UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Rosa Ana Blasco Porras DIRECTOR: Jesús Egido de los Rios Madrid, 2015 © Rosa Ana Blasco Porras, 1982 Alteraciones de la respuesta inmune en pacientes con nefropatía IgA rp 02-i Rosa Ana Blasco Porras llllllllllll " 5 3 0 9 8 6 2 9 2 1 * UNtVERSIOAD COMPLUTENSE X ALTERACIONES DE LA RESPUESTA IMMUNE EN PACIENTES CON NEFROPATIA IgA Departamento de Nefrologxa Facultad de Ciencias Qulmicas Universidad Complutense de Madrid 1984 I-Il’LIOTEc ." Colecciôn Tesis Doctorales. NS 21/84 Rosa Ana Blasco Porras Edita e imprime la Editorial de la Universidad Complutense de Madrid. Servicio de Reprograffa Noviciado, 3 Madrid-8 Madrid, 1984 Xerox 9200 XB 430 Depôsito Legal: M-1620-1984 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA ALTERACIONES DE LA RESPUESTA INMÜNE EN PACIENTES CON NEFROPATIA IgA Memoria para optar al grado de Doctor en Ciencias Qui- micas, presentada per: ROSA ANA BLASCO PORRAS DIRECTOR : Dr. D. Jesus Egido de les Rios Adjunto del Servicio de Nefrolcgfa Fundacion Jimenez Diaz PONENTE: Dr. D. Angel Martin Municio Catedratico de Bioquiraica Facultad de C. Qufmicas. Madrid, Abril 1982 A mis padres. Esta tesis ha sido realizada en el Institute de In— vestigaciones Médicas de la Fundaci6n Jiménez Dfaz de Madrid, ba jo la direccion del Dr. D. Jésus Egido de los Rios, adjunto del - Servicio de Nefrologia de esta Fundacidn. Quisiera expresar mi mas profundo agradecimiento al Dr. D. Jésus Egido por sus valiosas ensenanzas en el terreno pro- fesional y su contribucidn a mi preparacidn humana como investiga dor . As! mismo, al Profesor D. Angel Martin Municio, ca­ tedratico de Bioquimica de la Facultad de Ciencias Quiraicas de la Universidad Complutense de Madrid, ponente de esta tesis. Sus --- orientaciones y acertados consejos han sido décisives para la con solidacidn del trabajo. También quisiera expresarle mi gratitud - por su constante estimulo y apoyo, sin los cuales nunca se hubie- se concluido esta tarea. Al Dr. D. Luis Hernando Avendano, Jefe del Servicio de Nefrologla de la Fundacidn Jiménez Diaz, por haberme brindado= la oportunidad de accéder al mundo cientifico y manifestarle mi= respeto y admiracidn por su contribucidn al mejor conocimiento de la patologia renal, al permitir si desarrollo. y.alentar un grupo= interdisciplinario de trabajo, cuyos resultados estan siendo de - gran interds. A la Dra. Luz Lozano Maneiro, por su araistad y con- fianza. Su entusiasmo, capacidad de trabajo y colaboracidn desin- teresada han sido fundamentalss a la hora de llevar a termine es­ ta labor. A la Dra Margarita Ldpez Trascasa y al Dr. Jaime Saa cho Ldpez, miembros del Servicio de Nsfrolcgfa , que me han prece_ dido y abierto camino en el estudio de la nefropatia de IgA. A las Dras. Pilar Palomino, Clara Eugenia Roda y Ma ria de Miguel, miembros del Servicio de Inmunologia de esta Funda cidn, per sus aportaciones inestimables en el terreno inmunoldgi- cü tante técnicr como tedrico. A Rosario de Nicolas, técnico del Laboratorio de In munopatologia, por su ayuda y colaboracidn en la realizacidn de - A todos los miembros del Laboratorio de Fisiologia= Renal del Servicio de Nefrologia, por su apoyo moral, afecto y cq\ fiansa con los que supieron crear a mi alrededor el ambiante ade- cuado para superar las dificultades que toda tarea de investiga— cidn conlleva. Y en general, da ries las gracias a todos los compa- neros que en mayor d menor medida han contribuido a la realizacidi de este trabaja. Finalmente quiero dar las gracias a la Fundacidn — Conchita Rabago por la concssidn de la beca que ha hecho posible= la elabcracidn de esta tesis doctoral. ABREVIATURAS cs.- Componente secretorio IgA-SC.- IgA secretoria IgA-S.- IgA de superficie IgM-S.- IgM de superficie IgD—S .— IgD de superficie IgD-IgM-S.- IjD s IgM de superfice IgA p.- IgA polimdrica IgA m IgA rnonoir.érica IC,- Ininunocomple jos IC-IgA.- Inmu.iocomple jo£. de IgA IC-IgG.- Inmunocomplejos de IgG A-IgA.- Agregados de IgA A-IgG.- Agregados de IgG PWM.- Nitogeno Pcckeweed Con A.- Concanava] iria A INDICE iNTRODUCCiON 1 INMUNQGLOBULINA A: ASPEGTOS BASICQS 1.1.- Introduccidn 1 1.2.- Formas moleculareg de IgA 1 1.2.1.- IgA raonomérica 1 1.2.2.- IgA polimérlca 4 1.2.3.- IgA secretoria 6 1.3.- Funcionalidad biologica de la IgA 9 1.3.1.- Activaciôn del sistema del complemento 9 1.3.2.- Transporte a través de las membranas 9 1.3.3.- Otras funciones 11 1.4.- Ciclo hepâtico de la IgA 11 1.5.- Implicaciones clfnicas de la IgA 12 2.- II'IMUNOCOMPLEJOS EN EL SSNO DE LA DISFUNCION INMUNE 14 2.1.- Introduccidn 14 2.2.- Pactores que gobiernan el depdsito de iniTiunocomple- ,ics en les te,lidos 15 2.3.- Mécanismes de induccicn de daho tisular 15 3.- RESPUESTA DE IgA: ASPEGTOS CELULARES 18 3.1.- Linfccitos 18 3.1.1.- Introduccidn 18 3.1.2.- Linfocitos T y E: caracterlsticas géné­ rales 18 3.1.3.- Criterios de diferenciacion 3.1.4.- Funcionalidad de las células linfoides 24 3.2.- Factores implicados en la rescues ta de IgA 27 5.2.1.- Rutas de entrada antigénica e induccion de la respuesta de IgA 27 3.2.2.- Lineas celulares B 28 .......... 3.2.3.- Dependencla timica.de la respuesta de IgA 30 3.2.4.- Ciclo celular de la IgA 31 3.2.5.- Importancia biologica del ciclo celular de la IgA 37 4.- LA GLOMERUI^UEFRITIS MESAUGIAl DE IgA:UKA ENFERME- DAD IIIMUÜE 38 4.1.- Introduccidn 38 4.2.- Caracteristica générales 38 4.3.- El mesangic rcnal: Modèles irununopatoldgicos 40 4.4.- Modèles expérimentales de nefrcpatia de IgA 42 4.5.- Aspectcs inmunoldgiccs de la nefrcpatia de IgA 43 4.5.1.- Inmunoglobulinas séricas y complemento 43 4.5.2.- IgA glomerular 45 4 .5 .3 .- Inmunoccmplejcs circulantes 46 4.6.- Asoectos innvunogenéticos de la nefroratia de IgA 47 4.7.- Glcmerulonefritis mesangial de IgA asociada al sindrome d e = Schonleich Henoch y a las hepatopatias alcoholicas OBJETiVOS MATERiALES Y METODOS 3 .1 .- Materiales 52 3 .1 .1 .- Pacientes 52 3 .1.2.- Réactives y compensâtes especiales 52 3.1 .3 .- Aparatos 53 3.1.4.- Solucidnes mi.s utilizadas 54 3 .2 .- M^todos 55 3.2.A.- Tdcnicas inmunoqulmicas 55 3 .2.A.I.- Aislamiento de IgG ' 55 3 .2.A.2.- Aislamiento de IgM 56 3 .2.A.3.- Aislamiento de IgA 56 3 .2.A.4.- Inmunodifusion dcble bidiraensijo nal 57 3 .2.A.5.- Inmunoelectroforesis 58 3 .2.A.6.- Aislamiento de IgG de conejo 59 3 .2.A.7 .- Obtencidn del suero de carnero anti-IgG de conejo 59 3 .2.A.8.- Marcaje de proteinas 59 3 .2.A.9.- Purificacidn de proteinas marca das 50 3 .2.A.10.- Preparacidn de inmunoadsorbentes 61 3 .2.A.11.- Obtencicn del compcnento secre­ torio libre 62 3 .2.A. 12.- Ultracentrifugacidn en gi-adien te de densidad 63 3 .2 .E.- Quantificaoion de inmunoglobulinas por ra- dicinmunoanalisis (RIA) 64 5.2.B.I.- Cbtencicn del antigeno 64 3.2.B.2.- Marcaje d« Inmunoglobulinas con ^^^I 64 3.2.B.3.-Adsorcion del suero de carnero y del conejo frente a suero humano total 65 5.2.B.4.- Titulacion del suero de carnero anti-IgG de conejo 65 3.2.B.5.- Valoracion del primer anticuer- po 66 3.2.B.6.- Potencia del suero de carnero - anti-IgG de conejo 66 3.2.B.7.- Realisacicn del ensayo 67 3.2.B.8.- Analisis de variables 68 3 - 2.C .- Cultive de células mononucleares in vitro 68 .......3.2.C^.- Pre.paracion. de linfocitc.s para s.u cultive "in vitro" 68 - Obtencion de linfocitos 68 - Viabilidad celular 69 - Preparacidn de he.natles de carne­ ro 69 - Preparacidn del suero del suero de ternera fetal adsorbido 70 - Formacidn de rcsetas espontaneas 70 - Aislamiento de poblaciones enri- quecidas en células T y B 70 - Inmunoglobuli:ias de superficie 71 -Rendimientc de la técnica 71 3.2.Cg.- cdntesis de xnmunc.globulinas y ce lulas implicadas 72 - Sintesis de inmunoglobulinas 72 - Formas moleculares de IgA produ- cidas in vitro 73 - Oaracterisacidn tioquimica de la IgA producida In vitro 73 - Receptores celulares para el compo­ nente secretorio 74 - Sfntesis de inmunoglobulinas en prê sencia de suero anti-cadena J humana 76 - Deteccidn de cadena J en el citoplas ma de linfocitos cultivados in vitro 77 3.2.0^.- Factores implicados en la regulacicn de la sfntesis de inmunoglobulinas - "in vitro” 78 3.2.C^^.- Factores celulares 78 - Generacion de células supresoras mediante la activacién de la Con A 78 - Cultive raixto de células raononuclea res "in vitro" 78 - Co-cultivG de poblaciones de linfo­ citos enriquecidos en células T y B 73 - Ouantificacién de células T regula- doras de la sfntesis de inmunoglobu linas in vitro, mediante la utilisa cion de anticuerpos monoclonales 80 3.2.C^y.- Factures séricos 81 - Efecto del suero de los pacientes con nefropatfa de IgA sobre la sfn tesis de inmunoglobulinas in vitro 81 - Efecto del suero de los pacientes con nefropatfa de IgA sobre la ge neracion de células supresoras en cultive 81 - Efecto de los agregados de IgA m£ nomérica, IgA polimérica e IgG, so bre la sfntesis y la actividad de células supresoras en cultive 82 RESULTADOS 4.1.- Sfntesis de inmunoglobulinas "in vitro" 4.1.A.- f-studic de la sfntesis de inmunoglobulinas por las células moncnucleares de sangre pe riferica 84 4.1.B.- Estudio de las caracterfstlca bioqufmicas de la IgA producida en cultivo 84 4.1.B.I.- Formas moleculares producidas - in vitro. 84 4.1.B.I.- Caracterizacion bioqufmica de - las formas moleculares 85 4.1.e.- Analisis de los reosptores celulares para el componente secretorio en linfocitos es timulados con PV/M 88 4.1.G.I.- Inmunoglobulinas de superficie y receptores para el componente s£ cretorio 90 ................ 4.I.e.2.-Receptores citoplasmaticos para el componente secretorio 9Z 4.1.D.- Formacion de cadena J y presenda en el ci- plasma celular 92 4.1.E.- Bloquée de la sfntesis de iimunoglobulinas inducida por el PWM, en presencia de un — suero heterôlogo anti-cadena J humana 101 4.2.- Factores imolicados en la regulacicn de la sfntesis de inmuncglobulinas "in vitro" 105 4.2.A. Factores celulares 105 4.2.A.I.- Generacion de células supreso­ ras inducidas por la Con A 105 4.2.A.2.- Cultivo mixte de linfocitos 108 4.2.A.3.- Analisis de las poblaciones de células T reguladoras, median­ te la utilisacién de anticuerpos rncnoclcnales 112 4.2.A.4.- Estudio de la actividad de célu­ las ï cocperadoras de la sfntesis de IgA 121 4.2.B.- Factores séricos 123 4.2.B.I.- Efecto del suero de pacientes con nefropatfa de IgA, sobre la sfntesis de inmunoglobulinas en individuos control 125 4.2.B.2.- Niveles de células T reguladoras de la sfntesis de inmunoglobuli- nas en cultives control prstrata dos con el suero de pacientes con nefropatfa de IgA 125 4 .2 .B.3 .- Modificacion de la actividad y - generacién de células supresoras inducidas por la Con A en presen cia del suero de pacientes con - nefropatfa de IgA 128 4 .2 .B.4 .- Efecto de la IgA monomérica, IgA polimérica e IgG, asf como de sus agregados proteicos, sobre la sfn tesis de inmunoglobulinas 132 4 .3.- Estudio de las alteraciones celulares en familiares - oréximos a los pacientes con nefropatfa de IgA 135 4.3 .A.- Niveles séricos de inmunoglobulinas 139 4 .3 .B.- Produccién de inmunoglobulinas "in vitro" tras estimulacién con PWM 139 4 .3 .C.- Distribucién de las formas moleculares de IgA en familiares de pacientes con nefropa tfa de IgA 142 4 .3 .C.I.- Porcentaje de fermas-moleculares de IgA en el suero de familiares de pacientes con nefropatfa de - IgA 142 4 .3 .C.2 .- Formas moleculares de IgA en el sobrenadante de cultives celula res estimulados con PWM 142 4.3.D.- Analisis de receptores celulares para el componente secretorio e inmunoglobulinas^ de superficie 145 4.3.D.I.- Receptores citoplasmâticos pa­ ra el componente secretorio 145 4 .3 .D.2 .- Inmunoglobulinas de superficie 148 4 .3 .E.- Actividad supresora inducida per la Con A en los familiares de pacientes con nefro- uatfa de IgA 148 4 .3 .P.- CuantifIcacion de poblaciones de células T reguladoras de sfntesis de inmunoglobu linas in vitro. 151 DISCUSION 155 CONCLUSiONES 173 BIBU'OGRAFfA 176 INTRO- DUCCiON - 1 INTRODUCCION 1.- Inmunoglobulina A; aspectos basicos 1.1.- Introduccion La IgA représenta una sexta parte de las inmunoglo­ bulinas séricas. Pertenece a la fraccion de Y-globulinas del sue­ ro, con una migracion electroforética que la clasifica dentro de= las • La IgA sérica esta constituida por varias formas mo lecuiires: monomeros, dfmeros y polimeros. En el Nombre, la pro— porcion de IgA monoraéiica es muy alta, representando solo un 1G% - los dfmeros y oligomeros. En otras especies animales la forma pre dominante es la IgA dimérica (172). En 1963» Toraassi descubrio la participacion de la - IgA en las secrecciones humanas. La proteina es dimérica y difie- re del modelo sérico en una estructrura espeoffica adicional, de- nominada componente secretorio (CS) (l64). En 1970, Kolparn y Koshland determinaron la existen cia de otro componente estructural en todas las formas poliméricæ incluida La IgA secretoria, denominado cadena J. A pesar de la gran cantidad de dates aportados en - los ultimes ahos es muy dificil proponer un modelo coherente para esta inmunoglobulina que justifique alguna de sus propiedades y - su importancia funcional en el organisme. 1.2.- Formas moleculares de IgA 1.2.1.- IgA monomérica Esta constituida por una unidad simple integrada por dos cadenas pesadas tipo (X. y dos cadenas ligeras unidas en— tre SI por puentes disulfuro y fuerzas no covalentes. Su peso mo­ lecular es de 160.000 D, Migra electroforeticamente en la zona de las jO 2^“gloUulinas y su coeficiente de extincion es de 1.34. Ca- — 2 “ rece de estructural hélicoïdal y tiene forma de Y aplanada, se— gûn indican los estudios de microscopia electronica. Tiene una e_ levada carga negative deoido al bajo contenido en U s i n a y la al̂ ta proporcion de cisteina, cuya funcionalidad no esta del todo a clarada. Aparté de los residues que definen los dominios de homo_ logfa y del que participa en la union entre cadenas pesadas y l£ géras en el caso de IgA^, se forman dos puestes disulfuro en la= region "rotula" que estabilisan la estructura y le confieren re- sistencia a la accicn proteolftica. El reste se cree implicado - en la formacion de puentes disulfuro especificos de la IgA y en= la regulacicn del proceso de polimerizacion (Eig. 1). El peso molecular de la cadena ci es de 57.000 D. - Migra electroforéticamente entre las cadenas pesadas de la IgG e IgM. Tiene una gran homologia con las cadena Y y yu en la secuen cia de aminoâcidos distribuida a lo largo de la regién Ec. Esto= hace pensar en una evolucion independiente de les dominios de la cadena pesada, a través de una linea de descencia comun donde u- na cadena,pesada serra antecesora deotra. ........................ Desde un punto de vista quimico y antigénico se — pueden distinguir dos clases de IgA: IgA^ e IgAg. La IgAg presen ta dos alotipcs: A2m(l) y A2rn(2)» que se diferencian por la f al ta de uniones covalentes entre las cadenas pesadas y ligeras, — permaneciendo las cadenas ligeras unidas entre si (Fig. 4). Aproximadamente el 90% de la IgA sérica es IgA^, - mientras que la proporcion entre IgA^ e IgA^ se iguala en las se crecciones (171). Quimicamente, las majores diferencias entre y aparecen en la region "rotula" y en el numéro y tipo de los oligosacarid08 que forman parte de su estructura (168), La dete£ cion y s us ti tue ion de una secuencia de arninoacidos por otra en - "a cadena afecta la conformacion de la molécula. La regién — "rotula" no puede contraerse ncrmalmente y se pierden las sena— les alostéricas necesai'ias para la activaciôn del complemento — por la via clasica. Solo la region Fc de la IgA^ posee esta prc- piedad biologica. El contenido en hidratcs de carbono de la IgA-, e — IgAg es variable. Se disponen en pcsiciones homologas entre los= F(ab’) Fc Fc Fig* Caquema general de la Incunoglobulijia A 2.- ^«aeral di ua pollaero de Ij:̂ , — 4 — dominios compactes de las cadenas pesadas y ep su superficie. -- Son restes de N-Acetil Glucosamina y il-Acetil Galactosamina, es­ te ultimo propio de la IgA^, cuya distribucion depende del tipo= de cadena y el alotipo implicado. Incremental! la solubilidad de= la molécula y favorecen su secreccion. La existencia de 18 restes de aminoâcidos en la re gion C-terminal de la cadena oC , en relacion a los otros tipos -* de cadenas pesadas, le permite establecer un cuarto dominio de - homologia. Su importancia funcional es encrme ya que el potenciaL para pasar de estructura en c(-hélice a estructura p> en la for macion del dominio, esta relacionada con la union de la cadena J y su papel en el proceso de polimerizacion. 1.2.2.- I.gA polimérica La IgA polimérica represents aproximadamente un 20'?o de la IgA sérica circulante. Aparece como dimeros, trimeros = de coeficiente de sedimentacion (9-13)S y formas moleculares de= mayor tamano. Por micrografia electronica se observa que la aso- ciacién entre unidades para la formacion de estas moléculas se - réalisa a través de la region Fc (Fig. 3). En los polimeros de - alto peso molecular, las unidades se disponen circularmente alre_ dedor de un e.ie, de forma anâloga a la molécula de IgM (Fig. 2). Las uniones entre los Fc adyacentes son rigidas y la manvilidad - es aportada por las disposiciones caracteristicas de las regio— nés Fc y FXab*)^ en la region de la "rotula". La IgA polimérica contiens un pequeno polipéptido= estructrurd. denominado cadena J (109), que .juega un importante - papel en la polimerizacion (19). La cadena J tiene un peso molecular de 16.000 D. - Présenta un gran numéro de residues acides: prolina y cisteina - que le confieren unas propiedades confcrmacionales muy caracte,-- risticas. Esta unida covalentemente a des de las cadenas , m£ niante puentes disulfuro establecidos con les residuos de ciste^ na de la region C-terminal. Las demâs cadenas estan unidas entre - 5 - 3 **’ Eaqiiea* general de una Ig l d ia é r lc a Ig% 1 IgA 2 a ( l ) TT IL 'Ig. 4«- Clases de TgA moaoa^rlca _L IgA 2a(2) ‘i *. 3# ' '5er.«jral ie uca 1.̂ » aeeretoria. — 6 — sf, sin interaccionar con la cadena J (134). La union es varia­ ble. Cualquiera de las cadenas ^ de las subunidades intégrantes podria establecerla (108). Ocupa una posicion oculta en la mole- cula y no es accesi’cle antigenicamente. El papel jugado per la cadena J en la polimeriza— ciijn aim no ha side aclarado. Se sintetiza per las celulas pro— ductoras de IgA y su incorporacion es concomitante con la forma- cion de poliméros (96). El proceso es el resultado de la activi- dad de una enzima intercambiadora de puentes disulfuro que actua al azar. Esta actividad podria ser el factor regulador del proce so. Los primeros trabajos en este sentido sugerian la= necesidad de una incorporacion de la cadena J en el monoraero, - previa a su secreccion en el medio extracelular. El grado de po- limerizacion del moncmero vendria dado por les niveles intracelu lares de cadena J. En 1974 Imman ya apunto la posibilidad de que la - cadena J solo contribuyera a la estabilizacion de los polimeros, pero no fuera necesaria para su formacion. Los estudios posterio, res in vitro con la IgM, de caracteristicas estructurales anâlo- gas a IsBde IgA, confirmaron este punto. La influencia del poli- péptido se ejercia a nivel del ensamblaje de las cadenas y en — consecuencia en la estabilidad conforraacional de la molécula (81) La cadena J no solo proporciona multivalencia al - polirnero de IgA, sino que le confiere un centro bâsico de estab^ lidad trente a los agentes reductores propios de 1 medio externo= donde desarrolla su papel principal. Es de vital importancia pa­ ra su transporte y funcionalidad como anticuerpo en las secrec— clones externes, ya, que sin su presencia no puede realizarse la= union estacle del components secretcrio al dimero de IgA (20). - Este explicaria la conservacion filcgenética de esta molécula a= le largo de mi. 11 one s de afios (172) y el hecho de que la mayor — parte de las i,nmunug 1 obu 1 inas en las secrecciones y en el suero= de animales inferiores sea IgA dimérica (166). 1.2.3.- IgA secretcria - 7 - La IgA eliminada en las secrecciones externas o — IgA secretcria (IgA-CS) tiene un coeficiente de sedimentacion de 11 S y un peso molecular de 400.000 D, Su estructura es dimérica analoga a la de la IgA dimérica sérica. Lleva unida una glicopro teina denominada components secretorio (CS), cuyo peso molecular es de 71.000 D (66) y su composicién aminoâcidica totalmente di- ferente de la de la cadena c\ y J. Su contenido en glicina y su - carencia de metionina le proporcionan una movilidad electroforé- tica en la zona mas alejada de las (3 -globulinas. El CS esta unido por dos puentes disulfuro a una - de las dos subunidades de IgA (Eig. 5), actuando como barrera — protectora de la accion proteolitica que acompana a las secrec— clones externas. Hay algunas evidencias a favor de la existencia de dos formas molea»ns 4»1 tr-'r.oporte de I3» a trav-Ss del enteroeito SANGRE H IGA DO linfa bills INTESTINO 1i “ 9 - tre el CS y la IgA dimérica (121) y es responsable del intercam- bio de puentes disulfuro .necesario para la union estable (fig,6) Es necesario destacar el hecho de que aun no se - sabe,si el CS que sirve como receptor y mediador del transporte^ de la IgA a través de la célula, es el mismo que aparece unido= a la molécula en el fluido intestinal. Algunos autores suponen - un proceso de recombinacion en el moraento de la liberacion con - el CS libre en la luz intestinal (52). 1.3.- Euncionalidad biologica de la IgA Las propiedades biolégicas 6 funciones secundarias de un anticuerpo son aquellas que estan mediadas por la regién - Fc de la molécula (111). Se manifiestan con independe ncia del - antigeno por su unién directa a la superficie celular o tras la= interaccion del F(ab')2 con el antfgeno. 1.3.1.- Activacion del sistema del complemento Se ha comprobado en diverses expérimentes in — vitro, que los agregados por el calor de IgA, ya sea del tipo 1 = 6 del 2 (61), los imnunocomplejos (IG) en los que participa esta= inmunoglobulina y la propia IgA polimérica (45) son capaces de - activar la via alterna del sistema del complemento. In vivo, los dates no son tan concluyentes, Las — condiciones naturales en el tracto gastrointestinal no afectan - en principio las funciones del sistema inmune. Es muy posible,= que el CS unido a la IgA induzca propiedades biolégicas diferen- tes por el simple bloqueo fisico de porciones criticas de la mo­ lécula y sea el responsable le la falta de coherencia de los re- sultados fbtenidos hasta ei memento. 1.3.2.- Transporte a través de las membranas orotectoras El maximo significado biologico de la IgA se ma nifiesta en las secrecciones externas. Ejerce una barrera protec - 10 - tectora en la superficie donde el contacte antigénico es masivo= y continue. Se ha apuntado incluse, que al igual que la IgA ma terna perraanece en el intestine del lactante s in absorberse (187) , los anticuerpos de IgA en la edad adulta perrnanecen covalente- mente unidos a las microvellosidades de las células intestinales formando una verdadera cubierta protectora del intestine (122).= Parece ser, que la simple combinas ion con el antigeno es sufi-- ciente para impedir el ataque a la célula epitelial, paso necesa rio para su penetracion en el organisme. De hecho, la deficiency selectiva de IgA va acompahada de la presencia de anticuerpos de la clase IgM frente a antfgenos circulantes procedentes del trac to gastrointestinal (51). El tamaho y la razon antigeno/anticuerpo de los in munocomple.jos formados son factores decisivos de su destine y ca pacidad de proteccion. La naturaleza dimérica de la IgA-CS y su= alta proporcion en la luz intestinal favorece la formacion de in munocomplejos relativamente grandes facilmente atrapables por las secrecciones de mucus, en cuya activacion juegan un importante - papel (94). La formacion de inmunocomplejos a partir de molécu las no bien digeridas favorece un exceso antigénico capaz de ex travasar la barrera intestinal, constituyendo une de los princi­ pales mécanismes de induccion de tolerancia a antigènes locales. En el caso de microorganismos y toxinas bacterianas, la IgA-CS - mitiga la invasion estableciendo reacciones cruzadas y formando= grandes inmunocomple;ios que se elirmnan por medios no inmunologi- cos del intestine. (169). La degradaciôn proteolitica de la molécula de lgA= per la IgA proteasa colabora en la accion protectora. Los frag— mentes F(ab')^ tienen como ob.ieto la aglutinacicn del antigeno - y la formacion de anticuerpos bloqueantes (158). Este hecho con­ tribuée a explicar el aumento en la proporcion de IgAg en las se crecciones externas. La IgA proteasa sintetizada por algunos mi­ croorganism os de la flora intestinal, es especifica para la IgA^ sérica y sécrétera (55). Puede considerarse una adapta (ion dei hom bre trente a la bacteria. Se ha ocservadc que la neiseria patoge - 11 - na sintetiza IgA proteasa y la no patégena, no (158). Quizas el papel mas interesante, dada su importan­ cia en la perpetuacion de las especies, sea el desarrollado por= la IgA en la leche materna. Los anticuerpos de IgA se sintetizan en la glandula mamaria por células plasmaticas procedentes del - tracto gastrointestinal (176,177). Le proporcionan al intestino= del recien nacido una defense primaria frente a agentes potencial^ mente patogenos o endemicos, hasta que consigue poner en marcha= su propio sistema inmune. En roedores y otros animales, hay va— riaciones en la cantidad y clase de inmunoglobulina absorbida — por el intestine, pero en general la IgA materna nunca alcanza= la circulacion (24). 1.5.5.- Otras funciones La IgA agregada y no agregada en un medio sin - suero es capaz de unirse y reaccionar con los neutrofilos, esti- mulando la adherencia, fagocitosis y liberacion de enziinas liso- somales potenciando el poder bactericida de esta inmunoglobulina La IgA polimérica es capaz de inhibir la quimiota- xis de polimorfonucleares normales, siendo la unica funcion rea- lizada por el Fc de los inmunocomple jos ventajosa para el hue's— ped. Previaraente (174), se descubrio en pacientes con cirrosis - alcohélica, la presencia de inhibidores de la quimiotaxis leuco- citaria asociados a la IgA. La movilidad electroforetica de los= inhibidores era compatible con la de esta inmunoglobulina. La a£ tividad inhibidora aparecio de forma paralela al incremento de - la concentracion sérica de IgA. Los misraos autores demostraron - que la presencia de la paraproteina de IgA inhibia la quimiota— xis por otros mecanismos aun no aclarados (175). La actividad in hibitoria era mayor para la forma polimérica de la region (10-14 s) y es posible que este relacionada con la degranulacion de la= célula posterior a la interaccion. 1.4.- Ciclo hepatico de la IgA - 12 - Recientemente se ha describe la participacion del= higado en la eliminacion de la IgA polimérica del suero. La ruta hepatica constituye un mécanisme de refuerao en el aporte de IgA como anticuerpo al intestino (Fig. 7). La IgA eliminada proviens de las células plasmaticas intestinales y es transportada a la - bilis en contra de un gradients de concentracion (66, 130). El= mécanisme es analogo al de 1 enteroeito y la IgA liberada esta u nida al CS (Fig. 6). En animales de experiraentacion, el CS aparece so­ bre la superficie de los hepatocitos y actua como receptor en - la membrana (132, 158) para la IgA polimérica. El complejo se - internaliza y transporta a través del citoplasma mediante peque nas vesiculas que se liberan en los canâiculos biliares (66). En el hombre, el mécanisme aun no esta aclarado. - Se ha detectado CS e IgA sobre la superficie de las células epi­ teliales biliares (76), pero no ha podido determinarse el origen de esta inmunoglobulina. La IgA epitelial puede provenir lo mis­ mo del suero que de las células plasmaticas localizadas en la zo na. La locaLizacion de IgA sabre la superficie del hepatocito (76) y su distribucion en el 50% de las células, de forma analoga a - la.observada para el CG (163) en este orgaiio, apoya la idea de - que el CS sea también en el hombre el receptor y mediador de la= transferencia de IgA a los espacSo-s biliares. Es muy posible que el hxgado, capaz de transportar proteinas séricas e incluse IgG e IgM en muy baja proporcion, de_ sarrolle un papel controlador de las concentraciones de estas mo léculas en el suero. De hecho, la obstruccion biliar, cirrosis y todas la.s hepatopatias que suponen un daho extenso de la funcion hepatica, van acompahadas de una elevacion en las concentracio— nés séricas de IgA y CS (163). A i cas de ]a IcA A parte del posible papel patogénico que puoda de- sarrollar en la nefrcpatia de IgA, la IgA participa en m u c h o s --- trastornos inmunologicos, ya sea por aumento o defecto de su sin - 13 - tesis. El trastorno puede ser causa directa del desarrollo de la enfertnedad 6 secundaria a un desorden establecido. La hiperproduccién policlonal secundaria de IgA es_ ta asociada siempre a una estimulacion antigénica, conocida 6 no de la mucosa. Asi, aparece asociada a ciertas condiciones infla- matorias e infecciones urinarias agudas, colera asiatico 6 infe£ ciones bronquiales de distinto origen. En enfermedades hepaticas se producen algunos he-- chos de cierta consideracion. La IgA sérica se eleva cuatro ve— ces por encima de su valor normal y su proporcion se altera con= respecte a la de IgG e IgM en todos los procesos cronicos (52).= Curiosamente, una alta proporcion de la IgA es polimérica (165)= y su concentracion en el conducto toracico llnfoide es incluso - mayor que en el suero (157) Ademas, se ha obsrrvado la acuraula.— d o n de una importante poblacion de células con IgA en el teji- do portai peritubular y conectivo septal (64). En los m M o m a s se produce un aumento del nivel de = IgA 10 o 15 veces por encima del valor normal. La hiperproduc--- cion va acompahada de una alteracién en la relacion polfmero/mc- nomero a favor del polirnero. La proporcion de polfmeros varia — con el tipo de mieloma, observandose una serie de funciones bio- logicas de las que carece la forma monomérica: mayor capacidad - de paso a través de la barrera epitelial gracias a su capacidad= para interaccionar con el CS (19), formacion de complejos con al gunas proteinas séricas (56), e interaccion con neutrofilos y en consecuencia favoreciiniento de la liberacién de enzimas lisosoma les y citoplasmâticas. Por ultimo, en este caso la afinidad por= el antigeno es mayor. La enfsrmedad de cadenas "X es la nas importante,= d'-ofitro del grupo de las prodrcidas per u i incremento nionoclonal= de la IgA. Es debida a un aumento en la sfntesis de cadenas pesa das. Se caracteriza por un desorden proliferativo de células D a nivel primario en el intestine deslgado y nodules mesentéricos. = Esto tiene como consecuencia la sfntesis de cadena cé sin cade­ nas ligeras, no formando la molécula de inmunoglobulina tal como se conoce. Las cadenas rienen tendencia a polimerizarse en diver - 14 - SOS tarnahcs, ccnteniendo en tcdos los casos cadena J. Dado que - los grupos étn.ioos afectados pertenecen al area mediterranea, mab que una enfermedad de origen genetico, se considéra unaconsecuen cia de una estimulacion antigénica determinada, quizas por micro organismus intestinales. El deficit selectivo de IgA es un hecho muy genera lizado con una frecuencia del 1/500. En muchos casos, aparece a= lo largo del desarrollo y va acorapahado de transtornos intestina les y pulrnonares, haciendo pensar en un deficit de IgA secreto- ria. Va accmpanado de una aumento local de IgM e IgG (20), sien­ do elemento de diagncstico en individuos aparentemente normales^ y déficientes en IgA (129)* 2.- Inmur.ocomple ,1cs en el se ne de la disfuncion inmmie 2.1.- Introduccion La presencia de complejos de antigeno y anticuerpo sobre los bajidos es responsable de gran cantidad de enferraeda— des humanas, debido a su capacidad para inducir los mecanismos - de inflamacion. Algunos ejemplcs son: Lt.pus Eritematoso Sistémi- cc, nef repat La de IgA, glornerulonef ritis aguda y cronica, artri- tis reumatoide, vasculi tis, arteritis y los danos tisulares aso- ciadcs asociados a una amplia gama de agentes infecciosoe. En t£ dos los casos, el mécanisme por el cual se depositan o forman en les tejidos afectados depende de la Iccalizacién del antigeno. - Si se trata de un antigeno estructural c celular fijo, el anti— cuerpo difundira desde el compartimento vascular y el inmunocom­ ple jo se fcrmara en el organe donde se localisa el estimulo. Ali£ ra bien, si se trata de una antigeno seeretado soluble circulan­ te, les inmunocomplejos se fcrmaran en la circuladon y luego se= depcsitaran en el tejido. En estas condiciones, no hay relacion= entre el antigeno y la localizacicn del daho tisular y los inmu­ nocomple jos se depcsitaran preferentemente en,organes con vascu- larizacion especializada como rihones, arterias, piel, pulmones= y plexos coroideos. — 15 — 2.2.- Factores que gobiernan el deposito de inmunocomple .jos en — los tejidos Los irmunocomplejos estan constituidos por una o - varias moléoulas de antigeno con una o varias moléculs de anti-- cuerpc. Su tamaho y concentracion van a determinar su localize— cién sobre la membrana basai de un érgano particular y la activa cion de los sistemas mediadores humorales y celulares response— bles del daho tisular. El tamaho de la matriz tridimensional que constitu ye el complejo depende en su mayor parte de la concentracion de= molécules de antigeno y anticuerpo y de la afinidad de este ult£ mo por el primero. En animales de experimentacion, los inmunocom plejos de tamaho intermedia son responsables en su mayoria del - daho tisular, Los grandes inmunocomplejos son insolubles y rapi- damente eliminados de la circulacién por el sistema reticuloendo telial. Los pequehos inmunocomplejos no activan los sistemas me­ diadores y pueden circular libremente durante largo tiempo. En condiciones expérimentales, la enfermedad pro— gresiva no se desarrollaria en animales con una muy grande 6 muy pequeha respuesta de anticuerpos a un estimulo antigénico perma­ nente. En animales con una respuesta intermedia de anticuerpos - puede desarrrollarse la glornerulonefritis de diverse tipo histo— logico (membranosa 6 proliferativa) con una misma dosis antigen^ ca y afectar los pulmones con un pequeho incremento en el estimu lo. Estas diferencias en la respuesta individual que conducen a= sindromes clinicos distintos a partir del mismo estimulo antigé­ nico estan determinadas geneticamente. 2.3.- Mecanismos de induccién del daho tisular Una vez que los inmunocomplejo.s circulantes se hai depcsitado en un tejido es necesario un incremento en la permea— bilidad de los vasos para iniciar el daho tisular. En conejos, cuando los baséfilos sensibilizados — transportando IgE en su superficie interaccionan con el antigeno - 16 - liberan sus constituyentes grariulares. La histamina y el factor= activante de las plaquetas 6 PAF inducen la agrupacion y desgra- nulacion de las plaquetas y la liberacion de serotonina e hista­ mina plaquetaria. En el terrente sanguineo se desarrolla una --- reaccion alérgica que conduce al deposito de los inmunocomple— jos circulantes en la pared del vaso. Este proceso va acompanado de la la activacion del sistema del complemento. La liberacion - de anaiilctoxinas C5a y C3a,que actuan sobre basofilos y mastoai tes liberando aminas vascactivas y otras sustancias,contribuye a aumentar la permeabilidad de les vasos y el acumulo de inmunocom plejos en la membrana basai vascular. Los inmunocomple jos activan multitud de sistemas mê diadores a través de la porcion Fc de la molécula de inmunoglobu lina. Con la excepcion de los eritrocitos, todas las células cir culantes tienen receptores para la porcion Fc de las inmunoglobu linas. Su interaccién altera su funcion especifica. De esta for­ ma, todas las células de la serie mielcide y los mismos macrofa- gos pueden'acttvarse y liberar sus constituyentes granUlarès. — Los liniocitos E pueden ser bloqueados y los T estimulados para - prcducir factores supresores o cooperadores, capaces de modular= la respuesta inmune. La région Fc de los inmunocomplejos también activa la Vfa clasica del complemento. Su interaccion con el Cl inicia= una secuencia de sucesos que conduce a la excision proteolitica= limitada del C3 y C'5 y liberacion de las anafilotoxinas. El C5a= es un podercso agente quirniotâctico y el C3a tiens la propiedad= de faeilitar la adherencia celular,'favcreciendo la fagocitosis= por un lado y la activacion celular por ccrc. Ambos, degranulan= bséfilos y mastccitos aporta.ndo histamina y otras sustancias — an af i1c tcxicas. El segundo gran sistema mediador humoral es el de 1 factor de Rageman. Ile se activa per les inmunocomplejos, sino de forma indirecta durante el desarrcH: de la inflamacion. Une de los mécanismes mas importantes de induccién del daho tisular es al médiane per el complemento y los neutrof^ los. Experimentaimente se ha astudiadc mediante la reaccion de — - 17 Arthus, por inyecclén local de un antigeno a un animal con anti— cuerpos circulantes. El antigeno y el anticuerpo difunden juntos= y forman complejos en los vasos sanguineos. El complejo fija el - complemento con una acumulacion focal de neutrofilos en un pério­ de de dos a très horas. Se produce una destruccion asociada de la membrana basai estructural de los vasos, especialmente de las ve- nas, que permite el paso de células al espacio extravascular con= el consiguiente edema y hemorragfa. La reaccién alcanza un pico - maximo a las 12 horas de la inyeccion y luego decae lentamente. - En las 24 y 48 horas siguientes, los neutréfilos se reemplazan -- gradualmente por células mononucleares. Tanto los neutréfilos como el complemento son part£ cipantes obligados de esta reaccién y su eliminacion del medio — previene el daho tisular. La eliminacién del complemento évita la acumulacién de nertréfilos, pero la eliminacién de estes no évita la fijacién del complemento a los inmunocomplejos. Es decir, el - complemento es el factcsr que media la agrupacién de los neutréfi- los. El factor quimiotactico C5a atrae estas células a - la zona de depésito de los inmunocomplejos y junto con el C3a y - el Fc del complejo, activa su funcién fagocitica. La fagocitosis= produce radicales libres, péptidos vasodilatadores y sustancias - quimiotécticas. Su puesta en contacto con los macréfagos induce - la liberacién de su contenido granular, constituido por potentes= enzimas capaces de actuar en microambientes écidos y neutres. la= proteasa neutra incluye colagenasa, elastasa y una actividad enz£ matica seme jante a la de la quimotripsina. El medio inflamatorio= contiene, una gran variedad de sustancias :quininégeno, plasminége no, proteinas de la coagulacién, del complemento, elastina, colé- geno, etc.; capaces de inducir la actividad de estas enzimas y la degradacién proteolftica. Por ejemplo; en la nefritis nefrotéxica Inducida experimentalmente, la invasién de los neutréfilos destru ye la membrana basai que aparece en fragmentes en la orina. Un me_ canisrao similar opera en la sinovitis experimental, en la arteri­ tis necronizante de la enfermedad del suero y en el comienza de - los hechos histolégicos que acompahan a la GN estreptocécica y el — 18 — rechazo de in je rtos en e l hombre. Recientemente se ha demostrado un mécanisme inde— pendiente del neu tré filo y del coraplemènto en e l desarrollo de= la glornerulonef h i t is experimental de la enf ermedad del suero y •=• en la enfermedad inmunolégica pulmonar humana. El raacréfago a-T- tra ido por factores quimiotdcticos de forma an^loga a la del neu t r o f i lo , parece ser e l mediador de esta lesién. La presencia en= el exudado inflanatorio del fac to r de crecimiento de los macréfa­ gos contribuye a su pro life rac ién en la zona afectada. Los inmunocomplejoë circulantes se han determinado en una amplia variedad de enfermdades humanas . Sin embargo, es= muy importante tener presents que en enfermedades como la glome- ru lo n e fr it is cfénica, cuyo origen probablemente eean los comple- jos, no son detectados circulando en e l suero. En otras enferme­ dades, donde los inmunocomplejos no parecen estar involucrados - en la patogénesis pueden medirse perfectaraente en la circulacién La mera deteccién de inmunocomple jos no necesajriamente iraplica participacién en la patogénesis de la enfermedadÿ pero dada su - capacidad para inducir la inflamacién, a lerta a cerca de la posi ble evidencia de sus efectos flogogénicos, (180). 3 .- Respuesta de IgA: aspectos celulares 3;1 ,— lin fo c ito s 3 .1 .1 .- Introduccién El conjunto de estructuras orgénicas que desarr£ llan la funcién inraunolégica se denomina sistema inmune. Cuando= funciona adecuadamente sus componentes integrados proporcionan = una respuesta general de proteccién a l organisme frente a cual— quier tipo de agente patôgeno. Esta constituido por e l te jido lin fo id e , d is tr ib t i do en e l hombre en los nodulos y ganglios lin fâ tico s , bazo, timo , plaças de Peyer, apéndice y amfgdalas ( formadas por la con----- fluenoia de nédulos lin fâ tic o s ). Su célula bâsica es e l l in fo c i- to. Ocupa los in te rs tic io s de las mayas reticu lares y su funcién - 19 - es esencial en la iniciaclon y iesarrollo de la Inmunldad humo— ral y celular. 5.1.2.- Linfocitos T y B: caracteristicas générales En el hombre existen dos categorias de linfoci— tos : T y B (149). Los linfocitos T o linfocitos timo-dependientes - se distinguen por la presencia de receptores de superficie para= eritrocitos de carnero y la ausencia de inmunogloculinas de su— perfide. In vitro, proliferan tras su estimulacion por mitogencs no especificos 6 antfgenos y no sintetizan inrnunoglobulinas. Se = originan en la médula 6sea a partir de células troncc c madrés - (stem cell), diferentes de las responsables de los linfocitos B. iMaduran en el microarabiente dsl timo. La corteza de este crgano= présenta una actividad enzimatica que élimina los liniocitos con caracterfsticas B durante las ultimas etapas de la diferencia--- cion oimica (32). Los linf ocitos timo-inde pendiente s o liniocitos B== no presentan receptores de superficie para eritrocitos de carne- rc y la mayorfa portan inmunoglobulinas de superficie. In vitro= sintetizan ini-nunoglobulina-ÿ en respuesta al estfmulo no especff£ co del mitogeno Pcckeweed y a anticuerpos cspecffieos tratados - jo.n antfgenos, taies como hematfes de carnero, toxinas de la dif teria, etc. La especificidad de la célula B para cada tipo de an tfge.no esta determinada por la estructra inmune la, que eomo el= producto de los genes Ir é de la rspuesta inmune, programa la — respuesta de los anticuerpos. Son parte de la progenie de ? as ce lulas troncos de la médula ésea. Conservan su capacidad pluripc- tenoial aun en la vida adulta. Su nombre prcviem de su dependen cia del miicrcambienf.e de la Burs a de Fabricic en las aves. En el hombre, los garglios, les érganos linloides centrales y la lami­ na propia del intestine se consideran localizaciones crfticaa pa ra dife.Lenoiacion de este tipo celular (32). La cantidad de linfocitos T y linfocitos B en el - organisme es muy difici! de determinar. No solo iafltycn las di- - 2C - ficultades técnicas, sino que sus va lores estan afectados roi- faq_ tores fisi''logicos : ritno diaric, ciclo menstrual, edad; y otros de tipo amliental, coTUi alimentacion, rrie'-.ic de vida, etc. 3 .1.5 .- Criteries de diferenciacion Morfologicamente day poca diferencia entre lin focitos T y E examinados al niersscopio optico y electronics. 3u tomaho ceci la entre las 7 y 15 71m de di amont o , en dependencia — del moms n to fun cio m l en el que se encaenoren. Fisicamer.te, lcs = linfocitos ï tienen una mayor movilidad electroforética, una me­ ner capacidad de adherencio debidc a su supi^rficie lisa y una - dons il! ad mayor, que los l^nfocltos B. El me j or criterio para la diferenciacion entre lin focitos T y li.r.focitos B son los marcadorcs de superficie (117). La maycri a sc Lan caracterizado sobre células de raton. En el — nombre, sclc se han encontrado alginas estructuras similares, pe rd es 'muy posible una mayor analog fa a medlda que se perf ec clo­ ne n las téouicas dr det^ccién (87, 150), i ) Marcadcres prc.pios de liniocitos 1 : A.- Clstema TL.- Es in complejo de cuatrc antfgenos, très de — los cuales son prcpios de tiuocitos intratfmicos del raton. El - cuarto es un caracter leucémico que aparece sobre linfocitcs ma- durcs. B.- Sistema Ly.- Es un complejo de cuatro especificidades anti- génicas: Ly-1, Ly-2/3, Ly-5, codificado por dos cromosomas dis— tintes. Les genes implicadcs ccntrolan la especificidad antigéni ca y estan relacionadcs con la funcicn i:umunol'gica primaria del linfocitc. La rraduracicn celular conduce a su expresion génica - diferencial y en consecuencia a la diferenciacion de pcblaciones linfccitardas con actividades diferentes. Asf, las células Ly--- (1 .2 .3 )^ son timccitcs y precurscres intermediaries. Las células Ly-1^ tienen una a.ctividad ayudadora en la respuesta inmune y - las Ly-(2.3)* desarrolla:: una actividad citctéxica/supresora. En todos les casos, su aparicicn es independiente de la exposicién= - 21 - de la célula al antfgeno. C.- Antigeno © 6 Thy-1, y Gx.- Aparecen en las primeras etapas de maduracion in tratimica y se pierden a medida que avanza el proceso. Su propor— cion (3 muy baja una vez alcanzado el maximo grado cb madurez. El - segundo es uno de los majores ejemplos de interaccion entre el ge- noma de un virus y el huésped. D.- Receptores para hematfes de carnero.- Los linfocitos T poseen un conjunto de estructu­ ras en su superficie de naturaleza desconocida que permite la for­ macion de rosetas espontâneas con hematfes de carnero. La reaccion no tiene base inmunologica précisa. E.- Receptores para anticuerpos monoclonales.- La puesta a punto de las técnicas de monoclona- cion de proteinas, mediante la hibridacion celular (141, 142) ha - permitido la obtencion de anticuerpos monoespecificos, capaces de= diferenciar las distintas poblaciones funcionales de linfocitos T= hasta el momento conocidas. Gracias al caracter monoclonal del an­ ticuerpo son capaces de reconocer exclusivamente estructuras de su perficie propias de cada una de las subpoblaciones, presentando un alto grado de especificidad (143, 144, 145). ii) Marcadores de linfocitos B A.- Aloantfgenos Ly 4, 6, 7, 8.- E1 mas conocido es el producto del loci 4/2. Es un antigeno selectivo que se expresa en la diferenciacion del lin- focito B y se mantiene sobre células plasmaticas secretoras y to— talmente diferenciadas. B.- Antfgenos MLBA y MSPCA.- Ambos son propios del raton y del hombre. El — primero es el primer marcador diferencial del linfodto B. El segun do aparece a lo largo de la diferenciacion paralelamente al Pc-1 y se mantiene sobre células maduras secretoras. C.- Receptores para componentes del complemento.- Juegan un importante papel en los mecanismos de control de la respuesta inmune. Se han detectado sobre la superfi­ cie de los linfccitos B receptores para el C3b y C4b (87).= - 22 - Este ultime cccpera cor. el primero en la j.nion de los compleios= antfgene-ar.ticue.rpc sobre la superficie celular. A parecen en un= esuado de diferenciacion pestericr a las inmuncglobulinas y desa parecen una, vez alcanzado el maximo grado de madurez (151). L'.- Formacion de rosetas especif i cas . - Aprcximadamente el 50% de las células B forman rosetas con hematies de carnero recubiertos del components C3 — del complements. La base inmunologica de esta reaccion queda ex- plicada en el apartadc anterior. iii) Maracadores ccmunes a linfccitos T y B (78). A.- Sistema HLA.- Esta constituido per una serie de antfgenos co dificados por un grupo de genes localizados en el cromosoma 6 hu mano. Los productos de les loci A, B, C son glicoprote inas y un= polipéptido asociado a la (2, g-microglobulina, sobre la superfi — cie de les linfccitos B . Existe una gran similitud en los aminca cidcs de estas cadenas y las regiones constantes de las inmunc-- globulinas. Es posible que estos antfgenos fueran estructuras de reccnocimiento primitives sobre la superficie celular, a partir= de las que evclucicnarcn las inrnunoglobulinas por un proceso de= translocacion y duplicacién génica ( 78 ). Leterminan el numéro y especificidad de las células T citotoxicas. Para el desarrollo - de esta actividad se requiers la presence sobre la célula bianco de al mènes uno c dos allelos A c B ccmunes con el huésped. B .- Antfgenos asociados a la region I o la.- Estan codificados por la region D del sistema= génico rlLA. Sus productos son dos gliccprcteinas, expresadas co­ mo una unica molécula sobre la superficie de los linfccitos B, - algunos linfccitos T y macréfagos responsables do la presents--- cion del antigeno. Codifican para los componentes C2 y 04 del — complemento y el factor B de la properdina. Son responsables de= las reacciones en las mezclas de linfocitzs, propias de la - reaccién del "graft versus host". Infleyen en la efioiencia de - las interacciones celulares en les procesos de inmunoregulacion= (78). C.- Antfgeno Th-B y Ly-5.- - 23 - El primero aparece en timocitos inmaduros, perdién dose con la diferenciacién y el segundo sobre linfocitos T y B= lîo es conocido su signif i cado biologico, ontogénico y funcional = (87). D.- Receptores para el Fc de las inmunoglobulinas. Los linfccitos B poseen receptores para el Fc= de las inrnunoglobulinas propias y ajenas, uniformemente repart^ dos sobre su superficie. Estas inmunoglobuinas o porciones de la molécula de caractères analogos a los antfgenos del HLA, son — las responsables del reccnocimiento antigénico. En algunos casos , parte de los linfocitos T se tihen para inrnunoglobulinas de su perfide, debido a la presencia de estos receptores sobre su su— perficie. En 1976 Morëta y colaboradores asociaron su presencia para un tipo determinado de inmunoglobulina, con un posible pa— pel funcional en la produccion de anticuerpos, Demostraron que - poblaciones para el Fc de la IgG ejercfan una accion supresora - sobre la proliferacién de células B. Las poblaciones que présen­ tai an receptores para la IgM, cooperaban en la produccion de an­ ticuerpos (116, 117, 118, 119). El descubriniento de receptores para IgA en pobla= ciones cuya funcionalidad no estaba clara, la dificultad en la - repeticion de los expérimentes y la evidencia de que el efecto - final ccoperador 6 supresor tenfa una dependencia crftica de la= proporcion de linf ocitos T con receptores para IgG e IgM, pusie_ ron en tela de juicio los resultados iniciales (73, 190). Actualmente se considéra que los receptores Fc so­ bre los linfocitos T son marcadores de diferenciacion de la edad adulta y posiblemerte de poblaciones con distinta funcionalidad.= Su influencia en la regulacién de la sfntesis de inmunoglobuli— nas esta aun per descubrir (180, 182). No son exclusives de linfocitos. Se han descubier- to sobre macréfagos, células nulas, células K y en muy baja pro­ porcion en lineas inmaduras de células B. iv) Diferente respuesta frente a los mitogenos Los mitogenos son sustancias capaces de activar la respuesta de los linfocitos, independientemente de la especiflci dad de su union al antfgeno. - 24 — Les mitogenos mas utilizadcs son los inespacjficos= En su mayor p.ai'te se trata de proteinas de origen vegetal ijue se = unen a cligosacaridos de la superficie celular. Existen dos gru— pos : A.- Mitogenos T: (PUA) fitohemaglutinina y la Ccn- canavalina A (Con A).- Activan especificamente linfocitos T, pero .nluyen sobre ambas poblaciones, debido a la liberacion de factores facto_ res solubles que favorecen la reaccion de los linfocitos B, B.- Mitogenos B:titcgeno Pockeewed (PWM).- Estimula ambas poblaciones, pero la resouesta= de las células T es muy pequeha. A este grupo pertenecen lis lip£ proteinas y lipopolisacaridos de las paredes bacterianas, î ue al = ccmbinarse con un antfgeno adquieren fuerte caracter inmun:génico Su reactividad es diferente, asf como los receptores que los reci ben sobre la superficie de los linfocitcs B. Estas localizaciones estan sujexas a un control de tipo genético. En el transcuoso de= la diferenciaci cm,, s.u avidez. por . los mitogenos se modifies c.ondl- cionando su reaccion ulterior. 5.1.4.- Euncionalidad de las células linfoides Los linfocitcs humanos se han clasificado dentro de subpoblaciones adiccionales en base a sus caracterfsticas fun­ cionales y estructurales. Sus concentraciones varfan sensialemen- te en funcion de la técnica utilizada pai'a su determinado.a (7). 1.- Linfccitos B.- Se han definido très catej;orfas = (75): a) células con inrrirnoglcbv.linas de superficie. b) células con receptores para el Fc de Las in- muncglcbulinas. c) Células cou receptores para el C 5 . Frecuen bemente expresan li os o très de estos marca- do.res. Pueden representar diferentes estadcs de maduracion c pc — blaciones discrètes aun no bien reccnocidas. 2.- Linfocitcs T .- En funcion de su modèle a.itigén£ - 25 - CO de superficie se han caracterizado très categorias funcionales distintas (32): a) Linfocitos T citotéxiccs Estan sensibilizados para eliminar células que - portan ciertos déterminantes antigénicos. Su respuesta puede ser= inducida por drogas w simples haptenos ligados a la superficie ce lular. Contribuyen a la defensa del héq)al contra una amplia gama - de infecciones viricas, bacterianas y parasitarias (32) y son res pensables de las alteraciones inmunopatolégicas derivadas. Las reacciones de cititoxicidad requieren la pre-- sencia de al menos uno o dos antfgenos HLA idénticos sobre la cé­ lula T y la célula blanco (36, 141). Existen dos hipotesis de re- conocimjaito, En un caso, se supone que el linfocito T citot6xico= présenta dos receptores de superficie, uno reconociendo el antfge no ccdificado por el virus y otro es un antfgeno del HLA. En el - otro caso, el mas aceptado para el hombre, se piensa que el linfo cite reconoce un antfgeno HLA modificado por el virus. Es decir,= de una forma u otra, estas reacciones van dirigidas parcialmente= contra antfgenos propios. Los estudios realizados hasta el momento sugieren - la maduracion tfmica como vfa de adquisicién de la capacidad para el reccnocimiento de les antfgenos HLA modificados. Las células - de sangre periférica estan perfectamente dotadas para realiz^r es ta funcion. b) Linfocitos T cooperadores en la respuesta de pr£ duccion de anticuerpos (140).- In vitro, la sfntesis de inrnunoglobulinas es de- pendiente de la presencia de un numéro adecuado de linfocitos T - en cultive. Los mécanismes de colaboracién dependen de fenoménos taies como la manera de presentar el antfgeno a los linfocitos B= y los requerimientos inmunes para el desarrollo y diferenciacicn= de la célula en cultive. Presentan un marcador de diferenciacion en forma de receptor para el Fc de la IgM (117, 113). Como ya hemos indicado= esta caracterfstica estructrural no es exclusiva de este tipo de= - 26 - diferenciacion. Sc nan detectado células con receptores para IgA, con estas caracteristicas (39). Su caracter ccoperador depende de la proporcion en la que se encuentren en el cultivo y del tipo de inmunoglobulina, cuya sfntesis regular (227, 229). c) Linfocitos T supresores (121).- E1 sistema inmune funciona a través de un elabo»- rado sistema de interacciones celulares, algunas de las cuales i- nician y otras limitan las respuestap inmunes especfficas. Esta - funcion secundaria es realisada por los linfocitos T supresores . Su modo de accion aun no se conoce. Parece ser que= actuan reconociendo sitios de combinacion especffica para el antf geno denominados idiotipos, sobre la superficie de otras celulas= inmunologicamente activas. El idiotipo estimula la respuesta de - un anti-idiotipo que limita la extension y duracion de la respues ta inicial. Las células supresoras participan en el control de otros modèles de diferenciacion celular no relacionadcs con el — sistema inmune': eritrcpoyesis, granulopoyesis y serie pïaquetaria Su papel central en la modulacion de la respuesta - inmune lleva a pensar que una alteracion funcional, ya sea prima­ ria 6 secundaria, contribuye al desarrollo de enfermedades autoin munes, cancer, infecciones cronicas y rechazo de injertos (3). d) Células Nulas .- Estan constituidas por un grupo celular que ha — perdido los marcadores de linfocitos T o B, incluyendo las pro--- pias células madrés o pluripotenciales. e) Células K .- Poseen actividad citotoxica no especffica. Tie— nen receptores para el Pc de las inrnunoglobulinas y su puesta en- contacto con células recubiertas de anticuerpos détermina la 11-- sis celular. Esta forma de citotoxicidad se ha distribuido en una clase especial de células mononucleares, carentes de otros marca­ dores de diferenciacion. Esta implicada en la defensa del huésped contra la infeccion y en la patcgénesis del daho tisular que acom pana muchos descrdenes inmunologicos (160). No son exclusivas de- los estados patologicos. Juegan un importante papel en el desarr£ - 21 - llo y generacion de células tumorales. 3.2.- Factores implicadcs en la respuesta de IgA 3.2.1.- Rutas de entrada antigénica e induccion de la res puesna de IgA La induccion de una respiasta de IgA a un antfgeno - ingerido requiers su exposicién a los linfocitos del tejido lin— foide asociado al tracto gastrointestinal. La interaccién es crf­ tica para el desarrollo de los centros germinales, capaces de dar una respuesta adecuada. Las rutas antigénicas de entrada a nivel del siste­ ma gastrointestinal son principalmente dos: a) A través de los epitelios especializados que re cubren el tejido linfoide localizado en esa zona. Las células epi teliales, que carecen de glicocalix, son capaces por pinocitosis= de tomar moléculas de la luz intestinal y liberarlas en los espa- cios extracelulares, donde interaccionan con los linfocitos. b) 0 bien, a través de las células del intestine - por exocitosis dentro de la lémina propia. Parte de las moléculas pasan a la circulacién portai a través de las venas mesentéricas= y de ahf al hfgado. Otra parte, las solubles en los Ifpidos, en— tran en el torrente linfâtico y regresan de nuevo a los nédulos= mesentéricos. Los expérimentes realizados hasta el momento sugie ren el epitelio especializado que recubre las plaças de Peyer en= la zona del ilium distal, como principal ruta de entrada antigéni^ ca para la induccién de la respuesta de IgA. Aun no se ha podido= determinar la localizacién précisa de interaccién con el antfgeno Algunos autores sostienen que la presencia de centros germinales= en las plaças de Peyer, apoya la hipétesis de su papel primario= en la respuesta de IgA. De hecho, la falta del nédulo mesentérico no élimina de la lamina intestinal las células que contienen IgA= aparecidas tras la inoculacién de un antfgeno en la zona epite--- liai de las plaças (79). Ahora bien, es muy posible que estas cé- - 28 - lulas IgA* sean una respuesta secundaria al estimulo. El antfge— no puede atravesar,y de hecho lo hace, la plaça y alcanzar el no­ dule mesentérico sin encontrar una célulaB virgen capaz de dar u- na respuesta primaria inicial para la sfntesis de IgA. 5.2.2.- Lineas celuares B Las células B que maduran en el hfgado fetal y en la médula osea derivan de una céltula pre-B que contiene cadena= jii intracelular y no expresa IgM sobre su superficie (25). Su di­ vision continuada da lugar a una poblacion de pequenas células — pre-B, que presentan IgM sobre la superficie (IgM-S*) (28). La aparicion de la cadena (T es posterior a la de - la cadena 71. Es timo y antfgeno independiente. La may or fa de los linfocitos periféricos portan IgM e IgD y su secuencia de diferen ciacion parece ser: linfocitos B IgM-S*— IgD-IgM-S* — IgD-S*. - Se piensa que la IgD esta involucrada en la proteccion de los lin focitos B contra'16s fënoménbs de tbleràncià (99, lOO). La secuencia de aparicion de dros isotipos, como la IgA e IgG no esta clara. Hay evidencias a favor y en contra de u- na presencia anterior a la de la cadenaô , o bien tras una pérdi- da de este marcador. En cualquier caso, solo las células B IgM-S* y IgD-IgM-S* dan lugar a célüfeis plasmaticas productoras de IgA e= IgG sin necesidad de atravesar una fase de diferenciacion en la - que estos isotipos se expresen sobre la superficie (62, 188). Una vez que la célula esta comprometida en la expresion de IgA e IgG, solo da una respuesta primaria o secundaria del mismo.isotipo. La célula ha alcanzado un paso irreversible en la dif erenciacion. Recientemente Honjo y Kataoka han dado una explica- cion genética a la aparicion secuencial de los diferentes tipos - de inrnunoglobulinas. Parece ser que el orden de 1.'Ciads al tracto gastrointestinal o del tracto bronquial, -- produdéndose el "condicionamiento". Las células plantilla regresa rf an a la sa.ngre a través de la linf a eferente, pasando de nuevc= por las localizaciones de la mucosa, donde se diferenciai'fan en - plasmocitos no necesariamente isotipiccs de IgA. Las células mem£ ria recircularfan por el tejido linfoide, volviendo a ponerse en= 37 - contacte con el antfgeno en los nodulos linfâticos de la mucosa.= Los centres germinales ya formados, la estimulacién intensa y la= accién de los linfocitos T cooperadores para la sfntesis de IgA - determinarfan un fuerte incremento de blastos portadores de IgA - sobre otros isotipos en los misnios nédulos. Los plasmoblastos pa­ sarfan de la linfa a la sangre y a la muccsa, donde las células - memoria propagaclas recircularfan. 3.2.5.- Importancia biolégica del ciclo celular de la IgA Las vencajas adicionales del ciclo celular sobre= la estimulacion antigénica directa de inmunocitos y su diferencia cion in situ, ha llevado durante el curso de la evoluciôn del træ to intestinal a desarrrollar la compartimentalizacién y especial! zacién de sus funciones. La inmunizacion y proteccién contra microorganismos entéricos y otros antfgenos requiers su entrada limitada. De aquf , que el intestino haya utilizado la maycrfa de su longitud en la limitacion y abs'orcion simultânea de macromoléculas antigénicas y nutrientes. Un pequeho compartimento ha evolucionado proporcionan do un epitelio especializado a la entrada antigénica y la inicia-- cién de una respuesta inmune In situ é en los nédulos meséntéri— COS. El mecanismo de difusién paralelamente desarrollado amplifi- ca enormemente la respuesta inmune al permitir la circulacién de= los linfocitos estirnulados por el organisme y su regreso al inte£ tire, completando el ciclo celular. En general, todas las membranas mucosas y glândulas = exocrines estan preparadas para no limitar el destine final de — los precursores de IgA a una zona concreta. Esta caracterfstica - ha influido de forma decisiva en la evolucién y supervivencia de= los rnamifaros y la especie humana. La IgA materna no absorbida per el intestine infantil le ha conferidc durante siglos al recien la cido un mecanismo de proteccién pasiva a les antfgenos bacteria— nos entéricos a los que la madré era inmune, mientras desarrolla ba su propi o sistema defensive. Pero quizâs la ccnsecuencia mâs - - 38 - importante del c ü o celular sea la posibilidad de desarrollar nue vas formas de profilaxis inmune mediante la liberaciôn y distribu cién de células inmunes especificas de antfgenos localizados en - el tracto intestinal, en zonas anatomicamente distantes y de diff- cel accès0 . 4.- La glomerulonefritis mesanglai de IgA: una enfermedad inmune 4.1.- Introduocion La glomerulonefritis mesangial de IgA (GN-IgA) fue= descrita por Bergei- y Ilinglais en 1968. Se caracteriza por la pre dominancia de cepésitos de IgA a nivel mesangial y f'recuentes le — slo.ies focales y segmentales pue s tas de manif iestos por microsco- pia cptica y electrcnica. Los depésitos de IgA sueler. ir acompana dos de C3 y/o IgG e IgM en mueha menor proporcién (11). Esta enfermedad ba recibido diferentes denominaci£ nés a medida que ha ido caracterizandose: enfermedad de Berger, - nefropatfa de IgA, glomerulonefritis mesangial de IgA. El ultimo= término es el mas utilizado, tras haberse deoerminado con mayor - precision la naturaleza de los depésitos de inmunoglobulinas en - d-mesangio renal. Actualmente se considéra una de las nefropatfas mas frecuentes en nuestro medio. Una distribucicn similar de les depésitos de IgA - aparece en enfermedad.es como el Lupus er ltematoso sistémico, el - Sfndorme de Scnbnleich Hendch y las hepatopatfas alcohélicas. Aho ra bien, sus caracterfsticas clfnicas y serolégicas las excluyen= de la nefropatfa de IgA,como tal entidad. 4.2.- Caracterfsticas générales La glomerulonefritis mesangial de IgA aparece en p æ sonas jévenes, manifestândose los priraeros sfntonias antes de los= 35 ancs en el 85% de les casos. El sexo femenino prédomina en la= mayorfa de las series estudiadas. - 39 - La diferente pâLftica en cuanto a la prâctica de b i g sias renales, asi como el empleo de antisueros de distintas carac teristicas de especificidad, llevaron a pensar en una localisa- cion de la enfermedad en el ârea mediterranea. Actualmente, la -- participacion de un factor de tipo étnico 6 ambimtal se ha descar tado totalmente y se considéra una ae las nefropatfas de mâs am— plia difusion por todo el mundo. A nivel renal, los anâlisis de microscopfa optica - muestran una gran proliferacion de células mesangiales e incremen to de la matriz. Es muy frecuente la existencia de lesiones foca­ les y segmentales. Las asas capilares periféricas son normales, - aunque en algunas ocasiones aparecen lesiones seme jantes a las de las glomerulonefritis mesangio-capilares. Es muy posible que en - estos pacientes exista una alteracién vascular generalizada, debi do a la frecuencia de casos con funcion renal normal y auseitia de hipertensién. Los estudios estructurales con microscopfa electro nica muestran acumulos de depésitos densos a los electrohes repar tidos por el mesangio y ocasionalmente en el subendotelio de los= capilares periféricos. Menos frecuente, pero caracterfstico de la nefropatfa, es la aparicion de depésitos discrètes densos a los - electrones epi y/o intramerabranosos. La asociaciénde proteinuria= y alteracién de la funcién renal con los depésitos subendotelialæ frente a aquellos que sélo presentan depésitos mesangiales (68) - no ha sido confirmada (124). Clinicamente, la mayorfa de los pacientes tienen le maturia macroscépica, frecuentemente asociada a infecciones del - tracto respiratorio superior. En un 30-50% de los casos, la hema­ turia es récurrente. Sélo un 5-15% de los pacientes presentan al- guna’ vez un sfürome nefrético bioqufmico y el 30% nunca tienen he maturia. La nefropatfa se d^scutre generalmente al examiner el es tado de salud: proteinuria, hematuria, hipertensién arterial é fa llo renal. Su pronéstico no es tan favorable como se pensaba - en un principe. El 50% acaba en diâlisis é muere en una é dos de­ cades, tras el inicio de la dolencia y el 10% de los fracesos re- — 40 — nales que requieren transplante, se deben a esta nefropatfa (13,= 41). Es pucs, una enfermedad que evoluciona lenta, pero progresi- vamente hacfa la insirficiencia renal. 4 .3 .- El mesangio renal: modèles irununopatologlcos El mesangio ocupa una posicion intercapilar en el - glomerulc. Esta constituido por las células mesangiales y un mate, rial fibrilar amorfo o matriz mesangial. No es una estructura sim pie de sopcrte. Participa en el manejo activo y procesamiento de= grandes macromoléculas: ferritina, carbén coloidal, agragados de= Y-globulinas humanas (112). Las caracterfsticas liemodinâmicas y - de permeabilidad del glomerulo influyen significativamente en el= transporte de estos materiales. La acumulacion y deposito de materiales en el mesan gio de pende de la cantidad, tamafio y tipo de las macromoléculas — procesadas. La administracion de agregados de IgG 6 de albumina - humana a ratas y ratones va seguido de su deposito en la region - mesangial, cuatro horas después de la inyeccion, desapareciendo - gradualemte entre las 24 y 48 horas siguientes. Los niveles de a- gregados en sangre son crfticos para el deposito (112), no depen- diendo de la presencia del complemento (112), para su acumulacién en el mesangio. Los agregados de tan aho superior a 7S se localisai sorprendentemente y exclusivamente en la region mesangial, en las zonas de fagocitosis mfnima 0 no detectable. La relacion entre el sistema fagocftico mononuclear y el mesangio renal es muy estrecha. En los primeros expérimentes la captacion glomerular de particulas de carbon se observé, sélo- tras la inyeccién de dosis que saturaban el sistema reticulcendo- telial. La cantidad de proteina agregada o de inmunocomplejcs ac- tivamente formados y depositadcs en el gloméru^o representaba una pequena porcion de lo captado por el sistema fagocftico. Ademâs,= la reduccion en la captacién de macromoléculas por el hfgadc fav£ recfa la persistencia de niveles relativamente altos en sangre y= el incremento de los depésitos en la zona mesangial (112). La mayorfa de estes estudios expérimentales se h a n = - 41 - reallzado con agregados o inmunocomplejos (IG) solubles de IgG e= IgM. La utilizaclon de agregados solubles de IgA, como modelo de= IC es muy reciente. En estas condiciones se ha detectado una ma— y or dificultad para su aclaramiento, con un menor catabolismo por parte del hfgado, en relacidn a otras inmunoglobulinas (43). Cu— riosamente la participacion del rihén en el procesamiento es mas= activa (43). A priori, la manipulacién por el sistema fagocftico= debia ser analoga a la de agregados de otras inmunoglobulinas. — Los receptores para IgA, al igual que para IgG, estan présentes - sobre polimorfos nucleares y monocitos (47). Sin embargo, el cata bolismo celular es menor no jugando el complemento ningun papel,= contrariamente a lo observado para la IgG. La glomerulonefritis por inmunocomplejos se ha div£ dido en dos grupos (127): aquellos en la que primero aparece afec teién mesangial y aquellas en las que primero aparece dano capi- lar. En ambos, los niveles de acumulacion de inmunocomplejos en - otras estructuras determinan la gravedad y extensidn de la lesién renal. El tarn aho pareoe ser el factor determinants de su ]ocaliza— cion. Los pequenos inmunocomplejos solubles, capaces de penetrar= en las asas capilares producen una glomerulonefritis proliferati- va difusa. Los inmunocomplejos menos solubles y de tamano interme dio ( 1x10^ D) tienden a localizarse exclusivamente en lei mesan­ gio, provocando una glomerulonefritis mesangial. El tanaio viene dterminado por la læon antfgeno/an- ticuerpo, el nivel de antfgeno y su Valencia, la class de anticug po y probablemente otros factures como la afinidad y avidez del - mismo. Experimentalmente, la inyeccion intravenosa de inraunocom— piejos solubles de alta avidez détermina su depésito neto en el - mesangio (53). Los formados con anticuerpos de baja afinidad, se= localizan preferentemente a nivel subepitelial en las asas capila res. En enfemedades humanas, como la piirpura de Schonleich Hendch y la misma nefropatfa de IgA, no se ha definido su participacion, ni la responsabilidad del antfgeno/s implicados- En el caso del - lupus eritematoso sistémico, donde el antgeno dominante es el LNA - native, los resultados son muy contradictories. — 42 ~ El ultimo modelo experimental del dano mesangial in­ mune fue descrito por Mauer (102). Se basa en la fijacion del an- ticuerpo a un antfgeno previamente localizado en el mesangio glo­ merular. Para ello, se inyectaron conejos con albumina 6 IgG huma na agregada. Al cabo de 10 horas se transplanté un rinon a un re— ceptor sano, al que se inyecté con anticuerpos anti-albumina é an tl-IgG humana. Dfas después, los rinones presentaban infiltracfon glomerular de células polimorfonucleares y depésito de IgG, 03 y= fibrinégeno en el meaigio. Mâs adelante, se produjo proliferacion de células mesangiales e incremento de la matriz mesangial. Estos resultados sugieren que una localizacién persistante de antfgenos extrahos é la modificacién del mesangio, actuando como un antfge­ no ajeno, produce un daho mesangial inmune cronico y détériore — glomerular progresivo. Paralelamente a este surgieron otros modelos que — utilizaban una inmunizacién crénica con antfgenos de alto peso mo lecular: ferritina a ratones proteinuricos é tiroglobulina a cone, jos (58), que conducfan al depésito de Inmunocomplejos a nivel - mesangial. En todos los casos, los depésitos espéntaneos o induc£ dos no estaban asociados con enfermedad glomerular significative. Las manifestac iones clfnicas aparecfan en animales con nefropatfa asociada a la membrana basai y en ratas sin otra lesfon que un au mento en las resistencias periféricas (139), lo que indujo a pen­ sar en la posible participacién de los mecanismos patogénicos res pensables de estas lesiones, en el desarrollo del daho mesangial= inmune. 4.4.- Modelos expérimentales de nefropatfa de IgA El desarrollo de las técnicas de inmunofluorescen— cia y la obtencién de antisueros de mayor calidad pusieron de ma— nifiesto la importancia de la IgA en el desarrollo de las lesio-- nes glomerulares. De aquf, que en los ultimos tiempos se hayan de, sarrclladc una serie de modelos expérimentales tomando como base= esta inmunoglobulina. Los mâs destacados son : - 43 - 1.- Rifai (148) demostro que los inmunocomplejos de IgA (IC-IgA) formados "in vitro" o "in vivo" producfan cambios — histologicos e inmunopatolégicos relacionados con la nefropatfa - de IgA. Para ello, utilizo las fracciones poliméricas y monoméri- cas de una IgA de mieloma de raton con especificidad anti-DNP. La cantidad de antfgeno y anticuerpo en circulacion fue crftica para el desarrollo de la nefropatfa, que se producfa tanto en exceso - de uno, como de otro. Los inmunocomplejos de IgA monomérica no — producfan depésitos glomerulares. Por el contrario, los de IgA po lirnérica aparecieron en el mesangio junto con el antfgeno especf­ fico y fueron décisives para la induccién de cambios histolégicos nefréticos. Estos resultados estan de acuerdo con los descubri-- mientos posteriores de elevados niveles de IgA poliimérica en el - suero y rinones de pacientes con nefropatfa de IgA (38). 2.- Issacs (82) desarrollé un modelo activo de ne-- fropatfa de IgA en ratones, utilizando antfgenos derivados del — dextrano. A pesar de ser un trabajo meramente descriptive del pa­ pel de los hidratos de carbôno en las enfermedades renales por in munocomplejos, muestra la amplia respuesta de IgA a estos compue^ tos. El modelo es uniformeinente reproducible y las lesiones histo légicas inducidas le hacen part i cularmente adecuado para el estu- dio de algunos aspectos inmunopatolégicos de la nefropatfa de IgA 3.- Por ultimo, Gorley (60) en un modelo de cirro— sis inducida por CCI^ en ratas demostré la presencia de depésitos de IgA a nivel renal, inmunocomplejos de IgA circulantes y elevadas tasas de IgA sérica. Estos resultados confirman el papel del hfga do en el aclaramiento de la IgA polimérica y los inmunocomplejos= de IgA (135) y afirraan las observaciones de suero y rinones de pa cientes con nefropatfa de IgA en hepatopatfas alcohélicas (156). 4.5.- Aspectos inmunolégicos de la nefropatfa de IgA 4.5.1.- Inmunoglobulinas séricas y complemento El 50-70% de las nefropatfas de IgA presentan e levados niveles de IgA sérica, no correlacionados con los hechos= — 44 — clfnicos y anatomopatolégicos propios de la enfermedad. Por razones pocos claras, la IgA sérica tiende a — ser menor en pacientes con fallo renal y se ha encontrado una --- cierta correlacién entre los elevados niveles de IgA y un curso - favorable de la enfermedad. En ningun caso, hay asociacién entre= los niveles de IgA y ios antigenos del HLA especfficos. A pesar de haberse sugerido por Lagrue y Berger -— (93) la posibilidad de que la IgA en esta nefropatfa fuera anômabi en sus caracterfsticas bioqufraicas, hasta 1979 no se admitié co­ mo una realidad (101, 102). El 74% de los pacientes presentan un aumento en la proporcién de IgA sérica en la fraccion (9-21) S, - obtenida por ultracientrifugacién en gradiente de densidad. Esta= diferencia se reduce parcialmente en la zona (13-21) S, tras el - tratamiento âcido del suero. La reduccién con ditiotreftoi, la a- finidad por el components seoretorio y la deteccion de la cadena= J en esta zona del gradiente, son compatibles con la existencia - de formas poliméricas parcialmente en forma de inmunocomplejos en ëL aiero. La elevacion de la IgA sérica tiene un cierto valor diagnostico, ya que no se ha encontrado en otras nefropatfas pri- mitivas. Pero no es especffica de la nefropatfa de IgA. Niveles - moderadamente altos o medios aparecen en nefrpatfas asociadas al sfndrome de Schonleich Henoch, Lupus eritematoso sistémico, y he­ patopatfas alcohélicas y algunas sin depésitos de IgA como la glo merulonefritis focal n mesangio capilar y la gbmerulonefritis es- treptocécica. Los niveles de complemento sérico parecen ser nor­ males. La falta de actividad hemolftica del suero humane fresco - (CH-50) in vitro, frente a agregados de IgA (l-2xlO^D), no descar ta la posibilidad de una cierta activaoion in vivo. De hecho, se= ha encontrado un aumento en los niveles de C3 (93) y se han detec tadc Inmunocomplejos basados en la fijacién del 03 por ensayo de= células Raji (88) y unién a la ccnglutinina (45) en la nefropata de IgA y en la nefritis asociada al sfndrome de Schonleich HenUch - 45 - 4.5.2.- IgA glomerular La naturaleza y origen de la IgA depositada en el mesangio aun no ha sido aclarada. En un principio, se consideraron las secrecciones - externas como fuente principal de IgA, dado que las manifestacio- nes clfnicas de la nefropatfa aparecfan frecuentemente asociadas= a infecciones de las vfas respiratorias super!ores. Salvo en muy ccntadas ocasiones, hasta el momento no ha aparecido IgA secretor ria coriD ial, en el glomerulo. Algunos au cores han tratado de acla rar este punto, determinando la subclase de inmunoglobulina depo sitada. Pero los resultados hasta el momento son muy ccnflictivos Para André (4), los depositos glomerulares son predominantemente= IgAg y segun Conley (26), son de IgA^. Recientemente utilizando la fijacién especffica del components seoretorio a la cadena J de las inmunogloblulinas poli méricas (IgA e IgM) se ha deraostrado que la mayor parte de la IgA depositada en el mesangio renal de individuos con enfermedad de - Berger, sfndrome de Schonleich Henoch y hepatopatfas alcohélicas= es polimérica (19, 20, 30). Estos resultados estan de acuerdo con la mayor patogenicidad de los inmunocomplejos de IgA polfmerica - observada en los modelos expérimentales (9, 156). La participacién de la IgA en el desarrollo de esta nefropatfa es évidente, pero su papel inmunopatogénico es desco- nocido- El aspecto granular de los depésitos sugiere una enfermedad mediada por inmunocomgejos donde la IgA participarfa como antfge­ no y/o anticuerpo. En este sentido no se ha encontrado actividad= de anticuerpo contra diversas estructuras mesangiales, ni de ant^ geno frente autoanticuerpos de la clase IgG e IgM, ni aun después de una nefrectomizacién. De hecho, la IgA aparece como inmunoglo­ bulina unica en el mesangio y no se ha descrito enfermedad renal= en pacientes con deficiencias selectivas de IgA donde son freouen tes los anticuerpos anti-IgA. La reciente observacién de una reac cién cruzada entre la seccién de un rihén humano normal y el elu£ do de una nefrectomfa con enfermedad de Berger, ha sugerido la p£ 46 - sibilldad de que la IgA reaccione con el mesangio, 6 con un antf­ geno secuestrado por él (45), de forma anâloga a como sucede en - los modelos expérimentales de esta enfermedad. El deposito de 03 y properdina en ausencia de comp£ nentes tempranos del complemento ( Clq y 04) (167), acompanando a los depositos glomerulares de IgA, sugiere una activacion de este sistema por la vfa alterna. Esta adivacién podrfa ocurrir parale, lamente a la fijacién de la IgA en el rihén (165) . La disminucdén del numéro de receptores glomerulares para el 03b en rihones con= esta nefropatfa sugiere ademâs su ocupacién por parte de los inmu nocomplejos que contienen este components (161). 4.5.3.- Inmunocomplejos circulantes Los inmunocomplejos con un importante factor en= el desarrollo de las glomerulonefritis ya sean humanas, experi— mentales é asociadas a otras enfermedades. No se ha seguido una - uhiformidàd de cri'terio en cuanto a la frecuencia de su aparlcién debido a la gran diversidad de mâtodos utilizados para su detec— cién. Los primeros ensayos para determinar inmunooomple- jos en la nefropatfa de IgA basados tn la fijacién del complemen— to fueron negatives (159). Un mejor conocirniento de las propieda­ des biolügicas de la IgA permitié determinar inmunocomplejos de - IgA en un 30-80% de pacientes con esta enfermedad, segun el méto- do utilizado (184, 89), llegando a establecerse una cierta asocia cion entre la presenda de IC-IgA y la actividad clfnica de la en­ fermedad (89). De ferma indirecta, el hecho de que la mayor parte= de la IgA sérica tuviera un coeficiente de sedimentacion entre — (9.21) S y disminuyera selectivamente de un 4-10%, tras el trata­ miento âcido del suero en la zona (13-21) S, sugerfa claramente - la existencia de verdaderos inmunocompi.ejos de IgA. La incapaci — dad para demostrarlos en rnuchos casos refieja mâs la inoportuni — daa de la determinaciun, que el bajo Ifraite de sensibilidad de — las técnicas usadas. Es muy posible que la dificultad por parte - - 47 - del higado en el aclaramiento de inmunocomplejos 6 agragados en — hepatcpatias alcohdlicas (150) juegue un papel decisive en el de­ sarrollo de la enfermedad. Ademâs es curioso observar la falta de correlacién entre la actividad clfnica y el fallo renal y su pre­ sencia en el suero. Sobre el tamano de los inmunocomplejos de IgA a pe-_ nas se conoce nada. Se han detectado inmunocomplejos de tamano in termedio en el sfndrome de Schb'nMch Henoch. Kaufman (88) afirma= que cuando va acompahado de nefropatfa de IgA,su tamano es de 19S Estudios de ultracentrifugacién en gradiente de densidad del sue­ ro de estos pacientes en distintas etapas de la enfermedad hacen= sospechar una variacién del tamano de los inmunocomplejos en fun— cion del momento de la determinaclén (44). La mayor patogenicidad de las grandes macromolécu­ las se sospecha de forma teofica. Experimentalmente se produce u- na mayor localizacién mesangial, cuando se forman en exceso de an ticuerpo (148). Sus caracterfsticas bioqufmicas son importantes.= La IgA polimérica résulta crftica para el depésito e induccién de cambios nefréticos. Los immunocoraplejos de IgA monomérica forma— dos in vivo é in vitro, no producen glomerulonefritis en ningun - caso (148). Recientemente se ha confirmado la presencia de IgA po lirnérica en el mesangio y la alta frecuencia de inmunocomplejos - de IgA polimérica en la nefropatfa primitiva y hepatopatfa aieohé lica. La confirmacién final de su participacién en el de­ sarrollo de estas enfermedades requiers la deteccién del antfgeno Elevados titulos de anticuerpos especfficos contra agentes del — tracto respiratorio superior; micoplasna pneumonie, virus influen­ za, antfgenos de la flora intestinal y antfgenos dietéticos, en - relacién con exacerbaciones agudas asociadas a hematuria macrosc£ pica, hacen pensar en su posible implicacién patogénica. Junto a= estos deben considerarse aquellos que afectaii de forma primaria a la mucosa, donde la IgA juega un papel prépondérants. 4.6.- Aspectos inmunogenéticos de la nefropatfa de IgA — 43 — La frecuencia de lesiones renales y anormalidades - inmunolégicas en familiares proximos a los pacientes con nefropa— tia de IgA hablan en favor de la participacion de algunos aspectos genéticos en el desarrollo de esta entidad. Las diferencias étnicas y geogrâficas de las serfe estudiadas no han permitido establecer un resultado unanime sobre su asociacion con el sistema HLA. En î'acncia, donde su incidencia es muy elevada, el riesgo es mâs alto en poblaciones BW35 (15) y= se asocia con la prevalencia de inmunocomplejos de IgG (lü7). En= otras areas geogrâficas y en Espana, no se ha detectado esta pre- dominancîa, ni unaæociacién directa con los antfgenos A, B, G y= DR (41, 44), ni relacién entre ellos y la luncién renal "’es niv£ les de IgA sérica y la presencia de inmunocomplejos de IgA. Solo= em algunas ocasiones, se ha observado un incremento en las Æecuen cias del HLA-B12, CWl (45, 19) y algunos antfgenos del DR (45). - Japén es el unico caso, donde la asociacion es amplia y significa tiva con el antfgeno DEm, fuertemente ligado al DRvG (91). En otras enfermedades como la dermatitis herpetifor me que présenta depésitos continues de IgA sobre la piel, hay una predominaricla de antfgenos del HLA B8 y DV/3/DRW3. Estos antfgenos estan asociados con un aumento en la incident’a de enfermedades= autoinmunes y un defecto en la funcion Ec receptora del sistema - reticuloendoxelial, en pacientes e individuos sanos (119). La observacién de anormalidades en la funcién inmu­ ne reguladora en familiares préximos a los pacientes con lupus — eritematoso sistémico llevé a pensar en una posible participacién génetica tanto en el desarrollo de esta enfermedad, como de la ne fropatfa de IgA. En un principio, la teorfa propuesta sélo permi- tfa especular sobre el desarrollo de la nefropatfa. Se suponfa la existencia de dos clases de genes ligados en un sentido no Mande- liano, Uno controlarfa la expresién de funciones inmunes de reco­ nocimiento y regulacion (genes HLA) y el otro controlarfa las en- tradas y salidas del sistema: produccion de inmunoglobulinas, for macion de inmunocomple jos y respuesta inf lamatoria. El descubrimim to reciente de ciertos antfgenos nn intimamente ligados al HLA-rD= — 49 — sobre linfocitos B (53) y cuya jresencia incrementa en un 4-5% el= riesgo de la nefropatfa, ha dado cierto cuerpo a esta teoria ha— briendo un importante campo de experimentacion para el exclarec£ miento de los aspectos inmunogenéticos que concurren en el desa— rrollo de esta nefropatfa. 4.7.- Glomerulonefritis mesangial de IgA aociada al sfndrome de - Schonleich Hendch y a las hepatopatfas alcohélicas Estas enfermedades tienen como caracterfstica comh la presencia de elevados niveles de IgA sérica en gran cantidad= de casos y su deposito constante en el mesangio y la piel. Histo logicamente son indistinguibles y sélo por manifestacicnes clfni­ cas extrarenales pueden diferenciarse. Hay algunas evidencias a cerca de un posible meca­ nismo patogénico ccmun para la nefropatfa de IgA y la nefritis= del SchSnleich Henoch (38). Se han detectado altos niveles de — IgA polimérica sérica, parcialmente en forma de inmunocomplejos= y depésitos de la misma a nivel mesangial en ambas entidadades - (27, 43, 88). Esto sugiere que el defecto bâsico podrfauresidir en una anormal tendencia a elevar el grado de polimerizacién de= la IgA en ambas enxidades. En enfermedades hepâticas hay un icremenxo en los= niveles séricos de IgA moimomérica y polimérica, parcialmente en= forma de inmunomplejos e IgG (150), probablemente debido a la ne cesidad de neutralizar antfgenos abaorvidos por el intestino. las nive^os de IgA se correlacionan con la æveridaddel dano hepâtico (45) y su presencia a nivel glomerular es muy elevada en pacien­ tes con cirrosis alcohélica. Su origen es desconocido. Pero dada la importancia del hfgado en el aclaramiento de la IgA poliméri­ ca, PS muy posible que al igual que en los modelos expérimenta— les, un fallo hepâticc determine una elevacién en el tiempo de - persistencia de los inmunoccmplejos de IgA, favoreciendo el depé site en el rihén y el desarrollo de la nefropatfa(39). OBJETlVOS - 5C - 2.- OBJETlVOS A pesar de la gran cantidad de trabajos deiicados - al estudio de la patogenla de la nefropatfa de IgA, hasti el aho= 1979 no empezaron a considerarse las alteraciones en las celulas= participantes en la respuesta inmune, un factor importante en el= desarrollo de esta enfermedad. Dada la poca cantidad de datos existentes en la li teratura, el objetivo principal de este trabajo fue el estudio de las ateracicnes celulares que pudieran explicar los elevados nive les de IgA polimérica,parcialmente en forma de inmunocomplejos, - encontradcs en el suero y rihones de estos pacientes (59, 101). La presencia de hematuria macroscépica tras infeccg lies del tracto respiratorio superior nos llevé a suponer que los = linfocitos circulantes de los pacientes con nefropatfa ds IgA, — provenientes de , las secrec.dones externas,,producirfan altas, canti- dades de IgA polimérica después de la estimulacién virai. Para = aclarar este punto, se estudiaron las caracterfsticas bitqufmicas de la IgA producida por las células mononucleares obteniias de — sangre periférica en respuesta a la estimulacién policlcial del - mitégeno Pockeweed (PWM). Se analizaron la cantidad y calidad de= las células implicadas en la biosfntesis de IgA, su grado de dife renoiacién y su capacidad de respuesta en presencia de saeros es­ pecfficos anticadena J humana. Como la respuesta formadora de un isotipo ietermina do es consecuencia de un elaborado sistema de interaccioies celu­ lares, cualquier fallo en la cadena reguladora nos condwirfa a - la expresién anéraala de sus fUnciones especfficas y a una altera— • cién en el fino mecanismo de control. Esto nos indujo a estudiar= los factores celulares implicados en la regulacién de la sfntesis de inmunoglobulinas. Se cuantificaron las poolaciones de linfoci- tos T reguladores y su actividad cooperadora é supresora sobre la sfntesis de inmunoglobulinas eu respuesta a la estimulacién poli- - 51 - clonal del P\VM y la Con A. La deteccion reciente de inmunocomplejos de IgA e — IgG en el suero de estos pacientes durante los episodios de hema­ turia macroscopica (45) y de forma permanente los de IgA, asf co­ mo las evidencias sobre el efecto modulador de estos inmunocomple, jos sobre la sfntesis de inmunoglobulinas , ya sea por su interac­ cion con los linfocitos T 6 B i45), nos llevaron a estudia? e l --- efecto del suero de estos pacientes y los agregados de IgA monorné rica, IgA polimérica e IgG, sobre: - la sfntesis de inmunoglobulinas en respues ta - la actividad supresora de células T inducidas al PWM. por la Con A. - la generacién de células reguladoras en res— puesta a la estimulacién policlonal del PWM y la Con A. Por ultimo para conocer si algun trastorno de la in- munoregulacién podrfa transraitirse gerefcicamente, se estudio en lœ familiares préximos a los pacientes con nefropatfa de IgA,la modi cacién de los pars&netros inmunolégicos descritos en los apart ad os anteriores. si" MATERIAL V METCOO - 52 - 3.- MATERIAIES Y METODOS 3.1.- Materiales 3.1.1.- Pacientes Se han estudiado 35 paoientes con nefropatfa IgA establecida por biopsia renal. El criterio diagnostico se bas6 en la presencia de IgA en el mesangio glomerular asoeiada o no a o— tras inmunoglobulinas y complemento. Se excluyeron aquellos pa--- cientes que tuvieron evidencias clfnicas 6 bioquimicas de enferme dad hepatica, sindrome de Schonleich Henoch, lupus eritematososo- sistémico u otras enfermedades sistémicas. Los contrôles fueron - voluntaries pertenecientes a los miembros de plantilla, estüdian- tes de medicina y personal de laboratorio, con edades y æxos com­ parables a los pacientes estudiados. ......... 3.1.2.*- Réactives y componentes especiales Para la realisaci6n del cultive y posterior cuan tificacion de inmunoglobulinas y anâlisis de receptores se han — utilizado los siguientes réactivés: - Lymphoprep (Hücoa Erlbss) - Medio de cultive RPMI 1640 (Plow Laboratories) - Suero de ternera fetal descomplementado (") - Glutamina (") - Penicilina/Estreptomicina (") - Pockeweed Mitogen (Gibco) - Concanavalina A (Sigma) - Neurarainida® (Behring Diagnostic) - Suercs comerciales especfficos anti-cadenas pesa— das "'L T y yU humanas, obtenidas en conejo y antisuero humane total (Operon). - Sueros comerciales especificos conteniendo los — fragmentas P(ab’)2 de antlcuerpos anti-IgA, anti-IgG y anti-IgM - marcados con fluoresceina, obtenidos en cabra (Cappel Laboratories - 53 - - Suero comercial especffico marcado . con Rodamina= anti-componente secretorio humano (Atlantic Antibodies). Suero c£ mercial especffico anti-componente secretorio obtenido en conejo= (Dakopatts y Behring Diagnostic). - Suero comercial anti-lactoferrina humana (Behring Diagnostic) - Suero comerical especffico anti-cadena J humana - obtenido en cabra (Bering Diagnostic) - Suero comercial especffico anti-IgG de cabra obt£ nido en conejo, marcado con Rodamina (Cappel Laboratories) - Suero comercial especffico anti-IgG de raton obte nido en cabra, marcado con fluoresceina (Cappel Laboratories) - Anticuerpos monoclonales comerciales especfficos= anti-receptores de células T supresoras/citot6xicas (QKT8), anti- receptores de cëlulas T cooperadoras (0KT4) y anti-receptores es­ pecff icos de células T totales (0KT3) obtenidos en raton. - para el marcaje de proteinas (Amershan) - Alburaina sérica bobina (Sigma) - Shepharosa activada con CNBr (Pharmacia Fine) - DEAE-Celulosa (Watman) - Shephadex G-50 y G-200 (Pharmacia Fine) - Ultrogel ACA-22 y ACA-34 (LKB) - Ditiotreitol (Sigma) - lodoacetamida (BDH) - Agar Noble - Azul Trypan (Merck) - Plaças para cuantificar inmunoglobulinas (Kalles— tad) - Plaças de acetato de celulosa para inmunoelectro- foresis (Kallestad). 3.1.3.- Aparatos - Microscopio optico Nikon 112925 - Centrifuga termoregulable PR-6000 - 54 - - Microscope de fluorescencia Nikon - Espectrofot6metro de ultravioleta modelo SP1800 = - Contador de radiaciones modelo 500C-800C (Packard) - Colector de fracciones LKB - Calculadora prograraable modelo Olivetti 3000 - Câmara de flujo laminar - Gdmara de cultives estériles - Cdmara de contaje Neubauer. 3.1 .4 .- Soluciones mds utilizadas Solucion de Hank - Solucidn A: a) ClNa 80 g- GIK 4 g= SO^Mg VHgO 1 g= Cl^Mg ÔHgO...................... 1 g= Agua destj lada 400 ml= b) ClgCa ....................... 1,4 g= Agua destilada................. 50 ral= Mezclar a y b y complétas hasta 500 ml - con agua destilada. - Solucidn B: PO^HNaglZKgO....................... 1,52 g PO^HgK ............................... 0,6 g Glucosa .............................. 10 g Agua destilada 500 ml - Solucion G: C O ^ H K a 1,4 g Agua destilada 100 ml Para su utilizacion: mezclar un volumen de= solucion A con un volumen de solucion B y 18 volumenes de agua dæ tilada. Anadir un ml de solucion G por cada 40 ml de la mezcla - anterior. - 55 - Solucl6n de lisls de hematles: CINH^ 8,29 g CO^HK 1,0 g EDTA dcido 0,02 g Agua destilada........................ 100 ml Ajustar el pH a 7,4 y d i lu ir a l l/ lO para su u tilizaci<5n. Medio de cultive enriquecldo RPMI 1640 al que se anade: L-Glutaraina 2 mM Penicilina 100 ui/ml Estreptomicina/Penicilina 50 ug/ml Soluci6n de Azul Tripdn Azul Tripdn al 2 % en agua destilada ClNa .................................. 4,5% SE raezclan cuatro partes de azul tripan con u m de ClNa. 3.2.- Metodos 5.2.k.- Tecnicas Inmunoqufmlcas 3.2.A.I.- Alslamlento de IgG El aislamiento de IgG se realizd mediante cro- matograffa de afinidad en DEAE-Celulosa (155). La IgG se obtuvo a partir de sueros de sujetos nor­ males y pacientes con mieloma de IgG. La sangre extraida por puncidn venosa se dej6 coagu lar. Una vez retraido el coagulo, se omtrifug6 de nuevo durante - 30 minutes a 6000 xg para eliminar el posible sedimento. La capa= sobr^ ladante se dializ<5 frente a soluci<5n tampon fosfato 0.01 M - pH 8, durante 6 6 8 horas a 4—C y con agi tac ion continua. Finali-» zado el proceso, se centrifugo de nuevo y se aplic6 a una columna de DEAE-Celulosa 52 equlibrada en el misrao tamp6n. En estas condi clones de fuerza i6nica y pH, la IgG sérica se eluyo a través de= la columna. El resto de las proteinas quedaron unidas a los grupoB - 56 - activos de la résina cambiadora de aniones. Se recogieron fracciones de unos 8 ml de volumen, = en las que la presencia de proteina se determin6 por precipitaciéi con una gota de acido suifosalicxlico al 20%. Las fracciones pro teicas se mezclaron y concentraron frente al vacio 6 por precipi— tacion con SO^Cn K^)^ 2M . El grado de pureza y agregacl6n se deter mino por inmunoelectroforesis, inmunodifusidn doble bidimensional y filtracion en columna de Shephadex G-200, respectivamente. La - La concentracion de proteina se determine por inmunodifusi6n ra— dial y espectroscopia de absorcion ultravioleta. 3.2.A.2.- Aislamiento de IgM La IgM se obtuvo a partir de sueros de pacien­ tes con macroglobulinemia de Waldestrom. La fraccion de Y-globulinas séricas se précipité — con SO^(NH^)g al 45% a pH 7. El precipitado se lavo dos veces con este medio y se centrifugo a 1.500 xg durante 15 minutes. Se red£ solviô en tampén fosfato salino 0.15 M pH 7,5 y se diallzé toda = la noche frente a este medio, para eliminar los restos de sulfato El dializado se aplicé a una columna de Ultrogel __ ACA-34 y se eluyô en el mismo tampon. La localizacién de las fra£ clones que contenian IgM se reàlizé por inmunodifusién doble y su grado de pureza se ensayo por inmunoelectroforesis frente a sue— ros anti-IgM y antisuero humano total. Se mezclaron y concentra­ ron, cuantificéndose por inmunodifusion radial en plaças comercia les de Kallestad. La IgM se llevo a una concentracion final de - 10 mg/ml para su posterior utilizacion. 3.2.A.3.- Aislamiento de IgA Se aislo por croraatograffa de afinidad de DEAB Celulosa (135) a partir de sueros de pacientes con mieloraas de — IgA. La IgA se precipitaba del suero con una solucién de S0^(NH^)p 2M a Ph 7 y en frio. El precipitado se dializaba fren- - 57 - te tampén fosfatos 0,01 M pH 8. El dializado conteniendo una cantidad de 2 g de pro teina se cromatografiaba en una columna de DEAE-Celulosa 55, equi— librada en el mismo tampén. En estas condiciones, la IgG se eluye a través de la. columna, quedando retenidas la IgA y otras proteinas séricas en - los grupos activos de la résina. Cuando la densidad 6ptica de las fracciones IgG eluidas fue menor de 0,02, se modified la fuerza - iônica del medio, mediante un tampén fosfatos 0.05 M pH 8. La — IgA comenzo a eluirse. Su presencia se déterminé por inmunodifu— sién doble frente a distintos sueros monoespecificos anti-IgA, - anti- ^ macroglobulina, antisuero humano total y anti-albumina,= principales contaminantes en este proceso técnico. Las fracciones se mezclaron y concentraron, analizando su grado de agregacién — por filtracién en Shephadex G-200. La IgA se cuantificé por inmu- nodifusién doble y se llevé a una concentracién final de 10 mg/ml Cuando querfa separarse la fraccién monomérica de - la fraccién polimérica de esta inmunoglobulina, la solucién conte niendo los 2 g de proteina se cromatcgafié en DEAÊ-Celulosa 50 y - se eluyo con un gradients lireal de concentracién a pH 8 que se — inicié con una solucién fosfatos 0.05 M pH 8 y terminé en una so­ lucién fosfatos 0.05M ClNa 0*2M. En estas condiciones, .se eluye— ron dos picos. El priraero contenia IgA monomérica 7 S con una pu­ reza cfel 98% y trazas de IgG, puesta de manifiesto por inmunoelec­ trof oresis frente a sueros raonoespecfficos. El segundo pico era - raés rico en IgA y contenfa algo de ^g-macroglobulina y albémina.^ Por filtracién en Shephadex G-200 se séparé en dos picos de los - cuales, el primer o estaba constituido por IgA polimérica y -ma­ croglobulina y el sègundo por IgA monomérica 7S, analizados por - inmunoelectroforesis frente a sueros monoespecfficos y ultracentri fugacién en gradients de densidad. Este ultimo pico se unié al ob tenido en primer lugar y se concentré. Lo mismo se hizo con el pi 00 polimérico, cuantificéndose ambos por inraunodifusién radial. 3.2.A.4.- Inmunodifusién doble bidimensional - 58 - Se utilize el raétodo de Ouchterlony (132). Para e— 11c , se préparé una solucién de Agar noble al 1,5% en tampon fos fato 0,15M pH 7,3. El agar fundido al bano maria se distribuyé en alicuotas de 10 ml, guardandose a 4®C. Para la preparacién de las plaças se refundié el — agar por calentaraiento al bano maria. La solucién se agité repeti damente con una varilla de vidrio para eliminar las burbujas de — aire del medio. Con una pipeta se deposité en plaças de plâstico= Pétri colocadas sobre una superficie horizontal.Una vez frfas, se guardaron a temperatura ambiente en una camara humeda. Las plaças se utilizaron en un plazo no mayor de dos dfas, después de su pre paracién, 3.2.A.5.- Inmunoelectroforesis Se realizé en plaças de acetato de celulosa, e quilibradas en tampén veronal/ veronal sédico 0.03 M pH 8,6. Estæ plaças poseeh ùnà distribuciéh alterna de pocillos de 1 mm de dia métro y trincheras de 2 mm de ancho. Las muestras tenidas con una gota de azul de brorao fenol utilizadc como marcador de desarrollo al unirse especifica- mente a la alburaina sérica, se aplicaron cuidadosamente en los po cilles con una pipeta calibrada. Las plaças se Levaron a una cube ta de electroforesis que contenfa tampon veronal/ vernnal sédico= 0.03 M pH 8,6 y se les aplicé una caida de tensién de lOC voltios durante 90 minutes (30 vol/cm). Pinalizada la electroforesis, se rellenaron las trk obéras con los antisueros correspondientes y se guardaron en céma ra humeda. Al cabo de 24 é 48 horas se leyé el desarrollo de ban­ das . Las bandas de proteina se tiheron y fijaron por in- mersién en una solucién de metanol/acético (8/1) en agua, a la qie se anadié 0,5 mg/ml de azul de coraassie. A las 18 horas se lavé - el gel con la misma solucién, pero sin colorante hasta que las — bandas aparecieron con toda nitidez. - 59 - 3.2.A.6.- Aislamiento de IgG de cone .jo Se realizé segun una modificacién del método= de Peiperton (135). Se tomaron 25 é 30 ml de suero de conejo dializado= frente a tampén fosfatos O.OIM pH 8. El dializado se centrifugé a 1,400 xg, durante 15 minutes para eliminar sustancias précipita— bles en ese medio y se aplicé a una columna de DEAE-Celulosa 55,= equilibrada en el mismo tampén. Se recogieron fracciones de apro ximadamente 5 é 9 ml y aquellas cuyas densidades épticas fueron menor de 0.02, se concentraron y se ensayé su pureza por inmunodi fusion doble e inmunoelectroforésis , frente a un antisuero anti— IgG de conejo y antisuero de conejo total. La concentracién de IgG se déterminé por espectros- copfa de absorcién molecular y se llevé a una concentracién final de 10 mg/ml para su ulterior utilizacién. 3.2.A.7.- Obtencién del suero de carnero anti-IgG de co­ nejo 7.5 mg de IgG de conejo aislada segun el prccedi--- miento anterior, se llevaron a un volumen de 0.5ml de solucién sa lina fisiolégica 0.15 M pH 7,3 y se agregaron por calentamiento a 659C, durante una hora. Tras cornprobar el grado de agregacién por filtradén en Shephadex G-200. la proteina se llevé a un volumen de 4 ml en= solucion salina y se diluyé al 1:3 en adyuvante complète de Freud 3 ml de la preparacién se inyectaron intramuscular— mente en cada una de las patas de un carnero. Al cabo.de un mes,= se inyecté de nuevo repitiendo la operacién 20 dfas después. Tran curridûs dos meses desde el inido de las series de inyeociones, - se extrajo sangre y se comprobé su titulacién frente a IgG de co­ nejo. Siendo bastante buena, se sangré definitivamente al carnero y el suero se guardo a -2090 para su posterior utilizacién. 3.2.A.8.- Marcaje de proteinas - 60 - Se utilize el método de Hunter y Greenwood (1962), em— - pleando la Gloramina T como oxidante débll (79). A 50 yUl (20-50 pg) de la proteina a marcar, aislada y purificada por raétodos habituales, se le anadio 1 raCi de diluido al 1/2 en tampon fosfatos 0.5 M pH 7,5 y 50 ^1 de Clorami na T (2 mg/ml). La proteina se dializé previamente frente a tampéi fosfatos O.IM pH 7,4. La mezcla se agité durante 1 minute. A continuacién se anadieron 50 /il del agente reductor é metabisulfito sédico --- (2 mg/ml) y se agité suavemente durante 3 minutes. La reaccién se finalizé por adiccién de 200 jal de IK IM en tampén borato salino== al 0,9% a pH 8 con albumina bobina al 0,2%. 3.2.A.9.- Purificacién de proteinas marcadas La separacién de la proteina marcada del ^^^1= libre se realizé por dos métodos distintos: - Por dialisis en tubes Visking 8/32 ( ^=2,4) a 4^0 frente a tampén borato salino 0,9% pH 8 con albumina sérica bobl na al 0,2%. El liquide de dialisis se rénové cada 6 é 8 horas, mĵ ‘diendo las cpm liberadas al medio. - Por filtracién en una columna de Shephadex G-25 e quilibrada en tampén borato salino al 0,9% con albumina bobina al 0,2%. Se recogieron fraciones de 1 ml y se detectaron las cpm en= cada una de ellas, obteniéndose dos picos: el primero correpondié 125a la proteina marcada y el segundo al I libre. En ambos casos, el porcentaje de libre después de la separacién se déterminé por precipitacién con acido triclo- roacético al 20%. Para elle, se tomaron 10 pl de cada fraccién y= se anadieron 0,5 ml de tampén borato salino al 0,9% pH 8, albumi­ na bobina al 0,2% y 0, 5 ml de acido tridorodcetico al 20%. Sé c m trifugé durante 20 minutes a 1.400 xg y se leyeron las cpm en e 1= precipitado y en el socrenadante. Can este dato y el porcentaje db incoi^oracién de ^^^1 a la proteina, se calculé el rendimiento de la técnica. — 61 — La proteina marcada radiactivainente se pa sé por una columna de Shephadex G-200, para examinar la posible agragacién é fragmentacion debida al marcaje 3.2.A .10.- Preparacién de Inmunoadsorbentes Se prepararon dos tipos de inmunoadsorbentes= en funcién del soporte utilizado: a) Shepharosa 4B activada con BrCn.- De 6 a 15 g de Shepharosa 4B se lavaron alterna- tivamente très veces con una solucién de CLH 0,001 M y otro tanto con una solucién de carbonate sodico/bicarbonato sédico 0,IM pH 8 para eliminar èl GIH, Se resuspendié en el minimo volumen necesa rio de este éltimo tampén y se anadié una solucién de 10^15 mg de proteina a complejar por g de Shepharosa activada- La solucién — proteica se dializé previamente frente a tampén carbonato/bicarbo nato 0,3M pH 8. La mezcla se incubé con agitacién suave 2 horas a temperatura ambiente é 18 horas a 4^0 . A continuacién se filtré= en un Buchner y se recogié el filtrado, determinando su concentra cién mediante espectroscopfa de absorcién ultravioleta. El preci­ pitado se lavé repetidamente con tampén carbonato/bicarbonato — 0,IM hasta que la D.O. del liquide de lavado recogido fue menor cfe 0.02. El liquide de lavado se concentré y se cuantificé la canti- dad de proteina presents mediante un Folin para determiner el ren diraiento de la técnica. Para eliminar los grupos activos que se hub 1er on qie dado sin acoplar con la proteina, se incubé la shepharosa con una solucién de Etanolamina IM a pH 8, durante 2 horas a temperatura= ambiente. A continuacién se hicieron très series de lavados, al— ternando tampones de bajo y alto pH (acético/acetato 0.3 M pH 4 y borato salino 0,9% pH 8). Por iTltimo, se lavé dos veces wâs con - tampén carbonato/bicarbonato y se resuspendié en un pequeno volu­ men para procéder a empaquetar la columna. b) Precipitacién con Glutaraldehido.- Se procedié segun el método de Williams (189) — 62 — A 10 ml de suero humano normal dializado frente a - tampén fosfato salino 0.15 M pK 7,3 se le anadieron 1 ml de tampéi fosfatos 1 M pH 7 y 3 ml de una solucién acuosa a l 12% de gluta— ralheido, para obtener una concentracién f in a l del 2,5% en e l me­ dio. La mezpla se agité durante 20 minutes y se dejé reposar 3 ho ras a temperatura ambiente. 500 mg de proteina precipitada se homogeneizaron — con 200 ml de tampén fosfatos 0,2 M pH 7,3, lavando varias veces® la suspensién résultante, con e l mismo tampén- A continuacién se - centrifugé durante 15 minutes â 4 20 y a 1.400 xg y e l p rec ip ita ­ do se resuspendié en g lic in a -CIH 0,1 M pH 2,8, iniciândose una - nueva serie de lavados con este tampén. Por ultimo se suspendié - de nuevo en tampén fosfatos 0,2 M pH 7 y se lavé hasta que la D.O del sobrenadante fue menor de 0.02. El inmunoadsorbente se resuspendié en tampén fosfato salino 0,15 M pH 7,3 azida sédica a l 0,05% y se guardé a 4®c has­ ta su u tiliz a c ié n . 3.2.A .11.- Obtencién del componente secretorio lib re Se rea lizé segÆn e l método de ünderdown y col (1977) por cromatograffa de afinidad (170). a) Aislamiento de las proteinas de la leche.- La leche humana obtenida 3 é 4 dfas después del® parto se centrifugé durante una hora a 5000 xg para separar la p® te grasa del componente protéico. b) Preparacién del componente secretorio l ib re . - Para su separacién del suero se u t i l iz é su a f i— nidad por las inmunoglobulinas poliméricas, en este caso IgM. 50 ml del suero obtenido por centrifugacién de la — leche, se mezclaron con 450 ml de tampén fo s fa to /c itra to 0,01 M — pH 6,8 y 125ng de sulfato aménico ferroso para agregar la lactofe rr in a sérica presents y se incubaron dos horas a 490 con agitacié i continua. 200 ml del suero d ilu ido se incubaron con un inmuno adsorbents de shepharosa-IgM durante 3 horas a 42c. La mezcla se® - 63 - se empaqueté en una columna de vidrio y se lavé exhaustiianente — con tampén fosfato salino 0,15 M pH 7,5, hasta que la densidad ép tica (ÈL liquide de lavado fue menor de 0,02. La proteina adsorbida se eluyé con tampén fosfatos® 0,01M-SCNK pH 7 y se dializé frente a tampén fosfato salino 0,15M pH 7,3. Se concentré y se aplicé a una columna de shephadex G-200 superixno. La pureza de la preparacién se comprobé por electrofo- resis en acetato de celulosa e inmunodifusién doble frente a anti- sueros anti-componente secretorio, anti-lactoferrina, anti-IgA y® anti-suero humano total. En estas condiciones el componente secretorio prepa rade contenfa trazas de lactoferrina pero no de IgA. c) Marcaje del componente secretorio libre.- 1 mg de componente secretorio libre se marcé --- con 1 mCi de ^^^IK, segun el método de Hunter y Greenwood, elimi- nândose el ^^^I libre por filtracién en gel. 3.2.A.12.- Ultracentrifugacién en gradients de densidad Los gradientes se prepararon en tubos de nita to de celulosa con un volumen de 5 ml. Mediante un formador d e --- 2,25 ml de capacidad, se establecié un gradients de densidad con=® una solucién inicial de sacarosa al 5% y una final al 40% disuel- tas en Tris-’CIH 0,15 M pH 7,4. La preparacién se roalizé el mismo® dfa de su utilizacién. 50 /il del suero a ensayar diluido al l/lO en el raisi- mo tampén, se aplicaron cuidadosamente sobre la superficie del gia diente y se centrifugaron durante 16 horas a 4 9C con una ultra— centrifuga Spinco SW-50-1. Terminada la centrifugacién, los tubos se mantuvieron a 490 y se extrajeron alicuotas de 200 jul perforan do el fondo del tubo cm una aguja unida a un colector de fraccio­ nes, mediante un tubo de goma. A cada fraccién se le anadieron — 1,5 ml de tampén borato salino al 0,9% pH 8 y se diluyé adecuada- meate paoa cuantificacién de inmunoglobulinas por RIA. Los marcadores utilizados en el gradients fueron: — 64- “ Albumina sérica bobina. . . . . . . . . . . . . . 4 , 5 8 IgG de conejo............................. . . .7 S Ig M humana.............................. 19 S 2 mg de cada una de las proteinas se disolvieron en» 0,5 ml de tampén y se œitrifugaron paraislamente a las muestras - en tubos intependientes. La recolecclén de las fracciones se re a li zé de modo anélogo, leyéndose por espectrometrXa a 280 nm la con- oeitracién de proteina. Con estos datos, se construyé una recta patrén que» relacionaba e l n&iero de fraccién con e l peso molecular, eatable- ciéndose a que fraccién correspondia cada coeficiente de sedimen- tacién. La linealidad del gradiente se chequeo por re frecto metrla centrifugéndose 0,5 ml de tampén en las mismas condiciones de las muestras. El porcentaje de sacarosa en cada una de las fracciones eluidas se déterminé utilizando e l bromonaftaleno como estandar. 3.2.B .- Cuantificacién de inmunoglobulinas por radioinmunoanéll— sla (RIA) Para la cuantificacién de IgG, IgA e IgM se u t i l iz é un radioinraunoanélisis de doble anticuerpo, segén la técnica des- c r ita por Lépez Trascasa y co l. (1980) (102). 3 .2 .B .I.- Obtencién del antfgeno La IgA, IgG e IgM se obtuvieron de los sueros » de m-ielomas c orre pondient e s, aisléndoae segun los prooedimientos anteriormente descritos en los apartados 3.2.A. 1, 2 y 3. 3.2.B .2.- Marcaje de inmunoglobulinas con ^^^I Se procedié segén e l método de Hunter y Green­ wood (1979) (79). — 65 — La cantidad de IgA e IgG fue de 25 pg y la de IgM - de 50 pg. (Ver apartado 3.2.A.8). Alicuotas de cada proteina marcada se pasaron por - una columna de shephadex G-200 superfino para detectar la posible agregacién o fragmentacién de las proteinas con el marcaje. 3.2.B.3.- Adsorcién del suero de carnero y del suero de® conejo frente a suero humano total Para evitar las inespecificidades que pudieran pro- ducirse por reaccién cruzada entre los déterminantes antigénicos® de la IgG de estos sueros con los de la IgG humana a valorar, se® adsorbiercn con un suero humano tdal precipitado con glutaraldehi do al 2,5%. Un volumen igual al ocupado por el inmunadsorbente® se incubé 30 minutes a temperatura ambiente con agitacién suave.® Se centrifugé a 1.400 xg durante 15 minutes a 4^0 y el sobrenadan te se guardé a -209C para su posterior titulacién. El precipitado se lavé exhaustivamente con solucién salina fisiolégica hasta que la D,0. del liquide de lavado fue me_ noT" de 0.02. Se anadié 4 ml de tampén glicina-ClH 0,1 M pH 2,8 y® se agité 5 minutes a 4^0. El precipitado se lavé de nuevo con el® mismo tampén y varias veces con tampén fosÊto salino 0,15 M pH — 7,3. De esta forma quedé preparado para una nueva utilizacién. 3.2.B.4.- Titulacién del suero de carnero anti IgG de — conejo La titulacién del segundo anticuerpo se realizé me­ diante una curva de precipitacién entre el suero de carnero anti- IgG de conejo diluido al 1/2 en tampén borato salino al 0,9% pH 8 frente a distintas diluciones de suero de conejo utilizado como - transportador en el RIA. 1 0 0 /il de suero de carnero diluido se incubaron 2 ho ras a temperatura ambiente y 16 horas a 490 con 100 /il de suero - de conejo en un rangv de diluciones establecido entre l/l y 1/200 — 66 — en un volumen f in a l de 0,4- ml de tampén. El precipitado se lavé très veces en e l mismo medio diluyéndose con 1,5 ml de una solucién de sosa 0,1 N y leyéndose— la densidad éptica a 280 nm. Se tomé como punto de équivalencia e l inmediatamen te anterio r a l de méxima precip itacién. 3 .2.B .5.- Valoracién del primer anticuerpo Los antisueros comerciales anticadenas pesadas , Ty M fueron obtenidos en conejo. No mostraron œactividad cru— 125zada con los antigenos marcados con I cuando se ensayaron por i i munoelectroforesis e inmunodifusién doble. La precip itacién sélo= ocurrfa con e l antisuero especffico para cada antfgeno. La titu la c ié n del primer anticuerpo se ha cbfinido - como aquella d iluc ién del mismo que se requiers en la mezcla de - reaccién para f r ja r e l 50% del antfgeno marcado en ausencia del - antfgeno f r io . Para hacer esta valoracién, se incubaron alicuotas» de 100 p i de una serie de diluciones del primer anticuerpo que i - ban desde l/lOO hasta 1/400.000 con 100 f x l del antfgeno marcado a la concentracién fija d a para e l ensayo (10-20 ng) y 100p x l del ste ro de conejo adsorbido a la d ilucién fija d a en e l apartado ante­ r io r . El antfgeno unido a l antisuero se séparé del lib re por pre­ c ip itac ién con e l segundo anticuerpo anti-IgG de conejo, ya valo- rado. En un papel serailogarftmico se représenté e l tanto» por ciento de inmunoglobulina marcada precipitada en funcién de - la d ilucién y se seleccioné como d ilucién éptima de trabajo aque­ l la que précip ité entre un 40-50% de las cpm totales y aparecié - en la zona de méxima pendiente de la curva. 3 .2.B .6.- Potencia del suero de carnero anti-IgG de co— Se rea lizé por adiccién de diluciones crecientes dd. - 67 - suero de conejo y del suero de carnero anti-IgG de conejo a una - mezcla de reaccién que contenfa antisuero especffico anti-cadenas pesadas y antfgeno marcado en las proporciones fijadas en el apar tado anterior. Con esta ptueba se déterminé la dilucién de suero dfe carnero capaz de precipitar el 50% de las cpm de partida y permi- tié utilizar una menor cantidad de suero anti-IgG de conejo en les ensayos. 3.2.B.7.- Realizacién del ensayo Se utilizé como estandar de valoracién un suero humano normal cuantificado para IgA, IgG e IgM por inmunodifusién radial en plaças comerciales de Kallestad. El rango de concentra­ cién establecido para cada una de estas proteinas fue: 4,5 a ---- 10.000 ng/ml para la IgA e IgM y de 12 a 27.000 ng/ml para la IgG Las diluciones del estandar y las muestras se reali zaron con tampén borato salino al 0,9% pH 8 con albumina al 0,2%. El ensayo se llevé a cabo por incubacién de 2 horas a temperatura ambiente de 100yul del problema é estandar con 100= pl del primer anticuerpo anti-cadenas pesadas correspondientes, a compahado del suero de conejo diluido en la proporcién elegida. 100 p l del antfgeno marcado (10-20 ng) se anadieron a la mezcla, incubândose otras 2 horas a temperatura ambiente. La =eeparacién de los complejos solubles se realizé por précipitasin con 100 pl de suero de . carnero anti-IgG de conejo en la propor- cién seieccionada, tras una ultima incubacién de 2 horas a tempe­ ratura ambiente y 18 horas a 4^0. Los precipitados se lavaron très veces con tampén - borato salino al 0.9% pH 8 con albumina sérica bobina al 0,2% y - contaron en un contador de radiaciones Y. La curva estandar se obtuvo por presentacién del — tanto por ciento de precipitacién frente a la concentracién de — IgA, IgG e IgM frfa présentes en el ensayo. La concentracién de - inmunoglobulinas en los problemas se obtuvo por interpolacién en= — 68 — la curva estandar del tanto por ciento de cpm precipitadas en e l* ensayo . Las condiciones del RIA permitieron medir concentracion en un rango de sensibilidad de 10 a 300 ng/ml. 3 .2 .B .8 .- Anélis ls de variables Para tener certeza de la validez de las deter- minaciones efectuadas mediante e l RIA, se analizaron los siguien­ tes parémetros: - Reproductibilidad interensayo a p a r t ir de varias - curvas estandar provenientes de ané lis is d is tin to s . - Reproductibilidad intraensayo para muestras ana li- zados e l mismo dfa por sextuplicado. - Efectos inespecfficos establecidos por tanto por - ciento de precip itacién obterido cuando se aHadfa e l segundo anti cuerpo a una mezcla de incubacién quA carecfa del primer anticuer po. - Anâlisls de afinidad del primer anticuérpio por e l antfgeno, mediante la realizacién de varias curvas estandar en p sencia de dlferentés concentraciones de antfgeno marcado. - Paralelismo entre diluciones, por ané lis is de las muestras a dos diluciones d is tin ta s . - Anélisis de sensibilidad fijando e l rango de con­ centracién minima detectable en 10 ng/ml. 3.2.C .- Cultive de célülas mononucleares "In v it ro " 3 .2 .0^.- Preparacién de lin fo c ito s para su cu ltivo ” in v it ro " 3 .2 .C ^ .l.- Obtencién de lin fo c ito s En condiciones estériles se extrajeron 30 ml» de sangre venosa, de los que 5 ml se coagularon para la obtencién de suero y los 25 ml restantes se heparinizaron con 20 u i/m l de - hep a rin a /lit io lib re de conservantes. La sangre se diluyé a l 1/2» en solucién salina f is io lé g ic a a pH 7,3 y se oaitrifugé en un gra- — 69 — diente de densidad en Lymphoprep a una densidad de 1,077 g/ml, du rante 20 minutes a 400 xg y a temperatura ambiente (16). Las células mononucleares se recogieron db la inter­ face y se lavaron dos veces con solucién de Hank, centrifugéndose 10 minutps a 400 xg la primera vez y a 200 xg, la segunda. Se re- suspendieron en medio de cultivo RPMI 1640 enriquecido y se proce dié a la identificocién morfolégica de los linfocitos en una cama ra Neubauer Précisa, mediante microscopfa éptica. El numéro total de células obtenido venxa dado: N9 cel, por campo x Vol. suspensién Capacidad de la cémara (1/10^) Seguidamente se centrifugé la suspensién durante 10 minuTos a 200 xg y las células se llevaron a una concentracién fi­ nal de 10x10^ cel/ml de medio de cultivo enriquecido, més un 10%= de suero de ternera fetal descomplementado. El sobrenadante del ultimo se guardé y se comprobé» la ausencia de inmunoglobulinas por RIA. 3.2.C^,2.- Viabllidad celiiar Se calculé por la prueba de exclusién del azuL tripân. Tal como se ha descrito la técnica de aislamiento de lin­ focitos a partir de sangre periférica, sierapre fue superior a un 98%. El test se realizé mezclando a partes iguales un vo lumen de una solucién de azul tripén previamente preparada con o- tro de la suspensién celular. Se incubé durante 2 minutes a tempe ratura ambiente y se contaron las células tenidas antes de que — transcurrieran 5 minutes desde el inicio de la tincién. La viabi- lidad se establecié restando al numéro de células totales conta— das, aquellas que adquirieron un color violeta. 3.2.0^.3.- Preparacién de hematfes de carnero — 70 — Se extrajeron 10 ml de sangre de carnero en condicto nés estériles y se centrifugaron durante 5 minutes a 1.400_xg con e l f in de separar los hematies del plasma. Las células se lavaron très veces con una solucién fis io lé g ic a a pH 7,2 y se llevaron a= una concentracién del 2 % en e l mismo medio. Se incubaron 25 minu tes a 372c con 15 ui/m l de Neuraminidasa, con e l f in de se n s ib ili zar por desializacién la pared de los hematies. Seguidamente se centrifugaron 5 minutos a I . 40O xg y se lavaron de nuevo très vee ces con solucién salina f is io lé g ic a resuspendiéndose a una concen tracién f in a l de un 2% en e l mismo medio (54). 3 .2 .0^ .4 .- Preparacién del suero de ternera fe ta l adsor- bido Para ev ita r las interaccimnes inespecificas en la - separacién de células entre la membrana del e r it ro c ito y e l suero de ternera fe ta l, se mezclaron e l suero y las células en un pro— porclén de 4 a 1. Se incubaron dos horas a 42c con agitacién esp£ rédica y se centrifugaron durante 5 minutes a 200 xg, rebogiéndo* e l suero de ternera fe ta l. 3 .2 .0^ .5 .- Pormacién de rosetas esponténeas En tubos estériles )de 10 ml se mezclafon (54) - 1,5 ml de hematies de carnero a l 2%, lavados y — tratados con Neuraminidasa. - 0,75 ml de suero de ternera fe ta l adsorbido. - 0,75 ml de células mononucleares a una concentra­ cién de 10x10^ ce l./m l. Se centrifugaron 6 minutos a 100 xg y se incubaron» durante 1 hora a temperatura ambiente. 3 .2 .0^.6 .- Aislamiento de lin fo c ito s T y poblacionss nor T Las células formadoras de rosetas esponténeas é ce- - T1 - lulas T se sepaxaron de las no formadoras de rosetas mediante un» gradiente de densidad. Sobre 3 ml de Lymphoprep se deposito cuidadosamente la suspensién de rosetas y se centrifugé a 25 minutos a 400 xg. - De la interfase se recogié una poblacién rica en células B. Del - fondo se obtuvieron los linfocitos T previo tratamiento durante - 15 minutos con una solucién de CINH^ con el fin de lisar los hema ties. Ambas poblaciones se lavaron por separado dos veces con so­ lucién de Hank, primero 10 minutos a 400 xg y después 10 minutes» a 200 xg. Se resuspendieron en medio de cultivo enriquecido y se» procedié al contaje celular. Se comprobé la viabilidad por la --- prueba de exclusién de azul Tripan. Segun esta técnica la viabili dad celular siempre fue mayor de un 95%. La riqueza de estas poblaciones se déterminé por r£ setaa espontaneas e inmunoglobulinas de superficie. 3.2.0^. 7.- Inmunoglobulinas de superficie Las inmunoglobulinas de superficie son marca dores de superficie especificos de linfocitos B (126). Se tomaron 0,1 ml de la suspensién de linfocitos a» una concentracién de 10x10^ cel/ml y se incubaron durante 30 minu tos a 4 90 con una dilucién l/lO elegida previamente de un anti-— suero anti-inmunoglobulinas humanas, marcado con fluoresceina. Se lavan dos veces con solucién de Hank, se depositaron sobre un por ta objetos y se leyeron en un raicroscépio de fluorescencia, El — porcentaje de células que portan inmunoglobulinas en su superfi— cie se expresé como: N9 de cel. Flurt N9 total de cel. X 100 3.2.0^.8.- Rendimiento de la técnica Alicuotas de ambas pre parac i one s de células» - 72 - T y no-T se sometieron a formacién de rosetas esponténeas y deter nacién de inmunoglobulinas de superfic ie . Sobre un porta teflido de azul de to lu id ina se depo­ s ité una gota de la suspensién de rosetas y se mezclé hasta que - adquirié un color azulado. La preparacién se llevé a una cémara - Neubauer y se conté el némero de rosetas con respecte a l de l in fo d-tos to ta les. Sélo se consideraron rosetas positivas, aquellos — lin fo c ito s rodeados de a l menos très hematies. Por la técnica descrita en estos apartados,el por— centaje de rosetas en e l caso de la suspensién de células T fue - mayor de un 95% y en e l caso de la suspensién de células enrlque- cida en células B, menor de un 2%. El némero de células inmuno— globulinas de superficie^ en esta éltima suspensién estaba comprm dido entre un 60-80 %, siendo e l porcentaje menor de un 2% en e l* caso de las células formadoras de rosetas. 3 .2 .C2- Sintesis de inmunoglobulinas y células implicadas 3 .2 .C2 . I . - S intesis de inmunoglobulinas La suspensién de células mononuclares obteni— das de sangre peiiférica se llevaron a una concentracién f in a l de* 2x10^ cel/m l de medio enriquecido, més un 10% de suero de ternera fe ta l. Alicuotas de la preparacién^ se incubaron en microplacas - de cu ltivo durante 7 dias en presencia y ausencia de 10 / i l /m l de* PWM (mitégeno Pockeweed), mitégeno inespecifico estimulador de la s in tesis de inmunoglobulinas, en las condiciones habituales de c ii t iv o . El contenido de los pocillos se recogié y ce n trifu ­ gé a 200 xg durante 10 ninutos. Los sobrenadantes se guardaron a* -2090 para deteccién de inmunoglobulinas por RIA, segén e l raétodo descrito (3.2.B). Las células se u tiliz a ro n para la deteccién de receptores para e l componente secretorio y caracterizacién de po­ blaciones de células T, mediante antlcuerpos monoclonales. - 73 - 3.2 .Cg . 2 Formas moleaalares de la IgA producida "in vl tro". Las formas moleculares de IgA producidas "in vitro" se caracterizaron segun el método de Kutteth (92) por fil­ tracién en gel a pH 7,3. Los sobrenadantes aisiados del cultivo celular tras 7 dfas de incubacién con PWM y cuantificados por RIA, se dializa- ron durante 18 horas frente a tampén fosfato salino 0,15 M pH 7,3 2 ml del dializado se cromatografiaron en una colum na de Ultrogel ACA-22, equilibrada en el misrao tampén. La columna se calibré previamente. Los marcadores utilizados fueron: azul dec trano ( peso molecular mayor de 2x10^ D), ferritina (450.000), a^ dolasa (150.000) y albumina bobina (68.000). Se recogieron fracciones de 2 ml de volumen y la pm sencia de IgA se détecté por RIA. 3 .2 .G2 .3 .- Caracterizacién biooufmica de la IgA produci­ da "in vitro". Para tratar de caracterizar las formas molecu lares obtenidas en el cultivo celular, se realizaron tres grupos» de experiencias: a) Filtracién en gel a pH 4,1.- Para dsterininar si en la elucién a pH 7,3 hubieran podido obtenerse falsos porcentajes de distribucién, bien por la presencia de agregados é uniones inespecfficas de otro ti- po, 2 ml de los sobrenadantes se dializaron 18 horas frente a tara pén acético/acetato 0,1 M pH 4,1. Se cromatograf iar on en una colum na de Ultrogel ACA-22 calibrada y equilibrada en el misrao tampon, recogiéndose fracciones de 2 ml. La presencia de IgA se détecté - por RIA. b) Reduccion y algtilacién Para determinar la presencia de verdaferos polfmsros de IgA, alicuotas de los sobrenadantes se dializaron — — 74 - frente a tampén tris -C lH 0,2M EDTA 20mM a pH 8,6. 2 ml del d ia l i ­ zado se incubaron durante 1 hora a 3?9G con 20 u l de una solucién 10 mM de D it io tre f to l y 15 minutos a 4^0 con 20 p i de lodoacetami da 21 mM, en ausencia de luz. La muestra se aplicé a una columna» de ACA-22 calibrada y eqiilibrada en e l mismo tampén, recogiéndose fracciones de 2 ml. La IgA présente se cuantificé por RIA, c) Afinidad por e l componente secre torio .- Se rea lizé por e l método de Brandtzaeg — (1974), Crago y Mestecky (1979), parcialmente modificado por Lo— pez Trascasa (1980). La IgM presents en los sobrenadantes del cu ltivo se éliminé por incubacién durante 1/2 hora a temperatura ambiente coi agitacién continua, con un inmunoadsorbente de shepharosa unida a una anti-IgM, para ev ita r la interaccién entre e l componente se— cre torlo y esta inmunoglobulina de caracter polimérico. Alicuotas del sobrenadante adsorbido y previamente» cuantificadas para IgA, se incubaron con ^^^I-CS a una relacién - molar de 1/7,5 durante hora y media a temperatura ambiente. Las - muestras se ultracentrifugaron en gradiente de densidad, eegén e l procedimiento descrito. Se raidié la radlactlvidad presents en ca­ da una de las fracciones obtenidas y la presencia de IgA se loca- lizé por RIA. Paraislamente se establecieron los contrôles por in cubacién del ^^^I-GS con IgA monomérica y polimérica en las misras condiciones. 3 .2 .G2 .4 . - Receptores celulares para e l componente secre to r lc Se analizaron mediante una técnica de inmuno- fluorescencia doble ind irecta (18, 30, 39, 101). a) Receptores cltoplasméticos para e l componente se cre torlo en lin fo c ito s en cu ltivo Las céblas mononucleares extraidas de un cultivo — - 75 - tras 7 dfas de incubacion en presenda de PWM, se lavaron con solu cion de Hank dos veces: 10 minutos a 350 xg la primera y a 150 xg la segunda. Se suspendieron en medio de cultivo enriquecido y se= procedio a su qjitaje. Se ensayé su viabllidad, comprobéndose que» era superior a un 70%. Pinalmente se llevaron a una concentracién de 2x10^ cel/lO^ul y se depositaron sobre un porta dejandose secar Se fijaron con una solucién de etanolal 95% y acético al 5%. Las plaças se lavaron con solucién tampén fosfato- salino 0.15 M pH 7,3, azida al 0,05%, renovando el medio a inter­ val os de 5 minutos durante un cuarto de nora. En cémara hémeda, æ incubaron durante una hora con 100yul de componente secretorio li bre (200 pg), lavandose tres veces de nuevo de forma analoga a la anterior. La cantidad de componente secretorio utilizado se deter miné por ensayos previos. La presencia de componente secretorio en el citoplæ ma celular se détecté con un antisuero comercial anti-componente» secretorio marcado con Rodamina. Para evitar uniones inespecffi-- cas, el antisuero se adsobié con un inmunoadsorbente de shepharo- sa-IgA, IgG y cadenas, ligeras de ambos tipos. Su pureza y especi- ficidad se comprobé por inmunoelectrof oreds e inmunodif usién doble frente a los antisueros correspondientes a estas proteinas y a e- llas mismas y un antisuero anti-componente secretorio humano. 100 |il del antisuero adsorbido se incubaron a una dilucién 1/10 pre— viamente elegida, durante 1/2 hora a temperatura ambiente y en at mésfera humeda. La deteccién de la clase de inmunoglobulina recept£ ra del componente secretorio se realizé meuiante un antisuero que contenfa los fragmentos F(ab')2 de los anticuerpos anti-IgA, IgG» e IgM respectivamente, marcados con fluoresceina. Cada plaça se - incubé con 100jal del antisuero correpondiente diluido al 1/10 du rante media hora y en las condiciones ya descritas. Una vez lavadas y secas, las plaças se prepararon - pararon para contar por dos observadores distintos. La especificidad de la tincién se déterminé adsor— biendo los antisueros marcados con el inmunégeno correspondiente y por bloqueo de la tincién de fluorescencia con el antisuero sin - — 76 — marcar. Los porcentajes de uni6n del compônente seoretorio= a las o5Xulas se establecieron per e l cociente entre: NS de cel (Rod-fluor)^ N9 de ce l. F luor.* b) Inmunoglobullnas de superfic ie y receptores para e l compcnente secretorio Los lin fo c lto s aislados del cu ltivo después de - lavadoS; contada y ensayada su v lab llldad , se suspendieron en so- lucidn de Hank con azida sddica a l 0,05% a una concentraci6n f i ­ nal de 2x10^ cel/100 ju l de solucidn. ^ 100 y il de la suspension ce lu lar se incubaron en un= tubo de ensayo durante una hora con 100 j x l de componente secreto­ r io lib re (200 ^g) a temperature ambience, Transcurrido este tiem po, se lavaron tree veces con soluciôn Hank con azida, por centr^ fugaciOn a 200 xg, 5 minutes. A continuaciOn se incubaron con 100 j x l de suero anticomponente secretorio marcado, media hora a tempe ratura ambiante,. Una vez eliminada la rodamina, se trataron de - nuevo con 100yul en las raismas condiciones, con antisueros que cm tenfan los fragmentes F(ab* )g de los anticuerpos anti-IgA, IgG e IgM marcadcs con fluoresceina a una diluciOn l/ lO en presencia de azida. Las cOlulas lavadas y euspendidas en soluciOn de - Hank se depositaron sobre un porta y se prepararon para contar. EL recuento se efectud por dos observadores independientea y antes - de que la plaça se secase para e v ita r falsos positives. La especificidad de la tinc ion y los tantes por clm te de células que portaban componente secretorio y una clase detæ minada de inmunoglobulina se determineron de forma anâloga a la - descrita en e l apartado an terio r. 3.2.C2.5.- Sintesis de iniAunoglobulinas en presencia de= - 77 - suero anti-cadena J humana Se utilize una modifioaci6n del mëtodo descrito por Richard Warrington (1981). (175) E? antisuero anti-cadena J humana obtenido en cone- jo fufe previamente adsorbido trente a un suero humano total preci pitado con glutaraldehido para eliminar las posibles reacciones - ̂ cruzadas que pudieran establecerse. Diluciones cracientes del an- I tisuero adsorbido; 1/15, 1/30, 1/60, 1/120, 1/240, 1/480, 1/960,= 1/1920 fueron incubadas durante 7 dfas en las condiciones habitua - les de culrivo, con células mononucleai’es frescas obtenidas de — sangre periférica a una concsnentraci6n de 2x10^ cel/ml y en presm cia de lO^l/ml de PWM. Los sobrenadantes se cuantificaron para ïgA, IgG e IgM, mediante un radioinmunoensayo. 3 .2 .C2 .6 .- Deteccion de la cadena J en el citoplasma de= linfocitos cultivados "in vitro" Se utiliz<5 una modificacion del método de Mes^ tecky (1980) (110), Las células obtenidas de un cultivo tras 7 dfas de= incubacién con PWM se lavaron y suspendieron en solucion de Hank= a una concentracion de 10x10^ cel/ml previo ensayo de su viabili- dad. Alicuotas de 100 ^1 se fijaron sobre los portas con una solu ci6n de etanol al 95% y acérico al 5%, rehidraténdose a continua- ci6n por lavados sucesivos con tampon fosfato-salino 0,15 W pH — 7 ,5 . uas plaças se trataron con 100 yul de suero anticadena J huma na adsorbido trente a un suero humano total precipitado con gluta raldehido,durante 1 hora a temperatura ambiante y en cémara héme- da, Eliminado el antisuero,se incubaron con 100 jul de un suero an ti-IgG de cabra obten:do en conejo marcado con rodamina y diluido al 1/10. Esta suero fue previamenta adsorbido trente a suero huma no total precipitado con glutaraldehido para evitar reacciones — cruzadas entre la IgG humana y el antisuero. Tras media hora de - — 78 — Incubacién y varies lavados, las células se trataron finalmente - con lOOy-il de sueros d ilu idos a l l/ lO que contenfan los fragmen— tos P(ab*)2 de los anticuerpos anti-IgA , IgG e IgM, marcados con» fluoresceina. El contaje se rea lizd antes de que se secasen las» plaças y por dos observadores independientes. La especificidad de la tinc ién y los porcentajes - de células cadena-J* se establecieron ta l y como se ha descrito - en los apartados anteriores. 3.2.G^.- Eactores implicados en la regulacién de la sfntesis de= inmunoglobulinas " in v itro " 3.2.0^^.- Factores Gelulares 3.2.C^g^.l.- Generaclôn de células sucre s or as mediante la activacién de la concanavalina A .- La generacién de células supresoras en cu ltivo se ai say6 segiSn e l método de M ille r (113). Las células mononucleares - aisladas dé sangre p e rifé rica y llevadas a una concentracién de - 2x10^ cel/m l de raedio de cu ltivo enriquecido més un 10% de suero» de ternera fe ta l, se cu ltivaron en presencia de 10y il/m l de PWM y concentraciones variables de Con A, mitégeno estimulador de l in f£ citos T: 1,25 ^g/m l, 2,5 yig/ml, 5 yug/ml, 10 yig/ml, 25 yig/ml, 50 - ^g/m l, 100yig/ml en las condiciones tebituales de cu ltivo . Despées de 7 dfas de incubacién se recogieron los ao brenadantes, detecténdose la produccién de inmunoglobulinas por - RIA. Los niveles de generacién de células T se midieron por cuant^ ficacién de poblaciones reguladoras, mediante anticuerpos monoclo nales especfficos. 3.2.Cjg^.2.- Cultivo mixto de cAllas mononucleares " in v i tro " Las células mononucleares de pacientes que — - 79 - presentaron un comportamiento anormal en el ensayo anterior y de=. individuos control (48), a una concentracién de 2x10^ cel/ ml se= incubaron a 37^C y en atmésfera al 5% de COg, con 50 ̂ g/ml, 10 ̂ g /ml y 2,5 yug/ml de Con A. Al cabo de 48 horas se lavaron dos ve— ces con una solucién 0,3 M de 1-0 metilc^ -D glucopiranosido para» eliminar los restes de lectina de la merabrana celular y se suspen dieron en medio de cultivo. Una vez ensayada su viabilidad y con- tadas se llevaron a una concentracién de 2x10^ cel/ml. Células frescas de contrôles y pacientes alogénicos se preparon a una concentracién de 2x10^ cel/ml. Las células pre- tratadas con Con A se cultivaron con las células frescas alogéni— cas a una relacién molar de ]/l en presencia de 10 yil/ml de PWM y= en condiciones habituales. Los contrôles de la experienda se establecieron co- cultivando paralelamente células pre-cultivadas 48 horas sin Con A con células frescas en presencia de PWM. 3.2.C^g^.3.“ Co-cultivo de poblaciones de células T y no-T Las células frescas obtenidas de saigre peri­ férica por centrifugacién en gradiente de densidad, se trataron - con hematfes de carnero al 2% sensibilizados con neuraminidasa, - segun se ha descrito ya y se incubaron durante hora y media a — temperatura ambiante.. Las células formadoras de rosetas se sepa- raron de las no formadoras por centrifugacién en gradiente de den sidad. La poblacién de células no-T recogida de la interfa se y lavadas se llevaron a una concentracién 2x10^ cel/ml en me— dio de cultivo enriquecido més un 10% de suero de ternera fetal.= Igualmente se hizo con la poblacién de células T, tras la lisis= de los hematiee con una solucién de CINH^ al 0,98%. La pureza de= ambas preparaciones se déterminé por inmunoglobulinas de superfi­ cie y formacién de rosetas. 2x10^ c é M a s T de pacientes y contrôles se incuba— ron con una proporcién igual de células enriquecidas en B de con- — 80 — tro les y pacientes alogénicos respectivamente , en presencia de - PWM y en las condiciones habituales de c u lt iv o .(115) Al cabo de 7 dfas se recogieron los sobrenadantes,» cuantificéndose por radioinmunoensayo, la cantidad de IgA, IgG e» IgM producida. 3 .2 .G j^.4 .- Cuantificacién de células T reguladoras de — la sfntesis de inmunoglobulinas en v itro , mediante la u tiliza c lé n de anticuerpos monoclonales especificos La cuantif icacién se rea lizé segiîn e l método de Reinherz (1980). Las células frescas separadas de sangs pe rifé rica y» las cultivadas en presencia de PWM y de PWM més Con A, se a is la — ron segün e l procedimiento habituai y se llevaron a una concentra cién de 10x10^ cel/m l de medio de cu ltivo enriquecido con azida âL 0,05%. Alicuotas de 100 ^1 se incubaron durante una hora a 42c con 5 y jl de los antisueros que contenfan anticuerpos monoclo— nales obtenidos en ratén, anti-receptores especificos de l in fo c i­ tos T totales (OKT-3^), de lin fo c ito s T cooperadores (OKT-4^) y - lin fo c ito s T citotéxicos/supresores (OKT-8*) humanos, respectiva­ mente . Transcurrido este tiempo, se ahadié un ml de solu— cién de Hanl f r fa con azida a l 0,05% y se centrifugaron 5 minutes a 200 xg. La operacién se re p it ié ios veces, Las células lavadas se incubaron de nuevo con 100 - ^1 de un antisuero fluoresceinado, que contenfa los fragmentes — F(ab*)g de un anticuerpo anti-IgG de ratén producido en cabra, du rante media hora a 42c, Una vez eliminada la fluoresceida y suspendidas en» 100 ^1 de solucién Hank con azida, se prepararon para contar por» dos obsevadores independientes. La especificidad de la tinc ién se déterminé incuban do e l antisuero fluoresceinado con células no tratadas con los anU — 81 — cuerpos monoclonales. El gado de inespecifIcidad fue manor de un= 3.2.0^^.- Factores séricoa 3 . 2 . * 1.- Efecto del suero de los pacientes con nefropa tfa de IgA sobre la sfntesis normal de inmunoglobulinas "in vitrd* Las células mononucleares de individuos con— trol se llevaron a una concentracién de 2x10^ cel/ml de medio de= cultivo enriquecido, més un 10% de suero de ternera fetal. Paralelamente se extraderon 5 ml de sangre venosa cfe un grupo de 5 pacientes que presentaban daramente alteraciones de regulacion y de los contrôles utiizados en la experiencia. El sue_ ro se séparé por centrifugacién del coagulo y se diluyé al l/lO - en solucién de Hank. 100 yil del suero diluido de pacientes y contrôles se incubaron con 2xl0^células control durante 2 horas a temperatura» ambiente. Las células una vez lavadas , contadas y ensayada su — viabilidad, se resuspendieron de nuevo a una conœntracién de 2xl(f cel/ml de cultivo y se cultivaron en presencia de 10 yul de PWM sê gun el procedimiaito habituai Al cabo de 7 dfas se recogieron los sobrenadantes y se détecté la produccién de inmunoglobulinas por RIA. las células se cuantificaron mediante anticuerpos anti-receptores especfficos de linfocitos T reguladores. 3.2.0^^.2.- Efecto del suero de los pacientes con nefro- patfa de IgA sobre la generacién de células supresoras en cultivo Parte de las células control tratadas oon el suero dfe pacientes y contrôles alogénicos, tal como se ha descrito en el a partado anterior se Incubaron durante 7 dfas en presencia de PWM» y 50 yjg/ml, 10 ^g/ml y 2.5 Jig/ml de Con A respectivamente a 372C» y atmésfera de 1 5% de COg. — 82 — La produccién de Inmunoglobulinas se détecté por - RIA. La generacién de células T reguladoras en funcién de la dosjs de Con A se déterminé mediante los anticuerpos monoclonales especf ficos de lin fo c ito s T reguladores. 3 .2 .0^^.3 .“ Efecto de los agregados de IgA monomérica. - IgA pollmérica e IgG. asf como de estas orotelnas.sobre la sfnte-» sis y la actividad de células supresoras en cu ltivo - Agregacién de prote inas.- Las fraccLones monoméricas y p o li méricas de la IgA obtenidas segûn e l procedimiento descrito en e l apartado 3 .2 .A .3., se agregaron por calentamiento a 60SC durante» una hora y media. El grado de agragacién se déterminé por f i l t r a — cién en U ltrogel ACA-22 y se seleccionaron para estas experiencias aquellas fraoiones correspondientes a un tamaKo molecular compren dido entre (l-2)xlO^ D. La proteina agregada se concentré y cuantl f ic é por inmunodifusién rad ia l En e l caso de la IgG humana, la agregacién solo re - qu irfo media hora de calentamiento a 6Q2C. El grado de agregacién fue mayor que en e l caso de la IgA y se seleccionaron para tizbaja: los agregados comprendidos entre (l-2 )x lO ^ D de peso molecular. - Realizacién del ensayo.- Se aislaron câulas mononucleares de individuos control y se llevaron a una concentracién de 2x10^» cel/m l de medio de cu ltivo enriquecido, més un 10% de suero de — ternera fe ta l. Alicuotas de esta preparacion se incubaron con una concentracién f in a l de 250 yig/ml de cada uno de los agregados pro Mcos y sus corre^ondientes proteinas. Al cabo de 2 horas, las cé lulas se lavaron con solucién de Hank hasta elim inar la proteina» del medio y se suspendieron a una concentracién de 2x10^ cel/m l db cu ltivo . A continuacién se cu ltivaron drante 7 dfas a 3720 y en - atraésfaa a l 5% de COg, en presencia de 10 ^1/m l de PWM y concen— - 83 - tracione8 variables de Con A: 50 jug/ral, 10 jug/ral y 2,5 jxg/ml (185) La deteocién de inmunoglobulinas en los sobrenadan— tes se realizé por radioinmunoanélisis. gÿ — 84 — 4.- RESULTALOS 4.1.- Sfntesis de inmunoglobulinas "in vitro” 4.].A.- Estudio de la sfntesis de inmunoglobulinas» por las células mononucleares obtenidas de' sangre periférica. Con objeto de determinar si los elevados nj. veles de IgA sérica presentados por los pacientes con nefropatfa» de IgA podrfa deberse a un aumento en la sfntesis de esta inmuno­ globulina, se estudio la produccién de IgA, IgG e IgM "in vitro", mediante cultivo de linfocitos obtenidos de sangre periférica. En ausencia del estfmulo policlonal del mitégeno Po keweed no habfa diferencias significativas en la produccién de in munoglobulinas entre el grupo de pacientes y contrôles (Pig. 9).= En presencia del PWM, la produccién de IgA fue siginficativamente» mayor (p <0.0025) en pacientes (560 - 97 ng/ml) en relacién âl — mismo grupo control ( 231 - 57 ng/ml). No bubo diferencias entre» las cantidades de IgG e IgM sintetizadas por ambos grupoa. 4.I.E.- Estudio de las caracterfsticas bioqufmicas - de la IgA producida en cultivo. En un grupo de pacientes y contrôles se estu diaron los porcentajes de distribucién de IgA de alto peso molecu lar producida "in vitro", tras la estimulacién con PWM y sus ca:— racterfsticas bioqufmicas. 4.I.B.I.- Formas moleculares producidas in vitro Los sobrenadantes obtenidos despues de 7 dfas de — cultivo en presencia de PWM y dializados frente a tampén fosfato- salino 0.15 M pH 7,3, se cromatografiaron en una columna de ultr_o gel ACA-22, equilibrada y calibrada en el mismo tampén. Se obtuvo en ambos casos un perfil de elucién bifésico ( Fig. lOA). La pro— - 85 0(0 c 3 î O '0c 31 O "O « wo sO) o CD < 0) s Q. C (Ô s 0> E O'a. R S g Co U f? T" (O T - m AV "T lO "T œ m CM |ui/6u^0l.x - F ig .- 9- — 86 — porcion de IgA eluida en una zona correspondiente a una IgA de al to peso molecular (600.000-250.000 D) era elevada, siendo el por— centaje obtenido en esta regidn significativamente mâs alto en el grupo de pacientes (Fig. IIA), presentando los contrôles la misna situacion en la region comprendida entre (250.000-100.000) D, pro pia de la IgA monomerica. En todos los casos, se obtuvo una pequena cantidad= de IgA de alto peso molecular (10%) en el volumen de exclusion, que representaria un grupo de agregado^inespecificos de IgA, for mados en la manipulaci6n de las mueai^s (8*) (Fig. lOA). 4.I.B.2.- Caracterizacion bioquimica de la IgA produ cida "in vitro” . Para determinar si la IgA de alto peso mole cular sintetizada en presencia de PWM era realmente IgA polimériœ. 6 se trataba de agregados de pequeno tamano formados en el prooe_ CO de raanipulacion de las muestras, se realizaron tres grupos de= experiencias que proporcionaron los siguientes resultados: a) No se produjeron cambios en los porcentajes de - distribucion de IgA comprendida en la zona de peso moleoulares en tre (600.000-250.000) D , tras el tratamiento y cromatograffa de - los sobrenadantes a pH 4,1. En la figura lOB y IIB se reoogen es­ tes resultados que estan de aouerdo con la estruotura covalente - de la IgA polimérica. b) La reduccion y alquilaoion de los sobrenadantes= previa a la cromatograffa proporoiono el perfil recogido en la fi_ gura IOC, produciendose un desplazamlento de la IgA hacia forias - moleculares de mener tamano. El porcentaje de formas de alto peso molecular disminuyo significativamente en relaci6n al obtenido - por cromatograf fa a pH 7,3 (Fig. IIC) y aumento signif icativamenle en el caso de las formas monoméricas y conponentes de bajo peso mo Icular, con relacién a la misma situacion En la fig. 10 se ban represatado los perfiles de — 10^ O)c k % » Ferfit Ina Aldolasa BSA e GN IgA O Control pHs7.3 I \ / f ' I I \ I X t X % ' 'w A , ! \y-çy-o-^ r $ B pHa4.1 T 5 _ / \ ^ ___________ V Y R Red. y Alq. . / a T3 4 T 5 6 mIxK - 88 - elucion de un paciente con nefropatfa de IgA. (625 ng/ml IgA "in - vitro") y un control (210 ng/ml "in vitro"), como caso mâs repre- sentativo de la distribucién de las formas moleculares de IgA en= cultivo y su estabilidad frente a los diferentes tratamientos quf micos. c) La naturaleza pollmérica de la IgA producida "in= vitro" se déterminé finalmente mediante un ensayo de afinidad por el componente secretorio aislado de calostro humano^ segun el mé­ todo descrito por Brandtzaeg (19), parcialmente modificado (195). La IgM presents en los sobrenadantes y que podrfa in terferir con el ensayo dada su capacidad de unién al componente — secretorio, se éliminé por incubacién con un inmunoadsorbente de= shepharosa unida a un suero anti-lgM humana obtenido en conejo, m exceso de anticuerpo, tal como se ha descrito en el apartado 5.2. 1.10., durante dos horas a temperatura ambiente. Las fracciones eluidas a pH 7,5 y correspondientes= a cada uno de los tres picos obtenidos por filtracién en gel, se= 125incubaron con el 1-CS. Los complejos formados se separaron del ^^^1-CS libre por ultracentrifugacién en gradiente de densidad, - entre un 5-40% de sacarosa, midiéndose las cpm en cada una de las fracciones recogidas (195). Solamente la IgA comprendida en la regién de alto pe_ so molecular (22 pico de la Fig. lOA) fue capaz de unir un 40% dëL 12'''"1-CS^ porcentaje similar al hallado para la IgA polimérica puri ficada del suero de estos pacientes (126) y la IgA piimérica obte_ nida a partir de mieloinas de IgA (19). Estos resultados sugieren que la IgA pesada encon— trada en los sobrenadantes rel cultivo tras 7 dfas en presencia dë PWM es realmente polimérica, mantenienéo los pacientes con nefr_o patfa de IgA una proporcién significativamente mayor de esta form molecular que los sujetos control. 4.1.0.- Anélisis de los receotores celulares para el corn ponente secretorio sobre los linfocitos estimulados con PWM c8 ■O J23§ S to g ü 2 z oa 10E c w $ « oT- K 6 6. 5. 4 3 2 . 1 6. 5, 4. 3, 2 , 1. 5* 5, ■S 4. O 3 J X 2 _ ( 1 — 89 — p<0.05 N.S. T 0 1 (6 -2 5 ) I 0 G N -ig A O Contrôles pHr7.3 (25-15 ) xlo'^D P '0 .0 5 A# (6-25) N.S. B QN'IgA pH:7.3 QN-lqA pH:4.1 P O 005 GN-lgA pH:7.3 GN-lqA Red Alq (25-1^ Fig.- 11 <15 4 xlO D - 90 - El aumento de la sfntesis de IgA en cultivo de pa— oientes con nefropatfa de IgA, asf como el eumento en la proper— cl5n de la fraccion polimérica en respuesta a la estimulacién po­ liclonal, llevé a suponer un trastorno cuantitativo de la prolife racién de linfocitos B responsables de la sfntesis de esta inmuno globulina. Para estudiar este punto se analizo la interaccién= del componente . secretorio con las inmunoglobulinas de superficie e intracitoplasmaticas de los linfocitos extraidos de un cultivo= tras 7 dfas de incubacién con PWM. 4.I.C.I.- Inmunoglobulinas de superficie y receptcrœ para el componente secretorio Los ensayo8 de irmiunofluorescencia doble to directa revelaron un porcentaje mayor de células que transportabai IgA en su superficie en los pacientes en relacién a los contrôles (5.60 i 1.53 versus 5,28 - 1.53 respectivamente), como puede apre^ ciarse en la figura 12. Los niveles de células portadoras de IgG= e IgM no presentaban esa diferencia entre ambos grupcs, siendo el aumento especffico para la poblacién responsable é implicada en - la sfntesis de IgA. Estos resultados estan de acuerdo con el aumento en los niveles de esta inmunoglooulina producidos tras estimalacién= inespecffica en cultivo. La unién del componentes secretorio é CE a las inmu­ noglobulinas de superficie fue menor de un 3%, correspondiendo la mayor parte a linfocitos portadores de IgM,en el casc de los con­ trôles (0.84 - 0.25). En los pacientes, la unién del GS fue mayor aunque la diferencia no era significativa (5.73 - 2.25) con res— pecto a los contrôles, correspondiendo la mayor parte a células — portadoras de IgA (1,18 - 0,53 frente a 0,44- 0.27 en contrôles). En consecuencia la proporcién de células portadoras de IgA polimé rica frente a las portadoras de IgA total, también era significa­ tivamente mayor (20.74 - 5.69 versus 13.46 - 2.44) 91 - lU g il 3 « §•8 « «Iil i I q 2 ooz 3 W 0H 1 V .oo V» <î<3<3 U) 4 (O I- ü !■ % CNJrH I («-HIPh €0 W moo oogoocŜ t̂ pocd?) o K\ r4 IT»rH iH rH fH + 1 + 1 . COtrv enm O % Kk K>rH rH r-vo O +1 5 oK\ n0) 1H I $ O + 1 P n uoHy CO M + 1 1 M ««mox) OT-ïbO C0Oo ë® CiM 0om« •H U f:o orH > A - 'j4 - CL C ou i l) O T3 (D 3 E tnOf (/) O O Ou_ z 0) "D 0) ■4-* c a E(0 o 4-»(Ü E(Ara Q. o 4-1 Ü CD (/) Ü c «c 3 V 3 cr p <0.0025 N.S. N.S. 50 ^ Î1 IgA IgG I g M 13 - 95 - na desarrollo un importante papel e.i la pollmerizaci^n de la mol£ cula, dependlendo de su disponibilidad por paite de la c^lu la im­ plicada. La presencia de cadena J se determind u tilizandp un suero enti-cadena J humana preparado en cabra, que fue previamen te adsorbido con un suero hvrnmo to ta l precipitado con glutaralde­ hido segi5n se explica en e l apartado 1.2.A.10. El antisuero ads or bido no presèntaba aacciones cruzadas con la IgA polimérica y mo- nomérica, la IgM, n i con e l suero humano to ta l, cohservando su es peclfic idad frente a la cadena J. Por inmunofluorescencia doble ind irecta se ,detect6= en un 6,30 % de las células mononucleares contro l no estimuladas - con PWM, la presencia de cadena J| mientrad que en pacientes con nefropatfa de IgA alcanzaba un 15% + 4.92 (F ig. 14). La cantidad= de células que contenfan inmunoglobulinas en su citoplasma repre- sentaba un 4 % del to ta l contado, siendo la d is tribuc ién de IgA,* IgG e IgM .sim ilar en ambos grupos, También fue s im ila r e l conteni do de cachia J en cada una de estas poblaciones, oscilando entre m 75-80 % e l porcentaje de variacién. (Fig. 15 y 16 y 17). La presencia de cadena J intracitoplasmética se incœ mento sensiblemente tras la estimulacién de los lin fo c ito s con — PWM (F ig. 14). Los porcentajes alcanzaron un 30.9% ± 5.33 en los= pacientes y un 23.28% + 6.46 en los contrôles, manteniendo las d i ferencias s ign ifica tivas (p <0.025) (Fig. 16). Las proporciones - de lin fo c ito s sintetizadores de IgA, IgG e IgM, también se incre- mentaron sensiblemente no presentando diferencias s ig n ifica tiva s con e l grupo control (Tabla 1 y 2). Ahora bien, la proporcién de= células que contenfan a su vez cadena J, dentro de cada grupo po- blaoional disminuyé sensiblemente en e l caso de IgG e IgM, mante- niendose constante para la IgA, cosa que no ocurrfa en e l giupo - contro l (Fig, 16 y 17). Estos resultados confirman los puestos de manifiesto mediante la f i ja c ié n del componente secretorio en e l citoplasma -, ^ ce lu la r. Los porcentajes de células iraplicadas en la sfntesis de* IgA polimérica obtenidas por las dos técnicas fueron semejantes - - '36 — en o (dl-H A xiA o to CH 1—1 cdA A -E>A CQro A 0)<1* ACü A AO A oA A A- C--4 ■4- , ptS3 M ®1—t O O LOA A OM A +1 +: oA A -4 o AA a bû A 4 - ’A <1 A cr> O AA A Vû + 1r/> -i fciC C4A A A A A 03 M A O O t3 < •H M A bOA A O «; O O o W A A K\ 03A o A< AA A CQ S m A A aj 3: 0)M s; C A A AO tQ o A 0) a I—1O o p o tdA o A O > oT3CtJ UT3 n - 99 - Z10%X O 6 % %k. O"O(0N s4-1 *35 0)<-j _j UJ U 0•D UJ gzUJ u cr2 8_ 6_ 4 _ — Ô ------------------- 9? § : 8 1----^ ----1 O O # O H -% -4 i o p< 0.005 O . ^ O o 1 1 0 • o i - ee N.S. s Fresco PW M Fresco PW M IgA PACtENTES CONTROLES Fie.- 16 - l')0 - < z gu û ocoG Ü) d) c J! + 50 SS. d) T3 z ‘Q u < 3 g 1— UJ >1 z o * P<0.05 P<0.00 # GN-fqA O Contrôles i'i.T.- 21 - 107 - de SUPRESION y ESTIMULACION de la sintesis IgIVI O'a. oT- < C o o o 4 444 4 4 6 ^ 4 44^ Q. f^ |4 4 4 4 4 4 I ‘ CM §O K W K I l ■ ■ 10 8 ? CL ” T g c o ig P a g o lO 961 S f s a t u i s e\ ap N O I0V in W ilS 3 ^ NOIS3ddnS l'ig.- 22 • - 108 - üintesis de IgA en el 60% de los casos estudiados. Estos dates = no se correlacionaban con los ni-^les produîidos en presencia de PWM. Los porcentajes de supresl6n se mantuvieron a incluse dismi- nuyeron a altas concentraciones de Con A, estando muy por encima= de los valores alcanzados en el caso de cëlulas control, indicando una Clara incapacidad de las células T supresoras de los pacien— tes con nefropatfa de IgA para regular la sintesis normal de IgA. La fuerte inhibicidn de la sintesis de IgA a bajas= concentraciones iba acompanada en aproxidaraente el 50% de los ca­ sos de una falta. de supresidn de la sintesis de IgG y un compor- tamiento normal en la regulacidn de la sinteis de -IgM. (Pig. 22) Es ourioso destacar que sdlo aparece afectada la re_ gulacidn de la sintesis de IgM a 10 jxg/ml de Con A, concentracidn a la cual la IgA e IgG, presentan una regulacion normal. 4.2.A.2.- Cultivo mixto de linfocitos ........................... Para determinar si el trastorno en la re­ gulacion observada en pacientes con nefropatia de IgA era debida= a un trastorno en la generacidn y expresidn de células "supreso— ras” 6 bien a una incapacidad de la célula blanco para ser supri­ mida, se ensayo la capacidad de supresion de de estas células indu cidas por un tratamiento previo a 2,5 jig/vnl, 10 jig/ml, 50 yg/ml - de Con A durante 48 horas sobre un cultivo de linfocitos normales Los resultados obtenidos sobre la sintesis mediante esta técnica fueron anâlogos a los proporcionados por el método - de Miller (140) (ver apartado anterior). Los niveles de produccicn fueron algo mas elevados debidos a la estiraulacion alogénica, pe- ro en ningun cas o significatives con relacion a los obtenidos en= experiencias anteriores. Los porcentajes de supresién fueron m^s= altos en culoivos mixtes control, siendo a su vez mas acusadas læ diferencias en el comportamiento reguiador de pacientes y contrô­ les, sobre el mismo grupo control alogénico. (Pig. 23^) A una concentracicn de 1C jig/ml (Pig. 23B), el corn— portamiento de las células de pacientes y contrôles fue similar,= produciéndo una reduccion de un 48.28% + 18.38 les contrôles y= cou mo*0 w 3 E 4-»tn o> - 109 - n.s. \\ \\ \ Células pre incübadas: P '0.05 □ sin Con A @ 2.5pq/ml de ConA s Tm Control +Control GN IgA+Control 1 p .0.05 p. 0 .05 Células pre incubadas i M □ sin ConA ® 10 pq /ml de ConA B Control+Controi GN IgA+Control 3 _ 1 - p<0.05 n.s. m pili'I Células pre incubadas : D sin ConA E3 50pq/mt de Con A Control+Cont roi GNIqA+Control Pig.- 23 - 110 - t p) «aj ru A COo 'd"A a A 0 H w H 1—i 0 A >-i s CÎ3 fO, LPi fat A faO ir \ en Z) + 1 +1 00 A M ITv CTi t>- 0A < î A CTiA CM A 0 c! 1—t 1—1M A 0 1—1CO A 0H AA 0 AS 0 AMm CO co bO A D 0 3 ^ + 1 +1ot A 0 co A25 CO A 0 Tf K\A co A 1-( A M) -4 A 0 0A A tOv LPvm A 0 A A *=■5 A A - A0 0 A 0 A 0 A AA A en en > A a 0 A n0) s (U-tu I -p m w +1 IX co 0 0 t u t u A cd faO M0 t u 0 cd 0 ) 3 A o co • H 0 ) A p0 0 A ttS î > A - Ill - §EH 1 1 A A A A a EH Ü o a o A A H4 « ro O (d < r - S M A A (T> hf o A «4- M A >H B ' o A cd A OO fat A A ■e- (0 a. + 1 +1 A tU O 4) A m CD cn a e M CO A A CM td A O A CM A E4 m O z rr\ IP a A A 3: 0) M o a A TU A % A A <3 A A< A o A 3 A A A tU A A 3 A S O cd A A A A m p ■aj A fat A K\ CO % A A 3 cn <0 O A O CTi A M A A o fat C P U A A A A + 1 + 1 O o A O a fH A o A O A oa A M EH o A A a CO < M o A CO CO > A o o A cd 3 AO A - 112 - de un 36.34% + 13,34, los pacientes. En el caso de la IgG e IgM - tampoco aparecieron diferencias apreciables ( Tabla 3 y 4 ) . Por ultime, las células mcnonucleares de los pacien tes pretratadas a una'concentracion de 2,5 pg/ml de Con A reduje- ron en un 37.81% + 15.57 la sintesis de IgA, efecto que no se maii feste en las células control tratadas en iguales condicioîBS. Un - cemportamiento inverse se revelo para la sintesis de IgG (Tabla 3), donde los pacientes s6lo redujeren en un 5.60% + 22.82 la produc­ cicn, mientras que alacanzaba un 23-24% + 4.94 ( p 0.025) en el= grupo control. Estos resultados confirman el ccmportamiento cinét^ co obspvado para la actividad de las células supresoras. La rapi- da diferenciacién y supresién a bajas concentraciones y el mante^ nimiento de estos niveles a altas dosis , hablan en favor de una= ciertavalteracion dosis-dependiente de la generacidn de supresoras especificos de IgA, mas que de una incapacidad de la poblacidn — responsable, pare el ejercicio de la funcidn supresora propia. El efecto neto de esta alteracidn favorecaria el a.uinento de la sinte_ sis de IgA observada ^n cultivo, tras su estimulacidn policlonal= con PWM. i .3.A .5.- Anélisls de poblacionas de células T regu ladoras, mediante el use de anticuerpos monoclonales A la vista de los resultados obtenidos en la generacidn y expresidn de células supresoras,se planted el ané lisis de los niveles de células implicadas en la regulacidn pre— sentes en los pacientes previo a su mantenimiento en cultivo y — tras su estimulacidn con PWM, donde se expresa el a^umaxc especif^ co en la sintesis de IgA. En la iig.- 24 se han recogido los porcentajes de linfocitos con caracteristicas de células P-OKT 3^, de células T— supresoras üKT-3''’ , linfocitos T ccoperadores OKT-4^ y el indice= 0KI-4^/0KT-8^ eu una poblacidn de células frescas extraidas de s an gre periférica. Los porcentajes de células OKT-3'^, OKT-4'*’, OKT-8'*’ - - 11? - encontradas en la poblacidn control fueron similares a los indica dos como 5ptimos, segun la especificidad de cada uno de los anti­ cuerpos, aunque ligerajiiente menores que los encontrados por otrœ gupos. No hubo diferencias en los porcentajes de células OKT-?^ - entre pacieniBS y contrôles. Ahora bien, el balance entre cdlulas= 0KT-4^/0KT-8^ estaba elevado en la nefropatfa de IgA con un porcm taje significativamente aumentado de células OKT-4^ de caracterf^ ticas cooperadoras (20 de 27 pacientes) y un porcentaje normal de células supresoras OKT-8^. Siete de estos pacientes presentaban - simultaneamente un increma±o en los porcentajes de células OKT-4^ OKT-8^, con un radio normal 0KT-4^/0KT-8^. Un grupo de cuatro pa­ cientes y très contrôles examinados en dos ocasiones diferentes - mostraron niveles seme jantes a los ya detectados y una persisten- cia en los porcentajes elevados de células cooperadoras OKT-4^. La suma entre los porcentajes de células OKT-4^ y - OKT-8'*' fie signif icativamente mayor que el numéro de células OKT- 5^ detectadas. Esto nos llevé a pensar en la expresidn simultané a de ambos marcadores sobre la superficie de algunas pobladones de= células T. La adicidn simulténea de ambos anticuerpos OKT-8 yOKT- 4 a una misma poblacidn celular no reveld diferencias apreciables entre conbroles y pacientes. AsX como, el porcentaje de células - con ambos marcadores (diferencia entre %0K(T4^+T8'’’) y % 0KT(4-8)'*) tampoco fue significativamente mayor. Estos resultados no pueden descartax la posibilidad de que el menor porcentaje de células — OKT-5^ sea consecuencia de un fallo en la especif icidad de este - anticuerpD monoclonal. (Tabla Nfi5). Ahora bien, aunque las diferm cias no sean significativas, no puede pasarse por alto el hecho - de que 4 ie los 8 pacientes,en los que se caracterizd el numéro - de c ’lulas que expresan ambos marcadores, tengan unos porcentajes de este tipo poblacional entre un 7-10%, cuando el limite supemor en los contrôles es de un 6%. Los porcentajes de células T totales, T cooperadoras y T supresoras tras 7 dfas de cultivo en ausencia de PWM no se mo dificaror en relacién a los obtenidos en fresco. Persistfa el in- cremento sn el porcentaje de células qpperadoras OKT-4^ y el au— - 114 - PORCENTAJE de CELULAS o y B è S S ë o lO ooo w o § § o çn Oo O oo o 00.o o o t̂ bo oP o en enoen en‘o OKT-4'VOKT-8* - 115 - ooI Î I M§ wI E-(0E-t 1i a0J) ë g CO 1 EH o CM kd c n d - O 1 CD O + + l + 1 CO OO =H O CO a + tCN iTv + ■d- ITv -p w CD i-H CD O CVS •H Xl + VO r - CD cr> ITV G 00 1 o CM cd '?*- rH + 1 + 1 EH CO CD Id o OO X) O CO d " a U rH o - Cd QÎ CO V CD CD rH P O a p . (h CD P 3 O o CO Ü o ■S %3o o - 116 - Iapiwo MA gME4AAO CO I I g CO<4AA I WA CO <4Aa g cd g CO s g COo M M CO A A O > + 00I Atd _ o d -I s O COI A tdo CD O +d-I g O 0>o i r , VO t o o CM A o o O +1 + 1 + 1 CO CO D~ 00 a a d “ i r \ LO A 1—1 1—1 CM 1—1 LTN A CM vr> O to , r—4 + 1 + 1 + 1 CO CO VO m i r \ a a 1—J T\ r—4 d- CM t o v \l CM CM c n IT, o 1—1 'TO c - o CO cn + 1 + 1 +1 a a i r \ o - d " CO CM LTV d - VO c o t o CM VO c n d - LO d " (—1 CM O H -l H -l + 1 CO A '~C d - t o a a KV O t o VO CTi CO IT \ LTV LO r - v I—t X CO, p X M \J CM Ü X 1—1 X CO a 3 X X Cd 3= O A A CJ A CO (D S4 s Vi : s A i CO A I pra - 117 - a A à I a 8 CO g âM g n c o gMOg n c o 3Ia g c o 0 A MA c o g 1 c oH g > + ■ +d-I O KOO o +1 KC KOO o +1 cr*VO cr*o o +1 c o c o a a 00 c ~ - CM cd + A 1— 1 d A00 a1 A A CD A E fcd + 1 +1 + 1 CO CO O cd d - c - 1—t a a t— 11—1 i r * c r» . m ao A P CD CD o0) C 1—1 n cd A CO A > A - lis - mento en la relacion 0KT-4"*'/0KT-8'*’ observado en la nefropatfa de- IgA (Tablas 6 y ?). Idéntlcos resultados aparecieron tras estimu- lar con PWM, no pudiendo correlacionar ninguno de los porcentajes con los niveles de IgA producidos en esas condiciones Para observar los cambios en las subclases de célu— las T en la generacion de células supresoras inducidas por la Con A, los pacientes y contrôles fueron fenotipados con anticuerpos - monoclonales en presencia y ausencia del estfmulo inductor. En la figura 2 5 aparece recogido el marcado incre— mento en el porcentaje de células OKT-8^ al final de un cultivo= control tratado con 50 ^g/ml de Con A, mientras que no hay a pe- nas aumento en el porcentaje de células supresoras en el caso de= los pacientes. Analizados los porcentajes tras incubacion PWM y - 2.5 jug/ml de Con A, los contrôles experimentaro-n una reduccién en el porcentaje de células supresoras en relacion a sus niveles basa les cuando solo se habia incubado con PWM. Los pacientes no sélo= no tenfan la reduccion, sino que se producia un ligero aumento en este punto. Las diferencias de comportamiento en la generacion= de células supresoras en funcion de la Con A se aprecian mejor ai la figura 26A. La presencia de la lectina no inflqye en la dife-— renciacion de supresores, al contrai io de lo que ocurre en los = contrôles, siendo su prcporcion constante en el medio con indepen dencia de la dosis mitogénica utilizada. Paralelamente, la generacion de cooperadoras corrio pareja con la de supiæoras, oonfirmando las hipotesis que soste — nian que el efecto cooperador 6 supresor observado en un cultivo= dependia de las proporci ones de células cooperadoras o supnesoras = présentes en el mismo. En los pacientes con nefropatia de IgA (— Pig. 26A), la presencia de Con A inducia una disminucién signifi- cativa en el numéro de células T cooperadoras, con relacién a su= situacion basai, siendo su proporcién en el cultive® también inde- pendiente de la dosis mitogénica utilizada. Este comportamiento - se traducia en una fuerte alteracion de las proporci-ohs de células OKI-4''’/OKT-8''' con relacioi a la situacion presentada por contrôles - 119 - CL COu fnO "O m 3 E "S!0) + 00 H O «t(D Q)O « (Ô* 4-1 S g oT— X 5 n.s. 4 3 P* 0 .0025 2 Basai Con A 50pg /m lBasai Con A 50 4 3 2 A A n.s. Basai Con A 2.5 Basai Con A 2.5 fig/ml ?ig.- 29 - 120 - g 00 H O >* <3 h- üc: O 3 U ôu c<Ü (Q■g u 3 T3O < O) 2" (N O 7 6 5 4 3 2 1 7 6 5 4 3 2 1 p <0.025 L Bp + L-Tp p < 0.025 LINFOCITOS B n.s. n.s LINFOCITOS T PWM ( I0 p l/m l L- Bc + L Tp L-Bp+ L Te B FU.- 27 - 123 - nificativo de la sfntesis de IgA (406 + 140 frente a 303 + 6l) en relacion a la situacl6n obtenida cuando las células T provenian - de contrôles alogénicos (p<0.025). El comportamiento de las célu­ las B de los pacientes se normalisé al ser tratadas con células T de contrôles, alcajizando una produccién casi normal en estas con­ diciones . El aumento en la actividad cooperadora de las célu­ las T se observé en el 60% de los pacientes estudiados (7/12). A= pesar de la reduccién en la sfntesis de IgA tras el tratamiento — con células T contrôles, las células B del 40% de los pacientes= (5/12) no fueron suceptibles de una regulacién normal por células T contrôles, compartiendu 3 de estos individuos un aumento de la= actividad cooperadora T, sobre células normales B (Eig. 2?B). Estos resultados permiten deducir que el aumento de la sfntesis de IgA es consecuencia en parte de la hiperactividad= de las células cooperadoras, con una pérdida secundaria de la ac­ tividad supresora para esa poblacién, Pero el hecho de que las cé­ lulas B de un 40% de pacientes no sean regulables y parte de ellos cornpartan ambos defectos, junto con la falta de correlacién entœ estos datos y los aportados por la clfnica, apuntan una evolucjcn continuada del estado inmunolégicu de estos pacientes, no pudien­ do descartar la posible participacién de .las células B, como un - suceso temprano en el desarrolio y perpetuacién de la enfermedad, 4.2.B.- Factore8 séricos Los resultados comentados hasta el momento, la dif^ cultad a la hora de interpreter algunos hechos implicados en la - regulacion de la sfntesis de IgA y la permanencia de elevados ni­ veles en suero de IgA polimérica parcialmente en forma de inmuno- complejos, condujo a pensai en una posible pai’ticipacién de la — propia IgA sérica en los mecanismo de control y regulacién de la= sfntesis de inmunoglobulinas. Para estudiar este aspecto del pro- blema se realizaron un conjunto de experienciæ cuycs resultados - aparecen a continuacién - 124 - in < z 3 CO o_J o o z 3 S lU Û zg o o38 QC Û. x10 nq/ml 12 _ Ocr K— Zo o in < 3 111 O 3 Ü co 1 0 . 2 _ □ PWM E3 PWM+suero Contr ® PWM+suero GN-lq P<0-005 u n.s. n.s. IqA IqG IqM /I; 28 - 125 - 4.2.E.I.- Efectcs del auero de raclentes con nefropa tfa de IfiA. sobre la sfntesis de Ininunoglobulinas en individuos - control Las c^lulas raononucleares de sangre perif£ rlca se incubaron dtusnte 2 horas con sueroa de pacientes con ne— fropatia de IgA, cuantificados y diluidos al 1/10, cultivandose - en presencia de PWM, previa eliminacidn del suero, 7 dias en las= condiciones habituales de cultive. La sfntesis de inmunoglcblulinas se elev<5 de forma= no significative al incubar las células control con sueros de o— tros individuos control, en relacion a la producci5n cuando la in cuhaci6n se realisaba con suero propio. Curiosamente la sfntesis= de IgA auinentaoa al incubar con sueros de pacientes de forma sigii fiotiva ( p <0.0025), alcanzando una produccidn similar a la encon trada en los pacientes con esta enfrmedad. Este efecto no se ob— servo para la sfntesis de IgG, mientras que la de IgM ss incre— mentc sensiblemente, permaneciendo en el limite de significacion= (Pig. 28). 4.2.B.2.- Niveles de cëlulas ? reguladoras de la sfn tesis de iniaunoglobilinas en cultives control gretratados con sue ro de pacientes con nefropatfa de IgA El anâlisis de las poblaciones de células= reguladoras mediants la utilizaci<5n de anticuerpos monoclonales,= antes y despues de su incitacidn con el suero, puso de raanifiesto= un aumento significative (p 0.05) en la poblaci6n de célufeis coo- peradoras OKT-4*, en relacidn a la misma situacion previa incuba- cioa con sueros contrôles (Tabla NS8). Curiosamente el increme±o= en la relacion 0KT-4^/0KT-8^ no fue significative a pesar de mante nerse los niveles de células supresoras OKT-8^ dentro del rango - normal. No bubo diferencias entre los porcentajes de células OKT- 3^, obtenidas en ambos grupos de experiences. $% Cuando se cuantific6 la cantidad de células iraplica- das en la regulacion de la sfntesis de inmunoglobulinas en los pa - 126 - CO PQ EH 1 1 CO1 tnA VOo 00opq < Ao A A o o oo O O 1 +1 +1 COUS A +1Ë3 A B + 00 %W pq ■4' i-a to lArH 1 LOCO U! A A m ËS A A (—f CÜ o o O § O CO 1—1 A H sC3 A 3 IT\ A J3C.q ës A + CO !A Ocq pq CO •0Ü M A 1 1—1 O AO A A + t + 1 + 1&i <3j A COA -4 O53 A ir\ to o aO pq o A 1—1 03CH A 2S (UM A O hn to toÜ o CO C\J UJ CM T)O A A PSÙ4 H A tTj'g P3 A ■PM A O C\J 03 mS + r- C- -4- to% A -4H o 1 1—1 o 1—1 PiA o A + 1 to oÜ +1 +1 o PhCO CO CO O PHM o . SA Cvl , to. o - 0) 1-3 A A cvj CO O <3 A 0)EH m A O CO CD As A A to rt- pqcq o Oo a A pqoq M A cr\ to to + 1o A + 'D ThA A 3 lAO O 1 o. A Aro US A 1 + 1 + 1o A A A +1 COA 12: A Oo CO CO 03 A wÙ3 o A 1—1 to to CO om 0) tSCO o 00 A 03 ACO A to VO to W)o A CO o1-4 A oA A ü)rq A < PS (t)-< A A o Ü A >> A A o CO CO - 127 - A CO I CO-4 ai § I g AI g g g «4I OS s CO 3 g COo A« CO gs + CTN A " VO 0 0 0 I A 0 0 0 « # W A A H o + 1 + 1 + 1 M Ï5 Î3 O + A A r - < 4- r - 00 C ^ A 1—1 1 A 1—t A A pq W A r —1 0 S3 CO «J o o •H oi A T3 H CM ITv r - 0) A + U3 0 A Ë CO S 00 o 1 « 3 A CM nJ pq o A A A A A W + 1 + 1 + 1 CO 0 % <1) O Î o 1—1 0 3 x) M A t—1 0 3 CM 0 O m U I s A 0 VO IC3 VO (3 pq A C3J CM CM t 3 CO S d M A «J OS A ■H> A CO Ç - A 0 m pq + 0 3 1--1 CT\ (B 53 Tp pq 1 0 I--1 0 fM o A 0 CO CO N i + 1 + 1 + 1 A A M O 0 M A 0 3 K 3 VO X> + 1 M o KN A 1 CM «—I A IX S A A A 53 w NJ + 1 + 1 + ! A CO 0 13 13 o o 0 3 0 CO CO «4 o A 00 (A IT3 0 A A m t J 2 A 00 0 rH •H « pq i r \ A VO bO A A 0 o 0 A A 03 O -4 A > m A 0} « 03 A A M X 0) A CO d Ph PM X fM A Ü) X X 0 O ■H + + A O , 1—1 CO 0 tc5pq Hi PM A > A A A CO A o §o A - 128 - alertes tras su incubacion con sueras control, no se observaron== diferencias con respecco a los porcentajes encontrados previa in- cubaclcn con sueros de otros individuos afectos (Tabla 9). Estos resultados parecen indicarnos que aunque el suero de estos pacien tes afecta la sfntesis y dlferencxacion de las células reguladoras contribua;endo a la perpetuacion de la enfermedad, existe un defec-- tû Intrfnsecû en las células participantes en la respuesta a la= estimulacion policlonal y que parece ser el responsable de las a_l teracicnes inmunologicas propias de esta nefropatfa. A.2.B.3.- Modlficaci'n de la actividad y generacion de células supresoras inducidas oor la Con A en presencia del sue ro de pacientes con nefropatfa de IgA En las figuras 29, 30 y 31 se ha recogido el ccmportamiento dinamico de la generacion de células supresoras y su actividad frente a la sfntesis de ininonoglobulinas, previo — (OO 6 ) y rras el tratamiento del cultivo con sueros de pacientes ( # ) y contrôles (• # A ). Ocservandc. las très figuras, no a parece una diferen- cia en la actividad supresora de células control al ser rratadas= con sueros perteneoientes a otros individuos control. En el caso= de la IgA (Fig. 29), la incubacion con sueros de pacientes produœ un cambio en la actividad supresora aproximândose al comportatnien te observado en las células de estos sujetos, Bajas concentracio-^ nés de lectina indueen una fuerte supresicn de la sfntesis, que ae mantiene e incluse disminuye a tnedide que a urne nt a la dosis raitogé nica. La actividad supresora se independisa de ]a dosis inductora= a partir de 10 pg/ml de Con A. En el caso de la IgC (Fig. 30). el comportamiento cfe las células tras el tratamiento con si suero de contrôles y pacim tes es similar, manifestandose en ambos casos, frente al comporta miento normal de los contrôles, une falta de supresién en el ifrni te de significacion a bajas dosis de Con A. No se apreciraron dif_e rencias en cuanto al ccmportamiento regulador de la sfntesis de - - 129 - < O) 0)•O tn UJ U) J5 V T3 Z O (/)liiq:a 3 U) Q)•D ae pg/ml de Con A 1.25 5 5 10 25 50 100 it I 1 I_____J______I____I p<0.025 N.S. 25 • G N” IgA O Control50 # Cont.+Suero Pac. 29 - 130 - pg/ml de Con A c 0) O JO) Q TO < (0 O) (/) 1 lU Z h- z o ( /) 0) "O jO o Q) (D TO 3tn zo oT3 (0 LU .2œ ÛOl c 3 o (/) (A 0) 3Ü Co 3 O c0) +GO H O $ A O cou (A(0 '(UU 0) "O z g < LU cr B n - 134 - □□□ □ □ inooo d Va toLU_j Ocr HZ O O coLUh-Zm U 0)■D (AO3 Z(U 3 (A COu n . cr O 3. CO »o CI < , s H g COW gA > - 3%(afA EP P << d)ro g 'nAV£)A ovD '«fOK\A'.cf-or-cnir\'^Tf CgLr\KNC?\CvJOOCOtO'd-|>-C\JKN ^;:hTKrqotr\oc)\OArr\mir\cr, c\j (r\rHr-oi>-cri[~-K\M"\cnvo ofAC\JC\tCMCNJKNrOCJAf<̂ ACvJOJ O O C M A m o O H ^ A O O t A O O en Tj- Tfoo •^cTsK 'oo ie-cncO 'X ) ^ iTvotcNCNjcnAo-cnKnoAcviLn ir\n-'f-vDĉ irv'cj-von-'̂ tAC— n~ O o o O o%) o o cMcMo o o miAC— ir\'d-'y-T^c)'^#OU'C)KNCMCJKNCNJKNCMKNCV'^'^KnK'. 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De las 13 casos estudiados (Tabla 12), 7 présenta— ron un incremeto en la fraccion (9-13) S a expenses de los porcen tajes aparecidos en la regidn (5-9) 8. Cuatro de estos familiares tenfan una sfntesis normal de IgA en respuesta al PWM y 3 forma— ban parte del grupo con un distribucién anémala de la IgA sérica. Los resultados obtenidos para la familia (L.M.) c£ mentados en el apartado anterior, reprodujeron una situacion si­ milar para los dos miembros afectos y la madré, cuya produccién= in vitro, era ahora normal y un incremento en la region (9-13) S para uro de los hermanos, oya produccién estaba por encima de los limites de normalidad (Tabla 13) De estos resultados puede deducirse que el 30% de = los familiares préximos a los p.cientes con nefropatfa de IgA pré­ sentas un increraeto en la fracciôn polimérica de su IgA sérica, - de los que un 83% poseen un incremento de la sfntesis in vitro de esta fraccién. El aumento en la sfntesis de IgA polimérica aparece en el 45% de los casos correspondiendo en un 60% aproximadamente= a uno de los dos progenitores. 4.3.D.- Anélisis de receptores celulares para el compo— nente secretorio e inmunoglobulinas de superficie 4.3.D.I.- Receptores citoplasméticos para el componm te secretorio El porcentaje de linfocitos con capacidad= para unir el components secretorio era de un 20%, similar en los= très grupos, no existiendo tampoco diferencias en los porcentajes de células que contenfan IgA, IgG e IgM. Ahora bien, el pcrcenta- je de linfocitos que conteniendo IgA eran capaces de fijar compo­ nents sacretoriu en relacion al numéro total de células IgA*, esta ba significativamente incrementado en los familiares de estos pa- 146- - g g64 A AA MAAAO m <3jAMOAAO g AA gAOjA IA g raa g ra g«-criK>ovûa>Ac\ji>- K\^K\rr\vriATd-AAC\;raC)K\ -AraiOcnraoOAoJcnAOO\K\[A'M-K\00ACMCMC--r<-\\Orr\m raLPMPiAOQOCT'OOOAcnOA \ ra ra LrMiAC-LTvvûLnrao-'^LnuA .AOOOOravAAl'AA'X'OcMvora-e-mootArararaooir, CTvOALr»Acr»'AQoo>Lr\KNcrvLr\ KA "V A' A CM "M" C\J C\J A- A" ir\en +1 enO ou> CM +1 CTi00 om 0̂0M3 + 1 CMM3 n- X X X X X 00LfMn0Lr%0000i-n0M3 U3 Lr\cnir\ir\i>-Acnir\OAif\o CMAtCNACMA-V-KNKMTNCMr^CM bCA r- APC -X hfeA"X PiA ro A co raA *a3A btA A AA AA CO ro UCüA 1—1 EroA < X X X X X o o o o o o o o o o o o oLfMAO-Ln-d-ThThO'd-'cfOLnOM-\CMCMK\Ara,CMtC\CMX-TfM<-\rc\ S : A A A m A ! > A S A S A O «AK\A + 1 LP.mA Xm "M" M3 + 1 AA'A ra g § gS ra A + 1 IX cüA - 147 - n gA Penra ACM IP IP o P + 1r—* CM en M3 o OCM1 ■«4- tp CM p -M" enK> oF—1 p1 AO"X As üA g oA A "aR ra M) A AA CMO ai O CM O o P + 1> A en fp en Tt- PM A tp A A A O M> CP p P enA O 1 M3 M3 M> p M) 00A enO Ara opA A ra <4 aiA A 00A M3ü <*} A MA A +1O ra O (P P o CM ai A n- n- CM M3 CMA A CMen tr\ oo P A O M3<ü t fp CM P Th Pb£ A ip PA ' ■M" A A A Sen A A AA tSi<Ü A A A esA A o A 4 MO ra C- <ü '4 X A ai o œ M X P o A A O o p p O AA C3 A IP M) c- en P + 1A A ip CM p p (—1ra A eo P A ra 9 ' i PCM A o A A A Arara S g 8 gS AA ra A e PA o> A u O O o o O .A A d) '=4' IP P- p p MD A a A 03 A" tp p CM CM + 1A o X X XA o AA <übt X X X CMra < A A "d-A A «=tj CM ai A aiq A ra g A X X X M) > A CO(D ë•H 1—\ •fH II cü cü ro tü-en o M3'M" -V CM A A S A A A H > «s; A > I SAAOO ■o!bOA ra 03XI A •=ü HbO ro IXA 1—1roCD E roT3 'Oro A ro ro 03A X3ro roro üA A ao A AA *M3 C303 ro03 03ro roV3 ro03 •H oT) Ües A 03 A coO A 03■P ro roO A oQ) en AA A ro<4 A !> X b — 148 — cientes. No ocurrfa ssf en el caso de células IgG* e IgM*. En la figura 39 puede observarse que de los 25 fa­ miliares estudiados sélo 10 estan dentro de los limites normales= De los 15 que poseen alteracién, 7 corresponden a los progenitores no habiéndose podido establecer en ningun caso, ningun tipo de C£ rrelacién entre estos datos , los valores in vivo e in vitro de - IgA y el porcentaje de formas de alto peso molecular présentes. 4.3.D.2.- Inmunoglobulinas de superficie Los familiares préximos a los pacientes tienen un porcentaje mayor ( p < 0.005) de linfocitos portadores de IgA — (Fig. 40) en su superficie. La unién del components secretorio a las inmunoglo­ bulinas de superficie fue mener de un 5%, correspondiendo la maycr parte a linfocitos portadores de IgM. A pesar de esto, la propor- cion de linfocitos portadores de IgA polimérica, frente a los por tadorés dè IgA total, se elevé cbnsiderablemente, manteniéndose - dentro de los limites de normalidad establecidos. No hubo diferencias en los niveles de células porta doras de IgG e IgM, ni en las proporcioms que fijaban el OS, con= respecte al grupo control, siendo la alteracién observada especf- fica para la poblacién IgA*. El aumento en el numéro de linfocitos portadores de= IgA iba acompanadô en el 80% de los casos, de un aumento en el nu raero de linfocitos sintetizadores de IgA polimérica. 4.3.E.- Actividad supiBBora inducida por la Con A. en — los familiares de pacientes con nefropatfa de IgA Se estudio la actividad de las células supresoras inducidas por la Con A a très concentraciones diferentes : 50 pg/ ml, 10 |ig/ml y 2,5 jjg/ml, segun el método de Miller. A 10 jug/ml no se obervaron diferencias entre los - grupos de pacientes, contrôles y familiares. Tampoco aparecieron - 149 - < 0> ■S i/iQ) N %4- 6MM M A A 1—4O#4po CM 00 VOK r- r—1 (33M 03 +00 o A O 4 A +1 + 1 + 1 . . .—V OS M M 03 co ao A O M3 'M' AM A K3 A td Sd tJE A V« M" VO VO GÎD Pm O CM CM CMÜJ aH 03 AoJ A03 <33 CM O 0>E4 1—1 'M- A •a >* + 03 U3CO A" O O A O CM M1 O O a+1 +1 +1 o o -a» M M g|4 O r- ITv 00 o o (3M H •M" «3 U3 +»O A A «« ir> irv <33M ü K3 M" K3P» M MEM ow p 03 a oA O o A A > g p. - 154 lulas supresoras. Este junto con la existencia de niveles persis- tentemente elevados de células CKT-4^ en pacientes, habla en fa— vor de un transtorno primario de linfocitos T cooperadores. La e- xistencia de 8 fa:: il lare s con incremento de células T supresoras, frente a 7 de 27 pacientes sugerrria un intente compensador de loB linfocitos T supresores para evitar la excesiva produccion de IgA con un ulterior agotamlento del sistema, ya en el comienzo o en — ciertas fases de la enfermedad. Por ultimo, es interesante destacar que en las 7 fa milias estudiadas, siempre habia uno de los padres con alguna de= las alteraciones inmunologicas discutidas. Del mismo modo, apare- cian afectados uno c dos de los hermanos. Aunque no ha formadopr te de este trabajo, es curioso hacer notar que ninguno de los pa­ riantes han presentado inmunoccmplejos de IgA e IgG por dos técni cas distintas (células Raji y/o inhibicion de la fijacién de IgA= a un antisuero anti-igA de baja afinidad. Estas datos plantean un reto importante a la hora de dilucidar la importanci a de estos in munocomplejos en la aparicion y desarrollo de la nefropatia de -- IgA. □iSCUSlON - 155 - 5.- DISCUSION ; La nefropatia de IgA, descrita ccmo tal entidad por ; Berger en 1969 (10), se caracteriza fundaxnentalmente por la presm cia en el raesangio renal de IgA y frecuentemente C3 en un modelo= de depésito granular. La patogénesis de esta enfermedad es practicamente - desconocida. La presencia de elevados niveles de IgA en el suero= (59) y su récidiva tras el transplante renal (11), llaraé la aten- cion sobre el papel que podria jugar esta Inmunoglobulina. Pero - hasta 1979 con el descubrimiento de elevados niveles sériccs de - IgA politnérica, parcialmente en forma de inmunocomplejos en la ma yoria de los pacientes (45), no se considfecé a la IgA como un fac­ tor importante e incluse decisive en su desarrollo. En este trabajo hemos demostrado claramente que los pacientes con nefropatia de IgA presentan un conjunto de altera— clones en el comportamiento de las células implicadas en la res-*- puesta inmune, que pueden en parte explicar alguno de los hechos= inmunopatolégicos caracterfsticos de esta enfermecfei. Primeramente heraos demostrado que los linfocitos de sangre periférica estimulados con PWM producer selectivamente ma— yor cantidad de IgA en relacién a los contrôles. Este resultado - estarfa de acuerdo con el aumento especffico de linfocitos porta— dores de IgA en su superficie (126) y la disminucion de la activi dad supresora de las células T (192) de estos pacientes encentra las recientemente por otros grupos. Un estudio detallado de los - sobrenadantes del cultivo demostré que una gran parte de la IgA - producida tenfa caracterfsticas bioqufmicas de IgA polimérica. Es tos datos junto con el elevado porcentaje de células que conte--- nfan cadena J en su citoplasma y eran productoras de IgA,y a su - vez unfan components secretorio, debfan explicar en parte los al­ tos niveles de IgA polimérica en el suero de estos pacientes (101) La naturaleza y origen de la IgA depositada en el - mesangio renal en esta nefropatfa aun no ha sido corapletamente di lucidada. La alta frecuencia de hematuria macrosccpica asociada a - 156 - infecciones del tracto respiratorio superior en estos pacientes - sugirio las secrecciones externas como un posible origen para la= IgA depositada. Sin embargo, los intentes realizados hasta el me­ mento para demostrar IgA secretoria 6 procedente de las secreccio nes (IgAl/lgA2) han fracasado (54, 181) 6 son muy contradictorios (4, 26, 104). Recientemente (19, 20), basandose en la fijacion e£ pecffica del componente secretorio a las inmunogloblulinas conte- niendo cadena J, se ha demostrado que la IgA depositada en el g!b merulo renal es polimérica en la mayorfa de estos pacientes, ind_e pendientemente de que provenga de las secrecciones 5 de la perife ria (9, 39). Como menos de un 10% de las céluhs plasmâticas de la médula osea son capaces de unir components secreicrio (71, 140), — mientras que el 50% de las células plasmaticas formadoras de IgA= en la mucosa intestinal y de los linfocitos periféricos estimula­ dos con PWM (17, 18, 30, 92) lo unen, se podrfa aceptar que los ^ tos niveles de IgA polimérica sérica y la propia IgA localizada ai el mesangio, esten originadas en los linfocitos con capacidad mi- gratoria provenientes de las secrecciones externas. La alta produccion de IgA polimérica tras la estimu lacion pcliclonal de los linfocitos "in vitro" no puede explicar= por si misma el incremento en la fiaccion polimérica sérica de los pacientes con esta enfermedad (102). Los bajos niveles de IgA pjo limérica encontrados en ex suero de sujetos normales frente a la & ta proporcion de esta forma molecular producida por los linfcci- tos estimulados in vitro, se debe en parte a su rapide y efectivo aclaramiento por el higado, probablemente a través de los recepto res para el componente secretorio presenbe en los hepatocitos (65 76, 96, 131, 158). En teoria, undefècto en el âdaramiento de la= IgA por el higado como sucede probablemente en los pacientes con= cirrosis alcohélica, en los que aparecen elevados niveles de IgA= polimérica sérica (102), contribuirfa a explicar los hallazgcs en el suero de nuestros pacientes. La retencion de IgA observada en= ratas con ligadura de los conductos biliares (131) o danc hepati- 00 (83) .7 la dificultad en el aclaramiento de agregadcs de IgA in yectados en ratones en un modela de cirrosis cronica experimental - 157 - confirman esta hipétesis. . Es posible que los linfocitos originados en los te- jidos asociados a las secrecciones externas produzcan una mayor - cantidad de IgA polimérica tras una infeccién viral, tal como ocu rre in vitro por estlmulacién policlonal. Esta IgA formando parte de inmunocomplejos podrfa teoricaraente saturar los receptores pa el componente secretorio y probàiemente Pc de los hepatocitos,per_ maneciendo més tiempo en circulacién y favoreciendo su deposits a nivel glomerular. En esta misma linea, se ha demostrado en la ra­ ta la eliminacién especffica a través del hfgado de los inmunocom plejos de IgA polimérica (134) y una mayor dificultad para el ma^ nejo de agregadcs de IgA por el sistema mononuclear fagocftico en relacién a los agregadcs de IgG (45) El papel inmunopatogénico de la IgA polimérica en es ta nefropatfa no esta claro. En un modèle de nefropatfa experimen tal recientemente descrito, la presencia de Inmunocomplejos de - IgA polimérica era crftica para su deposito y la induccion de le- siones histolégicas nefréticas. El hecho de que este tipo de inmu nocomplejos aparezcan en el suero y rinones de pacientes con nefr£ patfa de IgA, sfndrome de Schonleich Henoch y cirrosis hepatica - alcohélica con depésitos de IgA a nivel reiaL, sugiere una situa— cién similar en el horobre, Ademés, la disminucién en los niveles= séricos de IgA polimérica en algunos pacientes tratados con dife- nilhidantoina, coincide con una mejorfa clfnica e histolégica (40 42). La produccién elevada de IgA polimérica y la alta - proporcién de células implicadas en su biosfntesis nos indujo a - pensar en la cadena J, como un factor déterminante del proceso. - De hecho, nuestros pacientes presentaban un incremento en el nume ro de linfocitos aislados de sangr_ periférica que contenfan cad£ na J en su citoplasma, con una proporcién semejante de células — IgA*, IgG *e IgM* en su citoplasma, al del grupo control, Estos - resultados indicaban a priori un trastorno en la biosfntesis de - cadena J. La estimulacién "in vitro" con el PWM, descarté esta po_ sibilidad. El incremento en el numéro de células cadena J* se man - 158 - tenfa en relacién a losœntr -les. Se producia una sintesis parale la de inmunoglübuliras, que conducfa a una distribucién de célu— las sintetizadoras de IgA, IgG e IgM similar en ambos grupcs. Pe­ ro mientras que les porcentajes de células sintetizadoras de IgG= e IgM que contenfan cadena J disminufan en la misma proporcién -— que los contrôles, con respecto a su situacién basai, los porcen­ tajes de células cadenaJ-IgA* no se modificaban y permanecfan sen sibleraente aumentados con relacién al mismo grupo. La sintesis de cadena J ccrre parale la in vitro a la. la sfntesis de inmunoglobulinas en linfocitos estimulados con PWM (109). Esta proteina no sélo media el proceso de intercambio de - puentes disuliuro entre los monémeros en la polimerizacién, slno - que juega un importante papel en el ensamblaje de las cadenas in­ tégrantes de la molécula de inmunoglobulina (109, 110). Su presen cia se considéré en un principio restringida a células sécréteras de inmunoglobulinas (18, 84). Més tarde se détecté en varias li— neas celulares mieloides carentes de la sfntesis de cadenas pesa- das o ligeras (86, 152) y en el retfculo endoplâsmico rugcso de - células B portâdcras de inmunoglobulinas en su superficie (123).= Muy recientemente se comprobé que su biosfntesis es un suceso tem prano en la ontogenia de células B anterior al desarrollo de la fa se secretora (105), confirmando la hipétesis de Brandtzaeg y col. (1974) sobre el caracter de marcador de inmunocitos de la cadena J en los primeros estadios de la diArenciacién celular. Con estos précédantes, el aumento en la proporcién= de células cadena J y cadena J-IgA* en nuestros pacientes con un= contenido similar de células IgA* al del grupo control, apüntarfa un posible trastorno en la maduracién y diferenciacién de algunos clones implicados en la sfntesis de esta inmunoglobulina. El alto contenido en cadena J refiejarfa un aumento en el numéro de pre— oursores celulares B con una alta suceptibilidad a la respuesta - de IgA y una cierta incapacidad para alcanzar estadios de diferen ciacién tardios como serfa la secreccion de IgA monomérica, IgG y el desarrollo de una respuesta generalizada normal a la activaciéi policlonal (186). - 159 - La hiperactividad de estos clones para la s£ntesis= de IgA frente a un estfraulo antigénico supoœ un incremento en la= disponibilidad de raonomeros y cadenas pesadas de cuyo ensamblaje= y polimerizacién es responsable la cadena J (109), Si esta prote^ na actua como han indicado algunos autores (110), limitando el — grado de polimerizacién espontânea concomitante al incremento en= la sfntesis de inmunoglobulinas y en ccnsecuencia de centres acti vos de polimerizacién, su alta proporcién en nuestros pacientes - serfa una consecuencâa natural de un defect j intrfnseco de un gru­ po de linfocitos B responsables del aumento en la sfntesis de IgA polimérica observada. No existe en la literatura ningiîn trabajo sobre el= papel modulador de la cadena J en la sfntesis directa de inrauno— globulinas. Dado su caracter de marcador de diferenciacién que — tiende a perderse en los ultimes estadios de proceso, es légico - pensar que el control génico de esta proteina este ligado a la ex presién diferencial de los genes implicados en la sfntesis de los diferentes isotipos (72). Cualquier factor que incida sobre la ca dena J debe afectar en alguna medida la biosfntesis de inmunoglo­ bulinas . Nosotros hemos observado que aunque la cadena J sé­ lo se ha (ttectado sobre la superficie de un 0.98% de las células= linfoides de sangre periférica (19), la adicién de un suero anti- cadena J humana a un cultivo celular détermina un cambio total en la biosfntesis de IgA e IgM Inducidas con PWM, dejando practice— mente inalterada la sfntesis de IgG Estudios similares, previamente recogidos en la li­ terature, realizados con sueros anti-IgA y anti-cadenas Y y haa puesto de manifesto que estes anticuerpos bloquean el paso de cé­ lulas sécréteras de IgG durante la diferenciacién de linfocitos B (51, 175). Los estadios iniciales de diferencàæién é activacién - sen mas facilmente estimulados que los estadios finales (51). De= hecho, se ha observado que bajas concentraciones de suero anti-ca denajx -^stimulan la sfntesis de IgM, mientras que este efecto no= aparece nunca para la IgA e IgG en las mismas condicicnes, cuya - — 160 — sintesis inducida por PWM se produce concomitante més que secuen- cialmente en el hcmbre (139). La supresion de la secreccién de in munoglobulinas tiene un momento crftico. Una vez que las oelulas= se han comproraetido en la biosfntesis de un isotipo determinado,= estos anticuerpos no ejercen ningun efecto (175). Lo mismo sucede cuando a penas se ha inicado la difsenciacion y el pequeno efecto observadc es totalmente reversible, quizes debido a que la activa cién de supresores ha comenzado, pero no han aparecido aun célu— las comprometidas en un sentido determinado (223). El efecto de - estes sueros chpende de la fraccién F(ab’)2 del anticuerpo y no pa rece estar condicionado por el proceso de reagrupacién y endocito sis del complejo formado sobre la superficie (51). Curiosamente hemos observado que las células con— trcl en estadios més tempranos de la diferenciacién como son las implicadas en la sfntesis de IgM donde la proporcién de células - conteniendo cadena J es mas elevada, son mas suceptibles a la es timulacién en presencia del suero anti-cadena J, Las células total^ mente cornprometidas en la sfntesis de un isotipo determinado pro­ pi o de les ultimos estadios de diferenciacién, como es la IgG no= se afecxan y en la propia IgA, la estimulacién se produce a muy - bajas concentraciones dd anticuerpo. El efecto estimulador apare- ce a concentraciones que no influyen sobre la sfntesis de IgG e - IgM y parece especffico para esta inmunoglobulina. Quizâs, dado - el caracter intermedio en la diferenciacién que se ha postulado - para la poblacién implicada en la sfrtesis de IgA, fuese una mani- festacién similar a la aparecida para la IgM a dosis mas elevadas Esta célula estarfa mas capacitada pra recoger a una ccncentracioi alta de anticne‘”po no sélo su efecto raitogénico, sino responder a los cambios de membrane que inducirfan una elevacién del AMPc, d£ sencadenando una respuesta celular que conducirfa a la inhibicién de la proliferacién de este gupo poblacional (47,133). El hecho cfe que la IgG ne aparezca en forma polimérica y la cadena J sélo par cicipe aparentemente en el ensamblaje de las unidades del raoncmero y en muchos casos ni siquiera este présente, junto a su elevado - grado de diferenciacién, explicarfa la falta de respuesta de la - - 161 - poblacion implicada en su sfntesis en presencia del suero anti-ca dena J humana. Posiblemente el control génetico de la cadena J sea a este nivel independiente de algunos factures que parecen irflulr en poblaciones menos diferenciadas. Es poable que el efecto del suero anticadena J este condicionado a su recepcion en ciertas localizaciones de la mera— brana muy proximas 6 implicadas en el transporte activo de las in munoglobulinas, mas que sobre las propias molécule poliméricas de le superficie, en las que los déterminantes antigénicos del pépt^ do no son accesibles. No hay que olvidar que algunos autores han= propuesto a la cadena J como un elemento necesario para el trans­ porte de las inmunoglobulinas al exterior (136). De hecho, su in corporacién a la IgM se produce instants antes de su liberacién 6 concomitante con ella, por lo que la proteina debe localizarse en un punto muy préximo 6 incluse sobre la membrana interna de la cé lula. Centréndonos en la respuesta obtenida para nuestros pacientes con nefropatfa de IgA, lo que a primera vista llama la= atencion es el comportamiento invertido de la sfntesis de IgA e — IgM en funciôn de la concentracién del antisuero, en relacién a - los contrôles. Si como hemos apuntado, los estadios iniciales de= diferenciacién son mas suceptibles a las variaciones de AMPc y en consecuencia a la proliferaciôn y diferenciacién ante un estfmulo policlonal, la poca modificacién observada en la sfntesis de IgM= reriejarfa un aespiazamienco de ias células a estadios de diferen ciacién posteriores con una menor respuesta al anticuerpo é bien= un cambio en la membrana que impidiera una mayor activacién mito- génica de la célula (51). El dréstico cambio en el comportamiento para la sfntesis de IgA y la similitud con el grupo cortrol en la= sfntesis de IgG, abogan por un defecto intrfnseco en la diferen— ciacién de linfocitos B secretores de IgM a secretores de IgA y - en el paso de este estadio a linfocitos B secretores de IgG. La - mayorfa de las células diferenciadas para IgA no alcanzan la fase de células IgG é la anémalia sélo afecta al control genético de - la IgG si considérâmes una sfntesis v-uiicumixante en el horabre. — — — 162 — La alteracion no serfa general y la diferenciacién aberrante afe£ tarfa sélo a un grupo de clones. El contenido final de células -— IgA* e IgG* es similar al de los contrôles en estos pacientes, — asf como la proporcién de IgA monomérica sintetizada en respuesta al PWM y sélo se produce un incremento en la proporcién que afec­ ta a células cadena J-IgA* que serfan las représentantes de — parte de esta poblacién anormal. Su comportamiento frente al ant^ suero anti-cadena J refleja posiblemente este hecho, al obtener - con una pequeha dosis una respuesta similar a la de células dife­ renciadas, pero aun no totalmente comprometidas que serfan sucep­ tibles de modulacién y fallarfan al aumentar la dosis debido a su alto contenido en células no bien diferencâdas para ese détermina do isotipo. La respuesta a un estfmulo policlonal "in vitro" no= es consecuencia sélo de la actividad de los linfocitos B, sino de un elaborado sistema de interacciones celulares que potencian y - limitan el desarrollo de una respuesta final (36). El aumento es- pecffico para la sfntesis de IgA en estos pacientes puede represm tar a priori una anomalfa en la funcién de los linfocitos B, como puede desprenderse de los comentarios anteriores, é bxen de los - linfocitos T, cuya partieipacién activa es necesaria para la res­ puesta frente al PWM. Nuestras experiencias demuestran que los pacientes= con nefropatfa de IgA, estudiados por anticuerpos monoclonales an ti-células T, presentan en sangs periférica unos porcentajes de - lirfocitos T totales OKT-3* normales y un aumento en el Indice de = œlulas OKT-4*/OKT-8*, debido a la prevalencia relative de la pob^ cién de T cooperadores OKT-4 sobre la poblacién supresora OKT-8*. Compatible con estas alteraciones, esta la profunda modificacién= que hemos observado en la actividad supresora de la sfntesis de - IgA, acompanada de una rapida diferenciacién de células supreso— ras inducidas por la Con A, con relacién a la situacién control. Bajas concentraciones de lectina inducen una fuerte supresién de= la sfntesis de IgA acompanada de una rapida diferenciacién de cé­ lulas supresoras OkT-S*. En el 50% de los contrôles no aparece e_s - 163 - te efecto. Se produce una estimulacién de la sfntesis manteniendo practicamente todos los casos estudiados, una elevada proporci6n= de células cooperadoras en el medio. Este comportamiento confirma la hipétesis de un efecto cooperador é supresor sobre la sfntesis de inmunoglobulinas en dependencia de las proporclones de células cooperadoras é supresoras présentes en el cultivo (119, 156*). El raanteniraiento e incluso la disminucién de los porcentajes de su— presién a altas dosis y la similitud en el comportamiento de los - cultivos mixtos en las mismas condiciones, frente a la fuerte su­ presién experimentada por los contrôles en todas las experiencias hablan ai favor de una cierta alteracién en la generacién de supre sores mas que de una "incapacidad" de la poblacién responsable pa ra el ejercicio de la funcién supresora. Esta hipétesis se ve apo yada por las variaciones que observâmes en las proporciones rela­ tives de células OKT-4* y OKT-8* para cada una de las experiencias coraentadas. Una vez que se ha producido la aparicién de supresores y la reduccién en los niveles de cooperadores en respuesta a la - Con A, su generacién posterior se independiza de la dosis, mante- niéndose cas! inalterados sus niveles en el medio. Esto détermina una profunda alteracién en las proporciones de células 0KT-4*/0KT -8 en el cultivo, ‘ Otro puntp interesante es él hecho de que nuestro - pacientes presenten un aumento en la suma de los porcentajes de - células con caracterfsticas T supresoras y T cooperadoras con re­ lacién al numéro de células totales OKT-3 . Esta diferencia puede ser debida a un fallo del anticuerpo monoclonal especffico, con - una deteccién menor células T con relacién a las présentes. Sin - embargo aunque estadlsticamente no fUe significatiso, se détecté - en 4 de los 8 pacientes en los que se estudié la expresién simul­ tanés de ambos maradores OkT-4* y OKT-8* sobre la superficie de - los linfocitos, con un porcentaje entre un 7 y un 10% cuando en cqi troles ninguno era superior a un 6%. Estos, resultados eran simila res a los encontrados por otros autores (6) en otras enfermedades como la glomerulonefritis membranosa, la misma nefropatfa de IgA, la miastenia graves y otras enfermedades sistémicas, asociados a» — 164 — una liberacion anormal de células T inraaduras, que unos casos son incapaces de alcanzar los ultimos esladios de dif erenciacién. Aun­ que son necesarios estudios mas profundos sobre este punto, es — muy posible que paralelamente o a consecuencia de las alteracio— nes inmunolégicas producidas por cualquier desérden patolégico en general, se prodiœa la expresién simultanea de ambos marcadores - sobre algunas poblaciones de células T, representando un paso in­ termedio en la diferendacién de poblaciones con una u otraoarac- terfstica funcional. El control de la respuesta a un estfmulo policlonal requiers la participacién primaria de céluhs cooperadoras, cuyas= senales inducen de forma secundaria la activacién de los linfoci­ tos B (56). En ausencia de células supresoras, la respucsta mito- génica es muy pequena y esta condicionada por la mayor é menor ca pacidad de las células cooperadoras OKT-4 para diferenciarse en= células supresoras OKT-8 (145). Este comportamiento no es bidiræ clonal en condiciones normales, no habiendose observado hasta e 1= momento en células OKT-8*. Asf, el aumento de células cooperadoras presentado por nuestros pacientes aén sin estfmulo mitogénico ia- bla en favor de la dificultad apuntada para generar supresores y= justifica los cambios observados en la actividad supresora de las células T sobre la sfntesis de inmunoglobulinas. Cuando estudiamos la actividad cooperadora de estas células mediante un co-cultivo in vitro de linfocitos T y B, ob— servaraos un gran paralelisrao con los resultados anteriores. Los - linfocitos T de los pacientes con nefropatfa de IgA tenfan un au­ mento en su capacidaa cooperadora en raq)uesta a un estfmulo poli­ clonal, a la hora de regular- ra sfntesis de inmunoglobulinas — en linfocitos B contrôles. En muchos casos, esta actividad no era intrfnseca de los linfocitos T, sino consecuencia de la incapaci­ dad de la célula B para ser regulada, incluso en presencia de lin focitos T normales. Esto junto con el hallazgo no infrecuente de= pacientes con una actividad supresora normal para la sfntesis de= IgA sugiere que la afectacién de cooperadoras podrfa ser la alte­ racion primaria y y las anomalies de supresién, su consecuencia. - 165 - La presencia de IC-IgAp y la propia IgA polimérica= en el suero de estos pacientes puede contribuir a la perpetuacién de las alteraciones celulares hasta ahora comentadas. Existen varies datos en la literatura sobre el pa— pel modulador de los 10 en la actividad de células supresoras in- vivo e in vitro (37» 156) y su capacidad para inducir la transfer macion de células Ty en células y la pérdida de su capacidad - para inducir la formacion de supresores (70). Ademés, existe una= asociacion generalizada entre la elevacién de los nivples séricos de un isotipo determinado y el aumento en el numéro de L-T con — receptores de superficie para la cadena pesada de ese isotipo en= mielomas secretores humanos (75) y plasmacitomas secretores expé­ rimentales (74). Concretamente, la elevacién de los niveles séri= COS de IgA induce la expansién de una poblacién no relacionada con el tumor en si. In vitro, se ha obtenido un efecto similar al incubar con IgA polimérica. La expansién y diferenciacién de célu las requerfa la interaccién con la IgA (75) y la biosfntesis - de DNA y proteinas. Nuestras experiencias de incubacién del suero de pa­ cientes con nefropatfa de IgA con células control demostraron cia ramente que el suero inducfa un aumento en la sfntesis especffica de IgA en respuesta al PWM, acompanado de un incremento en el nu­ méro de células cooperadores présentes en el cultivo. El estudio= de la actividad supresora inducida por la Con A en células con--- trol tratadas con el suero révélé un comportamiento similar al de las células de los pacientes en las mismas condiciones. Se produ- cfa un aumento en la supresién de la sfntesis de IgA, acompanada= de una estimulacién de las sfntesis de IgG a bajas dosis de Con A , mientras que existfa una falta de supresién especffica de IgA - cuando la dosis aumentaba. Los niveles de células OKT-4* sufrfan= una reduccién con respecto a su situacién basai, independizéndose de la dosis de lectina utilizada y los de células OKT-8* révéla— ban una incapacidad del sistema para la generacién de supresores, con una répida diferenciacién inicial a bajas dosis que no era — significative con respecto al basai y una falta de proliferacién= — 166 - cuando el requerimiento era mayor. Las células de los pacientes - tratadas con sueros control tuvieron el mismo comportamiento. Estos resultados revelan la participacién efectiva - de algunos factores présentes en el suero de los pacientes con ne fropatia de IgA. Estos factores contribuyen a la perpetuacion y - potenciacion de la lesion primaria que desencadena la serie de su cesos inmunclogicos propios de esta enfermedad. Para determiner si el efecto observado radicaba en - la propia IgA polimérica, sus inmunocomplejos o en ambos a la vez , hicimos un grupo de experiencias de incubacién de células con— trol con IgA monomérica, IgA polimérica e IgG y sus agregados co- rrespondientes. En contra de lo obtenido en otras situaciones - (5), la presencia de estas proteinas y sus agregados no influyé - en la sintesis de inmunoglobulinas, pero si indujo una fuerte al teracién en el comportamiento de las poblaciones implicadas en su regulacién, generadas por la Con A. Los agregados de IgG produ— — cian una estimulacién general de la sfntesis de inmunoglobulinas= en respuesta a la induccién de supresores por la Con A. La IgA m£ nomérica no alteraba el comportamiento normal de las células y la IgA polimérica, los agregados de IgA monomérica y de IgA poliméri ca determinaban una falta de supresién a altas dosis de Con A, — acompanado de un aumento de supresién a bajas dosis, especffico - para la sfntesis de IgA. Es decir, tanta la IgA polimérica, como= los inmunocomplejos de IgA polimérica o IgG présentes en el suero de estos pacientes pueden ser responsables en parte de las altera clones propias de la enfermedad. Es muy posible, que la persistencia de elevados nive_ les de IgA polimérica en el suero induzca y raantenga la expansién de una poblacién de células T con receptores para la cadena oL Los inmunccomplejos de IgA polimérica deben contribuir a modular= la actividad de esta poblacién de la misma forma que puede hacer- lo los de IgG (117), condicicnando la pérdida de su capacidad pa­ ra formar supresores. Esta serfa una situacién similar a la que - hemos observado con los agregados de IgG, IgA monomérica e IgA — polimérica. En el primer caso, segun Moretta (117) su presencia - - 167 - induce una pérdida de marcadores Y sobre las célula T con carac— terfsticas de supresoras globales sobre la sintesis de inmunoglo­ bulinas, que serfan incapaces de diferenciarse frente al estfmu­ lo mitogénico y contrôler la proliferacién de cooperadores en re£ pue8ta al PWM, que ne se afectarfan puesto que carecen de este — marcador. En el segundo y tércer caso, la pérdida selectiva dete= afectar a un grupo con marcadores T^, ya que la modificacién en - la generacién de supresoras es especff ica par-a la sfntesis de IgA . Esta hipétesis se ve apoyada por incremento en el numéro de cé­ lulas corn ambos marcadores OKT-4* y OKT-S* en su superficie que - aparece de nuevo en estas experiencias. La pérdida selectiva de - receptores para los inmunocomplejos de IgA sobre T^ no se aprecia rfa en el conjunto de supresores, pero contribuirfa a aumentar la proporcién de T con caracterfsticas cooperadoras. (28) La expansién general de cooperadores que aparece en= todas nuestras experiencias podrfa ser una exagerada, pero. normal respuesta inmunoreguladora que influirfa en el crecimiento y regu lacién de los linfocitos B. No hay que olvidar que en estos pa--- cientes se han detectado inmunocomplejos de IgA polimérica forma- dos en exceso de anticuerpo e inmunocomple j<$ de IgG. Ding y Segre (33) demostraron en modelos expérimentales, que los inmunocomple­ jos formai08 en exceso de anticuerpo son capaces de establecer — reacciones cruzahas on los receptores especfficos de linfocitos T , bien directamer.te o a través del macréfago (50), cuya internal! zacién détermina una sehal que conduce a la activacién de células T cooperadores. La permanencia de elevados niveles de cooperado--* ras aun en ausencia del estfmulo en los pacientes con nefrcpatfa= de IgA puede ser una manifestacién de estas interacciones y la — IgA polimérica^ el exceso de anticuerpo necesari,. Esto se verfa - apoyauo por las diferencias que hemos observado al incubar con — IgA monomérica e IgA polimérica en respuesta a la Con A. El efec­ to es tante mas acusado cuanto mayor es el numéro de reacciones - cruzadas que puede establecer* el elemento bloqueante (polfmero — frente al mcnémerc). 158 - Aunque la m ; y or fa le los estudios sobre inqiuncregula cion en diverses enfermedades, principalmente de origen autoinmu- ne, estan dedicados a las anomalfas de células T (49), particular mente a la deficiencia selctiva de T supresores, la afectacién — alternativa y no mutuamente excluyente de células T coopéraioras= con un aumento en su funcién, esté siendo considerada. De hecho,= varies estudios en modelos animales de Lupus Eritematoso sugieren esta posibilidad (49). Este estarfa de acuerdo con la hipétesis - de un defecto mas profundo y primitive de las células precursoras resultando en la hiperactividad de algunos clones de células B. — Consecuencia directa serfa el incremento de células cooperadoras= favorecido por los inmunocomple jos en exceso de anticuerpo seg4da= de la pérdida secundaria de células supresoras (49) que contribui rfa a perpetuar la alteracién. Esto explicarfa que algunos de las pacientes con nefropatfa de IgA presenten simultaneamente un au­ mento de la actividad cooperadora y una incapacidad de los linfo citos B para ser regulados normalmente. La elevada produccién de IgA por los linfocitos -— tras su estimulacién policlonal in vitro, el aumento en el numéro de portadores de IgA y cfe los que contienen cadena J y fijan compo nente secretorio en su citoplasma abogan por la existencia de — anomalfas intrfnsecas en los linfocitos B. Sin embargo, otras en- fermedades de tejido conectivo y el mismo lupus eritematoso, ca— - racterizadas por la hiperactividad de los linfocitos B (17), sue- len ir acompahadas de hipergammaglobulinemia y autoanticuerpos — contra una serie de déterminantes propios que no aparecen en la - nefropatfa de IgA. Muy recientemente se ha demostrado la existen­ cia de un factor antinuclear que reacciona en frio, de la dase — IgM en gran parte de estos pacientes, sugiriendo que algunos meca □Lsmos autoinmunes podrfan intervenir en el desarrollo de esta ne­ fropatfa (125). Tanto si la anomalfa primaria residiera en las célu las B, T cooperadoras é en ambas a la vez, se podrfa hipotetizar= que en algun momento de su evolucién estos pacientes tendrfan un= aumento en la diferenciacién de linfocitos T supresores en un in- — 169 — -tento de ccntrapesar la produccién excesiva de IgA. Esto estarfa seguido de una pérdida secundaria de la capacidad de generar con- venientemente nuevas células supresoras que funcionaran adecuada- mente. La presencia de inmunocomplejos de IgA polimérica favorece rfa el proceso. De hecho, 7 de los 27 pacientes estudiados y 12 - de sus familiares mostraron un aumento en el numéro de células su pre8oras OKT-8* en ausencia de estfmulo policlonal alguno. Nuestros hallazgos plantean la cuestién del posible papel del disbalance de células OKT-4*/OKT-8* en el desarrollo y= perpetuacién de la nefropatfa. La mayorfa de los pacientes estu— diados presentaban funcién renal renal normal é discretamente di£ minuida y no pudo establecerse ninguna correlacién entre los estu dios inmunoléglcos y la severidad de la enfermedad. Ahoia bien, es posible que siguiendo a una infeccién viral exista una disminucioi transitoria de la actividad supresora que podrfa conducir a un au mento de la sfntesis de IgA favoreciendo en individuos suoeptiblæ la diferenciacién de linfocitos B en este sentido y probablemente de IgG y a una subsiguiente formacién de inmunocomplejos como se= ha descrito durante los episodios de hematuria macroscépica en la nefropatfa de IgA (155). Recientemente nuestro grupo encontré una correlacién entre los niveles de IgA polimérica y la existencia - de inmunocomplejos de IgA polimérica (195). Los estudios longitu­ dinales de los disüntos subgrupos de linfocitos T en los mismos - pacientes a lo largo del tiempo podrfan ayudarnos a comprender si las alteraciones descritas en este trabajo estan directamente re- lacionadas con anomalfas genéticas de la nefropatfa, mas que una= expresién secundarfa de defectos primaries. Teniendo en cuenta la existencia de nefropatfa de - IgA de caracter familiar y la asociacién ocasional de esta nefri- tis con determinados antfgenos del sistema HLA (45), el estudio - de los familiares préximos de estos pacientes constitufa un grupo interesante para seguir la aparicién cronolégica de las anomalfas inmunolégicas, tal como ocurre en los pacientes lupicos (155). Ya se ha comentado que en algunos parientes otros autores habfan en-; contrado un aumento en el numéro de los linfocitos periféricos per - 170 - tadores de IgA y un factor antinuclear que reaccionaba en frio. - En este sentido, las siete familias estudiadas en este trabajo — aportan datos muy interesantes. En todos los casos, al menos uno de los padres pre­ sentaban e incluso compartian varias alteraciones de las comenta­ das. Curiosamente en una de las familias con dos miembros afectos (padre e hijo), la madré tenfa un aumento en sus niveles séricos= de IgA polimérica, con una produccion normal en su respuesta al -r PWM y una proporcion mayor de IgA polimérica. Las proporciones de de sus células 0KT-4*/0KT-8* eran normales.. Habfa supresién a al tas dosis de Con A, pero se producfa una fuerte supresién a concen­ traciones mayores que no se correspondfa con el comportamiento de los contrôles. Analizando el resto de los miembros de la familia= (dos hijos varones) observâmes un aumento en la produccién in vi­ tro de la fraccién polimérica y una muy ligera dificultad para ge nerar supresores a altas dosis y una total incapacidad a dosis me— nores. El numéro de células con capcidad para unir componente se­ cretorio era muy alta y presentaban simultaneamente un aumento en el numéro de células OKT-4* y OKT-8*, con un fndice normal OKT-4* /OKT-8*. Este defecto se observé en el 50% de los familiares. El— aumento de la ûaccién polimérica sérica aparecié en el 30%, acom pahada en un 85%, de un aumento en la sfntesis in vitro de esta - fraccién. La supresién a altas dosis de Con A era normal, pero fa llaba la regulacién a concentraciones menores, produciendo una — fuerte supresién con una prevalencia de células cooperadoras OKT- 4*. Esto, el aumento en el numéro de células con capacidad para - unir el componente secretorio y el aumento en el numéro de células portadoras de IgA esté a favor de que junto a los genes del HLA é independientemente de ellos, otros genes controlando la respuesta independiente del antfgeno sean necesarios para la aparicién de - la enfermedad. En este sentido, los hallazgos en los pacientes y - sus familiares estarfan en linea con la nueva teorfa a cerca de - la genética de algunas enfermedades inmunolégicas, como es el ca­ so del lupus (155). Segun esta teoria, existirfan dos grupos de - genes. Un grupo controlarfa la funcién de las células T cooperado - 171 - ras y supresoras y el sistema HLA y otro grupo codificaria la ra­ ma eferente del sistema inmunetclases de inmunoglobulinas, forma­ cién de inmunocomple jos y respuesta iiflamatoria. Aunque no esta - claro si esta teoria podrfa ser aplieable a la nefropatfa de IgA= es interesante comentar que ninguno de los familiares que presen­ taron trastornos de inmunoregulacién (primer grupo de genes) te— nfan inmunocomplejos (segundo grupo de genes). Se ha observado un riesgo relativo en el desarrollo de esta nefropatfa asociado a la presencia de antfgenos de células B identificados por aloantisue- ros L y B (53), que no parecen relacionados con la regién HLA-DR. Estudios més amplios en familias permitirfan un conocimiento més= profundo de los aspectos inmunogenéticos que podrfan estar impli­ cados en el desarrollo de esta enfermedad. Tras el andlisis detallado de los resultados aporta- dos por este trabajo y de las caracterfsticas clfnicas e histopa- tolégicas de la nefropatfa de IgA, proponemos la sigiiente. hipéte­ sis para explicar su desarrollo y perpetuacién como tal entidad: " la alteracién inmunolégica y la afectacién renal= propias de esta enfermedad podrfan tener su origen en una infec— cién viral é de otro tipo que en ciertos individuos geneticamente suceptibles determinarfa una diferenciacién de células precursoras para la respuesta de IgA. La caida de supresién transitoria y el= incremento normal en los niveles séricos de IgA polimérica e inmu nocomplejos de IgA y probablemente de IgG y su accién sobre la di ferenciacién de ciertos clones de linfocitos B con una alta suceg tibilidad para la respuesta de IgA. Una vez controlada la infeccioi la hiperactividad de estas poblaciones y el lento aclaramiento de la IgA polimérica en forma de inmunocomple jos por el sistema reti^ culoendotelial y el hfgado crearfan el ambiente adecuado para su= perpetuacién. Estos clones serfan incapaces de alcanzar estadios= de diferenciacién tardios y dar en condicinas normales una res— - puesta generalizada a un estfmulo antigéiico. La diferencacién de células supresoras para este iso tipo qu irfa paralela a la desaparicién del estfmulo antigénico. - 172 - se veria muy dificultada. Las células hiperestimuladas por las c m diciones del medio responderian rapidaxneiite ante pequenos estimulos pero falladan ouando les requerimientos antigénicos fuesen mayores debido a un agotamiento secundario del mécanisme regulador. La ac tividad de las células cooperadoras no estaria controlada, permi- tiendo su libre proliferaciôa y el mantenimiento de les elevados= niveles de produccion de IgA polimérica en estes pacientes. Los niveles de inmunccomplejos de IgA polimérica c± culantes y su tamano determinarxan su deposito en el mesangio re*- nal y la aparicion de las lesiorEs clinicas e histolôgicas propias de la enfermedad. El fallo del fine mécanisme regulador de la sLntesjs de IgA determinarfa un reajuste global del sistema inmune para m m tener su funcionamiento dentro de unos mârgenes de respuesta^ ace# tables. Esto se traducirfa en el aumento global de células T. regu ladoras y la estimulacion de la sintesis de IgG e IgMaciertas c m centracibnes mitogénicas. Le aqul, que la.mayoria de les pacientes con nefropatia de IgA no tengan ninguna alteracién clinica que — evidencie la existencia de la enfermedad. Il CONCLU- SiONES f ; ■■■ - 173 - 6.- CONCLUSlONES 1.- Los pacientes con nefropatfa de IgA presentan "in vitro" un - aumento especffico de la sfntesis de IgA en respuesta a la e^ timulacién policlonal de mitégeno Pockeweed (PWM). 2.” El anélisis cualitstivo révélé que la IgA sintetizada en res— puesta al PWM tenfa caracteristicas bioquxmicas de verdaderas moleculas poliméricas. Su proporcion era sensiblemate mayor,- que la sintetizada por los contrôles en las mismas condiciones 3 Este aumento en la proporcién de IgA polimérica iba acompana- do de un aumento en los prcentajes de células sintetizadoras= de IgA con capacidad para unir componente secretorio y en el= numéro de células portadoras de esta inmunoglobulina en su su p e r f i d e . 4.- La respuesta para la sintesis de IgA esta condicionada por un defecto en la diferendacién de algunos clones implicados en - la sintesis de IgA. Estos pacientes exhiben una proporcion ma yor de células conteniendo cadena J, antes y después de su es timulacion policlonal. Pero mientras la proporcién de células= sintetizadoras de IgG e IgM con este marcador disminuye en — respuesta al raitégeno, la IgA permanece aumentada. La cantidad total de células sintetizadoras de IgA, IgG e IgM antes y de^ pués de la estimulacion policlonal es similar a la de los con troles. 5.- La presencia de un suero anticadena J humana en un cultive de células mononucleares obtenidas de sangre periférica de suje- tos control détermina una modificacién de la sintesis de inmu noglobulinas en funcién del grado de diferenciaciôn de las po blaciones celulares implicadas en su biosintesis, 6.- El drastico cambio en la sintesis de IgA e IgM in vitro en — - 174 - presencia de un suero anticadena J humana experimentada por - los pacientes con nefropatia de IgA sugiere una incapacidad - por parte de algunos clones celulares implicados en la sinte- sis de este isotipo para alcanzar estadios de diferenciacion= tardios y dar una respuesta generalizada normal a ]a activa— — cion policlonal. 7.- Los pacientes con nefropatia de IgA manifiestan una relativa= prevalencia de células T cooperadoras OKT-4^ sobre las célu— las T supresoras OKT-8'*’, con unos niveles normales de células T totales OKT-3*. 8.- Esta predominancia va acompanada de un aumento en la actividad cooperadora de los linfocitos T especifica para la sintesis - de IgA en respuesta al PWM. En algunos casos, el incremento - de esta actividad es consecuencia de una incapacidad de la cé lula B para ser regulada 6 de la exprèsion de ambos defectos= a la vez. 9.- Los pacientes con nefropatia de IgA manifiestan un trastorno= especifico en el comportamiento de las células supresoras in- ducidas por la Con A, para la sintesis de IgA, que va acompa- nado de una estimulacién de la sintesis de IgG e IgM a ciertas dosis mitogénicas. Esta alteracion es consecuencia de un de— fecto primario en la diferenciacién y actividad de células — cooperadoras OKT-4^, con una pérdida secundaria de la capaci­ dad generadora de células supresoras OKT-8^ en respuesta a la Con A. 10.- El suero de los pacientes con esta enfermedad produce un in— cremento especifico de la sintesis de IgA en cultives de lin- focitos control estimuladcs con PWM. Este efecto va acompana- do de un aumento en la proporcion de células cooperadoras CKT -4*. Su presencia induce un fallo en la generacion de células suprèsors8 OKT-8^, con una profunda al+eracion de la propor— - 175 - clones de células reguladoras en respuesta a la Con A. Expe--- riencias paralelas demostraron que tanto la IgA polimérica — aislada de miel ornas de IgA, como los agregados de esta inmuno­ globulina y de IgG, poducfan una fuerte alteracién de la acti^ vidad supresora,an la misma situacién. Estes resultados son - compatibles con la existeicLa de ciertos factores (IgA polimé­ rica, inmunocomplejos de IgA polimérica y de IgG) en el suero de estos pacientes que contribuyer. al desarrollo y perpétua— cion de las alteraciones inmunologicas propias de esta enfer­ medad . 11.- El estudio de los familiares préximos a los pacientes con ne fropatia de IgA révélé la existencia de un porcentaje varia— ble de alteraciones inmunolégicas, segün los aspectos estudia dos. Entre estos destacan: la sintesis aumentada de IgA poli­ mérica, la existeijcia de un incremento en el numéro de linfo- citos T cooperadores OKT-4* y T supresores OKT-8^ y un fallo= generalizado de la activikd supresora inducida por dosis de - Con A inferiores a 10 jig/ml. 12.- La falta de inmunocomplejos de IgA e IgG en los familiares - con trastornos de inmunoregulacién y la trasmisién vertical - de las alteraciones nos sugiere la existencia de algun otro - factor desccnocido, junto a una cierta suceptibilidad genéti- ca,asociada é independiente de la expresién de los genes del= HLA, para el desarrollo de la nefropatia de IgA. BIBÜO - GRAFIA - 17b - 7.- BIBLIOGRAflA 1.- Abney E.R. Cooper D.D. Kearney J.E. Lawton A.R. y Parkhouse - R.M.E. (1978): J. Immunol. 120, 2041. 2.- Adolfini M . Glynn A.A. Lindsay S. Milme C.M. (1966): Imalunolo gy ID, 517. 3.- Alarcon-Segovia D. y Ruiz Arguelles A. (1978): J.Clin. Invest 6 2 , 1360. 4.- Andre C. Berthoux ?.C. Andre P. Guillon J. 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