode onda (cm 4) Figura 39. Espectros de FTIR de la a-sarcina en disolución y unida a diferentes tipos de vesículas de PG. (A) Espectros de FTIR de la iy-sarcina libre en disolución (a), y unida a OMPO (b), DOPO (c) y PO de huevo (d) a unarelaciónmolar lípido/proteínade 150:1. (B) Los mismosespectrostras desconvoluciónde Fourierempleandounaanchurade bandaLorentzianade 30 caí’ y un factor dc aumentode resoluciónde 1.8. Los espectrosse han realizado a 370C y en Mops 50 mM, pD 7.0, con NaCí 0.1 M y EDTA 1 mM. cl b a RESULTADOS Y DISCUSLON 109 pronunciadodel pico endotérmicode desnaturalización, mientras que las bandasa 1637, 1652 y 1667 caí’, representaríanestructura¡3, a-hélicey giros, respectivamente.Las bandasdébilesa 1677 y 1687 cm-1 serian vibracionesen fasede los grupos amidaimplicados en estructuras13 (Surewicza al., 1990),aunquetambiénpuedenoriginarsea partir de giros (Surewiczy Mantsch, 1988). La bandaamida1’ de la a-sarcinase ve modificadatras la unión de la proteínaa vesículasde fosfatidilglicerol (figura 39). Las principalesdiferenciasserelacionancon las bandasa 1626caí’ y 1643 caí’; la intensidadde ambasaumentatras la interacción.Estos efetosson máspronunciadosparaDOPOy POde huevoqueparaDMPG (figura 39). En presenciade estasvesículaslipídicas, la relaciónentrelas bandasamidaII y amida1’ varía entre 0.15 y 0.17, indicando un aumentoen el intercambio hidrógeno-deuterioen comparacióncon la proteínaen disolución. Esteaumentode accesibilidadal intercambio indicauna perturbaciónen la estructuranativade la cr-sarcina,resultantede la interacción con membranas. El estudio de la dependenciacon la temperaturade las bandasamida 1 puede aportarinformaciónútil acercade la estabilidadtérmicay del mecanismode desnaturaliza- ción de las proteínas(Surewicz a al., 1987; Arrondo a al., 1988). Los espectrosde infrarrojo de la a-sarcina libre en disolución y unida a membranas,a diferentes temperaturasapareceen la figura 40. El perfil de la bandaamida1’ de la a-sarcinalibre permaneceinvariableentrelos 200C y los 43 0C (figura 40A, espectroa), indicandoque RESULTADOSY DISCUSION 112 en este intervalo de temperaturas la proteína mantiene la estructuranativa. Un aumento posterior de la temperatura, en el intervalo comprendido entre los 47”C y 57’C, produce cambios en la forma inicial de los espectros, lo cual está de acuerdocon los resultados obtenidos mediante DSC. Es de resaltar el hecho de que de la desconvolución de los espectros se deduce que la banda a 1626 caí1, correspondiente a estructuras ¡3 de baja frecuencia, desaparece progresivamente (figura40B). Es más, los espectros de la a-sarcina tras sufrir la transición térmica, son diferentes para cadatipo de lípido (figura 40B). Para la a-sarcina en disolución se observa una banda amida 1’ asimétrica, con un máximo a 1648 caí’ y un hombro a 1668 cmt Sin embargo, los espectrosde la a-sarcinaen forma de complejo con los diferentes tipos de PO muestran mayor simetría y, tras la desconvolu- ción aparece una bandadiferenciadaa los 1655 cm’, característica de a-hélices. Todos los métodosempleadosparadeterminarlas contribucionesde los diferenteselementosde estructurasecundariaapartir de los espectrosde FTIR sebasanen el conocimientode la posición y anchurade las bandasindividuales.En estesentido,hemosobservadoque: i) los espectros de FTIR de la a-sarcinadesnaturalizadatérmicamente son anchos, englobandola región de giros-hélice-estructurairregular; u) la desconvoluciónde estos espectrosno proporcionaun estrechamientode las bandas,incluso empleandoun factor de aumentode resolución,K= 2.4; y iii) el contenidoen a-hélicese puedesobreestimar (parala a-sarcinareduciday carboxiamidometiladase deduceun contenidoen a-hélice muchomayor queel determinadomediantedicroísmocircular). Por lo tanto,se ha evitado cualquiertratamientomatemáticode los espectros.Deberesaltarse,sin embargo,que los lípidos podríanpermitir conservarelementoshelicoidalesen la a-sarcinadesnaturalizada térmicamente,ya que se observanbandasa 1655 caí’ en los espectrosanalizadospor desconvolución.Algunos autoreshan intentadoajustar los espectrosde FTIR de proteínas desnaturalizadastérmicamente,encontrandoestructurassecundariasremanentes.Así, Fabianet al. (1993) y Seshadriet al. (1994)hanconcluidola existenciade elementosde estructurasecundariaremanenteen la RNasaTi y RNasaA, respectivamente. La a-sarcinadesnaturalizadatérmicamenteexhibe una mayor accesibilidadal intercambiohidrógenopor deuterio(la relaciónentrelas bandasamida11 y amida1’ es 0.14 y 0.21 para la proteínadesnaturalizaday nativa, respectivamente).Así, la proteína unida a bicapasa una temperaturainferior a la Tm solamentemuestra un ligeramente menor intercambioHxD (la relaciónentrelas bandasamidaII y amida 1, se encuentra entre 0.15-0. 17) que el mostradopor la proteínadesnaturalizada.Un aumentode la accesibilidadal intercambioHxD se observatambiénpara la proteínadesnaturalizada unida a membranas. La relación entre las bandas amida II y amida 1, es 0.09, 0.03 y 0.03 paralaproteínadesnaturalizadaunidaa DMPG, DOPOy PO de huevo,respectivamente. RESULTADOS Y DISCUSION 113 1.5 o (O (O 1~~ e., (O 1~~ 1.0 Figura 41. Variación de la relación de intensidades a 1637 cxii’ y 1660 cm’ con la temperatura. Representación de la relación (1Ió37/II~), calculada a partir de los espectros de la figura 40 frente a la temperatura,parala a-sarcinaen disolución(e), o unida a DMPO (a), a DOPO (A) y PO de huevo (U). Un método empírico para seguir la desnaturalización térmica de la a-sarcina es el análisis de la relación de intensidades a 1637 y 1660 cm-’ (11637/I,6w). Los resultados obtenidosparala variacióndeesteparámetrocon la temperatura,tantoparala a-sarc¡na libre como unida a los diferentes PG, se resumen en la figura 41. La temperatura a la que se produce el 50% de la transición térmica de la a-sarcina libre es 52.70C, valor que disminuye en presencia de las diferentes vesículas: 51.30C, 45.90C y 47.30C para los complejos con DMPG, DOPG y PG de huevo, respectivamente.Estos valores de temperaturaestándeacuerdocon los determinadosmediantemedidasdeDSC. Las curvas de la figura 41 se puedenemplearparacalcularla fraccióndemoléculasdesnaturalizadas 30 40 50 60 70 RESULTADOS Y DISCUSION 114 para cada temperatura, que a su vez permiten determinar una constante de equilibrio aparentepara el proceso de desnaturalización.Tal constantepuede posteriormente emplearseparadeterminarel incremento de entalpía aparente asociado a la transición térmicaapartir de las correspondientesrepresentacionesde van’t Hoff. Sin embargo,de acuerdocon los resultadosobtenidosmediantelos estudiosde DSC, la desnaturalización térmica de la a-sarcinaen presenciade vesículas lipídicas no puede ajustarsea una transiciónentre dos estados.Por lo tanto, en estoscasosel parámetrocalculadoa partir de las representacionesde van’t Hoff daría idea solamentede la cooperatividadde la transición y no la variación de entalpíaasociadaal proceso. Estudios de la desnaturalización térmica de la a-sarcina mediante espectrosco- pía de fluorescencia La emisión de fluorescencia de los fluoróforos de una proteína está condicionada por las características de su microentorno, que viene a su vez determinado por la estructura terciaria de la proteína. El espectro de emisión de fluorescencia de la cv-sarcina viene dominado por la contribución de sus dos residuos de triptófano que se encuentran localizados en un entorno hidrofóbico(el máximode emisión secentraen torno a los 330 nm, para una longitud de onda de excitación de 275 nm y 295 nm). Se ha observado que la adición de vesículas de PO promueve un aumento de la intensidad de emisión de fluorescencia (Gasset etal., 1991); por lo tanto, la desnaturalizaciónde la a-sarcinalibre o unida a vesículas puede estudiarse mediante espectroscopia de fluorescencia. La desnaturalización térmica de la proteína viene acompañada de un desplazamiento hacia el rojo del máximo de emisión de los triptófanos(desdelos 330 nm hastalos 345 nm), así como por una disminución en el rendimiento cuántico de estos residuos. De este modo, la relación entre las intensidades de fluorescencia a 325 nm y 350 nm, para una excitación de 295 nm, es un parámetro empírico que puede emplearse para seguir la desnaturalización térmica de la cr-sarcina. La variaciónde esteparámetrocon la temperaturadaríacuenta de cambios a nivel de la estructuraterciariade la proteína(microentornode los residuos de triptófano) tras la desnaturalización de la proteína. En la figura 42 aparece un resumen de los resultadosobtenidosparala a-sarcinalibre en disolución,y parala a-sarcinaunida a los diferentes tipos de PO. La temperaturaa la que tiene lugar el 50% de la transición térmica para la cr-sarcina en disolución es 520C, mientras que disminuye hasta 46.50C, 46.50C y 450C para los complejos con DMPG, DOPO y PG de huevo, respectivamente, lo cual estáde acuerdocon los resultadosobtenidosmedianteDSC y FTIR. RESULTADOS Y DISCUSION 115 1.5 — o u.> u.> ti U. 1.0 — L Figura 42. Variación de la relación de intensidades de fluorescencia F~/F350 con la temperatura. Representación de la relación F323/F3~,, para excitación a 295 nm con la temperatura. para la a-sarcina en disolución (•), unida a DMPG (A), a DOPO (A) y PG de huevo (U). la relación molar lípido/péptido es de 125:1. Los experimentos se han llevado a caboen Mops 50 mM, pH 7.0 con NaCí 0.! M y EDTA 1 mM. DISCUSION Las tres metodologíasempleadasparaestudiarla desnaturalizacióntérmicade la a-sarcina, DSC, FTIR y espectroscopia de fluorescencia, permiten obtener información del proceso a nivel de la proteína completa, a nivel de la estructura secundaria y terciaria, respectivamente. A pH neutroy aunaconcentración0.1 M de NaCí, el procesode desnaturalización térmica de la a-sarcina puededescribirsecomounatransiciónentredosestadoscontrolada ¡ ¡ 1 ¡ 1 E 25 35 45 55 65 RESULTADOS Y DISCUSION 116 TABLA 11. Parámetros termodinámicos asociados a la desnaturalización térmica de la y-sarcina y de diversos complejos cx-sarcina-fosfatidilglicerol (relación molar 200:1>. La velocidad de barrido fue de 300C ir’ SISTEMA Tm (0C) (kcaL mol.l)b AH~ 11 (kcahmot’) cy-sarcina 52.6 136 148 cy-sarcina-DMPG 49.1 77 210 a-sarcina-DOPG 49.8 105 105 a-sarcina-POb 47.7 84 100 a Temperatura del máximo de capacidad calorífica. b Valores obtenidosde la transicióntérmica. cinéticamente,con una Tm de 52.6 0C segúnlos resultadosde DSC. Unaestimacióndel incrementodeenergíalibre a250Cde esteprocesoproporcionaun valor de 10 kcabmoF’, que estáen el intervalode los valoresde estabilidadconformacionaldeterminadospara otras proteínas hidrosolubles (5-15kcal~moF’> (Privalov, 1979; Pace,1975). La a-sarcina muestraun elevadogradode similitud desecuenciacon la RNasaTI deAspergillusoryzae (Saccoetat,1983), yconotrasRNasasfúngicasdelasubfamiliade la RNasaTI, aunque la a-sarcina posee alrededor de 40 residuos de aminoácidos en exceso. El valor de la temperatura de transición térmica de la RNasa TI a pH neutro varía entre 48.9”C y 65.60C (Ru et al., 1992; Plaza del Pino et al., 1992; Yu a al., 1994). Estos valores podrían considerarse similares al de la T~, de la cx-sarcina, de hecho, la mayoríade los estudios llevados a cabo con la RNasa Ti se han realizado a baja fuerza iónica, mientras que los realizados con la cx-sarcina se han hecho a 0.1 M NaCí (para mantener unas condiciones estándar en la formación de los complejos lípido-proteína), y es conocido que RESULTADOS Y DISCUSION ¡17 la RNasa Ti se estabiliza por la adición de NaCí (Oobatake a al., 1979; Pace y Grimsley, 1988). Así, el valor de ‘~m parala desnaturalizacióntérmicade la RNasa Ti a 0.1 M NaCí y pH neutro es 52.60C (Ru a al., 1992); sin embargo,en estecasola desnaturalización es totalmentereversible (Plaza del Pino et al., 1992) mientras que la transición térmica de la rsarcina no lo es en su totalidad (el porcentaje de recuperación del AH~ es el 70%). Por otra parte, el AH~ para la desnaturalización térmica de la a-sarcina es 136 kcal’mol’, mientras que el correspondiente a la RNasa Ti se encuentra alrededor de 95 kcalmoh. Esta diferencia podría ser explicada considerando el mayor número de residuos que posee la a-sarcina con respecto a la RNasa Ti, ya que ambos valoresseaproximan notablemente cuando se expresan por mol de residuos de aminoácidos. Los termogramas de DSC de la proteína unida a membranas sugieren la existencia de diferentes formas de proteína unida. En este sentido, el análisis de la agregación de vesículas lipídicas inducida por a-sarcina mediante técnicas de flujo detenido (véase Estudiocinéticode la agregación y mezcla de lípidos de vesículas de PG y PS producidas por cx-sarcina: medidas de dispersiónde luz mediantetécnicasde flujo detenidoy medidas de transferencia de energía de fluorescencia) revela la participación en el proceso de interacciones proteína-proteína, manteniendo los agregados lípido-proteína. Esto podría explicar Ja presencia de diferentes conformaciones de Ja proteína unida. Asimismo, esta última posibilidad de las dos diferentes conformaciones para la proteína unida a membranas se ha manejado para explicar el comportamiento diferencial que muestra la a- sarcina en cuanto a su capacidad de desestabilizar membranas. Existen diferencias entre los termogramas de la proteína unida a los diferentes tipos de vesículas de PG estudiados, DMPG, DOPG, y PO de huevo. Sin embargo, los resultadosobtenidosmedianteDSC tienen en común que tanto la Tm como el AH~, son menores comparados con los valores obtenidos para la proteína libre en disolución, lo cual significaría que la proteína unida tiene una menor estabilidad conformacional que la proteína libre. Las medidas de FTIR revelan que la unión de la a-sarcina a los diferentes tipos de vesículas de PO produce cambios conformacionales en la proteína, aumenta la accesibili- dad al intercambio de hidrógeno por deuterio y disminuye la Tm de la transición térmica analizada mediante el parámetro empírico (IIá37/I,~). Estos análisis muestran asimismo que la a-sarcina desnaturalizada unida a membranas contiene elementos de estructura secundaria, a-hélice, que no aparece en la a-sarcina desnaturalizada en disolución. La transición térmica se ha analizado también considerando el parámetro (F 325IF3~). Este cociente ofrece información relativa a los cambios que seproducenen el microentornode los residuos de triptófano de la proteína a consecuencia de la desnaturalización térmica. De nuevo, se observa una disminución en los valores de ‘1’,, de las formas de a-sarcina RESULTADOS Y DISCUSION 118 unidasa las membranas. Cuando se comparan los valores de T,,, obtenidos por las tres metodologías empleadas,se observa que coinciden significativamente. Este parámetroes siempre inferior para las formas unidas a bicapas,siendoel mayor efecto el producidopor las vesículasde DOPG seguidopor PG de huevoy DMPG. La interaccióndel ferricitocromo c con membranasde DMPO o DOPO revelantambiéndiferenciassutilesen cuantoa los datos calorimétricosrelativos a su transición térmica(Muga a al., 1991). Las únicas diferenciasquímicasentre los diferentesPG consideradoses la presenciade cadenasde acilo insaturadasen DOPG y PO de huevo. Estasdiferenciaspuedenresultarendiferentes gradosde fluidez de membrana;sin embargo,por una parte, los complejos a-sarcina- lípido siempresehan preparadoa una temperaturasuperiora la de transiciónde fasedel correspondientefosfolípido y, por otra, la transición térmicade la a-sarcinaseproduce siemprea temperaturasmuy superioresa la de transicióndel lípido. Por todo esto,esmuy probableque las diferenciasrelativasa esteparámetroen el intervalo de temperaturasen el que se producela transicióntérmicade la a-sarcinano seanlo suficientementegrandes comoparaexplicar las variacionesen la Tm de ladesnaturalización.Por otraparte,seha propuestoque el grado de insaturaciónde las cadenasde acilo afectaa la red de puentes de hidrógeno interlipídicosen los que intervienenmoléculasde agua,y que esteproceso es independientedel grado de orden de las cadenasde acilo (Síater et al., 1993). El diferente grado de insaturaciónde las cadenasde acilo de los fosfolipidos empleados podría resultaren distintasáreassuperficialesparacadafosfolípido, lo cual puedeafectar a la superficie de hidrataciónglobal de las vesículasy, por lo tanto, a las interacciones electrostáticasen las que participan al interaccionar con la a-sarcina.La a-sarcina es capazde distinguir entrePO de huevoy DMPG en términos de mezclade lípidos. Así, la cx-sarcinapromueveagregacióny mezclade lípidos de vesículasde DMPO, mientras que sólo promueveagregacióncon PO de huevo (véaseEstudiocinéticode la agregación y mezclade lípidos de vesículasde PO y PS producidaspor a-sarcma:medidasde dispersiónde luz mediantetécnicasdeflujo detenidoy medidasde transferenciade energía de fluorescencia),aunquesí se observacuandola mezclase produceentrevesículasde DMPG y PO de huevo. Este comportamientoseha explicadoconsiderandola existencia de al menosdos tipos de conformacionesde la proteína.Por todo ello, las diferencias observadasentre las vesículasde DMPO, DOPO y PO de huevo podrían deberseal diferentegrado de saturaciónde las cadenasde acilo. Este estudiodemuestraque la interacciónde la a-sarcinacon vesículasmodelo compuestas por diferentes PO resultaenunadesestabilizaciónglobal de la proteína.Esto queda demostrado por lo siguiente: i) por una disminución de su estabilidad térmica; u) RESULTADOS Y DISCUSION 119 por un aumentoen la accesibilidadal intercambiohidrógenopor deuterio de los grupos amida del esqueletopeptídicode la forma unidacon respectoa la forma libre. La a- sarcinaes una proteínabásica; a pH neutro poseeuna carganetaaproximadade +7 (Saccoet al., 1983). Por lo tanto, su interaccióncon bicapasde fosfolípidos ácidosestá gobernadaesencialmentepor interaccioneselectrostáticas(Gassetet al., 1989). Esta interacciónproduceunareordenaciónde lamoléculade a-sarcina,ya quelas interacciones electrostáticasen las que intervienenlos gruposcargados positivamente de la misma han de debilitarseparaestablecer interacciones con los grupos negativos de las cabezas polares de los fosfolipidos, lo cual podríaresultar en una desestabilizaciónde la proteína. Un efecto similar ha sido propuestopara la interacciónde ferricitocromo c con vesículas compuestaspor fosfolípidos ácidos (Muga a aL, 199!). Estos autores destacaron la posibilidadde que una desestabilizaciónconformacionalde las proteínasen la superficie de las bicapaspodríarepresentaruna propiedadgeneralde proteínaspolarescuya unión estágobernadaesencialmentepor interaccioneselectrostáticas,tal comoocurrecon la a- sarcina.Surewicza al. (1990) observaronuna conformaciónfluctuante(“bose”) en la subunidadA de la toxina del cólera,sugiriendoque tal conformaciónpodríaser operativa para permitir su adaptacióna diferentes entornos (medio acuoso, interfase disolvente acuoso-membranae interior hidrofóbicode labicapalipídica) en el procesode inserción y translocación a través de membranas. De acuerdo conestaposibilidad, la subunidadB de estatoxina serviríadeportadorpolarparala subunidadA (Surewiczet al., 1990). Al contrario que la toxina del cólera, la a-sarcinaestá formada por una sola cadena polipeptídica. Por lo tanto, la desestabilización observada tras su unión a las bicapas podríaser la responsablede la apariciónde unaregión competentepara insertarseen la membrana.Otrosautores(Endoa al., 1989> hanpostuladoquelos cambiosconformacio- nales mediados por los fosfolipidos podrían ser un factor adicional a aquellos responsables de la induccióny mantenimientodel estadocompetentede la translocaciónposttraduccional de proteínas. RESULTADOS Y DISCUSION 120 7. INTERACCION CON MEMBRANAS DEL PEPTIDO SIINTETICO aS(1l6-l39) CORRESPONDIENTE A LA REGION (116-139) DE LA SECUENCIA DE LA a- SARCINA Caracterización espectroscópicadel péptido sintético aS(l 16-139) En la figura 43 aparece un resumen de las características espectroscópicas del péptido sintético aS. El espectro de absorción UV muestra características típicas de cromóforosde tirosina. El máximode absorciónaparececentradoen torno a los 275 nm. El coeficientedeextinción E0’~ (278 nni, 1 cm) es 1.02, lo cual estáde acuerdocon la presencia de dos residuos de tirosina como únicos cromóforos presentes en esta región del espectro (figura 43A). El péptido aS(1 16-139) exhibe, para una excitación a 275 nm, una única banda de emisión de fluorescencia, con su máximo localizadoen tornoa los 304 nm (figura 43B). El espectro de dicroísmo circular (CD) en la región del Uy-lejano aparece en la figura 43C (espectro a). Los porcentajes de estructura secundaria calculados de este espectro son: 11.0% estructura ¡3 antiparalela, 26% giros ¡3 y 63% estructura no ordenada. El método empleado para la estimación de los diferentes porcentajes de estructura secundaria a partir de los espectros de CD (Perczel a al., 1991), está basado en datosprocedentesde estructurasde proteínas,por lo quepodríano ser la aproximación másadecuadaparaun péptido.En cualquiercaso,considerandosimplementela forma del espectro,la presenciade estructurano ordenadaen el péptido en disoluciónes el hecho más destacado.Asimismo, la estructuradel péptido sintético ha sido analizada en condiciones en las que se maximiza la formación de puentesde hidrógenointramolecula- res. El trifluoroetanol (TFE), promuevela formaciónde puentesde hidrógenointramole- culares en polipéptidos,por lo que sueleconsiderarsecomo un agentemimetizadorde membranas. Por todo esto, se ha analizado el efecto del TFE sobre la conformacióndel péptido, observándosela inducción de conformaciónhelicoidal (figura 43C y 43D). El TFE, hastauna concentracióndel 10%, no tiene efectoalguno sobre la estructuradel péptido, apareciendouna transición conformacionalen el intervalo entre 10% y 40% (figura 43D). El espectrode CD (d) en la figura 43Ccorrespondea una concentraciónde TFE 60%. La estructurasecundariadeducidade esteespectrosería:59% a-hélice, 17% giros ¡3 y 23% estructurano ordenada.Enconclusión,el péptidopuedeadoptarestructuras helicoidalesa pesar de la abundanciade residuos desestabilizadoresde este tipo de estructura(Val, Ile, Thr o Oly). Finalmentecabedecirque el espectrode CD del péptido sintéticoen disolucionesacuosasno cambiaen el intervalo de concentraciones0.3-3.0 mg/ml (0.11-1.13mM). RESULTADOSY DISCUSION 121 u e -o oen -o 0.5 0.4 0.3 0.2 0.! ci u e O)o en O) 1-o O) e ‘o 2 26(} 220 300 mu 2(0 220 •230 240 nii~ 9 Figura 43. Caracterización espectroscópicadel péptido ncs(116-139).(A) Espectro de absorción del péptido aS(l 16-139> (0.5 mg/mI). (B) Espectro de emisión de fluorescencia, para una excitación a 275 nm. Las unidades de fluorescencia son arbitrarias. (C) Espectro de dicroísmo circular en: (a) TFE 0-10%; (b) TFE 20%; (c) TFE 30%; (d) TFE 40-60%. Las unidades de elipticidad molar por residuo [~l songradoscm2dmot’.Los valoresteóricoscorrespondientesa las estructuras secundarias determinadas de los espectros de dicroísmo de acuerdo a Perczel exal. (1991) son (•) para el espectro en ausencia deTFE; (A) en TFE 40%. (D) Elipticidad media por residuo a 220 nm 10I~Q ~,, enunidades de gradostm2dmoV’, frente al porcentaje de TEE. Todas las disoluciones se han preparado en tampón Mops 50 mM, pH 7.0, con NaCí 0.] y EDTA 1 mM. -q -n 20 tfl -12 -8 [01220 10-3 RESULTADOS Y DISCUSION 123 Este último tipo de partículas se podrían relacionar con estructuras discoidales, del mismo tipo que las producidas por la melitina (Dufourcq a al., 1986a,b), por la alameticina (Mclntosh et al., 1982; Chapman et al., 1969) y por la 6-hemolisina (Freer, 1986). Asimismo, aparecen grandes estructuras resultantes de la agregación de estas pequeñas partículas de 50 nm de diámetro. Un aumento de la relación molar péptido/lípido determina la desaparición de partículas individuales; de hecho, a una relación 60:1 (lípido/péptido) lo único que se observa es una red amorfa de estructuras agregadas (figura 44C). Por lo tanto, aparentemente según los cambios morfológicos producidos por el péptido o~S(1 16-139), éste provoca fragmentación de vesículas. (r) 0.2 0.1 Figura 45. Efecto del péptido aS(1 16-139) sobre el comportamiento termotrdpico de vesículas de DMPG. Las muestras se disolvieron en tampón Mops 50 mM, pH 7.0, con NaCí 0.1 M y EDTA 1 mM. Se emplea una concentración constante de DMPG-DPH (120 nmoles) y diferentes relaciones molares péptido/lípido: (A) 0; (B) 0.05; (C) 0.10; (D) 0.15 y (E) 0.30. Recuadro:incrementodeanisotropíade fluorescenciade DPI?medidoa 350C, fl(r) 35, en función de la relación molar lípido/péptido (R). Los correspondientes A(r)35 se calculan con respecto el valor de anisotropía del lípido puro a 35’C. 20 30 RESULTADOSY DISCUSION 124 La interacciónentre el péptido y las vesículas de fosfolípidos también puede deducirsedel análisisde los efectosqueproduceéstesobre el comportamiento termotrópi- co de vesículasde DMPO. El péptido modifica la transiciónde fasede las vesículas.En la figura 45 apareceel perfil de variaciónde anisotropíade vesículasde DMPG marcadas con DPH, a diferentesrelacionespéptido/lípido. Estasmedidasse han realizadohasta60 0C no observándosetransicionesadicionales.La anisotropíade fluorescenciadel DPI-I disminuye paulatinamenteuna vez producida la transición que, en el caso de este fosfolípido, ocurrea los 230Caproximadamente.La adicióndepéptidono provocacambio algunoen dicho valor de temperaturasino queproduceunaprogresivadisminuciónde la amplitud de la transicióna medidaqueaumentala relaciónmolar péptido/lípido. El valor de anisotropíadisminuyeligeramenteen el estadogel, mientrasqueaumentasignificativa- menteaT > T~. Los valoresde anisotropíade DPH (r) a 350C sepuedenemplearpara poner de manifiesto los efectosdel péptido sobre el comportamientotermotrópicodel lípido (figura 45, recuadro). El efectodel péptidoes máximo a unarelación molar 3:1 lípido/péptido (R= 0.3), en donde se elimina totalmentela transición. La a-sarcina tambiéndisminuyela amplitudde la transiciónde fasede las vesículasde DMPG, aunque en menorextensiónque la producidapor el péptidoaS(116-139). El efectode la proteína se saturaa una relación molar 50:1 (lípido/proteína)sin llegar a eliminar totalmentela transición del fosfolípido (Gasseta al., 1989). La adición del péptido crS(116-139)a unasuspesiónde vesículasde fosfolípidos cargadasnegativamenteprovocaun moderadoaumentode la turbidez de la misma.La absorciónaparentea 360 nm de la mezclaaumentaconel tiempo, requiriéndose1 h para estabilizarsedichovalor, aunqueel 80% de la variacióntotal seproduceen los primeros ío mm de la reacción.En la figura 46A apareceun resumende los resultadosobtenidos. Puedeobservarseque se requiereuna relación molar mínimade 1:10 (péptido/DMPG) para observarvariación en la absorciónaparente,saturéndoseel efectoa una relación molar 3:1. Ensayadaen las mismascondiciones,la a-sarcinaproduceun AA,~ máximo 2.5 veces mayor queel producidopor el péptido sintético, saturándoseel efectoa una relaciónmolar 50:1 (DMPO/péptido)(Gasseta al., 1989).En estecaso,esteincremento de absorciónse ha relacionadocon la agregacióny fusión de vesículas unilamelares grandespromovidapor la proteína(Gassetaal., 1989, 1990). El péptidoaS(116-139)destabilizalas vesículasde DMPG produciendomezclade lípidos entrediferentesvesículastal y como se detectamedianteel ensayoclásico de dilución de sondas(Struck a al., 1981). En la figura 46B apareceun resumende los resultadosobtenidosconesteensayo.La dependenciadel porcentajede transferenciade energía(% ET) respectode la concentraciónde péptido muestraun comportamiento RESULTADOS Y DISCUSION 125 0.10 0.08 AA3~ 0.06 0.04 0.02 (%ET) (%) 80 80 70 60 60 40 50 20 40 Dl 0.2 péptido/lípido (R) Figura 46. Estudio de la interacción del péptido aS(116-L39) con vesículas de DMPG. (A) Variación de la absorción a 360 nm de una suspensión de vesículas de DMPG (30 nmoles) producida por diferentes cantidades del péptido aS(l 16-139). Los valoresde AA~ calculados tras 1 h de reacción se representan frente a la relación péptido/lípido (R). (B) Mezclade lípidos promovida por el péptido sintético aS(1 16-139). Los resultadosse expresancomoporcentajede transferenciade energía(%ET), calculadosapartir de la emisiónde fluorescenciaa 530 nmn de la sonda NBD-PE (véaseparteexperimental)tras excitación a 450 nm, frente a la relaciónmolar péptido/lípido(R). La concentraciónde DMPG fue de 75 nmoles/ml. (C) Porcentajesdel máximo (@) y máximo %ET (á) frentea la relaciónmolar péptido/lipido.(U) Variación de los porcentajesde anisotropíade DPH a 35”C (tomadosde la figura 44) frente a la relaciónmolar péptido/lípido. Se considera100% el valor de anisotropíaa 35 0C del lípido puro. Todas las disolucionesfueron preparadasen tampón Mops 50 mM, pH 7.0, con NaCí 0.1 M y EDIA 1 mM. Los resultadosson el promediode tres medicionesindependientes. relación molar péptido/lípido (R) 0.2 relación molar péptido/lipido (R) relación molar RESULTADOSY DISCUSION 126 sigmoideo, similar al que apareceen la variaciónde los valoresde AA3~. El procesose satura a una relación molar entre 3-4 (lípido/péptido). La variación del (%ET) en el ensayode mezclade lípidos es consistentecon una dilución de las sondasentre 4 y 5 veces. Considerandoque la relación vesículas marcadas/nomarcadas es 1:9, esta observaciónindicaría que no hay una gran extensiónen la mezclade lípidos, pues la máximadilución que podríadarseseríade 10 veces. En estascondiciones,la cr-sarcina producela máximamezclade lípidos que se puededetectarcon esteensayo,hecho que quedacorroboradomedianteestudiosde microscopiaelectrónica.De nuevo, el efectose saturaa una relación molar 50:1 (lípido/a-sarcina). Cuando los valores de AA3~ y de (% ET) se expresanen forma porcentual, considerandola máxima variación observadaen cadaensayo como el 100%, y se representanfrentea la relaciónmolar péptido/DMPG(figura 46C),puedeobservarseque los dos procesosson paralelos.Asimismo se ponede manifiestoque el péptido modifica el empaquetamientode los lípidos, tal y comose deducedel análisis de los efectosdel péptidosobrela transiciónde fasedel lípido, arelacionesa las queaúnno sehadetectado efectoalgunoa nivel de agregacióno de mecíade lípidos. La relacióna la que se saturan los tres efectoses, sin embargo,la misma. En este sentido,es interesantedestacarque, de acuerdoconla composiciónde aminoácidosdelpéptidoaS(116-139),éstepresentauna carga netaa pI-! 7.0 de +4. La variaciónde A3~, la mezclade lípidos y la variaciónde los valoresde anisotropíasesaturana una relaciónmolar 3:1 (DMPG/péptido), lo cual correspondea una relación de cargasde aproximadamente1.3. Todo ello sugiere la implicación de la neutralizaciónde cargasen el procesode interacciónpéptido-lípido. El péptido aS(l16-139) promueve la liberación de los contenidosacuososde vesículasde PS.La adicióndel péptidoa unasuspensiónde vesículasde PS quecontienen en su interior ANTS-DPX (verparteexperimental)determinaun aumentodela intensidad de fluorescenciadel ANTS dependientedel tiempo, lo cual es indicativo de la eliminación del apagamientoque ejerce el DPX sobreel ANTS, esdecir, indicativo de la liberación y dilución de amboscompuestosal medioextravesicular(Ellensel al., 1985; Parenteel al., 1990). La máxima intensidadde fluorescenciaobservadatras la adición de péptido representaun 70% de la que aparecetras liberar la totalidad de los contenidosacuosos (100% de Liberación) mediante la lisis vesicular con Triton X-100 (1% concentración final). El efecto observado es dependiente de la concentración de péptido (figura 47A). Tanto las velocidades iniciales de liberación como la extensiónen la que se produce muestran una dependencia similar con la concentración de péptido, saturándoseambosa una relaciónmolar de 10:1 (lípido/péptido). La a-sarcinatambiénproduceliberaciónde contenidosacuososintravesiculares,saturándosesu efectoa una relaciónmolar 50:1 RESULTADOS Y DISCUSION 127 (%)L (%) Lis so 7 60 5 40 3 20 1 (%) ET 70 60 50 40 0.2 0.3 péptido/lipido (R) Figura 47. Liberación de contenidos acuosos y mezcla de lípidos de vesículas unilamelaresgrandesde PS de cerebrobovino promovidaspor el péptido aS(116-139).(A) Liberación de contenidosacuososde vesículasde PS (60 mnoles/mI)quecontienenANTS-DPX (ver parteexperimental)promovidapor el péptidoaS(116-139).Los valoresse expresanenforma porcentual considerando 100%comoel valor de intensidaddefluorescenciamedido trastratar las vesículascon Triton X-100 a una concentraciónfinal del 1% (@) Valores de porcentajede liberación (%L) 5 mm. despuésde la adición de la correspondientecantidadde péptido. (~) Velocidades iniciales de liberación(%L/s) calculadasa partir de las cinéticas de variación de intensidaddefluorescenciadel ANTS (véasefigura 48). Ambosparámetrosse representanfrente a la relaciónmolar péptido/lípido(R). (B) Mezcla de lípidos, en unidadesde %ET (véaseParte experimental),de vesículasunilamelaresgrandesde PS inducido por el péptido aS(l16-139). Todos los ensayoshan sido realizadosen Mops 50 mM, pH 7.0, con NaCí 0.1 M y EDTA 1 mM, a 3’70C y a unaconcentraciónconstantede lípido (60 nmoles/ml), en un volumen total de lmL 0.1 relaciónmolar RESULTADOSY DISCUSION ¡28 (lípido/a-sarcina)(Gassetet al., 1990). El péptidosintético tambiénproducemezclade lípidos entrevesículasde PS. Un resumende los resultadosobtenidosapareceen la figura 47B. Cantidadescrecientesde péptido hastauna relación molar 5:1 (lípido/péptido) producensólamenteuna ligera disminucióndel %ET. apareciendouna drásticadisminuciónen el intervalode relaciones molaresentre5 y 3 (R: lípido/péptido).Puedeobservarseque los procesosde mezclade lípidos y de liberacióndecontenidosintravesicularesno transcurrenparalelamente(figuras 47A y 47B). Este mismo aspectotambién se deducedel análisis cinético de ambos procesos(figura 48>. La liberación de contenidoses un procesomás rápido que el de mezclade contenidos,en términos de velocidad inicial seríaunas20 vecesmás rápido. Esto sugiere que la interacción es un proceso secuencialen la que la liberación de contenidosacuososseríaprevia a la mezclade lípidos. (%) 80 60 40 20 5 Figura 48. Cinéticas de mezcla de lípidos y de liberación de contenidos acuososde vesículas unilamelares grandes de PSde cerebro promovidas por el péptido aS(116-139).(A) Cinética de liberación de contenidos acuosos y (B) de mezcla de lípidos, expresadascomo porcentajesde las correspondientesvariacionesmáximas promovidas por el péptido. Ambas cinéticascorrespondenamuestrasquecontienen60 nmolesdePSy 15 nmolesdepéptidoa 370C, en un volumen final de 1 ml. RESULTADOS Y DISCUSION 129 Cambios conformacionalesdel péptidoocS(l16-139)inducidospor la interacción con vesículas lipídicas La conformación del péptido sintético aS(1 16-139) se ve modificada como consecuencia de la interacción con vesículas lipidicas. La figura 49 muestra los espectros de dicroísmocircularde diferentesmezclaspéptido-lípido.Es conocidoque la turbidezde la muestrapuedeser origen de distorsionesen estetipo de espectros;sin embargo,en nuestras condiciones experimentales,las concentracionesde péptido y de vesículas empleadas,así como el pequeñopasoóptico de la cubeta(0.01 cm), minimizaron esta posibledistorsión. De hecho,la señalde dicroísmode la ribonucleasaA, unaproteínaque no interaccionaconestasvesículas,no seve afectadapor valoresde turbidezigualesa los producidospor el péptido c~S(116-139) sobrelas vesículas.El análisisde los espectrosde CD de las mezclaspéptido-vesiculasmuestraun significativo aumentodel contenidoen estructurafi, en oposiciónal efectoqueejerceel TFE sobre la conformacióndel péptido, que induceestructurasde tipo a-hélice(figura 43). El efectode los fosfolípidos sobrela conformacióndel péptidose ve saturadoa unarelaciónaproximadade0.3 péptido/lípido, la mismarelación que la observadapara los otrosefectosinducidospor el péptido sobre las vesículas.La estructurasecundariacalculadaapartirdel espectrode CD de unamezcla 3:1 lípido/péptido(figura 490 estadacompuestapor un 10% a-hélice,55% estructurafi antiparalela,8% giros y 27% de estructurano ordenada.Tal y comose ha indicadopara el péptido en disolución, estos valoreshan de tomarse cautelosamenteya que han sido determinadosconsiderandouna base de datos relativa a moléculasde proteínay no de péptidos. Además, en este caso los valores significativos de elipticidad que se han consideradoson los comprendidosen el intervalo 210-250nm, lo cual limita la exactitud de la anterior estimación.En cualquiercaso,simplementemediantela observaciónde la forma de los espectros,cabe concluir que existe una inducción de estructura fi a consecuenciade la interaccióncon vesículaslipídicas. Esteaumentoen estructurafi está claramenteen contrastecon la inducción de estructuraen a-hélicepor TFE (figuras 43C y 43D). DISCUSION El modelo de la conformaciónde la a-sarcinapropuestoen un capítuloanterior propone la existencia en esta proteína de un núcleo hidrofóbico formado por cuatro cadenasfi. Este núcleose ha consideradocomoun posible candidatoresponsablede las interacciones hidrofóbicas que se producen entre la a-sarcina y bicapas lipídicas. Dos de estascuatrohebrasfi se encuentranconsecutivasen la secuenciade la a-sarcina,en la RESULTADOS Y DISCUSION 130 7? -4 6 & -8 I0 910 220 230 240 (nm) -2 -4 t-~ o -6 -8 o 0.4 0.8 relaciónmolar lípido/péptido Figura 49. Espectrosde dicroísmocircular en la región del UY-lejano del péptido aS(116-139) en ausencia y presencia de vesículas de DMFG. Los diferentes espectros corresponden a diferentesrelacionesmolareslípido/péptido:(a) 0; (b) 0.15; (c) 0.43; (d) 0.73; (e) 1.07; (0 3.00. Las unidadesde elipticidad molar por residuo, [O], son gradoscm2~dmoF’. Recuadro:variación de [Oj a 210 nm frente a la relaciónmolar lípido/péptido.Las muestrasse prepararonen Mops 50 mM, pH 7.0, con NaCí 0.1 M y EDTA 1 mM. regióncomprendidaentrelos residuos120-135.Paraevaluarla posibleimplicaciónde esta región en las interaccioneshidrofóbicascon membranashemossintetizadoel péptido ~S(116-139) que comprendeno sólo las dos anteriores hebras fi sino también tres porcionesde cuatroresiduosque las limitan, y que se predicencomogiros fi. Los resultadosobtenidosdemuestranqueel péptidoaS(116-139) interaccionacon -12 vesículasunilamelaresgrandescargadasnegativamente,tanto de fosfolípidos naturales RESULTADOS Y DISCUSION 131 como de fosfolípidos sintéticos. Los resultadossugierenla implicaciónde interacciones electrostáticasy de interacciones hidrofóbicas. El efecto del péptido sobre la transición de fase de las vesículas es drástico, y sugiere la inserción del mismo en la bicapa.De hecho, el péptido llegaaeliminar totalmentedicha transición,lo cual es precisamentelo esperable parauna moléculade carácterintegral que restringe la movilidadde las cadenasde acilo de los fosfolípidos. La eliminación de la transición de fase de las bicapas ha sido observadatambiénen la interacciónde la cardiotoxina II, un péptido de 60 residuosde aminoácidos,consideradocomoagentelítico, con vesículasde PS y PG (Fauconet al., 1983). El pépridosintéticoaS(l16-l39)tambiénproduceuna aparentefragmentaciónde las vesículas.La disrupción de bicapasde fosfolípidos por polipéptidos en micelaso pequeñasvesículas ha sido observadaen otros casos; así, ha sido observadacon apolipoproteinas(Brouilletteel al., 1984; Anantharamaiahel al., 1985), y conla proteína básica de la mielina (Roux el al., 1994). Un efecto similar ha sido reveladopara el péptidoglucagón(Jonesel al., 1978), melitina(Dufourc el al., 1986, 1989; Dufourcqel aL, 1986a,b),alameticina(Mclntosh etal., 1982; Chapmanetal., 1969) y ¿-hemolisina (Freer, 1986). A este respecto,la melitina es un péptido lítico de 26 aminoácidosque exhibeciertasimilitud de secuencia(alrededorde un 20%) con el péptido aS(116-139). La liberaciónde los contenidosacuososintravesicularespromovidapor el péptidoaS(116- 139) podría estar relacionadacon tales cambiosmorfológicos. Estos efectosse pueden modelizar del siguiente modo: en primer lugar, el péptido, cargado positivamente, interaccionaelectrostáticamentecon la superficie de la vesícula, que posee una alta densidadde cargasnegativas.Posteriormente,teniendoen cuentala estequiometríade la unión, se produceunaneutralizaciónde cargasen el complejopéptido-lípido.Tras esta primera etapade adsorciónelectrostática,sepuedenproducir interaccioneshidrofóbicas conla regiónde lascadenasde acilode los fosfolípidos, las cualesinduciríanperturbacio- nes a este nivel. Consecuenciadirecta de estas perturbacioneshidrofóbicas seria la modificaciónde las propiedadesde permeabilidadde las vesículascon lo que se induciría la liberaciónde contenidosintravesiculares,asícomola inducciónde fragmentaciónde las vesículas. Las estructurasresultantespodrían relacionarsecon pequeñasvesículasy micelas,segúnsederivade las micrografíasobtenidasmediantemicroscopiaelectrónica. Cabedecirque no seobservaunaliberacióntotal de contenidosintravesiculares,queseria lo esperablesi el péptidoaS(l16-139) actuasea modo de detergente.En cualquiercaso, la presenciade estructurastipo micela no puededescartarse. El péptido también produceun ligero aumentode la turbidez de la mezclade reacción. Esta variación de absorción aparentesólo se observa a relacionesmolares péptido/lípidomayoresque las requeridaspara inducir liberaciónde contenidosacuosos. El valor de absorciónaparente,obtenido tras la agregaciónde vesículas unilamelares RESULTADOS Y DISCUSION 132 grandes inducida por a-sarcina, es mucho mayor que el inducido por el péptido. Podría sugerirse que el ligero aumento de turbidezinducidopor el péptidosedebeala formación de agregadosde las partículasmenosde 50 nm de diámetroobservadaspor microscopia electrónica (figura 44>. El péptido también induce mezcla de Jipidos entre diferentes vesículas. Este fenómenorequiere relaciones molares péptido/lípido mayores que las necesariasparadesencadenarla liberaciónde contenidosacuososy para la inducción de perturbacionesen la bicapa. Por ello, la mezclade lípidos podríaocurrir en los agregados anteriores.Esto podríaestarcorroboradoporel hechode que no seobservauna extensiva mezcla de lípidos. Las estructuras más pequeñasformadaspor el péptido, estructurasde tipo micela, no estaríanimplicadasen tal mezcla,por lo que la dilución de las sondasno podríadarseen toda la poblacióndevesículas.El valor mínimo de %ET seríamayorque el esperadosi seprodujesela máximamezclade lípidos. La dependenciacon respectoa la concentraciónde péptido,tanto de la mezclade lípidos como de la variación de absorción,podríasugerir la existenciade interacciones péptido-péptido.Con respectoa esta posibilidad, no se han detectadocambios en la estructurasecundariadel péptidoaS(116-139) en un amplio intervalo deconcentraciones, lo cual podríadescartarla posibilidadde que la unidadcompetenteparainteraccionarcon membranassea un agregadode péptidos monoméricos.Asimismo, el péptido poseeun residuode cisteínaque podríaparticiparen un procesode agregacióntras la interacción con membranas.Sin embargo,la carboxiamidometilaciónde mezclaspéptido-vesículas revelala ausenciade residuosde cistina. En cuantoa la posiblerelaciónentreel péptidocomotal y comoparteestructural de la cx-sarcina, se puede decir que los efectosobservadosinducidospor ambossobre membranasson cualitativamentesimilares. La a-sarcina,al igual que el péptido, induce mezclade lípidos, liberacióndecontenidosacuososy alteracionesen el empaquetamiento lipídico. Sin embargo,se observandiferencias significativas en cuanto a los cambios morfológicos inducidos sobre las membranas.Mientras que el péptido produce una fragmentaciónaparentede las vesículas,la a-sarcinainduce grandesagregadosde las mismas,así comoestructurasfusionadas(Gassetet al., 1990). Asimismo, cabedestacar el hecho de que el residuo de cisteina-132 de la a-sarcina, equivalente al del péptido aS(116-139),participaen la formaciónde un puentedisulfuro en la proteinanativa. Esta diferenciaestructuralpodríaser un motivo queorigine las diferenciasde comportamiento convesiculasqueseobservanentreambos.Sin embargo,apesarde ello, la capacidaddel péptido aS(116-139) parainteraccionarcon membranaspermite proponera estaregión comoparticipanteen las interaccioneshidrofóbicasentre la a-sarcinay membranas.El espectrode CD del péptidoaS(l16-139) en presenciade lípidos revelaun alto contenido RESULTADOS Y DISCUSION 133 en estructurafi, en contraste con la inducción de estructura a-hélice producida por TFE. Este se ha considerado,en ocasiones,como un promotor de estructurashelicoidales (Merutka y Stellwagen,1989; Nelsony Kallenbach, 1989), así como un potenciadorde a-hélices (Narayananet al., 1986). En este último caso, la formación de estructuras helicoidadesseproduceen tanto en cuanto los residuosde aminoácidosdel polipéptido tenganuna propensiónintrínsecapara formar estetipo de estructuras.En cualquiercaso, se suele considerarcomo agentemimetizadorde membranas,por cuantopromueve la formaciónde puentesde hidrógenointramoleculares,del mismomodoque las membranas. Así, aunqueel péptido sintéticopuedeadoptaruna estructurahelicoidal en presenciade TFE, ésta no es la conformaciónadoptadaen presenciade vesículaslipidicas. En este sentido,péptidossintéticoscorrespondientesal dominio de unión de lípidos de la proteína apo B- 100, adoptanunaestructurapreferentementefi en presenciade lípidos (Lins et al., 1994), hecho que contrastacon la adopción de estructurashelicoidales por numerosos péptidostras su interacciónconbicapas(Martin elaL, 1993). Lins et al., (1994>sugieren que una estructurafi hidrofóbica podría ser un motivo estructuralactivo como agente interaccionantecon membranas.Una conclusiónsimilar podríaobtenerseparael péptido aS(116-139) de la a-sarcina:las anteriorescadenasfi predichasen la a-sarcinapodrían estar implicadas en la interacción hidrofóbica que se produceentre la a-sarcinay las membranas. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 135 1. La y-sarcinainteraccionacon las vesículasde DMPS de modo similar a como lo hacecon las de DMPG. La diferente afinidad observadase explicaríaen virtud de la capacidadque tiene la PS para formar puentesde hidrógenointerlipídicos, y de Ja que careceel PG. 2. La a-sarcinaescapazde degradartRNA encapsuladoenvesículasde asolectina. A su vez, la toxina es degradadapor tripsina encapsuladaen tales vesículas. Estas observacionesestarían de acuerdo con una translocaciónde la cv-sarcina al interior vesicular. 3. La interacciónde la a-sarcinacon las vesículasconducea la formaciónde un dímerode éstas,mantenidopor interaccionesproteína-proteína.Esto sucedeen unaescala de tiempo del ordende milisegundos.La posteriordesestabilizaciónde la bicapasucede en una escaladel ordende segundos. 4. La interacciónde la a-sarcinacon vesículasse traduceen una disminuciónde la estabilidadde la proteína. 5. La interacciónde la a-sarcinacon vesículasno requierede la estructuranativa de la proteína. La a-sarcina reducida y carboxiamidometilada,que sólo contendría estructurafi y giros fi, comoordenacionesperiódicas,promuevesobrevesículassimilares efectosa los causadospor la proteínanativa. 6. La a-sarcinapresentaríauna lámina fi hidrofóbica,que estaríaimplicadaen las jnteraccionesde la proteínacon la zonade las cadenasde acilo de la bicapa. Un péptido sintético que contienela región (1 16-139) de la proteína,en la que estaríandos de las hebras de la anterior lámina, origina efectos sobre las vesículas similares a los que producela proteína.Dicho péptido adoptaunaconformaciónfi al interaccionarcon las vesículas. BIBLIOGRAFIA BIRLIOGRAFIA 137 Abola, E.E., Berstein, F.C., Bryant, S.H., Koetzle, T.F. y Weng, J. (1987) En CrystallograficDatabases(Alíen, F.H., Gergerhoff, G. y Sievers,R., Eds.); PP. 107-132. Cambridge,Chester. Alder, G.M., Bashford, C.L. y Pasternak,CA. (1990) J. Menibr. RbI., 113, 67-74 Allured, V.S., Collier, R.J., Carroll, S.F. y McKay, D.B. (1986>Proc. NiaL AcatÉ Sci. USA, 83, 1320-1324 Alonso, M.A. y Carrasco, L. (1981) FERSLea., 127, 112-114 Alonso, M.A. y Carrasco, L. (1982) Eur. J. Biochem.,127, 567-569 Anantharamaiah, G.M., Jones, J.L., Brouillet, C.G., Schmidt, C.F., Hong-Chung. B., Hughes, T.A., Bhown, A.S. y Segrest, J.P. (1985) J. Rial. C/zem.,260, 10248- 10255 Anba, J., Pagés,J.M. y Lazdunski, C. 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(1986) TrendsRbec/tem.Sci., 11, 512-515 ESTUDIO DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LA CITOTOXINA alfa-SARCINA ÍNDICE ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES BÁSICOS ACERCA DE LA alfa-SARCINA INFORMACIÓN ADICIONAL OBJETIVOS PARTE EXPERIMENTAL Materiales Purificación de la alfa-sarcina Espectros de absorción en la región UV-visible Espectros de dicroísmo circular Espectros de fluorescencia Medidas de polarización de fluorescencia Espectros de absorción en el infrarrojo Formación de vesículas de fosfolípidos Ensayos de unión proteína-vesícula Ensayos de agregación de vesículas Ensayos de mezcla de lípidos Estudios de permeabilidad de membrana Ensayos de mezcla de contenidos acuosos Medidas de dispersión de luz a 90º mediante técnicas de flujo detenido Calorimetría diferencial de barrido Encapsulación de tripsina en vesículas de fosfolípidos Digestión tríptica intravesicular de alfa-sarcina Degradación de tRNA en vesículos de fosfolípidos Degradación dc tRNA encapsulado por alfa-sarcina Fotomarcaje de alfa-sarcina Microscopía electrónica Reducción y carboxiamidometilación de alfa-sarcina Análisis de aminoácidos Digestiones proteolíticas Ensayo de actividad ribonucleasa de la alfa-sarcina Alineamiento y comparaciones de secuencias de aminoácidos. Predicción de estructuras secundarias Determinación de los contenidos de estructura secundaria a partir de los espectros de CD y de FTIR Síntesis y purificación del péptido alfa5(116-139) RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Agregación y mezcla de lípidos de vesículas de dimiristoilfosfatidilserina por alfa-sarcina 2. Translocación de alfa-sarcina a través de la bicapa lipídica de vesículas de asolectina 3. Predicción de la conformación de la proteína alfa-sarcina: modelo estructural para explicar la interacción alfa-sarcina-me 4. Estudio cinético de la agregación y mezcla de lípidos de vesículas de PG y PS producidas por alfa-sarcina: medidas de disp 5. Caracterización espectroscópica de la alfa-sarcina reducida y carboxia-midometilada. Análisis de los requerimientos estruc 6. Desnaturalización térmica de la alfa-sarcina: desestabilización de la proteína inducida por la unión a membranas 7. Interacción con membranas del péptido sintético alfa5(116-139) correspondiente a la región (116-139) de la secuencia de l CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA HG: