6’) ~—1 UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DPTO.BIOLOGíA ANIMAL II 1101 11111 U 10111 U ¡liii*3 Q953946Q~ UNIVERSIDAD COMPLUTENSE HIPERTENSIONARTERIAL INDUCIDA POR DEPRIVACION SOCIAL EN RATAS: IMPLICACION DE LOS SISTEMASNORADRENERGICOY OPIOII)E CENTRALES. Y B0 Directoras de TesisDoctoral ‘te Dña.AngelaAlsasnadel Valle Prof. Titular de Farmacología FacultaddeMedicina UCM Doctorando D onié ColaboradorCientífico CSIC W SoledadAlonso Madrid, 1995. FACULTAD DE MEDICINA CIUDAD UNIVERSITARIA 26040 MADRID TELE. 394 1464 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGíA ANGELA ALSASUA DEL VALLE, Profesora Titular de Farmacología de la Facultad de Medicina, PAZ FERNANDEZ TOME Colaborador Científico del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y ROSA MARIA ARAHUETES PORTERO, Profesora Titular de Fisiología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutensede Madrid, como Directoras y Ponente, CERTIFICAN: Que el trabajo titulado “HIPERJ3ENSION ARTERIAL INDUCIDA POR DEPRIVACION SOCIAL EN RATAS: IMPLICACION DE LOS SISTEMAS NORADRENERGICO Y OPIOIDE CENTRALES “ presentado por Dfia. María Soledad Alonso Domínguez ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina y reune los requisitos necesarios para optar al Título de Doctor. Madrid, Mayo de 1995. Fdo. Angela Alsasua Át C~n-Ck~ C~ Pdo .Paz Fernández-Tomé Pdo tibsa Maria Arahii~es AGRADECIMIENTOS Debo iniciar esta relación de sinceros agradecimientos refiriéndome a quien ha sido la protagonistade toda la actividadqueestelibro representa:la Profesora AngelaAlsasuadel Valle. En primer lugar, debo solicitar de ella su benevolencia por aquellas actitudes mías que, siendo fruto de la inexperiencia, han representado para ella un suplemento a la actividad, ya de por si extenuante, que implicó dirigir esta Tesis Doctoral. A continuación, he de expresarle mi más profUndo agradecimiento por la entrega y absoluta dedicación que ha mostrado para que obtuviese una excelente formación en un campo al que es tan dificil acceder Como CS el de la investigación. De su mano he ido atesorando en estos años conocimientos que han sido fundamentales en ini formación corno persona y como investigadora. De sus valores personales debo destacar una inaccesibLe, por exigente, capacidad de trabajo, su vocación al servicio de la Universidad y de todos los valores que esta institución representa y la gran ilusión que sabe transmitir, máxime, en aquellas circunstancias cuando la apatía impera. Por todas las razones expuestas la quiero expresar aqui mi cariño y amistad que de forma tan paciente se supo ganar y es mi deseo que las personas que estan iniciando la etapa que para mi tinaliza dispongan de las mismas oportunidades que a mi me ha concedido. La Doctora DHa. Paz Fernández-Tomé posee, en mi concepto, una personalidad que es la síntesis de una vida entregada al estudio, el trabajo y la creación, por esta razón y, gracias a sus exigencias, he aprendido cual es el camino que debo emprender para alcanzar su categoría humana y profesional. Todos los valores que me ha transmitido durante estos años no se pueden plasmar en estas breves lineas aunque sí mi protbndo reconocimiento y afecto, La Profesora DHa. RosaMaría Arahuetesdel Departamentode Biología animal II de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UCM ha tenido la gentileza de tutelary participaren la elaboraciónde estetrabajo experimental.Además, me ha enseñadocualesson las virtudesqueha de poseeren el momentoactual tina profesorauniversitariaparaconseguirquelos resultadosseanfruto de una actividadmultidisciplinaria. Al ProfesorPedroLorenzo,director del DepartamentodeFarmacología de la Facultadde Medicina de la UCM, debola excelenteacogidapararealizar este trabajo experimentalen el Departamentoque con tanta eficacia, rigor, ilusión y cariño dirige. Asimismo, inc ofreció en todo momento su apoyo incondicional y el ánimo necesario para que no desfalleciera en aquellos momentosquefrieron máscriticos en las sucesivasetapasdeestaobra. AL ProfesorJoseAngel Fuentesmi agradecimentopor habermehecho recipendariadel equipo que durantelos años ha desarrollado esta linea de investigación. Conocera Itziar Aldamendi Gomendioha sido para mi un inolvidable privilegio. Representaun dificil equilibrio entreel rigor y la responsabilidad profesional con la categoría humana. Su vitalida, seriedad, coherencia, valentía y coraje para valorar y decir lo que piensa, pese a quien pese, unido a un cariño y Lealtad que superan todas las pruebas son cualidades propias de una persona excepcional. A Lucia Parra quiero expresarle mi especial agradecimiento y cariño, por haber compartido conmigo tanto los buenos como los malos momentos que han acaecido durante los años que hemos trabajado juntas. Supo transmitirme su experiencia, su seriedad en el trabajo y su capacidad investigadora cuando yo me incorporé al Departamento. A Luis Gonzalez y a Guillermo Rodriguez por su apoyo incondicional y porque me han demostrado una verdadera amistad. A todos mis compañeros del Departamento de Farmacología por su cordial acogida, porque han conseguido hacerme especialmenteagradableeste periodo de mi formación y porque el hacerme participe de todas sus actividades “extraprofesionales”ha conseguido que la diversión compartida hiciera inés llevaderoslos numerososmomentosde desánimo.Portodo ello gracias. A todo el personaldel Departamento,muy especialmentea Rubény M~ Luisapor la ayudaquemehandispensadoentodo momento. Por último, quisiera expresarini más profundo agradecimientoa ini familia por el cariño y apoyo que me han ofrecido siempre. Graciasa su continuoesfuerzodurantetodosestosañoshe podido formarmetanto personal como cientificamente.Nuncapodréagradecerleslo suficiente la confianzaque siempremehandemostrado.Por todoello, gracias. A todosgracias. A mispadres. A mi hermana. INTRODUCCION 1. ESTRES 1. PERSPECTIVA HISTORICA. DEFINICION 2 2. MODELOS, ANIMALES Y PARAMETROS RELACIONADOS CON EL ESTRES. 3 3. SELECCION E INTERES DEL MODELO DE DEPRIVACION SOCIAL. 5 4. RESPUESTAFISIOLOGICA AL ESTRES 5 4.1. Activació¡i del sistemasimpatoadrenal 6 4.1.a. Sistemacatecolaminérgico 7 4.1 .a. 1. Síntesisde catecolaminas 7 4. 1 .a.2. Almacenamientoy liberación 9 4. 1.a.3. Receptoresadrenérgicos 9 4.1 .a.4. Vias catecolaminérgicasen el SNC 11 4. laS.Metabolismode las catecolaminas 16 4. l.a.6. Efectosfisiológicosde lascatecolaminas 16 4.1.a.7. Metabolismoy sinergismohormonal 17 4.2. Sistema opioidc 18 4.2.a.Biogénesisde los péptidos opioides 19 4.2.b.Distribución de los péptidos opioides en el sistemanerviosocentral. 20 4.2.c. Biosíntesis, liberación y degradación de los 1] péptidosopioides 22 4.2,d.Receptoresopioides 23 4.2.d.1. Distribución y significadofisiológico de los receptoresopioides 24 4.2.e. Mecanismode acciónde los péptidosopioides 28 4.2.f. Péptidosopioidesy sistemanerviosoautónomo: Acciones sobre el sistema cardiovascular 30 4.2.g. Activación del sistema opiolde durante el estrás 3 1 4.3. Activación del eje H¡potélamo-hipófiso-adreflfil 33 4.3.a. Hormona liberadora de corticotropina 34 4.3.b. Hormona adrenocorticotropa 36 4.3.c. Glucocorticoides 37 4.4. Respuestade faseaguda 37 4.4. Respuestade faseaguda 37 II. HII>ERTENSION ARTERIAL 1. CLASH?ICACION ETIOLÓGICA DE LA HIPERTENSION 2. HIPERTENSION ESENCIAL. ETIOPATOGENESIS 3. ESTilES E IJJPERTENSION PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO MATERIAL Y METODOS L MATERIAL II. FARMACOS Y PRODUCTOS QUIMICOS UTILIZADOS III. ANIMALES DE EXPERIMENTACION IV. LESION DEL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL (HNV) CON 6-HIDROXIDOPAMINA y. MEDIDA INDIRECTA DE LA PRESION ARTERIAL (TAIL-CUFF) VI. MODELO DE ESTRESPOR DEPRIVACION SOCIAL VII. DETERMINACIONES BIOQUIMICAS 1. DETERMINACION DE CATECOLAMUNAS EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL 1.1.Preparación y extraccionde muestras 1.2.Condicionescromatográficas 1.3.Cuantificacióny análisiscJe los resultados 2. ENSAYOS DE FIJACIÓN (“BINDING”) 2.1.Metodologíade los ensayosde fijación a receptores opioides (“binding”) ji 39 39 40 41 45 47 47 48 48 49 50 52 51 5] 52 53 53 a 2.1.a.Preparaciónde las membranas 54 2.1.b. Ensayode fijación a receptoresopioides 5y ¡1 54 2.2.Valoración de la proteina 55 VIII. ANALISIS ESTADíSTICO DE LOS RESULTADOS 56 RESULTADOS 1. EVOLUCION DEL PESOCORPORAL 1. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HNV POR 6OHDA 58 2. EFECTO DEL AISLAMIENTO {DEPR1VACION SOCIAL) 58 3. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HNV CON 6OHDA Y POSTERIOR AISLAMIENTO 58 II. EVOLIJCION DE LA PRiESION ARTERIAL 1. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HNV POR ÓOHDA 58 2. EFECTO DEL AISLAMIENTO (DEPRIVACION SOCIAL) 64 3. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HM’ CON 6OHDA Y POSTERIORAISLAMIENTO 64 III. ESTUDIO DE LA CONCENTRACION DE CATECOLAMINAS EN EL SISTEMA NERVIOS CENTRAL (SNC) 1. ANALISIS DE LAS CATECOLAMINAS DEL SNC EN ANIMALES SOMETIDOS A LESION DEL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL CON 6OHDA 65 1.1. Hipotálamo 65 1.2. Bulbo raquídeo 65 1.3. Médula espinal 67 2. ANALISIS DE LOS NIVELES DE CATECOLAMINAS EN ANIMALES SOMETIDOS A AISLAMIENTO 67 iii 2.1. Hipotálamo 67 2.2. Bulbo raquídeo 2.3. Médula espinal 3.ANALISIS DE LAS CATECOLAMIINAS DEL SNC EN ANIMALES LESIONADOSCON GOHDA EN EL HNV Y SOMETIDOS A AISLAMIENTO 3.1.Hipotálamo 3.2. Bulbo raquídeo 3.3.Médula espinal IV. RESULTADOS OBTENIDOS EN LA FIJACION AL RECEPTOR 5 OPIOIDE 1. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HNV POR ÓOHDA SOBRE RECEPTORES 5 OPIOIiDES 1.1.Hipotálamo 1.2. Hipocampo 1.3. Núcleo estriado 1.4. Bulbo raquídeo 1.5. Corteza cerebral 1.6. Médula espinal 2. EFECTO DEL AISLAMIENTO SOBRE LOS RECEPTORES 5 OPIOIOES 2.1. Hipotálamo 2.2. Hipocampo 2.3. Núcleo estriado 2.4. Bulbo raquídeo 2.5. Corteza cerebral 71 71 74 74 76 76 76 76 76 79 79 79 88 88 88 88 93 93 93 93 iv 2.6. Médula espinal 102 3. EFECTO DE LA LESION CON 6OHDA DEL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL ASOCIADA A AISLAMIENTO SOBRE LOS RECEPTORES 5 OPIOHIES 3.1. Hipotálamo 3.2. Hipocampo 3.3. Núcleo estriado 3.4. Bulbo raquideo 3,5. Corteza cerebral 3.6. Médula espinal V. RESULTADOS OBTENIDOS EN ix OPIOIDE EL ESTUDIO DEL RECEPTOR 115 1. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL CON 6OHDA SOBRE LOS RECEPTORES ~.t BNV OPIOIDES 1.1. Hipotálamo 1.2. Hipocampo 1.3. Nueleoestriado 1.4. Bulbo raquideo 1.5. Corteza cerebral 1.6. Médula espinal 2. EFECTO DEL AISLAMIENTO SOBRE LOS RECEPTORES p OPIOIDES 2.1. Hipotálamo 2.2. Hipocampo 2.3, Núc¡eoestriado 115 115 115 115 120 120 120 129 129 129 129 102 102 108 108 108 111 111 y 2.4. Bulbo raquídeo 136 2.5. Cortezacerebral 2.6. Médulaespinal 3. EFECTO DE LA LESION CON 6OHDA DEL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL ASOCIADO A AISLAMIENTO SOBRE LOS RECEPTORES p OPIOII)ES 3.1. Hipotálamo 3.2. Hipocampo 3.3. Núcleo estriado 3.4. Bulbo raquídeo 3.5. Corteza cerebral 3.6. Médula espinal 1. CARACTERIZACION DE LA RESPUESTAHIPERTENSIVA AL ESTRESPRODUCIDO POR DEPRIVACION SOCIAL II. EFECTO DE LA LESION DEL HiNV SOBRE LA PRESION ARTERIAL III. VALORACION DE CATECOLAMINÁS EN AREAS CEREBRALES 1. CATECOLAMINAS EN BATAS SOMETIDAS A AISLAMIENTO 2. CATECOLAMU4ASEN RATAS CON LESION DEL HNV 3. CATECOLAMINAS EN RATAS SOMETIDAS A AISLAMIENTO Y CON LESION DEL HNV IV. VARIACIONES EN EL SISTEMA OPIOIDE CENTRAL 1. DEBIDAS AL AISLAMIENTO 136 136 143 143 143 143 146 146 149 153 154 155 157 158 159 DISCUSION vi 2. EFECTO DE LA LESION DEL HNV 163 3. EFECTO DEL AISLAMIENTO ASOCIADO A LA LESION DEL HNV 164 CONCLUSIONES 167 BIBLIOGRAFIA 169 II vii ABREVIATURAS Ach: acetilcolina ACTH: adenocorticotropina Ad: adrenalina AMP0: Adenosin monofosfato cíclico ATP: adenosin trifosfato CA: catecolaminas COMT: catecol-orto-metil-transferasa CRF: factor liberadorde corticotropina CRI-I: hormonaliberadorade corticotropina CVLB: zonacaudalventrolateraldel bulbo raquídeo DA: dopamina DBH: dopamina-beta-hidroxilasa DE: desviación estandar DNA: acido desoxirribonucleico DOPA: dihidroxifenil-alanina ES: estadísticamentesignificativo FNMT: feniletanol-aniina-N-metiltransferasa OH: 1-lormonade crecimiento HHA: eje hipotalamo-hipofiso-adrenal I-IND: Haznoradrenérgicodorsal HNV: haz noradrenérgicoventral ¡cv.: intracerebroventricular Ko: constantede disociación LC: locusceruleus MAO: monoaminooxidasa MII-IPO: 3-metoxi-4-hidroxi-feniletilenglicol NTS: núcleodel tractosolitario 601-IDA: 6-hidroxidopamina PA: presiónarterial POMC: propiornelanocortina RNA: ácido ribonucleico RNA~1: ácidoribonucleicomensajero RVLB: zonarostralventrolateraldel bulbo raquideo SNC: sistemanerviosocentral SNS: sistemanervisosimpático TH:tirosinabidroxilasa TSH: Hormonaestimulantede tirotropina VMA: acidovanilmandélico ~: mediaaritmética viii INTRODUCCION Introducción 1. ESTRES 1. PERSPECTIVA HISTORICA. DEFINICION. El concepto de estrásaparecedesdetiemposhistóricosremotos,asociado estrechamente con el término daño o lesión. Ya el filósofo natural griego Empédocles(500-430 a.c.> sosteníaque toda materia estabaconstituida por elementosesenciales(tierra, aire, fuego y agua) y de cualidades(calor, frío, sequedady humedad)y que seencontrabanentreellos a favor o en contra. Este conceptode equilibrio lo extendióHipócrates(460-375 a.c.) a la salud.Definició ésta como un equilibrio armoniosode elementosy cualidadesde la vida, La enfermedad,en contraste,era la consecuencianaturaldel desequilibrio.Hipócrates tambiénreconociólas respuestasadaptativascorporalesal estrésestandoestas respuestasinscritasalas intrínsecas“fuerzasde la naturaleza”.(Singer,1941) Sydenham(1624-1689)avanzómásen el conceptodequela enfermedades la manifestación de la reacción del cuerpo a las fuerzas externas. Sin embargofijé ClaudeBernard(1813-1878)quien desarrolloel término “mileu interieur” (medio interno), concepto por el cual los organismosvivientes estabilizansusambientesinternos.(Cbrousosy cols, 1988) Estaformulaciónclásicasirvió paraprepararel trabajopreliminarde Walter Cannon(1871-1945)quienacuñéel término“homeostasis”.Susenseñanzasfueron aprovechadasy desarrolladaspor Hans Selye, quien introdujo el conceptode “síndromegeneralde adaptación”,por el cual todoslos organismosrespondenal estrés.Describióunasecuenciade cambiospatológicosoriginadosen el organismo cuandoésteessometidoa diversosestímulosnocivos.Estarespuestauniversalal estrés se acompañade una hiperpiasia adrenal y respuestasadaptativasno específicas.Selyetambiénsugirió queun estrésno remitentepor si mismo podría darcomoresultadoenfermedadesde adaptación. Selyedefinió tresfasesen e! estrésa lasquedenominérespectivamente:1.- reacciónde alarma, caracterizadapor hipertrofiaadrenal,ulceraciónde la mucosa y atrofiadel timo y tejidoslinfoides; 2.- fasede resistenciao adaptación,cuyas manifestacionespuedenser opuestasa las descritasen el caso de la reacciónde alarmay 3.- (ase de agotamiento, la cual sobreviene cuando la intensidad o la duracióndel estráses excesiva. Por todo ello, Selye definió el estréscoma la respuestainespecíficadel organismoanteun aumentode las exigenciasdel medio ambiente,y “estresantes”alos agentesresponsablesdedicharespuesta. A pesar de lo señalado, actualmente se han ido acumulando una sede de datosqueindican la existenciade un ciertogradode especificidaden la respuesta al estrás.J. Manson(1971) criticó el conceptode inespecificidadinherentea la teoría de Selye, y fié el primero en concederuna adecuadaimportanciaa los componentespsicológicasdel estrás, En definitiva, el estrásconstituyeuna alteracióndel procesohomeostático normal cuyo fin esfavorecerla adaptaciónal entorno,proporcionandoestrategias adaptativas al individuo. -2- Introducción La respuesta al estrés presenta un mecanismo evolutivo muy conservado por el cual las células son capaces de responder y de defenderse de los posibles cambiosabruptosy aversivosqueseproduzcanen su ambiente. El organismorespondeal estrásregulandoel mediointerno, manteniéndolo en unos niveles de tbncionalidad adecuadosque posibilitan su supervivencia. Cuando las circunstanciasestresantesdesaparecen,el organismo vuelve a recuperarsu anteriorestadode reposo,aunquesi la respuestaesexcesivamente intensao duraderapuedeque ya no seaposible el retomo a la situaciónbasal configurámdoseentoncesun nuevoequilibrio biológico. (Axelrody Reisine,1984; Welch, 1992) 2. MODELOS, ANIMALES Y PARAMETROSRELACIONADOSCON El ESTRES. Los animalesde laboratorio han sido indispensablescomo modelosen el estudiodel estrás.Son numerososlos modelosexperimentalesdiseftadoscon el fin de estudiar el estrás.Estos se generan de manera sencilla en el animal de laboratorio. A pesar de ello, cuando el Fm último es obtener resultados extrapolablesal serhumanohayqueconsideraralgunaslimitacionesquerestringen en granmedidasuutilización. Se podrían hacer múltiples clasificacionesdel estrásy los métodospara producirlo, dependiendode la intensidaddel estimulo estresante,la duración,la edad y el sexo de los sujetos estudiados,etc. Existen también animales de experimentación,fundamentalmenteratas,quehansido manipuladasgeneticamenté pararesponderde formasdistintasal estrás, De estamanerasepuededistinguir entreestrás: 1, Agudoo crónico. 2, Leveo intenso 3. Constanteo intermitente 4. Psicológicoo fisico 5. Farmacológico Los métodosmás frecuentementeutilizados son los fisicos, entre los que se encuentran: 1. Frío 2. Inmovilización 3. Aislamiento 4. Natación forzada 5. Ejercicioenrueda 6. Deprivación de comida 7. Bebidahipertónica a. Choqueeléctricode¡a cola(tail-shock) 9. Choqueeléctricoen laspatas(Foot shoclc) -3- introducción También hay modelos experimentales que utilizan factores que provocan alteraciones en el componente social o en la esferaemocionaldelanimal como: 1. Hacinamiento (Armario y cols, 1984) 2. Aislamiento o deprivación social (Gardiner y Bennett, 1977) 3. Estimulación audiovisual (Galeno y cols, 1984) 4. Estrés psicosocial-Agresividad(Adamsy Blizard, 1987) 5. Aislamiento de las crías de la madre en el periodo de lactancia (Kehoey cols, 1990) Dentro de los métodos farmacológicos los másutilizadosson: 1. Inyecciones intraperitoneales de Yohimbina, Ketamina, M-c!oro- fenilpiperazina,suerosalinohipertónico,formaldehido, 2. Inyeccionesintracerebroventriculares(icv) de CRH o interleucinas(It- 1,11-6) 3. Inoculaciónde gérmenescomoE. coli o H. influen.zae 4. Aspiración de eter Para la valoracióndel grado de estrás se miden infinidad de parámetrosque comprendenrespuestaspsicológicasy fisiológicas,entrelas queseencuentran: 1. Alteracionesde la conductay actividadlocomotora 2. Incrementosde la presiónarterial 3. Variacionesde! eje lIRA (medidasde cortisol plasmático,liberaciónde ACTH, beta-endorfinasy mRNA de POMC) 4. Variacionesdel eje simpático adrenal(medidasde catecolaminasy sus metabolitos plasmáticos, urinarios y cerebrales) 5. La hiperactividad adrenérgicaafecta a otros componentescelulares como linfoquinas y la actividad citotóxica de células NK y a los receptores para linfoquinas 6. Variaciones de otros péptidos (prolactina, NPY, sustanciaP, factores de crecimiento nervioso) 7. Alteraciónde la flinción reproductora 8, Desórdenesgastrointestinales,úlceras (Sutanto y DeKloet, 1994) Las ratasque han sido manipuladasgenéticamenterespondende distinta manera al estrás con parámetrosespecíficos de emocionalidad y muestran diferenciasfisiológicasendocrinasy no endocrinas,de conductay de respuestaa los fármacos.Algunasdelas quehansidodesarrolladassonlassiguientes: 1. Rl-LA (RomanHigh Avoidance)y RLA (RomanLow Avoidance),que presentancambios de conductay del grado de conscienciaal ser sometidas a pruebas de estrás. Son análogos a los humanosmuy ansiososy a personalidadesreprimidas.Presentandiferenciasen el eje HIJA. 2. APOSUS (Apomorfina susceptibles), APOLINUS (Apomorfina no susceptibles) que presentan diferentes respuestas del eje HIJA. En distintosensayosunastiendena la huiday otrasaquedarsequietas.Esta última respuestasecorrelacionaconla actividadroedorafacilitadapor el agonista dopaminérgico apomorfina. -4- Introducción 3. Alteradas inmunológicamente LEW/N y que padecen distintas enfermedadesautoinmunes.Presentanrespuestasdisminuidasa ACTH y corticosterona. 4. SHR (ratasgenéticamentehipertensas),son hiperactivasy presentan respuestasanormalesa ACTH, CRH y AVP. Sus controleslas WKY son menosactivas pero sin embargo presentanmayor incidencia de úlceras gastroduodenales. (Sutanto y De Kloet, 1994) 3. SELECCION E 1I~4TERES DEL MODELO DE DEPRIVACION SOCIAL Para la elaboración del presentetrabajo se ha elegido como método inductor de estrás la deprivación social o aislamiento social. La producción de estréspor estemétodoestábasadoen el caractermarcadamentegregarioatribuido a los roedores.La rata es una especieideal para la aplicaciónde estemétodo porque a la condición de su caractergregário se suma un comportamiento territorial muy similar al observado en primates. (Brain, 1985) El empleo de este modelo de estrás permite en primer lugar una aplicación homogéneadel estimuloa todos los individuos de la muestra,ademásconstituye un estimulode caractermoderado,esencialmentepsicológico, lo quepermite, en cierta manera, equipararlo con determinadas situaciones de estrás que afectan al ser humanoposibilitandola extrapolaciónde los resultadosobtenidos. Así, en estudios realizados en nuestro laboratorio, en ratas aisladas, se ha constatadoque la elevación de la presión arterial observadaes reversible por interrupción del estímuloaversivo(resocialización),sólo durantela faseinicial del aislamiento(periodo menor de 30 días), ya que cuando las ratas alcanzanun periododetiempode deprivaciónsocial superioralos 30 días, la resocializaciónya no es capaz de restaurar en dichos animales los valores de presión sistólica elevada. Paralelamente,otros estudiosdemostrabanque si se administrabanaloxonaa las ratas,dicha sustanciarevierteel efecto sobre la presiónarterial solamenteen las ratas socialmente deprivadasduranteun brevetiempo, no en aquellassometidasa aislamiento por un tiempo superior a 30 días. (Florentinoy cols, 1987). Por último se ha demostradoque en situacionesde estráspsicológicose produceunaactivacióndel sistemaoploide paraleloa un incrementoen la presión arterial (McCubbin y cols, 1988); así pués resulta un modelo interesantede hipertensión experimentalpermitiéndonosestudiar los efectos que provoca el estrás psicológico sobre el sistema cardiovascular, efectos aun escasamente conocidos. 4. RESPUESTA FISIOLOGICA AL ESTIlES La respuesta fisiológica al estrás difiere cualitativamente dependiendo de la duración del mismo. Los mecanismos que permiten la reacción inicial no son los mismos que intervienen cuando el organismo se ve sometido a un estrás 1 4 y y -5- Introducción prolongado, Así pués, en las formas de estrésagudo, donde la supervivencia depende de una reacción rápida de emergencia se precisa de una respuesta rápida y breve, que se logra mediante la activación de funciones nerviosas o neuroendocrinas;mientrasqueen las situacionesde estráscrónico, denominadas por Selye ‘Tase de resistencia”, en las que resulta más adecuada la adaptación al estímulo, se produce una activación o respuesta a largo píazo, de acción más persistentecomola que lleva a caboel sistema endocrino, A pesar de ello, tanto en el estrás agudo como en el crónico la alteración inicial queprovocael estímuloestresanteesunaactivacióndel SNC, el cual esel encargado de poner en marcha los mecanismos que se mencionaron anteriormente. En último lugar se presentarla la denominada ‘Tase de agotamiento” la cual sobrevienesi la intensidado duración del estráses excesiva,produciéndoseen consecuencia un agotamiento de la respuesta y unadisminuciónde la resistencia del individuo. 4.1. ACTIVACIÓN DEL SISTEMA SIMPATOADRENAL La reacciónde emergenciao de alarma, asociada a formas de estrás agudo, desencadena la acción conjunta del sistema nerviososimpáticoy de las hormonas liberadasdesdela médulaadrenal,esdecirde la activacióndel denominadosistema simpatoadrenal.La activación del sistema simpático da como resultado un incremento en el ritmo cardiaco,así como en la contractibilidad vascular y a dilataciónde determinadoslechosvascularesqueestánaparentementeimplicados en la supervivenciainherentea las situacionesde “lucha y huida”, Ademásel tronco bronquial sedilata, hay un incrementoen el campovisual y determinadas fUncionesvisceralesno esencialescomoel peristaltismointestinaly la evacuación de la vejiga urinaria se ven inhibidas. En contraste,el incrementodel tono parasimpáticoestimula la actividad visceral de los tractos gastrointestinalesy genitourinarios,controla la pupila y produce descenso del ritmo cardiaco. La función integrativa del sistema nervioso autónomo fié reconocida tanto por Bernard como por Cannon quienes apreciaron su importancia en el mantenimientode la homeostasis,Estas funciones incluyen la regulaciónde la respiración, la circulación, la digestión y la temperatura corporal, así como una numerosa cantidad de interacciones con otros sistemas endocrinos. El neurotransmisorde las fibraspreganglionaresdel SNA es la acetilcolina (Ach), mientrasqueel neurotransnnsorparalas fibras nerviosaspostganglionares esla noradrenalina(NA) y para el sistemanerviosoparasimpáticoesla acetilcolina. (Leficowitz y cols, 1990) La estimulación simpática da lugar a un incremento en la actividad tónica de los nervios simpáticoscon el consiguienteaumentode la liberación de1-JA en los terminales nerviosos. La médula adrenal es embriológicamenteanálogaa los ganglios simpáticosperiféricos. Las células medularescromafinesposeenfibras -6- Introducción nerviosas rudimentarias y la capacidad de sintetizar, almacenar y secretar catecolaniinas.(Cryer, 1980) Además, la estimulación del nervio esplácnicoprovocala activaciónde las célulascromafinesde la médulaadrenal,las cualesliberan a la sangreunamezcla de NA, AID y distintos fragmentos de péptidos opioides procedentesdel procesamientode la preproencefalina, que se encuentran almacenados en las vesículas junto conlascatecolaminas.(Viveros y cols, 1979) Las consecuenciasfisiológicas de la liberación de estas sustanciasson múltiples, afectandoa la mayoría de los sistemasorgánicos como el sistema cardiovascular,dondeseapreciaun aumentotanto de la frecuenciacardiacacomo del flujo sanguíneoal músculoesqueléticoacompafladoademásdeun aumentode la PA; el sistemagastrointestinalen dondeseobservaun aumentode ¡a secrecióny la motilidadgástrica;o el sistemainmunitarioen el cualseconstataun aumentoen suactividad.(Vogel 1987;Udelsmany cols 1994> 4.1.a. SistemaCatecolaminéraico 4.1.a.1. SíntesisdeCatecolanfinas Las catecolaminasse forman en el cerebro, células cromafines, nervios simpáticosy cápsulassuprarrenalesa partir de su aminoácidoprecursor,la tirosina, medianteuna seriede pasosenzimáticosdescritosen primer lugar por Blaschko (1939). La tirosina se encuentraen el torrente sanguineoy es captadapor el cerebroy otros tejidos inervadospor el sistemanerviososimpático(SNS)por un mecanismode transponeactivo, Una vez dentro de la terminaciónnerviosava a sufrir unaseriede transformacionesbioquímicasqueconducena la formaciónde NA, DA y AID en el cerebro, dependiendo de la disponibilidad de los enzimas dopamina-beta-hidroxilasa(DBH) y de feniletanol-amina-N-metiltransf’erasa (FNMT). (Esquema1) La tirosinapuedetambiénformarsea partir de la fenilalaninade la dietapor mediode unahidroxilasa. La tirosina hidroxilasa(TE) convienea la tirosina en dihidroxifenil-alanina (DOPA). Mediante una decarboxilasa(DOPA decarboxilasa)la DOPA se transformaen dopaminay ésta en noradrenalinapor medio del enzimaDBH. El enzima limitante de la síntesis de noradrenalinaes la tirosina-hidroxilasa, es estercoespecífico,requiereO~ , Fe~ y comocofactortetrahidropterma. El gen humanopara la TE ha sido donadoy codifica varios niRNA que sonheterogéneos. Estoscuatroenzimasno se encuentranen todaslas células,cuandoestán disponibles se forma AD comoocurre con las células cromafinesde la médula suprarrenaly algunasregionescerebrales.Las que carecende FNMT producen noradrenalina,como las neuronassimpáticaspostganglionares,algunas células cromatines de la médulasuprarrenaly numerosasneuronasdel SNC. La DA se forma en aquellas células que carecen de DBH y FN?MT como neuronas del SNC y algunas células periféricas. -7- H * O C—CH—NH., HO H COOH H HO C—CH—NH2 () 1 HO H COOH HO HO H C—CH.,—NH9 H H HO C—CH9—NH., (JI — — HO OH H HO C—CH.,—N () 1 - HO \—‘ OH CH:~ ROSINA~( %~Z~ Tetrahldrotaiapteflna DOPA II Docarboxilasa de los arnfnoácjdos FÓstago L-arcmttcos) )piridoxal DOPAMINA DopaminaI ( &HydroxílasaAswrtalo ) NORADRENALINA 1 Feniletanolamlna- N-Metfltrnnsterssa S-adenosfimeuonbaa H ADRENALINA ESQUEMA 1 ) Biosíntesisde Catecolaminas.Tomadade Goodmany Gilman (1991). Introducción La síntesis de catecolaniinasestáreguladamediante un mecanismode retroalimentación negativa por el incrementoo disminuciónde los nivelesde CA. La actividaddel enzimaFINMT estáreguladaporlos glucocorticoides.(Pohopecky ycols 1971) El incrementodel flujo simpático activa a la tirosina-hidroxilasa,pero además, recientes estudios han demostrado la relación de una fosforilación medianteunacalmodulinaCa~~dependienteen el procesode activacióndel enzima (Goldsteiny Oreen, 1987). Ademásdel control inmediatoejercidopor la descarga simpáticahay una estimulacióna largo plazo que se creeque es debidaa una inducción de la TW pero que ademásse acompaflade un incremento en la formación de DBH sin incrementossignificativos en la formación de DOPA- decarboxilasa,Sehapropuestoqueestosenzimasderivande un gencomúny por lo tantopuedensercorregulados(Coopery cols, 1991) Ensituacionespatológicaso farmacológicasestefactorlimitante puedepasar a dependerde la DBH comoocurreconel usode reserpina. 4.1.a.2. Almacenamientoy liberación. Las catecolaminas(CA) sealmacenanen vesículasde almacenamientoque contienenademásATP en una proporción CA-ATP de 4:1, el enzimaDBH y cromogranina.En la médula adrenal las CA se encuentrancoalmacenadascon encefalinas.Dentrode lasvesículas,las CA estánprotegidasde la destrucciónpor monoamino-oxidasasMAO (que sonenzimasintraneuronales>,en ellasseoxidala DA a NA y cuando el neurotransmisorva a ser liberado se aproximana la membranapresináptica,se fusionancon ella y seproducela liberación de CA por un mecanismode exocitosis quees Catdependiente.No solo Ja concentración local de CA en el espaciointersináptico¡nodulasu propia liberacióninteractuando conreceptorespresinápticos,Estánimplicadosen la regulaciónde la liberaciónlas prostaglandinas, Ach, aminas vasoactivas y polipéptidos tales como angiotensina II. 4.1.a.3. Receptoresadrenérgicos. La NA y DA interaccionan con receptores específicos que seencuentranen las membranascelulares y que se conocen con el nombre de receptores adrenérgicos. La respuestaquesigue a la estimulacióndetodos los tipos de receptores adrenérgicosseproducea través de proteínasO que van a generarsegundos mensajerosy/ó aactivarcanalesiónicos. Los receptoresadrenérgicosfueron clasificadospor Ahlquist en 1948 en dos clases:a y 13. posterionnentese subdividieronlos receptoresa en a~ y «a considerándose los a¡ como postsinápticos y responsablesde los efectos farmacológicos de NA y AD y los «2 como presinápticos debido a que su -9- Introducción estimulacióneracapazde inhibir la liberaciónde NA provocadapor estimulación de fibras noradrenérgicas. Su existencia fué confirmada por la aparición de antegomstas específicos (Prazosin para a1 y Yohimbina para «2) pero estafamilia de receptoreses mucho máscomplejaya que últimamentese han caracterizado nuevos subtipos (alA, cxiu,czic, EX2A, a2B y «2C). La estimulación del receptor a.1 activa el sistema de la fosfolipasa C que induce la formación de inositol trifosfato y diacilglicerol asociadosamboscon movilización del C&~ intracelular,Esteregulaunaserie de protein-quinasasentre las que se encuentra la proteinquinasa C y proteinquinasas sensibles a calmodulina. La estimulacióndel receptora2 inhibea la adenil-ciclasainteractuandocon una proteina O denominadaO~. Disminuyen las concentracionesintracelularesde AIvIW y el estado de activación de la protein-quinasaAMP-dependientetambién disminuye. Los receptoresJ3 se subdividieron inicialmente en dos grupos 13í y 132. Recientementese ha identificado un nuevo subtipo, los receptores [33 que predominan en el tejido adiposo, Todos los receptores f3-adrenérgicosestimulan a la adenilciclasa. La interaccióncon el receptorestámediadapor una proteinaG denominadaO~. La estimulación del receptor aumenta el AMPC, activa una protein-quinasa AMP- dependiente y fosforila numerosasproteinas celulares alterando su función. Además la O, puede actuar directamente sobre canales de Ca~~ voltaje- dependientes en la membrana plasmática de los músculos cardiaco y esquelético. Los genes de todos estos tipos de receptoresadrenérgicoshan sido donados. Su distribución en el organismoesmuy heterogéneay las accionesde las aminassimpaticomiméticasdependendel tipo de tejido del que se trate y de la concentracióndereceptores. El número de los receptoresadrenérgicosen un tejido dado es muy dinámico. Tanto la expresióncomo el estadofuncional de los mismosestá bajo extricto control, reguladopor los niveles de catecolaminasy otras hormonas, incluyendolos glucocorticoides.(Snyersy cols, 1990;Sakauey cols, 1991) La estimulación persistentepor agonistas da como resultado una disminución en la capacidad de respuesta del receptor y termina en desensibilización. Los cambios de función del receptor parece que ocun’en mediante alteracionesen la fosforilación del mismo queestanmediadaspor diferentesclases de serina-treoninaproteinquinasas.Los glucocorticoides,por otro lado actúanen principio alterandoel númerode receptoresmediantesu influenciaen la expresión génica. Las respuestasde las catecolaminasse dividen generalmenteen dos secuenciastemporales. -10- Introducción Efectosa corto plazo, que son aquellosque se producenen segundoso minutos, mientras que los efectos a largo plazo son aquellos que ocurren en un curso detiempoextenso. Los efectos a corto plazo reflejan cambios rápidos en los estados fUncionales dc las proteinas diana causadasprimariamentepor efecto de la fosforilación. Los efectosa largoplazo parecenserresultadodecambiosen el patrónde expresióngénica, Es importanteseflalar,sin embargo,queinclusolos cambiosen la expresión génicase generannormalmenteinmediatamentedespuésde la estimulacióndel receptor,produciéndosecomoresultadode la alteraciónen el estadoflincional de los factoresde transcripciónespecíficosque regulanla expresióngénica.(Hunter, 1992) Estaplasticidaden el númerode receptoresy en la fUnción, asociadocon susafinidadesdiferencialesparaagonistasy antagonistas,permitelas interacciones dinámicasa nivel celular. Los receptoresadrenérgicosestán presentesen la mayoriade los tejidos, pero su actividadpredominaen las rutascardiovasculares, endocrinasy metabólicas. 4.1.a.4. Vms Catecolaminérgicasen el SNC. El hecho de que las principalesáreascerebralescon influencia tanto sobre la presión arterial como la frecuencia cardiaca se encuentranampliamente inervadas por neuronas catecolaminérgicas,apoya la importancia de las catecolaminascentralesen la regulacióncardiovascular. Para estudiar en profUndidad tanto los grupos celulares cerebralesque sintetizanNA, AD y DA como susproyeccionesaxonalesa distintasregionesdel SNC se han aplicado técnicasneuroanatómicastales como la utilización de neurotoxinas que logran la destrucción selectiva de un sistema de neurotransmisión,siendola 6-hidroxi dopamina(6OHDA) unade las neurotoxinas másempleadasen los estudiosanivel central. NEJJROTOXINAS:6-HIDROXIDOPAMTNA En 1967 Tranzery Thoenendescubrieronqueun análogade la NA, la 6- hidroxí-dopamina (6OHDk 2,4,5-trihidroxifenetílamina), inducia una degeneración selectiva de terminaciones adrenérgicas simpáticas nerviosas. Como consecuencia de estas investigaciones se introdujo un nuevo concepto en neurobiologiadenominado“denervaciónquímica”. La 6OHDA escaptaday acumuladapor neuronas,lascualesposeenen sus membranasmecanismosde transportepara catecolaminas,produciendo,como agentecitotóxico queés, unaacciónneurodegenerativasobrelas mismas. —11— Introducción En animales adultos la GOHDA no es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica pero si se la administra local o intraventricularmente dicha neurotoxina es capaz de actuar sobrelas neuronascentrales, La acción neurotóxica de la 6OHDA es muy rápida. Treinta-sesenta minutosdespuésde su administraciónsevacían completamentelos depósitosde catecolaminasde fa neurona. A pesarde que la 6OHDA es captadapor gránulosde almacenamiento intraneuronalesno parecequeello seaun requisito imprescindibleparaprovocarel dañonervioso,ya queseha demostradoquela toxina tambiénsemuestraefectiva en animalesreserpinizados(Kostrzeway Jacobowitz,1974) Unapropiedadasociadacon suaccióncitotóxicaes queposeeun potencial redoxbajopor lo cualesmuy suceptiblede sufrir unaoxidaciónno enzimática, El último efecto descrito sobre la ÓOHDA es que dicha sustanciainduce una permanentedepolarizaciónque se encuentraasociadaa un incrementoen la ++ permeabilidadal Ca Sehan propuestodos teoríasmolecularescon el fin de explicarlos efectos citotóxicos de la 6OHDA, ambos catan basadosen la facilidad que dicha neurotoxinaposeeparala oxidación. Una de las teoríaspostulaquelos agentescausalesde la toxicidad son el H202y otros radicalesquese forman(Heikkila y cohen, 1975>; mientrasque la otrateoríaasumequela oxidacióndeproductosquinoidesde la ÓOHDA actuarían comoagentesalcalinizantes(Sanery Thoenen,1971).Ambosprocesospodríandar lugar a alteracionesen las propiedadestanto fUncionales como estructuralesde proteinasy lípidos celulares importantesy por tanto pueden causarun daño irreversible, Diversos estudios han demostradoque los niveles de catecolaminas intraneuronalesson capacesde controlarla actividaddegenerativade la 6OHDA, probablementeello sedelia a la captaciónde radicalespor partede las mismas. (Sachs,1975) Un incrementointraneuronalde NA pareceque es capazde ejercer una acciónprotectoracontralas accionesdegenerativasde la neurotoxina. Ademásde lo anteriormentereseñadoseha podido observarquedebido a la rapidezde consumode oxigenoque se producedurantela autoxidaciónde la ÓOHIDA, puedellegar a ser un potentedesacopladorde la fosforilación oxidativa. (Wagnery Tlendetenburg,1971) En cuanto a la especificidad,se ha constatadoque tas terminaciones nerviosasparecenser más sensiblesa la neurotoxina,los axonesun poco menos sensibles,siendolos cuerposcelulareslas estructurasmenossensiblesa la acción de la 6OHDA. Estasdiferenciasparecequepuedenrelacionarse,al menosenparte, conlas diferenciasenla relaciónsuperficie-volumen. Analizandola potencianeurotóxicade la ÓOHDA seha demostradoqueel ácido ascórbico (habitualmenteutilizado como vehículo para la misma) la incrementa,ademásla inhibición de ciertasenzimas(complejosenzimáticos)como -12- Introducción la MAO o de la COMT también se consigue un incrementode la potencia y especificidadde la 6O1~IDA. (Jonsson,1980) e SistemaNoradrenérRico LasneuronasquesintetizanNA selocalizananivel bulbary pontino. El grupo de células Al en la región ventrolateral caudal del bulbo raquídeo (CVLB) y el A2 del núcleodel tractosolitario (NTS), junto con unacontribución relativamentemenor de los grupos AS y A7, dan lugar a una de las vias noradrenérgicasascendentesde mayor relevancia: el haz noradrenérgicoventral (HNV) que se dirige rostralmenteinervando e] hipotálamo. También se han descrito proyeccionesdescendentesbulboespinalesdesdelos grupos Al y A2. (Ungerstedt,1971) Uno de los núcleosnoradrenérgicosde mayor trascendenciaes el locus ceruleus(LC) constituidopor el grupocelularA6, Los axonesde estasneuronasforman extensasramas colateralesque se proyectan ampliamentea lo largo de trayectosbien definidos. A nivel de microscopioelectrónico,los terminalesde estosaxonesexhiben , bajo apropiados métodosde fijación, el mismotipo depequeñasvesículasgranularesobservadasen los nerviosdel sistemasimpáticoperiférico. Estenúcleo,conunamenoraportaciónde los gruposA4 y A7, originaotra gran vía ascendentenoradrenérgica:el haz noradrenérgicodorsal (iHND) el cual cursarostralmenteemitiendoproyeccionesal hipotálamolateral,nucleostalámicos, amígdala,hipocampoy cortezafrontal. Las proyeccionesdescendentesdel LC inervan algunasestructurasdel troncoencefálicoy la médulaespinal.(Nygreny Olson, 1977) (Esquema2) La relevanciacardiovascularde las vías ascendentesnoradrenérgicasno admiteduda,dadala profUsainervaciónquedesdelos nucleospontinosy lulbares recibeel hipotálamo.(VandenBuusey cols, 1991> Así, áreasimplicadasen la regulaciónbásicadel sistemacardiovascularse unena centrosinvolucradosen la respuestacomportamental-e¡nocional-hormonal a estímulosambientales. Virtualmente todas las rutas noradrenérgicasque han sido estudiadas fisiológicamenteson rutas eferentesde las neuronasdel LC, en el cerebelo, hipocampoy cortezacerebral,el principal efectode la activaciónde estaruta esla produccción de una inhibición de la descaigaespontánea.Este efecto se ha asociadocon el tipo lento de transacciónsináptica, en la cual, la respuesta hiperpolarizantede la célula diana seacompañadeun incrementoen la respuesta de la membrana. El mecanismode estaacción ha sido relaccionadoexperimentalmentecon el esquemade segundomensajeroen el cual el receptornoradrenérgico,produce su accióncaracterísticaenlascélulasdianamediantela activaciónde la síntesisde -13- Vías de la noradrenalina(esquemasuperior) y dopamina (esquemacentral) esquematizadasenun cortesagital.En el esquemainferior sepresentanlas mismas vías en un corte horizontal. Tomado deBradford (1986). ESQUEMA 2 ir Introduedón AMP0101100 en/o sobre la membrana postsináptica. Farmacológica y citoquimicamente,las células diana respondena la NA o la proyeccióndel LC en estasáreascorticalesexhibiendoreceptoresj3-adrenérgicos. • SistemaAdrenérQico Los grupos celularesque contienenAd son tres: Cl, C2 y C3, estando restringidosal bulboraquídeo.(Hókfelt y cols, 1973) El grupoCI selocalizaen la región rostralventrolateraldel bulbo(RVLB), regiónimportanteenla regulacióncentralde la presiónarterial, estáentremezclado concélulasnoradrenérgicasdel sistemategmentallateral. Lasneuronasadrenérgicasdel grupoCl proyectansusaxonesparainervar rostralmentediversosnúcleoshipotalámicosy caudalmenteel núcleo intermedio lateralde la médulaespinal. (Fuller, 1982) El otro grupo, el C2, se sitúa en el NTS, proyectándosea los núcleos supraópticoy paraventriculardel hipotálamoy al LC, Ademásseencuentraen fas regiones en las cualestambién se hallan células noradrenérgicasde la médula dorsal. El tercer grupo de células, C3, se describeen el fascículo longitudinal medial. e SistemaDonaminérgico Los sistemas dopandnérgicoscentrales son considerablementemás complejos en su organizaciónque los sistemasnóradrenérgicos.No sólo hay muchasmáscélulas dopaminérgicas,tambiénhay varios núcleosdopaminérgicos principales así como neuronas dopaminérgicasespecializadasque realizan conexionesextremadamentelocalizadasdentrode la retinay el bulboolfatorio. Los grupos celularesdopaniinergicosdescritos en el SNC se designan desdeAS hastaAl 5 y están confinados fundamentalmenteal mesencéfalo,con pequeñosgruposquese sitúanen el diencéfaloy en el telencéfalo.(Dahlstromy Fuxe, 1964) Existen haces ascendentesde gran trascendenciacomo el sistema dopaminérgiconigroestriatal,constituido por ¡os grupos A8 y A9 que llega a inervarel núcleoputameny el núcleocaudado;otro haz ascendenteimportantees el sistemadopaminérgicomesolimbicoconstituidopor el grupo AlO y queinerva diferentesestructuraslímbicasy corticales,(Tjngerstedt,1971) En el diencéfalolos gruposcelularesdopaminérgicossecircunscribena dos núcleoshipotalámicos;el núcleoperiventricular(Al 1) y el núcleoarcuato(Al 2 y su prolongaciónrostral A14), dicho núcleo dará lugar al sistemadopaminérgico tuberoinfbndibularqueinervala eminenciamedia.Por último, el grupoAl 3 no está -15- Introducción concretamentelocalizado y el Al 5 se sitúa en el bulbo olfatorio (Bjorklund y Nobin, 1973)(Esquema2) 4.1.a.5. Metabolismode las Catecolamninas. Las catecolaniinas endógenas y exógenas son metabolizadaspor dos enzimas: la nionoaniinooxidasa (MAO) y la catecol-orto-metil-transferasa (COMT). LaMAO conviertelas catecolaminasen suscorrespondientesaldehídosque semetabolizanrápidamentepor la aldehídodeshidrogenasaa ácidoscarboxilicos. A vecessereducena alcoholeso gliceroles,produciéndoseel principal metabolito cerebralque es el nonohidroxifeniletilenglicol(MHPG). La MAO se considera como un enzimaintracelularunido a las membranasde las mitocondrias,aunque tambiénse encuentraRiera de las neuronasen sitios comoel hígadoy el epitelio intestinal. Se le conocendos formas: MAO-A y MAO-B, que difieren en su distribución regional,especificidaddel sustratoy susceptibilidada la inhibición por fármacos.La MAO-A metabolizaprincipalmenteNA y 5H17 mientrasquela DA es sustratoparaambasformas. Se consideraquebajo determinadascircunstanciaslas MAO intracelularespuedenmodificar la biosíntesisdeNA, controlandola cantidad de sustratoDA disponibleparael enzimaDBH. La segundavía del metabolismode las catecolaminasesla metilaciónde uno delos grupos-OH del núcleocatecolpor la COM’r. Es un enzimaneuronaly extraneuronal,El productofinal es el ácidovanilmandilico (VMA). El metabolismo es complejo y se forman diversos intermediarios que puedensermetabolizadospor distintasenzimas. Lasmedidasde VMA y MHPG en orina puedenservir paracuantificarla liberacióndeNA centraly periférica. 4.1.a.6.Efectosfisiológicosde lasCatecolaminas. EFECTOSCARDIOVASCULARES: En términosgeneralesla unión de agentesadrenérgicosa receptoresc¿-adrenérgicosda lugar a vasoconstricción,la unión a receptores~3’da lugar a un incrementoen la frecuenciacardiacay la contractilidad y la unión a receptoresP2 da lugar a una vasodilatación.Sin embargo las catecolaminasendógenas,la NA y AD, son agonistasmixtos. (Lefko’witz y cols, 1990) Por consiguientesus efectos fisiológicos reflejan la suma tota! de la densidadde receptoren un tejido determinadoy la afinidad parasusrespectivos ligandos. Para el presenteestudio son de gran importancia e interéslas acciones inducidassobreel sistemacardiovascularen especiallas queafectandirectamentea la presiónarterial (PA). 1 1$ 4; 1 -16- irr~ t Introducción La estimulaciónsimpáticadel corazónconlíeva un aumentotanto de la frecuenciacomode la fuerza de contracción.Las catecolaminas(CA) circulantes producenun aumentodel tono vasomotorresponsablede una vasoconstricción generalizada, Comoconsecuenciade ello seproduceun aumentosimultáneodel gasto cardiacoy de las resistenciasvascularesperiféricasque nos conducea un incrementode la PA. Estarespuestaes inmediatay de breveduración,siendola primerarespuestadesarrolladaante cualquiertipo de estréssin dependerde su duración, Ante un estrés agudo o puntual constituye la única respuesta del organismo. EFECTOSVISCERALES: El incrementoen la actividad a reduce la motilidad intestinaly redistribuyela sangreIberade las vísceras.Ademásel tono del esfinterde la vejigaurinariaestáincrementado. En ciertas especiesanimales (como el perro) la cápsulaesplénica se constriñepara incrementarel volumenintravascularfuncional. Otras acciones de las catecolaminasincluyen broncodilatación (132>, midriasis«xi) y tanto contracción(ai) como relajación(132) uterina. (Udelsmany cols, 1994) 4.1.a.7. Metabolismoy sinergismohormonal. Las catecolaminastienen efectos tanto directos como indirectos en múltiples mtas endocrinasy metabólicas.Intervienen en el metabolismode los hidratosde carbono,lípidosy proteinas. Los efectosdirectosincrementanla glucemiamediantela estimulaciónde la glucogenolisisy gluconeogenesishepáticay glucogenolisismuscular. Los efectosindirectosestánmediadosa travésde unavariedaddeacciones de la hormona estimuladora-adrenérgica,Estas acciones incluyen un efecto supresivode la secreciónde insulina («2) y un efectoestimuladoren la secreción de glucagón(¡3), hormonadel crecimiento(cx) y renina(¡3~). Ademásla lipolisis estáestimuladaen lascélulasadiposasy la cetogénsises estimuladaen el higado.(Cryer, 1981) El eje hipotálamo-hipofiso-adrenal(HIJA), el sistemanerviososimpáticoy las citoquinasde la faseagudaformanel marcoa travésdel cual el sujetoresponde al estrés con una respuestaglobal coordinada, Esto requiere cambios en el programagenéticocelularparaincrementearo disminuir la producciónde ciertos productosgénicos.Los mecanismosmolecularesa travésde los cualesestosejes operanestánempezandoaserentendidos. La expresiónde un determinadogenpuedeserreguladoa múltiplesniveles. Entreestosmecanismosseincluyen: 1. La alteración de su actividad transcripcional (el ritmo al que el DNA es transcrito a RNA) -17- Introducción 2. La alteraciónde la estabilidad de la transcripción del mRNA (incrementando o reduciendo su ritmo de descomposición) (Sachs y cols, 1993) 3. La utilización de patrones de unión alternativos para producir diferentes especiesde mRNA que estánen partesometidosa control postranscripcional diferencialy/o quecodificadiferentesformasde proteina(Kraysy cols, 1990) 4. La alteraciónde laspropiedadestransíacionalesdelmRNA (Proudfoot,1991) Por estos mecanismos,la activacióntranscripcionalpareceque juegaun granpapelenel controldel nivel dela expresióngénicaenrespuestaal estrés. La actividad transcripcionalestá controladapor la interacción de las denominadasproteinastransactivanteso factorestranscripcionalescon secuencias de DNA específicasdenominadaselementoscis-reguladores.(Mitchell y cols, 1989) Los factorestranscripcionalessonpor si mismosproteinas,y portanto los genesquelos codificanestansometidosa los mismosprocesosreguladoresque los que ellossirvenpararegular. Los glucocorticoides,las catecolaminasy las citoquinasasociadascon la respuestadefaseagudasoncapacesde modularla expresióngénica. Los glucocorticoidesy las catecolaminasson los principalesefectoresde la adaptaciónal estrése interactuanamúltiplesnivelesenun estilo sinergistico.Ellos se unen a receptoresespecíficosque estánvirtualmentepresentesen todos los órganos,mientrasque el númeroy la afinidad de los receptoresde un tejido determinadovaria paralos ligandosindividuales. La ocupaciónde un receptorda comoresultadoefectosa corto y largo píazoqueenúltimo casomejoranlasperspectivasdelsujetoparatolerarel estrés, Los efectosa corto plazo dan como resultadoaccionesrápidas, como respuestascardiovascularesy metabólicasquebeneficianal sujetoen las reacciones de “lucha o huida”. Los efectosa largo plazo sucedengeneralmentea través de alteracionesen la transcripcióngénica, que preparao adaptaal sujeto para un estrésrepetitivoo crónico. Los cambiosen el estadode fosforilacióndelas proteinasintracelularesson unaforma deaccióncomúntantoparalas respuestasacortocomo a largopíazo. Estas proteinas de respuestaal estrés tienen una enorme capacidad funcional: alteran rutas enzimáticas,modulan niveleshormonalesy actuancomo factorestranscripcionalesparamodificar la expresiónde los genesen respuestaal estrés.(Udelsmany cols, 1994) 4.2. SISTEMAOPIOIDE El SistemaOploide esun término genéricoque se utiliza para designara un grupo heterogéneode péptidos presentes en el organismolos cualesconstituyenlos -18- Introducción ligandos endógenosde los receptoresopioldes, y que como característicacomún contienenenalgúnlugarde sumoléculala secuenciaaminoacidicaTyr-Gly-Gly-Phe. Historicainente,los receptoresopioidesRieroncaracterizadoscon anterioridad al descubrimientode los propios péptidosopioides. En el alio 1973 se puso de manifiesto,medianteevidenciasfarmacológicas,la existenciade receptoresespecíficos parael alcaloidemorfinay otrosderivadosopiáceosen el SNCeerty Snyder,1973). La historiadelospéptidosendógenoscomenzótambiénenel año 1973cuando Hughesobservóquealgunosextractosde cerebrode cerdoinhibian la confracciónde la seña]producidapor estimulacióneléctricadel conductodeferentede ratón,viendo queestainhibición desapareclaen presenciade naloxona.La inhibición observadaen estosexperimentoserasemejantea la producidapor la morfina lo queinduciaa pensar enla existenciadeun compuestoendógenoconcaracterísticassemejantesa la morfina y sobrecuyo receptoractuadala morfina exógena.Despuésde dos añosde intenso trabajo,en 1975, Hughesy Kosterlitzdescubrieronlas encefalinasabriendoun nuevoe interesantecampodeinvestigación. 4.2.a. Biogénesisde los PéptidosOpioides Graciasal desanollode técnicasde recombinacióndel DNA se sabeque los distintos péptidosopioidesse producenpor rupturaproteolitica de tres precursores protéicos diferentes: Pro-opiomelanocortina,Pro-encefallnay Pro-dinorfina,Estos tresprecursoresexibentamañossimilares(deaproximadamenteunos30000daltons)y su proteolisisda lugar aunamezclade péptidosbiologicamenteactivosde distintos tamaños.(Nakanishiy cols, 1979;Legony cols, 1982;Kalddaniy cols, 1982). Los péptidosderivadosde la Pro-opiomelanocortina(POMC) se denominan endorfinasa los quepertenecela ¡3-endorfina,los derivadosde la Pro-encetblinase denominaronencefalinasy cuyos representantesmás destacadosson la metionina- encefalina(met-encefalina)y la leucina-encefalina(leu-encefalina)y por último los derivadosde la Pro-dinorfinaa los cualessedenominadinorfinassiendouno de sus representantesla dinorfina, Ademásde lo referido anteriormente,a lo largo de los últimos años se ha podido comprobarquela Pro-opiomelanocortina(POMC) tambiénesresponsablede la existenciadeotrosderivadosendorfinicosbiológicamenteactivos(8-endorfina1-27, 13-endorfina1-16, B-endorflna1-17), así mismo la adenocorticotropina(ACTH) y las melanotropinasderivandel precursorendorfinico y son co-almacenadasy secretadas junto conla 13-endorfina. Visto éstoseriaacertadosugerirquemientrasmásgrandeseael tamañodeun péptido,mayorprobabilidadexistede queésteejerzaactividadesbiológicasdiferentes. (Rodríguez,1992). Actualmentelospéptidosopioidessesuelenclasificaren seisgrupos: 1,- Péptidosopioidesde cinco aminoácidos(met-encefalina,leu- encefalina). -19- Introducción 2.- Péptidos que se supone que se forman a partir de los precursoresde las encet’alinas&or ejemplolos derivadosde la Pro-encefalinade la médulaadrenal:met-encefalina-Arg6-Phe7, péptidoE, dinorfina,ay 13-neoendorflnas). 3.- B-endorfinay otrasendorfinasrelacionadas(a y a-endorfinas). 4.- Péptidosdel tipo de la 13-casemorfina(presenteenla lechede la vaca). 5.- Kitorfina, la cual pareceque estimulala biosíntesise inhibe la degradaciónde lasencefalinas. 6.- Dennorfina. (Rodriguez,1992) 4.1k. Distribucióndelos PéptidosOpioidesen el SistemaNerviosoCentral. Mediante la utilización de técnicasbioqimicas e inmunohistoqúimicasse ha podidodetenninartanto la localizaciónintracelularde los opioidesendógenoscomo su distribuciónenvariasáreascerebrales.Así seha comprobadoquelos péptidosopioides no estándistribuidosuniformementeen el SNC. Comoejemplopodemosponerel caso de las encefalinas,las cuales,se hallan en concentraciónmáxima en el estriado,en concretoen el globo pálido y no en el putarneny nucleo caudado,mientrasque se encuentranconcentracionesmáspequefiasen el cerebroy en la corteza. Distribucióndeencefalinas: Las neuronasque contienenencefalinasselocalizan principalmenteen regionesrelacionadasconel controldeldolor(Hockfelt y cals,1977; Simantov y cols, 1977);aunquetambiénestanpresentesen otrasáreas. Los resultadosobtenidosde los diferentesestudiosinmunohistoquimicosque se hanrealizadopara analizarla distribución de las encefaiinasdebenser evaluadoscon cautelaya que los anticuerposde los que en este momentose disponepresentan reaccióncruzadaconotrospéptidos. Haciendousodelas técnicasautolTadiográficasy técnicasde unión al receptor (“Hinding”) se ha podido demostrarqueexisteunaclara relaciónentrela distribución de fibras encefalinérgicasy los receptoresopioides,lo quenos indica que el receptor opioideenel cerebroes,dehecho,el receptorencefalinérgico. (Esquema3) Distribución dela Il-endorfina: La ¡3-endorfina está presente en todas las especies estudiadas incluyendoel hombre. Se alsló por primera vez de la hipófisis de cerdo (Bradbury y cols, 1975), encontrándoseademásenel páncreas,sistemagástrico,en la placentay en el SNC, Engeneral,tantola 13-endorfinacomo susderivadosexistenen concentraciones muy pequeñas,causaquehacemuy dificil su aislamientoeidentificación. En el SNC todaslas fibras que contienen13-endorfinatienensu origenen dos poblacionesneuronales,el nucleo arcuato y la eminenciamedia, regionesque se localizanla primeracercadelbordeventromedialdeltercerventrículoy la segundaen -20- 1 ESQUEMA 3 Representaciónesquemáticade los tres siste- masdepéptidosopioldesenSNCderata,secciónsagital.Los cuerposneuronalesseseñalanporcírculosnegros,y las fibras y terminacionespor puntosfinos. . Dado que los péptidos derivadosde la POMC estánpresentestanto en la hipófisiscomoen restodel cerebro,debenseréstosconsideradospotencialmentecomo hormonaso neuromoduladoreso neurotransmisores. Laregulacióndela síntesisy a]macenamientopuedesucederadistintosniveles: 1.- Transcripcióndel genPOMCal RNA mensajero. 2.- Traslacióndel mRNA al precursor. 3.- Procesamientoproteoliticodelprecursora] péptido. 4.- Procesamientopostransíacional que puede afectar a las propiedadesbiológicasdel péptido. Los enzimasque participanenla biosíntesisde los precursoresde los péptidos opioidesendógenosson del tipo de la tripsina, endopeptidasasy N-carboxipeptidasas, aunquetodavíano se sabesi existenenzimasespecíficosparaalgúnprecursoro silos procesosenzimáticossoncomunesatodaslasprohornionas.(Hughes,1983). La liberaciónde los péptidosopioides puedetenerlugaren la sinápsis,en la hipófisiscomosucedeconla 13-endorfina,o bien de lamédulaadrenalcomosucedecon los heptapéptkloy octapéptido(met-encelblina-Arg-Phey met-encefaflna-Arg-Gly-Leu respectivamente>haciala circulaciónsanguinea. La liberacióndepéptidosopioidesen situacionesde estresjuegaun papelmuy importanteen las respuestasfisiológicas asociadasal mismo como se comentaráen detallemásadelante.(Zemany col.s, 1988). A diferenciade los neurotransmisoresclásicos,los péptidosopioidesuna vez queseliberan y actuansobresusreceptoresno sufrenun procesode receptaciónsino quesufrenunadegradaciónenziniática. Las encethlinasson degradadasporaniinopeptidasas(denominadasenestecaso encefalinasas)presentestantoenel plasmacomoen el cerebro.Esteenzimaseunea la membrana,mostrandoun patrondiferentededistribuciónen variasáreascerebralesy estandoasociadaademásal receptoropioide. Las encefalinasashidrolizan a una gran variedadde péptidos(angiotensina, sustanciaP...). Sin embargotanto la ¡3-endorfinacomola dinorfina son sustratosmuy pobresparaestasenzimas. Por la inactivaciónmediantepeptidasasde los péptidosopioidesendógenosse producenotros péptidos biológicamenteactivos, los cuales pueden mostrar una -22- Introducción actividad similar o diferente al del péptido precursor. También son importantes en la formación de metabolitos peptídicos los procesosde acetilación, sulfatación y formacióndeamidasen el carbonoterminal.(DeWied,1979). 4.2.d. ReceptoresOpinides La demostraciónbioquímica de la existenciade los receptoresopioides arrancade los años60 enlos quese realizaronlos primerostrabajosencaminadosa la determinaciónde receptoresopioidesespecificos.Entreestostrabajosseencontraban los llevadosa cabopor Periy Snyder(1973) en los que utilizaron como ligando un antagonistaselectivomarcadoradiactivamente,la 3H-naloxona, (Perty Snyder,1973;Simony col,, 1973;Terenius,1973). La naturalezaproteicade estosreceptoresse intuye al observarqueenzimas proteoliticasy otrosagentesmodificadoresde proteinasreducíanconsiderablementela unión específicade radioligandosopiáceosa este receptor. (Simon y col., 1973; Pasternaky Snyder, 1974).Por otro lado la gransensibilidadde estereceptora ciertas fosfolipasassugeríala posibilidadde quelos fosfolípidosjugaranun importantepapel ensu estructuray/o tbnción. (Pasternaky Snyder,1974). Asíparecequelos lípidosacidicosdemembranacomoel sulfhtodecerebrósido (Loh y cols., 1974)y la fosfatidilserina(Aboody Takeda,1976)esténimplicadosen la funciónnormaldel receptoropioide. La unión de ligandos a estereceptorcumplelas premisasbásicasrequeridas para diferenciarun lugar específicodel que no lo es, como son queseauna unión estereoespecificay saturable(Ooldsteiny cols., 1971),sensiblea diversosiones,GTP, pHy temperatura.(Simantovy cols, 1976). La existencia de múltiples formas de receptoresopioides ¡lié postulada inicialmentepor Portogheseen 1965, posteriormenteMartin y col. (1976)trabajando en perros espinalizadosy basándoseen los diferentes efectoscomportamentales producidospor los agonistasopiaceosclásicosy en la ausenciade toleranciacruzada exhibidapor los mismospostularonla existenciade tres tipos básicosde receptores: receptoresmu (g) para los compuestostipo morfina, kappa (k) para el alcaloide sintéticoketociclazocinay sigma(a) parael SKF 10,047. Estudios posteriores parecen confirmar que el receptor a no sería específicamenteopiáceo.(Coopery col., 1991). El aislamientoe identificacióndela leu- y met-encefalinaasícomoel desarrollo de la técnicade fijación de receptores(“binding”) posibilitaron la definición de los receptoresdelta(8), caracterizadospor su interaccióncon las encefalinasen conducto deferentede ratón (Lord y col., 1977). De modo similar, al descubrimientode la 13- endorfinasucedióla descripcióndel receptorepsilon(E) (Akil y col., 1980), En la actualidaddiversosestudiosparecenindicar la existenciade numerosos subtipos de receptores opioides. Así se han diferenciadodos subtiposparael receptor ¡tel ¡t~ y el ¡12 (Wolozin yPastemalc 1981), dossubtipostambiénparael receptor8, el -23- Introducción Si y el 52 (Negri y cols 1991, Traynor y Eliot ¡993) y tressubtiposparael receptork, denominadosk1, 1<2 y k3 (Zukin y cols 1988,Clarky cols 1988). Ademásse sabeque los receptores~t y 5 puedencoexistir en las mismas neuronas,comoporejemploenelganglio hipogástricoen el ratón(Rogers,1990)o en el neoestriadoen la rata en dondese sugiereque podríanincluso compartirla misma proteinaO inhibitoria parallevaracabosumecanismode acción.(Schoffelmeery cols, 1987). Tras la interpretaciónde externosestudiosde unióna receptores(‘binding’), en los queseobservóquelos ligandosparalos receptores¡L erancapacesdeinhibir el “binding” de ilgandos para receptores5 tanto de una forma competitivacomo no competitiva,Rothmany sus colaboradorespropusierondividir los receptores5 en dos subtiposen relacióna estacaracterística,así habríaunosreceptores5 asociadoscon receptoresp y que denominaron&.,,¡,l~ó o 8o~< y aquellosreceptoresdelta que no estabanasociadosareceptoresmu, denominadosS~«4>I~óo 5~. (Rothman,1988; Xu ycols, 1993). A pesarde los estudiosllevadosa cabo hastael momentotodavíano se ha podido correlacionarcoherentementelos dos tipos desubdivisionesdescritosparalos receptoresdelta,porun lado estaríanlos subtipos51 y52 basadosenestudiosrealizados con agonistasselectivosy por otro los denominados&,~ y S~< basadosen estudios sobrelarelaciónentrereceptoresdeltay receptoresmu. (TraynoryElliot, 1993). 4.2.d.1.Distribucióny significadofisiológico de los receptoresopioides : Se ha podido establecerla distribución de los diferentestipos de receptor opioideen basealos resultadosde estudiosde fijación a preparadosde membranasde áreasdiscretasverebralesasí como a la aplicaciónde técnicas autorradiográficas en cortes seriadosdel SistemaNervioso. Los receptoresopioidesse encuentranampliamentedistribuidos en el SNC (Tabla 1), particularmenteen estructuraslimbicas, núcleostalámicos y otras áreas neuralesrelacionadasconfuncionesviscerales. La distribución cuantitativade los tres principales tipos de receptoroploide (mu, deltay kappa)varíaen cadaestructurae incluso seencuentranmodificaciones entreespecies(Lewis y col,, 1984; Sbarify Hughes,1989). De tal formaquemientras en el humanola proporciónrelativade los trestiposessimilar, enla rata los receptores kapparepresentantansólo el ~/ 0 de la poblacióntotal frenteal 41%y 50%paralos receptoresmuy deltarespectivamente.(Mansoury col., 1988). Aunqueseobservaunaciertasuperposiciónenla distribuciónde los tipos mu, delta y kappa en el cerebro,son abundantes,sin embargo,las áreasen las que predominaun tipo sobrelos demás.(Mansoury col., 1988), Así, aunquelos tiposmu y deltaseencuentranen el neocortex,sudistribución esdistintapareciendocomplementaria. -24- TABLA 1 Distribución de receptoresopioidesen el SistemaNervioso de la rata. (Adaptado de Mansourycols, 1988). TIPO DE RECEPTOR REGION 6 1< 1.Telencefalo cortex frontal ++ + hipocampo ++ + tuherculo olfatorio + +++ n. accumbens ++++ ‘caudado-putamen +++-h globus pallidus + + + II. D¡cncéfnlo hipotálamo n. supraóptico o o ++ n. paraventricular O O ++ n. arcuado O O tálamo n. periventricular O O ++ n, centromedial .,..,. ++++ + ++ hab¿nula . + ni. Mesencéralo si. interpeduncular ++++ substancia negra O O subs. periacuedultal . .. + o ++ n. dorsal rafe ++ O ++ tub. cuadrigéminos ++++ 4- ++ IV. Bulbo-Puente n. parabraquial --+r O ++ si. rafe magno O + n. tracto solitario ++++ + n. tng¿m¡no +++ ++ V. Médula Espinal substancia gelatinosa + ++ introducción En generallas estructurasdelsistemalimbico, asícomoel neocortex,son ricas enreceptoresopioides. El receptormu selocalizaen áreasrelacionadasconel controlde la sensación nociceptiva e integración sensorialy motora. Este tipo de receptorpresentauna ubicación difusa, distribuyéndoseen numerososnucleos a lo Largo del neuroeje, incluyendo la corteza,el núcleoestriado, el hipocampo,la sustancianigra, el locus coeruleusy el NTS. La distribucióndel receptoropioidedpo deltaesmásprecisa,restringiéndosea áreastelencefalicas,mientrasqueel receptorkappapresentaunalocalizaciónpreferente en el áreapreóptica, la eminenciamedia del hipotálamo, la amígdalay el NTS, observándoseunaelevadadensidadenel hipocampomientrasqueenla cortezaybulbo raquídeosu concentraciónes baja. (Mansoury col,, 1988). Esta distribución es consistenteconsu posibleparticipaciónen la regulaciónde la ingesta,percepciónde la sensacióndolorosay funciónneuroendocrina. A pesasde lo señaladoanteriormenteno parece acertado asignarun papel fUncionalpreferenteparacadatipo dereceptoropiolde,ya quehay quetenerencuenta que ademásde la acciónprimariaa quedé lugarsu activación,inhibición o excitación neurona],la fUnción de la vía en la que se encuentraes la responsabledel efectofinal obtenido. Los receptoresopioidesestén,comohemosseñaladoampliamentedistribuidos, por lo que se encuentranimplicados en la funciónde una granvariedadde procesos. (Tabla II). Uno de los efectosmás relevantesde los opiáceos/opioideses la analgesia, actualmenteseaceptaquelos trestiposbásicosdereceptoropioideestanimplicadosen el controlde la sensacióndolorosa,sin embargola importanciarelativade cadatipo en el control de diferentessensacionesdolorosas(térmica,presión,visceral...>estáaun en debate. La mediacióndelaanalgesiaa nivel supraespinalquese atribuía clasicaznentea la ocupaciónde los receptoresmu, ha sido recientementeasignadaal subtipo mu1 (Pasternak,1988), así comoa los receptoresdelta (Porrecay col., 1987; Sánchez- Blázquezy Garzón,1989). A nivel espinalseproduceanalgesiamediantela activación de cualquierade los trestipos dereceptoropioide. La localizaciónde los receptoresmu, delta y kappaen el NTS pareceestas relacionadacon el control de las funcionesautónomas,másconcretamente,con el control reflejo del sistemacardiovascular. Por otro lado diversos estudios han correlacionado el patrón de distribución/densidadde los receptoresmu opioidesen el tálamoy troncocerebralcon las accionesdepresorasde los opioidessobrela respiracióny consusefectossedantes. (Atwehy Kuhar,1983). El aumentode la actividadlocomotorapareceser relativo a la localizaciónde los receptoresmuenlaszonasA9 y AlO, dondemodulan¡a liberaciónestriataldeDA -26- TABLA II Efectosopioides:su asociacióna los tiposde receptor. Comportamentales analgesia supraespinal analgesia espinal estres euforia disforia sedación catalepsia actividad motora supresión del apetito anciconvulsivos p> 8, FC g,t5>K 6>ji 14 K p.IC ti p <+,—), K (—3 ji~ 6, k Endocrinos liberación de ACTH.conisol liberación de prolactina liberación de OH inhibición dc ADH inhibición de LH y tetosterona Autónomos motilidad gastrointestinal (—3 motilidad vejiga (—3 midriasis miosis hipertermia depresión respiratoria bradicardia hipertensión choque hemorrágico choque endotóxico 11>6, 1< 6 FC ti ti /4 A’ ¡.46 ¡i.6 6 6, K a Inmunes inmunoestimulación inmunosupresión producción de anticuerpos (—3 quimiotactismo monocitos (+3 quimiotactismo resto leucocitos p>6, FC 11 K>p,6 Introducción (Chesselety col., 1982). De forma paralela, la ocupaciónde los receptoreskappaen estasregionesinducesedaciónlo que se correlacionacon el elevadocontenidodel receptorkappaenestaszonas. En cuantoa lo que se sabede los efectosde los opioidessobrela secreción hormonalen el SNC hay que señalarquela distribución anatómicade los receptores kappaen la hipófisisposteriorse asociaal papelinhibitorio ejercidopor los opioides sobrela liberación de la vasopresina,así comoa la acción diurética intrínsecaque presentanlos agonistaskappa(Blackburny col., 1986).Ademásla elevadadensidadde receptoresmu y kappapor un lado y delta por otro se correspondecon el papel excitatoriodelos mismossobrelaliberacióndeACTH y prolactinarespectivamente. El sistemaopioideintrínsecoal tractointestinalmodulasumotilidad, siendosu efecto más destacadoel descensoen el peristaltismolo cual justifica la actividad constipantey antidiarreicade los opiáceos.Tambiénintervienenen el control de la ingestay en el balancehidrosalino(Holaday, 1985)sin que bastael momentoen todos estosprocesossedeterminela participaciónselectivadeun subtipodereceptor. Estudiosrecienteshandetectadola existenciadereceptoresopioidesperiféricos asociadosa procesosinflamatorios, posiblementelocalizadosen terminalescutáneos sensoriales, que al ser activados por agonistas mu modularian las sensaciones nociceptivas.(Steinycol., 1988;Leviney Taiwo, 1989) 4.2.e. Mecanismodeaccióndelos PéptidosOpioldes La unión de los péptidos opioides a su receptor,el cual se localiza en la membrana postsináptica ha de traducirse en una señal intracelular, señal que puede venirmediadapor distintossistemasde segundosmensajeros. En la actualidad los estudios se centran en el análisis de los cambios postreceptor que conducen la información a través de la membrana hacia el efector primario. Existen evidenciasqueapuntanhaciaunaasociaciónde los receptoresopioides con la enzima adenilato ciclasa o concanalesiónicos; es más, en algunosestudiosse sugiereque la acciónde los opioidessobrelos canalesiónicos vendríamediadapor dichoenzima.(Loh y Smith, 1990). Estudios electrofisiológicos han demostradoquelos opioidesreducenel ritmo de descargade las neuronasy como consecuenciala cantidad de neurotransmisor liberado. Existen varias formas en que se pueden alterar las propiedades eléctricas de las membranas,así los opioidesal actuarsobrelos receptoresmu y deltaaumentanla conductanciadel potasiohipe~olarizandodichamembrana,dificultandola producción y/o propagacióndel potencialde acciónel cual en último término es el encargadode liberar al neurotransmisor presináptico (North, 1986).El receptorkappa,por su parte, al activarse va a reducir la entrada de calcio al interior celular dificultando la liberación del neurotransmisor (Werz y McDonald, 1985). -28- Introducción Independientemente de que el efector primario sea una enzima o un canal iónico entre el lugar de reconocimiento y el efector se intercala una proteina transductorao reguladoraqueseunea nucleótidos de guanina, proteinaCi Engenerallos receptoresunidosaproteinasU respondena diversashormonas, neurotransmisoresy autacoides,regulandolos nivelesde AMPO, GMP0, canalesiónicos y recambio de fosfolipidos. Se sabequeel sistemaadenilatociclasa,encargadoderegularla producciónde AMPC, incluye receptoresactivadoreso inhibidores acopladosa protenasO, o (Ji respectivamente.Algunos estudiossugierenquelos receptoresopioidesproduciríanun bloqueoen la activaciónde la adenilatociclasa.Tanto los agonistasopioidestipo mu (Freyy Kebabian,1984), comolos de tipo delta(Schoffelmeery cols, 1987;DeMontis y cols, 1987)y los detipo kappa(Bboolay Pay,1986)provocandicha inhibición dela adenilatociclasaconla consiguientereduccióndelosnivelesintracelularesdeAMPO. La adenilatociclasajuega tambiénun papel importante en el control de la síntesisde neuropéptidosdebidoaquediversosgenesquecodificanparaneuropéptidos incluyen en suspromotoreselementoscapacesde ser activadospor proteinquinasas dependientes de AMPO, por lo que una administración de agonistas opioides produce un descensoen los nivelesde AMR reduciéndoselos niveles de ARNm para proencefalina,reducción que es revertida por naltrexona (antagonistaopiáceo). (Childers,1991) Asimismola activaciónde la fosfolipasao dependede receptoresacopladosa proteinasO, dandolugar a la producciónde diacilglicerol e inositol trifosfato que activan, respectivamente, la proteina kinasa0 o la salida de calcio desde depósitos intracelulares al citosol, Igualmente,determinadosreceptores,comoes el casode los receptoresopioides,puedenregularla actividadde canalesde ionestalescomoCa 2~o K4. En el caso de los receptores opioides, el receptor mu puede utilizar los tipos <~i y (1<, (proteinaO) parahacerllegar su información a diferentesefectores,adenilato ciclasa(Ueday cols, 1988)y canalesiónicos(Heschelery cols, 1987). Se ha sugerido que al menos una proporción de los receptores opioides se encontraríanpreacopladosa la proteinaO. Esta forma se asocia a los estados de alta afinidadde los receptoresparaagonistasque sin embargono son detectadospor los antagonistas.(Costay cols, 1988). Para demostrarlo expuestoanteriormentediversos estudioshan puestode manifiesto que la administración in vivo de la toxina pertúxica, la cual se encarga de catalizar la ribosilación dependiente de ADP a partir deNAD de la subunidad a de los tipos (lí/(iL, reduce la analgesia espinal mediadapor receptoresopioides en la rata (Przewlocki y cols, 1989) y la actividad antinociceptiva supraespinal de ciertos opioides en el ratón. (Sánchez-Blázquez y Garzón, 1989) Otros agentescapacesde modificar el estado fUncional de las proteinas(3’, como la N-etilmaleimida (NEM) inducen también un descenso diferencial de la actividad antinociceptiva supraespinal de los opioides, (Sánchez-Blázquez y cols, 1989) -29- Introducción Si consideramos que la analgesia supraespinal opiolde es mediada predominantemente por el receptor mu, y que los agentes modificadores de las proteinas (i,/G~, toxina pertúxica y NEM, sólo reducen la analgesia inducida por ciertos opioldes se plantea la interesanteposibilidadde queel estadofUncional de las proteinas transductorassearesponsablede la eficaciade los opioldesanalgésicosy por lo tanto dependiendo de las modificaciones suflidas y del tipo de interación del ligando con el complejo receptor-proteina (1+ su eficacia en iniciar los eventos postreceptor se verá modificada en diferente grado. Estos hallazgos indican la importancia del estado fUncional de lasproteinastrasduotorasenla eficaciade los agonistas. Como ejemplode esto tenemosel fenómenode toleranciael cual pareceser debido en principio a un desacoplamientofUncional entre el receptory el sistema transductor(proteinasO), seguidode un descensoen el número de receptores. (Cox y Werling, 1991) Sehan propuestovarios mecanismospara explicar el desacoplamientoinicial entre el receptoropioide y las proteinaO, así podríadeberseauna fosforilación del receptor debida a un aumentode la actividad de kinasas dependientesde AMPO producidotras la administracióncrónica de opioides,esta fosforilación afectaráa la activación de la proteina Otras la interacción opioide-receptor (Harada y cols, 1989),o bien a un descenso en el número de subunidades a de las proteinas O provocada por agonistas oploides (Schulz, 1991) 4.2S. Peptidos Oploides y Sistema Nervioso Autónomo: Accionessobreel Sistema Cardiovascular Desde mediados del siglo XIX y comienzos del XX se tenía conocimiento de que la morfina y sus derivados además de efectos analgésicos ejercían una potente actividad cardiorespiratoria. (Bernard, 1964) La actividad queproducenlos opioidesno esuniforme, así se pueden obtener efectos estimuladores o depresores en un mismo animal de experimentación dependiendo de la ruta de administración o de ¡a utilización o no de anestésico. (Kayaalp y cols 1966). Este hecho sugiere que las acciones no se ejercen sobre un único sistema o bién que los efectos observados no sonprovocadosdirectamentesinoa travésde diversassustanciasmediadorascomoporejemplo,la serotonina,histamina,la acetilcolina y la noradrenalina, entre otros, Se sabe que el mantenimiento fUncional de las constantescardiopulmonares depende de la integridad de muchos núcleos que se encuentran localizados en el tronco del encéfalo en dondeexisten importanteszonaspara la regulaciónde la tensión arterial. (Dampney, 1981) La administraciónintravenosade morfina en ratas provoca en las mismas una disminuciónde la frecuenciacardiacay de la tensiónarterial, efectosqueparecenser mediadospor quimiorreceptorespresentesen el arbol cardiopulmonar,provocando,la -30- Fi Introducción estimulaciónde estospuntosuna triple respuesta,bradicardia, hipotensión y apnea transitoria. El desarrollo de tolerancia produceuna disminución en la depresión cardiaca.(Fennesyy cols, 1971) Diversosestudiosrealizadosen ratasdemuestranque la morfina provocaun quimiorreflejo vagal, lo que apoyala teoríade quela morfinaperif~ricaejerceun efecto hipotensor.Ademásla realizaciónde unaadrenalectomíao hipofisectomiaproduce aumentodelasensibilidadalas accionesdela morfina. (Kiangy cols, 1984) Todo lo expuestocon anterioridadpareceevidenciarque los agonistasmu puedenactuaranivel centralestimulandoel sistemanerviososimpáticoy/o inhibiendo el parasimpático. Estaaccióncentralpodríaencargarsede modularel reflejo barorreceptor,sobre todo a niveles bajos de activación nerviosa,ya quecuando¡a frecuenciade impulsos procedentes de los senosaórtico y carotideoesmásintensa,el sistemade receptores mu no es capazde inhibirlo, y en esemomentoel reflejo barorreceptorcomenzanaa actuar. Los agentes que actuan selectivamentesobreel receptoropioidedeltatambién soncapacesdeproducircambiosen el sistemacardiovascular.Así sehaobservadoque tras la administración por vía intravenosa de Met-ence&lina y Leu-encefalina se producenrespuestaspresorasy estimuladorasde la frecuenciacardiacatanto en ratas normalescomo en hipertensas.En generalseha observadoque los agonistasdelta modulan los quimioreceptoresdel cuerpocarotideo.(Qanteny cols, 1981; Schazy cols, 1980) Así pues se ha demostradoque tanto los receptoresmu como los delta participan en procesos cardiorrespiratorios, siendo su acción no idéntica aunque si complementaria. En cuantoala relación de los receptores kappa con la actividad cardiovascular, se debe mencionar que en el núcleo preáptico medial, área hipotalániica con demostradas acciones cardion-espiratorias, se han encontrado a altas concentraciones diferentescompuestosendógenoscon actividad agonista sobre receptoreskappa. (Feuersteiny cols, 1983) 4.2.g. Activaciéndelsistemaopioideduranteel estrés. Muchosautoreshan confirmadoel efecto estimulantede múltiples agentes estresantes sobre la secreción de péptidos opioides en diversas especies. Ya en 1977, Guillemin y cols describieron como el estrés producido por una fractura tibial provocaba un incrementoconcomitantede los niveles plasmáticosde ACm y f3-endorfina en la rata. Se ha podido constatar también una clara asociación entre el estrés y la liberación de péptidos opioides durante la activación del eje simpático-adrenalen estassituaciones,enlas cualesse observaunaliberaciónparalela de péptidostipo encefalinasy adrenalinadesdela médulaadrenal(Viverosy cols 1979; Livett y cols 1981) y de encefalinasy noradrenalinaen las tenninalessimpáticas. (Wilsony cols 1980) -31.. Infroducción Son bastantebien conocidos los efectosdel estréssobre la secreciónde opioidesdesdeque en 1976 Akil y colsdescribieronpor primeravez el fenómenode analgesia inducida por estés. Los efectos sobre los receptoresopioidestambiénhan sido estudiados,En generaltras unestéscrónico, tanto fisico (estéspor filo, Hnatowichy cols 1986) o psicológico (estrés por aislamiento, Petkov y cols 1985) se ha observado una disminucióndereceptoresoploidesen elcerebrodela rata. Recientesresultadosmuestranunadisminuciónde los receptoresmu en ratas sometidasa shock inescapable(Stuckeyy cols 1979), dicha disminución podría ser debidaala presenciadeligandosendógenosqueen estassituacionescompitenpor los sitios de unión, o bién, a una inducción de subsensibilidad de los receptores por una exposiciónpersistentede los mismosa niveles elevadosde opioides endógenos. (Adamsycols 1987) Por el contrario, el estrésagudopor inmovilización aumentael número de receptoresmuy deltay unainmovilizaciónrepetida(estréscrónico)aumentael número de receptoresdeltay la concentraciónde dopaniinasugiriendoestehechounaposible relaciónentreel sistemaopioidey el dopaminérgico. (Zeman y cols 1988).En estudios realizadosutilizandoshockhipovolémicoaparecenalteracionesenlos receptoreskappa (Raniabadramy Bansinath,1988) En condiciones normales, la administración de antagonistasopioides en animalescarecede efectosya que la mayoríade las célulasque contienenopioides endógenosno son activas tónicamente,sin embargo,cuandola homeostasisdel organismoseve alterada,por ejemplo,mediantela aplicacióndeun estímuloestresante se produceunaactivacióndel sistemaopioide que dará lugara efectosmuy diversos entrelos quepodemosdestacarmodificacionesen las fUncionesneuroendocrinas,en la actividadcerebral,en la sensacióndolorosa,en la temperaturacorporal,en el sistema cardiovascular,así comoen determinadasreaccionesautónomasy comportamentales. (Helada>’, 1985) Duranteel estrésagudosehandescritomodificacionesen los niveles de los péptidos derivadosde la POMC, se ha demostradoque los nivelesde j3-endorflna plasmáticaestán elevados en animales sometidosa estésagudo como el sbook inescapable(Rossiery cols 1980;Hulsey Coleman1984), inmovilización (Kant y cois 1986)y aislamiento(Kalin y cols 1985). Estudiosrealizadosen humanosmuestranasí mismo dichoincrementoen situacionescomoel parto (Furuhashiy cols 1984), en el transcursodeejerciciofisico intenso(Fraioli y cols 1982;Metzgery Stein1984)y dela hipoglucemiainsulínica(Wiedemanny cols 1979;Nakaoy cols1979) Pareceser que la ~-endorflnasegregadaal torrentecirculatorio duranteel estrésprocedede la hipófisis, ya que unahipofisectomíabloquea,en determinados casos,dicharespuesta(Guilleminy cols 1977).Ademásseha observadounareducción del contenidohipotalámicode f3-endorflnatrasla aplicacióndeestréspor filo (Vaswani y cols 1988), por shocken las patas(Hulse y Coleman1984) o tras el estéspor nataciónen la rata(Lim y Funder1983). En el estréscrónico, comoel producidotrasla aplicacióncrónicaintennitente de shockeléctricosen laspatasdel animal,tambiénseha observadouna elevaciónen -32- Introduedón los nivelesde ~-endorf1naplasmática(Aldí y cols 1984), aunqueen otrosmodelosde estréscrónicocomo el ayuno,otrosautoresno hanencontradovariacionesen dichos niveles(Vaswaniy Tejwani 1986) En el SistemaNervioso Central se ha descrito que el estréscrónicoproduce unaelevaciónen el contenidohipofisáriodel ARNm paraPOMC. (Shiomiy cols1986) En el caso de ratas sometidas a deprivación socia]apareceunaelevaciónde los nivelesde ARNm depreproencefalinaenhipotálamo. En otrosdosmodelosde estrésen la rata como el síndromede abstinenciaa morfinae inyecciónhipertónicasalina se describe dicha elevación en las concentracionesdel ARNm de preproencefalina,precursordemet-encefalinay leu-encelblina,en el nucleo paraventriculardelhipotálamo,nucleocerebraldcprobadaimplicaciónenla regulación del sistemacardiovascular.(Lightmany cols 1987) En diversosestudiosrealizadossobreotrasáreascerebralessehan obtenido diversos resultados mostrando en algunos casos discrepancias. Así Chancey cols (1977) vieron que tras la aplicación crónica de shock eléctricosse producíaanalgesiaasociadaa un aumentoen SNC de algún opioide endógeno.Porel contrariootros autoreshanobservadoun desarrollode toleranciaal efectoanalgésicodelestréscrónicoaplicadoduranteun periodomásprolongado(Akil y cols 1984).Tambiéntrasla aplicaciónprolongadade shockeléctricoen las patasde la rata se detectauna disminución en las concentracionesde leu-encefalinaen hipotálamo.(Rossiery cols, 1978) En resumen, las discrepanciasque se observanal estudiar los resultados obtenidosal respectopordiversosautoressedebenprobablementeal hechode queno se puedeconsideraral estréscomo un fenómenoconcretocausantedeunareacción única en el organismo, sino que da lugar a muchasrespuestaslas cualesvienen condicionadas por la duración,intensidady tipo de estrés,ya seafisico o psicológico. (Termany cols1984) 4.3. ACTIVACION DEL EJEHIPOTALA.MO-HIPOFISO-ADRENAL . El eje Hipotalamo-hipofiso-adrenal(HIHA) es posiblementeel sistemamás importantede respuestaal estrés.Entodaslasformasde estrésseproducela activación deleje HHA conjuntamenteconla activacióndel sistemasimpático.(Selye,1976) Estaactivaciónsólo estáausenteen las formas de estrésagudoy de caracter muy puntual; es por ello que la activacióndel eje HHA se incluye en la fasede resistencia típica del estrés crónico. Paralelamente tenemos que teneren cuentalas dificultadesque surgenal intentardelimitarestrictamentelas situacionesagudasde las crónicas,pudiendopresentarsemecanismosintermediosentrelos efectossimpáticosy los adrenomedulares. La activacióndel eje HHA duranteel estréslleva asociadaunaelevaciónde la hormonaadrenocorticotropao corticotropinadesdela adenohipófisis,elevaciónde la que es responsable el factor liberador de corticotropina (CRE), producidoen los somas -33- hufrodUCCIdN de lasneuronaspaivocelulareslocalizadasen el nucleoparaventriculardel hipotálamo, el cual esel origen,anivel central,de la activacióndelejeliliA. (Vale y cols 1981) El CRE es transportadopor medio de la circulación hipofisaria-portala la hipófisisanterioren dondeestimula la liberaciónde ACTH. Posteriormentela ACTHI circulante es transportadabastala corteza adrenal, en dondeinduce la síntesis y liberación de glucocorticoidesen las células corticoadrenales,sistema que se autocontrolagraciasa un mecanismode retroalimentaciónnegativoejercidopor los propiosnivelesde glucocorticoides.(Keller-Woody Dallman 1984) Sin embargo, durante períodos de estrás prolongado, a pesar de unos niveles circulantes altos de glucocorticoides,no se producela retroalimentaciónnegativa, secretándoseCRH y ACTH adicionales.(Keller-Woody cols 1984) Paralelamentea la liberaciónde ACTH desdeel lóbulo anteriorde la hipófisis es importante señalarque se producela liberación concomitantede 13-endorfina, péptidoopioideprocedentedelmismo precursorpolipeptidico(Proapionielanocortina> quela ACTH (Eippery Mains 1980) En general,comorespuestaa la activacióndel eje HIJA en el desarrollode la respuestafisiológica al estrás se provocan una serie de efectos derivados fundamentalmentedel aumento de los glucocorticoidescirculantes, entre los que podemosdestacarunareducciónde la capacidadde adaptación o cambios de la respuestainmunológica, de la actividad del eje hipotálamo-hipofiso-gonadal,de la producciónhipofisariade OHy TSHyporlo tanto desusefectossobreel crecimientoy el metabolismo,alteracionesen la ingestay en el pesoy unadisminución de HDL- colesterol.(Udelsmany Holbrook 1994) 4.3.a. Hormona liberadora de Corticotropina. En 1948 Harris sugirió la presenciade un factor hipotalámico capaz de estimular la liberación de la ACTH desdela hipófisis. En 1955 Saflion y cols demostraronla evidenciade actividad de dicho factor de liberación de corticotropina (CRE),siendoaisladoen 1981 porValey cois. Con el tiempo la nomenclaturareferentea estepéptido se cambió de factor liberadorde corticotropina(CRE) a hormonaliberadorade corticotropina(CRH?). El papel central de estepéptidode 41 aminoácidoses la regulaciónde la secreciónde ACm. Ademásla C11H juegaun papeltndamentalenla integraciónde lasrespuestas relacionadascon el estrásatravésdel eje neuro-mmuno-endocrino.La CRH actúa dentro del SNCparaintegrarlas respuestasautónomas,comportamentales,endocrinas y respuestasinmunesal estrés.Más aun, evidencias recientes sugieren que la CRH puede llevar a cabo accionesdirectasen los inniunocitos para modular la función inmuneenla peritbria. Las accionesde la CRH en el SNC, hipófisis y en el bazo estánmediadas específicamentepor receptoresdemembranadealtaafinidadconpropiedadescinéticas y ftrmacológicas similares. (De Souzay cols 1991) -34- Introducción Cuandoseadniinistraintracerebroventricularmentea animalesde laboratoriose observanunaserie de respuestasque incluyenaccioneshemodinámicasacompafiadas de unincrementode noradrenalina,adrenalina,glucagónyglucosa. Diversosestudioshandemostradoquela inmunorreactividady los receptores de la CRIN estanconcentradosen el sistemalimbico, en áreasdel cerebrosuperior, estasáreasincluyenel locuscemleusy el sistemanerviososimpáticocentral. Sin embargo,las neuronasresponsablesde la síntesisy secreciónde la CRIN se localizanfbndanientalmenteenel núcleoparaventriculardelhipotálamo. En diferentes estudios se observaque tanto las neuronasproductorasde la CRH,comoel ligandoyíosreceptoresselocalizanenáreasapropiadasdel SNC,enlas que se sabe que seproduce una respuesta ante el estrés. Mediante estudios por autorradiografla,los receptoresde la CRIN se localizabanenaltadensidadenlos lóbulosanterioreintermediode la hipófisis, regiones cerebralesimplicadasen funcionescognoscitivas,en áreaslimbicas implicadasen las emocionesy enáreascerebralesimplicadasenla regulaciónderespuestasautónomasy relaccionadasconel estrés. Todos estos datos proporcionan evidencias adicionales sobre el papel psicológicode la CRH enel ejecerebro-endocrino-inmuney un mayorapoyosobrela importanciade esteneuropéptidoen la coordinaciónde la respuestaal estrés, (De Souzaycols,1991) Además,seha demostradola existenciadereceptoresperiféricosde la CRH en el sistemanervioso autónomoperiférico de los primateslocalizadosen la médula adrenaly gangliossimpáticos.Estos receptorespresentanun rangode especificidad, afinidady característicasfuncionalessimilaresa los receptoresde la CRH descritosen la hipófisisy el SNC. (Udelsmany cols, 1986) La CEfI es secretadadesde el núcleo paraventricularal sistema portal hipotalámico-hipofisario,siendotransportadaa la hipófisisanteriordondepromuevela síntesisy liberacióndeACTH. Dicha acción es mediada por la unión de la CRH a receptorescelulares corticotróficosde altaafinidad, lo queda como resultadola activaciónde la adenilato ciclasay un incrementoen los niveles intracelularesdel segundomensajero,AMPO. (Browny cols, 1988) La CRIN no esel únicosecretagogoparala ACTH. Otrashormonasdel estés., incluidas la vasopresina,angiotensinaII y catecolaminasactúan sinérgicamente estimulando la síntesis y liberación de ACTH por las células de la hipófisis. (Antoni, 1986) La administraciónintracerebroventricularde la CRIN en animales da como resultado,un aumentode catecolaminasen el plasmay cambioshemodinámicosde acuerdo con un incrementode la actividad simpática, quesemanifiestacomo una elevaciónen lapresiónmediaarterialy ritmo cardiaco.(Browny cols, 1988) -35- introducción 4.3.b. Hormona adrenocorticotropa. Lascélulascorticotróficasde la hipófisisanteriorsonestimuladasporla CRH a sintetizar un precursor de la ACTH de 240 aminoácidos, la denominada proopiomelanocortina.(Krishnany cols, 1991) Estamoléculacontienetambiénlas secuenciasparalas hormonaspeptidicas melanocortina y lipotropina. Después de trasladarse, el precursor proteínico proopiomelanocortinase situa intracelularmenteparapoderdar lugar a los productos de secreción,la melanocortina,la ACTH, la lipotropina y el péptido endógeno¡1- endorfina.(Lowry, 1985) En ausenciade estrásla ACTH se secretaepisódicamentea la circulación periféricaenunosritmoscircadianoscaracterizadosporunaelevacióna primerashoras de la maflanade ACTH y glucocorticoides.Los glucocorticoidesejercenun efectode retroalimentaciónen el hipotálamo y la hipófisis, inhibiendo la CRH adicional y la secrecióndeACm. Esteritmo circadianoestámodificado en especiesanimalescon hábitosnocturnosy en sujetoshumanoscuandoestosestanaclimatadosa nuevosciclos deluz/oscuridad. El estréspuede anular estospatronescircadianos,dando como resultado la clásicarespuestaendocrinaal estrés. La ACTH seuneespecíficamentea receptoresde membranadealtaafinidaden la zonafasciculadade la cortezaadrenal.La unión a dichosreceptaresda lugar a la activaciónde la adenilatociclasay a un incrementode los nivelesde AMPO. El AMPO actúa como un segundomensajeroactivando a proteinasquinasasdependientesde AMP,, las cualesincluyen proteinasreguladorasfosforiladas.El resultadoneto es la estimulacióndel paso limitante en la esteroidogénesis,la conversiónde colesterola pregnenolona.(ERTENSION. Hans Selye introdujo la noción del estrés como un síndromedefinido constituyendouna reacciónde alarmaproducidaen respuestaa una variedadde agentesestresantes. -41- Introducción Los cambios en el equilibrio del sistema nervioso autónomo, particularmente la activación del Sistema Nervioso Simpático, parecen mediar tos efectosdel estésen la fUnción cardiaca.(Pasternacy cois, 1991) En la actualidad, el fondo humoral de esta respuesta al estrés está caracterizadapor un conjuntode reaccionessimpatoadrenomedularesincluyendo opioides,hormonasesteroideasy catecolaminas,las cualestienenun significativo efectosobrela actividaddel sistemacardiovascular.(Rheey cols, 1989) Los hipertensos reaccionan al estrés con una mayor elevación de la presión sanguineay delritmo cardiacoquelosnormotensos.(Shapiro,1961) Los agentesestresantesproductoresde una respuestaincrementadade la presión sanguínea incluyen factores psicoemocionales,inmovilización, dolor, exposición al filo o al calor. (Ohlsson y cols, 1982; Julius y cols, 1985) Seha demostradoque inclusoun estimulomoderadocomola infUsión de agonistas¡3-adrenérgicos(isoproterenol)induce a una exageradaexcreción de catecolaminas y AIvIP0, particularmente en los modelos de roedores con hipertensióngenéticacomo la rata espontaneamentehipertensa(SUR). (Hamet y cols, 1991) Los pacientes con hipertensión esencial y las SHR comparten una hiperrespuestasimpatoadrenal-cardiovascularcomún a los estímulosestresantes, (Goldstein,1983; Philipp y cols, 1978), incluyendo luz, mido (Hallback y cols, 1974),vibraciones,restricción,calory consumode etanol. Por otro lado, la adaptación al estrés (a la inmovilización, por ejemplo) puededisminuir la presión sanguíneaen los animaleshipertensos.(Kvetflansky, 1979) Los agentes estresantes ambientales como la temperatura modifican la expresión de la hipertensión. Así pués en numerosos estudios se ha observado que las presiones sanguineas en hipertensos humanos estaban correlacionadas significativamenteconla temperaturaambiental.Unapequeñaelevacióncrónicade la temperatura ambiental desciende la presión sanguinea. Diversos estudios parecen sugerir que hay una anormalidadde base genéticaen la sensibilidad al estrés ambientalen los modelosanimalesgenéticosde hipertensión.(Hamety cols, 1991) Las variaciones estacionalessobre la presión sanguíneaestán bien documentadaspor varios estudiosen sujetoshumanosy en ratasgeneticamente hipertensas. (Brennan y cols, 1982) También hay unacorrelacióncon la temperaturamedioambientalque es altamentesignificativatantoparala presiónsanguíneasistólicacomodiastólica. Losanimaleshipertensossontermosensíbles.(Malo y cols, 1989) Desdehacetiempo se conoceque el estrésmental,la ansiedad,así como diferentes estadosemocionalespueden ser factores desencadenantesde una elevaciónmarcadadela PA. (Folkow, 1987) Diversos autores consideran que la hiperactividad simpática, en la regulación del sistema cardiovascular, podría ser responsablede los períodosde -42- Introducción PA elevadaen los pacientescon hipertensiónlabil. Pareceser queesteestadode hipertensiónlabil, en buennúmerode casos,suponeel comienzode una historia natural de hipertensión esencia] (oscilaciones generalmente de origen paicógeno). En varios de estos casos,el aumento del gasto cardiaco pareceser la causa principal en la elevaciónde la PA (Fuentesy cola, 1991). Existe un gran número de trabajos recientesprocedentesde distintos gruposde investigaciónquesugierenqueunadescompensaciónnerviosaa nivel periférico o centralpodríaderivaren una elevacióncrónicade la presión arterial sistémica(Buckleyy Ferrario,1981). Es improbable que dicha hipertensiónde origen neurogénicoaparezca como resultadode la destrucciónregionalde tejido nervioso.Se contemplacomo másfactiblequela elevaciónde la PA seaconsecuenciade alteraciones sutiles, bien de ¡a organización, o en la neuroquimica del mecanismo nervioso involucrado en la regulacióncardiovascular(Fuentesy cols, 1991). -43- PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO Planteamientodel traba/o Estudios previos han demostrado que el estrés producido en un modelo experimental de deprivación social en la rata durantemas de 7 días cursa con aumentos de la presión arterial ydel umbral doloroso. Asimismo, antagonistasopioides inespecifleoscomoNaloxona,Naltrexona o Nalorfinareviertenestahipertensiónen unafaseinicial que oscilaentrelos 7 y los 30 díasdeaislamientode los animales,perono enestadiosmasavanzados. Porotraparte,el estréscursaconun incrementoen la concentraciónde CA en plasmay SNC,en particularhipotálamo,amígdala,bulbo raquídeoy locus cenileusen los primeros días del aislamiento, Estos hechos permiten establecer la hipótesis de que la respuestahipertensora inducidapor estrésen estemodelo experimentalseproducida,al menosenun periodo preco4poractivacióndel sistemaopioldecentral,entantoqueenel mantenimientode la HTA amaslargoplazo estaríanimplicadosotros tbctorescomolas CA cerebrales y/o periféricas. Basándonosenlos conocidosefectosde la neurotoxina6OHDA, queproduce la destrucciónselectivadeterminacionesnerviosasentractosnoradrenérgicosy evitala aparición de HTA en estemodelo experimental,intentamoscomprobarcualesserían sus efectossobre los receptoresopioides en ratascontrol y en ratas sometidas a aislamientoen diferentesperíodosde tiempo,así como el receptorimplicado en estos efectos. Hastael momentosehandescritohastanuevesubtiposdereceptoresopioldes, si bien el receptor mu, localizado en corteza cerebral, nucleo estriado, hipocampo, sustancia negra, locus ceruleus y nucleo del tracto solitario, constituye el 41% de la poblacióntotal y el receptordelta,presenteen nucleoestriadoy amígdalarepresentael 5O0/o. Ambos receptores regulan la sensación nociceptiva y, por su localizaciónen el NTS, el receptormuintervieneenel control reflejo del sistemacardiovascular. El sistemaopioideproduce efectossobrela liberaciónde CA y la implicación de estasrelacionesen la respuestahipertensivaesun hechoqueseintentabademostrar tambienenestetrabajo. El objetivo de estetrabajo ha sido, por lo tanto, determinarel patrón de distribución de las dos principales poblacionesde receptoresopioidesmu y delta en areas específicas del SNC en el modelo experimental de deprivación social, su implicación en la producción y/o mantenimiento de la hipertensión, sus relaciones con las CA y queefectosproducela lesiónespecíficade un areanoradrenérgicasobrela afinidad y número de estos receptores. -45- MA TERJAL YMETO»OS Material y métodos L MATERIAL . Aparato de medida de presión arterial Letica Equipo estereotáxico (David Kópf) Tomo dental(Emesco)y fresas(Mcisinger) CentrífUgaSorvalíRC-5B Sistemadecromatografiacompuestopor: BombaWatersM-5 10 (Waters) InyectorautomáticorefrigeradoRheodyneM 7010.PromisII (SparkHoliand) Columna Spherisorb ODS 2, Sm de tamaño de partícula. 150x3.9mm (SugelaborSA.) DetectoramperométricoWatersM 460 dotadode: TrasductorLC-l6 Electrododecarbono(WatersAS5) IntegradorSP4290(SpectraPhysics) Baño de ultrasonidos Transsonic T 460 (Elma) HomogenizadordeultrasonidosLabsonic-U(B.Braun) HomogenizadorUltra-TurraxT25 (Janke& Xunkel lka, Labortechnic) Bailo conagitaciónUnitronic-320(Selecta-P) Sistemade filtradoBrandelHarvesterM-24 (BrandelU.S.A.) Bombadevacio(Sogevac) Analizadorde liquido decentelleoTri-carb2500TR(Packard) EspectrofotómetroSpectronic601 (Spectronic) II. FARMACOSY PRODUCTOSOUIMiICOSUTILIZADOS . 2,4,5 trihidroxifenetilaminahidroclorido,6-hidroxidopamina(6OHDA) (Sigma) Pentobarbital sódico (Euta-Lender) (Normon) 3,4-dihidroxibenzilamina(3,4 Dliii) (Sigma) 3,4-dihidroxifenetilamina (Dopainina, DA) (Sigma> Noradrenalina (NA) (Sigma) Adrenalina (AD) (Sigma) (D-Ala2, D-Leu5)[tirosil-3,5-3H(N)]encefalina (DADLE 3fl), actividad específica 30,0 Ci/mmol (DupontNeN) (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5fltirosil-3,5-3H(N)]encefalina(DAMGO 3H), actividad específica 60,0 Ci/mmol (Dupont NeN) [D~PenZ5Jencefalina(DPDPE) (Sigma) Levorfanol (Sigma) Albúmina bovina sérica estandar (Sigma) Acido ascórbico(Merck) Sulfato magnésico (Merck) Hidratodecloral (Panreac) 1 ,2-Propiienglicol(Panreac) Etanol(Panreac) Acido cítrico (Merck) Acetatosódico(Merck) EDIA (Merck) -47- Materialy métodos Octilsulfato sódico (PIC) (Sigma) Metanol (Panreac) Acido perclórico 70% (Merck) Metasullito sódico (Merck) Bisulfito sódico (Merck) Tris (hidroximetil)-aminometano(Merck) Sacarosa (Merck) Polietilendiani.ida (Sigma) Líquido de centelleo: Cocktail-22 (Nomiascint) Reactivo para el análisis de proteinas de Herce Cooniassie [IT.ANIMALES DE EXPERIMENTACION . Los animales fUeron suministradospor Interfaunaibérica SA. (SanFeliú de Codines, Barcelona). Durante su estancia en nuestro estabulario, en el cual permanecieronhastael momentodel sacrificio, semantuvierona una temperatura constantede 210C y luz controlada(12h luzfl2h oscuridad), disponiendo en todo momentodeaccesolibre a la comiday la bebida. Se utilizaron 816 ratas Wistar macho de peso variable en firnción del experimentoenconcretoqueIberaallevarseacabo. Para la inducción del estadode estrés,el pesode los animalesal inicio del aislamientoIbéde90±lOg,estandolos animalesreciéndestetados.Enestudiosprevios realizadosen nuestrolaboratoriosehademostradoquela edadenla queseproduceel aislamientoes de sumaimportancia,siendotras el desteteel momentopreciso para realizarel aislamientoy conseguirla inducción del estadode estrésya que superada estaedadno se producedicha respuestaa pesarde quese aislen de igual forma los animales. Enaquellosexperimentosenlos queno seiba a inducirel modelode estréspor deprivación social se utilizaron ratas Wistarmacho de un pesode250±lOg. W. LESION DEL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL (serie sham),por lo cual sehadeterminadodenominaraestaserieshamcomoseriecontrol. V. MEDIDA INDIRECTA DE LA PRESION ARTERIAL CTa¡I-Cuffl . La medidaindirectadela presiónarterialseefectuóenun aparatoLetica, según el métododescritopor Buflag (1973).Consisteen un manguitoqueestáunido a un dispositivo neumático,generadorde una presiónqueva variandocidicamente,y un transductor.Cuandola presión en dicho manguito superala presiónsistólica de las arteriascaudales,estasse colapsane interrumpenla transmisiónde la pulsacióna la parte periférica de la cola. Cuandola presión del manguito descienderetorna la -49- Maten cdy métodos pulsaciónqueesdetectadapor el transductorquesehaacopladopreviamenteala cola dela ratacuyaseñalesadecuadamenteamplificaday registradaen un lectordigital. La frecuenciacardiacasemidió medianteun cardiotacómetroacopladoal sistema. Parapoder obtenerun registro establede la presiónarterial en el animal es precisoprocederpreviamentea la vasodilataciónde la arteriacauda],paralo cual se situó a la rata bajo una luz infrarroja duranteun periodo de tiempo de 5-10 mm, procediendoseinmediatamentea la medidadela presión. Los animalesse sometierona dicha medidadurantelos tres día.s previos al inicio decadaexperimentoconel fin de acostumbrarlesala manipulación.El valorfinal de la presión arterial sistólicacorrespondea la media de, al menos,ocho medidas consecutivas. VI. MODELODE ESTilESPORDEPRiVACIONSOCIAL Se utilizó un modelo por aislamientodescrito por pnmeravez por Gardinery Bennett (1977) y modificado posteriormentepor Naranjo y Fuentes (1985) y denominadoestréspor deprivaciónsocial. Parala inducción del estréspor deprivaciónsocial se alsló un determinado numero de ratas de seis semanasde edad (90±10g de peso) colocándolas individualmenteenjaulasestandar(25x25x14 cm> de paredesopacas,manteniéndose enaislamientocontinuodurante20ó 40 días, espaciode tiempoenel cualsemanifiesta el estadohipertensivo,considerándosequeesteseha producidocuandolos valoresde presiónarterial sistólicaseencontrabanpor encimadelos 20 mm de Hg dediferencia respectoa los valoresdel grupo control (animalesagrupados),constituidopor cinco ratasde la misma edadque las anteriores,quepermanecieronagrupadasduranteel mismo periododetiempo enjaulasde mayortamafio(40x33x16cm)y en condiciones similares.En estosanimalesno sepresentael estadohipertensivo. Comoconsecuenciade estudiospreliminaresrealizadosen nuestrolaboratorio sehanpodidodiferenciardosfasesen el mismo. lA FASE DEL MODELO DE AISLAMIENTO: Estafasese caracteriza porquetrasla administracióndel antagonistaopiaceonaloxona(lmgfkg, i.p.) a tos 15- 20 díasen animalessometidosa aislamientoseproduceunadisminuciónsignificativa (P<0,05)en los valoresde presiónarterial en dichosanimales,mientrasque la misma dosisno produceningunavariaciónen lapresiónarterialdelos animalescontrol, V FASEDEL MODELODE AISLAMIENTO: Enestecasosevió quetras 40 diasdesdeel inicio delaislamiento,la hipertensiónquescobservabaen los animales aisladosya no erarevertidapor la administracióndenaloxona(lmg/kg, i.p.) sin quese observaracomo en la V fase,ningunavariaciónen la presiónarterialde los animales pertenecientesal grupocontrol. -50- Materialymétodos VIL DETERMINACIONES BIOQUIMICAS. 1. DETER5nNACIONDE CAIIECOLANIINAS EN EL SISTEMA NERVIOSOCENTRAL. La determinaciónde los nivelesde catacolaminas(NA,AD y DA) en distintas estructurasdel SNC se realizó medianteunatécnicade cromatografla líquida de alta resolución con detección electroquímica siguiendo las condiciones descritas por Hammondy Jhonston(1984). Las catecolaminasson suceptiblesde ser detectadaselectroquimicamenteya que sus correspondientesortoquinonasson capacesde oxidarseen la superficie del electrododetrabajo. La selectividad de este método se pudo lograr medianteel ajuste de la diferenciade potencia]entreel electrodode trabajoy el dereferenciaen un valor que enel casodelascatecolazninasesdelordende0,60-0,70V. 1.1. PREPARACIÓNY EXTRACCIÓNDE LAS MUESTRAS . Los animalesse sacrificaron por la maflana(9-lOh a.m,) por decapitación medianteguillotina, extrayéndoserapidamentelas distintas estructurasdel SNC que iban asermotivo de estudio. Despuésde practicarseuna craneotomiay extraer la masa enceffilica se diseccionaroncuidadosamentesiguiendo el procedimientode Glowinski e Iversen (1966)enfilo a40C las siguientesestructurascerebrales:hipotálamoy bulboraquideo. Tambiénseextrajo la médulaespinaldel animal,paraello a nivel de la cinturapelviana seseccionala columnavertebral,enesepuntoseintroduceunajeringa, perflindiendoa presiónsuerofisiológico, estapresiónproducirála expulsióndela médulaespinalpor la zona craneal (en la zona de sección de la guillotina). Se congelarontodas las estructurasen nieve caxhónicay se conservarona unatemperaturade -800C hastasu valoración. Para esto se procedió a pesar las distintas estructurasen una balanzade precisión y se homogeneizaronen distintos volúmenes (dependiendode la concentraciónestimadade las diferentes aminas en cadauno de las estructurasa detemdnar)de unasoluciónde ácidoperclórico0,4Mi, metasulfitosádico0,IM y 3,4 DHiBA como estandar interno para la cuantificación de NA, AD y DA. La homogeneizaciónsellevó acaboconun homogenizadordeultrasonidosLabsonic-U. Despuéslasmuestrashomogeneizadasse centrifUgarona 1 SOOOxgdurante20 mm a40Cenunacentñft¡gaSorvailRC-SBdotadadeun rotor Sorvail 5H-MT, El sobrenadanteasí obtenidose inyectódirectamenteenel sistemade HPLC. 1.2. CONDICIONESCROMATOGRÁFI AS Se utilizó el sistema de HPLC descrito previamenteen el apartado de materiales.La columnautilizadaen el ensayofié unaSpherisorb005 2, de Sm de -5]- Material y métodos tamañode partícula,de 150x3,9mm.Los datosobtenidosquedaronregistradosen un integradoracopladoal sistema,parasu posteriorestudio. La fasemovil utilizadaestabacompuestapor: Acido cítrico 0,1 M Acetatosódico 0,1 M EDTA 0,15mM Octilsulfato sódico(PIC) lmM Metanol l0~/a PH 3,75 La adicciónde PIC como formador de par ionico es imprescindiblepara la detecciónde NA ya queal aumentarsu tiempo de retenciónimpide queeluyaconel frentede inyección. Ademástantoel pH comola concentraciónde solventeorgánicoson factores manejadosfrecuentementeconel fin de obtenerunaadecuadaresolución. Paralapreparacióndela fasemovil seutilizó aguadesionizada. Unavez preparadala fasemovil sefiltré avacio usandofiltros Millipore tipo HA con un tamañode poro de 0,45mm,degasificándoseposteriormentea vacio y en un bailo de ultrasonidosdurante al menos 20 minutos antes de pasarsepor el cromatógafo. La fasemóvil circulabapor el sistemaaun flujo de lmI/min, lo quedabalugara unapresiónde 2000psi,comovalormáximo,En el detectorelectroquímicose aplicó unadiferenciadepotencia]de+0,65Ventreel electrododereferenciay detrabajo.. ¿El volumendeinyecciónparatodaslas muestrasfhé de 20k1~ 1.3. CUANTIFICACIóN Y ANÁLISIS OlE LOS RESULTADOS . Se prepararonestándarescon NA, AD y DA en ácido perclórico 0,4M de variasconcentracionesadecuadasparala identificacióny cuantificacióndelasmuestras. Losestándaresasípreparadosy almacenadosa-200Csemantienenestablesduranteun més. Parapoder llevara caboun cuidadosocontroldel análisisde las muestrasy si eranecesariocompensarla pérdidagradualde sensibilidadquepodíasuflir el detector debidoasuusocontinuadoseinyectéel estándarcada5 muestras. Las concentracionesde catecolaminasen las muestras se determinaron mediantesuanálisisatravésdeun integradorSP4290. El valor obtenidode esteanálisisseconigió en fUnción de los volúmenesde homogeneizaciónutilizadosparacadatejido en concretoconel fin de expresardichos resultadosen pg/mgdetejido. -52- Materialymétodos 2. ENSAYOSDE FIJACION(“BINT>ING”). Este tipo de ensayosse lbndamentaen la capacidadque poseendistintos compuestosmarcadosradiactivamente,radioligandos,a bajas concentraciones,para unirsedeforma selectivaa aquellossidosdefijación por los quepresentanunaafinidad elevada. Ello nos permite determinar los receptores existentes en un determinado tejido y por tantotenerla posibilidadde observarlas variacionesquedistintos tratamientos puedenproducir, sobre la constantede disociación (KD) para cada receptory la concentración de receptores en el tejido estudiado (Bmax). Para el estudio de los receptoresoploides medianteesta técnicahay dos requerimientosmínimosexigibles:queseasaturable el procesode unión específica,esto esla diferenciade radiactividadligadaen presencia(binding inespecifico)y en ausencia (binding total) de un exceso de ligando no marcado (‘filo”); y que la unión sea estereoespecíiica. 2.1. METODOLOGIA DE LOS ENSAYOSDE FIJACION A RECEPTORES OPIOIDES(“BINDLNG”V Una de las caracteristicas más atractivas de los experimentos de fijación a receptoreses susimplicidad. Sin embargoestasimplicidaden la ejecuciónnitinariade los ensayos de binding contrasta con el complejo desarrolloque requierenestos ensayos hasta su validación. Para el estudio de la interacción opioide-receptor el método habitualmente utilizado esla medidade la fijación deligandosa preparacionesdemembranas.Uno de los isótopos que se utilizan más comunmente en el marcaje de ligandos es el tritio, el cual puede incorporarse a la molécula durante su síntesis o simplemente mediante el intercambio catalítico del tritio con átomos de H presentesen la molécula. Fundamentalmente el ligando marcado con tritio es biológicamente idéntico al compuesto no marcado y su purificación es sencilla, Las membranasson preparadasmediantehomogenizaciónen filo del tejido correspondiente, en un buiffer adecuado para el ensayo. A continuación el homogenizadose sometea varias centrilbgacionessucesivascon el fin de separarla fracción enriquecida en membranasplasmáticas.En este momentose procedea la resuspensióndel pellet obtenido,siendoen ocasionesnecesariaunapreincubaciónpara la disociaciónde los ligandosendógenosdeltejido. Una vez preparadas las membranas, se procede a los ensayos de fijación propiamentedichos, incubandodichasmembranascondistintasconcentracionesdeun radioligando en presencia y en ausencia de un ligando “filo” (no radiactivo) en exceso, que actua como desplazante. Se deben controlar determinadosfactores para asegurar las condiciones óptimasdelprocesode fijación: concentraciónestimadadel receptor,concentracióndel radioligando, tiempo y temperatura de incubación. Tras la incubación,seprocedea la separación de la fracción libre, para ello se realiza una filtración rápida al vacio, lavando cadatubo dos o tresvecescon 3m1 del buifer filo correspondiente,Por último se recogenlos filtros y bien secosse introducenen viales con un adecuadovolumende -53- Materialy métodos liquido de centelleo realizando un recuento radiométrico de la radiactividadcontenida en los filtros. El análisis de los resultadosse llevó a cabomediante la representaciónde Scatchard (Scatchard, 1949) en la que en abcisas se indican los valoresde “fijación específicat’ (BE fiuioles/muestra) y en ordenadas BE/DL, donde DL indica la concentración del ligando libre por muestra. La intersección de la recta con el eje de abcisas permite la cuantificación del número de receptores (Bmax) y la inversa de la pendiente de dicha recta es la constante de disociación (K 110. 2.1.a. Preparación de las membranas : Tras el sacrificio del animal por decapitación se extrajo cuidadosamente la masa encefalica y se disecaron en filo a 4 0C para su posterior análisis las siguientes estmcturas: hipotálamo, bulbo raquideo, corteza cerebral frontal, núcleo estriado e hipocampo. También se extrajo la médula espinal del aninial, siguiendo la misma técnica descrita en el apartado anterior, congelandose a -80<’C las estructuras basta su posteriorprocesamiento,Todoel procesosellevó a caboen materialplásticoy en ifio, a40C. Para la preparación de las membranas en primer lugar se pesó el tejido a analizar en una balanza de precisión; a continuación se homogenizó el mismo en 20 volúmenes de Buifer-Tris-CI SOmM con sacarosa 0,32M. Para ello se dieron 5 pulsos de 3 seg con el Ultra-Turrax a 13500 (min$ El homogeneizado se centrilligó 10 aún a lOOOxg (40C); se recogió el sobrenadante y se repitió la operación descrita para lavar una segunda vez el “pellet” obtenido. Se preincubó el sobrenadante en un bailo con agitación a 370C durante 15 mlii con el fin de disociar los posibles ligandos endógenos. A continuación se centrifixgó el sobrenadante preincubado a 20000xg durante 20 mlii recogiendo el “pellet”, Por último éstese resuspendióenun detenninadovolumendel Buffer-Tris-CI 50 mM (sin sacarosa) dependiendo de la estructura analizada mediante 5 pulsos de 3 seg en el Ultra-Turrax a 9500(minE5. 2.1.b. Ensayo de fijación a recentores onloides 8 y u : Una vez que se prepararon adecuadamente las membranas pasamos a realizar el ensayo de fijación a receptores (binding) propiamente dicho. Se estudió la población de receptores 8 y p en las distintas estructuras recogidas para su análisis. En tubos de plástico se dispone la mezcla de incubación que constó de: lOOmI de la muestra (suspensión de membranas) IOOml de distintas concentraciones desde 0,2 a 2nM del radioligandoDADILE parael estudiode receptores8 o del radioligandoDAMGO 3H agonista ‘-54- Materialy métodos opioideconalta afinidadparalos receptores~ parael estudiode dichotipo de receptores. lOOml de un ligando “filo” en exceso que actua como desplazante, habiéndose utilizado DPDPE(1OmM) agonista con alta afinidad para receptores 8 para el estudio de dicho receptor (buifer-tris-CI 5Omlvl en el caso del “binding” total) o levorfanol (1OmM) (o agua destilada en el caso del “hinding” tota]) para el estudiodereceptoresi’• 200nil de buffer-tris-CI5OmMparacompletarun volumenfinal deSOOn,l. El ordende adición fijé primero el Buifer-Tris-CI, a continuaciónel ligando “frio”, después el radioligando y por último las membranas preparadas, Esta mezcla se incubó en un bailo con agitación a 250C durante45 mm, a continuación se procede a la separación de la fracción libre mediante una filtración rápida a vacio, utilizando para ello un aparato de filtración BrandelHarvestery filtros de vidrio GFIC previamentetratadoscon polietilendiamida 1% (desde 2h antes del filtrado). Selavó cadatubo3 vecesconSmIde Buifer-Tris-CISniM filo. Serecogieron los filtros, se introdujeron en viales deplásticoopacocon 3m1 delíquido de centelleoy se realizó el recuento radiométrico de la radiactividad retenida en los filtros tras, 24h de reposo a temperatura ambiente en un contador 13 durante 1 mm/vial, 2.2. VALORACION DELA PROTEINA . La evaluacióndela concentraciónde proteínase realizóutilizando paraello el Kit de PierceCoomassie,el cual consisteen una soluciónlista paraser utilizada del reactivo Azul Coomassie 0-250. Esta técnica se basa en el método de Bradf’ord el cual utiliza el cambioen la absorbanciaenunasolución acídicaCoomassieazulbrillante O- 250 (Bradford, 1976).Tras la adición dela soluciónala proteinael coloranteseunea la proteina,resultandoun cambio decolor desdeel marrónrojizo al azul. El colorante seuneala proteinaidala atracción electrostática de los grupos sulfónicos del mismo. El compuesto coloreado que se origina es suceptible de ser medido espectrofotométricamente,aunalongitud deondade 595 mii. La coloraciónobtenida es establedesde5 a 9omin a temperaturaambientepudiendoprocedersea medir las muestrasinmediatamentedespuésde la adicióndelreactivo. Para realizar la valoración se utilizó una solución de albúmina bovina sérica estandar cuya concentraciónfijé de lmg/mi, a partir de la cual se prepara, posteriormente,una curva patrón mediante diluciones sucesivas para obtener concentraciones de proteina en un rango de 1 a 25 mg/ml. El análisis se realizó de la siguiente forma: - Se agitó cuidadosamente la botella con el reactivo antes de su uso. - Se preparó una curva patrón de un rango de 1 a 25 mg/ml con albúmina bovina sérica estandar en el mismo diluente en el que se encuentra la proteina a valorar. -55- Materialy métodos - Se afiadió O,5m1 de la dilución estandaro de la dilución problemaen un tubo de ensayo(utilizaremosel diluentecomo“blanco”>. Todoslos anáiisis se realizaron por triplicado. - Se afladió 0,5 ml del reactivo, agitando en Vortex. - Las muestras así preparadas se leyeron a 595nm transcurridos 5 mm de la adicióndel reactivo y hasta 90 mm como máximo despues de dichaadiciónenun espectrofotómetro Spectronic 601. Las concentraciones de proteina en las muestras problema analizadas se determinaron por extrapolación de las absorbancias en la curva patrón, VIIL ANÁLISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS Los valores se expresan como media + la desviaciónestándar(rEDE). La aplicación de la pmeba de Kolmogorov-Smimov a todas las variables estudiadasno penniterechazarel supuestodenormalidad de sudistribucióny por éste motivo sehanutilizadopruebasparamétricasdecontrasteestadístico. En el caso de datos apareados,la diferencia entre las medias se analizó mediantelat de Student, La comparaciónde las restantesvariablesserealizó medianteun análisisde la varianzay, cuandoéste mostró unadiferenciasignificativa, se empleó la pruebade Neuman-Keulsparacontrastesaposteriori, En todos los contrastesde hipótesisse rechazóla hipótesisnula cuando su probabilidadffié inferiora 0,05, -56- RI3SULTAbOS Resultados 1. EVOLUCION DEL PESO CORPORAL 1. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HNV POR 6OHIDA. Se observó tras 20 días de evolución un aumento normal del peso corporal en las series de animales control (C), animales pseudooperados (Sham) mediante la administración bilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el HINV (5) y en animales lesionadosbilateralmente mediante la administración de óng de 601-IDA en el haz noradrenérgico ventral y sacrificados transcurridos 20 días de realizada la lesión (L2Od). (Figura 1) No se encontrarondiferenciasES entrelas Seriesantessefialadasa los 20 días de evolución de las mismas. 2. EFECTO DEL AISLAMIENTO (DIEPIRIVACION SOCIAL) Se produce un incremento del peso corporal adecuadoal tiempo de evolución en la serie de animales control (C) y animales sometidos a aislamiento (A), tanto a 20 como a 40 días de evolución, (Figura 2) 3. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HNV CON 6OHDA Y POSTERiOR AISLAMIENTO Se obtuvo un incremento del peso corporal, en todas las series estudiadas, serie de animales control (C), animales lesionados bilateralmente (L) mediante la inoculación de 6OHDA en el haz noradrenérgicoventral, animalessometidosa aislamiento(A) durante20 ó 40 díasy animaleslesionadosy aislados(AL), tanto a 20 comoa 40 díasde evolución.(Figura2) II. EVOLUCION DE LA PRESIONARTERIAL 1. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HNV POR 6OHDA En la serie de animales lesionados bilateralmente (L) en el haz noradrenérgicoventral con6OHDA seproduceun ligero aumento,ES respectoal valor basal que se corresponde con la edad, en la presión arterial sistólica, tanto a 20 como a 40 días; esta serie, sin embargo, no presenta diferencias ESrespectoa la serie de animales control. (Tabla III, Figura 3) La presión arterial diastólica presentaun incremento ES (p respectoal valor basal (B) en la serie de animales sometidos a aislamiento (A), tanto a 20 como a 40 días de evolución. Esta serie presentaba diferencias ES respectoa los valores obtenidos en la serie de animales control (<2). (Tabla III, Figura 3) Para la presión arterial diastólica (¡rin Hg) seobtuvo también un incremento enla seriede animalessometidosa aislamiento(A), tanto a 20 comoa 40 díasde evolución.Dicho incrementopresentabadiferenciasES (p.C0,0Oí)respectoal valor basal y respecto a la sede de animalescontrol (<2). (TablaIII, Figura 4) 3. EFECTO DE LA LESION BILATERAL DEL HNV CON 6OHDA Y POSTERIOR AISLAMIENTO Al estudiar la evolución de la presión arterial sistólica seobservó que no seproducíanapenasvariacionesen la misma en la serie de animalescontrol (C), mientras que en el resto de las series si se dan variaciones. La serie de animales lesionados y además sometidos a aislamiento durante 20 6 40 días (AL), no presentaba prácticamente ningún incremento en la presión arterial sistólica durante el periodo de evolución. No presentaba diferencias ES respecto a las series de animales control y animales lesionados, mientras que sí habíadiferenciasestadisticamentesignificativas(P<0,001) respectoa la serie de animales sometidos aaislamiento. (TablaIII, Figura3) La presión arterial diastólica presenta un incremento ES (P y animales lesionadosy posteriormenteaislados(AL). De 20 a 40 díasde evolucióndescendióligeramentela presióndiastólicaen las series antes referidas aunqueseguíanmostrandodiferenciasES respectoa sus valoresbasales,quesecorrespondencon el peso.(Tabla1-II, Figura4) —64-’ Resultados III. ESTUDIO DE LA CONCENTRACIÓN DE CATECOLAMIINAS EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL (SNCI 1. ANÁLISIS DE LAS CATECOLALMINAS DEL SNC EN ANIMALES SOMETIDOS A LESIÓN DEL RItZ NORADRENERGICO VENTRAL CON ÓOHDA 1.1. Hipotálamo. Al analizarlasconcentracionesdenoradrenalina(NA) enel hipotálamose observóun ligero aumentono significativo de losnivelesen la sedecontrol tantoa los 20 comoa los 40 días,respectoa la concentracióna 1 día(TablaIV; Figura 1) Asimismo, en la seriede animalesconlesión bilateral (L> del haz noradrenérgico ventral (HNV) mediante la administración de óng de 6OHDA se obtuvo un descensosignificativo (P’c0,00l) a los 20 y 40 días respectoa los valores que presentabadicha seriea las 24h de realizadala lesión. Los valoresde la seriede animales lesionados(L) mostraban,así mismo, una diferencia estadisticamente significativa (ES)(P’c0,001)a los 20y 40 díasrespectoa los valoresobtenidosen la seriecontrol a dichoperiodode tiempo.(Figura5), Cuando se analizaron los resultadosobtenidoscon adrenalina(AD) se observó también en la sede control un ligero aumentoen la concentracióntanto a 20 como a los 40 días siendo dicho aumento no significativo. (Figura 5). En la serie de animales lesionados bilateralmente (L) en el HNV con ÓOHIDA, las concentraciones de AD experimentaban un descenso muy significativo a 20 y 40 días de la lesión respecto a los niveles obtenidos a 1 día. Asimismo,tantoa20 comoa 40 díaslas concentracionesobtenidasparala seriede animales lesionados (L) eran menores y presentaban diferencias ES (P’C0,00 1) respectoa los valoresde la seriecontrol, (Figura5) En cuantoa las concentracionesde dopamina(DA), los niveles eran muy similaresa 1, 20 y 40 díasdentro de la serie control, sin presentardiferencias estadísticas, (Figura 5). Respectoala seriede animaleslesionados(L) seobservóun ligero descensoen los nivelesde DA a 20 y 40 días,no presentandodiferenciasES. Entre los valores obtenidosparala seriede animalescontrol y animales lesionados no se encontraron diferencias ES. (Figura 5> 1.2. Bulbo raquídeo, Cuando se analizaronlas concentracionesde noradrenalina en el bulbo raquídeose observóen la serie de animalescontrol un ligero descensoa los 20 —65— 2000 81600 1 1 1200 ti, *.* E 800 Mt ~ 400- z o— 1 20 40 Tiempo (días) 300 ‘? 250 :t 200 br> 150 E [¡IT * ** ~t 100 ¡AtA¡Ir IT ~ 50 ti 0 1 20 40 Tiempo 400 —~ 350o 300 F 250 ór> 200 -~ 150 u, ~ 100 c1~ 50o o Tiempo (días) EEZc FIGURA 5 ConcentracionesdeNoradrenalina(NA, pg/mgtejido), Adrenalina(Al); pg/mgtejido), Dopamina(DA; pg /mg tejido) en el hipotálamodeanimalescontrol (<2)y con lesión bilateral (L) del haz noradrenérgico ventral mediante la administración de dng de 6- hidroxi dopamina(6OHDA). ***p En la serie de animales con lesión bilateral (L) del HNV mediante la administración de 601-DA, se observó •una pauta inversa a la descrita anteriormente para la serie control (C), en este caso se obtuvo un ligero aumento fi 20 días que tampoco era ES, Entre las series control y la serie de animales lesionados no se obtuvieron diferenciasES respectoala concentraciónde NA en el bulbo raquídeo.(Figura 6> Los niveles deadrenalinano presentabanapenasmodificacionestras 1, 20 y 40 días en las series estudiadas;serie de animales control (C) y animales lesionados (L). Tampocose obtuvieron diferenciasES entrelas sedesestudiadas;respectoa las concentraciones de AD. (Figura 6) Cuando se analizaron las concentraciones de dopamina en el bulbo raquídeono se encontrarondiferencias ES ni en las series estudiadasni entre dichas series. (Figura 6) 1.3. Médula espinal. La concentración de noradrenalina en la serie de animales control y animales lesionados no presentaba diferencias ES, siendo sus valores muy similares tanto transcurridos 1, 20 ó 40 días. Tampocose obtuvieron diferenciasentre la sede de animales control y animaleslesionadosrespectoa la concentraciónde NA en la médula espinal. (Figura 7) En cuanto a la concentraciónde dopandna(pg/mg tejido) en dicha estructura tampoco se observaron diferencias ES transcurridos 1, 20 y 40 días en la seriede animalescontrol y animalescon lesiónbilateral del HNV. As! mismo,no había diferencias estadísticas entre dichas sedes. (Figura 7) 2. ANÁLISIS DE LOS NIVELES DE CATECOLAMINAS LEN ANIMALES SOMETIDOS A AISLAMIENTO 2.1. Hipotálamo. En el hipotálamo las concentracionesde noradrenalina(pg/mg tejido) experimentaronun ligero aumentoa los 20 y 40 díasrespectoa los valoresbasales (B) en la seriede animalescontrol, no siendo dicho aumentoestadísticamente significativo. En la serie de animalesaislados(A) tambiénse apreció un ligero aumento en los niveles de NA a los 20 y 40 días no siendo dicho aumento estadísticamente significativo como en la serie control. (Figura 8) No se obtuvieron diferenciasES entre las series de animales control y animales aislados(A) respectoala concentracióndeNA en el hipotálamo. —67— ~ul 1 20 Tiempo (días) 40 1 20 40 Tiempo Ir/JA r~ 1 20 40 Tiempo ; pg/mg tejido) y Dopamina (DA; pg/mgtejido) en el bulbo raquídeode animalescontrol ( <2 ) y animales sometidosa lesiónbilateral(L) del haz noradrenérgico ventral mediante la administraci6n de 6ng cte 6-hidroxi dopamina(ÓOHDA). rl 2000 o ‘t 1600 1200 br>E 800 3 400 z o 300 3 250 200 ~ 150E ‘~b 100 50o < O 400 —~ 350o:~ 300 ~ 250 ~» 200 -~ 150 3 100 .c4 50 o o ñÉñS 1 20 Tiempo (días) 1 20 Tiempo (días) LIEIc FIGURA 7 Concentracionesde Noradrenalina(NA; pg/mg tejido) y Dopaniina (DA; pg/mg tejido) en la médulaespinalde animalescontrol (C) y animalessometidosa lesión bilateral (L) del haz naradrenérgicoventralmediantela administraciónde ángde 6-hidroxi dapamina(6OHDA). 2000 - 1600 - 1200 - 800 - 400 — o o 4> z 40 400 350 300 250 200 150 100 50 o o re ¿1> -4-. bflE 3 o 40 L Tiempo (días) t~ñI B 20 Tiempo (días> B 20 40 Tiempo (días) AEZZIc FIGURA 8 ConcentracionesdeNoradrenalina (NA; pg/nig tejido), Adrenalina (Al); pg/mg tejido) y Dopaniina (DA; pg/ntg tejido) en el hipotálamode animales control (<2) y de animalessometidosaaislamiento(A) durante20 6 40 días. B 20 40 2000 ~‘ 1600 1200 u, -~ 800 u,‘S 400 Z 0 300 3’ 250 ~‘ 200 150 E ~ 100 50 400 350o:~ 300 F 250 ~ 200 150u,~ 100 < 50 c o 40 B: basal Resultados Lasconcentracionesdeadrenalinatambiénpresentabanun ligero aumento a 20 y 40 días respectoa los valoresbasales(13) tanto en la serie de animales control como en la serie de animales sometidos a aislamiento; no siendo este aumento estadísticamente significativo. Tampoco se obtuvieron diferencias ES entrelas seriesantesreferidas.(Figura8) Las concentraciones de dopamina (pg/mg tejido) seguían una pauta similar a la observada en el caso de la NA y AL>; seobservóun ligero aumentotanto a los 20 comoa los 40 díasde evoluciónrespectoa los valoresbasales(B) en las sedes C y A. No seencontrarondiferenciassignificativasentredichasseries.(Figura8) 2.2. Bulbo raquídeo Cuando se analizaron las concentraciones de noradrenalina en el bulbo raquídeo en las series de animales control y animales sometidos a aislamiento se observóun ligero aumentoen ambassedesa los 20 y 40 díasrespectoa los valores basales (13), no siendo este aumentoestadisticamentesignificativo. Los valores obtenidosparaambasserieseranmuy similaresentresi no presentandodiferencias ES. (Figura9) Respecto a las concentraciones de adrenalina, en la serie control dichos valores eran muy similares tanto a tiempo basal como a los 20 6 40 días, sin presentar diferencias estadísticas. En la seriede animalessometidosa aislamiento(A) seobtuvo un ligero aumento en la concentraciónde AL> a los 20 días, aunque no fité estadísticamente significativo. (Figura 9) No se encontrarondiferenciassignificativas respectoa la concentraciónde AL> entrelasseriesdeanimalescontroly animalessometidosa aislamiento. En cuanto a las concentraciones de dopainina en el bulbo raquídeo no se encontrarondiferenciasES ni dentroni entre las distintas series (sede de animales controly sedede animalessometidosa aislamiento)ya quelos valoresobtenidosa los distintos tiempos eran muy similares. (Figura 9) 2.3. Médula espinal Las concentraciones de noradrenalina en las sedes de animalescontroly animalessometidosaaislamientofueronmuy similarestanto atiempobasalcomoa los 20 6 40 días, no obteniéndose diferencias ES en las sedes refeddas ni entre dichas series. (Figura 10) En la médula espinal no se encontraron en las concentracionesde dopamina diferencias ES en las sedes control y de animales aislados (A), tampoco había diferncias ES entre dichas series ya que los valores obtenidos para ambas eran muy similares. (Figura 10) —71-- ñfl B 20 40 Tiempo (días) ~I¡Iái 13 20 40 Tiempo ; pg/mg tejido) y Dopamina (DA; pWmg tejido) en el bulbo raquídeo de animales control (<2)y de anirnafrssometidosa aislamiento(A) durante 20 ó40 dÍas. B: basal. 2000 1600 F 1200 br> 800 ;iq ‘— 400 z o 300 250 ~ 200 150 -~ 100 ‘-~ 50 400350 o ~ 300 i~ 250 200 -~> 150 ‘5 100 -‘c 50 Q o 40 EZE c A B 20 Tiempo (días) 13 20 Tiempo (días) EZZEc FIGURA 10 ConcentracionesdeNoradrenalina(NA; pg/mgtejido) y Dopamina(DA; pgfmgtejido) en la médulaespinaldeanimalescontrol (<2) y animalessometidosa aislamiento(A) durante20 ó 40 días. 13: basal. 2000 - 1600 - 1200 - 800 — 400- o ore o> 4-~ br> z 400 ,—~ 350 ore 300 2 250 os~ 200 ~ 150 ‘E 50 o 40 40 A Resultados 3. ANÁLISIS DE LAS CATECOLAMINAS DEL SNC EN ANIMALES LESIONADOS CON 6OHDA. EN EL HM’ Y SOMETIDOS A AISLAMIENTO 3.1. Hipotálamo Al analizar las concentracionesde noradrenalina (pg/mg tejido) en el hipotálamo a 1 día seobservóun descensono significativo en la seriede animales lesionados bilateralmente en el haz noradrenérgico ventral mediante la administración de 6ng de 601-IDA y la sedede animaleslesionadosy sometidosa aislamiento respecto a la serie de animales control, mientras que la sede de animales sometidos a aislamiento presentaba unos niveles similares a los de la serie control. (Figura 11) Sin embargo a los 20 y 40 días se encontró un descensomuy pronunciado, estadísticamente significativo (p LasconcentracionesdeNA en la Seriede animalessometidosaaislamiento era, a los 20 y 40 días, muy similares a los obtenidospara la sedecontrol no presentandodiferenciasES. (Figura 11) Lasconcentracionesdeadrenalinasiguieronunapautasimilar ala descrita para las concentraciones de NA; a los 20 y 40 días. Transcurrido1 día seobservóun ligero aumentoen las concentracionesde AL>, aumento estadisticamenteno significativo, para las series de animales lesionados(L) y animaleslesionadosy sometidosaaislamiento(AL) respectoalos niveles obtenidos para la serie de animales control (C>, La serie de animales aislados presentó unos valores similares a los de la serie de animales control, (Figura 11) Transcurridos 20 y 40 días la Serie de animalessometidosa lesión bilateral (L) del haz noradrenérgico ventral mediante la administración de 6OHDA presentaba una concentración menor que la obtenida a 1 día en dicha serie (LP’cO,001) y que los valores obtenidos a dicho periodode tiempo parala seriede animalescontrol,presentandodiferenciasestadísticamentesignificativas. La serie de animales lesionados y sometidos a aislamiento (AL) presentó unosvaloresde concentraciónde AD a los 20 y 40 díasmenores que los obtenidos para las seriescontrol y de animalessometidosa aislamiento (A) presentando diferenciasES (PctO,O01)respectoa estaúltimaserie,(Figura11) Cuando seanalizaronlasconcentracionesde dopanhina(pg ¡mg tejido)en el hipotálamo se vió que a 1 día se presentaba un ligero aumento en dichas concentracionesen las series de animales lesionadosy animales lesionadosy sometidos a aislamientorespectoa losvaloresobtenidosparalas seriesde animales control y animales sometidos a aislamiento, siendo el aumento estadisticamente no significativo. Tanto a los 20 como a los 40 días de evolución no existe apenas variación entrelas seriesestudiadas,no presentándosediferenciasES, (Figura 11) —74-. 2000 — -ji ~AA 20 AAA Tiempo (días) * AA.r~.*II 20 Tiempo (días) Tiempo (días) L FIGURA 11 Concentracionesde Noradrenalina(NA; pg/mgtejido), Adrenalina(Al); pg/mgtejido) y Dopamina(DA; pg/mgtejido)en el hipotálamodeanimalescontrol (<2),animales con lesión bilateral (L) del haznoradrenérgicoventral mediantela administraciónde 6ng de 6OHDA, animales sometidos a aislamiento (A) durante 20 6 40 díasy animales lesionados y posteriormente aislados (AL). ***p IV. RESULTADOS OBTENIDOS EN LA FIJACIÓN AL RECEPTOR ti OPTOIDE 1. EFECTO DE LA LESIÓN BILATERAL DEL ifNi’ POR 6OHDA SOBRE RECEPTORES 5 OPIOJOES. 1.1. Hipotálamo En el estudio de la Bmax del receptor 5 oploide no se obtuvieron diferencias significativas entrela serie de animalescontrol (C) y la de animales pseudooperados(5). Por el contrario,sí se hallaron diferenciasES entrelas sedescontrol y animales pseudooperados respecto a las series de animales lesionados y sacrificados a las 24 horas de realizada la lesión (LId) o a los 20 días de realizadala misma(L2Od); así se observó que estas últimas sedespresentabanun descensoen la Bmax (finol/mg —76- 2000 — o 4> ‘5 z 1600 1200 — 800 — 400 — o 300 250 ~‘ 200 150 100 50 o 400 350 ,—~ 300o ~ 250 2 200 150 100 ~ 50 Q o ni rin no 1 20 Tiempo (días) 40 1 20 40 Tiempo (días) PI~I~I I1~, nrnm 1 EZEEJ c 20 Tiempo (días) L 40 AL FIGURA 12 Concentracionesde Noradrenalina(NA; pg/mgtejido), Adrenalina (AL>; pg/mg tejido) y Dopamina (DA; pglmg tejido) en el bulbo raquídeode animales control (<2>, animales con lesión bilateral (L) del haz noradrenérgico ventral mediante la administración de áng de 6ORDA, animales sometidos a aislamiento (A) durante 20 6 40 díasy animaleslesionadosyposteriormenteaislados(AL). 2000 — ore ti) 4-, 00 E z 1600 -. 1200 - 800 - 400 - o 400 - •—.~ 350 -o ~ 300 - ~ 250 - u, E 200 - I~ 150 - .< 100 — ~50- O ñu. níl, 1 1 LZEEC ‘lii. 20 Tiempo (días) 20 Tiempo(días) 40 40 AL FIGURA 13 ConcentracionesdeNoradrenalina(NA; pglmgtejido)y Dopamina(DA; pg/nig tejido> en la médulaespinalde animalescontrol (<2), animalescon lesión bilateral (L> del haz noradrenérgicoventral mediantela administraciónde áng de ÓOHDA, animales sometidos a aislamiento (A) durante 20 6 40 días y animales lesionados y posteriormenteaislados(AL). Resultados proteina>, descenso que era ES (P<0,001) respecto a las series C y 5. (Tabla IV, Figura 14) En cuanto al análisis de los resultados obtenidos para la KD (constante de disociación,nM) no se hallarondiferenciasES entrelas Seriesestudiadas.(Tabla IV) 1.2. Hipocampo Cuando se estudiaron los resultados de Bmax en el hipocampo se observó que apenas habíadiferenciasentrelas distintas series, unicamentese obtuvo un ligero aumento, no significativo, de la Bmax en las series de animales pseudooperados(5), animaleslesionadosy sacrificadosalas 24h (Lid) y animales lesionados y sacrificados a los 20 días (L2Od) respectoa los animalesde la serie control(C). (Tabla V; Figura 15) TampocoseobtuvierondiferenciasES parael otro parámetroestudiado,la KD, siendotodoslos valoresmuy similaresparalas distintasseries.(TablaV) 1.3. Núcleoestriado Respecto a los valores de Bmax se observó que dichos valores eran muy similaresparalas seriesde animalescontrol (C), animalespseudooperados(5) y animaleslesionadosy sacrificadosa los 20 días(L2Od), entantoque seaprecióun ligero descensoen el mismo en la serie de animaleslesionadosy sacrificadosa las 24h (Lid), aunque no presentabadiferenciasES respectoal resto de las series. (TablaVI; Figura16) Las constantesde disociación(1(n) obtenidaspara las distintas serieseran muy similares, presentando las series de animales lesionados y sacrificados a las 24h (Lid) y animales lesionados y sacrificados a los 20 días (L2Od) unos valores para la misma ligeramente inferiores a los observados en las series de animales Control (C) y animales pseudooperados(5), no siendo este descenso estadisticamentesignificativo. (TablaVI) 1.4. Bulbo raquídeo El bulbo raquídeo presentó un aumento estadísticamente significativo (P<0,0OI) de la Bmax (finol/nig proteina) en las series de animales lesionados y sacrificados a las 24h (Lid) y animales lesionados y sacrificados a los 20 días (L2Od) respecto a las series de animales Control (C ) y animales pseudooperados (5), presentando estas últimas valores muy similares, En este caso la serie que presentaba una mayor Bmax flhé la serie de animales lesionados y sacrificados a las 24h de realizada la lesión (LId). (Tabla VII; Figura 17) —79— TABLA IV Valores obtenidos en los ensayosdefijación al receptor8 (binding) en el hipotñlan¡o parala Bmax (finol/mg prat) y KD (nM) para las series de animales control (<2), animales pseudooperados (5) a los que se realiza la administraciónbilateraldevehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgicoventral,animalescon lesiónbilateraldelhaz noradrenérgicoventral mediantela administraciónde áng de ÓOHDA y que fueron sacrificados pasadas 24h (Lid> y animales con lesión do dicho haz que fueron sacrifcadosalos 20 díasdela lesión (L2Od). c Bmax (finol/nig prat) 44,66±4,03 47,00±5,02 KD (nM) 1,8±0,19 Lid 25,53±3,02 1,9+021 e.. L2Od 28,33±2,01 1,8±0,17 Los resultadosobtenidosse expresancomo ~±DE. (n=~ )~ número de experimentos realizado,paracadaexperimentoseutilizan las estructurascerebralesde 5 animales, ***p<0,OOl valores ES respectoa la serie de animales control (<2). ••@p 180 — 160 — 140 — ~ 120 — 100 — ~2 80- E t- 60- 40- E m 20- 0- S Lid L2Od FIGURA 14 Valores de Bmax (fmol/mg proteina) de los ensayos de fijación al receptor 8 en el hipotálamo en las seriesdeanimalescontrol (<2), animalespseudooperadosmediante la administración bilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgico ventral (5), animales con lesión bilateral del haz noradrenérgico ventral mediante la administraciónde áng de 6OHDA y sacrificadosa las 24 horas (Lid) y animales lesionadosy sacrificadosalos 20 díasde realizadala lesión (L2Od). ***p. ••@ps (S). 4 TABLA V Valores obtenidos en los ensayosde fijación al receptor8 (binding) en el hipocampo parala Bmax(finollmg prot) y 1(I) (niM) en lasseriesdeanimalescontrol (<2), animales pseudooperados(5) a los que se les realiza la administraciónbilateral de vehículo (ácidoascórbico)enel haznoradrenérgicoventral, animalescon lesiónbilateral del haz noradrenérgicoventral mediantela administraciónde 6ng de EOHDA y que fueron sacrificadospasadas24h (Líd) y animales con lesión de dicho haz que fueron sacrificados a los 20 tilas de la lesión (L2Od). Bmax (fmol/mg prat) (n5) KD (nM) (n5) C 87,71±9,02 2,5±0,19 S 95 00+ 10 10 2,3±0,21 Lid 90,47±12,06 2,8±0,30 L2Od 90,47±11,03 2,3±0,19 Los resultados obtenidos se expresan como tEDE. (n ): número de experimentosrealizado, para cada experimentose utilizan las estructuras cerebralesde 5 animales. 180 160 ~ 140 o ~. 120 o, 100 o 80 60 40E ~ 20 o FIGURA 15 Valores de Bmax (finol/mg proteina) de los ensayosde fijación al receptor8 en el hipocampo en las series de animalescontrol (Cl>, animalespseudooperadosmediante la administraciónbilateral de vehículo (ácido ascórbico)en el haz noradrenérgico ventral(s),animalescon lesión bilateral del haz noradrenérgicoventral mediantela administraciónde áng de ÓOHDA y sacrificadosa las 24 horas (Lid> y animales lesionadosy sacrificadosa los 20 díasderealizadala lesión(L2Od). C S LId L2Od TABLA VI Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor8 (binding) en el núcleo estriadopara la Bniax (fmol/mg prot) y lCD (nM) en las seriesde animalescontrol (<2), animalespseudooperados(5) a los que se realiza la administraciónbilateral de vehículo (ácido ascórbico)en el haz noradrenérgicoventral, animales con lesión bilateral del haz noradrenérgico ventral mediante la administraciónde6ng de 6OHDA y que fteron sacrificados pasadas 24 h (Lid) y animales con lesión de dicho haz que fueron sacrificadosalos 20díasde la lesión(L2Od) Bmax Ka (fmol/mg prot) (uM) (n5) (n=5) C 178,12±15,06 1,7±0,16 S 175,10±17,10 1,8+0 22 Lid 151,06±20,04 1,2+0 17 L2Od 166 04+19,03 1,3±0,18 Los resultados obtenidos se expresancomo ~±DE, (n ): número de experimentosrealizado, para cada experimentose utilizan las estructuras cerebralesde 5 animales. t <‘~L’lLNLNLMD4 180 160 . 140 L 120 ci~ 100 o 80 60 40 E ~ 20 o FIGURA 16 Valores de Bmax (fixiol/mg proteina)de los ensayosde fijación al receptor8 en el núcleo estriadoen las sedes de animales control (<2), animalespseudooperados mediante la administracián bilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgicoventral (S), animalescon lesi6n bilateral del haznoradrenórgicoventral mediantela administraciónde 6ng de 6OHDA y sacrificadosa las 24 horas(Lid> y animaleslesionadosy sacrificadosa los 20 diasde realizadala lesión(L2Od). C S Lid L2Od TABLA VII Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor8 (binding) en el bulbo raquídeo para la Bmax (finol/mg prot) y lCD (nM) en las series de animales control (<2), animalespseudooperados(5) a los que se realiza la adniinistraciónbilateral de vehículo (ácido ascórbico)en el haz noradrenérgicoventa!, animales con lesión bilateral del haz noradrenérgico ventral mediante la administración de Eng de ÓOHDA y quefueronsacrificadospasadas24 horas(Lid) y animalesconlesión de dichohazque fúcron sacrificadosa los20 díasdela lesión (L2Od). c Bmax (fmol/mg prot) (wz5) 60,24±8,06 65,71±7,04 lCD (nM) (n~5) 1=9=18 1,8±0,22 e.. Lid 117,47±15,10 2,7+0 28 *1<4< e.. A L2Od 96,38±9,02 2,2+0 25 Los resultadosobtenidosse expresancomo tEDE. (n= ): número cte experimentos realizado,paracadaexperimentose utilizanlas estructurascerebralesde 5 animales. 1<4<1. (TablaIX) 2. EFECTO DEL AISLAMIENTO SOBRE LOS RECEFTORES a OPIQIDES 2.1. Hipotálamo En el hipotálamo,se obtuvo unaBmax (fmol/mgproteina)en los ensayos de fijación al receptor8 parala seriede animalessometidosa aislamiento(A) que —88— TABLA VIII Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor 5 (binding) en la corteza cerebral para la Bmax (flnolimg prot) y KD (nM) en las seriesde animalescontrol (<2), animalespseudooperados(5) a los que se realizala administraciónbilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgicoventral, animales con lesión bilateraldelhaznoradrenérgicoventralmediantela administraciónde Gng de GORDAy quefueron sacrificadospasadas24 horas(Lid) y animalescon lesión de dicho hazque fueronsacrificadosa los 20 dias dela lesión(L2Od). c LTd Bmax ((¡noN/mg prot) (ir~5) 150,02±17,01 144,03±13,05 161,08±13,02 Ko (nM) (n5) 1,4±0,16 1,6+0 117 1,8±0,19 *1< e. MA L2Od 106,25±11,06 1,7±0,18 Los resultadosobtenidosse expresancomo KtDE. (n ): número de experimentos realizado, para cada experimento se utilizan las estructuras cerebrales de 5 animales. **pcz40,01; valoresES respectoa la seriede animalescontrol (C). •@p respectoa la seriede animalescontrol (<2), dicho aumentofijé ES (P=tO,0Ol)a los 40 días de evolución,(TablaXII; Figura22) Respectoala constantede disociación,lCD, no seobtuvierondiferenciasES entrelas series estudiadas,presentando,las mismas,resultadossimilares, (Tabla XII) 2.4. Bulbo raquídeo En el bulbo raquídeoseobservaun aumento,a los 20 díasdeevolución,en la Bmax correspondiente a la serie de animales sometidos a aislamiento (A) respectoala seriede animalescontrol, siendoesteaumentoES (P<0,01). A 40 díasde evoluciónseobtuvo un ligero aumentoen la Bmaxcorrespondientea la serieA, no siendoES. (TablaXIII; Figura 23) En estecasotampocoseobtienendiferenciasestadísticasentrelas Sedes estudiadasconrespectoala constantededisociación(Ko). (TablaXHI) 2.5. Cortezacerebral Estudiandolos valoresde Bmaxen el casode la cortezacerebralseobserva que estavariablepresentaun ligero aumento,tanto a los 20 comoa los 40 díasde —93-- NNNNN TABLA X Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor 8 (binding) en el hipotálamo para la Bmax (fmol/mg prot) y KO (nM) en las series de animales control (<2), animales con lesión bilateral del haz noradrenérgicoventral mediante la administración de 6ng de GQHJI)A (L), animales sometidos a aislamientoduranteun periodo de 20 6 40 días (A) y animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL). 20 días 40 días Bmax lCD Bniax lCD (fmol/mg prot) 44,66±4,02 (5) *1<1< (nM) (f¡nol/mg prot) 31,3±2,40 (5) (nM) C 2,50±0,25 (5) 1,83±0,16 (5> L 28,33±2,12 (5) 1,80±0,17 (5) 22 12+1 86 (5) 1,69±012 (5) 1< AAA AAA A 51 92+3,24 (5) 1,43±0,12 (5) 46,60±3,20 (5> 2,40±0,18 (5) ** * AA .ME AA mu. 34,13±1,98 (5) 1,15±0,34 (5) 26 50~1760 (5) 1,05±0,61 (5) Los resultadosobtenidosseexpresancomo!±DE. 1 L 90,47+1171 2,30±0,19 58,29±8,19 2,36±0,24 (5) (5) (5) (5) *1<4< AM AM A 143,82±814 (5) 2,60±0,17 (5) 95,30±8,40 (5) 2,40±0,19 (5) Los resultados obtenidos se expresan como iLDE. ***p~CQ4J01 valores ES respecto a la serie de animales control (C). AAAp<0,00l valoresES respectoala seriede animaleslesionados(L). ( ): número de experimentos, encadauno seutilizan las estructurascerebrales de 5 animales. 350 Tiempo(días) 300 250 ~ 200 -5 150 ~ 100 E ~ 50 o FIGURA 21 Valores de Bmax (flnol/mg proteina) de los ensayos de fijación al receptor 5 en el hipocampo para las series deanimalescontrol (<2) y animalessometidosa aislamiento (A) duranteun periodode 20 6 40 días. ***p’CO,OOl: valoresESrespectoa la seriedeanimalescontrol (<2) m ** * 20 40 r TABLA XII Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor5 (binding) en el núcleo estriadopara la Bmax (ftnol/mg prot) y KO (nM) en las series de animales control (<2), animales con lesión bilateral del haz noradrenérgico ventral mediante la administración de óng de ÓOHDA (L), animales sometidos a aislamiento durante un periodo de 20 ó 40 días (A) y animales lesionados y sometidosa aislamiento(AL). 20 días 40 días Bmax KD Bmax lCD (fmol/mg prot) (nM) 3,27±0,32 (5) *1< AL M Mu. 194,95±24,36 (5) 2,75±0,20 (5) 1 184 04+23,06 (5) 3 26-1-O 27 (5) Los resultadosobtenidosse expresancomoX±DE. **p<0,O1 valoresES respectoa la serie de animales control (C). Ap y animales sometidos a aislamiento(A) duranteun periodode20 ó 40 días. 1<1 a 40 díasde evolución.(TablaXV; Figura25) En cuantoa la otra variableanalizada,la lCD (constantede disociación)no seencontrarondiferenciasES, obteniéndosevaloresmuy similaresen lasdos sedes estudiadas.(TablaXV) 3. EFECTODE LA LESIÓN CON 6OHDA DEL HAZ NORADRENÉGICO VENTRAL ASOCIADA A AISLAMIENTO SOBRE LOS RECEPTORES 5 OPIOIDES. 3.1. Hipotálamo Estudiando ¡os valores de Bmax en el hipotálamo se observó que se produceun ligero descensorespectoa la seriede animalescontrol (C), ES, en las series de animales lesionadosbilateralmente (L) en el HNV mediante la administración de6ng de ÓOHDAy la seriede animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL), tantoalos 20 comoalos 40 días. Parala sedede animalessometidosa aislamiento(A) se obtuvieronunos valores ligeramentemayoresa los de la seriede animalescontrol (C), tanto a los 20 como a los 40 días de evolución; al último periodo de tiempo referido los valorespresentabandiferenciasestadistacamentesignificativas(P<0,001). Tambiénse obtuvierondiferenciasES entrelosvaloresde la Bmaxparalas sedesde animaleslesionados0) y la sedede animaleslesionadosy sometidosa aislamiento (AL) respecto a los valores obtenidospara la serie de animales sometidosa aislamiento(A), la cual presentabalos mayoresvalores para dicha variable. (TablaX; Figura26) Respectoa la constantede disociación(KD, nM) no seobtienendiferencias ES entrelas distintasseries,aunqueifieron la seriede animalescontrol(C) a los 20 días y la serie de animales sometidosa aislamiento(A) a los 40 días las que presentaronun mayorvalorparadichaconstante.(TablaX) —102— TABLA XIV Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor5 (binding) en la cortezacerebralpara la l3max (fmollmg prot) y KO (áM) en las seriesde animales control (C), animales con lesión bilateral del haz noradrenérgico ventralmediantela administraciónde 6ng de6OHDA (L), animalessometidosa aislamientoduranteun periodo de 20 ó 40 días(A) y animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL). 20 días 40 días Bmax lCD Bmax KD y animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL), ya queestaúltima sedeteníalos menoresvaloresparala Bmax. (TablaXII; Figura28) En cuantoa los valoresobtenidosparala otra variable estudiada,la KD, no seencontrarondiferenciasES entrelas distintassenes.A los 20 díasde evolución los mayores niveles fueron para las series de animales control (C), animales sometidosa aislamiento(A) y animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL); siendolosvaloresen todasellasmuy similares;a40 díasel mayorvalor parala Kn seobtuvoen la sedede animaleslesionados(L). (TablaXII) 3.4. Bulbo raquídeo LaBmax en el bulboraquídeopresentabaun aumentoES a 20 díasparalas sedesde animalescon lesión bilateral (L) con ÓOHDA del HNV y de animales sometidosa aislamiento (A) con respecto al valor obtenido para la serie de animales control; a 40 días las sedesanteriormentecitadas presentabanunos valoresmuy similaressin diferenciasES. —108— 350 7 mC~L 300— ~ 250 — 1~o,~ 200 — o 150— MA ioo— MA E r~dm 50- 20 Tiempo(días) FIGURA 27 Valores de Bmax (fmol/mg proteina)de los ensayosde fijación al receptor8 en el hipocampopara las seriesde animalescontrol (C),animalescon lesión bilateral del haz naradrenérgicoventral mediantela administraciónde áng de ÓOHDA (Li) y animalessometidosaaislamientoduranteun periodode 20 6 40 días(A). ***p, mientrasquea40 días¡téa la inversa,la serieconmayorvalor para la Ko fiJé la de animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL) y la serie con un menor valor para dicha constantefié la seriede animalessometidosa aislamiento(A). (TablaXIII) 3.5. Cortezacerebral A 20 díasde evolución, respectoa la seriede animalescontrol, seobserva un aumento para la serie de animales sometidos a aislamiento, que no fié estadísticamentesignificativo, mientrasqueseproduceun descensoen las seriesde animaleslesionadosbilateralmenteen el HNV conEOHDA y animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL). A 40 días,aunquelas seriessiguenunapauta similar ala descritapara 20 días de evolución,los valoresson muy similaresno obteniéndosediferenciasES. (TablaXIV; Figura30) Con respectoa ¡a KO, no se obtienen diferencias ES entre las distintas series.A 20 díasel mayorvalor para la Ko seobtieneparala serie de animales lesionados(L), y el menorvalor para la serie de animaleslesionadosy sometidosa asilamientto(AL); mientrasque a 40 díasde evoluciónsucedeal contrario, (Tabla XIV) 3.6. Médula espinal En la Bmax de la médula espinal, con respectoa la serie de animales control (C) seobtienenen el restode las sedesunasvaloresmuy similaresaunque ligeramentemayores,tanto a los 20 como a los 40 días. La serie de animales sometidosa aislamiento(A), a los 40 días, flié la única quepresentódiferencias ES (PcZO,01) respectoa la serie de animalescontrol(C). (TablaXV; Figura31) En cuantoa la otra variableanalizada,la constantededisociación(Ko) no se encontrarondiferenciasES entre las series.A los 20 díasel valor mayor se obtuvoparala seriede animaleslesionados(L) y el menorparala seriede animales control (C), mientras que a los 40 días los mayores valores para la Kn se obtuvieron para la sedede animales control y la serie de animalessometidosa —1)~1— 20 40 350 300 ~E250 ~ 200 o 150 AA~ 100 u.. E ~ 50 iii FIGURA 29 Valores de Bmax (fmol/mg proteina)de los ensayosde fijación al receptor8 en el bulboraquídeoparalas seriesdeanimalescontrol (C), animalescan lesión bilateral del haz noradrenérgicoventral mediantela administraciónde 6ng de 6OHDA (L), animalessometidosa aislamientoduranteun periodode 20 6 40 días(A) y animales lesionadosy sometidosaaislamiento. 300 - e’ o o. br) .5 E 250 - 200 - 150 - 100 - 50 — o ** u mil 20 Resultados aislamientoy los menoresse obtuvieronparalas seriesde animaleslesionados(L) y animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL). (TablaXV) y. RESULTADOS OBTENIDOS EN EL ESTUDIO DEL RECEPTORu OPIOIDE . 1. EFECTO DE LA LESIÓN BILATERAL DEL HNV CON 6OHIDA SOBRELOS RECEPTORES ji OPIOmES 1.1. Hipotálamo Con respectoa la Bmax (finol/mg proteina) obtenidaen los ensayosde fijación al receptorji en el hipotálamose obtieneun aumentoen los valoresde las series de animaleslesionadosen el HINV mediantela inoculaciónde 6OHDA y sacrificadosa las 24h (Líd) y de animaleslesionadosy sacrificadosa los 20 días de realizadadicha lesión (L2Od) con respectoa los valores obtenidospara las series de animales control (C) y animales pseudooperados(5), presentando diferenciasES (P 1.2. Hipocampo Parala Bmax en el hipocampono se encuentrandiferenciasES entre los valores obtenidos en las distintas series estudiadas,siendo todos ellos muy similares.(TablaXVII; Figura33) Tampocose encontraronpara la Ko (constantede disociación)diferencias ES entrelas diferentesseries.(TablaXVII) 1.3. Núcleoestriado En el núcleoestdadoseobtuvouna Bmax (finol/mg proteina)muy similar en la seriede animalescontrol (C), la seriede animalespseudooperados(5) y la seriede animaleslesionadosy sacrificadosa los 20 días (L2Od). Sí seobtuvo un menorvalor, conrespectoalas sedesantesmencionadas,de la serie de animales —115— TABLA XVI Valoresobtenidosen los ensayosdefijación al receptorg (binding)en el hipotálamo parala Bmax(fmol/mg prot) y KD (nM) en las seriesde animalescontrol (C), animales pseudoaperados(5) a los que se realiza la adniinistraciónbilateral de vehículo(ácido ascórbico)en el haz noradrenórgicoventral, animalescon lesión bilateral del haz noradrenérgicoventral mediantela administraciónde 6ng de 601-IDA y que fueron sacrificadospasadas24 horas(Lid) y animalescon lesión de dicho haz que fueron sacrificadosa los 20 díasde la lesión(L2Od). Bmax (fmol/mg prot) (n5) 157 05+18,93 163,20±22,54 KD (nM) (n=5) 2,39+012 2,50+0 16 * e LId 200,23±20,32 2,96±0,15 * • AA L2Od 190 26+19,55 2,44±0,16 Los resultadosobtenidosse expresancomo RiDE. (ir ): número de experimentos realizado,paracadaexperimentoseutilizan las estructurascerebralesde 4 animales. “pc0,05; *‘~‘«pen el haz noradrenérgicoventral, animales con lesión bilateral del haz noradrenérgicoventral mediantela administraciónde 6ng de 6OHDA y que fueron sacrificadospasadas24 horas (Lid> y animalescon lesión de dicho haz que fueron sacrificadosa los 20 díasde la lesión (L2Od). Binax (finol/mg prot) (n’~5) c Lid L2Od 184,22+2653 187,35±28,61 197,51+25 34 201,66±28,77 Kn (nM) (n5) 0,44±0,16 0,46±0,15 0,42±0,13 0,50+0 18 Los resultados obtenidos se expresan como RiflE. (n experimentosrealizado, para cada experimentose utilizan cerebralessefialadasde 4 animales, ): número de las estructuras 350 300 c~’ 250o 200 E 150 E ~ 100 ~ 50 o FIGURA 33 Valores de Emax (flnol/mg proteina) de los ensayosde fijación al receptor ji en el hipocampopara las series de animales control (C), animales pseudaoperados mediante la administración bilateral de vehículo (ácido ascárbico) en el haz noradrenérgicoventral (5), animalescan lesión bilateraldel haz noradrenérgica ventral mediantela administraciónde 6ng de 601-IDA y sacrificadosa las 24 horas (Lid) y animaleslesionadosy sacrificadasa los 20 díasderealizadala lesión(L2Od). C 8 Lid L2Od Re lesionadosy sacrificadosa las24h, diferenciaquetbéES (p. (TablaXVIII; Figura34) con respecto a la KO, no se hallaron diferencias ES entre las series estudiadas.El menor valor obtenidopara dicha constantefbé el de la serie do animaleslesionadosy sacrificadosa los 20 días de realizadadicha lesión. < loo (11 50 o FIGURA 34 Valores de Bmax (final/mg proteina)de los ensayosde fijación al receptor ji en el núcleo estriado para las series de animalescontrol (e), animalespseudooperados mediante la administración bilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgicoventral (5), animalescon lesiónbilateraldel haznoradrenérgicaventral mediantela administraciónde 6gg de ÓOHDA y sacrificados a las 24 horas (Lid) y animaleslesionadosy sacrificadosa los 20 diasde realizadala lesión(L2Od). **p. C S Lid L2Od TABLA XVIII Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor ji (binding) en el mnúcleo estriadopara la Bmax (finollmg prot) y KD (nM) en las seriesde animalescontrol (C), animalespseudooperados(5) a los quese realiza la administraciónbilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgicoventral, animales con lesión bilateraldelhaznoradrenérgicaventralmediantela administraciónde 6ngde 6OHDAy quefUeronsacrificadaspasadas24 horas(Lid) y animalescon lesión de dichohazque fueron sacrificadosa los 20 díasdela lesión (L2Od), Bmax (fmoVmg prot) 338,11±32,31 329,62±30,54 KD (nM) (n=5) 1 31+020 1,28±0,60 ** e. Lid 259,18±28,91 1,33±0,23 AA L2Od 326,02+2677 1,19±0,29 Los resultadosobtenidosse expresancomo ~±DE.(ir ): númera de experimentos realizados,paracadaexperimentose utilizan lasestructurascerebralesde4 animales. **p<0,O¶ valaresES respectoala seriedeanimalescontrol (O). ••pCO,0l valoresES respectoa la sededeanimalespseudooperados(5). Añpcto,Ol valoresES respectoa la seriede animaleslesionadosy sacrificadosa las24h (Lid). c s TABLA XIX Valores obtenidos en los ensayosde fijación al receptor ji (binding) en el bulbo raquídeopara la Bniax (fnioL/mg prot) y KD (nM) en las seriesde animalescontrol (O), animalespseudooperados(5) a los que se realiza la administraciónbilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgicoventral, animales con lesión bilateraldel haznoradrenérgicoventralmediantela administraciónde 6ng de 6OHDAy queftieron sacrificadospasadas24 horas(Lid) y animalescon lesiónde dicho haz que fUeron sacrificadosa las 20 díasdela lesión(L2Od), Bmax (fmol/mg prat) (n=5) 280 51+32,10 284,10±35,60 Ka (nM) (n5) 1,34±0,17 1,30±0,20 * e Lid 344 52+28,30 1,20±0,16 MA L2Od 250,26+3020 1,16±0,18 Los resultadosobtenidosse expresancomo ~tflB, (n= ): númerode experimentos realizado,paracadaexperimentoseutilizan lasestructurascerebralesde 4 animales, *p, animalespseudooperados mediante la administración bilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgicoventral (S), animalescan lesión bilateral delhaznoradrenérgicaventral mediantela administraciónde 6ng de 6OHDA y sacrificadosa las 24 horas(Lid) y animaleslesionadosy sacrificadosa los 20 diasderealizadala lesión (L2Od). *p. C S LId L2Od TABLA XX Valoresobtenidosen los ensayosde fijación al receptorp (binding) de la corteza cerebral para la Bmax (finol/mg prot) y KO (nM) en las seriesde animalescontrol (O), animalespseudooperados(5) a los que se realiza la administraciónbilateral de vehículo (ácido ascórbico> en el haz noradrenérgicoventral, animales con lesión bilateral delhaznoradrenérgicoventralmediantela administracióndo 6ngde 601-IDAy quefueronsacrificadospasadas24 horas(Lid) y animalescan lesión de dichohazque fUeron sacrificadosalos 20 díasdela lesión(L2Od). Bmax (fmol/wg prot) 185 88+30,53 188,46±24,62 191,33±28,97 225,00±26,32 Ka (nM) 0,81±0,2 0,84±0,33 1,13+032 0,97±0,18 Los resultadosobtenidosse expresancomo ~±DE. (n= >: númerode experimentos realizados;paracadaexperimentoseutilizan las estructurascerebralesde 4 animales, c Lid L2Od 350 300 ~‘ 250o ~ 200 E 150 < 100 CV 50 o FIGURA 36 Valores de Hmax (final/mg proteína)de los ensayosde fijación al receptorji en la cortezacerebralpara las seriesde animalescontrol (O), animalespseudooperados mediante la administración bilateral de vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgicoventral (5), animalescon lesión bilateraldel haznoradrenérgicoventral mediantela administraciónde 6ng de EOHDA y sacrificadosa las 24 horas(Lid) y animaleslesianadosy sacrificadosa los 20 díasderealizadala lesión (L2Od). O S LId L2Od TABLA XXI Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor g (binding) en la medula espinalpara la Bmax(final/mg prot) y KD (nM) en las seriesde animalescontrol (C), animales pseudooperados (5) a los que se realiza la administraciónbilateralde vehículo (ácido ascórbico) en el haz noradrenérgico ventral, animales con lesión bilateral del haz noradrenérgico ventral mediante la administración de 6ng de GOHiDA y que fueron sacrificados pasadas 24 horas (Lid) y animales con lesión de dicho haz que fueron sacrificados a los 20 días de la lesión (L20d). Bmax (fmolfing prot) jwwS) 173,82±20,50 180,10±22,60 lCD (nM) (n=5) 1,10±0,37 1,20±0,40 ** e. Lid 232,49±23,32 1,20+050 * e L2Od 220 62+24,51 1,15+047 Los resultadosobtenidosse expresancomo frDB. (n= ): número de experimentos realizados, para cada experimento se utilizan las estructuras cerebrales de 4 animales. *p en el haz noradrenérgico ventral (5), animales con lesión bilateral del haz noradrenérgico ventral mediante la administración de 6ng de EOHDA y sacrificadas a las 24 horas (Lid) y animaleslesionadosy sacrificadosa los 20 díasde realizada la lesión (L2Od>. *pIOWES 2.1. Hipotálamo En la Bmax obtenidaen los ensayosde fijación al receptorji, en la seriede animalessometidosa aislamiento(A) seobtieneun aumento respectoa la seriede animales control (C), tanto a los 20 como a los 40 días de evolución, encontrándosediferenciasES (p respecto a la sede de animales control (C), a 20 días los valores obtenidos para estas series eran muy similares. (TablaXXIV; Figura 40) En cuanto a la lCD (constante de disociación) no se obtienen diferencias ES entre dichas series. A los 20 días de evolución la serie de animalessometidosa aislamiento presentó una KD algo mayor que la de la sede de animales control, sin embargo a los 40 días sucedía lo contrario, siendo mayor el valor correspondiente a la serie de animales control, (Tabla XXIV) 129— TABLA XXII Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptorji (binding) en el hipotálamo para la Bmax (fniol/mg prot) y KD (nM) en las series de animales control (C), animales con lesión bilateral del haz noradrenérgicoventral mediante la administraciónde éng de 601-IDA (14, animales sometidos a aislamientoduranteun periodo de 20 6 40 días (A) y animaleslesionadosy sometidosaaislamiento(AL). 20 días 40 días Bmax Ko Bmax lCD (fmol/mg prot) (nM) (fmol/mg prot) (nM) C 326,52±45,3 (5) 1,94±0,32 (5) 290,00±52,6 (5) 1,94±0,27 (5) ** L 344,79+486 (5) 1,79±0,38 (5) 440,06±62,70 (5) 1 88+0 30 (5) * A 381,67+4250 (5) 2,05±0,22 (5) 392,07±59,8 (5) 1,88±0,29 (5) AL 391,69±50,80 (5) 2,05±0,18 (5) 363,53±43,80 (5) 1,99±0,33 (5) Los resultados obtenidos se expresan como X±DE. *pcZO,OS; * *p. EzJ o600 500 o ~ 400 300 — 200 E ~ 100 o FIGURA 38 Valoresde Bmax (fmol/mg proteina)de los ensayosde fijación al receptorji en el hipotálamo en las seriesde animales control (C) y animalessometidosa aislamiento durante un periodode20 6 40 dias. *p.CO,O5: valores ES respectode la seriecJe animalescontrol (C). * 20 40 Tiempo (días) TABLA XXIII Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor ji (binding) en el hipocampoparala Bmax y animales lesionadosy sometidosa aislamiento(AL). 20 días 40 días Bmax IC» Bmax Ko (fmol/mg prot) (nM) (fmoVmp prot) (nM) C 394,77+405 (5) 1,29±0,72 (5) 414,26±48,65 (5) 1,22±0,60 (5) * L 365,64±36,26 (5) 1,71±053 (5) 508,73±50,60 (5) 1,80±0,57 (5) A 390,4+4025 (5) 2,88±1,23 (5) 467,87±44,3 (5) 0,94±0,62 (5) * AL 428,96±52,5 (5) 1,18±0,62 (5) 522,82±55,60 (5) 1,20±0,59 (5) Las resultadosobtenidosseexpresancomo!±DE.~p y animales sometidos a aislamiento(A) duranteun periodode 20640días. ED c 20 40 Tiempo(días) TABLA XXVI Valores obtenidosen los ensayosde fijación al receptor ji (binding) en la cortezacerebralpara la Bmax (final/mg prat) y LCD de los ensayosde fijación al receptorp en la cortezacerebralen las sedesde animales control (C) y animales sometidos a aislamiento(A) duranteun periodode20 6 40 días. **p.CO,Ol: valoresES respectoala sededeanimalescontrol (C) ED o 1* 20 40 Tiempo , animales con lesión bilateral del haz noradrenérgico ventral mediante la administración de óng de EOHDA <1-.), animalessametidosa aislamiento durante un periodo de 20 6 40 días (A) y animales lesionadosy sometidosa aislamiento (AL). 20 dfas 40 dfas Bmax KD Bmax KD ((mal/mR prot) (nM) ((mol/uz prat) (nM) C 160,48±21,80 2,73±0,29 190,15±32,5 1,62±0,27 (5) (5) (5) (5) L 171,63±23,20 2,59±0,33 243,47±35,90 1,88±0,33 (5) (5) (5) (5) A 168,33±20,503 24+0,42 200,23±32,6 1,60±0,28 (5) (5) (5) (5) A AL 172,58±23,90 (5) 3,04±0,36 (5) 187,81±28,70 (5) 1,48±0,37 (5) Los resultadosobtenidos se expresan como !±DE.Ap<0,05 valores ES respectoa la seriede animaleslesionados(L). ( ): númerodeexperimentos,en cadauno seutilizan lasestructurascerebrales de 4 animales. 600 - 500 — o 1-o. ti) E o E 400 — 300 — 200 — 100 - o ED o nl 20 Tiempo(días) té 40 FIGURA 43 Valores de Bmax (final/mg proteína)de los ensayosde fijación al receptorji en la médula espinal en las seriesde animalescontrol (C) y animales sometidos a aislamiento(A) duranteun periodode 20640 días, Resultados 3. EFECTO DE LA LESIÓN CON 6ORDA DEL HAZ NORADRENÉRGICO VENTRAL ASOCIADOA AISLAMIENTO SOBRE LOS RECEPTORES ji OPIOIDES 3.1. Hipotálamo Enlos ensayosde fijación al receptorji en el hipotálamoseobtuvoa las20 días de evolución, respectoa la Bmax (final/mg proteina), un ligero aumento respectoal valor obtenido para la serie de animales control de las series de animales lesionados (L), animales sometidos a aislamiento (A) y animales lesionadosy sometidosa aislamiento(AL), aunqueno se encuentrandiferencias ES. A los 40 díasseobtuvo un mayorvalor para la Bmax en todaslas series estudiadasrespectoal obtenido en la serie de animales control, siendo este aumentoES paralas sedesde animaleslesionados(L> y animalessometidosa aislamiento(A). (TablaXXII; Figura44) Respectoa la constantede disociación,no se encontrarondiferenciasES entrelas seriesestudiadasobteniéndoseparatodasellasunosvaloresmuy similares tantoalos 20 comoa los 40 díasde evolución,(TablaXXII) 3.2. Hipocampo Conrespectoa la Bmax a los 20 díasla serie de animaleslesionados(L) presenta un valor ligeramente menor que el obtenido para la serie de animales control (C); las series de animales sometidosa alsímiento (A) y de animales lesionados y sometidosa aislamiento(AL) teníanparel contrarioun mayor valor, mostrandodiferenciasES (p’CO,O5) respectoal obtenidoparala seriedeanimales control (C); también las citadas series(A y AL) presentabandiferencias ES (p.cO,01)respectoa la seriedeanimaleslesionados(L). (TablaXXIII; Figura45) Al analizarla otravariableestudiada,la constantede disociación,Kn, no se obtuvieron diferenciasES entre las distintas seriesrealizadas.A los 20 días de evolución la serie quemostrabaun valor menor era la de animales lesionadosy sometidosa aislamiento(AL> mientrasque el restode las seriespresentabanunos valoresmuy similares;a 40 díasde evolución el mayor valor la tenía la seriede animalescontrol (C), mientras que el resto de las series tenían unos valores ligeramentesmenoresy muy similaresentreellos, (TablaXXIII) 3.3. Núcleoestriado Si se analizanlos resultadosobtenidasparala Bmax en el núcleoestriado en los ensayosde fijación al receptorji seobserva,a los 20 díasde evolución,para la serie de animales lesionados(L) un ligero descensocon respecto al valor obtenidopara la seriede animalescontrol (e), la sedede animalessometidosa aislamiento(A) presentabaun valor muy similar al obtenidoen la seriede animales —143— 600 500 .4-ao 1-a- E o E 400 300 200 100 o m c AL FIGURA 44 Valores de Bmax (final/mg proteína)de los ensayosde fijación al receptor ji en el hipotálamoen las seriesde animalescontrol (C), animalescon lesión bilateral (L) del haz noradrenérgicoventral mediante la administración de 6ng de 6OHDA, animales sometidosa aislamientoduranteun periodode 20 6 40 días (A) y animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL). *pcCO,O5; **p.cO,OI: valoresES respectade la seriede animalescontrol (C), ** * 20 40 Tiempo(días) 600 500 4-. 2 400o. 300 ‘—‘ 200 ~ 100 o FIGURA 45 Valores de Bmax (fmoVmg proteína)de los ensayosde fijación al receptor~t en el hipocampoen las seriesde animalescontrol (O), animalescon lesiónbilateral(L) del haz noradrenérgicoventral mediantela administraciónde 6ng de EOHDA, animales sometidosaaislamientoduranteun periodode 20 6 40 días(A) y animaleslesionadosy sometidosaaislamiento(AL). *p. A los 40 días deevoluciónel mayor valar obtenidoparala lCD fijé el de al serie de animales lesionados (L), y el menor ¡té para la serie de animales sometidosa aislamiento(A), las otras dos series restantes(C y AL) presentabanunosvaloresmuysimilares. (TablaXXIV) 3.4. Bulbo raquídeo En el bulbo raquídeo la Bmax obtenida en los ensayosde fijación al receptorji, a las 20 díasde evolucióneramuy similar en todaslasseriesrealizadas, siendo su valor ligeramente menor en la serie de animales sometidos a aislamiento (A) conrespectoala seriede animalescontrol (O). A los 40 díasde evoluciónse obtuvoun mayorvalor dela Bmax (frnollmg proteina) en las series de animales lesionados (14, animaleslesionadosy sometidos a aislamiento (AL), con respectoa la seriede animalescontrol el mayor valor parala En lo presentabala sede de animales lesionados(14 mientrasque el menor valor era el de la serie de animalessometidosa aislamiento(A). A los 40 díasde evolución,el mayor valor parala lCD lo presentabala seriede animaleslesionados,mientrasqueel restode las seriespresentabanunosvaloressimilaresparadichavariable. (TablaXXV) 3.5. Cortezacerebral A los 20 días de evolución la Bmax obtenidapara las distintas series realizadasen los ensayosdefijación al receptorji , fié muy similar en todasellas, no habiendodiferenciasES. A los 40 días de evolución la Bmax presentabaun valor mayor y ES (p’CO,01) para las series de animales lesionados (Lj, animales sometidos a —146— 4.J o ~1 EJ O L AL 600 500 400 300 200 100 o FIGURA 46 Valores de Bmax (finol/mg proteina)de los ensayosde fijación al receptor ji en el núcleoestriadoai las seriesdeanimalescontrol (C>, animalescon lesiónbilateral (L) delhaznoradrenérgicoventralmediantela administraciónde 6ngde 601-IDA, animales sometidosa aislamientoduranteun peñadode20 6 40 días (A) y animaleslesionadosy sometidosaaislamiento(AL). *pc~O,O5:valoresES respectoala seriedeanimalescontrol (C). * 20 40 Tiempo(días) 600 500 400 do 300 ‘— 200 ~ 100 o FIGURA 47 Valores de Bmax (flnol/mg proteina)de los ensayosde fijación al receptorji en el bulbo raquídeo en las seriesde animalescontrol (C), animalescon lesión bilateral (L) del haz noradrenérgicoventral mediantela administración de 6ng de 6OHIDA, animalessometidosa aislamientode20 ó 40 días(A) y animaleslesionadosy sometidos a aislamiento(AL). **p.CO,Ol: valoresES respectoa la seriedeanimalescontrol (C). ¿Ap Resultados aislamiento(A) y animaleslesionadosy sometidosa aislamiento(AL) respectode la seriede animalescontrol (C). La seriede animales lesionadosy sometidosa aislamientotambiénpresentabadiferencias ES respectoa la serie de animales lesionados (L). (Tabla XXVI; Figura 48) Con respecto a la otra variable analizada, la Kn, no se encontraron diferencias ES entre las series realizadas. A los 20 días de evolución el mayor valor para la Kn lo presentó la serie de animales control (C), mientras que el resto de las series tenían unos valores algo inferiores y muy similares. A los 40 días de evolución los valores de todaslas series eran muy parecidos presentando el mayorvalor la seriede animaleslesionados(L). (Tabla XXVI) 3.6. Médula espinal En la médula espinal, en los ensayos de fijación al receptor LL para la Bmax se obtuvieron a tos 20 días de evolución unos valores muy similares para todas las series realizadas, sin que se encontraran diferencias ES entreellas. A los 40 días se observa un ligero aumento de la Bmax en la serie de animales lesionados (L) respecto a la serie de animales control (C>, no siendoES, mientras que las series de animales sometidos a aislamiento (A) y animales lesionadosy sometidosaaislamiento(AL) presentabanunasvalares muy similares a los de la seriecontrol (C). La sedeAL presentódifernciasES (pERTENS1VA AL ESTilES PRODUCIDO POR DEPRiVACION SOCIAL . La caracterizacióndel modeloexperimentalutilizado en estetrabajohabla sido llevada a cabo previamenteen nuestro laboratorio (Jiménez,1990;Montero,1992; Parra, 1993). No obstante,y paracomprobarla respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocialy su modificaciónpor la lesióndel HNV, se procedióavalorarlas PA sistólicay diastólicaen todoslos gruposde animalesutilizados>obteniéndoseun aumento estadisticamentesignificativo a partir de los 12 días de aislamiento, incrementoquealcanzócifras máximashaciala tercerasemana,sin modificacionesde la FC. Esto último no concuerda con resultadosprevios obtenidospor Naranjoy Fuentes(1985) que encontraronvariacionesen la FC, y que puedeser debidoa las variacionesgenéticasquepresentacadaestirpede ratas(Trippodoy Froblich,l981). El aumentade la PA es reversiblepor Naloxonay/o resocializaciónde los animalesen las 3 primerassemanasde aislamiento.A partir de esetiempoya no se consiguerevertir el aumentode la presión arterial ni con Naloxonani mediantela resocialización. Paravalidar el estrésproducido en estasrataspor el aislamientonos hemos basadoendeterminacionesanterioresdeglucocorticoidesy beta-endorfinascirculantes, El eje HITA es uno de los principales componentesde la respuestaal estrésy se manifiesta por un aumentode ambas sustanciasen plasma, considerándoseque el incrementodelosnivelesdeglucocorticoidescirculantesesuno de losparámetrosque serepitemasfrecuentementeenlos distintostipos deestrés(Selye,1976). Seha demostrado(Iglesiasy cols,1991) quelos niveles de corticosteronase encuentranaumentadosdemanerasignificativaa partir de los 20 díasde aislamiento,lo que coincidecon los resultadosobtenidospor Bennety Gardiner<1978), a pesarde que estos autores encuentranniveles mas elevados, aunque la proporción del incrementoseala misma,la quepuedeserdebidoala edadde las ratasempleadasoa la hora del día en que se sacrificaronlos animalesya que esteúltimo factor puede modificar los resultadosa causade los ritmos circadianosde los glucocorticoides (Shimoday cols,1988) Losnivelesplasmáticosdebeta-endorfinas,tambienseencontraronelevadosen ambas fases del aislamiento (datos no mostrados), así como el RNA de preproencefalinaen el hipotálamode ratasen los primeros díasdel aislamiento,y los péptidosderivadosde Met-encefalina.No seobservaronincrementosde esteRNA ni en otrosnúcleoscerebralesestudiados(estriado,hipocampoy bulboraquídeo)ni en el hipotálamoen periodosde aislamientomasprolongados(Iglesiasy cols,, 1992>. Estas diferencias indican quela produccióny el mantenimientode la HTA son procesos diferentes. -153- Discusión ff EFECTODE LA LESION DEL HNV SOBRELA PRESIONARTERIAL . En nuestro trabajo, cuando se lesionó el HINV con 6OHDA en animales jóvenes,se encontróuna disminución de las presionesarterialesque se mantuvo a todos los tiempos estudiados.Si los animales eran sometidosa deprivación social inmediatamentedespuésde la lesión, las hipertensionesarterialesno seproducían, lo queindica un claro predominiode los efectosde la lesióndel HNV sobrelos efectos producidospor el aislamientoprolongado.Montero(1992) demostróquele lesiónno disminuía la presiónarterial elevadacuandolas ratashablan estadoaisladasdurante períodosdetiempode20 díaso mas. La importancia de la 6OHDA como agente citotóxico radica en que es recaptadaselectivamentepor las neuronas catecolaniinérgicas,donde se oxida rapidamentea compuestosque causanla degeneraciónde las mismas(Jonsson,1980; Kostrzeva,1989),lo quehahechoqueseaunaherramientamuy útil en el estudiodela fUnción de los sistemas de neurotrasmisión monoaminérgicaen la regulación cardiovascular,comportamentaly neuroendocrina(Van denBuusey cols,1984;Coley Robins,1987;Haas y George,1989).Ha sido empleadaen diversos modelos de hipertensiónexperimentalparaestudiarlos mecanismospatogénicosqueoriginan el aumentode la PA, tanto en ratascon hipertensiónrenavascular(Dargiey cals.1976> comoen SHR (VandenBuusey cols, 1986). En todos estoscasosla lesión atenúael desarrollodela hipertensión, La relevancia cardiovascularde las vías noradrenérgicasascendentesestá basadaen la inervaciónquerecibenestructurastalescomoel hipotálamoa la corteza cerebral desde neuronas naradrenérgicassituadas en regiones pontino-bulbares (Ungersted,1971;Lindvall y Bjñrklund,1974).Del mismomodonucleoshipotalámicos proyectan densamenteal nucleo del tracto solitario, dondetiene lugar la primera sinapsis de las aferencias barorreceptoras (Palkovits,1980). Dichos tractos noradrenérgicosparecenmediardiversasrespuestascardiovasculares(Lightmany cols., 1983,1984a,1984b)y debido a esto hemos elegido el HNV como lugar de administraciónde la 6OHDA. La disminuciónde la presiónarterialya habla sido descritapor otros autores (Kornerycols.,1978;VandenBuuseycols.,1991)estudiandolos efectoscirculatorios agudosde la inyección central de ÓOHDA en conejos.Encontraronuna elevación transitoriade la PA acompafladapor una caldagradualde la FC que podría estar ocasionadapor la recaptaciónde la neurotoxinaen neuronasnoradrenérgicasy el desplazamientosubsiguientedelneurotrasmisorque seproducirlaantesde sus efectos neurodegenerativos.Este mismo resultado fUe obtenido en nuestro modelo experimentalporMontero(1992)quedemostróunarespuestahipertensivatransitoriaa las 24 horasdela administraciónde la neurotoxina,recuperándoselas lecturasbasales de PA sistólica y diastólica tras un periodo breve de tiempo (2-3 días). Dicho incrementodePAeraefectodirectodeJalesión,ya queno seproducíaen losanimales sometidosaoperaciónficticia. Estopodríaestaren relaciónconcambiosen el sistemanoradrenérgico,puesla misma autoraencontróun aumentoen los nivelesde MHPG en bulbo raquídeoy -154- Discusión médula espinal 24 horas despuésde la lesión con ÓOHDA lo que podría estar relacionadoconla elevacióndela presiónarterialqueacontecíaenesemomento. RL VALORACION DE CATECOLAMINAS EN AREAS CEREBRALES 1. CATECOLAMINAS EN RATAS SOMETIDAS A AISLAMIENTO. Teniendoen cuentala regulaciónde la presiónarterial mediadapor diversas areasdel SNC y la implicaciónde las catecolanuinas,seestudiaronsusconcentraciones en hipotálamo, bulbo raquídeo y médula espinal, no encontrándosevariaciones significativasenningunadeellasa los tiemposestudiados, Esto que concuerdacon los resultadosde Thou y cols (1976) quienes solamenteencontraronincrementode las concentracionesde NA en nucleos de la cortezacerebrala las 28 semanasde aislamientopero no en periodosmascortosde tiempo. Un incrementoen los niveles de neurotrasniisorespuede ser debido a un incrementoen la síntesis,disminucióndel metabolismoo variacionesenla velocidadde renovación. Hay evidencias de un mecanismocompensatoriopor disminución de la velocidadde renovacióndemostradoporMontero(1990) queobtuvounadisminución del principal metabolitocerebraldeNA (MHPG) enhipotálamo, transcurridos20 días de aislamiento y que coincide con las resultados obtenidos en otros modelos experimentalesde HTA. Sautel y cals.(1988) encontraronuna disminución de la actividadde estesistemadeneuratrasmisiónendistintosnucleosbipotalámicosderatas geneticanientehipertensasde la razaLyon, resultadosqueson coincidentesconlos de Wijneny cols. (1980)en SHR. Numerososestudiosseñalanquela concentraciónde MHPG en el SNC esel indicadormas sensiblede la velocidad de renovaciónde NA y de este modo, la formación del mismo refleja la actividad fUncional de las neuronasnoradrenérgicas centrales(Tanakay cols., 1982;Elsworthy cols,, 1983;Migasy cols.,1986). Si la mencionadavariación en el tono noradrenérgicoduranteel aislamiento estácorrelacionadaconel aumentode la presiónarterial, por el momento es solo una hipótesis,puestoquetambienesposiblequedichavariaciónseareflejo deotros efectos fisiológicos que acompaflanal estrás(Weiss y cols,, 1989) y quetambien han sido asociadosconmodificacionesdel tonocatecolaminérgicocentral. -155- Discusión Estaconsideraciónalcanzamayorrelevanciaal tratarsedel hipotálamo,región cerebral que juega un papel fUndamental en la coordinación de las respuestas neuroendocrinasy de comportamiento(Swansony Swachenko,1983; Yang y cols,, 1990;Bachelardy cols.,1992). Por el contrario,el bulboraquídeoy la médulaespinalson zonasque desempeñan, casi exclusivamente, ¡Unciones autónomas como el control cardiovascular,sin aparentesimplicacionesdirectasenel fUncionalismoendocrino. En nuestrascondicionesexperimentalesla hipertensiónsemanifestabaa los 10- 15 días de iniciado el aislamiento, mientras que la disminución en los niveles hipotalámicosde MiHP<3 aparececon posterioridada la alteracióncardiovascular(20 díasde aislamiento). Esto indica que la modificación noradrenérgicahipatalánilcaes secundariaal aumentode la presiónarterialy puedeserque dichamodificaciónsearesultadode un reflejo fisiológico compensatoriodesencadenadocon objeto de reducir la presión arterial en estosanimales, lo queseria concordanteconlos resultadosde Saavedra (1981)enel casoderatasSHR. Puedeexistir tambienuna relación con las CA plasmáticas,pues en ratas aisladasdurante35-40días(Parra,1993>encontróun aumentode la concentraciónde catecolaminasplasmáticassin quesehayanencontradovariacionesenlosprimerosdías de aislamiento. Existe una hiperactividadde la glándula adrenal que provocaun aumentode corticosteronaplasmáticaen eseperiodo de tiempo de aislamiento,que inducirla la síntesis del enzimaFNMT y por lo tanto de AID lo cual explica los aumentadosnivelesde AD plasmáticaen estasratas(Parra,1993). Seríainteresanteconocerque ocurrecon las CA plasmáticasinmediatamente despues del aislamiento, porque podría producirse una elevación rápida que desapareceríaal desencadenarseel reflejo barorreceptorque se produce en la hipertensión(Korner y cols. 1974). Esteaumentosedeberíaa la biperactividadde los nervios simpáticosperiféricosque tiene como refiqio una elevación de los niveles plasmáticosdeNA. Unaclaraelevaciónde NA apareceen el plasrnadejóvenespacientesconHTA esencial(Goldstein,1983).Tambienen pacientesconhipertensiónsecundariaexisteun aumentosignificativo en losnivelesplasmáticosdeNA (Masuyaniay cols. 1979; Shiff y cok. 1981;Weidmanny cols. 1982). Laalteraciónde los nivelesplasmáticosdeNA tambienha sido demostradaen diferentesmodelosexperimentalesde HTA (Rasehery cols. 1980;SiriyKaner,1985). Estapodríademostrarqueel efectodel estrésagudopodríaactivar el sistema noradrenérgicaen distintas regionescerebralespara respondera las demandasmas inmediatasdel organismoen esasituación(Dunn,1988;Tanakay cols, 1988;Nakatay cols,1991).El efectoseriadiferentecuandoel estréses persistentey tieneun carácter crónicoo semicrónico(Anisniany cols., ¡987; AdeIl y cols., 1988). -156- Discusión En nuestrosresultadosno seencontraronvariacionesen las concentracionesde AID y DA, lo que concuerdacon los resultadosobtenidospor Fuxe y cols.(1975)en ratasSHR. Estono excluyetotalmentesu participaciónen el desarrollodela hipertensión. Las terminacionesdopaminérgicasen el hipotálamono sola desempeñanfUnciones cardiovasculares,sino tambien las conocidasfUnciones neuroendocrinasde la DA (Hókfelt y cols,, 1973) queaparecenduranteel estrés,y quepodríancontrarrestarel efectocardiovascular. Los resultados obtenidos en bulbo raquídeo y médula espinal pueden interpretarsecomo consecuenciade la disposiciónde los neurotrasmisoresen los distintos nucleosque componenambasestructuras,y que la ausenciaaparentede efectosrepresentaseel resultadoneto de la activación o inhibición simultáneade distintaspoblaciones. En condicionesfisiológicasnormalesel sistemaopioide está quiescente,pero cuandoseproduceunaalteraciónde la homeostasis,los opioidesseincluyenentrelos múltiples sistemasinhibidores del dolor quese ponenen flincionainiento cuando el organismorecibeunaagresión(Watkinsy Mayer,1982). Nuestros resultadossugieren que el aumento del número de receptores opioidesen las mencionadasregionesdel SNC puedecontribuir al mantenimientodel estadohipertensivoquepresentanlos animalesaisladossocíalniente, 2.EFECTODE LA LESION DEL HNV La administraciónde 6OHDA enunaimportantevía catecolaminérgicano solo evitala respuestahipertensivaquetienelugarenel modelode deprivaciónsocialen la -163- Discusión rata; ademásen estetrabajo se ha comprobadoque tambienalterael sistemaopioide central. Sehacomprobadoqueseproduceunadisminuciónde la ~ del receptormu opioide en nucleo estriado transcurridas 24 horas y un aumento en bulbo raquídeo, hipotálamoy médula espinal. Asimismo se encontró un aumentoen hipotálamo y médulaespinaltranscurridos20 díasdela lesiónconla neurotoxina. Conrespectoalos ensayosde fijación al receptordeltaopioide la disminución de laB»..~, se observóenhipotálamotranscurridos1, 20y 40 díasdela lesióny alos 20 díasencortezacerebralfrontal. Transcurridos1, 20y40díasdela administracióndela neurotoxinaseencontróun aumentodela B,..~,,enbulbo raquídeoy médulaespinal.En ningunodeloscasossepresentaronvariacionesenla K~, Pocostrabajossehanllevadoa caboparaestudiarlos efectosdelas lesionesde víasnoradrenérgicas,comoel HNV. Smithy cols., (1991)handemostradaen la rataunadisminuciónde receptoresmu de aproximadamenteel 30% en estriado, dos semanasdespuesde lesionar las vías aferentesnigroestriadascon 6OHDA. Estos datos sugieren que se encuentran receptoresmu localizados en tem-¡inacionesnigroestiladas.Estudiospostenores demostraronque las lesionesconÓOHDAinducenpérdidade receptoresmu en ratas recien nacidasy adultas como resultadode la regulación transinápticade sitios postsinápticos,pero no presinápticoscomo demostraronLoughlin y cols. (1992) haciendo análisis cualitativo de cerebro entero, no detectandocambios en los receptoresmuestriatalesmarcadoscon3H-Naloxonaen ratassin lesióncerebral.Tales resultadosson consistentescon la conclusión de que los receptoresmu no están localizadospresinapticaxnenteen terminacionesnigroestriadasy sugierenquela pérdida de neuronasdopaminérgicasno producenecesariamenteuna subsensibilizacióndel receptormuopioide. Estoconcuerdaconnuestrosresultadoscon respectoal receptordeltaopioide en queseha encontradaunapersistentedisminuciónde la B,,~, en hipotálamo,quese correspondecon unadisminuciónde la NA hipotalámicatras la lesión con ÓOHDA. Estosugierequeun ciertonúmerodereceptoresopioidespuedenestarlocalizadosen la terminal noradrenérgicadel hipotálamo de la rata y apoya el conceptodel papel modulatoriode los péptidosopioidessobrelasvíasnoradrenérgicascerebrales, El incrementode receptoresdelta en bulbo raquídeoy médulaespinalpodría serdebidoaqueunainternipcióndelsistemadetransmisiónnoradrenérgicaalteraríala modulaciónquelasCA ~ercensobrelos receptoresopioides.Esteefectosedemuestra masconsistentementesobrereceptoresmu enla médulaespinal. 3. EFECTODEL AISLAMIENTO ASOCIADOA LA LESIONDEL HNV Cuandoselesionael HNV einmediatamenteseaislan las ratas,en los ensayos con el receptormu seprodujo un aumentode la B~ en hipotálamoe hipocampo transcurridos20 díasy en hipotálamo,hipocampo,nucleoestriadoy cortezacerebrala los40 días. Ii -164- Discusión Con respecto al receptor delta la lesión del HNV acompañada de aislamiento produjo una disminución de la Bmax en hipotálamoy estriadoa los 20 díasy en hipotálamotranscurridos40 días. Cuandola rata es umcamentesometidaa lesión del HNV la afectacióndel sistemaapioideestáprotagonizadapor un descensoenla poblacióndereceptoresdelta de localizaciónhipotalániicay estaalteraciónpersisteaun cuandolos animalessean sometidosadeprivaciónsocial. Los resultadosobtenidossobrelas modificacionesde los receptoresopioidesen lasratasalas queseles lesionóelHNV conÓOHDAmuestranunaseriedevariaciones que, en su conjunto, indican que la lesión de vías noradrenérgicasafecta de alguna maneraal sistemaopioide. El incrementoo la disminuciónen la densidadde dichosreceptoresnosindica quela regulaciónes complejay queexistendiferenciasen cuantoalos mecanismosque controlanambostiposdereceptoren el SNC. Jiménezy cols., (1993) demostraronpor primeravez “iii vivo” que en una estructuracerebralconcreta(bulboraquídeo)puedeexistirunainhibiciónselectivade la transmisiónnoradrenérgicay adrenérgicadebidoala ocupaciónde distintosreceptores opioides. El estudio de segundos mensajeros o de fosforilización de proteínas posiblementeproporcionaríadatossobrelos mecanismosimplicadosen la actividadde los receptoresopioides. Los tratamientoscrónicasconagonistasopioidessugierenqueel acoplamiento delos receptoresconproteínasO y conet’ectoresde segundosmensajerosostentanun importantepapelen el desarrollodela toleranciaaopioides(Childers,1991) Es importante, con vistas a una posible aplicación terapeúticade nuestrosdatos, poner de manifiesto el papel del sistema opicide en la etiología, desarrolloy/o mantenimientode la lirA parael desarrollode nuevosfánnacosque pudieranemplearseen la terapeátícade dichaalteracióncardiovascular,especialmente cuandosedebeala exposicióncontinuadaa situacionesdeestrés. -165- CONCL(¡AVIONES Conclusiones 1.- Los resultadosobtenidosen estetrabajopermitenafirmar quela integridaddel haz noradrenérgicoventral es necesariaparala elevaciónde la presiónarterialinducidapor deprivación social en la rata. La lesión del haz noradrenérgicoventral afecta fundamentalmenteal hipotálamopuestoquese ha demostradounaalteraciónparalela de catecolaminasy receptoresopicidesen esta región cerebral que tiene una gran implicaciónenla regulacióncentralsimpática. 2.- Los agonistasoploides endógenos,movilizadoscomo consecuenciadel estrés producido por deprivación social en ratasjóvenes,ejercen un papel critico en la elevaciónde la presiónarterial atravésde suacciónsobrelos receptoresopioides centralesmu y delta,que esevidente tantoalos 20 comoa los 40 díasde evolución. Suactivación podríaser la causade lasalteracionesen la velocidad derenovaciónde las catecolaminasdel SNC quetienelugarenestemodeloexperimental. n 3.- Asimismo se ha comprobadoque la lesión del haz noradrenérgicoventral secundariaa la administraciónde 6-hidroxidopaminaconsigue abolir la respuesta F hipertensivaqueproducela deprivaciónsocial,posiblementecomoconsecuenciade la afectación del receptor delta opioide hipotalámico, así como del sistema catecolaminérgicocentral. Esto nos pemiite concluir que la administraciónde la neurotoxinano soloafectaavíascatecolaniinérgicassino tambiendel sistemaopioide puestoquesecomprueban variacionestanto enla densidadde receptoresmu como delta opioides. t -167- BIBLIOGR4FÍA Bibliogratía Abood LO., TakedaF. Enhancementof sterospecificopiatebindingto neuralmembranes by phosphatidilsesine.Eur Y Pharmacol.39:71,1976. 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RESULTADOS OBTENIDOS EN EL ESTUDIO DEL RECEPTOR Y OPIOIDE DISCUSIÓN I. CARACTERIZACIÓN DE LA RESPUESTA HIPERTENSIVA AL ESTRÉS PRODUCIDO POR DEPRIVACIÓN SOCIAL II. EFECTO DE LA LESIÓN DEL HNV SOBRE LA PRESIÓN ARTERIAL III. VALORACIÓN DE CATECOLAMINAS EN AREAS CEREBRALES IV. VARIACIONES EN EL SISTEMA OPIOIDE CENTRAL CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA D: