UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Departamento de Fisiología Animal II PAPEL DE ENDOGLINA Y ALK-1 EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE TGF-ß MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Francisco Javier Blanco López Bajo la dirección del doctor: Carmelo Bernabéu Quirante Madrid © Francisco Javier Blanco López , 2006 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA ANIMAL (II) PAPEL DE ENDOGLINA Y ALK-1 EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE TGF-β TESIS DOCTORAL FRANCISCO JAVIER BLANCO LÓPEZ Madrid, 2006 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE BIOLOGÍA Departamento de Fisiología Animal (II) PAPEL DE ENDOGLINA Y ALK-1 EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE TGF-β Memoria presentada por FRANCISCO JAVIER BLANCO LÓPEZ Para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas Realizada en el Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC) bajo la dirección del Dr. Carmelo Bernabéu Quirante VºBº del director de la tesis Carmelo Bernabéu Quirante VºBº del interesado Francisco Javier Blanco López Este trabajo ha sido realizado con cargo a los proyectos: SAF2000-0132 del Ministerio de Ciencia y Tecnología, Plan Nacional de I+D: "Endoglina, un receptor endotelial implicado en la remodelación vascular". Período 2000-2003. Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC. Madrid. Investigador Principal: Carmelo Bernabéu Quirante. PI020200 del Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación tecnológica (I+D+I). Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigación Sanitaria, "Bases moleculares de la telangiectasia Hemorrágica hereditaria. Detección y relevancia funcional de mutaciones en el gen de endoglina". Período 2002-2005. Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC. Madrid. Investigador Principal: Carmelo Bernabéu Quirante. SAF2004-01390 del Ministerio de Educación y Ciencia, Plan Nacional de I+D: "Estudios sobre endoglina, un co-receptor de TGF-beta implicado en la patología humana". Período 2004- 2007. Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC. Madrid. Investigador Principal: Carmelo Bernabéu Quirante. El más terrible de los sentimientos es el sentimiento de tener la esperanza perdida. Federico García Lorca. Te pasas años y años investigando y, de repente, en un suspiro das con un gran descubrimiento y eres consciente, por primera vez en tu vida, de que conoces algo que a esa misma hora y ese mismo día nadie más sabe. Judah Folkman, 1961. Descubridor de la angiogénesis inducida por tumores. Premio Príncipe de Asturias 2004 junto con T. Hunter, B. Vogelstein, R. A. Weinberg y Joan Massagué CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES D. CARMELO BERNABEU QUIRANTE, Profesor de Investigaci6n del Centro de Investigaciones Bioldgicas, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas, CERTIFICA Que D. Francisco Javier Blanco Lopez, Licenciado en Bioquimica por la Universidad de Granada, ha realizado bajo mi direcci6n el proyecto correspondiente a su Tesis Doctoral titulado "Papel de endoglina y ALKl en la via de seiializaci6n de TGF-beta" y que dicho trabajo refine 10s requisitos necesarios para su presentacidn como Tesis Doctoral en el Departamento de Fisiologia Animal I1 de la Universidad Complutense de Madrid. Fdo. Dr. Carmelo Bernabeu Quirante RAMIRO DE MAEZTU. 9 28040 MADRID. ESPANA TEL.:+3491 83731 I2 FAX: +34 91 536 04 32 A Gema ! _____________________________________________________________Agradecimientos Son casi las ocho de la tarde. Salgo del CIB y voy escuchando Lagartija Nick. Voy pensando en cómo escribir la forma de dar las gracias a las personas que han estado a mi lado apoyándome en mi tesis que está a punto de terminar. Después de casi cinco años es difícil acordarse de todos pero lo voy intentando. Por supuesto recuerdo a Enrique, que con los pocos medios de los que disponía en esa época en Granada me dio las alas para volar por el universo de las moléculas. Merche se encargó, aquí en Madrid gracias a Carmelo, de enseñarme a moverlas como nadie mejor lo podría haber hecho. A lo largo de este tiempo siempre han estado Carmen y Luisa, que han tenido tiempo para escuchar mis disparates. Recuerdo que una vez hablando con Tilman, de cien ideas que me vienen a la cabeza, cinco podrían tener sentido y finalmente sale una (o ninguna). La ciencia es así, aunque Juan Francisco me ha mostrado que “eventualmente” en todos los disparates hay parte de verdad. Realmente ha sido un placer ser vuestro discípulo. La investigación es un mundo duro y difícil, como si de una carrera de fondo se tratase, en la que no gana siempre el mejor sino el que más aguanta. A pesar de esto, Ángel Corbí insiste en que la ciencia debe primar y no debo dejar que nadie me derrote. Y entonces recuerdo tantas palabras de ánimo de Soichi en el RIKEN, allá en Japón. Ojalá algún día nos volvamos a ver. Seguro que a Arturo le gustaría ir y organizaría un viaje con todo el mundo. El reportaje fotográfico correría a cargo de África, Eva y Lu. A la vuelta, Amaya, Diego, Esther, Carlos y Elena no creo que echaran de menos el sushi. Van pasando las canciones y comienzo a escuchar a Los Planetas. Recuerdo entonces aquellas salidas por Huertas que a duras penas intentaban desconectarme del laboratorio. Y es que con Pedro Carmona, desde cuando aún se pagaba en pesetas, la noche siempre tiene un momento para experimentos. Es como un vicio que tiene. Aún así, seguimos pensando que si no triunfamos con la música nos dedicaremos a la ciencia. He salido ya de Madrid, y la canción “cada vez” me recuerda a todas las personas a las que me gustaría sentir su corazón y que ya no están; aunque seguro que no nos han olvidado allí donde se encuentren, observándonos cada una desde su rinconcito de cielo. Los Enemigos suenan a continuación, formando parte esencial de la banda sonora de esta tesis. Me vienen recuerdos de Andrés Castillo y todos mis amigos de Úbeda, Luis, Ángel S, Nano, Acapulco, Ángel M, Murillo, Fernando, Paco M, José María, Fran S, Isra. Me suelen preguntar que cuándo voy a inventar algo. A veces les digo entre risas que soy investigador y no inventor. Carmen siempre me pregunta cómo me va y sobre qué investigo. Siempre me dice que qué cosas más raras. La mayoría me dicen que me aplique y a ver si les saco de pobres y pienso, haciendo alegoría a un dicho de mi pueblo, que la venida de los cigarrones será primero. Cuando descubra algo, como me dijo Lucía, siempre habrá sitio para una molécula H. Pienso también que algún día debería disculparme con María V, Dani, Julia, Felipe, María G, Emilia, Pedro, Lourdes, Juanjo, Jacinto, Francis, Antonio, por las veces en las que he sido un poco pesadito cuando salía una conversación sobre moléculas y les ponía la cabeza como un bombo. Los Piratas hacen su aparición antes de llegar a casa y me gustaría ser también como aquella canción de los años ochenta, Bloody Maries en el bar, un déjà vu, Matrix está cambiando. A cada rato voy pensando en Gema. Alucino con ella desde hace más de nueve años. Me escucha, me soporta, nos reímos y, sobre todo, es mi amiga. Somos enfermos, pero es que nunca tuve una enfermedad más dulce. Dentro de unos días defiendo la tesis. Me muero de ganas porque mi familia estará y por fin sabrán en qué he estado trabajando todo este tiempo. Hasta entonces sigo hablando con las nubes, ellas me enseñan lo que tuve. Blanco _________________________________________________________________Abreviaturas ALK-1: Kinasa similar al receptor de activina 1 ALK-5: Kinasa similar al receptor de activina 5 BRE: Elemento de respuesta a BMP (proteína morfogenética del hueso) CAGA: Secuencia consenso para la unión de Smad3 cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementario Dox: Doxiciclina EDTA: Ácido etilen-diamino-tetraacético FBS: Suero bovino fetal HHT: Telangiectasia hemorrágica hereditaria, síndrome de Rendu-Osler-Weber kDa: Kilodaltons MBS: Tampón MES salino MES: Ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico pb: Pares de bases PBS: Tampón fosfato salino PCR: Reacción en cadena de la polimerasa RNA: Ácido ribonucleico SAβGal: Actividad β-galactosidasa asociada a senescencia SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil-sulfato sódico siRNA: Pequeñas moléculas de RNA de interferencia SP-A/-G: Proteína A/G acoplada covalentemente a sefarosa TβR: Receptor de TGF-β TBS: Tampón Tris [Tris(hidroximetil)aminometano, H2NC(CH2OH)3] salino TGF-β: Factor de crecimiento transformante-β X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido _______________________________________________________________________Índice i I. INTRODUCCIÓN 1.1. Angiogénesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2. La superfamilia del TGF-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.3. Receptores de TGF-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.3.1. Receptores tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.3.2. Receptores tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.3.2.1. ALK-5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.3.2.2. ALK-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.3.3. Las proteínas Smad. Modelo de señalización de TGF-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.4. Endoglina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.4.1. Distribución celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.4.2. Características bioquímicas de endoglina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.4.3. Funciones que desempeña endoglina en la célula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.4.4. Endoglina y ALK-1 como genes responsables de la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.5. Caveolas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.5.1. Caveolinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.5.2. Regulación de la vía de señalización de TGF-β por caveolina-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 II. OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Cultivos celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.2. Anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.3. Vectores de expresión y transfección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.4. Construcción y expresión de la proteína de fusión EndoEC-Fc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.4.1. Obtención del vector de expresión para EndoEC-Fc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.4.2. Generación de transfectantes estables productores de la proteína recombinante EndoEC-Fc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.5. Ensayos de proliferación celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 _______________________________________________________________________Índice ii 3.6. Citometría de flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 3.7. Microscopía de inmunofluorescencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.8. Inmunoprecipitación de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.9. Ensayos de arrastre in vitro (pull-down) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.10. Fraccionamiento celular para la obtención de caveolas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.11. Electroforesis e inmunodetección (western-blot) de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.12. Estudio de la señalización de TGF-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.12.1. Ensayos de actividad reportera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.12.2. Ensayos de transactivación con el sistema reportero GAL4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.13. Inteferencia de la expresión génica por pequeñas moléculas de RNA (knock-down) . . . . . . 32 3.14. Transcripción reversa mediante reacción en cadena de la polmerasa (RT-PCR) . . . . . . . . . 33 3.15. Actividad β-galactosidasa asociada a senescencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3.16. Análisis estadístico de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 IV. RESULTADOS 4.1. Endoglina se asocia directamente con ALK-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 4.1.1. La interacción endoglina/ALK-1 implica a sus regiones extracelulares . . . . . . . . . . 36 4.1.2. Los dominios citoplásmicos de endoglina y ALK-1 interaccionan entre sí . . . . . . . . 40 4.2. Endoglina favorece la señalización de TGF-β vía ALK-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 4.2.1. El dominio extracelular de endoglina promueve la señalización vía ALK-1 . . . . . . . 43 4.2.2. Endoglina induce la actividad del promotor de Id1 en respuesta a TGF-β vía ALK-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4.2.3. La ruta de señalización de TGF-β vía ALK-5 se bloquea en presencia de endoglina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 4.2.4. La quimera EndoEC-Fc mimetiza los efectos de la endoglina endógena . . . . . . . . . 50 4.3. La isoforma corta de endoglina es capaz de interaccionar con los receptores de TGF-β . . . 52 4.3.1. Endoglina-S aparece en células senescentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.3.2. La región citoplásmica de endoglina-S interacciona con ALK-5 y ALK-1 . . . . . . . . . 56 4.4. Endoglina-S modula de forma distinta a endoglina-L las vías de señalización de TGF-β/ALK-5 y TGF-β/ALK-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.4.1. La expresión de endoglina-S induce la actividad del promotor de PAI-1 mientras que reprime la del promotor de Id1 en respuesta a TGF-β. . . . . . . . . . . . . 62 _______________________________________________________________________Índice iii 4.5. Localización subcelular de ALK-1 en caveolas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 4.5.1. ALK-1 se detecta en la fracción caveolar de células endoteliales . . . . . . . . . . . . . . . . 64 4.6. ALK-1 interacciona con el dominio de andamiaje (SD) de caveolina-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 4.7. La localización de ALK-1 en caveolas induce su vía de señalización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 4.7.1. Caveolina-1 estimula la vía de señalización TGF-β/ALK-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 4.7.2. La cooperación de caveolina-1 sobre la vía TGF-β/ALK-1 depende de su dominio de andamiaje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.7.3. El bloqueo específico de caveolina-1 por siRNA reduce la señalización de ALK-1 . . 72 V. DISCUSIÓN 5.1. La interacción de endoglina con ALK-1 favorece su vía de señalización . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 5.1.1. Disección y consecuencias de la interacción endoglina/ALK-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 5.1.2. ¿ALK-5 o ALK-1? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 5.2. La isoforma endoglina-S antagoniza el efecto de endoglina-L en la vía de señalización de TGF-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 5.2.1. Papel de endoglina-S en la senescencia endotelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 5.3. Caveolina-1 interacciona con ALK-1 y potencia su vía de señalización . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 5.3.1. Paralelismo funcional entre ALK-1 y caveolina-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 5.4. Comentario final y perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 VI. CONCULSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 VII. BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 VIII. ANEXO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 I. INTRODUCCIÓN _________________________________________________________________Introducción 2 El endotelio vascular es una monocapa de células que tapiza el interior de los vasos sanguíneos y que se encuentra en contacto directo con el torrente circulatorio. Las células endoteliales que lo componen son las encargadas principales de regular diversas funciones fisiológicas como el tono vascular, el intercambio de nutrientes con los tejidos y el propio crecimiento de los vasos, proceso denominado angiogénesis. El estudio de los mecanismos subyacentes a este proceso ha sido y es una de las principales áreas en investigación biomédica. 1.1. ANGIOGÉNESIS Durante la embriogénesis, el sistema cardiovascular es el primer órgano en desarrollarse y llegar a ser funcional, permitiendo el crecimiento y el mantenimiento de la integridad de los órganos. Son dos los procesos responsables de la formación de los vasos sanguíneos: (i) vasculogénesis, que implica el principal proceso de diferenciación in situ de células endoteliales a partir del mesodermo y su organización en plexos capilares primarios y (ii) angiogénesis, que define la formación de nuevos vasos sanguíneos por un proceso de brotes y ramificación a partir de vasos preexistentes (Pepper, 1997). Además de su papel en el desarrollo, la angiogénesis es requerida para el mantenimiento de la integridad funcional y estructural del organismo en la vida postnatal. En este caso, la angiogénesis es un proceso delicadamente regulado que está generalmente limitado por demandas metabólicas de los tejidos en cuestión. La angiogénesis puede ser vista como dos fases separadas pero equilibradas. Una primera fase de activación que incluye: un incremento en la permeabilidad vascular, degradación de la membrana basal y proliferación y migración de células endoteliales. Después, una fase de resolución que incluye la inhibición de la proliferación y migración de las células endoteliales, reconstitución de la membrana basal y estabilización del vaso mediante el reclutamiento de pericitos y células de músculo liso (Hanahan & Folkman, 1996). Por lo tanto, son numerosos los factores implicados en la regulación de ambas fases, algunos de los cuales se resumen en la Tabla 1. Así por ejemplo, el contacto de las células endoteliales con las mesenquimales hace que se libere factor de crecimiento transformante, TGF-β (Transforming Growth Factor-β), provocando que éstas se diferencien a pericitos y células de músculo liso (Hirschi et al., 1998). También, los pericitos contribuyen en parte a la supervivencia y estabilidad de la célula endotelial mediante la expresión del factor de crecimiento vascular endotelial, VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). El reclutamiento de células mesenquimales en el nuevo vaso está mediado por factores tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas, PDGF-BB (Platelet-Derived Growth Factor-BB) y TGF-β (Li et al., 2001). Igualmente, el factor de crecimiento fibroblástico básico, bFGF (basic Fibroblast Growth Factor), es un potente inductor de la migración y proliferación de las células endoteliales y la angiopoyetina 1 (Ang1) induce la formación de brotes capilares por su efecto quimioatrayente. Por el contrario, la angiopoyetina 2 (Ang2), la trombospondina-1 (TSP-1) y la endostatina son ejemplos de potentes factores inhibidores de la angiogénesis (Klagsbrun & Moses, 1999). En este sentido, el TGF-β puede actuar también como un inhibidor de la angiogénesis, ya que se ha demostrado que en _________________________________________________________________Introducción 3 determinadas circunstancias es capaz de inhibir la proliferación de las células endoteliales (Li et al., 2000). ANGIOGÉNESIS FASE DE ACTIVACIÓN FASE DE RESOLUCIÓN Aumento Permeabilidad celular Disminución Degradación Membrana basal Síntesis Aumento Migración Disminución PROCESO Aumento Proliferación Disminución MEDIADORES bFGF, Ang1, IL-8, PlGF, VEGF, PDGF-BB, TGF-β Ang2, TSP-1, angiostatina, endostatina, troponina, TGF-β Tabla 1. Etapas de la angiogénesis. bFGF, factor de crecimiento fibroblástico básico; Ang1, angiopoyetina 1; IL-8, interleuquina-8; PlGF, factor de crecimiento placentario; VEGF, factor de crecimiento vascular endotelial; PDGF-BB, factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB; TGF-β, factor de crecimiento transformante-β; Ang2, angiopoyetina 2; TSP-1, trombospondina-1. El TGF-β se considera una de las citoquinas más pluripotenciales de organismo y este papel dual en el proceso de angiogénesis contribuye a su versatilidad. Esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes responsables de su función pivote en el proceso de angiogénesis es el principal objetivo de este trabajo de investigación. 1.2. LA SUPERFAMILIA DE TGF-β Descrito originalmente por Anita B. Roberts en 1981 por su capacidad de inducir el crecimiento de fibroblastos de riñón de rata in vitro, podríamos decir que el TGF-β es la citoquina más multifuncional presente en los organismos por sus efectos tanto inhibitorios como estimulatorios. La superfamilia del TGF-β, de la que éste es el miembro modelo, está presente en una gran variedad de organismos, desde insectos hasta humanos, e incluye factores de crecimiento y diferenciación tales como las proteínas morfogenéticas del hueso, BMP (Bone Morphogenetic Protein), activina, proteínas Dpp (decapentaplegic complex) relacionadas con Vg, DVR (Dpp-Vg1-related), dorsalina, proteína nodal, hormona antimuleriana, MIS (Müllerian Inhibiting Substance), inhibinas, factores de crecimiento y diferenciación, GDF (Growth and Differentiation Factor), y factor neurotrófico derivado de células gliales, GDNF (Glial cell-Derived Neurotrophic Factor) (Massagué, 1998). Durante el desarrollo estos factores regulan la expresión de un patrón de expresión génico determinado e influencian varios comportamientos celulares, incluyendo proliferación, diferenciación, producción de matriz extracelular y muerte celular. En adultos, están implicados en la reparación de tejidos y regulación del sistema inmune, así como en muchos otros procesos. En cuanto al TGF-β, han sido descritas cinco isoformas hasta el momento, todas ellas con un elevado porcentaje de homología (65% aproximadamente). En mamíferos encontramos las isoformas β1, β2 y β3, mientras que la β4 es exclusiva de aves (Jakowlew et al., 1991) y la β5 de ranas (Vempati & _________________________________________________________________Introducción 4 Kondaiah, 1998). Como se resume en la Figura 1, cada factor es sintetizado como complejo latente compuesto por un dímero del propéptido TGF-β. Después de la síntesis, pero antes de la secreción, una furin-convertasa escinde el propéptido quedando así la región LAP (Latency-Associated Peptide) asociada no covalentemente al TGF-β biológicamente activo (Dubois et al., 1995). En la mayoría de las células, la liberación eficiente de esta forma latente del TGF-β requiere de su asociación a una tercera proteína denominada LTBP (Latent TGF-β-Binding Protein), formando así el gran complejo latente del TGF-β. Mientras que el extremo C-terminal de la LTBP se une al TGF-β latente por un puente disulfuro, el N- terminal se ancla a proteínas de la matriz extracelular. Una vez ahí, el TGF-β es liberado en su forma biológicamente activa por la acción de proteasas, como plasmina o elastasa, o por entrecruzamiento mediado por transglutaminasa 2 (TG2) de LTBP y/o LAP. De este modo, el TGF-β activo se unirá a sus receptores de membrana para disparar la compleja vía de señalización (Miyazono et al., 1993; Saharinen et al., 1999). En cuanto a su estructura, las isoformas presentan un patrón tridimensional similar debido a su alto grado de homología. Así por ejemplo, el TGF-β1 se compone de dos cadenas polipeptídicas N- glicosiladas de 12,5 kDa unidas por un puente disulfuro tal y como se demostró por espectroscopía de resonancia magnética multinuclear (Hinck et al., 1996). Existen nueve residuos de cisteína conservados, de los que ocho se encuentran formando cuatro puentes disulfuro intracatenarios mientras que el noveno es el responsable de la homodimerización. En cuanto a las regiones no conservadas (un 40% de la secuencia), son las responsables, en parte, de la especificidad en la unión al receptor y, por tanto, la diversidad de respuestas celulares inducidas por los diferentes miembros de la superfamilia. El estudio de esta diversidad es clave para entender por qué alteraciones en la actividad de estos factores han sido relacionadas con procesos patológicos tales como fibrosis, inmunosupresión y cáncer, entre otros. Figura 1: Esquema de la activación del TFG-β. Las líneas verdes representan puentes disulfuro, mientras que los puntos rojos son interacciones no covalentes. MP, membrana plasmática; LAP, péptido asociado a latencia; LTBP, proteína de unión al TGF-β latente; MEC, matriz extracelular; TG2, transglutaminasa 2, también denominada tisular. Entrecruzamiento: TG2 Proteolisis: Plasmina Elastasa Kalikreína TGF-β (activo) pro-TGF-β Furin-convertasa Complejo latente LAP Citoplasma MEC LTBP MP _________________________________________________________________Introducción 5 1.3. RECEPTORES DE TGF-β Para ejercer sus funciones biológicas, el TGF-β debe ser captado por sus receptores específicos, siendo de vital importancia tanto la isoforma como la composición del complejo receptor. Éste es expresado por la mayoría de tipos celulares presentes en un organismo y, atendiendo a sus características estructurales y funcionales, contiene dos componentes principales denominados como receptor tipo I y tipo II (Derynck & Feng, 1997; Miyazono et al., 1994). Los receptores tipo I y tipo II transmiten la señal al interior celular por sus actividades serina/treonina quinasa citoplásmicas (ten Dijke et al., 1996). Como sustratos de esta actividad catalítica destacan, además de ellos mismos, los miembros de la familia de las proteínas Smad, que serán descritos más adelante. Los receptores de tipo II son capaces de interaccionar con distintas isoformas de receptor tipo I formando complejos heteroméricos y determinando la especificidad de la unión de ligando (Attisano et al., 1993; Ebner et al., 1993; Lebrin et al., 2005), mientras que la especificidad de la respuesta biológica al ligando en un determinado tipo celular está definida por la variante del receptor tipo I implicado en el complejo (Cárcamo et al., 1994; Shi & Massagué, 2003). En la Figura 2 se refleja la especificidad de la respuesta celular en detalle. 1.3.1. Receptor tipo II En humanos, el receptor tipo II de TGF-β, o TβR-II, fue clonado por Lin et al. en 1992. Este receptor es expresado por la mayoría de tipos celulares y lo hace como un homodímero (Chen & Derynck, 1994; Henis et al., 1994). Cada una de sus dos cadenas de unos 70-75 kDa contiene 565 aminoácidos y presenta un alto grado de N-glicosilación en su corta región extracelular. Ya que el TβR-II es capaz de unir TGF-β per se (Wrana et al., 1992), este dominio se consiguió cristalizar por primera vez formando un complejo con TGF-β3 y gracias a los estudios de difracción de rayos X se pudo demostrar que un conjunto característico de cisteínas cercanas a la región transmembrana está implicado en la formación, mediante puentes disulfuro, del receptáculo para el ligando, mientras que la estabilización de éste se produce por puentes de hidrógeno, de los que el formado por el Asp42 (TβR-II) con la Arg92 (TGF-β3) es clave (Hart et al., 2002). A continuación y tal como se esquematiza en la Figura 3, su extenso dominio citoplásmico se caracteriza por poseer actividad serina/treonina quinasa, responsable del comienzo de la transmisión de señal. En la célula, este receptor se encuentra constitutivamente fosforilado, incluso en ausencia de ligando, en serinas y treoninas de su dominio citoplásmico (Lin et al., 1992), aunque el estado de activación se define en función de cuáles son dichos residuos. En concreto, mientras que las fosforilaciones en Ser213 y Ser409 son activadoras, la de Ser416 es responsable de su modulación negativa (Heldin et al., 1997; Luo & Lodish, 1997). 1.3.2. Receptores tipo I Los receptores tipo I, abreviados como TβR-Is, presentan unas características bioquímicas similares a las del TβR-II (ver Figura 3). Son también proteínas homodiméricas transmembrana cuyas cadenas polipeptídicas poseen un peso molecular algo menor (55-65 kDa) con actividad serina/treonina _________________________________________________________________Introducción 6 quinasa citosólica. Presentan también N-glicosilación en su dominio extracelular, además del conjunto de cisteínas característico probablemente responsable de la configuración estructural adecuada para la interacción con el ligando. A diferencia del TβR-II, los TβR-Is no son capaces de unir ligando por sí solos (Wrana et al., 1992) y necesitan del TβR-II para su activación por fosforilación. Ésta se produce en residuos de serina altamente conservados en una pequeña región, a continuación del transmembrana y previa al dominio catalítico, que abarca unos 30 residuos y contiene la secuencia Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly, por lo que se denomina dominio GS (Massagué, 1998; Wieser et al., 1995). Fosforilaciones fuera de dicho dominio GS, como la Ser165, actúan como moduladoras de la actividad (Heldin et al., 1997; Souchelnytskyi et al., 1996). Figura 2: Esquema de la especificidad en la respuesta celular a la superfamilia del TGF-β. MGT, maquinaria general de la transcripción. Activina TGF-β BMP ActR-II ActR-IIB ALK-4 TβR-II ALK-5 ALK-1 BMPR-II ActR-II ActR-IIB ALK-2 ALK-3 ALK-6 Smad2 Smad3 Smad1 Smad5 Smad8 Smad4 Smad6 Smad7 MGT Núcleo _________________________________________________________________Introducción 7 En 1994, el grupo de Yamashita et al. (1994b) consiguió demostrar, empleando [125I]TGF-β, que tras la unión del ligando se induce la formación de complejos hetero-oligoméricos entre los receptores. Aunque la estequiometría aún no está bien esclarecida, se sabe que se forma como mínimo un complejo heterotetramérico compuesto por dos TβR-II y dos TβR-I (Gilboa et al., 1998; Luo & Lodish, 1996; Weis- García & Massagué, 1996). Incluso, recientemente se ha descrito que pueden coexistir variantes de TβR-I en dichos complejos (Goumans et al., 2003b). La composición de este complejo se puede complicar aún más si se tiene en cuenta la presencia de co-receptores como endoglina y betaglicano, que actuarían como moduladores de las respuestas celulares a TGF-β (Guerrero-Esteo et al., 2002; López-Casillas et al., 1993; Wang et al., 1991; Yamashita et al., 1994a). Como se mencionó anteriormente, las acciones del TGF-β son altamente dependientes del contexto celular y del tipo de TβR-I presente en el complejo receptor. Así, éste puede actuar como inhibidor o estimulador de la angiogénesis. De hecho, han sido descritas dos moléculas distintas de receptor tipo I en células endoteliales, entre otras; las cuales serán detalladas en los siguientes apartados. 1.3.2.1. ALK-5 Fue clonado a partir de células de eritroleucemia humanas (HEL) por Franzén et al., (1993) tras la búsqueda de nuevos receptores con actividad serina/treonina quinasa mediante PCR usando oligonucleótidos cebadores degenerados. Ya que previamente habían sido identificados cuatro miembros con actividad quinasa similar al receptor de activina (Attisano et al., 1993; ten Dijke et al., 1993), se le adjudicó la nomenclatura de ALK-5. A diferencia del TβR-II, sólo se conoce la estructura atómica de la región citoplásmica. Ésta fue cristalizada por primera vez asociada no covalentemente al factor inhibidor FKBP12 (FK506 Binding Protein) (Huse et al., 1999), un miembro de la familia de las inmunofilinas que media los efectos inmunosupresores de FK506 y rapamicina (Chen et al., 1997; Wang et al., 1996). Estructuralmente, cada cadena polipeptídica de ALK-5 consta de 503 aminoácidos y se glicosila en un único residuo de arginina dentro de la caja de cisteínas en su región extracelular, por lo que migra a una altura correspondiente a 55 kDa de peso molecular en electroforesis de SDS-PAGE (a veces se Figura 3: Esquema de los receptores de TGF-β, TβR-II y TβR-I. PS, péptido señal; EC, dominio extracelular; TM, región transmembrana; CT, dominio citoplásmico; GS, dominio GS rico en cisteína y glicina. TM PS CT ser/thr quinasa EC TβR-II TβR-I (ALK-1, ALK-5) ser/thr quinasa TM PS CT EC GS _________________________________________________________________Introducción 8 nombra como RI p55). Interacciona con el complejo TβR-II/TGF-β y a continuación es fosforilado por el TβR-II en su dominio GS dando lugar a su activación. ALK-5 no es sustrato de si mismo, ejerciendo su actividad serina/treonina quinasa principalmente sobre las proteínas Smad, en concreto Smad2 y 3 (Heldin et al., 1997; Shi & Massagué, 2003; Wieser et al., 1995). En cuanto a su expresión, ALK-5 se distribuye ampliamente en distintos tipos celulares del organismo; como por ejemplo las células endoteliales, donde dirige la señal del TGF-β hacia procesos antiangiogénicos tales como la quiescencia y parada de la proliferación (Goumans et al., 2003a; Pepper, 1997). Y es en este contexto endotelial donde la respuesta celular a TGF-β debe estar finamente regulada, ya que ALK-5 no es el único receptor tipo I expresado. Así, la señalización a través de uno u otro receptor da lugar a un interesante punto de control de la respuesta celular a TGF-β. 1.3.2.2. ALK-1 Denominado en un primer momento como receptor tipo I de la superfamilia del TGF-β (TSR-I, TGF-β Superfamily Receptor Type I) fue posteriormente caracterizado como ALK-1 por su similitud con el receptor tipo II de activina, ya que fue obtenido a partir de células endoteliales de cordón umbilical humano por PCR usando oligonucleótidos degenerados de dicho receptor (Attisano et al., 1993; ten Dijke et al., 1993). La secuencia primaria de ALK-1 consta, al igual que ALK-5, de 503 aminoácidos. Sin embargo, el nivel de homología entre ambos no llega al 60%, por lo que este hecho determinaría probablemente una distinta especificidad en la respuesta celular al ligando. De hecho, como se mostró en la Figura 2, ALK-1 transduce la señal del TGF-β hacia el núcleo a través de miembros de las Smad relacionados con ALK-5 distintos, esto es, ejerciendo su actividad serina/treonina quinasa específicamente sobre Smad1, 5 y 8 (Chen & Massagué, 1999; Lebrin et al., 2005; Oh et al., 2000). La expresión de ALK-1 está restringida principalmente a células endoteliales, aunque también se ha detectado en sitios específicos de interacción epitelial-mesenquimal, monocitos y células de carcinoma pancreático (Jonson et al., 2001; Mo et al., 2002; Roelen et al., 1997). Además, en el endotelio, ALK-1 es un marcador de arterias que se induce durante la angiogénesis de éstas (Seki et al., 2003). Actualmente, hay crecientes evidencias de que su señalización en la célula es requerida para el establecimiento de las diferencias moleculares, funcionales y anatómicas entre arterias y venas (Sorensen et al., 2003; Urness et al., 2000). Asimismo, se han descrito mutaciones en el gen de ALK-1 como responsables de una haploinsuficiencia vascular denominada telangiectasia hemorrágica hereditaria tipo 2 (HHT2), que será descrita en detalle más adelante. Durante mucho tiempo, se ha considerado a ALK-1 como un receptor huérfano ya que era incapaz de inducir la activación del inhibidor del activador del plasminógeno-1, PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1) (ten Dijke et al., 1994). No obstante, en 1999 se demostró, empleando una construcción quimera en la que se combinaba la región extracelular de ALK-1 con la transmembrana y citoplásmica de ALK-5, que TGF-β1, β3 y otro componente aún indeterminado del suero eran capaces de inducir la expresión de PAI-1 en colaboración con el TβR-II (Lux et al., 1999; Oh et al., 2000). De estos datos, junto con el trabajo de Pepper et al. (1997), surgió la idea de que los genes diana de TGF-β podrían depender del TβR-I empleado para transmitir la señal a la célula. De hecho, varios grupos han demostrado la expresión génica diferencial dependiente de ALK-5 o ALK-1 mediante chips de DNA, aunque no siempre se ha _________________________________________________________________Introducción 9 llegado a las mismas conclusiones (Lamouille et al., 2002; Matsuyama et al., 2003; Ota et al., 2002; Wu et al., 2006). Aún así, lo que parece estar claro es que ambos receptores tipo I son la clave del papel dual que ejerce el TGF-β para regular el proceso de angiogénesis (Goumans et al., 2003a; Goumans et al., 2003b; Goumans et al., 2002), aunque los mecanismos subyacentes no están bien esclarecidos aún. 1.3.3. Las proteínas Smad. Modelo de señalización del TGF-β. Las proteínas Smads son los principales sustratos directos de los receptores del TGF-β y una vez fosforiladas transmiten la señal hasta el núcleo, donde en colaboración con otros factores de transcripción regulan positiva o negativamente la expresión de genes diana. Forman un grupo de factores de transcripción presentes en la mayoría de organismos, desde nematodos hasta mamíferos (Attisano & Wrana, 2000; Massagué, 1998; Massagué et al., 2005; Moustakas et al., 2001; Piek et al., 1999). Han sido identificadas a partir de 1995 y su nomenclatura viene por su homología con los factores Sma, de Caenorhabditis elegans, y MAD (Mothers against dpp), de Drosophila melanogaster. Atendiendo a sus características funcionales, se han dividido en tres subclases: activadas por receptor, R-Smad; mediadoras comunes (Co-Smads); e inhibitorias (I-Smads). Aún así, todas guardan unas características estructurales comunes que se muestran en la Figura 4. En resumen, las proteínas Smad constan de unos 500 aminoácidos que se organizan en dos dominios globulares conservados, MH1 y MH2 (Mad-homology 1 and 2), conectados por una región variable de unión. En las R-Smads y Smad4 (única Co-Smad en mamíferos) el dominio MH1 contiene una secuencia de localización nuclear, NLS, y una estructura en horquilla-β para su unión al DNA, excepto en Figura 4: Las proteínas Smad. (A) Dendrograma que indica el nivel relativo de identidad en cuanto a sus secuencias aminoacídicas. (B) Estructura de las Smads. La fosforilación en la secuencia SSXS en el extremo C-terminal hace que los dominios MH1 y MH2 se disocien, quedando la proteína biológicamente activa. Smad1 Smad5 Smad8 Smad2 Smad3 Smad4 Smad6 Smad7 R-Smad Co-Smad I-Smad A ATP ADP Tβ-RI MH1 MH2 N-ter C-ter Dominio de unión al DNA Dominio de transactivación Fosforilación (Smad1, 2, 3, 5, 8) SSXS Región de unión B _________________________________________________________________Introducción 10 el caso de Smad2 (Dennler et al., 1998). Las I-Smads son las más divergentes y carecen del dominio MH1 (Imamura et al., 1997; Nakao et al., 1997). La región de unión de las R-Smads contiene múltiples sitios de fosforilación por MAPKs como Erk, quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) y otras proteín-quinasas. En las R-Smads e I-Smads, la región de unión contiene un motivo PY, prolina-tirosina, para el reconocimiento de los dominios WW de las ubiquitina ligasas Smurf (Smad ubiquitination-related factor), que median su degradación vía proteasoma (Izzi & Attisano, 2004; Wrana, 2000). En el caso de Smad4, la región de unión contiene una secuencia de exportación nuclear, NES, por lo que está en continuo recambio entre el citoplasma y el núcleo. Por otro lado, el dominio MH2 contiene un bolsillo de carácter básico capaz de interaccionar con las serinas fosforiladas del dominio GS de los receptores tipo I (caso de las R-Smads) y del motivo SSXS en el extremo C-terminal de las R-Smads para su homo- /heteromerización con Smad4 (Chacko et al., 2001; Chacko et al., 2004; Wu et al., 2001). Además, en este dominio MH2 de las R-Smads se localiza una estructura denominada pasillo hidrofóbico que sirve como sitio de múltiples interacciones con otros factores; como SARA (Smad Anchor for Receptor Activation), que regula la disponibilidad de Smad2 y 3 para el TβR-I (Derynck & Zhang, 2003; Lutz & Knaus, 2002; Massagué et al., 2005; Moustakas et al., 2001; Shi & Massagué, 2003; Tsukazaki et al., 1998). Las R-Smads son dianas directas de la actividad serina/treonina quinasa de los TβR-Is, siendo fosforiladas en la secuencia SSXS cerca del extremo C-terminal (Macías-Silva et al., 1996). Son críticas para la especificidad de la respuesta biológica al TGF-β. Así, Smad2 y 3 son fosforiladas por los receptores de activina y ALK-5, mientras que Smad1, 5 y 8 son activadas por los de BMP y ALK-1 (Figura 2) (Chen & Massagué, 1999; Kretschmer et al., 2003; Kretzschmar et al., 1997; Lagna et al., 1996; Oh et al., 2000; Zhang et al., 1996b). El mecanismo establecido para la señalización del TGF-β se resume en la Figura 5. El TβR-II une el ligando y recluta al TβR-I, fosforilándolo en el dominio GS activándose así su dominio catalítico. De este modo, una vez activado el TβR-I, fosforila a las R-Smads, lo que conduce a su heteromerización con Smad4. Este complejo se transloca al núcleo en un mecanismo en el que la intervención de importinas no siempre es necesaria pero sí su interacción con nucleoporinas (proteínas del poro nuclear) (Chen et al., 2005; Reguly & Wrana, 2003; Xiao et al., 2000; Xu et al., 2003). Allí se une al DNA por el reconocimiento de secuencias consenso y/o formando complejos con otros componentes de la maquinaria de transcripción como AP-1, ATF-2, AML-2, TFE3, Sp1, CBP/p300, HIF, etc. (Hocevar et al., 1999; Hua et al., 2000; Massagué et al., 2005; Moustakas et al., 2001; Sánchez-Elsner et al., 2004; ten Dijke et al., 2002; Zhang et al., 1998), modulando la expresión de genes específicos. Este modelo secuencial fue demostrado gracias a la generación de una forma mutada del TβR-I ALK-5 constitutivamente activada (sustitución Thr Asp en posición 204, T204D), la cual era capaz de ejecutar la señal del TGF-β en ausencia de TβR-II (Wieser et al., 1995). La generación de estos TβR-Is mutantes activados permanentemente de forma independiente del TβR-II, así como los quinasa deficientes, son de gran utilidad a la hora de estudiar la vía de señalización de los receptores de TGF-β. Por último, Smad6 y 7 (I-Smads) son capaces de inhibir la señal de TGF-β al interaccionar tanto con los receptores, impidiendo así la fosforilación de las R-Smads, como con los complejos heteroméricos R-Smad/Smad4, bloqueando así su translocación al núcleo. La expresión de estas Smads inhibitorias está inducida por miembros de la propia superfamilia del TGF-β, lo que da lugar a un mecanismo de retroalimentación negativa (negative feed-back regulation) de la propia vía de señalización. Incluso, la existencia de fosfatasas que desfosforilan específicamente los receptores y las R-Smads contribuye a la _________________________________________________________________Introducción 11 terminación de la señal de TGF-β (Chen et al., 2006; Hill, 2006; Maeda et al., 2006; Valdimarsdottir et al., 2006). Existen, además, otras vías de señalización del TGF-β en las que no están implicadas directamente las Smads y que incluyen mediadores tales como JNK, Erk, RhoA, XIAP, Daxx, Ocludina, Par6, o Limk1 entre otros (Derynck & Zhang, 2003; Feng & Derynck, 2005; Moustakas & Heldin, 2005; Shi & Massagué, 2003). Figura 5: Diagrama esquemático de la señalización del TGF-β desde la membrana hasta el núcleo. El receptor tipo II capta el TGF- β (A), recluta (B) y fosforila al tipo I en su dominio GS (C). Así, éste es capaz de fosforilar las R-Smads (E), presentadas en la membrana plasmática por la proteína SARA (D). Se forma el complejo heteromérico con Co-Smad (F) y se transloca al núcleo mediante un mecanismo mediado por la interacción directa con nucleoporinas y en menor medida con importinas (G). Tanto la Co-Smad (H) como las R-Smads (I) son recicladas, previa defosforilación de éstas últimas. Alternativamente, las R-Smads pueden ser marcadas con ubiquitina por la acción de Smurf para su posterior degradación en el proteasoma (J), regulando así la vía de señalización. Por último, las I-Smad (K) actúan como otro punto de control en el apagado de la ruta al inhibir el receptor tipo I. SARA TGF-β TβR-II R-Smad I-Smad Núcleo A B C TβR-I Co-Smad D E F G Proteasoma H I J K _________________________________________________________________Introducción 12 1.4. ENDOGLINA 1.4.1. Distribución celular Endoglina, también llamada CD105, se expresa principalmente en células endoteliales que integran las venas, arterias y microvasculatura, detectándose ya en la cuarta semana de gestación y manteniéndose en los tejidos adultos (Gougos & Letarte, 1988a; Gougos & Letarte, 1988b; Qu et al., 1998). Por este motivo, endoglina es considerada como un marcador de células endoteliales. Su expresión se ve incrementada en estas células cuando están proliferando en cultivo (Duff et al., 2003; Miller et al., 1999), en zonas de angiogénesis (Bodey et al., 1998a; Bodey et al., 1998b; Burrows et al., 1995; Jerkic et al., 2006), en regiones donde se ha producido un daño en la pared vascular (Botella et al., 2002; Wang et al., 1995), en el endotelio de algunas patologías de la piel (van de Kerkhof et al., 1998; Westphal et al., 1993), en enfermedades autoinmunes (Marazuela et al., 1995) y en el endotelio capilar angiogénico de carcinomas (Li et al., 2001; Wang et al., 1994) y angiosarcomas (Ohta et al., 1997). En este sentido, la elevada expresión de endoglina en la vasculatura de tumores sólidos (Burrows et al., 1995; Kumar et al., 1996) ha servido como diana de anticuerpos específicos acoplados a toxinas con la finalidad de destruir dicha vasculatura (Matsuno et al., 1999; Thorpe & Burrows, 1995). Sin embargo, la expresión de endoglina en la pared vascular no se limita al endotelio. Así, también podemos encontrarla en los fibroblastos del estroma perivascular (Ma et al., 2000; Matsubara et al., 2000) y en las células de músculo liso que se encuentran rodeando los vasos. En este último tipo celular se ha observado expresión de endoglina después de un daño vascular, en las placas de arteriosclerosis, y en células cultivadas in vitro (Adam et al., 1998; Conley et al., 2000; Ma et al., 2000). La presencia de endoglina en distintos tipos celulares de las tres capas del vaso (túnicas íntima, media y adventicia), sugiere un importante papel en la fisiología vascular. Fuera del contexto endotelial, también se ha descrito la expresión de endoglina en: Células de origen hematopoyético, como son los proeritroblastos (Bühring et al., 1991), precursores de células B (Zhang et al., 1996a) , macrófagos (Lastres et al., 1992; O'Connell et al., 1992), y células estromales de la médula (Robledo et al., 1996; Rokhlin et al., 1995; St-Jacques et al., 1994a); en algunas células tumorales, como es el caso de melanomas (Altomonte et al., 1996), cáncer de próstata (Liu et al., 2002), coriocarcinomas (Letamendía et al., 1998a) y tumores de origen hematopoyético, en concreto de los linajes monocíticos (Lastres et al., 1996) y de linfocitos B (Zhang et al., 1996a); en las células mesangiales de riñón (Rodríguez-Barbero et al., 2001); en los sincitiotrofoblastos de placenta, componentes fetales de la interfase materno-fetal los cuales forman una capa de células multinucleadas que actúa como barrera protectora e intercambiadora de nutrientes para el feto (Gougos et al., 1992; St-Jacques et al., 1994b); en condrocitos humanos de cartílago (Parker et al., 2003) y queratinocitos epidérmicos de folículos pilosos y glándulas sudoríparas (Quintanilla et al., 2003). 1.4.2. Características bioquímicas de endoglina. En lo que respecta a su estructura, endoglina es una proteína transmembrana de tipo I cuya estructura primaria consta de 658 aminoácidos y es expresada como un homodímero de 180 kDa de peso molecular unido por puentes disulfuro. En su secuencia, los primeros 25 residuos constituyen el péptido _________________________________________________________________Introducción 13 señal rico en leucinas y que dirige la proteína a través del retículo endoplasmático y aparato de Golgi hasta la membrana plasmática donde finalmente es eliminado. A continuación, en la región extracelular de 561 aminoácidos destaca la presencia de un tripéptido Arg399-Gly400-Asp401 (RGD), posiblemente implicado en adhesión celular (Gougos & Letarte, 1990), y un dominio estructural conservado denominado zona pelúcida (ZP), probablemente implicado en interacciones proteína-proteína (Bork & Sander, 1992; Jovine et al., 2005; Jovine et al., 2002). Los siguientes 25 aminoácidos corresponden a la región transmembrana, rica en residuos hidrofóbicos. Finalmente, un pequeño fragmento citoplásmico de 47 residuos rico en serinas y treoninas susceptibles de ser fosforiladas concluye el extremo C-terminal (Figura 6.A). También, se ha descrito en humanos y ratón una isoforma minoritaria con el tallo citoplásmico más corto (Bellón et al., 1993; Pérez-Gómez et al., 2005). Denominada endoglina-S, ésta se origina por la aparición de un codón de stop prematuro en el marco de lectura como consecuencia de la no eliminación de un pequeño intrón de 135 nucleótidos entre los exones 13 y 14 (Figura 6.B). El papel que desempeñaría esta isoforma corta de endoglina está aún poco estudiado y forma parte de este trabajo de investigación. Figura 6: Esquema de endoglina. (A) PS, péptido señal; EC, región extracelular; ZP, dominio zona pelúcida con 8 residuos de cisteína conservados; S-S, puente disulfuro; TM, secuencia transmembrana; CT, tallo citoplásmico. Las líneas ramificadas simbolizan sitios de N- glicosilación. (B) Ayuste alternativo en el RNA primario de endoglina. Si no se elimina el pequeño intrón de 135 pares de bases entre los exones E13 y E14 la traducción se detiene en el primer codón de parada (†), originándose la isoforma corta endoglina-S. En el caso de que sí se elimine, la traducción continúa hasta el segundo codón de parada en el exón E14 (‡), dando lugar a la isoforma larga endoglina-L. Ambos RNA maduros contienen la misma señal de poli- adenilación en el extremo 3’ de la secuencia. La secuencia de aminoácidos de ambas isoformas se detalla en la parte inferior, resaltándose los residuos de serina y treonina susceptibles de ser fosforilados. S -S S -S S -S Endoglina (CD105) TM PS CT EC Dominio ZP A Endoglina-S ...KGLVLPAVLGITFGAFLIGALLTAALWYIYSHTREYPRPPQ Endoglina-L ...KGLVLPAVLGITFGAFLIGALLTAALWYIYSHTRSPSKREPVVAVAAPASSESSSTNHSIGSTQSTPCSTSSMA Transmembrana E13 E14 † ‡ Endoglina-S Endoglina-L Gen ENG Señal poli-A B _________________________________________________________________Introducción 14 Respecto a la homología con otras proteínas hay que destacar que endoglina es un caso particular ya que la única secuencia con la que mantiene identidad significativa es betaglicano, también denominado receptor tipo III de TGF-β (TβR-III). La secuencia de aminoácidos correspondiente a las regiones transmembrana y citoplásmica de ambas proteínas son bastante similares, manteniendo un 63% y 71% de similitud, respectivamente (López-Casillas et al., 1991; Wang et al., 1991). Sin embargo, las funciones que desempeñan en la célula son distintas (Letamendía et al., 1998b). En cuanto al dominio extracelular, el único motivo conservado presente en endoglina es el denominado ZP, designado así por estar presente en las proteínas que constituyen la zona pelúcida que envuelve al óvulo de mamíferos. Ejemplos de glicoproteínas con dominio ZP son las propias proteínas ZP1, 2 y 3, uromodulina, α- y β-tectorina, cuticulina-1, betaglicano y GP-2 (Glycoprotein-2), entre otras. En todos los casos, estos dominios ZP se localizan próximos al extremo C-terminal de la proteína y se componen de unos 260 aminoácidos con al menos ocho residuos de cisteína conservados. Dentro de los dominios ZP existen dos subdominios que contienen 4 cisteínas cada uno y que están separados entre si por un sitio de corte proteolítico, que coincide con la unión de dos exones en el RNA mensajero maduro (Jovine et al., 2005). 1.4.3. Funciones que desempeña endoglina en la célula En cuanto a las funciones atribuidas a endoglina derivadas de su estructura, se demostró mediante ensayos de marcaje de afinidad y entrecruzamiento, en células endoteliales, que podía unir las isoformas β1 y β3 del TGF-β con alta afinidad (Kd= 50 pM), pero no unía la isoforma β2 (Cheifetz et al., 1992). Estudios posteriores demostraron que era capaz de interaccionar con los receptores tipo I y II unidos a TGF-β (Lastres et al., 1996; Wong et al., 2000; Yamashita et al., 1994a; Zhang et al., 1996a) e incluso en ausencia de ligando (Guerrero-Esteo et al., 2002). No obstante, era incapaz de, al contrario que betaglicano, unir TGF-β por si sola, necesitando del receptor tipo II para poder captarlo (Letamendía et al., 1998b). Además, en contextos similares, se vio que endoglina era capaz de unir activina-A, BMP-7 y BMP-2, esto es, en presencia de sus respectivos receptores (Barbara et al., 1999). Endoglina es capaz de inhibir algunas de las respuestas celulares a TGF-β mejor conocidas, como son la inhibición de la proliferación celular, el aumento en la producción de proteínas de la matriz extracelular y la inhibición de la migración y tubulogénesis de células endoteliales (Díez-Marqués et al., 2002; Lastres et al., 1996; Letamendía et al., 1998b; Li et al., 2000). Sin embargo, se desconoce el mecanismo molecular subyacente en detalle. Se ha sugerido que endoglina podría modular las respuestas celulares a TGF-β mediante la interacción directa con los receptores señalizadores, si bien no parece afectar a la formación de los complejos TβR-II/TβR-I como sucede en el caso de betaglicano (Barbara et al., 1999; Eickelberg et al., 2002). Así, endoglina actuaría regulando o el acceso del ligando al complejo receptor, a nivel extracelular, o bien la actividad quinasa catalítica de los receptores señalizadores, por su interacción citoplásmica. Apoyando esta hipótesis, Guerrero-Esteo et al. (2002) demostraron que endoglina inhibía los niveles de fosforilación del TβR-II mientras que aumentaba los del TβR-I ALK-5 tanto in vivo como in vitro, probablemente al interferir con la actividad autocatalítica de éste. Otra de las funciones atribuidas recientemente a endoglina es su implicación en el control del tono vascular. Por un lado, se observó que los ratones heterocigotos para el gen de endoglina tenían una menor capacidad de respuesta al estímulo vasodilatador de acetilcolina o bradikinina. Además, estos ratones, _________________________________________________________________Introducción 15 también denominados Eng(+/-), tenían una menor cantidad de metabolitos del óxido nítrico en plasma y orina, debido a que los niveles de la enzima óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) estaban también reducidos (Jerkic et al., 2004). Inclusive se ha demostrado que endoglina es capaz de asociarse con eNOS en unos microdominios de la membrana plasmática denominados caveolas, donde estabiliza el complejo con la proteína reguladora Hsp90, potenciadora de su actividad catalítica (Toporsian et al., 2005). Por otro lado, recientemente se ha estudiado el papel que endoglina juega en la organización del citoesqueleto celular. Como resultado de una búsqueda de ligandos para su región citoplásmica mediante el método del doble híbrido en levaduras, se obtuvo que esos 47 residuos citoplásmico de endoglina eran capaces de interaccionar con Zyxin (Conley et al., 2004) y ZRP-1 (Zyxin-Related Protein-1; o también TRIP6, Thyroid Receptor Interacting Protein-6) (Sanz-Rodríguez et al., 2004), dos miembros de la familia de proteínas con dominios LIM (acrónimo de las iniciales de los genes Lin-11, Isl-1 y Mec-3). Así, endoglina es capaz de controlar la migración y la composición de las adhesiones focales por interaccionar con zyxin y de organizar las fibras del citoesqueleto de F-actina, por medio de ZRP-1. 1.4.4. Endoglina y ALK-1 como genes responsables de la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria Hace más de 100 años que se describió una patología vascular caracterizada por la presencia de telangiectasias (dilatación anormal de los vasos sanguíneos) y episodios de epistaxis (sangrados nasales) espontáneos y recurrentes denominada síndrome de Rendu-Osler-Webber, debido a que fue descrita por parte de tres diferentes autores, H. J. L. M. Rendu (1896), W. Osler (1901) y F. P. Webber (1907) (Fuchizaki et al., 2003; Hanes, 1909). También denominada como Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT, Hereditary Haemorrhagic Telangiectasia), se caracteriza además por sangrados gástricos y malformaciones arteriovenosas en hígado, cerebro y pulmón que dan lugar a la pérdida localizada de la red capilar, originando una conexión directa entre arterias y venas (Abdalla & Letarte, 2006; Fernández-L et al., 2006; Guttmacher et al., 1995). Criterios de Curaçao 1. Epistaxis espontáneas recurrentes 2. Telangiectasias mucocutáneas 3. Implicaciones viscerales tales como AVM pulmonares y cerebroespinales, sangrados gástricos o desvío intrahepático 4. Historial familiar de HHT Tabla 2. Criterios de Curaçao (Shovlin et al., 2000). AVM, malformaciones arteriovenosas. Se considera que un individuo tiene HHT si presenta al menos tres de los cuatro criterios. La presencia de dos de los criterios es señal de un posible diagnóstico, mientras que un solo criterio no es indicativo de la enfermedad. Se debe tener en cuenta que algunos síntomas de la enfermedad no son exclusivos de la HHT. Además, muchos signos son dependientes de la edad y se empiezan a manifestar con el envejecimiento. Por lo tanto, estos criterios diagnósticos deben ser considerados con cautela, particularmente en niños. _________________________________________________________________Introducción 16 Actualmente es considerada como una enfermedad rara ya que su prevalencia es de 1:8.000. El dictamen de esta patología se lleva a cabo mediante un diagnóstico clínico basado en los denominados criterios de Curaçao (Tabla 2). Además, existe el diagnóstico genético por secuenciación de DNA pero aún no está considerado entre estos criterios. En 1994 se reportó por primera vez que pacientes de HHT presentaban mutaciones en un locus localizado en la región 9q33-q34.1, cromosoma 9, mediante estudios de ligación (McDonald et al., 1994; Shovlin et al., 1994). Independientemente, mediante la técnica de hibridación in situ, se demostró que el gen que codificaba para endoglina (ENG) mapeaba en esa misma región (Fernández-Ruiz et al., 1993), lo que permitió demostrar que ENG era de hecho el gen de la HHT (McAllister et al., 1994), estableciendo que mutaciones en el gen de endoglina son las responsables de la HHT tipo 1 (HHT1; OMIM 187300). No obstante, se vio que la HHT presentaba una heterogeneidad genética y que existían pacientes de HHT sin mutaciones en endoglina (Shovlin et al., 1994). Así, también mediante ensayos de ligación genética, se describió un segundo locus para HHT que mapeaba en la región 12q11-q14, cromosoma 12, donde se localizaba el gen que codifica para ALK-1 (ACVRL1). Así, se estableció el tipo 2 de HHT (HHT2; OMIM 600376) (Johnson et al., 1996). Además, existe alrededor de un 20% de pacientes de HHT en los que los estudios genéticos no han revelado mutaciones en ninguno de estos dos genes (Buscarini et al., 1997; Wallace & Shovlin, 2000), por lo que se sugiere la existencia de un tercer locus de la enfermedad (HHT3), posiblemente localizado en el cromosoma 5 (Cole et al., 2005). En cualquier caso, los pacientes afectados por ambos tipos de HHT son heterocigotos para el gen afectado, proponiéndose un mecanismo de haploinsuficiencia como causa de la enfermedad. Así, estudios en ratones modificados genéticamente para eliminar completamente la expresión (knock-out) de endoglina o ALK-1 mueren a mitad de gestación (días 10,5-11,5) debido a defectos angiogénicos evidentes en el saco vitelino y cardiovasculares en la formación de las válvulas del corazón (Arthur et al., 2000; Bourdeau et al., 1999; Li et al., 1999). Inserción Deleción Sitio de ayuste de exones Inserción y deleción Sin sentido Sustitución HHT1 (ENG) Número de exón N ú m er o d e m u ta ci on es HHT2 (ACVRL1) Número de exón N ú m er o d e m u ta ci on es Figura 7: Las gráficas representan el número y tipo de mutaciones identificadas por exón en los genes de endoglina (HHT1) y ALK-1 (HHT2) (Abdalla & Letarte, 2006). _________________________________________________________________Introducción 17 Hasta el momento se han descrito más de 150 mutaciones distintas responsables de HHT1 y más de 120 para HHT2, incluyendo pequeñas inserciones y/o deleciones, sustituciones de un aminoácido por otro, cambios en el marco de lectura o la aparición de codones de stop prematuros o alteración en los sitios de ayuste de exones (Figura 7). Ambos tipos de HHT son difíciles de distinguir clínicamente, ya que la sintomatología es similar y, por otro lado, hay variaciones significativas incluso dentro de una misma familia de afectados. No obstante, en la HHT2 parece existir un desarrollo tardío y una menor penetrancia de la enfermedad, mientras que en la HHT1 las malformaciones arteriovenosas pulmonares y cerebrales son algo más frecuentes (Abdalla et al., 2003; Abdalla & Letarte, 2006; Berg et al., 2003; Cymerman et al., 2000). Lo que aún no está claro es cómo una disminución de los niveles de endoglina o ALK-1 predisponen a la HHT y cual es la causa de las lesiones vasculares en sitios tan concretos del organismo. 1.5. CAVEOLAS En 1953 se describieron por primera vez unas estructuras subcelulares en el endotelio de tipo continuo del corazón denominadas en aquel momento vesículas plasmalémicas (Palade, 1953) (Figura 8.A). Actualmente, dichas estructuras han sido identificadas en la mayoría de tipos celulares y en referencia a su morfología se las han denominado caveolas, o pequeñas cavernas (Yamada, 1955). En un primer momento, se propuso que estas estructuras actuaban como meras vías de absorción celular similares a las vesículas recubiertas de clatrina, pero ahora parece estar claro que las caveolas son microdominios de la membrana especializados multifuncionales que modulan numerosos procesos, como la adhesión celular (del Pozo et al., 2004), la migración (Navarro et al., 2004), la señalización de receptores (Pike, 2005) e incluso la supresión tumoral (Razani et al., 2001b). Simultáneamente, se observó que en prácticamente todos los tipos celulares existían unos peculiares microdominios en la membrana plasmática enriquecidos en colesterol y esfingolípidos que fueron denominados balsas lipídicas (del inglés lipid rafts). Debido a las interacciones entre sus componentes, así como a la presencia de fosfolípidos portando cadenas de ácidos grasos saturados, esas balsas lipídicas representaban un ambiente más ordenado que el resto de la membrana (Brown & London, 2000; Galbiati et al., 2001). Posteriormente, las caveolas fueron caracterizadas bioquímicamente, quedando demostrado que, en esencia, eran balsas lipídicas enriquecidas en unas proteínas propias que fueron denominadas caveolinas. Éstas eran capaces de interaccionar, tanto in vitro como in vivo, con los principales componentes de las balsas lipídicas (Smart et al., 1999) y que agentes secuestradores de colesterol, como el ciclodextrano o la nistatina, eran capaces de desestabilizarlas (Pelkmans et al., 2004; Rothberg et al., 1992). 1.5.1. Caveolinas Caveolina-1, también llamada VIP21 (Vesicular Integral membrane Protein of 21 kDa), fue el primer miembro caracterizado de esta familia de proteínas (Glenney & Soppet, 1992; Rothberg et al., 1992) y, años después, se identificaron las isoformas 2 (Scherer et al., 1996) y 3 (Tang et al., 1996), todas con un peso molecular pequeño de entre 20-24 kDa. Curiosamente, el patrón de expresión de las caveolinas es bastante diferente. Los mayores niveles de expresión de caveolina-1 y 2 se encuentran en _________________________________________________________________Introducción 18 células endoteliales, neumocitos, fibroblastos y adipocitos (Scherer et al., 1997), mientras que la expresión de caveolina-3 se restringe a células musculares (cardíacas, esqueléticas y lisas) (Tang et al., 1996). Caveolina-1, como representante de la familia, es una proteína peculiar, ya que sus extremos amino y carboxilo terminal se localizan en el citoplasma celular (Figura 8.B). De sus 178 aminoácidos que integran su estructura primaria, la región comprendida entre Asp61 y Arg101 corresponde al dominio de oligomerización, localizándose en él un subdominio comprendido entre los residuos Asp82 y Arg101 denominado dominio de andamiaje (del inglés scaffolding domain). Este dominio es el responsable de la interacción con otras proteínas, en las que se suelen localizar secuencias consensos. Estos motivos de unión a caveolina son pequeñas secuencias hidrofóbicas que siguen uno de los siguientes patrones: ΦXΦXXXXΦ, ΦXXXXΦXX o ΦXΦXXXXΦXXΦ, donde X puede ser cualquier aminoácido y Φ representa un residuo aromático como triptófano, fenilalanina o tirosina (Couet et al., 1997a); aunque otros estudios han demostrado que motivos con una mezcla aromática, apropiadamente espaciada, y residuos hidrofóbicos, como leucina, isoleucina y valina, pueden actuar también como unión a caveolina (Carman A 200 nm 50 nm Caveolina-1 TM C-terminal CT N-terminal SD Tyr14 B Figura 8: Caracterización de las caveolas. (A) Micrografía de transmisión de electrones. RBC, eritrocito; EC, célula endotelial. Se identifican pequeñas invaginaciones de la membrana plasmática de unos 70 nm correspondientes a las caveolas (Navarro et al., 2004). Una de ellas es magnificada en la imagen superior derecha (Stan, 2005). (B) Esquema en el que se representan dos monómeros de caveolina-1 asociados. TM, región embebida en la membrana plasmática; CT, regiones citoplásmicas; SD, dominio estructural de andamiaje. Las líneas en zig-zag representan sitios de palmitoilación en residuos de cisteína. También se detalla el residuo de tirosina en posición 14 susceptible de ser fosforilado. _________________________________________________________________Introducción 19 et al., 1999). A continuación, existe una región rica en aminoácidos hidrofóbicos comprendida entre la Leu102 y la Arg135 que inusualmente queda embebida en la membrana sin llegar a traspasarla y, particularmente, presenta un residuo de cisteína en posición 133 que se encuentra irreversiblemente palmitoilado. El resto de la secuencia queda localizada, por tanto, hacia el interior celular y contiene otros dos residuos de cisteína, en posiciones 143 y 156, también irreversiblemente palmitoilados post- traduccionalmente, tanto en caveolina-1 como en caveolina-3. Estas palmitoilaciones no son determinantes para la localización en las caveolas (Dietzen et al., 1995) pero son las responsables de la estabilización de los oligómeros de caveolina (Monier et al., 1996). Por otra parte, caveolina-1 es susceptible de ser fosforilada en residuos de serina y treonina por PKCα (Protein Kinase C-α) (Mineo et al., 1998), pero la fosforilación en el residuo Tyr14 por c-src (C-terminal Src Kinase) es determinante para su modulación y localización subcelular (Aoki et al., 1999; Cao et al., 2002). 1.5.2. Regulación de la vía de señalización de TGF-β por caveolina-1 Actualmente se considera que las caveolas, lejos de ser simples distinciones de la membrana plasmática, son microdominios especializados multifuncionales capaces de modular multitud de respuestas celulares a nivel de la transducción de señal. Así, de los múltiples papeles que caveolina-1 juega en la célula, se destaca a continuación su reciente implicación en el sistema del TGF-β. Esta hipótesis de trabajo surgió al observar por microscopía confocal que el patrón de tinción que seguía el complejo del receptor de TGF-β era un punteado discreto, tanto en la membrana plasmática como en el interior celular (Gilboa et al., 1998; Wells et al., 1999). Posteriormente, al estudiar en detalle la secuencia del TβR-I ALK- 5 se vio que existían tres posibles secuencias diana, próximas al extremo C-terminal, para la interacción con el dominio de andamiaje de caveolina-1. Justamente, se pudo demostrar que ambas proteínas eran capaces de co-inmunoprecipitar y que dicha interacción resultaba en una disminución en la señalización de TGF-β vía Smad2 (Razani et al., 2001c). Y lo que es más, recientemente se ha puesto de manifiesto que el TβR-II también se localiza en caveolas (Schwartz et al., 2005). Incluso ha sido descrito que caveolina-1 es capaz co-localizar con BMPR-Ia y BMPR-II, modulando así negativamente la vía de señalización de BMP-2 (Nohe et al., 2005). Finalmente, se ha analizado el papel que caveolina-1 juega en la angiogénesis ya que los ratones knock-out para este gen (CAV1) son viables pero tienen defectos en la formación de nuevos vasos sanguíneos (Drab et al., 2001; Razani et al., 2001a; Woodman et al., 2003). De hecho, la expresión de caveolina-1 incrementa la formación de túbulos similares a similares a capilares de células endoteliales in vitro (Liu et al., 2002). Estos ratones carecen de caveolas en sus células y presentan un fenotipo hiperproliferativo. Así, se podría establecer una relación entre caveolina-1 y TGF-β en el contexto de la angiogénesis. Ya que el TGF-β puede actuar en células endoteliales a través de dos receptores de TGF-β distintos, ALK-5 y ALK-1, con efectos opuestos, cabría suponer que caveolina-1 podría modular la vía de ALK-1. Este sistema no ha sido estudiado aún y complementaría lo descrito hasta ahora para la vía de ALK-5. _________________________________________________________________Introducción 20 En resumen, la señalización del TGF-β en células endoteliales juega un papel crucial en la angiogénesis y remodelado vascular durante el desarrollo y el estadio adulto. Los mecanismos moleculares subyacentes a estos procesos dependen del TβR-I que dispare la señal, de la presencia de receptores auxiliares como endoglina y de la interacción con otras proteínas presentes en las células endoteliales, como caveolina-1. Determinar qué papel juega cada uno de estos componentes ayudará a comprender mejor cómo una misma citoquina como el TGF-β puede ejercer funciones tan dispares en una misma célula. II. OBJETIVOS ____________________________________________________________________Objetivos 22 Los objetivos de la presente tesis doctoral han sido analizar los siguientes puntos: 1. ASOCIACIÓN ENDOGLINA/ALK-1 EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE TGF-β Se estudiará la posible interacción de endoglina con ALK-1, así como la implicación de los dominios extracelulares y citoplásmicos en dicha asociación. También se analizará si la interacción de endoglina con ALK-1 afecta a la vía de señalización de TGF-β 2. PAPEL DE LA ISOFORMA CORTA DE ENDOGLINA EN EL SISTEMA DE TGF-β Se analizará si existe interacción del dominio citoplásmico de endoglina-S con los distintos receptores tipo I de TGF-β presentes en las células endoteliales. Se examinará si endoglina-S es capaz de modular tanto la vía de ALK-5 como la de ALK-1. 3. EFECTO DE CAVEOLINA-1 SOBRE LA VÍA DE TGF-β/ALK-1. Se estudiará la posible asociación de ALK-1 con caveolina-1 así como el efecto modulador sobre la vía de señalización de ALK-1/TGF-β. III. MATERIALES Y MÉTODOS _________________________________________________________Materiales y Métodos 24 3.1. CULTIVOS CELULARES El medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) fue suplementado con el 10% de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina. Este complemento calificará de completo a los medios en lo sucesivo. Así, este DMEM completo fue empleado para cultivar la línea epitelial de riñón de mono verde africano COS-7, la epitelial de riñón humano 293T, las líneas de transfectantes estables en mioblastos de rata L6E9 (Letamendía et al., 1998b) y la línea endotelial bovina inducible de endoglina GM7372EL (Conley et al., 2004), a la que se adicionó doxiciclina (Sigma, St. Louis, MO) como agente inductor a las dosis indicadas en cada caso. Para cultivar las células epiteliales de ovario de hámster chino CHO-K1 se empleó el medio de cultivo Ham’s F-12 completo. Para la obtención de transfectantes estables en esta línea (Blanco et al., 2005), el antibiótico de selección geneticina (G418) fue añadido en una concentración final de 1 mg/ml y la proporción de suero bovino fetal se redujo al 2% hasta ser cultivados finalmente en medio libre de suero UltraCHO (Bio-Witthaker, Walkersville, MD). La línea de células endoteliales humanas HMEC-1 fue mantenida en medio MCDB-131 completo suplementado, a su vez, con 1 ng/ml de EGF (Epidermal Growth Factor) (Promega Corporation, Madison, WI) y 1 µg/ml de hidrocortisona (Sigma). Las células humanas de vena de cordón umbilical (HUVECs) fueron obtenidas tras lavar dicha vena con solución isotónica Hank’s y digestión durante 10 minutos a 37ºC con colagenasa tipo I-A (Sigma). Fueron purificadas por adhesión diferencial a la placa, especificidad del medio de cultivo y por su potencial proliferativo sobre el resto de tipos celulares contaminantes. Para mantener estos cultivos primarios, las placas se incubaron previamente con gelatina al 0,2% en PBS durante 1 hora a 37ºC. El medio empleado para crecer estas HUVECs fue EBM-2 más el suplemento EGM-2 SingleQuots (Cambrex, Walkersville, MD). Para los ensayos en los que se desestabilizaron las caveolas de las células endoteliales mediante depleción de colesterol, se trató con 1% metil-β-ciclodextrina (MβCD) (Sigma) o 50 µg/ml nistatina (Sigma) durante 1 hora a 37ºC en ausencia de suero bovino fetal. Para recuperar el efecto inducido por la desestabilización de las caveolas, las células fueron incubadas a continuación con 25 µg/ml colesterol (Sigma) durante 24 horas adicionales. El TGF-β1 recombinante humano utilizado en los experimentos de estimulación fue reconstituido y hecho alícuotas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (R&D Systems Europe, Ltd., Abingdon, UK). La solución de lavado empleada fue tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4). Cuando fue necesario, las células se recogieron mediante tratamiento con una solución de tripsina/EDTA (0,05% Tripsina, 0,02% EDTA·4Na) durante 3 minutos a 37ºC, tras los cuales se detuvo su actividad por la adición de medio completo. Todos los cultivos celulares se mantuvieron de forma rutinaria en un incubador NAPCO, en atmósfera húmeda a 37ºC y 5% de CO2. Todo el material de cultivos empleado fue de Gibco/BRL (Life Technologies Ltd., Alemania), excepto cuando se indica. _________________________________________________________Materiales y Métodos 25 3.2. ANTICUERPOS Los anticuerpos primarios empleados se describen a continuación en la Tabla 3. Para el reconocimiento de los anticuerpos de ratón, se emplearon anticuerpos policlonales de conejo marcados con HRP (peroxidasa de rábano) o con el isómero 1 del fluoróforo FITC (isotiocianato de fluoresceína) según el caso (DakoCytomation, Dinamarca). Proteína diana Nombre Isotipo y especie Fuente Epítopo reconocido Referencia P4A4 IgG1, ratón Hibridoma Tyr227-Gly331 (Pichuantes et al., 1997) Endoglina H-300 PoAb, conejo Purificado Glu27-His326 sc-20632 T-19 PoAb, conejo Purificado Citoplásmico C-terminal sc-402 ALK-1 αALK1 PoAb, conejo Purificado Secuencia completa (Abdalla et al., 2000) ALK-5 V-22 PoAb, conejo Purificado Citoplásmico sc-398 K HA 12CA5 IgG2b, ratón Purificado Tyr98-Ala106 R-11 666 606 001 myc 9E10 IgG1, ratón Purificado Val408-Arg439 sc-40 caveolina-1 2297 IgG1, ratón Purificado Phe68-Pro75 BD 610407 Flag M2 IgG1, ratón Purificado D-Y-K-D-D-D-D-K Sigma F-3165 β-actina AC-15 IgG1, ratón Purificado Asp2-(V10I)-(M16K)Lys16 Sigma A-1978 Tabla 3. Descripción de los anticuerpos utilizados. IgG, inmunoglobulina monoclonal; PoAb, anticuerpo policlonal; sc, Santa Cruz Biotechnology Inc.; R, Roche; Sigma, Sigma, St. Louis, MO; BD, Becton Dickinson Transduction Laboratorios, San Jose, CA. 3.3. VECTORES DE EXPRESIÓN Y TRANSFECCIÓN Los cDNA marcados con el epítopo HA que codifican para el TβR-I ALK-5, su mutante constitutivamente activo ALK-5 (T204D), su mutante deficiente en actividad quinasa ALK-5 (K232R), y el de TβR-II estaban insertados en el vector de expresión pCMV5 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) y fueron amablemente cedidos por la Dra. Liliana Attisano (University of Toronto, Canadá). El Dr. Kohei Miyazono (Universidad de Tokio, Japón) cedió amablemente los vectores de expresión que contenían el cDNA de ALK-1, así como su mutante constitutivamente activo ALK-1 (Q201D) y el quinasa deficiente ALK-1 (K229R). A partir de la forma salvaje se obtuvieron dos versiones de ALK-1 mediante mutagénesis dirigida sobre el motivo consenso para la unión al dominio de andamiaje de caveolina-1. Empleando el oligonucleótido cebador 5’-GGCCTGGTGCTAGCGGAGATTGCCCGC-3’ y su complementario se consiguió la forma ALK-1 (001), que contiene la sustitución W406 A. Sobre éste, se llevó a cabo mutagénesis dirigida empleando el cebador 5’-GACATCTGGGCCGGCGGCCTGGTGCTG-3’ y su complementario, lográndose el mutante ALK-1 (011), que contiene por tanto la sustitución anterior _________________________________________________________Materiales y Métodos 26 más la F401 G. Todas las versiones de ALK-1 estaban marcados con el epítopo HA en sus extremos C- terminal e insertados en pcDNA3.1 (Invitrogen). La secuencia completa de endoglina, excepto su péptido señal, así como las distintas construcciones truncadas de la proteína (Figura 15) portando el epítopo HA en su extremo N-terminal están clonadas en el vector de expresión para mamíferos pDisplay (Invitrogen) y han sido previamente publicadas (Guerrero-Esteo et al., 2002). También, se utilizó un vector de expresión de endoglina marcado con el epítopo myc e insertado en el vector pCMV5, cedido por el Dr. Douglas A. Marchuk (Duke University Medical Center, NC). El cDNA de la isoforma corta de endoglina insertado en pcDNA3.1 fue amablemente proporcionado por el Dr. Miguel Quintanilla y estaba marcado con un epítopo Flag en su extremo C-terminal (Pérez-Gómez et al., 2005). Los vectores de expresión que contienen las secuencias completas de cDNA de caveolina-1 salvaje y la versión obtenida por mutagénesis dirigida sobre el dominio de andamiaje con las sustituciones F92 A y V94 A, cav-1 (SDmut) (Nystrom et al., 1999), fueron amablemente donados por el Dr. Michael J. Quon (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Ambas formas de caveolina portaban el epítopo myc. El vector de expresión de caveolina-1 con el dominio de andamiaje delecionado (∆82-101) (Li et al., 2003) fue amablemente cedido por el Dr. Timothy C. Thompson (Baylor College of Medicine, Houston, TX). La transfección de células de mamífero se llevó a cabo siguiendo dos estrategias diferentes indistintamente. Por un lado, se empleó el reactivo comercial Superfect (Qiagen, GMBH, Alemania) siguiendo las indicaciones recomendadas por el fabricante. Alternativamente, se usó un reactivo basado en liposomas preparado en el laboratorio. Así, se mezclaron 10 mg de DC-colesterol (colesterol 3β-N- (dimetil aminoetil) carbamato) (Sigma) y 10 mg DOPE (dioleil L-α-fosfatidil-etanolamina) (Sigma) en 1 ml de etanol a 37ºC y mediante una aguja del calibre 25G se consiguió una suspensión patrón concentrada 20x. La solución de trabajo se preparó justo antes de su utilización en agua destilada estéril y se hizo pasar por un filtro de 0,45 µm de diámetro para esterilizar y homogeneizar el tamaño de los liposomas. El protocolo de transfección seguido fue el mismo recomendado por el fabricante de Superfect (Qiagen). 3.4. CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN EndoEC-FC 3.4.1. Obtención del vector de expresión para EndoEC-Fc El dominio Fc de la inmunoglobulina IgG1 humana (hFcγ) fue amablemente cedido por el Dr. Joaquin Teixidó (Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC) en una construcción del vector pCMD8 que contenía la proteína de fusión VCAM-Fc. La secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio hFcγ contiene los tres exones que codifican para las regiones bisagra, CH2 y CH3, separados por dos intrones, y un codón de terminación de la traducción. Dicho dominio se aisló mediante amplificación por PCR en un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Roche) empleando los oligonucleótidos cebadores que aportaban en ambos extremos la secuencia diana para la enzima de restricción SalI (subrayada) y cuyas secuencias son las siguientes: directo 5’-CCGTCGACGAGCCCAAATCTTGT-3’ y reverso 5’-CCGTCGACTCATTTACCCGGGGA-3’. El producto de 914 pb resultante de la amplificación se _________________________________________________________Materiales y Métodos 27 separó por electroforesis en gel de agarosa y se purificó con un kit comercial de extracción de DNA (Millipore Corporation, Bedford, MA) siguiendo sus propias instrucciones. Posteriormente, se subclonó en el vector comercial pCR-II TOPO (Invitrogen) y se digirió con SalI (Roche Diagnostics SL, Sant Cugat del Vallès, España). En paralelo, la construcción pDisplay/586-Endo, que contiene el dominio extracelular de endoglina (Glu26-Gly586) (Guerrero-Esteo et al., 2002), fue digerida con SalI y defosforilada en sus extremos 5’ con fosfatasa alcalina (Roche) para evitar el reanillamiento. Así, el fragmento hFcγ se incubó con este vector abierto en presencia de la ligasa de T4 y su correspondiente tampón (Promega, Madison, WI) toda una noche a 16ºC. El vector de expresión resultante fue denominado pDisplay/EndoEC-Fc, estando marcado con un epítopo HA en su extremo N-terminal y portando el gen que confiere resistencia a geneticina (G418). 3.4.2. Generación de transfectantes estables productores de la proteína recombinante EndoEC-Fc Células CHO fueron transfectadas con la construcción pDisplay/EndoEC-Fc. Tras 48 horas, los transfectantes se seleccionaron con 1 mg/ml de G418 (Calbiochem, Darmstadt, Alemania). Paulatinamente, la concentración de suero bovino fetal del medio de cultivo F12 completo fue reduciéndose hasta el 2% hasta ser definitivamente sustituido por el medio sin suero UltraCHO (Bio- Witthaker), siempre en presencia del antibiótico de selección. Para obtener grandes cantidades de la proteína quimera, se generaron clones por dilución límite en placas de 96 pocillos con fondo en U (Nalge Nunc, Alemania). El sobrenadante de cultivo fue analizado mediante un ensayo de inmunoabsorbancia con enzima ligada (ELISA) indirecto tipo sándwich. Las placas de microtitulación empleadas fueron BIOCOAT (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) y tenían inmovilizado un suero policlonal de cabra frente a las cadenas pesada (H) y ligera (L) de la IgG humana. Para detectar la presencia de la proteína de fusión en los medios de cultivo condicionados de 24 horas de los clones aislados, se utilizó el anticuerpo monoclonal de ratón anti-endoglina humana P4A4. La presencia de la proteína recombinante EndoEC-Fc fue puesta de manifiesto mediante el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa y posterior incubación con el sustrato TMB (PharMingen, San Diego, CA). Los controles negativos empleados fueron medio condicionado de células CHO-K1, transfectadas con un vector de expresión irrelevante, y el fragmento hFcγ purificado (Chemicon International Inc., Temecula, CA). Éste también se empleó para comprobar la especificidad del método por competencia frente a un sobrenadante condicionado con EndoEC-Fc. La reacción fue detenida al añadir 2N H2SO4 (Panreac, Barcelona, España) y cuantificada en un colorímetro para placas de ELISA MPR A4 (Eurogenetics, Bruselas, Bélgica) a una longitud de onda de 450 nm. 3.5. ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR Para comprobar la funcionalidad de la proteína quimera EndoEC-Fc sobre células endoteliales se estudió si el efecto antiproliferativo dependiente de TGF-β era revertido por esta proteína recombinante, tal y como sucede con la endoglina endógena (Lastres et al., 1996; Letamendía et al., 1998b). Células HMEC-1 fueron sembradas en placas de 24 pocillos en una relación de 5 x 104 células/pocillo y _________________________________________________________Materiales y Métodos 28 transfectadas con pDisplay/EndoEC-Fc, utilizando el vector vacío, pDisplay (Invitrogen), como control negativo. Para comprobar que la región extracelular de endoglina presente en EndoEC-Fc era la responsable del efecto observado, pocillos paralelos conteniendo el mismo número de células HMEC-1 se incubaron con la región extracelular de endoglina purificada libre de transportador (R&D Systems, Minneapolis, MN) o bien con PBS como control negativo. Tras 24 horas en presencia o no de 10 ng/ml TGF-β las células fueron lavadas con PBS y fijadas posteriormente con una solución de formaldehído al 3,5% en PBS durante 10 minutos seguido de metanol al 2% en PBS durante 2 minutos a temperatura ambiente. Después, los pocillos se incubaron con una solución del colorante cristal violeta al 0,5% en metanol al 20% en PBS durante 15 minutos. Tras lavar con abundante agua, los pocillos se dejaron secar al aire completamente durante toda una noche a temperatura ambiente. Los núcleos celulares así teñidos fueron disueltos en ácido acético al 5% y la absorbancia de alícuotas leída en un colorímetro a una longitud de onda de 595 nm. Estas medidas son directamente proporcionales al número de células presentes en los pocillos y, por lo tanto, a la proliferación. Para estimar el número de células en cada caso, se realizó una curva de calibrado en paralelo. Se definió como índice de proliferación (IP) el resultado de aplicar la siguiente fórmula: 0 0 XX XX IP i − − = ; para cada triplicado. Donde iX corresponde al número final de células en cada pocillo dentro de un triplicado, X es la media de cada triplicado, y 0X es el número inicial de células, que fue de 50.000 células/pocillo. 3.6. CITOMETRÍA DE FLUJO La expresión de endoglina inducible por doxiciclina en células GM7372EL (Conley et al., 2004) se monitorizó de forma indirecta por citometría de flujo. El sistema de expresión inducible se basa en el plásmido pBI-EGFP (Clontech, Worcester, MA) que permite expresar simultáneamente el gen de interés y EGFP (proteína verde fluorescente mejorada) a partir de un promotor de respuesta a tetraciclina bidireccional. Así en este caso, la cantidad de EGFP presente en las células es directamente proporcional a la de endoglina. Por tanto, las células creciendo en monocapa se trataron con cantidades crecientes de doxiciclina (20-500 ng/ml). Transcurridas 24 horas, las células se lavaron con PBS y se recogieron mediante tratamiento con tripsina. Después de 2 lavados más con PBS, las células se resuspendieron en una solución de 10 µg/ml ioduro de propidio en PBS para comprobar la viabilidad celular y la fluorescencia se valoró en un citómetro de flujo EPICS-XL (Coulter, Hialeah, FL), empleando un láser de argón sintonizado a una longitud de onda de emisión de 488 nm y colección de fluorescencia a 525 nm, 620 nm para el ioduro de propidio, mediante amplificadores logarítmicos. _________________________________________________________Materiales y Métodos 29 3.7. MICROSCOPÍA DE INMUNOFLUORESCENCIA Las células se crecieron durante 24 horas sobre cubreobjetos circulares de 12 mm de diámetro previamente tapizados con 0,5 % de gelatina bovina (Sigma), en placas de cultivo de 24 pocillos. Para detectar la síntesis de la proteína soluble EndoEC-Fc las muestras se fijaron y permeabilizaron en un mismo paso con una solución del 3,5% de formaldehído (Merck, Darmstadt, Alemania) y 100 µg/ml L-α-lisofosfatidilcolina (Sigma) durante 20 minutos a 4ºC. A continuación, se bloqueó con 1% de BSA en PBS durante 1 hora, tras la cual se procedió a la incubación con el anticuerpo primario indicado en cada caso. Después de tres lavados con PBS frío, las muestras se incubaron con el anticuerpo secundario acoplado al fluorocromo Alexa 488 (emisión en el espectro verde) o Alexa 546 (emisión en el espectro rojo) (Molecular Probes, Eugene, OR), según el caso. Los filamentos de actina se visualizaron incubando las células una vez fijadas y permeabilizadas, mediante el mismo método anteriormente descrito, con 5 U/ml de faloidina acoplada al fluorocromo rodamina (Molecular Probes), que emite en rojo, durante 30 minutos a 4ºC. Finalmente, las muestras fueron montadas sobre portas con Mowiol 44-88 (Sigma) y analizadas en un microscopio de epifluorescencia Axioplan Universal (Zeiss, Alemania) con CCD Photometrics CH 250/A acoplada. Alternativamente, las muestras fueron analizadas en un microscopio confocal espectral Leica TCS SP2 (Leica Microsystems GmbH, Alemania). 3.8. INMUNOPRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS Las células fueron lisadas a 4ºC durante 30 minutos con tampón de lisis celular, compuesto de 50 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 500 µM EDTA, 100 µM EGTA, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 10% glicerol, 1% digitonina y una mezcla de inhibidores de proteasas (Complete 1x, Roche). Este tampón fue utilizado también para lisar células en los ensayos de arrastre in vitro. Para los ensayos con caveolina-1, el tampón de lisis fue sustituido por 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 60 mM octil- β-glucósido y Complete 1x (Roche). Las placas de cultivo fueron raspadas y los extractos celulares así obtenidos se centrifugaron a 13.400 rpm durante 5 minutos a 4ºC, para sedimentar restos celulares. La concentración de proteínas totales en los sobrenadantes fue determinada mediante el reactivo de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) respecto a una recta de calibrado con BSA (albúmina sérica bovina) (Roche). Todas las inmunopreipitaciones se llevaron a cabo a 4ºC con proteína G, según el anticuerpo utilizado en cada caso, unida covalentemente a sefarosa (SP-G) (Amersham Biosciences, Alemania). Debido a las posibles interacciones inespecíficas con esta matriz, se tomaron alícuotas de los lisados con cantidades equivalentes de proteína y se preaclararon con SP-G durante 1 hora a 4ºC. Tras este proceso, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante fue sometido a inmunoprecipitación. Para ello, el anticuerpo adecuado se acopló a SP-G durante 1 hora a 4ºC. A continuación, los extractos celulares preaclarados se incubaron con los complejos SP-G/anticuerpo durante toda la noche a 4ºC. Finalmente, estos inmunoprecipitados fueron lavados con tampón TNE-T, compuesto por 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA y 0,05% Tween-20. _________________________________________________________Materiales y Métodos 30 3.9. ENSAYOS DE ARRASTRE IN VITRO (PULL-DOWN) Las células CHO-K1 transfectadas de forma estable con pDisplay/EndoEC-Fc se cultivaron en medio libre de suero UltraCHO (Bio-Witthaker) con 1 mg/ml de G418. Los sobrenadantes condicionados de los cultivos que contenían la proteína soluble EndoEC-Fc se recogieron a las 48 horas de cultivo y se sometieron a centrifugación a 2.000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente con concentradores Vivaspin (Vivascience, Sartorius Group, Alemania) de membrana de polietersulfona que sólo permiten el paso de partículas menores de 50 kDa de peso molecular. La proteína de fusión EndoEC-Fc presente en el medio así enriquecido se acopló a proteína A unida covalentemente a sefarosa (SP-A) (Amersham) durante 1 hora a 4ºC en un agitador orbital. Las células COS-7 transfectadas transitoriamente durante 48 horas con los vectores de expresión de TβR-II, ALK-5 y ALK-1 se lavaron con PBS y se lisaron en frío y agitación durante 30 minutos con el tampón de lisis anteriormente descrito. Alícuotas de estos lisados totales que contenían igual cantidad de proteína se incubaron con la proteína EndoEC-Fc inmovilizada a SP-A durante toda la noche en agitación orbital a 4ºC. A continuación, las muestras se lavaron tres veces con TNE-T y finalmente se resuspendieron en tampón Laemli 1X en presencia de 100 mM DTT, para someterla posteriormente a separación por SDS-PAGE y posterior inmunodetección con el anticuerpo correspondiente. 3.10. FRACCIONAMIENTO CELULAR PARA LA OBTENCIÓN DE CAVEOLAS Células endoteliales humanas HMEC-1 fueron crecidas en placas de 10 cm de diámetro y lisadas durante 30 minutos a 4ºC con 2 ml de tampón de lisis compuesto de MBS (25 mM MES pH 6,5, 150 mM NaCl), 1% Triton X-100 y Complete 1x. La superficie de la placa se raspó y los extractos fueron homogenizados con la ayuda de una aguja del calibre 30G. Se almacenó una pequeña alícuota del lisado total y el resto se mezcló con 2 ml de sacarosa al 80% en MBS. Sobre esta suspensión se añadieron 4 ml de sacarosa al 30% en MBS y, sobre esta, 4 ml de sacarosa al 5% en MBS, creando así 12 ml de gradiente de sacarosa discontinuo. La muestra se sometió a ultracentrifugación a 200.000 g a 4ºC durante 20 horas en un rotor SW41-4160. Se recogieron 12 fracciones de 1 ml cada una y las proteínas presentes en ellas se precipitaron añadiendo 1 volumen de tricloroacético (TCA) al 40%. Se centrifugaron durante 5 minutos a 4ºC a máxima velocidad en una microcentrífuga y se realizaron 3 lavados con una solución etanol:éter (1:1). Las proteínas precipitadas se resuspendieron en 100 µl de tampón de muestra Laemli 1x con 1 mM DTT y alícuotas se sometieron a SDS-PAGE y electrotransferencia a membrana de PVDF y posterior inmunodetección. 3.11. ELECTROFORESIS E INMUNODETECCIÓN (WESTERN BLOT) DE PROTEÍNAS Las proteínas se separaron y analizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS- PAGE). Muestras de extractos celulares totales, o bien inmunoprecipitados, se diluyeron en tampón Laemmli, se hirvieron durante 5 minutos y se analizaron en condiciones reductoras, con 100 mM DTT _________________________________________________________Materiales y Métodos 31 (Sigma), o no reductoras en minigeles adaptados a los sistemas de electroforesis Mini Protean 3 (Bio-Rad Laboratories) y Hoefer (Amersham), según los casos. Las proteínas separadas en función de sus tamaños presentes en el gel se transfirieron a una membrana de PVDF Immobilon-P (Amersham). Las uniones inespecíficas se bloquearon incubando la membrana en una solución de leche desnatada en polvo al 5% en TBS-T (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl y 0,05% Tween-20). Una vez bloqueada, la membrana se incubó con los anticuerpos correspondientes durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la membrana 3 veces con TBS-T durante 10 minutos, se procedió a la incubación con el segundo anticuerpo acoplado a peroxidasa (DakoCytomation). La reacción de reconocimiento de las bandas específicas se llevó a cabo, tras 3 lavados con TBS-T, mediante un ensayo de quimioluminiscencia utilizando el kit comercial SuperSignal (Pierce, Rockford, IL). La densitometría de las bandas reveladas en películas Curix RP2 Plus (AGFA, Mortsel, Bélgica) se realizó con el programa informático Adobe Photoshop CS (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA). 3.12. ESTUDIO DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE TGF-β Todos los ensayos se llevaron a cabo mediante la transfección transitoria de las células indicadas en cada caso en placas de 24 pocillos. Las unidades relativas de luciferasa se determinaron en un luminómetro TD20/20 (Promega). En todos los casos, la transfección incluyó un vector de expresión de β-galactosidasa insensible a TGF-β (pSV40/β-Gal) que se utilizó como control interno para corregir la eficiencia de transfección. La medida de esta actividad se llevó a cabo mediante el reactivo Galacto-Light (Tropix, Bedford, MA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se definen como unidades relativas de luciferasa (U.R.L.) el cociente de la actividad luciferasa entre la de β-galactosidasa. Cuando fue necesario, se añadió TGF-β a la concentración y tiempo indicados. Todos los experimentos fueron realizados al menos por triplicado y los resultados fueron analizados mediante el test estadístico t- student. 3.12.1. Ensayos de actividad reportera Para estudiar señalización activada por TGF-β, se analizó la actividad reportera de promotores de genes diana de TGF-β y la de elementos concretos de respuesta dentro de estos promotores, en ambos casos acoplados al cDNA que codifica para la enzima luciferasa. Estos vectores se describen a continuación en la Tabla 4. _________________________________________________________Materiales y Métodos 32 Nombre Gen de origen Secuencia Referencia pId1-Luc Id1 -1585/+88 (Tournay & Benezra, 1996) p800-Luc PAI-1 -800/+71 (van Zonneveld et al., 1988) p(BRE)2-Luc Id1 2x[(-1052/-1032)/(-1105/-1080)] (Korchynskyi & ten Dijke, 2002) p(CAGA)12-Luc PAI-1 12x[(-791/-546)/(-328/-187)] (Dennler et al., 1998) Tabla 4. Vectores reporteros de la vía de señalización de TGF-β. Id1, Inhibidor de la unión al DNA-1; PAI-1, Inhibidor del Activador del Plasminógeno-1; BRE, Elemento de Respuesta a BMPs; CAGA, Consenso denominado caja CAGA para la unión a Smad3 (AG(C/A)CAGACA). 3.12.2. Ensayos de transactivación con el sistema GAL4 Para los ensayos de transactivación se utilizaron vectores de expresión que codificaban para las proteínas Smad1 y Smad3 fusionadas al dominio de transactivación GAL4, cedidas amablemente por el Dr. Konosuke Nakayama (Universidad de Tokio, Japón) (Nakayama et al., 2003) y el Dr. Rik Derynck (Georgetown University, Washington, DC) (Feng et al., 1998), respectivamente. Fueron co-transfectadas con el vector reportero pFr5-Luc (Stratagene, La Jolla, CA). Así, la capacidad de transactivación por parte de las Smads del promotor heterólogo GAL4 fue cuantificada por la medida de la actividad luciferasa expresada por las células transfectadas. 3.13. INTERFERENCIA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR PEQUEÑAS MOLÉCULAS DE RNA (KNOCK-DOWN) El vector pSUPER (OligoEngine, Seattle, WA) fue utilizado para los ensayos de interferencia con pequeñas moléculas de RNA. Así, el vector pSUPER/Endo-Ex4 se generó insertando un oligonucleótido de doble hebra, según las reglas de Elbashir (Elbashir et al., 2001; Harborth et al., 2001), correspondiente a una pequeña secuencia homóloga del exón 4 del gen de endoglina humana, tal y como fue descrito previamente (Sanz-Rodríguez et al., 2004). El vector pRNA-U6/cav-1 para la interferencia de caveolina-1 (Bhatnagar et al., 2004) fue amablemente aportado por el Dr. Bryan L. Roth (Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH). Una vez que el vector es transfectado, se transcribe una pequeña molécula de RNA que al adoptar una estructura secundaria bicatenaria interfiere post-transcripcionalmente con la expresión del gen diana. Como control de la interferencia se utilizaron secuencias irrelevantes para el gen estudiado en cada caso. _________________________________________________________Materiales y Métodos 33 3.14. TRANSCRIPCIÓN REVERSA MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RT-PCR) El RNA total de células HUVECs para su análisis a lo largo de los pases del cultivo primario fue obtenido mediante el método de un solo paso con el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El RNA aislado se resuspendió en el tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0). A continuación, la síntesis de cDNA se llevó a cabo a partir de 1 µg de RNA total mediante un kit comercial para RT-PCR (First Strand cDNA Synthesis, Roche) usando como oligonucleótido cebador oligo(dT)15 en un volumen final de reacción de 20 µl siguiendo las indicaciones comerciales. Después, alícuotas de 5 µl de cDNA así obtenido se sometieron a amplificación por PCR empleando el kit comercial HotMaster Taq DNA Polimerase (Eppendorf, Alemania) y los productos derivados se resolvieron por electroforesis en geles de agarosa. La secuencia de los oligonucleótidos cebadores específicos para PCR empleados se resume en la Tabla 5. Como control interno, y para normalizar, se amplificó una secuencia de 417 pb correspondiente a la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Secuencia (5’ 3’) Diana Directo Reverso CT-Endo GAATTCTGGTACATCTACTCGC GGCTATGCCATGCTGCTGGTGG EC-Endo GGGGCCCAGCCGGCCGAAACAGTCCATTGT TCCCCGCGGTTTCCGCTGTGG ALK-1 GCAGATCTGACCCTGTGAAGCCG TACCGCGGCTGGCCATCTGTTCC ALK-5 GGCCATGGATCTGCCACAACC GACCCGGGTACATTTTGATGCC TβR-II ATGGCCATGGAGGCCCGCGTTAACCGGCAG GAGGATCCTATTTGGTAGTGTTTAG GAPDH GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCA CGGCCATCACGCCACACAGT Tabla 5: Secuencia de los oligonucleótidos específicos empleados en la amplificación por PCR. La pareja de oligonucleótidos CT-Endo detectan la región citoplásmica tanto de endoglina-L (150 pb) como de endoglina-S (285 pb) (Bellón et al., 1993). El par EC-Endo amplifica una secuencia del dominio extracelular de endoglina, por lo que pone de manifiesto la endoglina total. Las condiciones de la reacción de transcripción reversa fueron 30 minutos a 50ºC seguidos de 6 minutos a 85ºC y posterior enfriamiento a 4ºC. Las condiciones de tiempo y temperatura de las amplificaciones por PCR fueron las siguientes: 5 minutos a 96 °C, seguidos de 35 ciclos de 1 minuto a 96 °C, 1 min at 52 °C (según la pareja de cebadores) y 1 min a 68 °C, con un paso final de elongación de 8 min at 68 °C y posterior enfriamiento a 4ºC. _________________________________________________________Materiales y Métodos 34 3.15. ACTIVIDAD β-GALACTOSIDASA ASOCIADA A SENESCENCIA Células HUVECs se cultivaron en placas de 60 mm de diámetro pretratadas con 0,2% gelatina en PBS. La tinción de la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia (SA β-gal) se desarrolló de acuerdo con el protocolo establecido en la literatura (Dimri et al., 1995). En resumen, en el pase indicado las células se lavaron con PBS dos veces y se fijaron con una solución de 3,5% formaldehído (Merck, Alemania) en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tras dos lavados las células fijadas fueron incubadas a 37ºC en ausencia de CO2 durante 16 horas la solución de tinción compuesta por 1 mg/ml de X-gal, 40 mM tampón ácido cítrico/Na2HPO4 pH 6,0, 5 mM K4Fe(CN)6, 5 mM K3Fe(CN)6, 2 mM MgCl2 y 150 mM NaCl. Las células teñidas fueron observadas en un microscopio invertido de contraste de fase Axiovert 25 (Zeiss). El marcaje SA β-gal fue puesto de manifiesto como células con el citoplasma teñido de azul y el porcentaje de senescencia se estableció como la media del conteo de células marcadas de cuatro campos tomados de forma aleatoria. 3.16. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS Los resultados que se muestran son representativos de al menos tres repeticiones. El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo mediante la aplicación del test t-Student. Las representaciones gráficas muestran la media ± SEM (error estándar de la media). Se consideró estadísticamente significativo un valor de p<0,05. IV. RESULTADOS ___________________________________________________________________Resultados 36 4.1. ENDOGLINA SE ASOCIA DIRECTAMENTE CON ALK-1 De acuerdo con el primer objetivo planteado, se quiso estudiar la posible interacción de endoglina con ALK-1, ya que ambos intervienen en el complejo del receptor de TGF-β y son co-expresados en células endoteliales. Para dicho fin, se transfectaron células COS-7 con los vectores de expresión para endoglina y ALK-1. Al mismo tiempo, se quiso comprobar si de producirse la interacción, ésta dependía del estado de activación del TβR-I por lo que dos mutantes correspondientes a la forma quinasa deficiente, ALK-1 (K229R), y constitutivamente activada, ALK-1 (Q201D), se incluyeron en el ensayo de inmunoprecipitación. La Figura 9.A muestra que las tres versiones de ALK-1 son inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal frente a endoglina (panel superior). Como control, tanto endoglina como las tres formas de ALK-1 se inmunodetectan en los lisados totales gracias a los epítopos HA que portan (panel inferior). Por otro lado, el experimento reverso (Figura 9.B) confirmó estos resultados, es decir, el anticuerpo monoclonal frente al epítopo HA presente en las variantes de ALK-1 es capaz de inmunoprecipitar endoglina, marcada en este caso con un epítopo myc. Estos resultados demuestran que endoglina interacciona con ALK-1 y que esta asociación no depende del estado de activación de la quinasa de este receptor tipo I de TGF-β. 4.1.1. La interacción endoglina/ALK-1 implica a sus regiones extracelulares Para diseccionar esta interacción, se quiso comprobar si la región extracelular de endoglina era capaz de asociarse con ALK-1. Para conseguir este objetivo, se construyó el vector de expresión pDisplay/EndoEC-Fc que codifica para la proteína quimera compuesta por el dominio extracelular completo de endoglina (Glu26-Gly586) fusionado al fragmento Fc de la IgG1 humana. Esta proteína recombinante se obtuvo a partir de transfectantes estables de células CHO-K1. Se comprobó que era sintetizada por éstos (Figura 10.A) y que era secretada al sobrenadante principalmente en forma de homodímero (Figura 10.B). Esta proteína quimera EndoEC-Fc se acopló a sefarosa-proteína A y se incubó con lisados totales de células COS-7 transfectadas independientemente con los receptores TβR-II, ALK-5 y ALK-1. Como muestra la Figura 11, todos estos receptores fueron arrastrados por la región extracelular de endoglina fusionada al fragmento Fc, demostrando que la interacción se puede llevar a cabo por este ectodominio de endoglina. Sin embargo, hay que destacar que la interacción de TβR-II y ALK-5 con EndoEC-Fc es similar pero mucho menor que con ALK-1, tal y como pone de manifiesto la densitometría de las bandas reveladas en la inmunodetección (Figura 11, panel inferior). ___________________________________________________________________Resultados 37 Figura 9: Endoglina se asocia con ALK-1. Células COS-7 se transfectaron con los vectores de expresión indicados. Tras 48 horas, las células fueron lisadas. Los lisados totales y las inmunoprecipitaciones fueron sometidas a SDS-PAGE en condiciones reductoras seguido de electrotransferencia e inmunodetección (western-blot). (A) Anticuerpos frente a endoglina son capaces de inmunoprecipitar la forma salvaje de ALK-1 así como los mutantes kinasa deficiente y constitutivamente activo. (B) Experimento inverso en el que se demuestra que anticuerpos contra el epítopo HA presente en ALK-1 salvaje y sus variantes inactivas y activas inmunoprecipitan endoglina, confirmándose la interacción entre ambas proteínas. A ALK-1 (WT) ALK-1 (KR) ALK-1 (QD) (HA)-Endoglina - - - + + - - - + - - + - + - + - - + + - Endoglina - ALK-1 - Endoglina - ALK-1 Co-Inmunoprecipitación IP: α-Endoglina (P4A4) WB: α-HA (12CA5) Lisados totales WB: α-HA (12CA5) B ALK-1 (WT) ALK-1 (KR) ALK-1 (QD) (myc)-Endoglina - - - + + - - - + - - + - + - + - - + + - Endoglina Co-Inmunoprecipitación IP: α-HA (12CA5) WB: α-myc (9E10) Lisados totales - Endoglina - ALK-1 WB: α-HA (12CA5) WB: α-myc (9E10) ___________________________________________________________________Resultados 38 Figura 10: Producción de la proteína quimera EndoEC-Fc. Células CHO-K1 fueron transfectadas de forma estable con pDsiplay/EndoEC-Fc o con el vector vacío. Se seleccionaron clones que sobreexpresaban la proteína recombinante y se analizaron. (A) La tinción citoplásmica indica que EndoEC-Fc es activamente sintetizada por los transfectantes estables de CHO-K1, puesta de manifiesto mediante los anticuerpos anti-HA (12CA5) y anti-endoglina (P4A4). En el control negativo se incubó sólo con el anticuerpo secundario, mientras que la tinción con faloidina marcada con rodamina se utilizó como control positivo. (B) El sobrenadante UltraCHO condicionado de los transfectantes control y de EndoEC-Fc fue recogido por duplicado a los tiempos indicados y sometidos a separación por SDS-PAGE en condiciones no reductoras (C.N.R.) o reductoras (C.R.) y electrotransferencia e inmunodetección. Los resultados obtenidos demuestran que (i) EndoEC-Fc se libera al medio de cultivo, (ii) se libera al medio de forma soluble como un dímero, y (iii) con mayor rendimiento entre las 24 y las 48 horas. A Control IgG Control Positivo α-HA α-Endoglina B 250 kDa - 98 kDa - 64 kDa - 250 kDa - 98 kDa - Ctr 24 h 48 h 72 h C.N.R. WB: α-Endoglina (P4A4) C.R. WB: α-Endoglina (P4A4) ___________________________________________________________________Resultados 39 Figura 11: Interacción de las regiones extracelulares de endoglina y los receptores de TGF-β. Células COS-7 fueron transfectadas con los vectores de expresión de los receptores de TGF-β indicados y lisadas tras 48 horas. La expresión de los distintos receptores fue analizada mediante separación por SDS-PAGE en codiciones reductoras y electrotransferencia e inmunodetección por el epítopo HA con el que estaban marcados en los lisados totales (panel medio). El sobrenadante de cultivo UltraCHO condicionado de 24 horas de tranfectantes estables de EndoEC-Fc fue incubado con sefarosa/proteína A para retener la proteína quimera por su fragmento Fc humano. Este cebo fue incubado con los distintos lisados totales y los receptores arrastrados se separaron por SDS- PAGE en condiciones reductoras yelectrotransferencia e inmunodetección con el anticuerpo anti- HA (12CA5). El panel superior muestra que EndoEC-Fc es capaz de arrastrar el TβR-II, ALK-5 y ALK-1 (señalados con asteriscos). La densitometría de las bandas (panel inferior) muestra que la interacción de EndoEC-Fc con ALK-1 es mucho mayor que con el resto de receptores. * * * E n d o E C -F c C o n tr o l A L K -1 T βR -I I A L K -5 TβR-II EndoEC-Fc ALK-1 ALK-5 Arrastre in vitro (pull-down) Cebo: (HA)-EndoEC-Fc WB: α-HA (12CA5) * * * ALK-5 ALK-1 TβR-II Lisados totales WB: α-HA (12CA5) Proporción de receptor precipitado (Arrastre/Total) U n id a d e s A rb it ra ri a s 18 - 12 - 9 - 6 - 3 - 15 - T βR -I I A L K -5 A L K -1 ___________________________________________________________________Resultados 40 4.1.2. Los dominios citoplásmicos de endoglina y ALK-1 interaccionan entre sí. Para estudiar si la asociación endoglina/ALK-1 tenía lugar también por sus regiones citoplásmicas, se transfectaron la forma salvaje de ALK-1, la forma quinasa deficiente y la constitutivamente activa junto con una construcción truncada de endoglina que contenía la secuencia transmembrana y el tallo citoplásmico. Como se aprecia en la Figura 12, anticuerpos frente a ALK-1 son capaces de inmunoprecipitar el tallo citoplásmico de endoglina. No obstante, hay que puntualizar que en este caso el estado de activación de ALK-1 sí influye en la asociación con la construcción truncada de endoglina TMCT-Endo (Figura 12). Este hecho se podría explicar por la pérdida de afinidad del dominio serina/treonina quinasa por su producto, tras actuar sobre el sustrato. Figura 12: Interacción del dominio citoplásmico de endoglina con ALK-1. Células COS-7 fueron transfectadas con los vectores de expresión de ALK-1 salvaje (WT), quinasa deficiente (KR) y constitutivamente activo (QD) junto con el dominio citoplásmico de endoglina (TMCT-Endo) y lisadas tras 48 horas. Los lisados totales y los inmunoprecipitados fueron separados por SDS-PAGE en condiciones reductoras y electrotransferidos e inmunodetectados con anticuerpos específicos. En los lisados totales se inmunodetectó la expresión de las proteínas recombinantes mediante los anticuerpos indicados (paneles medio e inferior). El panel superior muestra que la construcción truncada de endoglina TMCT-Endo fue co-inmunoprecipitada con anticuerpos policlonales frente a ALK-1, excepto en el caso del mutante constitutivamente activo ALK-1 (QD). ALK-1 (WT) ALK-1 (KR) ALK-1 (QD) TMCT-Endo + - - - + - - + - + - + - - + + Co-Inmunoprecipitación IP: α-ALK-1 WB: α-HA (12CA5) TMCT-Endo Lisados totales WB: α-HA (12CA5) WB: α-ALK-1 TMCT-Endo ALK-1 ___________________________________________________________________Resultados 41 4.2. ENDOGLINA FAVORECE LA SEÑALIZACIÓN DE TGF-β VÍA ALK-1 Para analizar el papel que juega endoglina en la vía de señalización dependiente de ALK-1 en células endoteliales, se utilizó el sistema inducible por doxiciclina GM7372-EL (Conley et al., 2004). Como se comentó en el apartado de Materiales y Métodos, esta línea celular endotelial bovina expresa endoglina humana en respuesta a doxiciclina. La Figura 13 muestra la monitorización de este sistema mediante inmunodetección y por citometría de flujo a distintas dosis de doxiciclina. Ya que ALK-1 desencadena la señalización de TGF-β vía Smad1, se utilizó el sistema reportero, denominado también como híbrido simple, GAL4-Smad1 (Nakayama et al., 2003) para comprobar si la asociación endoglina/ALK-1 tenía alguna implicación funcional. En este sistema se genera una proteína de fusión del factor de transcripción Smad1 al dominio de unión al DNA de GAL4, la cual es transfectada simultáneamente con el vector reportero para GAL4 acoplado a luciferasa, pFr5-Luc (Stratagene). La inducción de endoglina a dosis crecientes de doxiciclina resultó en una clara inducción de la actividad reportera vía GAL4-Smad1 (Figura 14.A). En este sentido cabe destacar que curiosamente esta inducción tuvo lugar incluso sobre la actividad basal, esto es, en ausencia de estímulo por TGF-β. Esta inducción de GAL4-Smad1 fue corroborada mediante la forma quinasa deficiente de ALK-1 independientemente de la presencia de endoglina en el sistema. El efecto negativo de este ALK-1 (KR) sobre la respuesta transcripcional basal de Smad1 indica la existencia de actividad de ALK-1 endógeno. El papel de endoglina en la señalización TGF-β/ALK-1 fue analizado además mediante ensayos con RNA de interferencia (siRNA). Así, células endoteliales humanas HMEC-1 fueron transfectadas con el vector pSUPER/EndoEx4, que codifica para un pequeño siRNA que interfiere específicamente con la expresión de endoglina (Sanz-Rodríguez et al., 2004). El resultado del experimento demostró que el bloqueo específico de la expresión de endoglina inhibe la transactivación de GAL4-Smad1 inducida por TGF-β (Figura 14.B). Estos resultados demuestran que endoglina está implicada en la vía de señalización TGF-β/ALK-1 en células endoteliales. ___________________________________________________________________Resultados 42 Figura 13: Monitorización del sistema GM7372-EL, línea endotelial bovina inducible de endoglina humana por doxiciclina. Se establece una relación directa entre la dosis de doxiciclina y la expresión de endoglina durante 24 horas mediante (A) lisados totales sometidos a SDS-PAGE en condiciones no reductoras y electrotransferencia e inmunodetección con anticuerpos anti- Endoglina (P4A4) y (B) citometría de flujo, donde la detección de la proteína verde fluorescente, EGFP, es directamente proporcional a la expresión de endoglina por estar acopladas transcripcionalmente (ver apartado Materiales y Métodos). (C) Detección de ALK-1 endógeno bovino en un extracto total. Como control positivo se analizó un lisado de células endoteliales humanas HMEC-1. Como control negativo, un lisado de células 293T. Estos tres lisados se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reductoras y electrotransferencia e inmunodetección. Debido al alto nivel de homología entre la secuencia humana y la bovina de ALK-1 (aproximadamente 90%), ambas proteínas pueden ser reconocidas por los mismos anticuerpos policlonales frente a ALK-1 humano por reacción cruzada. El lisado total de células HMEC-1 se utilizó como control positivo y el de células 293T como negativo. A WB: α-Endoglina (P4A4) WB: α-β-actina (AC-15) β-actina Dox (ng/ml) 0 20 100 500 Endoglina B Intensidad de fluorescencia 500 100 20 0 Dox (ng/ml) 1,3 7,9 10,6 14,4 C WB: α-ALK-1 (PoAb) WB: α-β-actina (AC-15) β-actina ALK-1 H M E C -1 29 3T G M 73 72 -E L ___________________________________________________________________Resultados 43 4.2.1 El dominio extracelular de endoglina promueve la señalización vía ALK-1 Para mapear las regiones de endoglina implicadas en la señalización de ALK-1 inducida por TGF-β, varias construcciones truncadas fueron transfectadas en células CHO-K1. Este sistema celular se empleó por su alta eficiencia de transfección y por ser un modelo que responde a la señalización de TGF-β vía receptores ALK (Liu et al., 2002). Así, la Figura 15 esquematiza las construcciones empleadas para analizar la contribución específica de cada dominio de endoglina, donde se empleó el sistema reportero GAL4-Smad1/pFr5-Luc. Como era de esperar, la secuencia completa de endoglina aumentó la transactivación, tanto basal como inducida por TGF-β, de GAL4-Smad1 con respecto a células transfectadas con vector vacío (control). Sin embargo, la transfección de la construcción que carecía del dominio citoplásmico (ECTM-Endo) resultó en una marcada estimulación de la transactivación GAL4-Smad1 respecto la forma completa, mientras que la que carecía del dominio extracelular (TMCT-Endo) condujo a una inhibición de esta actividad que, incluso, no pudo ser inducida por el tratamiento con TGF-β (Figura 15.A). Figura 14: Efecto de la expresión de endoglina sobre la señalización dependiente de Smad1. (A) La expresión de endoglina inducida por dosis crecientes de doxiciclina durante 16 horas en células GM7372EL resultó en un aumento de la transactivación GAL4-Smad1 tanto basal como inducida por 10 ng/ml TGF-β durante 24 horas adicionales, mientras que la forma quinasa deficiente ALK-1 (KR) anuló toda actividad reportera. (B) La expresión de endoglina endógena en células HMEC-1 fue eliminada mediante la transfección de un siRNA específico durante 40 horas. Mientras que un siRNA irrelevante no causó efecto alguno sobre la actividad de transactivación de GAL4-Smad1, el siRNA de endoglina redujo significativamente esta actividad, tanto en ausencia como en presencia de 10 ng/ml TGF-β, demostrando que endoglina es capaz de potenciar considerablemente la vía de señalización ALK-1/Smad1. En todos los casos, p<0,01. A 160 - 140 - 120 - 100 - 80 - 60 - 40 - 20 - Dox (ng/ml) 0 20 100 500 0 500 ALK-1 (KR) Control TGF-β U n id a d e s R e la ti v a s d e L u ci fe ra sa GAL4-Smad1 B 1 - 7 - 6 - 5 - 4 - 3 - 2 - siRNA Ctr Endoglina Control TGF-β U n id a d e s R e la ti v a s d e L u ci fe ra sa GAL4-Smad1 ___________________________________________________________________Resultados 44 Figura 15: Contribución de cada región de endoglina a la inducción de la vía ALK-1/Smad1. Células CHO-K1 fueron transfectadas con los vectores de expresión de la forma de endoglina indicada junto con el sistema reportero GAL4-Smad1/pFr5-Luc y el control interno pSV40/β- Gal. En los esquemas de endoglina representados se indican los dominios extracelular (EC), transmembrana (TM) y citoplásmico (CT), así como la posición del residuo que delimita la versión truncada de endoglina. También se indican el epítopo HA (azul), la región transmembrana de endoglina (gris claro), la aportada por el vector pDisplay del receptor de PDGF (gris oscuro) y el epítopo myc (verde). El TGF-β fue añadido a 10 ng/ml durante 24 horas posteriores a 24 horas de transfección. En todos los casos, p<0,01. (A) La estimulación de la transactivación de GAL4-Smad1 depende del dominio extracelular de endoglina. (B) La expresión de la construción 558-Endo mostró el mayor efecto inductor de la señalización de Smad1. B 26 658 Endoglina 26 558 558-Endo 437 26 437-Endo 437 586 437/586-Endo 558 586 558/586-Endo Control 20 - 4 0 - 6 0 - 8 0 - 10 0 - 120 - Unidades Relativas de Luciferasa Control TGF-β GAL4-Smad1 A 26 658 Endoglina 26 612 ECTM-Endo 563 658 TMCT-Endo Control 20 - 4 0 - 6 0 - 8 0 - 10 0 - 120 - 140 - 16 0 - Unidades Relativas de Luciferasa Control TGF-β GAL4-Smad1 ___________________________________________________________________Resultados 45 En un intento por definir qué región dentro del dominio extracelular era la responsable de la inducción de la vía de Smad1, se emplearon distintas construcciones truncadas de endoglina (Figura 15.B). Aquella que contenía la región Glu26-Gly558 fue la que mayor efecto inductor tuvo sobre el sistema reportero de la vía de Smad1. Por otro lado, aunque algo menor que la actividad de la forma completa de endoglina, la construcción 437-Endo también fue capaz de inducir la vía de Smad1. Por el contrario, el resto de variantes truncadas no fueron capaces de alterar este sistema reportero. Estos resultados sugieren que la inducción de la vía ALK-1/Smad1 mediada por endoglina depende de su dominio extracelular, siendo la región comprendida hasta la Gly558 la que potencia esta señalización. 4.2.2. Endoglina induce la actividad del promotor de Id1 en respuesta a TGF-β vía ALK-1 La familia de proteínas Id (Inhibition of DNA binding) se compone de cuatro miembros, Id1, 2, 3 y 4, pertenecientes al grupo de factores de transcripción hélice-giro-hélice básicos, bHLH (basic helix-loop- helix), que actúan como reguladores dominantes negativos y que están implicados en proliferación celular y procesos de diferenciación que afectan a la angiogénesis (Ruzinova & Benezra, 2003). Ya que el miembro Id1 se identificó como un gen diana inducido por la señalización TGF-β/ALK-1 en células endoteliales (Goumans et al., 2002; Ota et al., 2002; Valdimarsdottir et al., 2002), se empleó una construcción reportera con su promotor, pId1-Luc, (Tournay & Benezra, 1996) para analizar la implicación de endoglina. Así, la actividad de este vector fue analizada en presencia de concentraciones crecientes de doxiciclina en células GM7372EL, que indujeron la expresión de endoglina. En la Figura 16.A se muestra que si bien el tratamiento con TGF-β reprime el promotor de Id1, la expresión de endoglina aumenta su actividad reportera y compensa dicha inhibición. Además, los niveles basales de la actividad promotora de Id1 en el sistema GM7372EL aumentaron notoriamente por la transfección del mutante constitutivamente activo ALK-1 (QD) o el quinasa deficiente ALK-5 (KR), mientras que fueron inhibidos por la forma dominante negativa ALK-1 (KR) o la constitutivamente activa ALK-5 (TD). La actividad del promotor de Id1 se vio reducida en todos los casos por el tratamiento con TGF-β. Esta observación concuerda con la estimulación mediada por ALK-1 de la expresión de Id1 en condiciones basales o a bajas dosis de TGF-β (Goumans et al., 2002), mientras que la transcripción de Id1 es reprimida por elevadas dosis de ligando a través de la vía TGF-β/ALK-5 (Goumans et al., 2002; Kang et al., 2003) (Figura 16.B). Para confirmar estos resultados, se llevaron a cabo experimentos en células GM7372EL con el vector reportero p(BRE)2-Luc. Como se describió en el apartado Materiales y Métodos, esta construcción contiene dos elementos críticos de respuesta específicos para ALK-1 dispuestos en tándem del promotor de Id1 (Korchynskyi & ten Dijke, 2002). Así, la inducción de endoglina por doxiciclina resultó en un aumento de la actividad basal del vector reportero de forma dependiente de la dosis, si bien su actividad fue inhibida en presencia de TGF-β. Como control, la especificidad de ALK-1 sobre la actividad de p(BRE)2-Luc fue demostrada por la transfección del mutante dominante negativo ALK-1 (KR), que anuló prácticamente la respuesta de esta construcción en cualquier condición (Figura 16.C). ___________________________________________________________________Resultados 46 Figura 16: Efecto de la expresión de endoglina sobre la actividad del promotor de Id1 y del elemento de respuesta p(BRE)2-Luc. El tratamiento con TGF-β fue de 10 ng/ml durante 24 horas en todos los casos indicados. Para inducir la expresión de endoglina en células endoteliales bovinas GM7372EL, el tratamiento con las dosis indicadas de doxiciclina se realizó durante 16 horas. U.R.L., unidades relativas de luciferasa. En todos los casos, p<0,01. (A) Se observa que la presencia de endoglina disminuye la inhibición de la actividad del reportero pId1-Luc inducida por TGF-β. (B) Control de la actividad del reportero pId1-Luc en el que se ve aumentada por las formas mutadas ALK-1 (QD) y ALK-5 (KR), constitutivamente activado y quinasa deficiente respectivamente, mientras que es reprimida por las versiones reversas ALK-1 (KR) y ALK-5 (TD), dominante negativo y positivo respectivamente. (C) La actividad basal de la construcción p(BRE)2- Luc aumenta marcadamente de manera dosis dependiente de la expresión de endoglina en células GM7372EL, mientras que el dominante negativo ALK-1 (KR) anula dicha inducción. Igualmente, la inhibición de la actividad reportera se ve reducida con la inducción de endoglina. (D) Al transfectar en células HMEC-1 cantidades crecientes de pSUPER/EndoEx4 se bloquea gradualmente la expresión de endoglina endógena, lo cual se traduce en un descenso en la actividad del reportero p(BRE)2-Luc, tanto basal como en presencia de TGF-β. A Dox (500 ng/ml) U .R .L . 2,5 - 2,0 - 1,5 - 1,0 - 0,5 - - + Control TGF-β pId1-Luc B 5 - 4 - 3 - 2 - 1 - Ctr ALK-1 (QD) ALK-1 (KR) ALK-5 (TD) ALK-5 (KR) U .R .L . pId1-Luc C Dox (ng/ml) 0 20 100 500 0 500 ALK-1 (KR) 100 - 80 - 60 - 40 - 20 - Control TGF-β U .R .L . p(BRE)2-Luc D U .R .L . pSUPER/Endo-Ex4 (µg/pocillo) 16 - 12 - 8 - 4 - Control TGF-β 0 0,25 0,50 1,00 p(BRE)2-Luc ___________________________________________________________________Resultados 47 Finalmente, para demostrar el papel específico de endoglina en la inducción mediada por ALK-1 de la actividad del promotor de Id1, se llevaron a cabo experimentos con RNA de interferencia. Así, la supresión de la expresión de endoglina por dosis crecientes de siRNA específicos en células endoteliales humanas HMEC-1 reflejó una inhibición dosis dependiente de la actividad inducida por ALK-1 del vector p(BRE)2-Luc. Además, como muestra la Figura 16.D, la actividad de esta construcción reportera fue inhibida por TGF-β excepto con la dosis mayor de supresión de endoglina, en donde no se observó ningún efecto. Estos resultados sugieren la cooperación funcional de endoglina con ALK-1 en la transcripción de Id1 y que la inhibición inducida por TGF-β de la actividad del promotor de Id1 está mediada por la vía TGF-β/ALK-5. Figura 17: Efecto de la expresión combinada de endoglina, ALK-1 y ALK-5 sobre las vías de señalización ALK-1/Smad1 y ALK-5/Smad3. Células CHO-K-1 se transfectaron con las construcciones y sistemas reporteros indicados y, tras 24 horas, se incubaron en presencia o no de 10 ng/ml de TGF-β durante 24 horas adicionales. En todos los casos las diferencias fueron estadísticamente significativas con un valor p<0,01, excepto en (*) que no fueron significativas. (A) La transactivación de GAL4-Smad1 es dependiente de ALK-1 y se ve incrementada por la presencia de endoglina, mientras que la incorporación de ALK-5 al sistema anula dicha actividad. La transfección de las mismas combinaciones salvo ALK-1 rindió lecturas despreciables (U.R.L.<1), por lo que se excluyeron de la gráfica. (B) El análisis de la actividad GAL4-Smad3 mostró un aumento en la transactivación dependiente de ALK-5 que fue revertido por la presencia de endoglina, ALK-1, o ambos. Análogo al caso anterior, la transfección de las mismas combinaciones salvo ALK-5 no rindió lecturas significativas (U.R.L.<1), por lo que no se incluyeron en la gráfica. A ALK-1 ALK-5 Endoglina + - - + - + + + - + + + 50 - Control TGF-β 40 - 30 - 20 - 10 - U .R .L . GAL4-Smad1 * B ALK-1 ALK-5 Endoglina - + - - + + + + - + + + U .R .L . Control TGF-β 35 - 30 - 25 - 20 - 15 - 10 - 5 - GAL4-Smad3 * * * ___________________________________________________________________Resultados 48 4.2.3. La ruta de señalización de TGF-β vía ALK5 se bloquea en presencia de endoglina. En células endoteliales, TGF-β puede activar dos vías de señalización distintas en función del TβR-I utilizado, ALK-1 (Smad1 y 5) o ALK-5 (Smad2 y 3), aunque ambas rutas pueden ser reguladas de forma recíproca (Goumans et al., 2003b; Goumans et al., 2002). Así, para determinar el papel de endoglina en el balance ALK-1/ALK-5 se emplearon los sistemas reporteros GAL4-Smad1 y GAL4-Smad3 para ALK-1 y ALK-5, respectivamente (Figura 17). Como era de esperar, la transfección en células CHO-K1 de endoglina junto con ALK-1 resultó en un claro aumento de la transactivación mediada por GAL4-Smad1, tanto en condiciones basales como en presencia de TGF-β, con respecto a las células transfectadas sólo con ALK-1. Sin embargo, el aumento de la transactivación de GAL4-Smad1 mediado por endoglina en presencia de TGF-β fue anulado al incluir ALK-5 en la transfección. Este hecho sugiere que ALK-5 interfiere con la vía de señalización de ALK-1 (Figura 17.A). Igualmente, el tratamiento con TGF-β tras la transfección de ALK-5 resultó en un marcado aumento de la señal GAL4-Smad3, la cual fue inhibida al incluir endoglina, ALK-1 o ambos en la transfección (Figura 17.B). Para corroborar estos resultados, el mismo sistema GAL4-Smad3 fue empleado en células GM7372EL, mediante la inducción de endoglina por doxiciclina, y en células HMEC-1, mediante ensayos con RNA de interferencia. En el primer caso, la inducción de endoglina con 500 ng/ml de doxiciclina inhibió la transactivación de GAL4-Smad3 dependiente de la vía TGF-β/ALK-5 (Figura 18.A). Por el contrario, como se aprecia en la Figura 18.B, el bloqueo de la expresión endógena de endoglina en células HMEC-1 mediante siRNA provocó un marcado aumento de la señalización GAL4-Smad3 en respuesta a TGF-β. Por último, la actividad de la construcción artificial reportera p(CAGA)12-Luc (Dennler et al., 1998) que contiene el elemento de respuesta a Smad3 se analizó en células HMEC-1 y GM7372EL y los resultados obtenidos confirmaron los anteriores. Así, mientras que el aumento de la supresión de endoglina endógena por siRNA en células HMEC-1 provocó una inducción dosis dependiente de la actividad reportera p(CAGA)12-Luc (Figura 18.C), la expresión de endoglina dependiente de doxiciclina en células GM7372EL resultó en una marcada inhibición de su actividad (Figura 18.D). ___________________________________________________________________Resultados 49 Figura 18: Efecto de endoglina sobre la señalización de Smad3. Cuando se indica, las células se trataron con TGF-β 10 ng/ml durante 24 horas. (A) Las células GM7372EL fueron transfectadas con el sistema reportero GAL4-Smad3/pFr5-Luc y la expresión de endoglina se indujo con doxiciclina 500 ng/ml durante 16 horas. La presencia de endoglina provocó un claro efecto inhibitorio de la actividad transactivadora de GAL4-Smad3 tanto basal como dependiente de TGF- β. (B) La expresión endógena de endoglina en células endoteliales humanas HMEC-1 fue específicamente bloqueada durante 40 horas mediante la transfección pSUPER/EndoEx4. Como control negativo se transfectó un vector que produce un siRNA irrelevante. La presencia de TGF-β resultó en un marcado aumento de la transactivación de GAL4-Smad3. (C) El vector reportero p(CAGA)12-Luc, que contiene el elemento de respuesta a Smad3, fue transfectado en células HMEC- 1 junto con cantidades crecientes de pSUPER/EndoEx4 durante 40 horas para reducir gradualmente la expresión de la endoglina endógena. El tratamiento con TGF-β dio lugar al aumento de la actividad reportera directamente proporcional a la reducción de endoglina. (D) La expresión de endoglina se indujo a las dosis indicadas de doxiclina en células GM7372EL durante 16 horas, previamente transfectadas con el vector reportero p(CAGA)12-Luc. En respuesta a TGF-β la actividad de este reportero fue notoriamente inhibida por la expresión creciente de endoglina. En todos los casos, p<0,01; excepto en (*) donde las diferencias no fueron significativas. A U .R .L . Control TGF-β 30 - 25 - 20 - 15 - 10 - 5 - Dox (500 ng/ml) - + GAL4-Smad3 B Control TGF-β U .R .L . 50 - 40 - 30 - 20 - 10 - siRNA Ctr Endoglina GAL4-Smad3 C U .R .L . pSUPER/Endo-Ex4 (µg/pocillo) 0 0,25 0,50 1,00 60 - 50 - 40 - 30 - 20 - 10 - Control TGF-β p(CAGA)12-Luc * D U .R .L . 30 - 25 - 20 - 15 - 10 - Control TGF-β Dox (ng/ml) 5 - 0 20 100 500 p(CAGA)12-Luc * ___________________________________________________________________Resultados 50 4.2.4. La quimera EndoEC-Fc mimetiza los efectos de la endoglina endógena Ya que endoglina es capaz de modular la señalización de TGF-β induciendo la vía de ALK-1 en detrimento de la de ALK-5, se quiso analizar si la forma soluble EndoEC-Fc (Figura 19.A) era capaz de reproducir estos resultados. Como se mostró en la Figura 15, la construcción transmembrana que contiene la región de endoglina comprendida entre Glu26 y Gly558, que representa casi la totalidad del dominio extracelular, fue capaz de inducir en un mayor nivel la transactivación de GAL4-Smad1. En primer lugar se analizó si EndoEC-Fc era capaz de unirse a la superficie de células endoteliales humanas. Para ello, células endoteliales humanas HMEC-1 fueron incubadas con el medio de cultivo condicionado de células CHO-K1 control y transfectantes estables de EndoEC-Fc. La Figura 19.B muestra en detalle la tinción de superficie de la unión de EndoEC-Fc, puesta de manifiesto mediante el anticuerpo monoclonal anti-HA. Para comprobar si la unión de EndoEC-Fc a la célula endotelial tenía un efecto funcional sobre el sistema reportero GAL4-Smad1 se analizó en células CHO-K1 transfectadas con el vector de expresión para ALK-1. La Figura 19.C muestra que EndoEC-Fc es capaz de aumentar la transactivación de GAL4- Smad1 en presencia de TGF-β y que dicho aumento es comparable al inducido por la transfección de la forma salvaje de endoglina. Además, para corroborar esta potenciación de la vía de Smad1, se analizó la actividad reportera del vector p(BRE)2-Luc en células endoteliales HMEC-1. Como refleja la Figura 19.D el aumento de la cantidad del vector de expresión para EndoEC-Fc transfectado se traduce en un incremento de la actividad reportera basal de p(BRE)2-Luc, indicando que esta proteína quimera es capaz de mimetizar los efectos de la endoglina endógena sobre la vía de ALK-1. El efecto de EndoEC-Fc sobre la vía de Smad3 se analizó con el reportero GAL4-Smad3. Al contrario que con la vía de Smad1, la proteína quimera fue capaz de bloquear la transactivación de GAL4- Smad3 de modo similar al ejercido por la proteína completa (Figura 19.E). Estos resultados demuestran que el dominio extracelular presente en la forma soluble EndoEC-Fc es capaz de actuar de modo similar al propio de endoglina en la membrana plasmática. A continuación se analizó si el dominio extracelular de endoglina reproducía alguno de los efectos fisiológicos que se le atribuyen a la endoglina completa como es la inhibición del efecto antiproliferativo inducido por TGF-β (Lastres et al., 1996; Letamendía et al., 1998b; Li et al., 2000). Así, células endoteliales HMEC-1 se transfectaron con el vector de expresión de EndoEC-Fc y se estimularon con TGF-β. La proliferación celular fue determinada mediante tinción con cristal violeta. Como se muestra en la Figura 20.A, la expresión de EndoEC-Fc contrarresta la parada de la proliferación inducida por TGF-β respecto a las células control transfectadas con el vector vacío. Resultados similares se obtuvieron cuando células HMEC-1 se incubaron con el dominio extracelular (Glu26-Gly586) de endoglina recombinante purificado (Figura 20.B). ___________________________________________________________________Resultados 51 Figura 19: EndoEC-Fc mimetiza el efecto de endoglina endógena. (A) Esquema comparativo entre los monómeros de endoglina salvaje y de EndoEC-Fc. (B) Células endoteliales HMEC-1 fueron sembradas en cubreobjetos cubiertos con gelatina e incubadas con el medio de cultivo condicionado de transfectantes estables de EndoEC-Fc durante 3 horas a 4ºC es capaz de unirse a la superficie de células HMEC-1. La tinción con el colorante DAPI pone de manifiesto los núcleos celulares. (C) EndoEC-Fc es capaz de transactivar GAL4-Smad1 de forma similar a la endoglina completa en respuesta a TGF-β en células CHO-K1 transfectadas con ALK-1. (D) Las células endoteliales HMEC-1 fueron transfectadas con el vector reportero de ALK-1 p(BRE)2-Luc junto con cantidades crecientes del vector de expresión de EndoEC-Fc. La actividad basal de este reportero fue significantivamente inducida en relación directa la cantidad de vector pDisplay/EndoEC-Fc transfectado. (E) La transactivación de GAL4-Smad3 en células CHO-K1 transfectadas con ALK-5 se ve drásticamente inhibida tanto por la transfección de EndoEC-Fc como por la de la forma transmembrana de endoglina en respuesta a TGF-β. En los casos indicados, el TGF-β fue añadido 24 horas después de la transfección a 10 ng/ml durante 24 horas adicionales. Las diferencias fueron estadísticamente significativas con un valor p<0,01, excepto en los casos señalados (*). M e d io c o n d ic io n a d o Control EndoEC-Fc α-HA (12CA5) DAPI B A 586 26 658 Endoglina 586 26 Fc (hIgG1) EndoEC-Fc D µg DNA (EndoEC-Fc) U .R .L . 5 - 10 - 15 - 20 - 25 - 0 0,2 0,4 p(BRE)2-Luc C TGF-β EndoEC-Fc Endoglina U .R .L . 2 - 4 - 6 - 8 - 10 - 12 - 14 - 16 - 18 - - - - + - - + + - + - + GAL4-Smad1 * E TGF-β EndoEC-Fc Endoglina U .R .L . 5 - 10 - 15 - 20 - 25 - - - - + - - + + - + - + GAL4-Smad3 * ___________________________________________________________________Resultados 52 4.3. LA ISOFORMA CORTA DE ENDOGLINA ES CAPAZ DE INTERACCIONAR CON LOS RECEPTORES DE TGF-β La secuencia de endoglina que generalmente se expresa en las células endoteliales corresponde a la isoforma mayoritaria con una región citoplásmica de 47 aminoácidos. No obstante, existe una isoforma alternativa cuya región citoplásmica contiene solamente 14 residuos. Denominada endoglina-S, se origina debido a que el último intrón presente en el gen de endoglina no se elimina y permanece en el RNA mensajero maduro (Bellón et al., 1993). Este intrón introduce un codón de parada en el marco de lectura por lo que la proteína traducida es más corta (Figura 6.B). La expresión y función de esta forma corta de endoglina están poco estudiadas. 4.3.1. Endoglina-S aparece en células senescentes. Datos previos del laboratorio mostraban que la morfología de las células endoteliales que habían sido cultivadas durante un número considerable de pases era muy similar a la de los mioblastos L6E9 transfectados de forma estable con endoglina-S. Además, aquellos cultivos endoteliales envejecidos perdían su capacidad de proliferación y expresaban esta isoforma corta de endoglina. Así, para monitorizar este proceso de senescencia, células endoteliales humanas de vena de cordón umbilical (HUVECs) se mantuvieron en cultivo a lo largo del tiempo. Estos cultivos primarios se obtuvieron Figura 20: El dominio extracelular de endoglina revierte el efecto antiproliferativo inducido por TGF-β en células HMEC-1. (A) El tratamiento con TGF-β redujo el nivel de proliferación de células HMEC-1 transfectadas control. Sin embargo, a pesar de no tener efecto alguno sobre el nivel basal, la transfección de EndoEC-Fc potenció la proliferación en presencia de TGF-β. (B) Ensayo paralelo en el que células HMEC-1 fueron incubadas con el dominio extracelular recombinante de endoglina (rh-Endoglina) empleando la solución vehículo (0,1% BSA en PBS) como control. El tratamiento con TGF-β en presencia de rh-Endoglina provocó un ligero aumento en el nivel de proliferación celular. Todos los experimentos se realizaron por triplicado partiendo de 50.000 células/pocillo. El tratamiento con TGF-β fue de 5 ng/ml durante 24 horas. Las diferencias entre control y tratamiento fueron estadísticamente significativas con un valor de p<0,04. B 8 - 7 - 6 - 5 - 4 - 3 - 2 - 1 - Ín d ic e d e P ro li fe ra ci ó n Ctr rh-Endoglina Control TGF-β A 3,0 - 2,5 - 2,0 - 1,5 - 1,0 - 0,5 - 0 -0,5 - -1,0 - Ín d ic e d e P ro li fe ra ci ó n Ctr EndoEC-Fc Control TGF-β ___________________________________________________________________Resultados 53 directamente de cordones umbilicales de mujeres donantes voluntarias sanas y se analizó la senescencia y la expresión de las isoformas de endoglina, así como los receptores de TGF-β mediante RT-PCR. Figura 21: Análisis de la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia en céluas HUVECs. En los cltivos primarios de HUVECs las células fueron sembradas en placas pretratadas con 0,2% gelatina. Los pases se realizaron cuando los cultivos alcazaron un nivel de confluencia cercano al 90%. En cada etapa, las células fueron fijadas e incubadas durante 16 horas a 37ºC en ausencia de CO2 con una preparación del sustrato X-gal. El depósito en el citoplasma de un producto azulado es indicativo de la actividad β-galactosidasa asociada al proceso de envejecimieno celular o senescencia. El recuento de células senescentes mostró que a partir del noveno pase los cultivos de células HUVECs comienzan a envejecer significativamente, llegando a alcanzar un nivel del 90% de senescencia en el pase 14. 10 - 20 - 30 - 40 - 50 - 60 - 70 - 80 - 90 - 100 - 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Número de Pase % C é lu la s S e n e sc e n te s Pase 10 Pase 11 Pase 12 Pase 13 Pase 6 Pase 7 Pase 8 Pase 9 Pase 2 Pase 3 Pase 4 Pase 5 Pase 14 ___________________________________________________________________Resultados 54 El aumento de la actividad β-galactosidasa es un fenómeno asociado a la senescencia celular ampliamente aceptado (Brandes et al., 2005; Dimri et al., 1995). Así, este incremento es utilizado como un marcador de envejecimiento celular, el cual se pone de manifiesto por la tinción descrita en el apartado Materiales y Métodos en la que se utiliza X-gal como sustrato de la reacción enzimática. El resultado es el depósito de un producto azulado en el citoplasma celular fácilmente detectable mediante un microscopio de contraste de fase. De acuerdo con lo esperado, el cultivo primario de células HUVECs envejeció a lo largo del tiempo. Si bien los primeros pases se realizaban cada tres días, a partir del noveno los pases se efectuaban una vez a la semana hasta que finalmente, las células del pase 15 perdieron su capacidad de proliferación sin llegar a alcanzar la confluencia tras dos semanas. Así, como se muestra en la Figura 21, hay un claro aumento en la actividad β-galactosidasa que se asoció claramente a la senescencia celular llegando a ser del 90% aproximadamente. En paralelo, se fueron obteniendo muestras de RNA total a cada pase para analizar la expresión de TβR-II, ALK-5, ALK-1 y endoglina. Además, la pareja de cebadores CT-Endo hibridan en los exones flanqueantes del intrón no eliminado en endoglina-S, por lo que tienen la peculiaridad de detectar ambas isoformas en la misma reacción de amplificación, permitiendo establecer una relación entre las dos variantes de endoglina a lo largo del tiempo de cultivo. Así, la Figura 22.A muestra la separación por electroforesis en geles de agarosa de los fragmentos amplificados por RT-PCR. Se observa que la isoforma larga se expresa en todos los pases del cultivo mientras que la forma corta es co-expresada en los últimos pases, asociándose de esta manera endoglina-S con el proceso de envejecimiento celular o senescencia (Figura 22.A). Esta relación endoglina-S/endoglina-L se cuantifica en la Figura 22.B. Al amplificar un fragmento del dominio extracelular de endoglina, por lo tanto común a ambas isoformas, se observa una ligera disminución de la expresión con respecto al envejecimiento (Figura 22.A, endoglina total). En cuanto a los receptores de TGF-β, la expresión de ALK-1 aumenta durante los primeros días del cultivo aunque sigue una tendencia a disminuir hasta que finalmente el nivel decae en las células más senescentes (Figura 22.A y 22.C). Por el contrario, ALK-5 sigue una evolución más o menos constante a lo largo del tiempo incluso se observa una cierta tendencia a aumentar en los pases finales antes de decaer drásticamente en el pase 14 (Figura 22.A y 22.C). La expresión del TβR-II sigue un leve aumento hasta el pase 6, a partir del cual comienza a descender ligeramente (Figura 22.A y 22.C). La expresión de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, EC 1.2.1.12) es constante a lo largo del tiempo (Figura 22.A y 22.C) y se usó como control interno para normalizar los niveles de expresión del resto de fragmentos amplificados (Figura 22.C). ___________________________________________________________________Resultados 55 Figura 22: Expresión de los distintos componentes del complejo del receptor de TGF-β. (A) El RNA total fue aislado de cada pase de células HUVECs y convertido en cDNA mediante transcripción reversa con el cebador oligo-(d)T. Los paneles muestran la separación por electroforesis en geles de agarosa de los fragmentos amplificados por PCR de los distintos componentes del complejo receptor de TGF-β. Todas las parejas de cebadores se detallan en el apartado Materiales y Métodos. Como control interno se amplificó un fragmento de la enzima GAPDH, lo cual nos permite realizar cálculos semicuantitativos de la expresión de los distintos receptores. (B) Densitometría de las bandas correspondientes a las isoformas endoglina-S y endoglina-L. Se observa que la isoforma larga es la mayoritaria y está presente en todos los pases, mientras que la isoforma corta aparece en el pase 12 y alcanza su máximo nivel de expresión en el pase 14, asociándose así al proceso de senescencia. (C) Densitometría y normalización de los distintos receptores respecto a la expresión de GAPDH. Las variaciones en la expresión de los receptores analizados se consideran circunstanciales, sin observarse una tendencia significativa. Sin embargo, cabe destacar que en el pase 14, donde se alcanza el 90% de células senescentes, el nivel de expresión de ALK-5 y ALK-1 disminuye. 10 11 12 13 14 2 3 4 5 6 7 8 9 Número de Pase GAPDH Endoglina total TβR-II ALK-1 ALK-5 Endoglina-S Endoglina-L A C Número de Pase 2 4,0 - 3,0 - 2,0 - 1,0 - 3,5 - 2,5 - 1,5 - 0,5 - 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 U n id a d e s A rb it ra ri a s TβR-II ALK-5 Endoglina total ALK-1 14 Relación a GAPDH B 2 Número de Pase 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 40 - 30 - 20 - 10 - 50 - U n id a d e s A rb it ra ri a s (E n d o- S/ E n d o- L )x 10 0 Relación Endoglina-S/Endoglina-L ___________________________________________________________________Resultados 56 4.3.2. La región citoplásmica de endoglina-S interacciona con ALK-5 y ALK-1. Una vez comprobado que endoglina-S aparece en células endoteliales senescentes se quiso estudiar si ésta era capaz de interaccionar con los TβR-I ALK-5 y ALK-1, como sucede con la isoforma mayoritaria endoglina-L. Ya que la extensa región extracelular de ambas isoformas es común y es capaz de interaccionar con ambos TβR-Is, se pensó que de existir alguna diferencia debería tener lugar a nivel citoplásmico. Así, células COS-7 fueron transfectadas transitoriamente con los vectores de expresión de ALK-5 o ALK-1 junto con los dominios citoplásmicos de endoglina-L (TMCT-EndoL) o endoglina-S (TMCT-EndoS). Para comprobar la especificidad de la interacción se incluyó un vector de expresión que codificaba para una proteína irrelevante. Todas las proteínas expresadas estaban marcadas con el epítopo HA, por lo que en los lisados totales se pueden inmunodetectar con el mismo anticuerpo anti-HA (Figura 23.B). Como control de carga se inmunodetectó β-actina. El panel izquierdo de la Figura 23.A demuestra que tanto la isoforma corta como la larga del dominio citoplásmico de endoglina son capaces de interaccionar con ALK-1, ya que son co-inmunoprecipitadas por anticuerpos contra ALK-1. En el caso de ALK-5 el resultado fue similar y ambos dominios citoplásmicos de endoglina fueron co- inmunoprecipitados por anticuerpos anti-ALK-5. No obstante, se encontró que en el caso de ALK-1 el rendimiento de la co-inmunoprecipitación de TMCT-EndoS fue mucho menor que con TMCT-EndoL, puesto de manifiesto por la densitometría de las bandas. Así, se analizó si esta diferencia encontrada con ALK-1 tenía lugar con la proteína completa de endoglina-S. De esta forma, células COS-7 se transfectaron con los vectores de expresión de endoglina-S junto con ALK-1 o ALK-5. Como se muestra en la Figura 24, tanto ALK-5 como ALK-1 son co- inmunoprecipitados mediante anticuerpos frente al epítopo Flag presente en endoglina-S, ya que la interacción por sus dominios extracelulares y citoplásmicos ha sido demostrada (Guerrero-Esteo et al., 2002 y este trabajo). Sin embargo, el rendimiento del ensayo fue muchísimo menor en el caso de ALK-1. De hecho, al cuantificar el resultado mediante la densitometría de las bandas se observó una enorme diferencia de la cantidad de ALK-5 co-inmunoprecipitado con endoglina-S respecto a la de ALK-1. Este hecho induce a pensar que endoglina-S podría modular la respuesta celular a TGF-β de forma diferente a la isoforma larga mayoritaria. ___________________________________________________________________Resultados 57 Figura 23: La región citoplásmica de endoglina-S se asocia con ALK-1 y ALK-5. Células COS-7 fueron transfectadas con los vectores de expresión de las proteínas indicadas en cada caso y lisadas a las 48 horas. Se incluyó la expresión de una proteína irrelevante marcada también con el epítopo HA para analizar la especificidad de las interacciones (*). (A) Los inmunoprecipitados fueron sometidos a SDS-PAGE en condiciones reductoras y electrotransferidos e inmunodetectados con el anticuerpo 12CA5 que reconoce el epítopo HA presente en ALK-1, ALK-5 así como en las regiones citoplásmicas de endoglina TMCT-EndoS y TMCT-EndoL. Tanto anticuerpos frente a ALK-1 (paneles de la izquierda) como a ALK-5 (paneles de la derecha) son capaces de co-inmunoprecipitar las regiones citoplásmicas de endoglina-S (TMCT-EndoS) y de endoglina-L (TMCT-EndoL) con la misma afinidad, mientras que la proteína (HA)-irrelevante no se inmunodetecta en ninguna co-inmunoprecipitación. (B) Las proteínas presentes en los extractos totales fueron separadas por SDS-PAGE en condiciones reductoras y electrotransferidas e inmunodetectadas. Control de carga se analizó la expresión de β-actina. TMCT-Endo-L TMCT-Endo-S ALK-5 ALK-1 IP: α-ALK-5 (V22) ALK-1 TMCT-EndoS TMCT-EndoL - - - + - - + - + + + - ALK-5 TMCT-EndoS TMCT-EndoL - - - + - - + - + + + - Co-Inmunoprecipitación WB: α-HA (12CA5) IP: α-ALK-1 (PoAb) * * β-actina Lisados totales WB: α-HA (12CA5) WB: α-β-actina (AC-15) TMCT-Endo-L TMCT-Endo-S ALK-5 ALK-1 irrelevante ALK-1 TMCT-EndoS TMCT-EndoL - - - + - - + - + + + - ALK-5 TMCT-EndoS TMCT-EndoL - - - + - - + - + + + - * * 16 - 4 - 12 - 8 - Relación de región TMCT de endoglina co-inmunoprecipitada (IP/Total) U n id a d e s A rb it ra ri a s TMCT-Endo-S TMCT-Endo-L ALK-1 ALK-5 ___________________________________________________________________Resultados 58 Figura 24: Interacción de endoglina-S con ALK-5 y ALK-1. Células COS-7 fueron transfectadas con el vector de expresión de endoglina-S marcada con el epítopo Flag junto con el de ALK-5 o ALK-1, ambos portando el epítopo HA. Tras 48 horas las células fueron lisadas y los extractos sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Flag (M2). Alícuotas con igual cantidad de proteínas y los inmunoprecipitados fueron sometidos a SDS-PAGE en condiciones no reductoras y electrotransferidos e inmunodetectados con anticuerpos anti-HA. Como control de carga se inmunodetectó β-actina. Se observó que la cantidad de ALK-1 que interacciona con endoglina-S es muy inferior a la de ALK-5, como mostró la relación obtenida por densitometría de las bandas señaladas (*). Relación de receptor tipo I co-inmunoprecipitado (IP/Total) U n id a d e s A rb it ra ri a s A L K -1 A L K -5 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - ALK-1 ALK-5 (Flag)-Endoglina-S - - - - - + - + + + - + Co-Inmunoprecipitación IP: α-Flag (M2) WB: α-HA (12CA5) ALK-5 (dímero) ALK-1 ALK-5 (monómero) * * β-Actina Lisados totales WB: α-Flag (M2) WB: α-β-actina (AC-15) ALK-1 ALK-5 (Flag)-Endoglina-S - - - - - + - + + + - + Endoglina-S ALK-5 (dímero) ALK-1 WB: α-HA (12CA5) * * ___________________________________________________________________Resultados 59 4.4. ENDOGLINA-S MODULA DE FORMA DISTINTA A ENDOGLINA-L LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN TGF-β/ALK-5 Y TGF-β/ALK-1. Para conseguir un modelo más cercano al que ocurre en una célula endotelial senescente, se estudiaron las vías de señalización de ALK-1 y ALK-5 en presencia de ambas isoformas de endoglina. En este contexto, se quiso analizar la hipótesis de que la aparición de endoglina-S podría ejercer un papel distinto al hasta ahora descrito para la isoforma larga sobre la vía de señalización de TGF-β. De este modo, se analizó la actividad de los vectores reporteros p(CAGA)12-Luc y p(BRE)2-Luc, específicos para las rutas de señalización de ALK-5 y ALK-1 respectivamente. Así, células endoteliales humanas HMEC-1, que expresan constitutivamente endoglina-L, se transfectaron con el vector de expresión de endoglina-S y se estudió la actividad de estos vectores reporteros de la señalización de TGF-β. En respuesta a TGF-β, la actividad reportera de p(CAGA)12-Luc fue claramente inducida por la transfección de endoglina-S en células HMEC-1 (Figura 25), sugiriendo la existencia de una colaboración de endoglina-S en la vía de señalización TGF-β/ALK-5. Por el contrario, endoglina-L mostró un efecto inhibitorio sobre este vector reportero, tal como se demostró en la Figura 18.D utilizando el sistema celular endotelial inducible de endoglina por doxiciclina GM7372EL (Figura 25). En cuanto a la construcción p(BRE)2-Luc, la introducción de endoglina-S en el sistema no tuvo efecto significativo sobre su actividad reportera basal, mientras que endoglina-L sí que aumentó considerablemente su actividad, como previamente había sido demostrado (Figura 16.C). Figura 25: Efecto de la co-expresión de endoglina-S sobre la señalización de ALK-5 y ALK-1. El vector de expresión de endoglina-S se transfectó en células endoteliales humanas HMEC-1 para simular un estado de senescencia celular. Como control interno, se transfectó el vector de expresión de endoglina-L. La actividad del vector reportero p(CAGA)12-Luc en respuesta a 10 ng/ml TGF-β durante 24 horas se utilizó como indicador de la vía de señalización de ALK-5 (panel izquierdo), ya que su actividad basal en ausencia de estímulo es práctimante nula. Por otro lado, la actividad basal de la construcción p(BRE)2-Luc representó la vía de señalización de ALK-1 (panel derecho), ya que el tratamiento con TGF-β resulta en la inhibión de su actividad. La presencia de endoglina-S favorece la vía de señalización de ALK-5. Sin embargo, sobre la vía de ALK-1 endoglina-S no fue capaz de estimular significativamente la actividad de p(BRE)2-Luc tal como lo hace endoglina-L. Excepto en el caso (*), todas las diferencias fueron estadísticamente significativas con un valor de p<0,01. p(CAGA)12-Luc + TGF-β U .R .L . 70 - 60 - 50 - 40 - 30 - 20 - 10 - - S L Endoglina * p(BRE)2-Luc U .R .L . - 5 - 15 - 20 - 10 - S L ___________________________________________________________________Resultados 60 A continuación se trataron de confirmar los resultados obtenidos respecto a la vía de señalización TGF-β/ALK-5 en el modelo endotelial GM7372EL inducible de endoglina por doxiciclina. La Figura 26.A muestra cómo el tratamiento con TGF-β promueve la actividad reportera de p(CAGA)12-Luc y más aún cuando endoglina-S es incorporada al sistema mediante la transfección de su vector de expresión. Por el contrario, la inducción de endoglina-L por el estímulo con doxiciclina hace que la actividad reportera en respuesta a TGF-β disminuya, como era de esperar. Sin embargo, la coexistencia de ambas isoformas por transfección de la corta e inducción de la larga por doxiciclina hace que la actividad reportera de p(CAGA)12-Luc aumente ligeramente en respuesta a TGF-β, indicando que endoglina-S contrarresta en cierta medida el efecto de la isoforma larga sobre la señalización de ALK-5. Para esclarecer el efecto de la expresión de endoglina-S sobre la vía de señalización TGF-β/ALK-1, se utilizaron células CHO-K1, donde la expresión de endoglina endógena es nula. Así, estas células se transfectaron con la forma constitutivamente activa de ALK-1 y se analizó la actividad reportera de la construcción p(BRE)2-Luc. Como muestra la Figura 26.B, la actividad de este reportero aumenta con la transfección de ALK-1 (QD) y más aún cuando se introduce la expresión de endoglina-L, como cabía esperar. Al transfectar endoglina-S, la actividad de p(BRE)2-Luc es similar a la obtenida sólo con ALK-1, sugiriendo un papel neutro para la isoforma corta de endoglina. Sin embargo, cuando ambas isoformas son co-transfectadas, la actividad del reportero se ve significativamente disminuida, indicando que endoglina-S podría estar bloqueando la cooperación de endoglina-L en la vía de señalización de ALK-1. Ya que el dominio extracelular de endoglina es común para ambas isoformas, se quiso estudiar si las diferentes regiones citoplásmicas eran las responsables de estos efectos observados sobre la señalización de ALK-5. Para tal fin se emplearon los transfectantes estables de endoglina corta, L6E9- EndoS, y larga, L6E9-EndoL, previamente obtenidos en el laboratorio (Letamendía et al., 1998b). En los transfectantes L6E9-EndoS se transfectó el dominio citoplásmico de endoglina larga (TMCT-EndoL) y viceversa, esto es, el dominio citoplásmico de endoglina corta (TMCT-EndoS) en los transfectantes L6E9- EndoL, donde se analizó la actividad reportera del vector p(CAGA)12-Luc en respuesta a TGF-β (Figura 26.C). El estudio comparativo entre ambos sistemas celulares mostró que la región citoplásmica de endoglina larga fue capaz de bloquar drásticamente la actividad reportera en los transfectantes de endoglina-S. Por el contrario, la actividad p(CAGA)12-Luc en respuesta a TGF-β que estaba inhibida en los transfectantes estables de endoglina-L fue considerablemente inducida por la construcción citoplásmica de endoglina-S. Estos resultados atribuyen a los distintos dominios citoplásmicos de endoglina el efecto modulador sobre la respuesta celular a TGF-β. ___________________________________________________________________Resultados 61 Figura 26: Efecto dual de endoglina-S sobre los TβR-Is. (A) Células GM7372EL tratadas o no con 500 ng/ml doxiciclina fueron transfectadas con el vector de expresión de endoglina-S o un vector vacío. Cuando se indica, se estimuló con 10 ng/ml TGF-β durante 24 horas adicionales a la transfección. La actividad reportera p(CAGA)12-Luc fue claramente inducida por el tratamiento con TGF-β e incrementada por la expresión de endoglina-S. Al coexistir ambas isoformas de endoglina, la inhibición de la actividad reportera provocada por la inducción de la forma larga dependiente de doxiciclina fue débil pero significativamente revertida. (B) La actividad reportera de p(BRE)2-Luc fue analizada en células CHO-K1 transfectadas con los vectores de expresión de las proteínas indicadas. Endoglina-L incrementó la actividad reportera inducida por la forma constitutivamente activa ALK-1 (QD). Sin embargo, la expresión de endoglina-S fue inocua, per se, sobre la inducción por ALK-1 (QD). No obstante, al ser co-transfectadas ambas isoformas de endoglina, la actividad transcripcional de p(BRE)2-Luc experimentó un marcado descenso, atribuyendo un papel inhibitorio de la isoforma corta sobre la cooperación de endoglina larga y ALK-1. (C) Mioblastos L6E9 transfectados establemente con la isoforma corta de endoglina (L6E9-Endo-S) o con la isoforma larga (L6E9-Endo-L) fueron transfectados con el dominio citoplásmico de endoglina larga (TMCT-EndoL) o de endoglina corta (TMCT-EndoS), respectivamente. La actividad reportera de p(CAGA)12-Luc en respuesta a 10 ng/ml TGF-β durante 24 horas fue drásticamente bloqueada por TMCT-EndoL en los transfectantes de endoglina corta y marcadamente inducida en los transfectantes de endoglina larga por TMCT-EndoS, indicando que los dominios citoplásmicos son los responsables del distinto efecto modulador sobre la señalización de TGF-β. Excepto para las parejas de datos señaladas con (*), los resultados fueron estadíticamente significativos (p<0,01). * * p(BRE)2-Luc ALK-1(QD) Endoglina-L Endoglina-S U .R .L . 80 - 70 - 60 - 30 - 20 - 10 - 50 - 40 - - - - + - - + + - + - + + + + B A p(CAGA)12-Luc Endoglina-S Dox U .R .L . 35 - 30 - 15 - 10 - 5 - 25 - 20 - - - + - - + + + TGF-β Control 40 - C U .R .L . TMCT-EndoS TMCT-EndoL 120 - 100 - 80 - 60 - 40 - 20 - - - - + - - + - Endo-L Transfectantes L6E9 Endo-S p(CAGA)12-Luc + TGF-β ___________________________________________________________________Resultados 62 4.4.1. La expresión de endoglina-S induce la actividad del promotor de PAI-1 mientras que reprime la del promotor de Id1 en respuesta a TGF-β Para estudiar la relevancia fisiológica de la aparición de endoglina-S en células senescentes, dos construcciones reporteras fueron analizadas: por un lado, el promotor de Id1, pId1-Luc, como diana de ALK-1, y por otro el promotor de PAI-1, p800-Luc, como diana de ALK-5. Estos vectores reporteros fueron transfectados en el modelo celular endotelial HMEC-1, junto con cantidades crecientes del vector de expresión de endoglina-S. Como control interno se incluyó el vector de expresión de endoglina-L. Según muestra la Figura 27.A, al aumentar la cantidad de endoglina-S transfectada se produce un débil descenso en la actividad reportera de pId1-Luc, tanto en condiciones basales como en respuesta a TGF-β, siendo estadísticamente significativa la diferencia entre la dosis más elevada de endoglina-S con respecto a los valores iniciales. El control interno de endoglina-L mostró el esperado aumento de esta actividad reportera. En cambio, se observó un aumento de la actividad reportera de p800-Luc directamente proporcional a la cantidad de vector de expresión de endoglina-S transfectado, siendo más marcado en la actividad basal que en respuesta a TGF-β (Figura 27.B). El control interno de endoglina-L mostró una esperada inhibición de la actividad transcripcional del promotor de PAI-1 respecto tanto a los valores iniciales como en respuesta a TGF-β (Letamendía et al., 1998b). Figura 27: Efecto antagónico entre endoglina-S y endoglina-L sobre promotores diana de ALK- 1 y ALK-5. Células HMEC-1 fueron transfectadas con las cantidades crecientes indicadas del vector de expresión de endoglina-S o con endoglina-L como control y, tras 24 horas, sometidas o no al tratamiento con 10 ng/ml TGF-β durante 24 horas adicionales. Todas las diferencias encontradas entre control y tratamiento fueron estadísticamente significativas (p<0,01). También se alcanzó el mismo nivel de significación estadística entre las parejas de datos señalados con (§). (A) La actividad transcripcional de la construcción reportera pId1-Luc, diana de ALK-1, fue significativamente reducida por la transfección de la mayor cantidad de endoglina-S respecto al control con vector vacío tanto en ausencia como en presencia de TGF-β. El control con endoglina-L indujo la actividad reportera y redujo la inhibición provocada por el ligando. (B) La secuencia del promotor de PAI-1 presente en el vector reportero p800-Luc se empleó como diana de la vía de ALK-5. El tratamiento con TGF-β estimuló este vector reportero, cuya respuesta se vio directamente incrementada con respecto a la cantidad de endoglina-S transfectada. El control con endoglina-L resultó en la esperada inhibición de la actividad reportera en respuesta a TGF-β. A § (µg DNA) Endoglina-S Endoglina-L - - 0,1 - 0,2 - 0,5 - - 0,5 10 - 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4 - 3 - 2 - 1 - U .R .L . Control TGF-β pId1-Luc B 40 - 35 - 30 - 25 - 20 - 15 - 10 - 5 - U .R .L . (µg DNA) Endoglina-S Endoglina-L - - 0,1 - 0,2 - 0,5 - - 0,5 Control TGF-β p800-Luc § ___________________________________________________________________Resultados 63 4.5. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE ALK-1 EN CAVEOLAS Estudios previos han demostrado que la vía de señalización de TGF-β puede ser modulada por la interacción directa de caveolina-1 con el receptor tipo II y con ALK-5 (Razani et al., 2001c; Schwartz et al., 2005). Sin embargo, no ha sido estudiado aún el efecto que caveolina-1 podría ejercer sobre el otro receptor tipo I ALK-1. De este modo, lo primero que se quiso estudiar fue si ALK-1 se localizaba en caveolas. Así, células HMEC-1 fueron fijadas, permeabilizadas y teñidas simultáneamente con anticuerpos frente ALK-1 y caveolina-1. Como muestra la Figura 28, el análisis por microscopía confocal reveló que ambas proteínas co-localizaban, siguiendo un patrón de punteado discreto en la membrana plasmática. Además, para corroborar que esta co-localización tenía lugar en caveolas las células HMEC-1 fueron tratadas con el agente secuestrador de colesterol metil-β-ciclodextrina (MβCD) para desestabilizarlas. En estas condiciones, el patrón de tinción obtenido por microscopía confocal fue totalmente difuso, indicando que ambas proteínas se localizaban en las mismas estructuras subcelulares. Figura 28: Localización subcelular de ALK-1 y caveolina-1. Células HMEC-1 fueron sembradas sobre cubreobjetos pretratados con 0,2% gelatina. Tras ser fijadas y permeabilizadas, las células fueron inmunoteñidas con anticuerpos frente a ALK-1 o caveolina-1 y anticuerpos secundarios marcados con los fluorocromos Alexa488 o Alexa546, respectivamente. Las preparaciones fueron montadas sobre portaobjetos con Mowiol y analizadas en un microscopio confocal. Los núcleos son puestos de manifiesto por la tinción directa con DAPI. En condiciones normales (control) ambas proteínas siguen un patrón punteado definido en la membrana plasmática (flechas blancas). Al desestabilizar las caveolas con 1% metil-β-ciclodextrina (MβCD) a 37ºC durante 1 hora previa a la fijación, esta distribución punteada de la membrana plasmática se convierte en un patrón difuso por toda la célula, esto es, persiste la co-localización pero ya no es en la membrana plasmática. α-ALK-1 (PoAb) α-cav-1 (2297) Combinación C o n tr o l M βC D ___________________________________________________________________Resultados 64 4.5.1. ALK-1 se detecta en la fracción caveolar de células endoteliales Después de observar que ALK-1 y caveolina-1 seguían una distribución similar y que el tratamiento con metil-β-ciclodextrina alteraba dicho patrón, se quiso estudiar si ambas proteínas estaban presentes en la misma fracción subcelular y si esta era la fracción caveolar. Así, se obtuvieron lisados totales de células HMEC-1 y se sometieron a un fraccionamiento por ultracentrifugación en gradiente discontinuo de sacarosa. La Figura 29.A muestra cómo ALK-1 es inmunodetectado en las subfracciones 4 y 5 correspondientes a la fracción caveolar (panel superior), puesta de manifiesto por la presencia de caveolina-1 (panel inferior). Sin embargo hay que destacar que la presencia de ALK-1 no está restringida a esta fracción caveolar. Incluso, caveolina-1 también se inmunodetecta en otras fracciones caracterizadas como no-rafts, es decir, fracciones que no corresponden a las denominadas balsas lipídicas. Así, para analizar la especificidad de este co-fraccionamiento, el ensayo se repitió tratando la células con 1% metil- β-ciclodextrina durante 1 hora. Este agente hizo que las caveolas se desestabilizasen dando lugar, como muestra la Figura 29.B, a un cambio en la distribución de ambas proteínas. Estos resultados nos indican que ALK-1 se localiza en caveolas, ya que se inmunodetecta en la misma fracción que caveolina-1 y, cuando las caveolas son disgregadas, la distribución de ambas proteínas cambia drásticamente. Figura 29: ALK-1 y caveolina-1 se inmunodetectan en la fracción caveolar. Células HMEC-1 fueron lisadas y los extractos totales sometidos a ultracentrifugación en gradiente de sacarosa discontinuo. Las proteínas presentes en cada fracción fueron separadas por SDS-PAGE en condiciones reductoras y electrotransferidas e inmunodetectadas por los anticuerpos indicados. La presencia de ALK-1 y caveolina-1 fue inmunodetectada en los lisados totales (LT) como control. La distribución de ambas proteínas en las 12 fracciones recogidas fue analizada mediante inmunodetección. (A) La presencia de caveolina-1 en las fracciones 4 y 5 las define como fracciones caveolares (panel inferior), en las que ALK-1 es también detectado (panel superior). No obstante, la distribución de ALK-1 no está restringida a estas fracciones caveolares pudiéndose detectar en las fracciones no asociadas a las denominadas balsas lipídicas (fracciones no-rafts). (B) Al romper las caveolas con el tratamiento con 1% metil-β-ciclodextrina (MβCD) durante 1 hora a 37ºC antes de la lisis se observa que no aparece caveolina-1 en las fracciones caveolares, 4 y 5, ni tampoco ALK-1, quedando establecida la distribución de ambas proteínas en el resto de fracciones denominadas no-rafts. B MβCD LT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Fracción ALK-1 cav-1 WB: α-ALK-1 (PoAb) WB: α-caveolina-1 (2297) A Caveolas No-rafts ALK-1 cav-1 WB: α-ALK-1 (PoAb) WB: α-caveolina-1 (2297) LT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Fracción ___________________________________________________________________Resultados 65 4.6. ALK-1 INTERACCIONA CON EL DOMINIO DE ANDAMIAJE (SD) DE CAVEOLINA-1 Tras analizar en detalle la secuencia de aminoácidos de ALK-1 se observó que la región comprendida entre Trp399-Trp406 (WAFGLVLW) se adecuaba a la secuencia consenso establecida ΦXΦXXXXΦ (Φ, residuo aromático) para la unión al dominio de andamiaje (SD, del inglés scaffolding domain) de caveolina-1 (Couet et al., 1997a). Así, para comprobar si ALK-1 y caveolina-1 además de localizarse en el mismo compartimento subcelular estaban interaccionando, se siguieron dos diferentes aproximaciones: analizar la co-inmunoprecipitación de ambas proteínas mutando el dominio SD de caveolina-1 o bien la secuencia consenso presente en ALK-1. La Figura 30 muestra la primera de las aproximaciones. El modelo celular utilizado fue la línea epitelial humana 293T por carecer de caveolas de forma natural. Así, el vector de expresión de ALK-1 fue transfectado junto con la forma salvaje de caveolina-1 o con su forma mutada en dominio de andamiaje. Tras comprobar la expresión de estas proteínas en los lisados totales, se llevó a cabo la inmunoprecipitación con anticuerpos frente al epítopo HA presente en ALK-1. Ambas formas de caveolina-1 fueron co-precipitadas aunque la cantidad de la forma mutada de caveolina-1 fue mucho menor que la salvaje. Este resultado sugiere que ALK-1 interacciona con caveolina-1 a través de su dominio SD. Para confirmar esta interacción, se llevó a cabo mutagénesis dirigida sobre el consenso de unión al dominio SD de caveolina-1. Así, se generaron los mutantes ALK-1 (001) y ALK-1 (011), según se mutase el tercer residuo aromático o los dos últimos, respectivamente. Por lo tanto, los residuos mutados fueron Phe401 Gly y Trp406 Ala. En los lisados totales de la Figura 31 se pone de manifiesto que las mutaciones introducidas en la secuencia de ALK-1 no afectan su nivel de expresión al ser transfectadas en células 293T. Así, se transfectaron los tres vectores de expresión de ALK-1, salvaje (WT), (001) y (011), junto con el de caveolina-1. Anticuerpos frente al epítopo myc presente en caveolina-1 fueron capaces de co-inmunoprecipitar las tres variantes de ALK-1. Sin embargo, las formas mutadas de ALK-1 fueron arrastradas con menor afinidad, tal y como pone de manifiesto la densitometría de las bandas. De esta manera queda demostrado que ALK-1 interacciona directamente con caveolina-1 y que esta asociación tiene lugar, aunque no de forma exclusiva, por el dominio de andamiaje (SD) de caveolina-1. ___________________________________________________________________Resultados 66 Figura 30: Implicación del dominio de andamiaje (SD) de caveolina-1 en la interacción con ALK- 1. Las células de la línea epitelial humana 293T no presenta caveolas en su membrana plasmática y, por lo tanto, no expresan ninguna isoforma de caveolina. Así, el vector de expresión de ALK-1 fue transfectado junto con la forma salvaje de caveolina-1 (WT) o el mutante en su dominio de andamiaje (SDmut). Se analizó la expresión de estas proteínas en los lisados totales separándolas por SDS-PAGE seguido de electrotransferencia e inmunodetección, observándose similares niveles de expresión. Como control de carga se inmunodetectó la presencia de β-actina. El panel superior muestra que anticuerpos frente al epítopo HA presente en ALK-1 co-inmunoprecipitan la forma salvaje de caveolina-1 por su epítopo myc. En el caso del mutante del dominio SD de caveolina-1 (SDmut), el rendimiento de la co-nmunoprecipitación fue considerablemente menor, poniendo de manifiesto una pérdida de afinidad por ALK-1. La gráfica inferior representa la proporción de caveolina-1 inmunoprecipitada (IP) respecto a la total presente en los lisados celulares. 0,8 - 1,0 - 0,6 - 0,4 - 0,2 - Relación de caveolina-1 co-inmunoprecipitada (IP/Total) Ctr WT SDmut Caveolina-1 U n id a d e s A rb it ra ri a s cav-1 + - - + + - + - + ALK-1 Cav-1 (WT) Cav-1 (SDmut) Co-Inmunoprecipitación IP: α-HA (12CA5) WB: α-myc (9E10) Lisados totales cav-1 ALK-1 β-actina WB: α-myc (9E10) WB: α-HA (12CA5) WB: α-β-actina (AC-15) ___________________________________________________________________Resultados 67 Figura 31: Identificación del consenso de unión al dominio SD de caveolina-1 en ALK-1. Mediante mutagénesis dirigida se generaron dos mutantes de ALK-1. En la forma mutada (001) contiene la sustitución Phe401 Gly, mientras que la (011) contiene ésta misma y Trp406 Ala. Estas mutaciones eliminan el consenso potencial de ALK-1 para la interación con el dominio de andamiaje de caveolina-1. Estas sustituciones no afectan al nivel de expresión de los mutantes de ALK-1, como se muestra en los paneles correspondientes a los lisados totales. En los paneles superiores se demuestra la co-inmunoprecipitación de la forma salvaje de ALK-1 así como de las formas mutadas mediada por anticuerpos frente al epítopo myc presente en caveolina-1. Sin embargo, se observa una marcada pérdida de afinidad de los mutantes de ALK-1 (001) y (011) por caveolina-1 demostrándose la implicación de la región Trp399-Trp406 en la interacción con el dominio SD de caveolina-1, que se cuantifica en la gráfica inferior. Ya que la eliminación del consenso ΦXΦXXXXΦ en ALK-1 no anula totalmente la co-inmunoprecipitación de ambas proteínas, se deduce que otras regiones deben estar implicadas en la interacción. + - + WT + 001 + 011 Caveolina-1 ALK-1 cav-1 Lisados totales WB: α-HA (12CA5) WB: α-myc (9E10) ALK-1 + - + WT + 001 + 011 Caveolina-1 ALK-1 Co-Inmunoprecipitación IP: α-myc (9E10) WB: α-HA (12CA5) ALK-1 0,2 - 0,4 - 0,6 - 0,8 - 1,0 - Ctr WT 001 011 U n d a d e s A rb it ra ri a s Relación de ALK-1 co-inmunoprecipitado (IP/Total) ALK-1 ___________________________________________________________________Resultados 68 4.7. LA LOCALIZACIÓN DE ALK-1 EN CAVEOLAS INDUCE SU VÍA DE SEÑALIZACIÓN Una vez demostrada la presencia de ALK-1 en caveolas se quiso analizar si la desestabilización de éstas por agentes secuestradores de colesterol afectaba a su vía de señalización. Así, el modelo celular elegido fue la línea endotelial humana HMEC-1, en la que se analizó la actividad reportera del vector p(BRE)2-Luc. Ya que el colesterol es un componente esencial de las caveolas, se observó que cuando fue añadido al medio se produjo una inducción en la actividad basal de p(BRE)2-Luc con respecto al control. Por el contrario, la depleción de colesterol producida por la incubación con los agentes metil-β- ciclodextrina o nistatina tuvo un efecto inhibitorio sobre la actividad de p(BRE)2-Luc. Este efecto negativo fue netamente revertido tras la restauración del colesterol al ser añadido al medio (Figura 32). Así, estos resultados demostraron que la vía de señalización de ALK-1 depende de su localización en caveolas por lo que a continuación se estudió el significado funcional de la interacción ALK- 1/caveolina-1. Figura 32: La presencia de ALK-1 en caveolas induce su vía de señalización. El vector reportero de la vía de señalización de ALK-1 p(BRE)2-Luc fue transfectado en células endoteliales HMEC-1. Treinta y seis horas post-transfección, las células fueron tratadas, cuando se indica, con 1% metil-β- ciclodextrina (MβCD) o 50 µg/ml nistatina en ausencia de suero para deplecionarlas de colesterol. Tras 1 hora, este tratamiento se reemplazó por medio completo y, en los casos señalados, se complementó con 25 µg/ml colesterol durante 12 horas más para restaurar su presencia en las células. Se observó que la depleción de colesterol por cualquiera de los dos métodos reduce significativamente la vía de señalización de ALK-1 (actividad). La adicción de colesterol al cultivo indujo la actividad p(BRE)2-Luc y fue capaz de restaurarla tras los tratamientos con MβCD o nistatina. En todos los casos p<0,01. 2 - 4 - 6 - 8 - 10 - 12 - MβCD Nistatina Colesterol 14 - U n id a d e s R e la ti v a s d e L u ci fe ra sa 16 - - - - - - + + - - + - + - + - - + + p(BRE)2-Luc ___________________________________________________________________Resultados 69 4.7.1. Caveolina-1 estimula la vía de señalización TGF-β/ALK-1 Según datos previos, la interacción de caveolina-1 con ALK-5 resulta en un efecto inhibitorio sobre la señal de transducción (Razani et al., 2001c). Para estudiar el efecto que caveolina-1 podría ejercer sobre la vía de señalización de ALK-1, se sobreexpresó caveolina-1 mediante transfección en células HMEC-1 donde se analizó la actividad del vector reportero de ALK-1 p(BRE)2-Luc, en respuesta o no al tratamiento con TGF-β. Así, los resultados obtenidos se muestran en la Figura 33.A. La transfección del vector vacío (control) confirmó que TGF-β inhibe la actividad reportera de p(BRE)2-Luc, a dosis altas (10 ng/ml) y teimpos largos (24 horas) . Sin embargo, cuando caveolina-1 es sobreexpresada su actividad reportera transcripcional experimenta un sorprendente aumento tanto en condiciones basales como en respuesta a TGF-β, sugiriendo una colaboración funcional de caveolina-1 sobre la vía de TGF-β/ALK-1. Para comprobar la especificidad de estos resultados se llevó a cabo un experimento similar en el que se transfectaron cantidades crecientes del vector de expresión de caveolina-1 y se analizó su actividad en respuesta o no a tratamiento a dosis pequeñas (1ng/ml) durante un corto intervalo de tiempo (4 horas). Está descrito que este tratamiento de TGF-β no provoca una represión de la actividad reportera de p(BRE)2-Luc sino que resulta en una inducción (Lebrin et al., 2004). Así, en estas condiciones se observó una respuesta positiva directamente dependiente de la cantidad de vector de expresión de caveolina-1 transfectado, confirmándose así su efecto cooperativo sobre la vía TGF-β/ALK-1 (Figura 33.B). No obstante, también ha sido descrita la localización en caveolas de los receptores de BMP, donde son regulados por caveolina-1 (Nohe et al., 2005). Por este motivo se pensó que estos receptores podrían estar interfiriendo en la señal de ALK-1 analizada hasta el momento, ya que comparten éste las mismas R- Smads en sus vías de señalización (Figura 2). Así, para despejar esta duda se analizó la actividad reportera del sistema GAL4-Smad1 en células HMEC-1 pero en este caso transfectando el vector de expresión de la forma quinasa deficiente de ALK-1 junto con caveolina-1 o vector vacío. Así, la Figura 33.C muestra que el dominante negativo ALK-1 (KR) anula considerablemente la inducción de la transactivación de GAL4- Smad1 provocada por la sobreexpresión de caveolina-1. Estos resultados indican que el estímulo de caveolina-1 sobre la transducción de señal vía Smad1 es dependiente de ALK-1 y no de los receptores de BMP. ___________________________________________________________________Resultados 70 Figura 33: Caveolina-1 promueve la vía de señalización de ALK-1. La vía de señalización de ALK-1 fue analizada en células endoteliales HMEC-1. U.R.L., unidades relativas de luciferasa. (A) La transfección del vector de expresión de caveolina-1 induce la actividad reportera de la construcción p(BRE)2-Luc tanto en condiciones basales como en respuesta a 10 ng/ml TGF-β durante 24 horas. (B) El vector de expresión de caveolina-1 fue transfectado en cantidades crecientes, observándose una inducción de la actividad reportera p(BRE)2-Luc dependiente de la dosis tanto en ausencia como en presencia de 1 ng/ml TGF-β durante 4 horas. A diferencia del tratamiento con altas concentraciones de TGF-β durante tiempos prolongados, este tratamiento más corto con dosis pequeñas induce la actividad del vector reportero p(BRE)2-Luc (Lebrin et al., 2004). (C) La inducción de la transactivación GAL4-Smad1 por caveolina-1 es dependiente de ALK-1. Al transfectar la forma quinasa deficiente ALK-1 (KR) actúa como un dominante negativo sobre el aumento de la vía de señalización ALK-1/Smad1 provocado por caveolina-1. Excepto en los casos señalados con (*), las diferencias fueron estadísticamente significativas con un valor de p<0,01. A p(BRE)2-Luc 5 - 10 - 15 - 20 - 25 - Control Caveolina-1 U .R .L . Control TGF-β C * GAL4-Smad1 2 - 4 - 6 - 8 - 10 - 12 - 14 - 16 - Control ALK1-KR U .R .L . Caveolina-1 - - + + 18 - B p(BRE)2-Luc 2 - 4 - 6 - 8 - 10 - 12 - 14 - - 0,05 0,25 0,50 U .R .L . µg DNA Caveolina-1 Control TGF-β * ___________________________________________________________________Resultados 71 4.7.2. La cooperación de caveolina-1 sobre la vía TGF-β/ALK-1 depende de su dominio de andamiaje. Según se mostró en las Figuras 30 y 31, la interacción entre ALK-1 y caveolina-1 está mediada por el reconocimiento de la secuencia Trp399-Trp406 de ALK-1 por parte del dominio SD de caveolina-1. Por lo tanto, se analizó la implicación de estas regiones en la cooperación funcional sobre la respuesta a TGF-β vía ALK-1. Así, las estrategias seguidas para este fin fueron las mismas que cuando se mapeó esta interacción; esto es, se analizó el efecto de la transfección del vector de expresión de caveolina-1 mutada en el dominio SD (SDmut) y de los de ALK-1 mutado en el motivo de unión a caveolina-1 , ALK-1 (001) y (011), sobre la actividad de la construcción reportera p(BRE)2-Luc. Figura 34: Implicación del dominio de andamiaje (SD) de caveolina-1 sobre la vía de señalización de ALK-1. U.R.L., unidades relativas de luciferasa. (A) En respuesta a 1 ng/ml TGF- β durante 4 horas, la actividad del vector reportero p(BRE)2-Luc en células endoteliales HMEC-1 aumenta al sobreexpresar ALK-1 y la forma salvaje de caveolina-1 (WT) sobre los niveles basales. Sin embargo, cuando el dominio de andamiaje de caveolina-1 es mutado (SDmut) o bien delecionado (∆82-101) se inhibe drásticamente la actividad transcripcional de p(BRE)2-Luc. (B) La actividad reportera de p(BRE)2-Luc fue analizada en células 293T en presencia o no de caveolina-1 junto con la forma salvaje de ALK-1 o con sus versiones mutadas (001) y (011). La cooperación observada entre ALK-1 y caveolina-1 sobre la actividad reportera de p(BRE)2-Luc fue abolida totalmente por las sustituciones puntuales introducidas en el motivo consenso de unión al dominio SD de caveolina-1. No hubo diferencias estadísticamente significativas en los casos señalados con (*). Para los demás, p<0,01. A p(BRE)2-Luc Ctr WT SDmut ∆82-101 5 - 10 - 15 - 20 - 25 - U .R .L . Control TGF-β * * B * * * p(BRE)2-Luc Caveolina-1 ALK-1 - + Ctr - + WT - + 001 - + 011 20 - 40 - 60 - 80 - 100 - 120 - 140 - 160 - U .R .L . ___________________________________________________________________Resultados 72 El resultado del primero de los abordajes se muestra en la Figura 34.A. Entonces, se transfectaron células HMEC-1 con la forma salvaje de caveolina-1, el mutante en el dominio de andamiaje (SDmut), una construcción de caveolina-1 en el que dicho dominio SD fue totalmente eliminado (∆82-101) o con el vector vacío (control). Como era de esperar, la expresión de caveolina-1 potenció la actividad reportera p(BRE)2-Luc tanto en respuesta a dosis bajas de TGF-β durante tiempos cortos como sin tratamiento. Sin embargo, esta inducción fue totalmente anulada por la transfección tanto de la forma mutada cav-1 (SDmut) como de la carente del dominio SD (∆82-101). Además, estas formas mutadas de caveolina-1 hacen a su vez al reportero p(BRE)2-Luc insensible al tratamiento por TGF-β. Respecto a la otra estrategia, el efecto de los mutantes de ALK-1 en el motivo de unión a caveolina-1 sobre la actividad reportera p(BRE)2-Luc se muestra en la Figura 34.B. En este caso, células 293T, carentes de caveolina-1 endógena, se transfectaron con estas formas de ALK-1 junto con la forma salvaje de caveolina-1. Esta línea epitelial humana no expresa ALK-1 ni presentan caveolas en su membrana plasmática, por lo que si ALK-1 no es transfectado caveolina-1 no ejerce ningún efecto sobre la actividad reportera (control). Sin embargo, cuando se introduce ALK-1 en el sistema se observa el correspondiente aumento de la actividad de p(BRE)2-Luc que es claramente incrementado por la co-transfección de la forma salvaje de caveolina-1. Por otro lado, este efecto positivo sobre la vía de señalización de ALK-1 fue considerablemente inhibido en presencia de los mutantes (001) y (011), alcanzándose un nivel de actividad reportera similar al obtenido en ausencia de caveolina-1. Tomando estos resultados en conjunto se concluye que la cooperación funcional de caveolina-1 sobre la vía de señalización de ALK-1 depende en gran medida del dominio de andamiaje (SD) de caveolina-1 así como del reconocimiento de su motivo de unión presente en la región Trp399-Trp406 de ALK-1. 4.7.3. El bloqueo específico de caveolina-1 por siRNA reduce la señalización de ALK-1 Finalmente, se llevó a cabo el bloqueo específico de la expresión endógena de caveolina-1 mediante pequeñas moléculas de RNA de interferencia (siRNA). Esta metodología se empleó para confirmar el papel específico que caveolina-1 ejerce sobre ALK-1. Así, células HMEC-1 se transfectaron con el vector para siRNA de caveolina-1 resultando en una reducción parcial, pero considerable, de los niveles de expresión endógenos de caveolina-1 (Figura 35.A). Esto es debido al elevado nivel de expresión de caveolina-1 endógena en estas células y a que el porcentaje de transfección del vector que origina el siRNA específico no es total, por lo que la cantidad de caveolina-1 que se observa corresponde a la de las células que no han sido transfectadas. La especificidad de este bloqueo se puso de manifiesto tanto por la constancia en los niveles de β-actina como cuando se analizó que otros tres siRNA irrelevantes (C1, C2 y C3) no tenían efecto alguno sobre sus niveles de expresión. ___________________________________________________________________Resultados 73 Figura 35: La reducción de caveolina-1 anula la vía de señalización de ALK-1. (A) La expresión de caveolina-1 fue considerablemente reducida en células L6E9 mediante un siRNA específico, que no tuvo efecto alguno sobre la expresión de β-actina. Además, el efecto nulo de tres siRNA irrelevantes (C1, C2 y C3) sobre el nivel de expresión de caveolina-1 confirmó la especificidad al ensayo. (B) La actividad reportera de p(CAGA)12-Luc se analizó en células L6E9 transfectadas con la construcción del siRNA para caveolina-1. Puesto que se ha descrito el efecto inhibitorio de caveolina-1 sobre la vía de señalización de ALK-5, al reducir los niveles de caveolina-1 endógena aumentó la actividad de la construcción reportera de la vía de ALK-5 tanto basal como en respuesta a TGF-β. (C) El análisis de la actividad p(BRE)2-Luc en células L6E9 demostró que es inducida por la transfección de ALK-1 e incrementada por la sobreexpresión de caveolia-1. Sin embargo, tanto la mutación del dominio SD como su eliminación de la secuencia de caveolina-1 se comportaron como formas dominantes negativas sobre la cooperación con ALK-1. El mismo resultado inhibitorio sobre la capacidad de ALK-1 para inducir la actividad reportera de p(BRE)2-Luc fue obtenido al reducir los niveles endógenos de caveolina-1 por su siRNA específico. En todos los casos, p<0,01 excepto en (*). B p(CAGA)12-Luc Control Caveolina-1 siRNA 5 - 10 - 15 - 20 - 25 - 30 - 35 - U .R .L . Control TGF-β C * p(BRE)2-Luc - Caveolina-1 SDmut ∆82-101 siRNA ALK-1 - + - + - + - + - + WT 10 - 20 - 30 - 40 - 50 - U .R .L . A C1 C2 C3 Cav-1 siRNA Caveolina-1 WB: α-caveolina-1 (2297) β-Actina WB: α-β-Actina (AC-15) Lisados totales 1,0 - C1 0,2 - 0,4 - 0,6 - 0,8 - C2 C3 Cav-1 Especificidad de los siRNA (caveolina-1/β-actina) U n id a d e s A rb it ra ri a s ___________________________________________________________________Resultados 74 Antes de pasar directamente a estudiar el efecto de la reducción de caveolina-1 sobre la vía de señalización de ALK-1, se analizó como control la modulación de la vía de ALK-5. De este modo, el bloqueo de la expresión de caveolina-1 endógena por el siRNA específico resultó en un marcado aumento de la actividad reportera del vector p(CAGA)12-Luc en células L6E9, debido a la eliminación del efecto inhibitorio de caveolina-1 sobre ALK-5 (Razani et al., 2001c). Hay que destacar que en estas células la expresión endógena de caveolina-1 es muy elevada, lo que explica que el tratamiento con TGF-β no indujera la actividad del vector reportero en condiciones control (Figura 35.B). Del mismo modo, este hecho se observó posteriormente al estudiar el efecto sobre la vía de señalización de ALK-1. Ya que las células L6E9 expresan bastante caveolina-1 se obtuvo una elevada actividad del vector reportero p(BRE)2- Luc en presencia de ALK-1. Cuando caveolina-1 fue sobreexpresada se obtuvo un aumento significativo en la vía de señalización de ALK-1 (Figura 35.C). Por el contrario, la transfección de los mutantes caveolina-1 (SDmut) y caveolina-1 (∆82-101) redujo drásticamente la actividad reportera de p(BRE)2-Luc, actuando así como dominantes negativos de la caveolina-1 endógena. La expresión de siRNA de caveolina-1 tuvo el mismo efecto sobre la actividad del reportero que los mutantes anteriores, confirmándose así la cooperación funcional de caveolina-1 sobre la vía de señalización de ALK-1. V. DISCUSIÓN ____________________________________________________________________Discusión 76 5.1. LA INTERACCIÓN DE ENDOGLINA CON ALK-1 FAVORECE SU VÍA DE SEÑALIZACIÓN Numerosos estudios han demostrado que endoglina forma complejos heteroméricos con los receptores señalizadores TβR-II y ALK-5 tanto en ausencia como en presencia de TGF-β (Guerrero-Esteo et al., 2002; Lastres et al., 1996; Letamendía et al., 1998b; Wong et al., 2000; Yamashita et al., 1994a), incluso con otros receptores de la superfamilia como ActR-II, ActR-IIB, ALK-3 y ALK-6, en presencia de sus respectivos ligandos (Barbara et al., 1999). Sin embargo, la interacción con el otro receptor tipo I de TGF-β presente en las células endoteliales, ALK-1, ha sido caracterizada en este trabajo por primera vez. Este hallazgo está de acuerdo con que ALK-1 esté presente en el complejo del receptor de TGF-β y que anticuerpos frente a TβR-II sean capaces de co-inmunoprecipitar todo el complejo receptor incluyendo ALK-5, ALK-1 y endoglina (Abdalla et al., 2000; Attisano et al., 1993; Barbara et al., 1999). Por otro lado, se sabe que en respuesta a TGF-β, ALK-1 es capaz de transmitir la señal al núcleo por medio de proteínas R-Smad específicas. De hecho, esta vía de señalización implica a Smad1, 5 y 8, sobre las que ALK-1 ejerce su actividad serina/treonina quinasa (Chen & Massagué, 1999; Macías-Silva et al., 1998). De esta manera, se establece la hipótesis de que si la interacción de endoglina con ALK-1 tenía algún significado funcional debería ser sobre esta vía de transducción de señal. Al mismo tiempo, existían evidencias fisiológicas de este paralelismo entre endoglina y ALK-1. Así, mutaciones en los genes de endoglina (ENG) o ALK-1 (ACVRL1) dan lugar a una displasia vascular con un fenotipo similar denominada Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria tipo 1 y 2, respectivamente (Marchuk & Lux, 2001), lo que apoyaba la existencia de una vía de señalización común. Por otro lado, los ratones a los que artificialmente se les había eliminado los genes de endoglina o ALK-1 morían a los 10 u 11 días de gestación debido a anormalidades cardiovasculares (Arthur et al., 2000; Bourdeau et al., 1999; Li et al., 1999; Oh et al., 2000). Asimismo, cuando en el modelo murino sólo es uno de los dos alelos de estos genes el que se elimina aparecen telangiectasias y malformaciones arteriovenosas, síntomas característicos de la HHT (Satomi et al., 2003; Srinivasan et al., 2003; Torsney et al., 2003). Todas estas premisas sugerían que endoglina y ALK-1 estaban íntimamente relacionados por lo que se comenzó a estudiar la interacción entre ambos y cómo endoglina era capaz de modular la respuesta celular a TGF-β vía ALK-1. 5.1.1. Disección y consecuencias de la interacción endoglina/ALK-1 Se ha demostrado, mediante un análisis detallado, la asociación física entre endoglina y ALK-1. Dado que ambos receptores son proteínas transmembrana con regiones extracelular y citoplásmica, es muy probable que esta interacción implique y sea estabilizada por múltiples sitios de contacto. De hecho, algo similar ocurre con los complejos formados por endoglina, ALK-5 y TβR-II (Chen et al., 1995; Derynck & Feng, 1997; Guerrero-Esteo et al., 2002). Se ha demostrado que cuando ambas proteínas, endoglina y ALK-1, son expresadas de forma ectópica pueden ser co-inmunoprecipitadas de forma recíproca con anticuerpos específicos contra cada una de ellas sin necesidad de añadir TGF-β al sistema (Figura 9). Este hecho concuerda con estudios previos de co-inmunoprecipitación en células endoteliales HUVECs (Abdalla et al., 2000). ____________________________________________________________________Discusión 77 En el contexto intracelular, se ha observado la interacción entre ALK-1 y el dominio citoplásmico de endoglina, aunque si bien el estado de activación de ALK-1 determinó la cantidad de proteína co- inmunoprecipitada (Figura 12). Este hecho se explica desde el punto de vista de la actividad enzimática presente en el dominio citoplásmico de ALK-1, el cual perdería afinidad por su producto una vez fosforilado. Por esta razón la región citoplásmica de endoglina no resultó co-inmunoprecipitada con la forma constitutivamente activa de ALK-1. Esta situación sustrato-enzima-producto sería similar a la que ocurre cuando los receptores tipo I actúan sobre las R-Smads fosforilando los residuos de serina del motivo SSXS presente en sus extremos C-terminal, ya que se disocian rápidamente (Shi & Massagué, 2003). Sin embargo, un hecho llamativo es que el estado de activación de ALK-1 no afecta a la interacción con la endoglina completa. Esto sugiere que la interacción entre sus regiones extracelulares permanece y que dicha asociación presenta un alto grado de afinidad. De hecho, al comparar el total de ALK-1 arrastrado por el dominio extracelular de endoglina, presente en la quimera EndoEC-Fc, se pudo observar una diferencia de más de 15 veces con respecto al obtenido de ALK-5 o de TβR-II (Figura 11). Así, endoglina y ALK-1 permanecerían unidos por sus regiones extracelulares independientemente de que el patrón de serinas/treoninas citoplásmicas fosforiladas de endoglina se vea modificado. Algo similar ocurre en la interacción entre TβR-I/TβR-II: el receptor tipo II fosforila al tipo I pero su disociación no es inmediata ya que permanecen unidos formando complejos con el ligando (Chen et al., 1995). Figura 36: Implicación de las regiones extracelular y citoplásmica de endoglina sobre la señalización de ALK-1. Para simplificar el modelo se ha omitido el TβR-II así como el propio TGF- β. (A) Situación basal en la que TGF-β promueve la señalización de ALK-1 vía Smad1. (B) La región citoplásmica de endoglina competiría con Smad1 al ser ambos sustratos de la actividad serina/treonina quinasa de ALK-1, provocando una inhibición de la respuesta celular. (C) La región extracelular de endoglina estabilizaría la unión del ligando a ALK-1, que actuaría sobre Smad1 con más eficiencia al no estar presente el otro sustrato, esto es, la región citoplásmica de endoglina. Esto explica por qué la respuesta celular vía Smad1 se ve amplificada. (D) Así, en presencia de endoglina completa la región citoplásmica queda en contacto con ALK-1, estabilizada por las regiones extracelulares. Esta es la situación natural en la que endoglina promueve la señalización de TGF-β vía ALK-1. ALK-1 Endoglina Smad1 Fosforilación Respuesta A Respuesta C B Respuesta D Respuesta ____________________________________________________________________Discusión 78 El estudio de la cooperación funcional entre endoglina y ALK-1 corrobora la hipótesis de la importancia de la interacción extracelular de ambas proteínas. Se ha demostrado mediante el sistema celular inducible de endoglina por doxiciclina, GM7372EL, que cuando son co-expresadas, la señalización de ALK-1 vía Smad1 se ve favorecida (Figura 14). Este efecto se reprodujo al transfectar construcciones truncadas de endoglina que contenían, al menos, la región extracelular comprendida entre Glu26-Arg437 (Figura 15). Además, formas solubles del dominio extracelular de endoglina fueron capaces de unirse a las células endoteliales e inducir la señalización vía Smad1 así como revertir el efecto antiproliferativo de TGF-β (Figuras 19 y 20). No obstante, esta cooperación no se observó con la transfección de la región citoplásmica de endoglina. Estos hechos sugieren que la modulación de la vía de señalización de ALK-1 por endoglina depende principalmente de su región extracelular. Así, la región citoplásmica de endoglina sería sustrato de ALK-1 pero el efecto que ésta ejercería sobre el receptor dependería de la estabilización por sus regiones extracelulares (Figura 36). 5.1.2. ¿ALK-5 o ALK-1? La coexistencia de dos receptores tipo I de TGF-β en células endoteliales capaces de unir el mismo ligando debe ser finamente regulada. Más aún cuando las respuestas celulares vía ALK-5 o ALK-1 han sido relacionadas con efectos opuestos sobre la angiogénesis. Así, mientras la señalización de TGF-β vía ALK-1 se ha relacionado con la fase de activación, la de ALK-5 está implicada en la fase de resolución (Goumans et al., 2003a; Goumans et al., 2003b; Goumans et al., 2002). A partir de estos artículos citados de Goumans y colaboradores y junto con los resultados obtenidos en el presente trabajo se ha propuesto el modelo recogido en la Figura 37, en el que se establece que endoglina es capaz de modular el balance entre las vías de señalización de ALK-5 y ALK-1. Desde hace tiempo se había observado que el TGF-β ejercía este papel dual sobre la migración y proliferación de las células endoteliales. Analizando el perfil de expresión génica, mediante chips de DNA, dependiente de formas constitutivamente activadas de uno u otro receptor tipo I se observaron marcadas diferencias (Ota et al., 2002). Así, ALK-1 inducía específicamente la expresión de Id1, un miembro de la familia de factores de transcripción hélice-giro- hélice básicos (bHLH) que promueve la migración y proliferación de células endoteliales. Por su parte, ALK-5 era capaz de estimular de forma específica la expresión de PAI-1, un regulador negativo de la migración endotelial in vitro y de la angiogénesis in vivo (Stefansson & Lawrence, 1996; Stefansson et al., 2001). En el presente trabajo se ha demostrado mediante construcciones reporteras de ambas vías de señalización que endoglina es capaz de inclinar la balanza hacia la vía de señalización ALK-1/Smad1 en detrimento de la de ALK-5/Smad3 (Figuras 16, 17 y 18). Estos resultados están de acuerdo con numerosos trabajos publicados en los que se describía el papel antagonista de endoglina sobre algunas de las respuestas a TGF-β mediadas por ALK-5, como la inhibición de la proliferación celular, activación de la apoptosis, o inducción de la síntesis de matriz extracelular (Díez-Marqués et al., 2002; Lastres et al., 1996; Letamendía et al., 1998b; Li et al., 2003; Obreo et al., 2004), y con la propia inhibición de la vía TGF-β/Smad3 (Guo et al., 2004). Por la otra parte, un trabajo reciente apoya la cooperación funcional de endoglina sobre la vía de señalización de ALK-1 demostrando el aumento de la proliferación de células endoteliales embrionarias y la promoción de la vía TGF-β/ALK-1 (Lebrin et al., 2004). No obstante, a pesar de que la interacción directa entre endoglina con ALK-1 y ALK-5 podría explicar la regulación de la actividad del correspondiente TβR-I, no puede ser descartado el papel de una interferencia cruzada (en ____________________________________________________________________Discusión 79 inglés cross-talk) entre ambos receptores. Así, se ha propuesto que endoglina podría interferir indirectamente vía ALK-1 con la señalización de ALK-5 modulando la composición de los complejos R- Smads y, por lo tanto, su actividad (Lebrin et al., 2004). Ninguno de los mecanismos puede ser excluido, incluso puede que ambos tengan lugar simultáneamente en células endoteliales, donde coexisten los tres miembros. No obstante, existen evidencias que apoyan la idea basada en una interacción directa por el hecho de que la expresión ectópica de endoglina/ALK-5 o endoglina/ALK-1 reproduce los resultados obtenidos en células endoteliales. Es sabido que la presencia de endoglina en el complejo receptor, en el modelo de mioblastos de rata L6E9, no aumenta espectacularmente la cantidad de TGF-β unido pero sí que favorece la unión del ligando a ALK-5 (Letamendía et al., 1998b). Por otro lado, la afinidad de ALK-1 por TGF-β es mucho menor (Oh et al., 2000), por lo que endoglina favorecería esta estabilización fomentando así la transducción de señal. Así, el papel de endoglina en el complejo receptor de TGF-β sería la modulación del acceso del ligando a los receptores. Apoyando esta hipótesis se observó que el dominio extracelular purificado de endoglina así como la construcción quimera EndoEC-Fc eran capaces de mimetizar la forma Figura 37: Modelo funcional de la regulación de endoglina sobre el balance ALK-5/ALK-1. Endoglina favorece la fase de activación de la angiogénesis, en la que las células endoteliales degradan la matriz extracelular (MEC), invaden y migran a través del espacio extracelular, proliferan y forman el lumen del vaso. Por el contrario, endoglina es capaz de inhibir la fase de resolución, la cual implica que las células endoteliales dejan de migrar y proliferar, y reconstituyen la barrera endotelial. Smad3 Smad1 A L K -5 A L K -1 E n d og li n a Proliferación Migración Síntesis de MEC PAI-1 Id1 Fase de resolución de la angiogénesis Fase de activación de la angiogénesis ____________________________________________________________________Discusión 80 completa endógena, respecto a las variaciones de la actividad de los reporteros específicos y en cuanto a la reversión de la inhibición de la proliferación inducida por TGF-β (Figura 19). Sin embargo, no todas las funciones que endoglina ejerce en las células serían mimetizadas por la región extracelular soluble, ya que se ha descrito el importante papel que su región citoplásmica juega en la organización del citoesqueleto de actina por su interacción con miembros de la familia Lim, como zyxin y ZRP-1 (Conley et al., 2004; Sanz- Rodríguez et al., 2004). Por lo tanto, la aplicación de endoglina soluble como un posible tratamiento paliativo a enfermos de HHT1, donde los niveles de expresión de endoglina son la mitad debido a la mutación de uno de los alelos del gen que la codifica, sería de una eficacia limitada. No obstante, estudios en modelos animales de HHT ayudarían a analizar esta hipótesis. 5.2. LA ISOFORMA ENDOGLINA-S ANTAGONIZA EL EFECTO DE ENDOGLINA-L EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE TGF-β Por lo general, cuando se menciona a endoglina se hace referencia a su isoforma larga, denominada endoglina-L, que es la que se expresa de forma mayoritaria en las células. Sin embargo, hace tiempo que se describió la expresión de una isoforma algo más pequeña (Bellón et al., 1993). Su expresión era minoritaria en relación a la isoforma larga y se originaba por la permanencia en el RNA maduro de un pequeño intrón de 135 pares de bases entre los exones 13 y 14, el cual contenía un codón de parada prematura de la traducción en fase de lectura. En cuanto a la estructura primaria, la diferencia entre ambas reside en su región citoplásmica que en el caso de endoglina-L contiene 47 residuos y en endoglina-S contiene 14, siendo comunes los 7 primeros (Figura 6). Más recientemente se ha descrito la existencia de esta isoforma corta en ratón (Pérez-Gómez et al., 2005), pero el papel fisiológico que estas formas más cortas de endoglina juegan en la célula no ha sido estudiado aún en detalle. Los primeros estudios fueron realizados en células promonocíticas humanas U-937. Se observaba que endoglina-S no era capaz de inhibir totalmente el efecto antiproliferativo inducido por TGF-β, al contrario que su isoforma endoglina-L, debido a que la expresión de c-myc no llegaba a anularse en respuesta a TGF-β. Además, estos transfectantes de endoglina-S eran capaces de producir una mayor cantidad de fibronectina tras el tratamiento con TGF-β a tiempos cortos (Lastres et al., 1996). Estos datos indicaban que ambas formas de endoglina podrían influenciar de manera distinta la respuesta celular a TGF-β. Por otra parte, se había observado que esta isoforma corta de endoglina aparecía en los cultivos endoteliales envejecidos, que perdían su capacidad de proliferación y presentaban una morfología muy similar a la de los mioblastos L6E9 transfectados de forma estable con endoglina-S. 5.2.1. Papel de endoglina-S en la senescencia endotelial. Los resultados presentados en este trabajo han demostrado por primera vez que hay una relación directa entre endoglina-S y senescencia endotelial (Figura 22). Cuando el organismo envejece, aparecen alteraciones en la capacidad de remodelación de la pared vascular, ensanchamiento del lumen de los vasos, aumento del espesor de las túnicas íntima y media y un incremento de la rigidez vascular, que conducen al empeoramiento de la función endotelial aumentando el riesgo del desarrollo de una enfermedad cardiovascular. Al mismo tiempo, las respuestas vasodilatadoras dependientes del endotelio ____________________________________________________________________Discusión 81 están atenuadas debido a un descenso en la actividad o la expresión de la isoforma endotelial de la óxido nítrico sintasa, eNOS, lo cual obliga al aumento de la expresión de su isoforma inducible, iNOS, con la consecuencia final del incremento de la formación de especies reactivas del oxígeno, que pueden ser la causa del aumento de la proporción de células endoteliales apoptóticas en la senescencia. Endoglina parece tener un papel protector en estos fenómenos que acontecen en el envejecimiento endotelial. Así, su expresión aumenta en el remodelado vascular tras un daño endotelial (Botella et al., 2002), es capaz de estabilizar la interacción eNOS/Hsp90 para alcanzar su óptima actividad enzimática (Jerkic et al., 2004; Toporsian et al., 2005), y previene la apoptosis endotelial inducida por estados de baja concentración de oxígeno, hipoxia (Guo et al., 2004a; Li et al., 2003). Sin embargo, todas estas funciones se atribuyen a endoglina-L. En este trabajo se ha demostrado por primera vez que en las células senescentes hay un cambio hacia la expresión de la isoforma corta y se ha visto que endoglina-S ejerce efectos opuestos a su isoforma mayoritaria sobre la respuesta a TGF-β, como la promoción de la vía de señalización a través de ALK-5 y el bloqueo de la de ALK-1 (Figuras 25, 26 y 27). Sin embargo, en este estadio senescente no hay una situación de todo o nada sino que coexisten ambas isoformas. Incluso, se ha descrito que cuando son co-expresadas de forma ectópia pueden formar heterodímeros S/L (Pérez-Gómez et al., 2005). Por lo tanto, la inclinación de la balanza hacia ALK-5 o ALK-1 dependería de la relación S/L presente en cada momento en la célula endotelial (Figura 38). Es interesante resaltar que se ha observado, en líneas generales, que los niveles de expresión de ALK-5 y ALK-1 a lo largo del envejecimiento celular permanecen constantes dentro de un determinado intervalo, por lo que sería el aumento de la proporción S/L la que potenciaría la vía de ALK-5. Ya que ambas isoformas de endoglina comparten la extensa región extracelular, las regiones citoplásmicas son los principales candidatos de ejercer los efectos antagonistas observados. Así, se Figura 38: Modelo de acción comparativo de las isoformas de endoglina. En un estadio de senescencia celular la respuesta a TGF-β se ve modulada por la aparición de endoglina-S en el complejo receptor, que favorece la señalización a través de ALK-5. No se descarta la posible formación de heterodímeros de las formas S y L de endoglina. Id1 PAI-1 Proliferación Síntesis de MEC senescencia Endoglina-L ALK-5 ALK-1 Smad3 Smad1 Endoglina-S ALK-5 ALK-1 Smad3 Smad1 ____________________________________________________________________Discusión 82 encontró que ALK-5 es capaz de interaccionar con el dominio citoplásmico de ambas isoformas de endoglina en igual medida, mientras que la interacción de ALK-1 con el dominio citoplásmico de endoglina-L es mucho mayor que con el de endoglina-S (Figura 23). En concordancia con estos resultados, cuando fue la proteína completa la que se expresó en la célula, estas diferencias para ALK-1 se acentuaron aún más, obteniéndose un rendimiento mucho mayor en la interacción ALK-1/endoglina-L (Figura 24). En este sentido, si bien el tallo citoplásmico largo de endoglina inhibiría la actividad de ALK- 5 sobre Smad3, su versión corta sería incapaz de tener dicho efecto resultando en una potenciación “indirecta” de la señalización ya que por su región extracelular estaría promoviendo la captación de ligando (Letamendía et al., 1998b). Por el otro lado, endoglina-S sería incapaz de promover la señalización vía ALK-1, favoreciendose así la anterior cascada de señalización. De acuerdo con esta hipótesis, se ha sugerido el efecto antiagiogénico de endoglina-S frente al establecido proangiogénico de endoglina-L. Se ha observado que los ratones transgénicos que expresan la isoforma corta humana, denominados S-Eng+ (Velasco et al., 2001), exhiben un fenotipo angiogénico deficiente que conduce a un retardo del crecimiento tumoral, usando el modelo de carcinoma 3LL (Pérez-Gómez et al., 2005). El mecanismo por el cual se generan las dos isoformas no ha sido aún determinado. Es muy probable que se produzca por un mecanismo de ayuste de exónes alternativo. De hecho, ese pequeño intrón que queda retenido en la endoglina-S contiene sitios donador (GT) y aceptor (AG) del ayuste en los extremos 5’ y 3’, respectivamente, así como un sitio de ramificación (CTGAC). A modo de ejemplo, esta misma situación es la responsable de la expresión de varias isoformas del receptor de activina (Attisano et al., 1992). Ese pequeño intrón de endoglina contiene, además, sitios consenso teóricos para el reconocimiento por determinados miembros de la familia de proteínas con dominios ricos en serina y arginina (SR). Estos factores forman parte y modulan la actividad del complejo macromolecular denominado espliceosoma, compuesto principalmente por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP)s (Matlin et al., 2005; Singh & Valcárcel, 2005). Estas proteínas SR son requeridas en los primeros estadios del ensamblaje del espliceosoma, tienen especificidades distintas pero solapantes y pueden alterar la elección del sitio de ayuste, sugiriendo que podrían estar implicados en la regulación del ayuste alternativo in vivo. Este mecanismo de generación de ayuste alternativo propuesto para endoglina- S ha sido descrito en otras proteínas como CD45 (Wang et al., 2001), la β-tropomiosina (Expert-Bezançon et al., 2004), la acetilcolinesterasa neuronal (AChE) (Meshorer et al., 2005), o la proteína proteolipídica 1 (PLP1) (Wang et al., 2006). Conocer el mecanismo y el estímulo que determina uno u otro ayuste de exones nos ayudará a comprender en detalle el papel de endoglina en la biología vascular. 5.3. CAVEOLINA-1 INTERACCIONA CON ALK-1 Y POTENCIA SU VÍA DE SEÑALIZACIÓN Las proteínas de la familia de las caveolinas se asocian típicamente con microdominios de la membrana plasmática ricos en colesterol y esfingolípidos denominados balsas lipídicas (en inglés, lipid rafts) formando estructuras llamadas caveolas. Sin embargo, lejos de formar simples estructuras subcelulares las caveolinas, y más en concreto caveolina-1, tiene la capacidad de interaccionar y modular la actividad de numerosas proteínas generalmente implicadas en transducción de señal. Si se recopila bibliografía publicada sobre caveolina-1 se observa que la mayoría de las interacciones en las que está implicada resultan en un efecto inhibitorio (revisado en Krajewska & Maslowska, 2004). Así por ejemplo, ____________________________________________________________________Discusión 83 caveolina-1 es capaz de interaccionar y reprimir la actividad de eNOS (García-Cardeña et al., 1997), del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) (Couet et al., 1997b), de las isoformas α y ζ de la proteína quinasa C (PKC) (Oka et al., 1997), o del propio ALK-5 (Razani et al., 2001c). Sin embargo, los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran por vez primera una cooperación positiva entre caveolina-1 y ALK-1 (Figura 33). Se ha identificado en la región Trp399- Trp406 de la secuencia de ALK-1 un motivo de interacción con el dominio de andamiaje (SD) de caveolina-1. Tanto las mutaciones específicamente introducidas en este consenso como la mutación del dominio SD de caveolina-1 (SDmut) reducen a la mitad la cantidad de proteína co-inmunoprecipitada (Figuras 30 y 31) así como la cooperación funcional (Figuras 34 y 35). También se ha observado que la depleción de colesterol, con la consecuente desestabilización de las caveolas, cambia el patrón de distribución de ambas proteínas (Figuras 28 y 29) y bloquea la vía de señalización de ALK-1 (Figura 32). Apoyando la idea de la cooperación positiva de caveolina-1 sobre ALK-1 están los análisis de la actividad de sistemas reporteros, donde se obtuvo un aumento de la vía de señalización de ALK-1. Este no es el único caso de activación de un receptor por caveolina-1 ya que se ha descrito que la interacción con el receptor de insulina resulta también en una activación de su actividad tirosina-quinasa (Nystrom et al., 1999; Yamamoto et al., 1998). 5.3.1. Paralelismo funcional entre ALK-1 y caveolina-1 Desde hace relativamente poco, se ha descrito la implicación de caveolina-1 en el proceso de angiogénesis. Se ha observado que la eliminación de la expresión del gen que codifica para caveolina-1 en modelos de ratón (knock-out) conduce a anormalidades vasculares puestas de manifiesto por alteraciones, entre otras, de la morfología de las uniones estrechas que resultan en un aumento de la permeabilidad de la microvasculatura, un incremento de la vasorrelajación de la aorta inducida por acetilcolina debido a una activación constitutiva de eNOS, y un ensanchamiento de los septos alveolares de los pulmones por una hiperproliferación de células endoteliales acompañada de fibrosis (Drab et al., 2001; Razani et al., 2001a; Woodman et al., 2003). Además, en modelos in vitro, el bloqueo específico de la expresión de caveolina-1 por oligonucleótidos antisentido da lugar a una incapacidad de formación de estructuras tubulares similares a capilares (Liu et al., 2002). De este modo, tomando todos los datos en conjunto aparece un paralelismo funcional entre caveolina-1 y ALK-1 (Figura 39). Así, en las células endoteliales de los ratones cav-1-/- la vía de señalización de TGF-β a través de ALK-1 estaría reducida o al menos desfavorecida, mientras que la de ALK-5 quedaría libre de la inhibición por caveolina-1. Esta hipótesis sería apoyada por la fibrosis observada en los septos alveolares, que estaría mediada por la vía de ALK-5 al desaparecer el obstáculo que representa su interacción con caveolina-1. De hecho, el exceso de producción de matriz extracelular es un proceso patológico asociado a altos niveles de TGF-β en sangre, por lo que el resultado de ambas situaciones sería análogo. Por otro lado, el fenotipo hiperproliferativo de células endoteliales de estos ratones no estaría relacionado con la vía de ALK-1, sino por el marcado aumento de la expresión de receptores de factores de crecimiento como Flk-1, receptor del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). Sin embargo, la formación de estructuras tubulares, tubulogénesis, sí que estaría influenciada por un descenso en la vía de ALK-1. Se ha observado que la expresión de caveolina-1 aumenta significativamente momentos antes del comienzo de la tubulogénesis (Liu et al., 2002). En paralelo, ____________________________________________________________________Discusión 84 también se ha observado que las células endoteliales de pacientes afectados por HHT2 (ACVRL1+/-) son incapaces de formar estas estructuras similares a capilares (Fernández-L et al., 2005). Aquí aparece de nuevo la similitud funcional entre caveolina-1 y ALK-1, ya que la tubulogénesis endotelial dependería de la cooperación del aumento de caveolina-1 sobre la vía de señalización TGF-β/ALK-1. 5.4. COMENTARIO FINAL Y PERSPECTIVAS El TGF-β es un citoquina multifuncional que juega un papel dual sobre el endotelio vascular. En las células endoteliales, TGF-β puede ejercer sus diversas funciones a través de dos receptores tipo I diferentes, ALK-5 y ALK-1. Por lo tanto, la decisión de inclinar la balanza hacia uno u otro receptor es un proceso que debe estar finamente regulado. En la fase de activación de la angiogénesis, la expresión de endoglina aumenta, siendo capaz de modular la respuesta a TGF-β. En este contexto, es la isoforma mayoritaria endoglina-L la que es capaz de promover la señalización ALK-1/Smad1 en detrimento de ALK-5/Smad3. Así, esta cooperación funcional entre endoglina-L y ALK-1 es fundamental para el desarrollo y el mantenimiento de la vasculatura. De hecho, mutaciones en un alelo de uno de estos genes son la causa de una alteración vascular denominada Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT) tipo 1 y 2, respectivamente. Por el contrario, cuando las células endoteliales envejecen, el aumento de la expresión de la isoforma corta endoglina-S invierte la inclinación de la balanza hacia la vía de señalización ALK-5/Smad3. Conocer los mecanismos implicados en la expresión de endoglina-S así como el estímulo que los desencadena ayudará a elucidar las funciones que desempeña en la célula endotelial. Se había descrito que el complejo TβR-II/ALK-5 se localizaba en los microdominios especializados de la membrana plasmática denominados caveolas, donde la actividad de ALK-5 se veía reprimida. En el presente trabajo se ha demostrado que ALK-1 también se localiza en caveolas e Figura 39: Cooperación funcional de caveolina-1 sobre la vía de señalización de ALK-1. En condiciones normales ALK-1 se localiza tanto en caveolas como fuera, pudiendo existir interacción entre ambos y una señalización basal. A consecuencia de un estímulo angiogénico la expresión de caveolina-1 aumenta, luego es capaz de retener a ALK-1 durante más tiempo en las caveolas. Esta situación potenciaría la señalización de TGF-β mediante ALK-1, ya que caveolina ejerce un papel inhibitorio sobre la vía de ALK-5, dando lugar a procesos tales como migración celular, tubulogénesis y, en definitiva, la fase de activación de la angiogénesis. Smad3 Smad1 ALK-1 ALK-5 Migración celular Angiogénesis Estímulo angiogénico Smad1 ALK-1 Caveolina-1 ____________________________________________________________________Discusión 85 interacciona con caveolina-1, su principal componente. Sin embargo el resultado es distinto ya que potencia la señalización ALK-1/Smad1. Este hecho hace de caveolina-1 una nueva diana para el control de la fisiología vascular. Péptidos del dominio de andamiaje de caveolina-1 podrían desencadenar la respuesta angiogénica en patologías donde su correcto desarrollo estuviera comprometido. Es muy probable que todas estas respuestas a TGF-β tengan lugar en caveolas. Recientemente se detectado la presencia de endoglina en estos microdominios, donde estabiliza la interacción y cooperación de Hsp90 con la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) (Toporsian et al., 2005), función que estaría alterada en las células senescentes por el aumento de endoglina-S. Así, el análisis del papel que tendría endoglina en un modelo integrado por TβR-II, ALK-5, ALK-1 y caveolina-1 es un atractivo proyecto que ayudará a comprender mejor la regulación de la respuesta a TGF-β en células endoteliales. VI. CONCLUSIONES ________________________________________________________________Conclusiones 87 1. Se ha caracterizado la interacción de endoglina con el receptor tipo I de TGF-β ALK-1. Esta interacción tiene lugar en ausencia de ligando tanto por las regiones extracelulares como citoplásmicas de ambos. 2. El estado de activación de ALK-1 no influye en la asociación con endoglina completa, aunque si bien al no asociarse la región citoplásmica de ésta con la forma constitutivamente activada ALK-1 (QD) se sugiere que podría ser sustrato de su actividad serina/treonina-quinasa. 3. Endoglina coopera funcionalmente en la vía de señalización de ALK-1 en células endoteliales, siendo responsable su región comprendida entre Glu26-Arg437. La actividad transcripcional del promotor de Id1, específico de la vía de señalización de ALK-1, así como la de sistemas reporteros dependientes de Smad1 aumentan con la sobreexpresión de endoglina. 4. Endoglina interfiere en la respuesta celular TGF-β/ALK-5. La sobreexpresión de endoglina es capaz de inhibir la actividad transcripcional de sistemas reporteros de la vía de Smad3, mientras que el bloqueo específico de su expresión por siRNA resulta en un significativo aumento de la vía de señalización ALK-5/Smad3. 5. La isoforma corta de endoglina aumenta en células endoteliales senescentes, caracterizadas por un aumento de la actividad β-galactosidasa. 6. Tanto ALK-1 como ALK-5 son capaces de interaccionar con ambas isoformas de endoglina. Sin embargo, endoglina-S muestra una afinidad mucho mayor por ALK-5 que por ALK-1. 7. Endoglina-S es capaz de inclinar la balanza hacia la señalización de ALK-5 en detrimento de la de ALK-1. Este hecho se ve representado por la inducción transcripcional del promotor de PAI-1 y la represión de Id1, respectivamente. Este efecto opuesto al ejercido por la isoforma mayoritaria, endoglina-L, depende de la región citoplásmica. 8. ALK-1 se localiza en caveolas, donde interacciona con caveolina-1. El motivo WAFGLVLW (Trp399-Trp406) presente en el dominio serina/treonina-quinasa de ALK-1 es reconocido por el dominio de andamiaje (scaffolding domain) de caveolina-1. 9. Caveolina-1 promueve la vía de señalización de ALK-1. Esta cooperación funcional depende de la interacción entre las regiones Trp399-Trp406 de ALK-1 y el dominio SD de caveolina-1. VII. BIBLIOGRAFÍA __________________________________________________________________Bibliografía 89 ABDALLA, S. A., GEISTHOFF, U. W., BONNEAU, D., PLAUCHU, H., MCDONALD, J., KENNEDY, S., FAUGHNAN, M. E. & LETARTE, M. (2003). Visceral manifestations in hereditary haemorrhagic telangiectasia type 2. J Med Genet 40, 494-502. ABDALLA, S. A. & LETARTE, M. (2006). Hereditary haemorrhagic telangiectasia: current views on genetics and mechanisms of disease. J Med Genet 43, 97-110. ABDALLA, S. A., PECE-BARBARA, N., VERA, S., TAPIA, E., PÁEZ, E., BERNABÉU, C. & LETARTE, M. (2000). Analysis of ALK-1 and endoglin in newborns from families with hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Hum Mol Genet 9, 1227-37. ADAM, P. J., CLESHAM, G. J. & WEISSBERG, P. L. (1998). Expression of endoglin mRNA and protein in human vascular smooth muscle cells. 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ANEXO _______________________________________________________________________Anexo 106 Las investigaciones de esta tesis han dado lugar a las siguientes publicaciones: 1. BLANCO, F. J., SANTIBÁÑEZ, J. F., GUERRERO-ESTEO, M., LANGA, C., VARY, C. P. & BERNABÉU, C. (2005). Interaction and functional interplay between endoglin and ALK-1, two components of the endothelial transforming growth factor-beta receptor complex. J Cell Physiol 204, 574-84. 2. FERNÁNDEZ-L, A., SANZ-RODRÍGUEZ, F., BLANCO, F. J., BERNABÉU, C. & BOTELLA, L. M. (2006). Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia, a Vascular Dysplasia Affecting the TGF-beta Signaling Pathway. Clin Med Res 4, 66-78. 3. LLORCA, O., TRUJILLO, A., BLANCO, F.J. & BERNABÉU, C. 3D structure of human endoglin, a transmembrane receptor responsible for Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. En preparación. 4. BLANCO, F.J., LANGA, C., LÓPEZ-NOVOA, J.M., QUINTANILLA, M. & BERNABÉU, C. S-endoglin antagonizes L- endoglin regulation of the ALK-5/ALK-1 TGF-beta signalling pathway. En preparación. 5. SANTIBÁÑEZ, J. F., BLANCO, F. J. & BERNABÉU, C. Caveolin-1 interacts and cooperates with the TGF-beta type I receptor ALK-1 in endothelial cell caveolae. En preparación. Tesis Francisco Javier Blanco López ABREVIATURAS INDICE I. INTRODUCCIÓN 1.1. ANGIOGÉNESIS 1.2. LA SUPERFAMILIA DE TGF-β 1.3. RECEPTORES DE TGF-β 1.3.1. Receptor tipo II 1.3.2. Receptores tipo I 1.3.3. Las proteínas Smad. Modelo de señalización del TGF-[beta] 1.4. ENDOGLINA 1.4.1. Distribución celular 1.4.2. Características bioquímicas de endoglina. 1.4.3. Funciones que desempeña endoglina en la célula 1.4.4. Endoglina y ALK-1 como genes responsables de la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria 1.5. CAVEOLAS 1.5.1. Caveolinas 1.5.2. Regulación de la vía de señalización de TGF-[beta] por caveolina-1 II. OBJETIVOS III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. CULTIVOS CELULARES 3.2. ANTICUERPOS 3.3. VECTORES DE EXPRESIÓN Y TRANSFECCIÓN 3.4. CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN EndoEC-FC 3.4.1. Obtención del vector de expresión para EndoEC-Fc 3.4.2. Generación de transfectantes estables productores de la proteína recombinante EndoEC-Fc 3.5. ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR 3.6. CITOMETRÍA DE FLUJO 3.7. MICROSCOPÍA DE INMUNOFLUORESCENCIA 3.8. INMUNOPRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS 3.9. ENSAYOS DE ARRASTRE IN VITRO (PULL-DOWN) 3.10. FRACCIONAMIENTO CELULAR PARA LA OBTENCIÓN DE CAVEOLAS 3.11. ELECTROFORESIS E INMUNODETECCIÓN (WESTERN BLOT) DE PROTEÍNAS 3.12. ESTUDIO DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE TGF-[beta] 3.12.1. Ensayos de actividad reportera 3.12.2. Ensayos de transactivación con el sistema GAL4 3.13. INTERFERENCIA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR PEQUEÑAS MOLÉCULAS DE RNA (KNOCK-DOWN) 3.14. TRANSCRIPCIÓN REVERSA MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RT-PCR) 3.15. ACTIVIDAD β-GALACTOSIDASA ASOCIADA A SENESCENCIA 3.16. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS IV. RESULTADOS 4.1. ENDOGLINA SE ASOCIA DIRECTAMENTE CON ALK-1 4.1.1. La interacción endoglina/ALK-1 implica a sus regiones extracelulares 4.1.2. Los dominios citoplásmicos de endoglina y ALK-1 interaccionan entre sí. 4.2. ENDOGLINA FAVORECE LA SEÑALIZACIÓN DE TGF- [beta] VÍA ALK-1 4.2.1 El dominio extracelular de endoglina promueve la señalización vía ALK-1 4.2.2. Endoglina induce la actividad del promotor de Id1 en respuesta a TGF-[beta] vía ALK-1 4.2.3. La ruta de señalización de TGF-[beta] vía ALK5 se bloquea en presencia de endoglina. 4.2.4. La quimera EndoEC-Fc mimetiza los efectos de la endoglina endógena 4.3. LA ISOFORMA CORTA DE ENDOGLINA ES CAPAZ DE INTERACCIONAR CON LOSRECEPTORES DE TGF-β 4.3.1. Endoglina-S aparece en células senescentes. 4.3.2. La región citoplásmica de endoglina-S interacciona con ALK-5 y ALK-1. 4.4. ENDOGLINA-S MODULA DE FORMA DISTINTA A ENDOGLINA-L LAS VÍAS DESEÑALIZACIÓN TGF-[beta]/ALK-5 Y TGF-[beta]/ALK-1. 4.4.1. La expresión de endoglina-S induce la actividad del promotor de PAI-1 mientras quereprime la del promotor de Id1 en respuesta a TGF-[beta] 4.5. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE ALK-1 EN CAVEOLAS 4.5.1. ALK-1 se detecta en la fracción caveolar de células endoteliales 4.6. ALK-1 INTERACCIONA CON EL DOMINIO DE ANDAMIAJE (SD) DE CAVEOLINA-1 4.7. LA LOCALIZACIÓN DE ALK-1 EN CAVEOLAS INDUCE SU VÍA DE SEÑALIZACIÓN 4.7.1. Caveolina-1 estimula la vía de señalización TGF-[beta]/ALK-1 4.7.2. La cooperación de caveolina-1 sobre la vía TGF-[beta]/ALK-1 depende de su dominio deandamiaje. 4.7.3. El bloqueo específico de caveolina-1 por siRNA reduce la señalización de ALK-1 V. DISCUSIÓN 5.1. LA INTERACCIÓN DE ENDOGLINA CON ALK-1 FAVORECE SU VÍA DE SEÑALIZACIÓN 5.1.1. Disección y consecuencias de la interacción endoglina/ALK-1 5.1.2. ¿ALK-5 o ALK-1? 5.2. LA ISOFORMA ENDOGLINA-S ANTAGONIZA EL EFECTO DE ENDOGLINA-L EN LAVÍA DE SEÑALIZACIÓN DE TGF-[beta] 5.2.1. Papel de endoglina-S en la senescencia endotelial. 5.3. CAVEOLINA-1 INTERACCIONA CON ALK-1 Y POTENCIA SU VÍA DE SEÑALIZACIÓN 5.3.1. Paralelismo funcional entre ALK-1 y caveolina-1 5.4. COMENTARIO FINAL Y PERSPECTIVAS VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA VIII. ANEXO