UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular OBTENCIÓN DE BIOCATALIZADORES PARA LA SÍNTESIS ENZIMÁTICA DE GLICOESTRUCTURAS DE INTERÉS BIOLÓGICO EN CONDICIONES SOSTENIBLES MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Carlos Santiago Bayón Sánchez Bajo la dirección del doctor María José Hernáiz Gómez-Degano MADRID, 2013 © Carlos Santiago Bayón Sánchez, 2013 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR I “OBTENCIÓN DE BIOCATALIZADORES PARA LA SÍNTESIS ENZIMÁTICA DE GLICOESTRUCTURAS DE INTERÉS BIOLÓGICO EN CONDICIONES SOSTENIBLES” TESIS DOCTORAL Por: CARLOS BAYÓN SÁNCHEZ Realizada en el Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica Facultad de Farmacia Directora: Dra. María José Hernáiz Gómez-Dégano Madrid, 2013 Dª. MARÍA JOSÉ HERNÁIZ GÓMEZ-DÉGANO, Profesora Titular del Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de la Universidad Complutense de Madrid (UCM) y Directora del Grupo de Investigación Biotransformaciones de la UCM (920227) HACE CONSTAR: Que el trabajo presentado por D. Carlos Bayón Sánchez para aspirar al grado de Doctor con título: “Obtención de biocatalizadores para la síntesis de glicoestructuras de interés biológico en condiciones sostenibles”, reúne, bajo mi punto de vista, las características necesarias para alcanzar dicho objetivo, pues, en primer lugar, presenta claramente los Objetivos por alcanzar, que posteriormente son desarrollados de forma completa por lo que respecta a Resultados y Discusión y explicados de manera clara en la sección de Materiales y Métodos. A la luz de lo expuesto en la Tesis Doctoral, es evidente que el doctorando domina correctamente las Técnicas Experimentales empleadas, y por otra parte, la Bibliografía empleada es amplia y bien actualizada. El trabajo es muy valioso pues utiliza diferentes tipos de enzimas para las síntesis de glicoestructuras con interés biológico en condiciones sostenibles y su posteriormente implicación en procesos reconocimiento molecular. Por todo ello informo muy favorablemente acerca de la mencionada Tesis Doctoral, por lo que bajo mi opinión procede la exposición y defensa de la misma. Prof. Dra. Dª María José Hernáiz Gómez-Dégano Prof. Dra. Dª.María J. Hernáiz GómezDégano, Profesor Titular. Dpto de Química Orgánica y Farmacéutica. Facultad de Farmacia. Univ. Complutense de Madrid. Ciudad Universitaria, Plaza de Ramón y Cajal, s/n. E-28040 MADRID, ESPAÑA. Tel. nº. +34-913941821. Fax nº. +34-913941822. E-mail: mjhernai@ucm.es http://www.ucm.es/info/btg/ Parte de los resultados que se expresan en esta Memoria han sido expuestos en diferentes congresos nacionales e internacionales y han dado lugar a las siguientes publicaciones: Publicaciones Bayón, C., Cortés-Cabrera, A., Berenguer, J., Hernáiz, M.J. Highly efficient enzymatic synthesis of Galβ-(1→3)-GalNAc and Galβ-(1→3)-GlcNAc in ionic liquids. Tetrahedron 69 (2013), pp. 4973-4978 Bayón, C., Cortés-Cabrera, A., Aires-Trapote, A., Civera, C., Hernáiz, M.J. Highly efficient and regioselective enzymatic synthesis of β-1→3 galactosides in biosolvents. Aceptado en revista RSC Advances. In Press. Treviño, J., Bayón, C., Ardá, A., Marinelli, F., Gandolfi, R., Molinari, F., Jimenez- Barbero, J., Hernáiz, M.J. New Insights into the Glycopeptide Antibiotics Binding to Cell Wall Precursors using SPR and NMR spectroscopy. Enviado. Sandoval, M., Navarrete, S., Bayón, C., Langerwisch, U., Berenguer, J., Mateo, C., Guisán, J., Hernáis, M.J. Immobilization of β-galactosidase from Thermus thermophilus onto agarose supports for N-acetyllactosamine synthesis in presence of ionic liquids. Enviado. Congresos Bayón, C., Navarrete, S., Ruiz, L., Sandoval, M., Berenguer, J., Hernáiz, M.J. High- yield enzymatic synthesis of gal β-(1→3) galnac and gal β-(1→3) glcnac using recombinant β-galactosidase from Bacillus circulans. ICS 2012. 26th International Carbohydrate Symposium. Madrid. España. Comunicación oral. Bayón, C., Treviño, J., Ardá, A., Gandolfi, R., Marinelli, F., Molinari, F., Jimenez- Barbero, J., Hernáiz, M.J. Binding of glycopeptide antibiotics to cell wall analogs using SPR and NMR spectroscopy. ICS 2012. 26th International Carbohydrate Symposium. Madrid España. Poster. Ruiz, L., Navarrete, S., Sandoval, M., Bayón, C., Aires, A., Rumbero, A., Berenguer, J., Hernáiz, M.J. Influence of green solvents on enzymatic activity of free and inmobilized TTP0042 recombinant β-galactosidase from Thermus thermophilus. ICS 2012. 26th International Carbohydrate Symposium. Madrid. España. Poster. Aires, A., Muelas, D., Bayón, C., Treviño, J.;Ardá, A., Jimenez-Barbero, J., Rumbero,A., Hernáiz, M.J. Synthesis of new glycodendrimers by click chemistry and binding studies. ICS 2012. 26th International Carbohydrate Symposium. Madrid (Spain). Poster y Comunicación Flash presentada por Aires, A. Manuel Sandoval, Carlos Bayón, Sergio Navarrete, Álvaro Cortés-Cabrera, Pedro Lozano, José Berenguer, José V. Sinisterra, María J. Hernáiz. “Influence of ionic liquids on enzymatic synthesis of β-galactosidases: a Surface Plasmon Resonance and molecular modeling analysis”. Biotrans 2011. Sicilia. Italia. 10th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations. Bayón, C., Aires, A., Sandoval, M., Zambelli, P., Rumbero, A., Sinisterra, J.V., Hernáiz , M.J. “Influence of green solvents on enzymatic activity of free and inmobilized b-galactosidases from Bacillus circulans”. APIB 2011. Active Pharmaceutical Ingredients from Biotechnology: from research to industrial and regulatory issues Sergio Navarrete Serradilla, Laura Ruiz Ruiz Paolo Zambelli Manuel Sandoval Barrantes Carlos Bayón Sánchez. “Síntesis enzimática de oligosacáridos y glicoconjugados de interés terapéutico”. VII Jornadas de Investigación de pregrado en Cc. de la Salud. UCM 2011 Carlos Bayón Sánchez, Javier Tomé Alcalde, María José Hernáiz Gómez-Dégano, José Vicente Sinisterra Gago. “Búsqueda de nuevas glicosidasas. Caracterización de una nueva β-fucosidasa de Cellulomonas gelida”. Poster. III Congreso de Microbiología Industrial y Biotecnología Microbiana. 2010. Alcalá de Henares. (España) Bayón, C., Hernáiz, M.J., Sinisterra, J.V. “Detection and purification of a new β- fucosidase enzyme in Cellulomonas gelida” Poster. Biotrans 2009. Berna (Suiza). 9th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations. Oviedo. Bern. Switzerland. Almendros M., Bayón C., Afonso D., Fernandez-Lucas J., Clavijo E., de Regil R., Martín-Gonzalez I., Hernáiz M.J., Sinisterra J.V. “New microorganisms active in the production of enzymes with industrial interest”. 4th International Congress on Biocatalysis (Biocat 2008). Hamburg. Germany. Aceptado como comunicación oral. Trujillo R., Pelaez P.P., Bayón C., Sinisterra J.V. “New lipase producer microorganisms isolated from Peruvian Amazonia”. Poster. Biotrans 2007. 8th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations. Oviedo. Spain. Agradecimientos Me gustaría expresar mi más sincero agradecimiento: A la Dra. María José Hernáiz, Profesora Titular del Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid, y Directora del Grupo de Biotransformaciones, por la dirección de este trabajo, por su confianza y por su paciencia, por haberme guiado por el mundo de la ciencia y la investigación, y sin la cual, esta Tesis nunca se hubiera podido realizar. Al Dr. José Vicente Sinisterra, anterior Catedrático del Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid, Director del Grupo de Biotransformaciones y Director del Servicio de Biotransformaciones del Parque Científico de Madrid, por acogerme en el grupo de investigación, por su confianza, su guía y sus consejos, no solo en ciencia, sino en la vida misma.. Al Dr. Andrés Alcántara, Profesor Titular del Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid, y Director del Grupo de Biotransformaciones, por su apoyo, por todo lo que me ha enseñado, pero sobre todo, por su simpatía y buen humor, capaz de iluminar el laboratorio solo con una frase. A la Dra. Isabel de la Mata, Profesora del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I de la Facultad de Biología de la Universidad Complutense, por tutelar este trabajo, y al Dr. Miguel Arroyo, Profesor del mismo Departamento, por su disposición para ayudarme en todo momento. A la Dra. Amalia Rodríguez Bayón, por su confianza y su apoyo, aunque no pudo llegar a ver esta Tesis terminada, confío en que pudiera sentirse orgullosa. Agradecimientos A todos los Profesores del Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica, en especial al Dr. José María Sánchez-Montero, Dra. María Fernández, Dra. María Teresa Ramos, Dra. Pilar López-Alvarado, Dra. Mercedes Villacampa, Dra. Mercedes Grande, Dra Nieves Cabezas, Dr. Giorgio Giorgi, Dr. Juan Francisco González, y al personal no docente, Ana, Jesús y Marisa, todos ellos siempre me han ayudado y animado durante estos años. Al Dr. José Berenguer, Director del Laboratorio de Biotecnología y Genética de Bacterias Termófilas Extremas del Centro de Biología Molecular–Severo Ochoa, por recibirme en su laboratorio para realizar algunos de los apartados más importantes de esta Tesis, por su cercanía, por sus consejos y orientación. También quisiera expresar mi agradecimiento a su excelente equipo, por su ayuda y por hacerme sentir como uno más en su laboratorio: al Dr. Aurelio Hidalgo, siempre dispuesto a ayudarme para encontrar la solución a los problemas, a Eloy, Emilio, Carlos, Carol, Akbar, Alba, Noé, Esther, Mariajo y en especial, a Laura, eje motor de ese grupo, por su disponibilidad total, su ayuda sin condiciones y su amistad. Al Dr. Ángel Rumbero, Profesor Titular de la Facultad de Ciencias de la Universidad, Autónoma de Madrid, por haberme recibido en su laboratorio y sobre todo por su inestimable ayuda y consejos en los procesos de síntesis química y de interpretación de Resonancia Magnética Nuclear. A su equipo, David, Rubén y en especial, a Antonio, quien me ha ofrecido siempre su ayuda desinteresada y gracias a él he podido solucionar más de una situación imposible, y por lo más importante, su amistad. Al Dr. Francesco Molinari, Profesor de la Sección de Microbiología Industrial del Departamento de Ciencia y Tecnología Alimentaria y Microbiológica, Universidad de Estudios de Milán (Italia), por recibirme en su laboratorio y por la colaboración entre nuestros grupos de Investigación, por la confianza que siempre ha depositado en mí y por hacer que la ciudad de Milán ocupe un hueco importante en mi corazón. Agradecimientos Al Dr. Woody Fessner, Profesor del Instituto de Química Orgánica y Bioquímica de la Universidad Técnica de Darmstadt (Alemania), por acogerme en su laboratorio para llevar a cabo la funcionalización de glicodendrímeros. A todo su equipo, en especial a la Dra. Ning He, por su paciencia y sus consejos. A la comunidad de españoles que me adoptaron durante mi estancia en Darmstadt, en especial a Juan, Leo y Jorge, por haberme hecho sentir en familia en todo momento. Gracias. A todas las personas con las que he tenido la oportunidad de coincidir en el Parque Científico de Madrid, desde su propio personal, Rubén, Mota, Laura, Oscar y en especial Gustavo. A las distintas empresas allí alojadas: de ProAlt, Juán, José, Carmen, Paula, Laura y muy especialmente a Mari, por su ayuda, enseñanzas, apoyo y su amistad. A las chicas de Decantum, Ana y Macu, por todos sus consejos y por los buenos momentos que hemos pasado. A mis compañeros del Servicio de Biotransformaciones, a Marcos, mi primer compañero de Doctorado, que tantas cosas hemos pasado juntos, a Nacho, José y Clara, y especialmente a Tomé, gran amigo y mejor persona, y Sara, por su paciencia, ayuda y entrega por los demás, todo un ejemplo a seguir. A mis compañeros de laboratorio de la Facultad de Farmacia, empezando por mis predecesores, Javi, María y Pilar, por su guía, consejos, apoyo y amistad. A Manuel, por sus enseñanzas. A Mario, por su ayuda en esta última etapa. A Laura y Sergio por su colaboración en esta Tesis. A los alumnos extranjeros, Paolo, Roberta, las Alessandras, Spela, por los buenos momentos. Al resto de alumnos del Departamento, Ricardo, Fran, Lena, la comunidad italiana e india, y en especial, a Vero, por su ayuda desinteresada y su apoyo. Agradecimientos A mi maestro y amigo Manu, que me inició en el mundo de la investigación y me enseñó todo lo que sé sobre microbiología y otras tantas artes. A mis amigos de la Carrera, en especial a Marta, modelo de esfuerzo y perseverancia, seguir su ejemplo ha hecho que esta Tesis exista, a Irene y Carlos, mis dos fantásticos, amigos como ellos no se encuentran fácilmente, a Inés y Alfonso, por todos esos incontables momentos, en breve seremos familia, a Jorge y Cris, cuando la amistad es para siempre, no importa dónde estemos cada uno, a Nuria, por su apoyo en todo momento. A todos los demás, que son tantos que no les puedo nombrar. Al grupo de Doctorandos del Departamento de Zoología, por los buenos momentos, por su amistad, y sobre todo, por la comprensión, en especial a Sheila, Luis, Bea, Sofía, Samu, Antón, Pablo, Miren, Jasper, Joaquín y todos los demás. A mis amigos de toda la vida, Lorenzo y Javi, porque nos veamos más o nos veamos menos, parece que no pasa el tiempo. A Ale, mi amigo, mi hermano, por todos los momentos que hemos pasado juntos a lo largo de estos años, por comprenderme y por estar ahí siempre. A Sandra y Alfredo, por su amistad. A Odín y su Canal, por los buenos ratos que me han hecho pasar. A los padres de Cristina, José y Lola, por acogerme en su familia desde el primer día, por hacerme sentir como en casa siempre. A Adela, por su simpatía y amistad, por su disposición a ayudarme en todo momento. A mi familia, en especial a mi madrina, siempre pendiente de mí, y a mi abuela, que le habría encantado poder ver este momento. Agradecimientos A mis gatas, Nix y Lilith, por su compañía y porque sus ronroneos cuando se subían sobre mis piernas mientras escribía eran el mejor bálsamo, aunque ellas no lo supieran (o sí). A Cristina, por su apoyo incondicional, por su cariño sin medida, por estar ahí siempre, con una sonrisa en los momentos buenos y con una sonrisa mayor en los malos, por aguantarme en estos meses de locura, y por tantas cosas que no podría terminar de escribir, así que lo resumiré en una: por ser ella. A mis padres. No hay palabras para agradecer todo lo que han hecho por mí a lo largo de mi vida. Su cariño sin fin, su apoyo en todo, incluso en las ideas más extrañas, como estudiar Biología. Siempre preocupados por darme lo mejor, ellos han hecho que me haya convertido en la persona que soy. Jamás podría devolverles ni una pequeña parte de todas las cosas que les debo, así que les dedico lo más valioso que he conseguido, esta Tesis, fruto de todo el esfuerzo y confianza que han depositado en mí, y es que es tan suya como mía. “Una obra nunca se termina, solo se abandona” Leonardo da Vinci “Qué extraño destino sufrir tanto miedo y tanta duda por algo tan pequeño” El Señor de los Anillos. J.R.R. Tolkien A Cristina A mis padres Abstract ABSTRACT Obtaining of biocatalysts for the enzymatic synthesis of biologically interesting glycostructures in green conditions Introduction Glycostructures present on the cell surface are involved in many biological processes such as cell-cell recognition and communication, growth regulation and antibody interaction, bacterial and viral infection and other crucial intercellular recognition events.(Hakomori 2004; Niederer y col. 2005; Yanagisawa y col. 2009; Yagi y col. 2010). An example of a key carbohydrate structure is galacto-N-biose (Gal-β-(1-3)- GalNAc) which is integrated in the Tn antigen that is associated to carcinoma cells, or lacto-N-biose (Gal-β-1-3-GlcNAc), the critical disaccharide of Lewis antigen (sLea), which has been reported to be a ligand in metastasis of cancer cells.(Springer 1984; Takada y col. 1993; Rapoport y col. 2003; Holeman y col. 2004; Caines y col. 2008; Shirato y col. 2008; Mandal y col. 2010). As well, sialic acids such as N- acetylneuraminic acid (Neu5Ac) or N-glycolylneuramic acid (Neu5Gc), are naturally occurring as the most abundant outermost carbohydrates in vertebrates or as cell- surface components in certain types of bacteria (Malykh y col. 2001; He y col. 2011). The study of molecular processes involving carbohydrates requires the development of tools for multivalent presentation. Multivalency, defined as the multiple and simultaneous interaction between two systems (molecular aggregates, viruses, cell surfaces, etc.), entails a large increase of the binding affinity, compared to its monomeric equivalent (Krishnamurthy y col. 2006). Glycodendrimers are among the most used multivalent systems, and are very interesting for the efficient multivalent presentation of biological ligands, such as carbohydrates (Munoz y col. 2009). Abstract Lipoglycopeptides are an important class of glycostructures with antibiotic function produced by actinomycetes. They act by blocking the synthesis in bacterial cell walls, by binding the peptidoglycan precursors (Nicolaou y col. 1999). Vancomycin and teicoplanin have been in clinical use since 1958 and 1988, respectively. They still represent the drugs of last resort against multi-resistant enterococci and methicillin resistant staphylococci (Parenti y col. 1978). The emergence of resistance to lipoglycopeptides among enterococci and more recently, the occurrence of the first two highly vancomycin resistant Staphylococcus aureus isolates, has prompted the search for second generation drugs of this class (Gandolfi y col. 2007; Perichon y col. 2009). There is a great interest in the synthesis of glycostructures in order to deepen our knowledge of their biological functions. Organic chemical methods for obtaining them have been developed, but they involve several elaborate protection and deprotection procedures and the use of toxic reagents (Lemieux y col. 1975; Schmidt y col. 1980; Paulsen 1982; Khare y col. 1985; Schmidt 1986; Wilstermann y col. 1995). Furthermore, biocatalysis is an attractive prospect for the synthesis of compounds in mild reaction conditions, biodegradable and environmentally acceptable catalyst, and tend to occur with high regio-, chemo-and stereoselectivity (Sheldon y col. 2004; Alcalde y col. 2006). To perform the enzymatic synthesis of oligosaccharides and glycoconjugates can be used mainly three types of enzymes: glycosidases, glycosynthases and glycosyltransferases (Perugino y col. 2004). Recently, green solvents have received increasing attention as new co-solvents for biocatalytic organic synthesis in general, and in carbohydrate chemistry in particular because of their less toxic properties. It has been shown that the use of this kind of solvents, such as solvents derived from biomass or ionic liquids (ILs), as co-solvents in the enzymatic reaction, lead to a variation of the enzyme activity. (Ryu y col. 1992; Tawaki y col. 1992; Kamat y col. 1993; Wescott y col. 1993; Hernaiz y col. 2010; Perez y col. 2010; Pérez-Sánchez, Cortés-Cabrera, y col. 2011; Pérez-Sánchez, Sandoval, y col. 2011; Perez-Sanchez y col. 2012; Sandoval y col. 2012) Abstract Objectives 1. Search for glycosidase producing mesophilic and thermophilic microorganisms useful in the synthesis of biologically interesting oligosaccharides. 2. Cloning and characterization of the β-Gal-3 enzyme from Bacillus circulans ATCC 31382 applied to the synthesis of biologically interesting disaccharides. 3. Enzymatic synthesis of biologically interesting disaccharides (Gal-β (1-3)- GlcNAc and Gal-β (1-3)-GalNAc) using the β-Gal-3 enzyme from Bacillus circulans ATCC 31382 in the presence of green solvents. 4. Structural analysis by fluorescence spectrometry and molecular modelling of the effect of green solvents on reactions catalyzed by the β-Gal-3 enzyme from Bacillus circulans ATCC 31382. 5. Immobilization of the β-Gal-3 enzyme from Bacillus circulans ATCC 31382 using different approaches (macroporous polymers activated with epoxide groups and glyoxyl agarose activated with aldehyde groups). 6. Obtaining of glycosynthases useful in the synthesis of glycoconjugates (β-Gal-3 from Bacillus circulans ATCC 31382 and D327G TmGalA Thermotoga maritima) and characterization of the effect of green solvents on enzyme activity. 7. Using of glycosyltransferases or sialyltransferases (α2,6SiaT and, α2,3SiaT Photobacterium sp) for the synthesis of sialic acid functionalized glycodendrimers. Abstract 8. Enzymatic modification using glycosidases, lipases, proteases and oxidases of different glycopeptide antibiotics: Teicoplanin, Mideplanin, Dalbavancin, MDL- 63,426 y A-40926. 9. Study of glycopeptide antibiotics interactions with bacterial peptidoglycan precursors and hydrophobic chains using Surface Plasmon Resonance (SPR). Chapter 1: Search for glycosidases useful for the synthesis of biologically interesting oligosaccharides A screening for glycosidase producing microorganisms had been developed from a bacteria collection composed by 122 mesophilic organism. A β-fucosidase enzyme from Cellulomonas gelida was purified and characterized for the first time. The production of this enzyme was inducible by cellobiose and showed high activity for the hydrolysis of β-fucose residues in mesophilic conditions (309.63 IU/mg ). A search for glycosidases and glycosyltransferases was carried out in the genome of the thermophilic bacteria Thermus thermophilus PRQ25. Six putative genes were cloned in E. coli BL21 and E. coli Rosetta-Gami2, resulting in the proper production of all of them. The activity of the six enzymes was characterized, obtaining for the first time an α-glucosidase from this bacteria strain. The enzyme showed high activity in the hydrolysis of α-glucose residues in thermophilic conditions (257 IU/mg). Chapter 2: Synthesis of biologically interesting disaccharides using glycosidases The β-Gal-3 enzyme from Bacillus circulans ATCC 31382 had been cloned in E. coli BL21. Its optimal reaction conditions were studied, obtaining an optimum pH of 6 and a temperature of 37 °C in 50 mM sodium buffer. In transglycosylation reactions, the enzyme was able to synthesize Gal-β(1-3)-GlcNAc and Gal-β(1-3)- Abstract GalNAc using pNP-β-Gal as donor and GlcNAc or GalNac as acceptors, showing a maximum yield of 51% and 49% respectively for each disaccharide after 3 h. The effect of green solvents, such as solvents derived from biomass and ionic liquids (ILs), as reaction co-solvents was analyzed. Solvents derived from biomass enhanced the specificity of the transglycosylation reaction catalyzed by β-Gal-3 towards the synthesis, reaching a yield in the production of Gal-β(1-3)-GlcNAc and Gal-β(1-3)- GalNAc of 99 and 95% respectively with the solvent S13 (a dimethylamide derivative), detecting an optimal concentration of the co-solvent of 2 M. Moreover, ILs used as co-solvents in transglycosilation reaction also increases the yield of the synthesis of Gal-β(1-3)-GlcNAc and Gal-β(1-3)-GalNAc, obtaining the best result with [Bmim][PF6], which showed a yield of 97% in the synthesis of both disaccharides, with an optimal concentration of the co-solvent of 30%. An scaling up process of the disaccharides Gal-β (1-3)-GlcNAc and Gal-β (1-3)- GalNAc production, using the enzyme β-Gal-3 in presence of the solvent derived from biomass S13 and the IL [Bmim][PF6], was developed. We set up the conditions for the recovery of co-solvents, allowing their reuse, and the separation of the different reaction products, obtaining a final product yield after purification of 85% of β(1-3) disaccharide with S13 and 88% with [Bmim][PF6]. The effect of solvent S13 and [Bmim] [PF6] on the β-Gal-3 structure was studied by molecular modelling techniques and fluorescence spectroscopy. Using concentrations of 2 M and 30% respectively, these co-solvents cause structural modifications which increase the affinity of the substrate for the active site of the enzyme, and decrease the affinity of the aqueous phase for them, increasing the time that they remain located in optimal reaction distance. β-Gal-3 enzyme had been immobilized using two different strategies: macroporous polymers activated with epoxy groups, and glyoxyl agarose activated with aldehyde groups, obtaining the best results with the latter. Immobilization of the enzyme on Abstract glyoxil agarose support was total and showed a maintenance of the activity of 86% compared to the free enzyme, carrying out the process of immobilizing the stabilizing agent in the presence of PEG-600. Transglycosylation reactions were carried out using immobilized β-Gal-3 on glyoxyl agarose for the synthesis of Gal- β(1-3)-GlcNAc and Gal-β(1-3)-GalNAc. Yields obtained in only buffer were 34 and 30% respectively, in presence of S13 2M were 29 and 55%, and in presence of [Bmim][PF6] 30% were 74 and 91% respectively. Immobilization of the enzyme β-Gal-3 on glyoxyl agarose allowed the recovery by centrifugation and reuse of the biocatalyst. Reusing reactions were carried out for the synthesis of Gal-β(1-3)-GlcNAc in three different reaction media: only buffer, adding S13 2M and adding [Bmim][PF6] 30%. In reuse number 10, the biocatalyst maintained a synthetic activity of 55% in the reaction with only buffer, a 67% with S13, and a 76% with [Bmim][PF6]. In reuse number 20 the biocatalyst reacting in only buffer and S13 were no longer active, but the enzyme in [Bmim][PF6] media retained a 62% of activity. In the reuse number 40 among immobilized enzyme reacting in [Bmim][PF6] media retained a 30% of activity. The IL [Bmim] [PF6] 30% used in the reaction with the enzyme β-Gal-3 immobilized on glyoxyl agarose as co-solvent, offered the best yields in the synthesis of disaccharides, allowed more reuses and also, as being not water soluble, could be separated from the reaction media by centrifugation, allowing its reuse and increasing the sustainability of the process. Chapter 3: Synthesis of glycoconjugates using glycosynthases Directed mutagenesis of the catalytic residues in the active site of the enzyme β-Gal- 3 was developed in order to generate glycosynthase enzyme. The substitution of glutamic-233 (nucleophilic residue) for a glycine resulted in an inactive enzyme. To date, there is no description of any glycosynthase derived from GH35 family, to which β-Gal-3 belongs. Abstract For the next studies, TmGalA D327G glycosynthase from Thermotoga maritime was used. Mutagenesis of the enzyme TmGalA and its derivative glycosynthase (TmGalA D327G) were carried out to add a histidine tag to their C-terminal end. His-tag simplified the process of purification and did not affect to their activity, compared with non-tagged versions. TmGalA D327G enzyme uses Gal-β-N3 as donor and pNP-α-Glu or pNP-α-Man as acceptors, for the synthesis of the glycoconjugates Gal-α (1-6)-Glu-α-pNP, and Gal-α (1-6)-Man-α-pNP, obtaining a conversion of the substrate of 55 and 57% in each reaction, and yields in the synthesis of glycoconjugates of 35 and 25% respectively. The effect of green solvents on glycosynthase enzymes was evaluated for the first time, using them as co-solvents of TmGalA D327G in the synthesis of the glycoconjugates Gal-α(1-6)-Glu-α-pNP and Gal-α-(1-6)-Man-α-pNF. Solvents derived from biomass proved to be inadequate co-solvents for these enzymes, due to the low conversion rates obtained. However, ILs improved the synthesis results, obtaining the best results with [Troma] [NTf2], which showed a conversion rate of the starting substrate up to 98 and 97% and a yield in glycoconjugate synthesis of 49 and 80% respectively. Chapter 4: Functionalization of glycodendrimers using sialyltransferases Two sialyltransferases, α2,6SiaT from Photobacterium leiognathi and α2,3SiaT from Photobacterium phosphoreum, were used for the functionalization with sialic acid derivatives (Neu5Ac and Neu5Gc) of six glycodendrimers with different multivalency. Neu5Gc was synthesized in a two-step chemo-enzymatic reaction using an aldolase enzyme. To become recognizable substrates for the sialyltransferases enzymes, Neu5Ac and Neu5Gc were activated with CMP using a CMP-sialate synthetase enzyme. α2,6SiaT was able to complete the reaction with all glycodendrimers, but α2,3SiaT only generated reaction intermediates. The final yield Abstract of the twelve purified products ranged between 42 and 54% compared with the starting glycodendrimers. Chapter 5: Structural modification of glycopeptide antibiotics and study of interactions with peptidoglycan precursors by SPR Structural modifications of glycopeptide antibiotics (Teicoplanin, Mideplanin, Dalbavancin, MDL-63,426 y A-40926) were carried out using glycosidases, lipases, glucose oxidases and serine proteases. None of the tested enzymes showed any positive results, demonstrating the difficulty in finding enzymes which recognize such molecules. SPR analysis and molecular modelling were developed to study the interaction between glycopeptide antibiotics and peptidoglycan precursors, and also the binding of these molecules to hydrophobic surfaces. We demonstrated for the first time that lipoglycopeptides dimerize like vancomycin-type glycopeptides, not in solution, but when are bound to the peptidoglycan precursor, increasing the stability of the union synergistically. This dimerization implies a new model of action for these antibiotics, according to which, the pharmacological effectiveness of these molecules is directly related to its ability to bind to precursors of bacterial cell wall peptidoglycan, the capability to form dimers on the surface stabilized that union and the anchorage to the cell membrane with lipophilic chains reinforces it. References Alcalde, M., M. Ferrer, F. J. Plou and A. Ballesteros (2006). "Environmental biocatalysis: from remediation with enzymes to novel green processes." 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Abreviaturas Listado de abreviaturas Ap: Ampicilina ATCC: Colección americana de cultivos tipo (American type culture collection) BSA: Albúmina de suero bovino (bovine serum albumin) CMP: Citidin monofosfato Cn: Cloranfenicol CSS: CMP-Sialato sintetasa Ctag: Cola de seis hitidinas en el extremo C-terminal de una proteína CTP: Citidin trifosfato DC: dicroísmo circular DH5a: cepa de E. coli DH5a DMF: N,N-dimetilformamida anhidra DMSO: Dimetil sulfóxido DNA: Ácido desoxiribonucleico (Deoxyribonucleic acid) dNTP: Desoxinucleótido trifosfato DT: Tubo de deriva (Drift tube) EDTA: Ácido etilendiamino tetraacético ELSD: Detector de dispersión de luz por evaporación (evaporative light scattering detector) Fru: D-(+)-fructosa Fuc: D-(+)-fucosa Fuc-β-MU: 4-metilumbeliferil-β-D-fucopiranosido Gal: D-(+)-Galactosa Gal: D-(+)-galactosa GalNAc: N-acetil-D-galactosamina GalNH2: D-(+)-galactosamina Gal-β-F: 1-desoxi-1-fluoro-α-D-galactopiranósido Gal-β-N3: β-D-Galactopiranosil azida GDP-Man: Guanosin difosfato-α-D-manosa GlcNAc: N-acetil-D-glucosamina Abreviaturas Glu: ácido glutámico Glu: D-(+)-Glucosa Glu: D-(+)-glucosa HisTag: Cola de seis histidinas en uno de los extremos de una proteína HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución (High performance liquid chromatography) IPTG: Isopropil-b-D-tiogalactopiranósido KA: Constante de asociación KD: Constante de disociación en el equilibrio Kn: Kanamicina LB: Medio de cultivo Luria Bertani LI: Líquido iónico Man: D-(+)-Manosa Man: D-(+)-manosa MES: ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico MeTHF: Metil tetrahidrofurano MRSA: Estafilococos resistentes a meticilina (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) NCBI: Base de datos: Nacional Center for Biotechnology Information Neu5Ac: Ácido N-acetilneuramínico Neu5Gc: Ácido N-glicolilneuramínico Ntag: Cola de seis hitidinas en el extremo N-terminal de una proteína oNF: o-nitrofenol ORF: Marco abierto de lectura (Open Reading Frame) PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase Chain Reaction) PEG: Polietilenglicol pET 22b(+):Plásmido comercial PET 22b(+) (Novagen) pET 24d(+): Plásmido comercial PET 24d(+) (Novagen) pET 28b(+): Plásmido comercial PET 28b(+) (Novagen, Reino Unido) Pfu polimerasa: DNA polimerasa de Pyrococcus furiosus Abreviaturas pNF: p-nitrofenol pNF-α-Fuc: p-nitrofenil-α-D-fucóspiranósido pNF-α-Gal: p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido pNF-α-GlcNAc: p-nitrofenil-α-N-acetilglucosaminopiranósido pNF-α-Glu: p-nitrofenil-α-D-glucopiranósido pNF-α-Man: p-nitrofenil-α-D-manopiranósido pNF-β-D-Man: p-nitrofenil-β-D-manopiranósido pNF-β-Fuc: p-nitrofenil-β-D-fucóspiranósido pNF-β-Gal: p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido pNF-β-GlcNAc: p-nitrofenil-β-N-acetilglucosaminopiranósido pNF-β-Glu: p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido PPi: Pirofosfato inorgánico PSA: Persulfato de amonio psi: Libras por pulgada cuadrada (unidades de presión: pounds per square inch) RMN: Resonancia Magnética Nuclear RMSD: raíz media de desviación de los cuadrados (root mean square deviation) SC: Cámara de spray (Spray Chamber) SDS: Dodecil sulfato de sodio (sodium dodecyl sulphate) SDS-PAGE: Gel de electroforesis de poliacrilamida en presencia de SDS SOC: Medio de cultivo rico en nutrientes para cultivar bacterias sometidas a electroporación SPR: Resonancia de plasmón de superficie STD: Diferencia de transferencia de saturación (Saturation Transfer Difference) TAE: Tampón tris (40 mM) /EDTA disódico (2mM) / ácido acético 0,1142% m/v) Temed: Tetrametiletilendiamina TH: Medio de cultivo para Thermus thermophilus (preparado con agua milli Q) TLC: Cromatografía en capa fina (Thin Layer Chromatography) TmGalA: α-galactosidasa de Thermotoga maritima TRIS: Tris(hidroximetil)aminometano Tth polimerasa: DNA polimerasa de Thermus thermophilus Abreviaturas UDP-Glu: Uridin difosfato-α-D-glucosa UI: Unidad enzimática, equivalente a la cantidad de proteína que cataliza la conversión de un micromol de sustrato por minuto. UV: Ultravioleta VOC: Compuesto orgánico volátil (Volatile Organic Compound) VRE: Enterococos resistentes a vancomicina (Vancomycin-resistant enterococci) VRSA: Estafilococos resistentes a vancomicina (Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) α2,3SiaT: α/β-galactosido α-2,3-sialiltransferasa α2,6SiaT: β-galactosido α-2,6-sialiltransferasa β-Gal-3: β-Galactosidasa-3 de Bacillus circulans ATCC 31382 Índice 1 I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 9 I.1. Importancia biológica de las glicoestructuras ................................................ 10 I.1.1. Oligosacáridos y glicoconjugados ............................................................ 10 I.1.2. Glicodendrímeros: Modelos multivalentes para el estudio de interacciones carbohidrato-proteína ......................................................................................... 15 I.1.3. Glicopéptidos:glicoestructuras con función antibiótica ............................ 17 I.1.3.1. Mecanismo de acción de los glicopéptidos ........................................ 19 I.1.3.2. Resistencia a antibióticos de tipo glicopéptido .................................. 23 I.2. Enzimas útiles en la síntesis de oligosacáridos y glicoestructuras ................. 24 I.2.1. Síntesis de oligosacáridos utilizando glicosidasas .................................... 27 I.2.1.1. β-Galactosidasa β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 ..................... 31 I.2.1.2. Glicosidasas de Thermus thermophilus PRQ25 ................................. 32 I.2.2. Síntesis de oligosacáridos utilizando glicosintasas ................................... 33 I.2.2.1. α-Galactosintasa de Thermotoga maritima ........................................ 36 I.2.3. Síntesis de oligosacáridos utilizando glicosiltransferasas ......................... 36 I.2.3.1. Sialiltransferasas: funcionalización de glicoestructuras con ácidos siálicos ............................................................................................................ 39 I.2.4. Enzimas aplicadas a la modificación de regiones no glicosídicas de glicoestructuras ................................................................................................... 40 I.2.4.1. Lipasas ............................................................................................... 40 I.2.4.2. Serín proteasas ................................................................................... 41 I.2.4.3. Glucosa oxidasas ................................................................................ 41 I.2.5. Procesos de Inmovilización y estabilizacion de enzimas .......................... 42 I.2.5.1. Inmovilización covalente por unión a un soporte: ............................. 43 I.2.5.2. Síntesis de oligosacáridos y glicoconjugados utilizando enzimas inmovilizadas .................................................................................................. 47 I.3. Glicosidasas en disolventes sostenibles ........................................................... 49 I.3.1. Los principios de la química sostenible .................................................... 50 I.3.2. Disolventes Sostenibles ............................................................................. 51 Índice 2 I.3.2.1. El agua ............................................................................................... 52 I.3.2.2. Disolventes orgánicos obtenidos de fuentes renovables .................... 53 I.3.2.3. Disolventes orgánicos de bajo impacto ambiental ............................. 54 I.3.2.4. Disolventes orgánicos fluorados ........................................................ 56 I.3.2.5. Líquidos iónicos (LIs) ........................................................................ 57 I.3.3. Galactosidasas en disolventes sostenibles ................................................ 59 I.3.4. Estudio de la influencia de los disolventes sostenibles en la actividad enzimática .......................................................................................................... 60 I.3.4.1. Espectroscopia de Fluorescencia ....................................................... 61 I.3.4.2. Herramientas de Bioinformática ........................................................ 62 I.4. Estudios de interacciónes moleculares entre glicoestructuras y ligandos ...... 66 I.4.1. Resonancia de plasmón de superficie (SPR) ............................................ 66 I.4.2. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) .................................................... 69 I.4.2.1. Experimentos de diferencia de la transferencia de saturación (STD) 70 II. OBJETIVOS ..................................................................................................... 73 III. RESULTADOS Y DISCUSÓN ....................................................................... 77 III.1. Capítulo 1. Búsqueda de glicosidasas útiles en la síntesis de oligosacáridos de interés biológico ................................................................................................ 78 III.1.1. Selección de organismos mesófilos productores de glicosidasas .......... 78 III.1.1.1. Selección de microorganismos mesófilos productores de glicosidasas .................................................................................................... 79 III.1.1.2. Búsqueda de actividad de transglicosidación con células enteras de organismos mesófilos ..................................................................................... 83 III.1.1.3. Inducción de la producción de β-fucosidasa de Cellulomonas gelida ........................................................................................................................ 85 III.1.1.4. Purificación de la enzima β-fucosidasa de Cellulomonas gelida .... 88 II I.1.1.5. Búsqueda de actividad de transglicosidación con β-fucosidasa semipurificada de C. gelida............................................................................ 97 Índice 3 III.1.2. Búsqueda de termozimas con actividad glicosidasa y glicosiltransferasa ............................................................................................................................ 98 III.1.2.1. Búsqueda de actividades glicosidasa con células enteras de T. thermophilus PRQ25 ...................................................................................... 98 III.1.2.2. Búsqueda de actividades de transglicosidación con células enteras de T. thermophilus PRQ25 ............................................................................. 99 III.1.2.3. Búsqueda de potenciales glicosidasas y gicosiltransferasas en el genoma T. thermophilus PRQ25 .................................................................. 100 III.1.2.4. Amplificación de secuencias de genes de T. thermophilus PRQ25 ...................................................................................................................... 101 III.1.2.5. Producción de termozimas de T. thermophilus PRQ25 ................ 110 III.1.2.6. Caracterización de actividades de termozimas de T. thermophilus PRQ25 .......................................................................................................... 114 III.2. Capítulo 2: Síntesis de disacáridos de interés biológico mediante glicosidasas .......................................................................................................... 118 III.2.1. Producción y puridicación de la enzimas β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 ................................................................................................................ 118 III.2.2. Estudio de potenciales actividades glicosidasa de las enzimas β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 ................................................................................ 122 III.2.2.1. Cálculo de pH óptimo de reacción de β-Gal-3 .............................. 124 III.2.2.2. Termoestabilidad de β-Gal-3 ......................................................... 124 III.2.2.3. Temperatura óptima de reacción de β-Gal-3 ................................. 125 III.2.3. Síntesis de disacáridos catalizada por la enzima β-Gal-3 DE B. circulans ATCC 31382 .................................................................................................... 126 III.2.3.1. Reacciones de transglicosidación en presencia de disolventes sostenibles derivados de biomasa ................................................................. 131 III.2.3.2. Reacciones de transglicosidación en presencia de líquidos iónicos (LIs) .............................................................................................................. 136 III.2.3.3. Escalado de la producción de disacáridos β(1-3) en presencia de S13 y [Bmim][PF6] .............................................................................................. 142 Índice 4 III.2.4. Modelado molecular y docking ............................................................ 146 III.2.4.1. Modelado por homología .............................................................. 146 III.2.4.2. Centro activo de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 ...................................................................................................................... 147 III.2.4.3. Resultados de Docking .................................................................. 148 III.2.4.4. Dinámica molecular ...................................................................... 148 III.2.5. Estudio del efecto del disolvente en la estructura terciaria de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 por espectroscopía de fluorescencia ... 150 III.2.6. Inmovilización de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 ... 152 III.2.6.1. Inmovilización de β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 sobre polímeros macroporosos de tamaño de poro controlado.............................. 153 III.2.6.2. Inmovilización de β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 sobre glioxil agarosas ............................................................................................ 155 III.2.6.3. Síntesis de disacáridos catalizada por la enzima β-Gal-3 inmovilizada en soportes de glioxil agarosa ................................................ 159 III.2.6.4. Reutilización de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 inmovilizada en glioxil agarosa ................................................................... 161 III.3. Capítulo 3: Síntesis de glicoconjugados mediante glicosintasas ............... 165 III.3.1. Mutagénesis dirigida de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 para la obtención de glicosintasas .................................................................... 165 III.3.1.1. Síntesis de disacáridos utilizando las glicosintasas β-Gal-3 E157G y β-Gal-3 E233G ............................................................................................. 168 III.3.2. Síntesis de disacáridos utilizando la enzima mutante TmGalA D327G- HisTag de Thermotoga maritima en presencia de disolventes sostenibles ...... 171 III.3.2.1. Mutagénesis de las enzimas TmGalA y TmGalA D327G de T. maritima para la adición de colas de histidinas ........................................... 171 III.3.2.2. Reacciones con la enzima TmGalA nativa de T. maritima ........... 173 III.3.2.3. Reacciones de transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G-HisTag de T. maritima ..................................................... 174 Índice 5 III.4. Capítulo 4. Funcionalización de glicodendrímeros mediante sialiltransfersas .............................................................................................................................. 186 III.4.1. Síntesis de los sialoconjugados Neu5Ac-CMP y Neu5Gc-CMP ......... 188 III.4.1.1. Síntesis químio-enzimática de Neu5Gc ........................................ 188 III.4.1.2. Activación de ácidos siálicos con CMP ........................................ 191 III.4.2. Funcionalización de glicodendrímeros con derivados de ácido siálico mediante el uso de enzimas sialiltransferasa .................................................... 193 III.4.2.1. Reacciones con la enzima α2,6SiaT de P. leiognathi ................... 195 III.4.2.2. Reacciones con la enzima α2,3SIAT de P. phosphoreum ............. 196 III.4.2.3. Purificación de sialilglicodendrímeros .......................................... 197 III.4.2.4. Caracterización estructural de los 2,6-sialoglicodendrímeros ....... 198 Capítulo 5. Modificación estructural de glicopéptidos y estudio de interacciónes con precursores de peptidoglicano ................................................................... 211 III.4.3. Modificación enzimática de la estructura de lipoglicopéptidos ........... 213 III.4.3.1. Hidrólisis enzimática de la cadena hidrofóbica de lipoglicopéptidos ...................................................................................................................... 213 III.4.3.2. Oxidación enzimática del residuo N-acil-glucosamina de lipoglicopéptidos .......................................................................................... 214 III.4.3.3. Eliminación enzimática del residuo β-GlcNAc de lipoglicopéptidos ...................................................................................................................... 215 III.4.3.4. Eliminación enzimática de residuo α-manosa de lipoglicopéptidos ...................................................................................................................... 215 III.4.4. Análisis de interacción glicopéptido-precursor de peptidoglicano mediante SPR ................................................................................................... 217 III.4.5. Modelado molecular del complejo formado entre glicopéptidos y precursores de peptidoglicano .......................................................................... 221 III.4.6. Análisis de interacción de glicopéptidos con superficies hidrofóbicas mediante SPR ................................................................................................... 224 IV. CONCLUSIONES .......................................................................................... 227 Índice 6 V. MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................... 233 V.1. Materiales ..................................................................................................... 234 V.1.1. Reactivos y disolventes ......................................................................... 234 V.1.1.1. General ........................................................................................... 234 V.1.1.2. Electroforesis .................................................................................. 234 V.1.1.3. Resonancia de Plasmón de Superficie ............................................ 235 V.1.1.4. Disolventes derivados de biomasa ................................................. 235 V.1.1.5. Líquidos Iónicos (LI) ..................................................................... 236 V.1.1.6. Soportes para inmovilización: ........................................................ 236 V.1.1.7. Glicodendrímeros ........................................................................... 236 V.1.1.8. Glicopéptidos ................................................................................. 236 V.1.2. Microorganismos y plásmidos .............................................................. 237 V.1.3. Oligonucleótidos sintéticos ................................................................... 238 V.1.4. Enzimas ................................................................................................. 239 V.2. Procedimientos generales ............................................................................. 240 V.2.1. Métodos microbiológicos ...................................................................... 240 V.2.1.1. Medios de cultivo ........................................................................... 240 V.2.1.2. Revitalización y mantenimiento de la colección BTG ................... 242 V.2.1.3. Crecimiento de microorganismos................................................... 243 V.2.1.4. Transformación bacteriana ............................................................. 244 V.2.1.5. Expresión de proteínas recombinantes en E. coli. .......................... 246 V.2.1.6. Rotura de microorganismos ........................................................... 246 V.2.2. Manipulación de DNA .......................................................................... 246 V.2.2.1. Preparación de DNA total .............................................................. 246 V.2.2.2. Preparación de DNA plasmídico de E. coli.................................... 247 V.2.2.3. Técnicas de amplificación de DNA por reacción en cadena de polimerasa (PCR) ......................................................................................... 247 V.2.2.4. Clonaje de genes ............................................................................ 247 V.2.2.5. Protocolo Quick-Change para generación de mutantes puntuales . 248 Índice 7 V.2.2.6. Secuenciación de DNA ................................................................... 249 V.2.2.7. Electroforesis de en geles de agarosa y purificación de DNA ....... 249 V.2.3. Manipulación de proteínas .................................................................... 249 V.2.3.1. Cuantificación de Proteínas ............................................................ 249 V.2.3.2. Electroforesis de proteínas ............................................................. 251 V.2.3.3. Purificación de β-fucosidasa de C. gelida ...................................... 252 V.2.3.4. Purificación de proteínas recombinantes mediante cromatografía de afinidad ......................................................................................................... 255 V.2.4. Ensayos enzimáticos .............................................................................. 257 V.2.4.1. Determinación de la actividad enzimática de glicosidasas ............. 257 V.2.4.2. Reacciones de transglicosidación ................................................... 263 V.2.4.3. Reacciones con glicosiltransferasas ............................................... 266 V.2.5. Purificación de compuestos ................................................................... 273 V.2.5.1. Extracción del derivado de biomasa S13 ........................................ 273 V.2.5.2. Cromatografía en columna de carbono-celite ................................. 273 V.2.5.3. Cromatografía de intercambio catiónico ........................................ 274 V.2.5.4. Cromatografía en capa fina (TLC) ................................................. 274 V.2.5.5. Cromatografía en columna de sílica gel ......................................... 275 V.2.5.6. Cromatografía de exclusión molecular en Biogel P-2 .................... 275 V.2.5.7. Liofilización ................................................................................... 275 V.2.6. Inmovilización de la enzima Β-Gal-3 de B. circulans........................... 275 V.2.6.1. Inmovilización en polímeros macroporosos ................................... 275 V.2.6.2. Inmovilización en soporte de glioxil agarosa ................................. 278 V.2.7. Tecnicas Analíticas ................................................................................ 280 V.2.7.1. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) .......................... 280 V.2.7.2. Especroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ............ 283 V.2.7.3. Espectroscopía de Fluorescencia .................................................... 283 V.2.7.4. Resonancia de Plasmón de superficie (SPR) .................................. 284 V.2.8. Herramientas informáticas ..................................................................... 287 V.2.8.1. Programas bioinformáticos ............................................................. 287 Índice 8 V.2.8.2. Modelado molecular y docking de la interacción co-solvente-enzima β-Gal-3 ......................................................................................................... 288 V.2.8.3. Modelado molecular y docking de la interacción glicopéptido- precursor de peptidoglicano ......................................................................... 291 VI. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 295 Introducción 9 I. INTRODUCCIÓN Introducción 10 I.1. Importancia biológica de las glicoestructuras I.1.1. Oligosacáridos y glicoconjugados La superficie de las membranas celulares presenta una cubierta de carbohidratos llamada glicocálix, cuya función se creyó durante mucho tiempo que consistía en la protección de la célula contra el medio externo a través de fuerzas de repulsión. Sin embargo, actualmente se sabe que estos oligosacáridos son moléculas que desempeñan un papel muy importante en los procesos de reconocimiento y comunicación celular a través de su interacción específica con diversas proteínas (como las lectinas), actuando como mecanismo de adhesión y señalización celular, generando una respuesta biológica (Lingwood 1998; Schmidt y col. 2003; Rudd y col. 2004). Así, células, toxinas, bacterias, virus y otros microorganismos interaccionan con receptores de la superficie celular, los cuales en muchos casos son glicoconjugados (glicolípidos, glicoproteínas o proteoglicanos, Figura 1). Por ello, un gran número de fenómenos biológicos, tales como la inflamación, procesos tumorales, defensa inmune e infecciones víricas y microbianas están mediadas por carbohidratos (Varki 1993; Dwek 1996; Imberty y col. 2008). Figura 1. Representación de algunas de las interacciones moleculares que ocurren en la membrana celular donde participan glicoconjugados. (Imagen obtenida de la página http://www.ncnr.nist.gov/programs/reflect/cnbt). Introducción 11 Además de su papel como dianas de reconocimiento molecular, los glicoconjugados de la superficie celular pueden ser utilizados como marcadores tumorales. Los llamados antígenos de tipo carbohidrato asociados a tumores (TACA, del inglés Tumor-associated carbohydrate antigens) son el resultado de la glicosilación aberrante causada por los trastornos metabólicos que sufren las células al convertirse en cancerígenas (Heimburg-Molinaro y col. 2011). Un ejemplo de gran trascendencia de este tipo de carbohidratos es el antígeno Thomsen-Friedereich, conocido como antígeno T. Está compuesto por la unión β(1-3) de una molécula de galactosa con una N-acetil- galactosamina (disacárido llamado galacto-N-biosa), unida a su vez a una serina o treonina de una mucina de la superficia celular (Gal-β(1-3)-GalNAc-Ser/Thr, (Figura 2A). Fue descubierto en 1930 como una curiosidad de laboratorio (Van den Akker y col. 1996), sin embargo varias décadas después, ésta molécula y su precursor, el antígeno Tn (GalNAc-Ser/Thr, Figura 2B), se han asociado de manera inequívoca a tumores (Springer 1984; Holeman y col. 2004), llegando a ser expresiones inmunoreactivas del 85% de los carcinomas de pecho, colon, vejiga y próstata, que no aparecen en tejidos sanos (Springer y col. 1990; Van den Akker y col. 1996). En los últimos años se han desarrollado estrategias antitumorales basadas en la obtención de anticuerpos frente a glicopéptidos sintéticos cubiertos de estos epítopos, alcanzando distintos niveles de éxito (Heimburg-Molinaro y col. 2011). O OH HO OH O OH O OH NH Ser/Thr OH O HO O OH NH Ser/Thr OH O A) B) Figura 2. Estructura de algunos disacáridos y glicoconjugados involucrados en procesos de reconocimiento celular: A) Antígeno T; B) Antígeno Tn. Otro disacárido importante es el formado por la unión β(1-3) de galactosa con N- acetil-glucosamina (Gal-β(1-3)-GlcNAc), disacárido también llamado lacto-N-biosa, que compone la base estructural de los antígenos de Lewis de tipo I (Esquema 1). En Introducción 12 individuos sanos se expresan sobre todo en fibroblastos y en el lumen de células epiteliales (Hakomori 2001; Ragupathi y col. 2009), y participan en los procesos de extravasación (Ravindranath y col. 1997). Debido al metabolismo modificado de las células tumorales, se han encontrado en la superficie de células de cáncer de pecho, colon, estómago, páncreas y melanoma (Ravindranath y col. 1997; Ugorski y col. 2002). La sobreexpresión de estos antígenos favorece la metástasis de las células tumorales, debido a su participación en los ya citados procesos de extravasación (Takada y col. 1993). El tratamiento con anticuerpos frente a estos antígenos ha probado ser eficaz para inhibir la metástasis en cáncer de páncreas en ratones, lo que los convierte en interesantes dianas terapéuticas. (Monzavi-Karbassi y col. 2001). o Tipo 1H Tipo 1 Clave: Esquema 1. Formación de antigenos de Lewis a partir de Gal-β(1-3)-GlcNAc mediante fucosidación o sialización La lacto-N-biosa no solo aparece en epítopos de antígenos de la superficie celular, sino que también es un componente fundamental de la lacto-N-tetraosa (Gal-β(1-3)- GlcNac-β(1-3)-Gal-β(1-4)-Glu), tetrasacárido presente en la leche humana al que se atribuyen cualidades prebióticas e inmunomoduladoras (Figura 3) (Murata y col. 2006). Introducción 13 O OH HO OH O OH OHO NH OH O O O OH OH OH HO O O OH OH OH Figura 3. Estructura de la lacto-N-tetraosa (Gal-β(1-3)-GlcNac-β(1-3)-Gal-β(1-4)-Glu) Es frecuente encontrar ácidos siálicos en los extremos de los glicoconjugados de las superficies celulares, ya que median en gran cantidad de procesos de interacción azúcar-proteína y están involucrados en los sistemas de reconocimiento y adhesión celular, componentes sanguíneos, inmunología en infecciones, transmisión de impulso nervioso, regulación hormonal y muchos otros (Schauer 1982). Las bacterias, principalmente las patógenas, también producen lipooligosacáridos o polisacáridos en su pared terminados en ácidos siálicos, que imitan a los del individuo hospedador para pasar desapercibidas a su sistema inmune (Chen y col. 2010). Existe gran variedad de ácidos siálicos en vertebrados, pero los más frecuentes son el ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y el N-glicolilneuramínico (Neu5Gc), que se diferencián por un átomo de carbono en su cadena lateral (Figura 4) (Chen y col. 2010). Una característica que llama la atención es que, a pesar de encontrarse los dos tipos de siálicos en la gran mayoría de células de mamíferos, incluyendo los grandes primates, el Neu5Gc no se encuentra en humanos (Gottschalk 1960). Solo aparece en humanos en células cancerígenas y en las células de los primeros estadíos del feto, por lo que se puede utilixar como marcador tumoral (Malykh y col. 2001). Esta divergencia evolutiva se atribuye a un intento de evadir los sistemas de reconocimiento de los patógenos que infectan al hospedador mediante la interacción con Neu5Gc. Es más, diversos autores sitúan el escenario de esta diferenciación en África, cuando la malaria de los grandes primates (malaria NHH, del inglés Non- human hominids) estaba diezmando las poblaciones del continente y los primeros homínidos humanos dejaron de expresas Ne5Gc para solo producir Neu5Ac, Introducción 14 volviéndose inmunes a la infección del parásito Plasmodium falciparum (Martin y col. 2005). Posteriormente, el parásito evolucionó a su vez, cambiando sus receptores y siendo capaz de reconocer Ne5Ac, apareciendo un nuevo tipo de malaria que solo afecta a humanos (Rich, Leendertz, y col. 2009). Este es un ejemplo de la “carrera de armamentos” que ha impulsado a la evolución desde el origen de la vida, y en el caso de las interacciones entre patógeno y hospedador, los ácidos siálicos de los glicoconjugados juegan un papel fundamental (Varki 2006). Figura 4. Estructuras de los ácidos siálicos A) Neu5Ac y B) Neu5Gc Actualmente, los tratamientos disponibles para muchas de las patologías relacionadas con la interacción y reconocimiento de un patógeno, o bien no son curativos, o presentan problemas debidos a pérdida de eficacia a largo plazo por aparición de resistencias, por lo que son necesario estrategias alternativas para controlar estas patologías (Li y col. 2001; Rubinstein y col. 2001). En este sentido, el desarrollo de inhibidores de los procesos de adhesión en los que están implicadas las interacciones carbohidrato-proteína se ha convertido en un objetivo prioritario para el desarrollo de nuevos sistemas terapéuticos contra los procesos patológicos que median en dichas interacciones (Sears y col. 1998; Yarema y col. 1998; Bertozzi y col. 2001; Rudd y col. 2001; Dube y col. 2005; Bernardi y col. 2008). Para evitar la citada adhesión es necesario entender a nivel molecular las interacciones específicas que tienen lugar entre las moléculas implicadas. No es de extrañar, por tanto, que exista un interés creciente en el estudio de las bases moleculares de los procesos de reconocimiento molecular en los que intervienen los glicoconjugados. A) O COOH NH HO HO OH HO HO O OH B) Introducción 15 Debido a la complejidad que presenta su aislamiento, purificación y caracterización (Hölemann 2004), el estudio de la implicación de estos epítopos en procesos biológicos se ha desarrollado en menor medida si lo comparamos con el de otras biomoléculas como ácidos nucleicos o proteínas. En los últimos años se ha dado una creciente investigación para obtener glicoconjugados específicos en cantidades suficientes para llevar a cabo estudios que determinen su verdadera implicación en procesos tumorales o infectivos, así como miméticos que puedan ser utilizados en la lucha contra estas patologías. Este hecho requiere de la exploración de diversas metodologías de síntesis que permitan preparar éstos epítopos, y análogos de estos, en gran cantidad y un alto nivel de pureza, así como el desarrollo de técnicas para medir las interacciones, y han surgido diferentes estrategias para la obtención de sistemas modelo multivalentes que mimeticen los glicoconjugados presentes en las membranas celulares (Schmidt 1986; Mammen 1998; Kiessling 2000; Nicolaou 2001; Houseman 2002; Kiessling 2002; Hölemann 2004). I.1.2. Glicodendrímeros: Modelos multivalentes para el estudio de interacciones carbohidrato-proteína El estudio de los procesos moleculares en los que participan de forma activa los carbohidratos requiere el desarrollo de herramientas que permitan su presentación multivalente. La multivalencia, definida como la interacción múltiple y simultánea entre dos sistemas (agregados moleculares, virus, superficies celulares, etc), supone un gran aumento en la afinidad comparado con la unión de su equivalente monomérico (Krishnamurthy y col. 2006). Este aumento sinérgico en la afinidad se denomina efecto “cluster” o dendrítico, y se atribuye a un efecto cooperativo entre los diferentes monómeros que componen el sistema (Ehrlich 1979; Lundquist y col. 2000; Turnbull y col. 2002). En la bibliografía se encuentran descritos numerosos modelos de sistemas multivalentes con carbohidratos para el estudio de estos procesos biológicos, cuyo diseño está basado en la imitación de los glicoconjugados naturales que están involucrados en dichos procesos (Houseman y col. 2002). Introducción 16 Estos sistemas artificiales consisten fundamentalmente en soportes de muy diversa naturaleza, sobre los que se unen varias copias del carbohidrato, originando una presentación multivalente del mismo. La unión del carbohidrato al soporte se establece normalmente a través de un espaciador que proporciona el medio de anclaje, así como una separación suficiente entre el soporte y el ligando, para que el primero no interfiera en la interacción. El diseño y preparación de sistemas multivalentes sintéticos de carbohidrato permite un acceso a una cantidad mayor de compuesto y a un mayor control sobre la estructura, la pureza, la naturaleza del soporte, la multivalencia (número de copias de carbohidratos presentes), etc. Entre los sistemas multivalentes más usados cabe destacar los péptidos y proteínas (Davis 2004), los liposomas (Stewart y col. 1993), los dendrímeros (Röckendorf y col. 2001), los calixarenos (Sanchez-Navarro y col. 2011), las ciclodextrinas (Roy y col. 2000), oligómeros y polímeros (Roy 1996) y las nanopartículas (de La Fuente y col. 2001) (Esquema 2). Esquema 2. Sistemas polivalentes para el estudio de interacciones carbohidrato-proteína Introducción 17 Uno de los sistemas multivalentes de carbohidratos más utilizados son los glicodendrímeros. Los dendrímeros son macromoléculas altamente ramificadas con estructura casi globular (en función de su tamaño), versátiles, derivatizables y estructuralmente bien definidos (monodispersos) con tamaños y propiedades fisicoquímicas que pueden parecerse mucho a biomoléculas como, por ejemplo, proteínas. Desde su descubrimiento a finales de los años 70 (Buhleier y col. 1978), los dendrímeros han demostrado ser unos compuestos con múltiples aplicaciones tanto en ciencia de materiales como en biología y biomedicina (Lee y col. 2005). Estos sistemas son muy interesantes para una eficiente presentación multivalente de ligandos biológicos como los carbohidratos (Munoz, Correa, y col. 2009). La ventaja de los glicodendrímeros frente a otros sistemas multivalentes con carbohidratos es que se pueden preparar desde compuestos que presentan un número pequeño de unidades de carbohidrato hasta sistemas que presentan un gran número de carbohidratos en la superficie. Es decir, el diseño puede ser ajustado a las características del receptor que se pretende estudiar. Los dendrímeros empleados para la síntesis de estas estructuras son muy diversas, muy utilizados han sido los andamios basados en polialcoholes y en restos aromáticos (Kikkeri y col. 2010). I.1.3. Glicopéptidos:glicoestructuras con función antibiótica Los glicopéptidos son una clase de antibióticos con acción bactericida producidos por bacterias de tipo actinomiceto. Son glicoestructuras compuestas por un heptapéptido cuyas cadenas laterales se unen formando anillos aromáticos, presentando diferentes residuos como pueden ser átomos de cloro, azúcares o cadenas lipídicas (Nicolaou y col. 1999). El primero en ser aislado fue la vancomicina, en el año 1956 (Figura 5A) (Eli Lilly). Fue aprobado en 1958 por la FDA y comercializado para fines clínicos. Este antibiótico fue considerado como legendario debido a su acción frente a Staphylococcus aureus, y es la última barrera frente a enterococos multi-resistentes y estafilococos resistentes a meticilina (MRSA, de inglés Methicillin-resistant S. aureus) (Nagarajan 1994). En el año 1978 se descubrió la teicoplanina (Figura 5B), obtenida de la fermentación de Actinoplanes Introducción 18 teichomyceticus que presentaba mayor actividad que la vancomicina y que recibió la aprobación para uso clínico en 1988 (Parenti y col. 1978). Este fue el primero de los llamados lipoglicopéptidos, que se caracterizan por la presencia de una cadena hidrofóbica en la glucosamina de su anillo D. Figura 5. A) Estructura de la vancomicina. B) Estructura de la teicoplanina. Otro lipoglicopéptido natural es el A-40926, producido por Nonomuraea sp.ATCC 39727 ( Esquema 3) (Goldstein y col. 1987). Éste y la teicoplanina son la base para obtener los derivados semisintéticos mideplanina, MDL 63,246 y dalbavancina ( Esquema 3), que mostraron resultados prometedores puesto que presentan una actividad mayor, un espectro antibacteriano ampliado y mejores características farmacocinéticas (Biavasco y col. 1992; Malabarba y col. 2001; Maffioli y col. 2005). Mideplanina y dalbavancina se prepararon mediante la amidación química con N,N-dimetilamino propilamina desde teicoplanina y A-40926 respectivamente, mientras que MDL 63,246 se obtuvo mediante la reducción del grupo carboxilo del residuo N-acilaminoglucurónico desde dalbavancina (Malabarba y col. 2001). A) B) Introducción 19 Esquema 3. Estructuras de teicoplanina, mideplanina, MDL, 63,246, dalbavancina y A-40926 I.1.3.1. Mecanismo de acción de los glicopéptidos Los glicopéptidos actúan inhibiendo la formación de la pared bacteriana mediante la formación de un complejo con el precursor del peptidoglicano UDP-muramil-N- acetilpentapeptido. Crean una unión reversible con la porción L-Lys-D-Ala-D-Ala del pentapéptido que impide la reacción de transglicosidación que elonga el Introducción 20 peptidoglicano, lo que resulta en el colapso de éste y la consecuente lisis celular (Nicolaou y col. 1999). La unión de los glicopétidos al L-lys-D-Ala-D-Ala se debe a la formación de cinco puentes de hidrógeno entre ambas estructuras (Figura 6) (Williams y col. 1999). O O OR NH O H N N H HN O O Cl O HNO HO HO O N H HO OH OH Cl NH2 O O NH OH H N N H H N O- O O O O NHAc Me Me w7 w5 w4 w3 w2 Figura 6 Unión del glicopeptido al L-lys-D-Ala-D-Ala por formación de cinco puentes de hidrógeno entre ambas estucturas Existen evidencias que indican que la acción de la vancomicina se ve potenciada por la capacidad que tiene este glicopéptido de dimerizar en solución. Según esto, las moléculas se unirían normalmente al L-lys-D-Ala-D-Ala, pero a su vez se uniría también con otra molécula cercana, estabilizando la unión gracias a la redistribución de las cargas de las moléculas y haciendo que los puentes de hidrógeno formados con el L-lys-D-Ala-D-Ala sean más fuertes, siendo éste a la vez un efecto cooperativo y alostérico (Figura 7A) (Lahiri y col. 1999; Rao, Yan, Lahiri, y col. 1999; Rao, Yan, Xu, y col. 1999; Cooper y col. 2000). Por otro lado, no se ha detectado dimerización en solución en el caso de los lipoglicopéptidos (Mackay, Gerhard, Beauregard, Maplestone, y col. 1994). Éstos utilizan su cadena hidrofóbica para anclarse a la membrana celular, lo que aumenta el tiempo de unión al precursor de peptidoglicano (Mackay, Gerhard, Beauregard, Westwell, y col. 1994). La teicoplanina es más efectiva que la vancomicina frente a cocos gran positivos (Ravizzola y col. 1987; Billeter y col. 2008), por ello, la segunda generación de derivados semisintéticos se Introducción 21 ha preparado uniendo residuos hidrofóbicos a la estructura del glicopéptido para potenciar esta capacidad de anclaje a la membrana (Kahne y col. 2005; Zhanel y col. 2010; James y col. 2012). Figura 7. Vista esquemática del mecanismo de acción de los glicopéptidos al unirse a los presursores de peptidoglicano. La vancomicina (A) dimeriza aumentando la actividad antibiótica de ambas moléculas por un efecto cooperativo y alostérico. Los lipoglicopéptidos (B) utilizan si cadena hidrofóbica par anclarse a la membrana plasmática. Imagen obtenida de (Jovetic y col. 2010). En la Figura 8 se señalan las regiones funcionales de los lipoglicopéptidos, y en el Esquema 3 los grupos unidos a cada uno de ellos. En la región 1, presentan una cadena hidrofóbica con la doble función de anclar el antibiótico a la membrana celular, lo que aumenta su actividad, y además, aumentar la vida media del mismo, lo que permite la aplicación de la dalbavancina en dosis semanales, a diferencia de la vancomicina, que se debe administrar más frecuentemente (Malabarba y col. 2005; Kim, Kuti, y col. 2007; Zhanel y col. 2008). En la región 2, en el residuo N-acil- glucosamina, teicoplanina, mideplanina y MDL 63,246 tienen un alcohol primario en el carbono 6, mientras que A-40926 y dalbavancina tienen ese grupo oxidado a ácido carboxílico. Esta oxidación aumenta la actividad antibiótica del glicopéptido.(Zhanel y col. 2008) La región 3 es la causante de la dimerización de dos moléculas de antibiótico. En teicoplanina y mideplanina aparece una molécula de GlcNAc en posición β que no se presenta en el resto. Se considera que la ausencia de esta Introducción 22 molécula puede disminuir la polaridad y mejorar el anclaje a la membrana plasmática, lo que podría aumentar la efectividad frente a cepas resistentes (Kim, Kuti, y col. 2007). En la región 4 se localizan los grupos responsables de la formación de los puentes de hidrógeno de unión al precursor de peptidoglicano (Williams y col. 1999). En la región 5, mideplanina, MDL 63,246 y dalbavancina presentan una cadena de 3,3-dimetilamino-propilamida, que aumenta la potencia de estos antibióticos, sobre todo frente a estafilococos (Malabarba y col. 2005; Kim, Kuti, y col. 2007; Zhanel y col. 2008). En la región 6 hay un residuo de α-manosa. Se considera que un grupo polar en esta región disminuye la vida media del antibiótico(Zhanel y col. 2010). 1 2 5 3 4 6 Lys-D-Ala-D-Ala Figura 8. Diferentes regiones funcionales en la estructura de dalbavancina. 1) Cadena hidrofóbica asociada con el anclaje a la membrana celular y la vida media del antibiótico. 2) Grupo que al oxidarse aumenta la actividad del antibiótico. 3) Región responsable de la dimerización de glicopéptidos. 4) Región de unión al precursor de peptidoglicano. 5) Cadena lateral que aumenta la potencia del antibiótico. 6) Azúcar causante de la disminución de la vida media del antibiótico. Introducción 23 I.1.3.2. Resistencia a antibióticos de tipo glicopéptido En el año 1988 se descubrió por primera vez la existencia de cepas de enterococos resistentes a la vancomicina (VRE, del inglés vancomycin-resistant enterococci). Estos organismos se pueden dividir en tres categorías: Tipo A, que es resistente a vancomicina y teicoplanina; Tipo B, que es resistente a vancomicina pero sensible a teicoplanina; y Tipo C, que aun siendo sensibles tanto a vancomicina, este antibiótico ve su actividad recucida unas seis veces (Nicolaou y col. 1999). Los de tipo A y B basan su resistencia en una modificación en el tripéptido terminal del peptidoglicano, el L-lys-D-Ala-D-Ala, que está sustituido por L-lys-D-Ala-D-Lactato. Este cambio implica la desaparición de uno de los cinco puentes de hidrógeno que se forman entre el antibiótico y el tripéptido por el cambio de un NH por un O, lo que implica una afinidad mil veces menor (Figura 9) (Axelsen y col. 1998). El tipo C es diferente al tipo A y B, y se basa en el cambio de la alanina terminal del tripéptido por una serina, lo que no evita la formación de los cinco puentes de hidrógeno, pero hace que estos sean más débiles (M. A. van Wageningen y col. 1998). O O OR NH O H N N H HN O O Cl O HNO HO HO O N H HO OH OH Cl NH2 O O NH OH H N N H O O- O O O O NHAc Me Me w7 w5 w4 w3 w2 Figura 9. Unión del glicopéptido al L-lys-D-Ala-D-Lactato. El cambio de un NH por un O impide la formación de uno de los puentes de hidrógeno entre ambas moléculas, lo que disminuye mil veces la afinidad comparado con la unión con L-lys-D-Ala-D-Ala. Introducción 24 La base genética de los VRE de tipo A y B se debe a la existencia de un operón con cinco genes plasmídicos: vanS, vanR, vanA, vanH y vanX (Walsh y col. 1996), montados sobre el operón Tn1546 (Perichon y col. 2009). Las enzimas VanA, VanH y VanX actúan juntas para llevar a cabo la sustitución de alanina por lactatato en el tripéptido, mientras que VanS y VanH se combinan para crear una señal de transducción que activa los genes anteriores (Walsh y col. 1996). En el año 2002 el Centro de Control de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC, del inglés Center for Disease Control and Prevention) detectó una cepa de Staphylococcus aureus MRSA que había adquirido la resistencia a glicopéptidos (VRSA, del inglés Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) (CDC 2002). Desde entonces se han detectado un total de once cepas VRSA en distintas pates del mundo. Excepto en uno de los casos, de todos los pacientes se aislaron, junto al estafilococo VRSA, también enterococos VRE, lo que implica que los estafilococos pueden adquirir in vivo el transposón Tn1546 por conjugación bacteriana (Perichon y col. 2009). De ahí la urgencia por encontrar formas de glicopéptidos activos frente a estos organismos. Para ello es necesario modificar la estructura de los antibióticos para conseguir una molécula capaz de unirse a los precursores de peptidoglicano L- lys-D-Ala-D-Lactato de los organismos resistentes (Li, Liu, y col. 2012). I.2. Enzimas útiles en la síntesis de oligosacáridos y glicoestructuras Los oligosacáridos son el principal tipo de carbohidratos presentes en la naturaleza llegando a tener hasta 10 unidades de monosacárido unidas covalentemente entre sí. Por otra parte los glicoconjugados son moléculas en las que los oligosacáridos están unidos a lípidos o proteínas para dar lugar a glicolípidos o glicoproteínas, respectivamente (Weijers y col. 2008). El creciente auge en la química de hidratos de carbono ha buscado la optimización de metodologías para la obtención de Introducción 25 oligosacáridos que pueden reproducir los glicoconjugados presentes en los fenómenos de reconocimiento molecular, así como oligosacáridos ligados a otros fenómenos bioquímicos. Por ello se han utilizado las formas más variadas de obtención de oligosacáridos utilizando: síntesis química (Plante y col. 2001; Palmacci y col. 2003; Seeberger 2003; Unverzagt 2003; Weiss y col. 2003; Seeberger 2008), enzimática (Crout y col. 1998; Sasaki y col. 2005; Zeng y col. 2006; Faijes y col. 2007; Hommalai y col. 2007; Vocadlo y col. 2008; Bojarova y col. 2009), o bien una mezcla de ambas (quimioenzimática) (Gambert and Thiem 1997; Gonzalez Lio y col. 1999; Koeller 2000; Yan y col. 2004; Ueki y col. 2010; Yu y col. 2010). La síntesis química de oligosacáridos se caracteriza por varios pasos de protección y desprotección, siendo primordial la correcta activación y protección de la posición anomérica (Bröder y col. 1993; Fukase y col. 1996; Dasgupta y col. 2011). Algunas de las metodologías clásicas para la activación y modificación de carbohidratos fueron las descritas por Koenigs y Knorr (Paulsen 1982), Schmidt (Schimdt y col. 1980; Schimdt y col. 1986), así como Tietze (Tietze y col. 1982). Un aspecto importante a considerar en la síntesis química de oligosacáridos es la regio y estereoselectividad que se requiere para obtener las moléculas de interés específico para cada finalidad, por lo que se requieren numerosos pasos de protección y desprotección lo que obliga a buscar métodos con la menor cantidad de reacciones intermedias para mejorar los rendimientos y disminuir la generación de subproductos y de residuos (Wang y col. 2007; Wang 2007; Boltje y col. 2009), ya que muchas veces los múltiples pasos en la síntesis de carbohidratos derivan en procesos poco sostenibles y con gran impacto para el medio ambiente. Otras desventajas que presenta la aproximación química es la gran cantidad de residuos que se genera así como el uso de sustancias contaminantes como parte del medio de reacción, en muchos casos utilizando precursores ó disolventes halogenados (Schimdt y col. 1980; Paulsen 1982; Schimdt y col. 1986), agentes oxidants fuertes (Böhm y col. 1995) o sales de metales pesados con Hg (II) o Ag (I) (Schmidt y col. 1980; Paulsen 1982; Böhm y col. 1995). Introducción 26 Este hecho, supone claramente una incompatibilidad entre el obtener derivados de carbohidratos por síntesis química y las metodologías sostenibles, pues se contravienen los principios de: prevención, economía atómica, síntesis menos contaminantes (y/o tóxicas), disolventes y auxiliares más seguros y reducción de derivados, todos ellos principios de la química sostenible citados anteriormente (Anastas y col. 1998). Por otra parte, la biocatálisis es una perspectiva muy atractiva para la síntesis de compuestos en condiciones ambientalmente benignas, ya que ofrecen condiciones de reacción moderadas, catalizadores biodegradables y ambientalmente aceptables (normalmente agua), además suelen transcurrir con alta regio-, quimio- y estereoselectividad. A estas ventajas se les suma el hecho de que realizan rutas sintéticas más cortas debido a que no requieren pasos de protección y desprotección por lo que generan menos deshechos (Sheldon y col. 2004; Alcalde y col. 2006). Todos estos factores, permiten apreciar la síntesis enzimática de oligosacáridos como procesos mucho más sostenibles que los procesos químicos tradicionales. Además se utilizan sustancias menos tóxicas, se disminuye el uso de reactivos auxiliares y muchas veces el disolvente es agua. Por otro lado, dependiendo del tipo de enzima utilizada las condiciones de síntesis se realizan a temperatura y presión ambiente. Todo ello está en clara armonía con varios de los principios de la química sostenible ya discutidos (Anastas y col. 1998). Para llevar a cabo la síntesis enzimática de oligosacáridos y glicoconjugados se pueden utilizar principalmente tres tipos de enzimas: 1) glicosidasas (E.C. 3.2.1.); 2) glicosiltransferasas (E.C. 2.4.); 3) glicosintasas (E.C. 3.2.1. glicosidasas) (Perugino y col. 2004), éstas últimas son un grupo de enzimas que se han incluido recientemente y que derivan de las glicosidasas. Introducción 27 I.2.1. Síntesis de oligosacáridos utilizando glicosidasas Las glicosidasas constituyen una gran familia de enzimas (E.C.3.2.x.y.) que están involucradas en la hidrólisis de enlaces glicosídicos. Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y han sido aisladas de diferentes organismos, tanto eucariotas como procariotas (Blanchard y col. 2001; Vasella y col. 2002; Hinou y col. 2009). En los últimos años, el número de las secuencias y estructuras tridimensionales de las glicosidasas ha aumentado enormemente. Por consiguiente la clasificación es complicada y se puede basar en múltiples aspectos como las similitudes de secuencia, la estructura tridimensional, la especificidad de sustrato o el mecanismo de reacción (Henrissat 1997; Vasella y col. 2002). Podemos encontrar que las más de 6300 secuencias de glicosidasas se han agrupado en 130 familias basadas en la secuencia aminoacídica. Además, estas familias se agrupan también de un modo diferente, en función de su estructura tridimensional. Así, las encontramos en 14 clanes organizados por orden alfabético desde GH-A hasta GH-N. La importancia fundamental de la clasificación en familias es que debe tener carácter predictivo en cuanto a la especificidad por el sustrato, el mecanismo de acción o la posibilidad de que se formen productos secundarios en la reacción que catalizan (Henrissat 1997). La mayoría de estas enzimas son exo-glicosidasas, es decir, que hidrolizan únicamente residuos glicosídicos terminales aunque también existen las endo- glicosidasas, que hidrolizan residuos glicosídicos de una cadena oligosacarídica (Giordano y col. 2006; Murata y col. 2006; Trincone y col. 2006). Las glicosidasas, no necesitan la intervención de ningún cofactor y muestran una elevada especificidad por el residuo glicosídico y la naturaleza del enlace glicosídico (Withers y col. 1995; Gijsen y col. 1996; Koeller y col. 2000; Daines y col. 2004). En 1995, Withers y Aebersold (Withers y col. 1995) propusieron el mecanismo de reacción en el centro activo de las glicosidasas, que se mantiene vigente hasta hoy (Esquema 4). Introducción 28 O HO O R C OO H C -O O C OO H C O- O O HO O R O HO C O-O C O O O R1H R1OH ROH C OO H C O- O O HO O R1 Estado de transición Estado de transición O HO O R1 C OO H C -O O Glu1 Glu2 Glu1 Glu1 Glu1Glu1 Glu2 Glu2 Glu2 Glu2 Esquema 4. Mecanismo de reacción en los sitios activos de las glicosidasas con retención de la configuración, propuesto por Whiters y Aebersold.(Withers y col. 1995) La función biológica de las glicosidasas es catalizar la hidrólisis de determinados carbohidratos. En el mecanismo de reacción de las glicosidasas (Esquema 4) intervienen dos residuos de ácido glutámico o aspártico, que a efectos prácticos se suelen denominar residuo ácido catalítico (Glu1) y residuo nucleófilo (Glu2) (Moracci y col. 2001). En un primer paso el Glu1 protona el oxígeno del carbono anomérico, lo que lo convierte en un buen grupo saliente a uno de los azúcares, mientras que el Glu2 con carga negativa realiza un ataque sobre el carbono anomérico que posee una carga parcialmente positiva, generando un intermediario enzima-azúcar (Esquema 4) (Withers y col. 1995). En el segundo paso, el complejo azúcar-enzima es atacado por un nucleófilo (R1OH) que puede ser agua, en este caso la reacción favorecida es la hidrólisis, si el nucleófilo Introducción 29 es un azúcar, la reacción favorecida es la síntesis de un oligosacárido, a esta última reacción se le denomina transglicosidación (Zeng y col. 2005; Turner y col. 2007; Li, Xiang, y col. 2009; Ashida y col. 2010). El tamaño y forma del azúcar, así como el origen de la enzima, son determinantes sobre el tipo de enlace generados, α, β, y su dirección, (1-3), (1-4), (1-6), etc. Algunas glicosidasas realizan mecanismos que permiten invertir la configuración sobre el carbono anomérico (Esquema 5). Estas enzimas actúan en un solo paso, mediante el cual uno de los residuos se comporta como ácido y el otro como base, desplazando directamente al grupo saliente ROH. Lo cual se asemeja a un mecanismo de tipo SN2 (Withers y col. 1995). Esquema 5. Mecanismo de reacción en el centro activo de las glicosidasas que invierten la configuración propuesto por Whiters y Aebersold (Withers y col. 1995). El mecanismo por el cual las glicosidasas realizan la síntesis de disacáridos requiere condiciones distintas a las condiciones de trabajo en sistemas biológicos, donde la enzima realiza exclusivamente la hidrólisis. Partiendo del mecanismo anteriormente explicado (Esquema 4), se pueden entender las estrategias desarrolladas en la síntesis de oligosacáridos con éstas enzimas. La estrategia consiste, en sustituir al agua como nucleófilo, para disminuir la hidrólisis y favorecer la entrada de otras moléculas (azúcares) para sintetizar oligosacáridos. Esta estrategia se logra por aproximaciones termodinámicas y cinéticas, tal y como se muestra a continuación: Introducción 30 1- La aproximación termodinámica: se basa en desplazar un equilibrio químico, favoreciendo la reacción inversa, por ello se le suele conocer como “hidrólisis inversa” o “síntesis por equilibrio controlado” (Perugino y col. 2004), esto implica optimizar condiciones de temperatura, pH, salinidad y principalmente colocar en exceso productos de hidrólisis (v.g. galactosa, que actuarían luego como nucleófilo), y disminuir la presencia de agua, para desfavorecer la hidrólisis. (Vetere y col. 1996; Nieder y col. 2003). Por ello se suelen utilizar mezclas de agua-disolvente, evitando que ésta alcance concentraciones importantes y con ello disminuyendo las posibilidades de que pueda entrar al sitio activo de la enzima y con ello disminuya la hidrólisis. 2- La aproximación cinética: Consiste en usar glicósidos activados que actúan como donadores, éstos se unen con el residuo de ácido glutámico del centro activo de la enzima formando el complejo glicosil enzima antes descrito (Esquema 4) y al aumentar la concentración del aceptor, este compite con las moléculas de agua para realizar el ataque nucleofílico sobre el complejo. En estos casos, se suelen utilizar donadores que poseen buenos grupos salientes, por ejemplo glicósidos con fluoruros, azida o p-nitrofenil (pNF), entre otros. Una vez formado el producto de reacción puede ser hidrolizado por la enzima, pero este hecho dependerá de que la transglicosidación sea más rápida que la hidrólisis y que la hidrólisis del producto de reacción sea más lenta que la del donador (Murata y col. 2003; Sandoval, Ferreras, y col. 2012). Como ya se ha explicado, entre las glicosidasas hay gran variedad de enzimas, las cuales pueden clasificarse en función del tipo de sustrato que reconocen y según el tipo de enlace que hidrolizan. Dos de los organismos de interés para la búsqueda y caracterización de glicosidasas en el presente trabajo de investigación han sido Bacillus circulans ATCC 31382 y Thermus thermophilus PRQ25. Introducción 31 I.2.1.1. ββββ-Galactosidasa β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 Bacillus circulans es una bacteria mesófila, Gram positiva, en forma de bastón que habita en el suelo (Bergey y col. 2001). Su cepa ATCC 31382 es capaz de sintetizar tres isoformas de β-galactosidasa, cada una de las cuales es hidroliza un tipo determinado de enlace glicosídico: β(1-3), β(1-4) y β(1-6) (Song y col.). En el año 1997 se clonó por primera vez el gen de la enzima con actividad β(1-3) a la que se denominó β-Gal-3 o β-Gal-C (Ito y col. 1997). Esta enzima, con un tamaño de 67 kD, pertenece a la familia GH35 de las glicosil hidrolasas. No solo hidroliza enlaces de tipo β(1-3), sino que también es capaz de llevar a cabo reacciones de transglicosidación cuando se utiliza como donador pNF-β-D-Galactopiranósido (pNF-β-Gal) y como aceptores GalNAc y GlcNAc (Fujimoto y col. 1998), y en menor medida Manosa (Man) (Miyasato y col. 2004), para la síntesis de Gal-β(1-3)- GalNAc, Gal-β(1-3)-GlcNAc y Gal-β(1-3)-Man respectivamente. Como se explicó previamente, los disacáridos β(1-3) presentan un papel fundamental en la estructura de un gran número de glicoconjugados (Springer 1984; Takada y col. 1993; Rapoport y col. 2003; Holeman y col. 2004; Caines y col. 2008; Shirato y col. 2008; Mandal y col. 2010). Su síntesis química se ha llevado a cabo y se ha optimizado para hacerla más eficiente, pero se caracteriza por pasos elaborados de protección y desprotección (Lemieux y col. 1975; Schmidt y col. 1980; Paulsen 1982; Khare y col. 1985; Schmidt 1986; Wilstermann y col. 1995), lo que hace más atractiva la síntesis mediante métodos enzimáticos, a la vez que más sostenible. Hasta la fecha, se ha utilizado otra glicosidasa para la síntesis por transglicosidación de este tipo de enlaces, la β-galactosidasa de testículos bovinos, pero presenta el inconveniente de que se extrae de un órgano animal, por lo que no es apropiada para su uso a gran escala (Hedbys y col. 1989; Gambert, Lio, y col. 1997; Schroder y col. 2004). Por todo esto, la enzima β-Gal-3 de B. circulans es la candidata ideal para la síntesis enzimática de este tipo de disacáridos. Introducción 32 I.2.1.2. Glicosidasas de Thermus thermophilus PRQ25 En las últimas décadas se han descubierto microorganismos capaces de vivir en condiciones que desde una perspectiva humana parecen imposibles, a los cuales se les conoce como extremófilos. Sus condiciones de vida pueden implicar bajas ó altas temperaturas, valores de pH extremos ó altos niveles de sal, siendo el principal requisito para su desarrollo la disponibilidad de agua líquida.(Rothschild y col. 2001) Esta resistencia a ambientes extremos hace de estos organismos, y en especial sus enzimas, biocatalizadores de gran interés industrial.(Niehaus y col. 1999; Sellek y col. 1999; Demirjian y col. 2001; van den Burg 2003; Egorova y col. 2005; Salameh y col. 2007) Los organismos que poseen una temperatura óptima de crecimiento entre 45ºC y 80ºC se denominan termófilos y los que superan este valor se denominan hipertermófilos.(Panasik y col. 2000; Vieille y col. 2001; Zhou y col. 2008) La termoestabilidad de éstos organismos se ha intentado explicar en varios estudios, en parte se ha atribuido a la mayor cantidad de interacciones moleculares como por ejemplo: puentes de hidrógeno, interacciones iónicas, puentes disulfuro e interacciones hidrofóbicas,(Li y col. 2005) a la mayor cantidad de cargas eléctricas en la superficie de la proteína, a un aumento en la hidrofobicidad de su núcleo y al reemplazo de aminoácidos considerados como “termolábiles” que están expuestos al disolvente.(Paiardini y col. 2002; van den Burg 2003) Dentro de los organismos termófilos, el género Thermus, establecido por Brock y Freeze en 1969,(Brock y col. 1969) es uno de los más extendidos. Incluye cepas termófilas e hipertermófilas que por lo general son aerobias, con una pigmentación amarillo-anaranjada o rojiza.(Yokoyama y col. 1996) La especie Thermus thermophilus es una bacteria extremadamente termófila y halotolerante, aislada en Japón y descrita inicialmente como Flavobacterium thermophilum.(Oshima y col. 1971) Su cepa PRQ25 fue aislada en la playa de Rebeira Quente, Islas Azores Introducción 33 (Portugal) (da Costa 2001). El genoma de esta cepa ha sido secuenciado y anotado en el laboratorio del Dr. Berenguer, del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa.(Alvarez y col. 2011) Previamente, se han caracterizado enzimas glicosidasas de otras cepas de Thermus thermophilus, como la β-glucosidasa de la cepa HB27, que es capaz de llevar a cabo la reacción de transglicosidación para sintetizar oNF-β-D-Glu-(1-3)-β-D-Glu,(Drone y col. 2005) o la β-galactosidasa TTP0042, también de la cepa HB27, que sintetiza Gal-β-D-(1-4)-GlcNAc y Gal-β-D-(1-6)-GlcNAc.(Sandoval, Cortés, y col. 2012) Algunas de las ventajas con las que cuentan las enzimas de organismos termófilos, o termozimas, frente a sus análogas mesófilas son que presentan una mayor resistencia frente a diversos agentes químicos como solventes orgánicos, detergentes y cambios de pH,(Leuschner y col. 1995; Sellek y col. 1999; Vieille y col. 2001) o que tienen una mayor estabilidad y una vida media más prolongada, lo que hace que disminuya la necesidad de sustitución en los procesos y facilita su almacenamiento.(Coolbear y col. 1992) I.2.2. Síntesis de oligosacáridos utilizando glicosintasas Las glicosintasas surgieron como una evolución de las reacciones de transglicosidación con glicosidasas, con el objetivo de mejorar los limitados rendimientos obtenidos con estas enzimas y por lo tanto, obtener un método eficiente para la síntesis de oligosacáridos (Cobucci-Ponzano y col. 2012). Son enzimas derivadas de glicosidasas en las que el centro activo ha sido mutado para reemplazar el residuo nucleófilo por otro no nucleofílico, y son capaces de llevar a cabo la reacción de transglicosidación en presencia de donadores activados con un buen grupo saliente en su carbono anomérico. Debido a la desaparición del residuo nucleófilo, los productos sintetizados por estos mutantes no pueden ser posteriormente hidrolizados, además de no ser necesaria la utilización de una gran concentración de aceptor para que se produzca la síntesis (Mackenzie y col. 1998). Introducción 34 Existen fundamentalmente dos mecanismos de acción en la glicosintasas, de inversión y de retención de configuración, en base a la configuración anomérica del sustrato donador y de los productos (Esquema 6) (Cobucci-Ponzano y col. 2012). A) B) C) Esquema 6. A) Mecanismo de una β-glicosintasa con inversión de la configuración. B) Mecanismo de una β-glicosintasa con retención de configuración. C) Mecanismo de una α- glicosintasa. Las primeras glicosintasas fueron publicadas casi paralelamente, en el año 1998 y provienen de β-glicosidasas con retención de la configuración. Al obtener enzimas glicosintasa, esta configuración se invierte, por lo que el mecanismo propuesto para ellas se basa en la utilización de α-glicósidos activados con fluor para mimetizar el intermedio de reacción típico de reacciones con glicosidasas no mutantes y obtener productos en β (Esquema 6A). La primera, de tipo exo-glicosintasa, se obtuvo de la mutación de la enzima β-glucosidasa de Agrobacterium sp., en la que se sustituyó el Introducción 35 glutámico 358 (residuo nucleófilo) por una alanina y sintetizaba oligosacáridos con un rendimiento superior al 80% (Mackenzie y col. 1998). La otra, de tipo endo- glicosintasa, se obtuvo de la mutación del glutámico 134 por alanina de la enzima 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis (Malet y col. 1998). Las glicosintasas con retención de la configuración sintetizan oligosacáridos que mantienen la misma configuración que los azucares activados utilizados como sustratos donadores (generalmente pNF- o 2,4-dinitrofenil-glucósidos). Esta reacción transcurre en presencia de iones externos, como puede ser el formiato de sodio, que se comportan como nucleófilo externo, mimetizando el comportamiento del residuo ácido catalítico del centro activo de la enzima nativa, lo que posibilita la formación de un glicosil-formiato estable y posterior reacción de transglicosidación con el aceptor (Esquema 6B). Los productos mantienen la misma configuración que el donador y no pueden ser hidrolizados, a pesar de la presencia del formiato, porque no poseen un buen grupo saliente, lo que permite que se acumulen en la mezcla de reacción con rendimientos cuantitativos. La primera de estas enzimas se produjo en el año 2000, a partir de la mutación del glutámico 387 por una glicina de la enzima LacS de Sulfolobus solfataricus (Moracci y col. 1998). La primera glicosintasa derivada de una glicosidasa con inversión de la configuración fue descrita en 2006 y proviene de la exo-oligoxilanasa de Bacillus halodurans, enzima también conocida como Rex (Honda y col. 2006). En este tipo de glicosintasas se sustituye el residuo que actúa como base por un residuo no catalítico, de forma que adquiere el mecanismo de las glicosintasas con inversión de configuración (Esquema 6A). En el caso de la Rex, se sustiyutó el aspártico 263 por una cisteína. Desde la invención de las glicosintasas, se han descrito enzimas de este tipo derivadas de 17 familias de glicosidasas de las 130 exixtentes. De estas, la mayor parte corresponden con enzimas capaces de sintetizar enlaces β-O-glucosídicos entre Introducción 36 una gran variedad de sustratos, mientras que las α-glicosintasas (Esquema 6C) están limitadas a la familia GH31 (α-glucosintasa), GH29 y GH95 (α-fucosintasa), GH36 (α-galactosintasa) (Cobucci-Ponzano y col. 2012). Esta última se trata de la α- galactosintasa de Thermotoga maritima, una de las enzimas utilizadas en este trabajo de investigación (Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011). I.2.2.1. α-Galactosintasa de Thermotoga maritima T. maritima es una bacteria termófila Gram negativa con forma de bastón, aislada en 1986 de sedimentos marinos calentados por actividad geotérmica. Es capaz de crecer entre 60 y 90 ºC, presentando su óptimo de crecimiento a 80 ºC (Huber y col. 1986). Produce una enzima α-galactosintasa que pertenece a la familia GH36, la TmGalA, capaz de hidrolizar los residuos de galactosa en posición α(1-6) (Miller y col. 2001). Ésta enzima no es capaz de llevar a cabo la reacción de transglicosidación para sintetizar oligosacáridos, pero ese problema se solucionó gracias a la obtención de su glicosintasa, que se obtuvo de la mutación del centro activo de TmGalA, cambiando el aspártico 327 por glicina. Esta galactosintasa es capaz de sintetizar disacáridos cuando se utiliza galactosa con un grupo azida en posición β como donador (Gal-β- N3) y pNF-α-Glu y y pNF-α-Man como aceptores (Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011). I.2.3. Síntesis de oligosacáridos utilizando glicosiltransferasas Las glicosil transferasas son biocatalizadores responsables de la síntesis de oligosacáridos in vivo, incluidas en el grupo E.C. 2.4, de clasificación de enzimas (Shur 1993). Al igual que en el caso de las glicosidasas, se ha intentado establecer una clasificación de estas enzimas en 91 familias basadas en la similitud de la secuencia aminoacídica propuesta por Campbell y col (Campbell y col. 1997). Introducción 37 Las glicosil transferasas presentan una elevada especificidad frente al tipo de sustrato y a la naturaleza del enlace glicosídico que se forma. Como consecuencia, estas enzimas se han empleado en la síntesis de oligosacáridos y glicoconjugados con una gran eficacia y alta especificidad. Existen múltiples ejemplos en los que han sido utilizados con éxito: la síntesis de tetrasacáridos ramificados(Niggemann 1998), derivados de antígenos sialil Lewis (Elling 1999), y diferentes oligosacáridos (Hirschbein 1982; Wong 1982; Dudziak 1998; Hoh 2002; Michalik 2002) o glicopéptidos (Gutiérrez Gallego 2003). Como ya se ha comentado, las glicosiltransferasas presentan en su estructura un sitio de reconocimiento específico del aceptor. Un claro ejemplo es la β-(1-4)- galactosiltransferasa de leche bovina, cuyo aceptor natural es GlcNAc, preferentemente sus β -derivados. Los β -glucósidos también son aceptados, aunque en el caso de los α-glucósidos, se necesita la presencia de lactalbúmina para que la reacción tenga lugar (Wong 1991). También se ha descrito la utilización de aceptores hidrofóbicos que incorporan en sus estructuras cadenas alifáticas de 8 átomos de carbono (C8) para llevar a cabo ensayos de la actividad enzimática de las glicosiltransferasas (Palcic 1988). Por otro lado, las glicosiltransferasas han sido utilizadas para llevar a cabo la síntesis de glicopéptidos. En estos casos, se ha descrito que la presencia de grupos sulfato en los residuos de Tyr de la cadena peptídica, provocan una disminución de la actividad tanto de la galactosil- como de la sialiltransferasa a la de hora de incorporar los respectivos donadores a la estructura (Koeller 2000). La principal desventaja del uso de las glicosiltransferasas es la poca disponibilidad comercial y el alto coste tanto de los sustratos donadores como de las propias enzimas. Por ello, en los últimos años se buscan nuevas fuentes de obtención de glicosiltransferasas con diferente regioselectividad, y mejores características cinéticas y de estabilidad para poder aumentar la versatilidad de estas enzimas en la Introducción 38 síntesis de oligosacáridos. De este modo, han aparecido diferentes ejemplos, como la β(1-3)-galactosiltransferasa aislada del tejido conectivo de caracol Lymnaea stagnalis (Mulder 1991), o la α-glucosiltransferasa de Talaromyces duponti para aplicación en la síntesis de alquil-glucósidos (Bousquet 1998). Para solventar el problema de la disponibilidad de los sustratos se han descrito estrategias en las que se regenera el donador mediante otro sistema enzimático, o también se estudian posibles nuevos donadores más accesibles que los clásicos activados mediante nucleótidos (Wong 1982; Palcic 1991; Srivastava 1993; Breton 1999). Por otro lado, el problema de la disponibilidad de las enzimas es más difícil de solucionar debido a su inestabilidad y la complejidad de su aislamiento. En este sentido están apareciendo estudios que emplean la ingeniería genética como herramienta para mejorar la disponibilidad de estas enzimas o incluso llevar a cabo este tipo de transformaciones con células enteras (Herrmann 1995; Baisch 1998). Aunque en general hay muy pocos motivos conservados, a excepción de la familia de las sialiltransferasas, sí que se presentan pequeños residuos muy conservados que tienen una relación muy estrecha con su implicación biológica (Breton 1999). Muchas han sido las estructuras cristalizadas en los últimos años, y pese a las diferencias estructurales que se presentan, en todas ellas se revela un sitio de reconocimiento del aceptor, lo que indicaría su especifidad de sustrato (Ramakrishnan 2002). En cuanto al mecanismo de acción de estas enzimas, cabe destacar que el residuo donador que se va a unir a la cadena de oligosacárido está activado por fosforilación en la posición anomérica. Se han descrito 2 vías de acción de estas enzimas según la activación de la posición anomérica. En primer lugar, se llama vía Leloir a aquella en la que el grupo activante del hidrato de carbono donador es un nucleótido. Por el contrario, si este grupo activante es un fosfato, la vía de acción de estas enzimas es la vía no-Leloir (Esquema 7) (Niggemann 1998). Introducción 39 OMonosacárido donador O GS Monosacárido donador Monosacárido aceptor Glicosil transferasa HO GS Monosacárido aceptor O OHOH O Base P P P GS = Grupo saliente.Vía No- Leloir Leloir Esquema 7. Vías de acción de las glicosil transferasas. Diferentes grupos activantes del monosacárido donador(Faber 2004). I.2.3.1. Sialiltransferasas: funcionalización de glicoestructuras con ácidos siálicos Debido a la dificultad de la sialización química, se suelen utilizar métodos enzimáticos para llevar a cabo este tipo de reacciones (Chen y col. 2010). Las sialiltransferasas catalizan la transferencia de un ácido siálico activado con citidin monofosfato (CMP) a un azúcar aceptor por la vía Leloir. Este tipo de enzimas aparecen en bacterias patógenas, aunque no suelen presentar problemas de producción o de plegamiento a clonarlas en E. coli (Takakura y col. 2007), por lo que se han convertido en herramientas eficientes para la síntesis de glicoconjugados sializados. Hasta la fecha, se han encontrado sialiltransferasas en Campylobacter jejuni, Pasteurella multocida, Haemophilus sp., Neisseria sp., Photobacterium sp., y Vibrio sp., y se han clasificado en las familias GT42, GT52 y GT80 respectivamente. Se clasifican principalmente en α/β-galactosido α-2,3-sialiltransferasas (2,3SiaT, E.C. 2.4.99.4) y β-galactosido α-2,6-sialiltransferasas (α2,6SiaT, E.C. 2.4.99.1), de las cuales, las α2,3SiaT pueden transferir los CMP-sialicos tanto a α como β- galactósidos, pero las α2,6SiaT solo aceptan β-galactósidos. Entre los galactósidos aceptores de estas enzimas, destacan residuos de lactosa y lactosamina o antígenos como los de Lewis, T o Tn (Li and Chen 2012). Introducción 40 De entre las sialiltransferasas bacterianas, las α2,6SiaT y α2,3SiaT de Photobacterium sp. presentan un pH óptimo de 8, a diferencia del pH 6 o 6,5 de otras sialiltransferasas. Un pH óptimo alcalino es más apropiado para la síntesis de sialilconjugados, ya que los CMP-siálicos no son estables en condiciones ácidas (Yamamoto y col. 2007). Además, estas enzimas han sido utilizadas con éxito para la síntesis de sialilconjugados naturales y no naturales (Yu y col. 2006; Muthana y col. 2009; Cheng y col. 2010). Por estos motivos, estas enzimas serán las utilizadas en este trabajo para la funcionalización de glicodenrímeros con ácidos siálicos. I.2.4. Enzimas aplicadas a la modificación de regiones no glicosídicas de glicoestructuras Dada la complejidad de las glicoestructuras, existen enzimas útiles para la modificación de residuos no glicosídicos que pueden alterar la función de éstas. Las lipasas, serin proteasas y glucosa oxidasas son enzimas de interés en este trabajo de investigación para la modificación de antibióticos de tipo glicopéptido. I.2.4.1. Lipasas Las lipasas (EC 3.1.1.3, triacilglicerol lipasas) son enzimas que catalizan la hidrólisis y síntesis de ésteres carboxílicos. Están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se pueden encontrar en: animales, plantas, hongos y bacterias (Schmid y col. 1998; Fojan y col. 2000). Se caracterizan por su alta regioselectividad y estereoselectividad (Bornscheuer y col. 1999; Liese y col. 2000; Schmidt y col. 2005). Una de las principales características de las lipasas es su promiscuidad catalítica, definida como la capacidad que poseen las enzimas de catalizar reacciones que se diferencian de su reacción fisiológica natural (Hult y col. 2007; Gupta y col. 2011; Kapoor y col. 2012). Dada esta característica, se han logrado realizar numerosas reacciones catalizadas por distintas lipasas en las que se obtienen productos con enlaces distintos a ésteres (Kapoor y col. 2012), tales como: la síntesis de amidas (Gotor- Fernández y col. 2006), reacción de Mannich (Li, He, y col. 2009; He y col. 2010) Introducción 41 adiciones aldólicas (Li y col. 2008) y formación de enlaces carbono-carbono entre otras (Branneby y col. 2003; Svedendahl y col. 2005), por lo que pueden ser útiles para la modificación de glicoestructuras. I.2.4.2. Serín proteasas Las serín proteasas son hidrolasas que degradan enlaces peptídicos de proteínas y péptidos que poseen en su centro activo un aminoácido de serina, esencial para la catálisis enzimática. Esta clase de enzimas (clasificadas como EC 3.4.21) incluye a la tripsina, quimotripsina, subtilisina y otras (Hedstrom 2002). Las subtilisinas son enzimas bien caracterizadas tanto física como químicamente, que tienen un peso molecular entre 20-45 KDa. Son secretadas en grandes cantidades por muchas especies del género Bacillus, como B. amyloliquefaciens o B.subtilis, del que reciben el nombre (Mathews y col. 2003). Al igual que las lipasas, las subtilisinas presentan una baja especificidad de sustrato, lo que permite su utilización para hidrolizar todo tipo de enlaces peptídicos. Se han utilizado en procesado de alimentos y como aditivo en detergentes, además de la industria química y farmacéutica (Rao y col. 1998; Gupta R Fau - Beg y col. 2002). Dada su versatilidad para reconocer diferentes sustratos, pueden ser aplicadas para la modificación de glicoestructuras. I.2.4.3. Glucosa oxidasas La glucosa oxidasa (E.C. 1.1.3.4) es una enzima de tipo óxidorreductasa que utiliza oxígeno como aceptor de electrones externo para oxidar uno de los grupos hidroxilo de β-D-glucosa, liberando peróxido de hidrógeno. Es una enzima homodimérica que presenta una molécula de FAD unida de forma no covalente en el centro activo de cada subunidad (de 80 kD), por lo que no necesita la presencia de cofactor (Ferri y col. 2011). Fue originalmente aislada del hongo Aspergillus niger (Keilin y col. 1948), y sigue siendo a día de hoy la fuente principal de esta enzima. Se utiliza en biotecnología como biosensor para detectar la concentración de glucosa, y como conservante en alimentos por sus características oxidantes (Clark y col. 1962; Bankar Introducción 42 y col. 2009). Debido a que el peróxido de hidrógeno producido en la reacción inhibe la actividad de la glucosa oxidasa, se suele acoplar una segunda enzima, como puede ser la catalasa, para descomponerlo y permitir que la reacción finalice (Uppoor y col. 1996). I.2.5. Procesos de Inmovilización y estabilizacion de enzimas La inmovilización es una técnica que confina a una enzima catalíticamente activa dentro de un sistema de reacción, dando lugar a un derivado insoluble que posteriormente puede ser reutilizado (Klibanov 1983; Norde y col. 1986; Lamb y col. 2000). Dentro de las características ventajosas de este tipo de biocatalizadores se puede mencionar que: se mejora la estabilidad de la enzima, permite reutilización del biocatalizador (incluso de forma continua), el catalizador se puede separar con facilidad de la mezcla, se previene la contaminación por proteínas en el producto final y se evitan fácilmente contaminaciones microbianas en el sistema (Bornscheuer 2003). La inmovilización supone ventajas en términos económicos para las industrias que utilizan biocatalizadores, ya que la posibilidad de reutilizar una enzima hace que la productividad del catalizador (definida como kg de producto obtenidos por kg de catalizador) sea más alta y con ello reduce los costes de manufactura, siendo un ejemplo de ello la producción de ácido 6-aminopenicilánico, cuya productividad es de 600 kg por kg de enzima (Spieß y col. 1999; Tischer y col. 1999; Sheldon 2007). Por lo anterior, si desde una perspectiva de la química sostenible, el uso de biocatalizadores es considerado como ambientalmente amigable (Sheldon y col. 2004; Alcalde y col. 2006), el uso de enzimas inmovilizadas puede resultar aún más sostenible, dada la posibilidad de reutilizar el biocatalizador. El Prof. Sheldon (Sheldon 2007) clasifica las metodologías de inmovilización de enzimas en tres grandes grupos: I) inmovilización covalente sobre un soporte previamente funcionalizado, II) captura de la enzima en matrices orgánicas o Introducción 43 inorgánicas (encapsulamiento) y III) entrecruzamiento de proteínas. En el presente trabajo se han empleado la primera: la inmovilización covalente sobre soportes funcionalizados, que se describe con más detalle a continuación. I.2.5.1. Inmovilización covalente por unión a un soporte: La inmovilización covalente sobre un soporte es un proceso en el que la enzima se une a un material con el que forma un derivado estable. Los soportes pueden provenir de fuentes naturales como el quitosano (Barbara 2004; Chiou y col. 2004; Taqieddin y col. 2004; Cetinus y col. 2007; Pan y col. 2009), polímeros naturales químicamente modificados como glioxil agarosas (Guisán 1988; Mateo y col. 2006; Mateo y col. 2010), soportes orgánicos funcionalizados (Mateo, Fernández-Lorente, y col. 2000; Boller y col. 2002; Mateo y col. 2002; Pessela y col. 2003; Torres y col. 2003; Lu y col. 2009) o inorgánicos como la sílica mesoporosa (Fan y col. 2003; Wang y col. 2005). El proceso se puede realizar de distintas maneras: adsorción física por atrapamiento en cavidades polares (Luckarift y col. 2004; Salis y col. 2005), adsorción por fuerzas de Van der Walls (Petkar y col. 2006), adsorción por fuerzas iónicas (Mateo, Abian, y col. 2000), acomplejamiento metálico (Akgöl y col. 2004; Akkaya y col. 2007) ó por unión covalente (Mateo y col. 2002). De éstos, la unión covalente es una opción muy utilizada debido a la ventaja de que la unión enzima-soporte es irreversible. Para el presente trabajo se han elegido soportes orgánicos funcionalizados con superficies macroporosas y glioxil agarosas como soportes para inmovilizar enzimas de interés en la síntesis de oligosacáridos y glicoconjugados. I.2.5.1.1. Polímeros sintéticos macroporosos activados con grupos epóxido Dentro de la gran variedad de polímeros que pueden obtenerse por síntesis química, el uso de polímeros macroporosos cobra gran auge debido a las múltiples propiedades que les hacen más competitivos respecto a aquellos polímeros que inmovilizan Introducción 44 enzimas sobre su superficie (Santora y col. 2001; Svec 2004; Miletic, Vukovic, y col. 2009). Este tipo de polímeros pueden ser comerciales como: “Epoxy Sepabeads” y “Eupergit C”, o bien, pueden ser sintetizados en el laboratorio a partir de los monómeros. Sin embargo, es importante mencionar, que existen numerosos ejemplos de inmovilizaciones sobre polímeros macroporosos no comerciales sintetizados en el laboratorio con distintas enzimas: glucoamilasa de A. niger (Milosavic y col. 2007), penicilina G acilasa (Koilpillai y col. 1990), invertasa de Saccharomyces cerevisiae (Prodanović y col. 2001), lipasa de C. rugosa (Vaidya y col. 2008) y lipasa B de C. antárctica (Miletic, Rohandi, y col. 2009), lo que demuestra su amplio uso en el campo de la inmovilización de enzimas. El soporte Sepabeads está constituido por resinas acrílicas que forman partículas esféricas macroporosas con grandes valores de superficies internas y alta congruencia geométrica con proteínas (Mateo y col. 2007; Cerdobbel y col. 2010). Algunas de las enzimas inmovilizadas sobre este tipo de soportes son: fructosiltransfersa de A. aculeatus (Ghazi y col. 2005) y la β-galactosidasa de B circulans.(Torres y col. 2012) El Eupergit C, está constituido por pequeñas esferas macroporosas con un diámetro de 100–250 µm, es estable mecánica y químicamente y puede resistir valores de pH desde 0 hasta 14 (Katchalski-Katzir y col. 2000). Sobre este soporte se han inmovilizado diferentes tipos de enzimas, entre ellas algunas glicosidasas como: β- glucosidasa de Aspergillus niger (Tu y col. 2006), α-galactosidasa de A. oryzae (Hernaiz y col. 2000), β-galactosidasa de B. circulans (Hernaiz y col. 2000; Hernaiz y col. 2000). También se ha inmovilizado la lipasa de C. rugosa.(Hernaiz y col. 2000; Knezevic y col. 2006) La inmovilización sobre Sepabeads y Eupergit se realiza mediante la reacción entre los grupos epóxido libres que tiene el polímero en su superficie y los grupos amino libres de las enzimas (generalmente de residuos de lisinas), que realizan un ataque nucleofílico que finaliza con la unión del sistema soporte-enzima mediante una amina secundaria (Esquema 8) (Mateo y col. 2002; Sheldon 2007). Introducción 45 Esquema 8. Inmovilización covalente de una enzima sobre Eupergit C. (Sheldon 2007) Una de las desventajas de utilizar epóxidos como grupos reactivos en la superficie de un soporte durante la inmovilización, es su baja selectividad química, ya que pueden interaccionar con otros residuos libres de aminoácidos de carácter nucleófilo como: tioles presentes en las cisteínas e hidroxilos de serinas, treoninas y tirosinas, formando enlaces covalentes con ellos. Estas reacciones secundarias pueden distorsionar la estructura terciaria de la enzima debido a la formación de múltiples puntos de anclaje, causando pérdidas o modificaciones en su actividad (Esquema 9). Esquema 9. Inmovilización covalente de enzimas sobre epóxidos mediante residuos hidroxilos o tioles. I.2.5.1.2. Glioxil agarosas activada con grupos aldehido Las glioxil agarosas son soportes muy versátiles para inmovilizar enzimas. Se basan en un biopolímero (la agarosa) que han sido modificados para funcionalizar su superficie con grupos aldehído (Guisán 1988). Los grupos aldehídos libres tienen la ventaja de que pueden reaccionar de forma específica con los grupos amino primarios Introducción 46 libres para formar iminas mediante la formación de Bases de Shiff, que luego son reducidas con borohidruro sódico para formar aminas (Esquema 10) (Mateo y col. 2006). Esquema 10. Estrategias de inmovilización sobre glioxil agarosa. Lamentablemente este tipo de inmovilizaciones requieren un pH igual o superior a 10.0, lo que hace ésta técnica poco compatible con algunas enzimas sensibles a los cambios de pH. Sin embargo, el grupo de investigación del Dr. Guisán, ha desarrollado diversas estrategias de inmovilización con glioxil agarosas, que permiten disminuir el tiempo de reacción a pH alcalino para minimizar la desactivación enzimática. El proceso se basa en la atracción soporte-enzima mediante una funcionalización de la glioxil agarosa. De esta forma se han descrito glioxil agarosas funcionalizadas con cationes metálicos como el Ni (II), que interaccionan con enzimas recombinantes que poseen extremos polipeptídicos con múltiples histidinas (Histag). También se han desarrollado soportes funcionalizados con grupos carboxilo que se cargan de forma negativa a pH 7.0, para atraer enzimas con cargas positivas, por lo que se requiere un punto isoeléctrico de la enzima mayor a 7.0. Finalmente, existen soportes funcionalizados con derivados de tipo catión amonio cuaternario que están cargados positivamente a pH 7.0, los cuales requieren que la enzima esté cargada negativamente a ese valor de pH, y por lo tanto su punto isoeléctrico sea menor a 7.0 (Mateo y col. 2010). Introducción 47 I.2.5.2. Síntesis de oligosacáridos y glicoconjugados utilizando enzimas inmovilizadas Existen numerosos ejemplos de glicosidasas y glicosintasas inmovilizadas sobre distintos soportes y posteriormente han sido caracterizadas y utilizadas en la síntesis oligosacáridos. Entre ellas se tiene constancia de las mencionadas en la Tabla 1. En dicha tabla se pueden señalar algunos datos importantes sobre las ventajas de utilizar este tipo de enzimas inmovilizadas. Por ejemplo, la β-glicosintasa de Streptomyces E383A se ha inmovilizado sobre un soporte de Ni (II)-sefarosa y conserva 93% de actividad tras nueve ciclos de uso, retiene un 83% de su actividad luego de 54 días de almacenamiento a 4ºC en tampón fosfato. La enzima libre se empleó en la síntesis de distintos p-nitrofenil disacáridos donde los mayores rendimientos alcanzados (77%) se obtuvieron en la síntesis de pNF-β-Glc-(1→3)-Glc, para la misma síntesis, la enzima inmovilizada sobre sefarosa-Ni(II) aumento los rendimientos hasta un 95% (Faijes y col. 2006). Otro ejemplo de enzima inmovilizada es la β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis que ha sido inmovilizada en Duolite A-568 (Maugard y col. 2003). Las reacciones se han realizado con radiaciones de microondas, en tampón y en presencia de algunos disolventes orgánicos como hexanol, hexanodiol, glicerol, dietilenglicol dietil éter. Tanto la enzima libre como la inmovilizada, se han comparado en cuanto a su actividad en la síntesis de galactooligosacáridos, dando mejores resultados la enzima inmovilizada, ya que el equilibrio de reacción se desplaza hacia la síntesis cuando se usa la enzima inmovilizada, mientras que en medio acuoso se favorece la hidrólisis del donador. Otra enzima inmovilizada que ha sido utilizada en presencia de disolventes orgánicos es la β-galactosidasa aislada de la almendra (Ponrasu y col. 2009), aislada por precipitación de los taninos (Hestrin y col. 1995) e inmovilizada sobre perlas de alginato de calcio (Won y col. 2005). Esta enzima ha sido utilizada en presencia de tampón y mezclas de di-isopropil éter, a distintos valores de pH mostrando un comportamiento relativamente predecible en función de las condiciones del medio (Ponrasu y col. 2009). Introducción 48 Tabla 1. Algunas glicosidasas y glicosintasas inmovilizadas de utilidad en la síntesis de disacáridos y glicoconjugados. Enzima Soporte Productos Referencias Streptomyces E383A β-glicosintasa Sefarosa-Ni2+ Glc-β(1-3)-Glc (Faijes y col. 2006) β-galactosidasa Kluyveromyces lactis Duolita A 568 (resina defenol formaldehído) Galactooligosacáridos (Maugard y col. 2003) β-galactosidasa B. circulans (Biolacta Nº5) Eupergit C Gal-β(1-4)-GlcNAc (Hernaiz y col. 2000) β-galactosidasa B. circulans (β-gal-3) CNBr-sefarosa Gal-β(1-3)-GalNAc Gal-β(1-3)-GalNAc-α-Bn (Naundorf y col. 1998) β-Galactosidasa de A. oryzae. Partículas magnéticas F3O4 Quitosano Galactooligosacáridos (Pan y col. 2009) β-glucosidasa de almendra Perlas de alginato de calcio 2-O-Glc-Tiamina (Ponrasu y col. 2009) Un factor importante en la inmovilización de enzimas es el aumento de la estabilidad y de la termoestabilidad, así por ejemplo, dos enzimas diferentes provenientes de B. circulans se han inmovilizado en soportes como el Eupergit C (Hernaiz y col. 2000) y la Sefarosa activada con bromuro de cianógeno, en ambos casos con una importante retención de la actividad enzimática y con un aumento de la estabilidad (Naundorf y col. 1998). En el primer caso la enzima utilizada es regioselectiva hacia la síntesis de Introducción 49 enlaces β(1-4) y en el segundo caso hacia enlaces de tipo β(1-3). Efectos similares de aumento de la estabilidad se han obtenido con la β-galactosidasa de A. oryzae, que ha sido inmovilizada sobre partículas magnéticas de Fe3O4 sobre quitosano, en este caso la inmovilización favorece la estabilidad térmica y también la estabilidad a diferentes valores de pH (Pan y col. 2009). I.3. Glicosidasas en disolventes sostenibles Al inicio de la década de 1990, apareció un campo de estudio emergente denominado Química Sostenible, el cual pretende implementar en la industria química procesos respetuosos con el medio ambiente (Anastas 2002; Horvath 2007; Sheldon y col. 2007). Esta disciplina se conoce también como Química Verde y se inscribe dentro de las “tecnologías sostenibles” (Sheldon y col. 2007). El nombre Química Sostenible fue acuñado inicialmente en la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de América por Paul Anastas (Anastas 2002), y para el año de 1993 esta entidad crea el Programa de Química Sostenible en dicho país (Sheldon y col. 2007). Anastas y Warner definen esta nueva disciplina como: “La química sostenible es el diseño de productos y procesos químicos que reducen o eliminan la generación de residuos y sustancias tóxicas”(Anastas y col. 1998). Otra definición sobre este campo la ofrece el Profesor Sheldon: “La química sostenible utiliza eficientemente materias primas (preferiblemente de fuentes renovables), elimina residuos, y evita el uso de reactivos y disolventes tóxicos y/o peligrosos para la salud, en la manufactura y elaboración de productos químicos” (Sheldon 2000; Sheldon y col. 2007). Introducción 50 I.3.1. Los principios de la química sostenible La química sostenible está basada en doce principios que en general pretenden un diseño ambientalmente benigno de productos y procesos (Anastas 2002; Sheldon y col. 2007). Estos principios son (Anastas y col. 1998): 1. Prevención: es mejor prevenir la formación de residuos que dar tratamiento o limpiarlos una vez creados. 2. Economía atómica: los métodos de síntesis deberían estar diseñados para maximizar la incorporación de todos los materiales usados en el proceso de producción en el producto final. 3. Síntesis químicas menos peligrosas (y/o tóxicas): dentro de lo posible, los métodos de síntesis deberían ser diseñados para usar y generar sustancias que posean poca o ninguna toxicidad para la salud humana o el ambiente. 4. Diseño de productos químicos seguros: los productos químicos deberían ser diseñados para obtener la función deseada minimizando su toxicidad. 5. Disolventes y auxiliares más seguros: el uso de sustancias auxiliares, como disolventes, reactivos de separación, entre otros, debería ser un hecho innecesario y dentro de lo posible dichas sustancias deben ser inocuas al ser usadas. 6. Diseño con eficiencia energética: los requerimientos energéticos de procesos químicos deberían ser reconocidos por su impacto ambiental y económico y deberían ser minimizados. De ser posible los métodos de síntesis deberían ser realizados a temperatura y presión ambiente. 7. Uso de materias primas renovables: deberían emplearse éstos materiales siempre que sea técnica y económicamente viable. 8. Reducción de derivados: los derivados utilizados (en procesos de bloqueo, protección, desprotección, etc.) deben ser minimizados e incluso anularse de ser posible ya que cada paso requiere reactivos adicionales y esto genera residuos. 9. Catálisis: los reactivos catalíticos (tan selectivos como sea posible) se emplearán en lugar de reactivos estequiométricos. Introducción 51 10. Diseño para la degradación: los productos químicos deben ser diseñados para que al final de su función se transformen en productos de degradación inocuos y no persistan en el ambiente. 11. Análisis en tiempo real para prevenir la contaminación: será necesario desarrollar metodologías analíticas para permitir en tiempo real el seguimiento y control durante el proceso antes de que se produzcan sustancias peligrosas. 12. Química inherente a la seguridad para evitar accidentes: deben seleccionar las sustancias y su forma para minimizar el potencial de accidentes, incluidas emanaciones, explosiones e incendios (Anastas y col. 1998). I.3.2. Disolventes Sostenibles El concepto de disolventes sostenibles ó verdes es bastante restringido, si se consideran los postulados de la química sostenible ya mencionados. Esto implica analizar muchos supuestos y por ello la clasificación de los disolventes considerados sostenibles no estará exenta de tensiones en su totalidad, ya que difícilmente un mismo disolvente cumple todos los requisitos presentados. Desde esta perspectiva se ha llegado a postular que el disolvente más sostenible en sí mismo no es un disolvente (Kaupp 2003), sin embargo existen notorias ventajas de utilizar disolventes para el desarrollo de reacciones químicas respecto a los medios sin disolventes, algunas de las ventajas citadas son las siguientes (Hernaiz y col. 2010): - Las reacciones ocurren rápidamente y con mayor facilidad cuando los reactivos están disueltos, por que se reducen las restricciones de transferencia de masa. - Los disolventes pueden afectar los rendimientos y las regioselectividades de una reacción debido a la distinta solvatación de reactivos, intermediarios y estados de transición. - Los disolventes actúan como medios para transferir el calor ayudando a minimizar los cambios bruscos de temperatura por gradientes más moderados - Muchas veces los disolventes facilitan la separación y purificación de los productos. Introducción 52 Desde una perspectiva legal, en la Unión Europea, los disolventes deben reunir una serie de características que hagan su uso menos peligroso y más seguro para el medio ambiente, por este motivo se ha limitado el uso de compuestos orgánicos volátiles (VOC’s por sus siglas en inglés), ya que muchos de esos vapores son tóxicos para el ser humano, constituyendo una amenaza a la salud de quienes lo utilizan y a la vez pueden potenciar efectos dañinos en el ambiente como daños a la capa de ozono y potenciar el efecto de invernadero (Hernaiz y col. 2010). Tomando en cuenta los aspectos legales sobre la sostenibilidad de los disolventes y los doce principios de la química sostenible, en especial los principios 3, 4 y 5 (Anastas y col. 1998; Jessop y col. 2008), se han considerado como disolventes sostenibles los siguientes: 1) el agua, 2) disolventes orgánicos obtenidos de fuentes renovables, 3) disolventes orgánicos de bajo impacto ambiental, 4) los disolventes fluorados 5), los líquidos iónicos (LIs), 6) fluidos supercríticos (FSC) (Capello y col. 2007; Sánchez-Vicente y col. 2009; Pérez y col. 2010; Morère y col. 2011). Para el presente trabajo se han utilizado disolventes descritos en las anteriores categorías con excepción de los fluidos supercríticos. I.3.2.1. El agua Por sus características, el agua se puede considerar el disolvente sostenible por excelencia (Ball 2000), pues no es tóxico para el ser humano ni para el medio ambiente, no es inflamable, disuelve las enzimas en su forma natural, no requiere procesos de manufactura (aunque sí de purificación), etc. Desde una perspectiva de la química sostenible, el agua es un excelente disolvente. Sin embargo desde la perspectiva de síntesis química, muchas veces el agua no es un buen disolvente de reactivos, o resulta no ser un buen disolvente para los productos, lo que obliga a buscar métodos de separación de mezclas para purificar el producto deseado (Hernaiz y col. 2010). Introducción 53 I.3.2.2. Disolventes orgánicos obtenidos de fuentes renovables Los disolventes orgánicos tradicionales son en su mayoría derivados del petróleo (una materia prima no renovable) e incumplen algunos de los postulados de la química sostenible (Anastas y col. 1998), entre los que se pueden mencionar los siguientes: aumentan la formación de residuos, los procesos de síntesis química en éstos son relativamente peligrosos (lo que requiere cuidados adicionales en el proceso de síntesis), muchos de ellos son volátiles por lo que se aumentan las emisiones de VOC’s, además de que por lo general poseen cierta toxicidad para el ser humano y el medio ambiente. La obtención de disolventes procedentes de fuentes renovables puede disminuir muchas de las características mencionadas anteriormente. En primer lugar constituyen en sí mismos una forma de evitar residuos, pues convierten lo que sería un potencial residuo en un nuevo disolvente, adicionalmente el diseño de estos disolventes puede ser mejorado para cumplir otras características como mejorar su compatibilidad con la salud o el medio ambiente. Dos de los disolventes de fuentes renovables más conocidos y utilizados son el etanol y metanol (Capello y col. 2007), pues se pueden producir en grandes cantidades por fermentación en procesos relativamente sostenibles y en sí mismos son sustancias que pueden ser biodegradadas con facilidad. Por otro lado también existen otros disolventes obtenidos de fuentes renovables que también están ya comercializados por LOBA Chemie y Sigma-Aldrich, y entre ellos podemos citar el ciclopentenil metil éter (CPME), lactato de etilo y el 2- metiltetrahidrofurano (MeTHF) (Figura 10) (Hernaiz y col. 2010). Otros disolventes derivados de fuentes renovables están en fase de exploración, uno de los ejemplos más claros es el proyecto europeo SolvSafe (Hernaiz y col. 2010), constituido por una plataforma innovadora de pequeñas y medianas empresas junto con sectores de investigación, cuya meta ha sido la reducción de disolventes tóxicos/peligrosos Introducción 54 actualmente utilizados, reducir los compuestos orgánicos volátiles enviados a la atmósfera, reducir las emisiones de dióxido de carbono a la atmósfera y aumentar la cantidad de materiales renovables en uso (Hernaiz y col. 2010). Figura 10. Estructura de algunos disolventes obtenidos de fuentes renovables disponibles comercialmente:(Hernaiz y col. 2010) a) CPME; b) lactato de metilo; c) MeTHF. Finalmente, es importante comentar que el actual aumento en la producción de biodiesel (en parte debido al innegable hecho de que los combustibles fósiles son fuentes en proceso de agotamiento) ha conllevado un aumento en su principal sub- producto de manufactura: el glicerol, el cual constituye cerca de un 10% de la masa total en el proceso de producción (da Silva y col. 2009). Por lo anterior, es posible prever un aumento masivo en la producción de glicerol como subproducto de la industria del biodiesel, lo cual lo convierte en una posible materia prima a utilizar derivada de la biomasa. Por este motivo se ha explorado la posibilidad de sintetizar y caracterizar disolventes derivados del glicerol, como una alternativa de aprovechamiento de éste subproducto de la industria del biodiesel (Dasari y col. 2005; Wolfson y col. 2007; García y col. 2010). I.3.2.3. Disolventes orgánicos de bajo impacto ambiental En un estudio publicado en el año 2007 (Capello y col. 2007), se realizó un análisis sistemático de 26 disolventes tradicionales de uso común en la química orgánica. El análisis se hizo utilizando dos enfoques, el primero de ellos denominado EHS (del inglés: “enviromental, health and safety”, ambiente, salud y seguridad) que se basa en los riesgos potenciales de las sustancias químicas (irritación, toxicidad, Introducción 55 inflamabilidad, etc.) y el segundo se conoce como LCA (del inglés: “life cycle assessement”, evaluación del ciclo de vida), que contempla factores como las emisiones al ambiente durante la vida útil del mismo: producción, uso, reciclabilidad potencial (destilación) y disposición final (en algunos casos incineración, como medida más benigna para el ambiente). Según esta perspectiva, los disolventes orgánicos más sostenibles son: el etanol, el metanol y el acetato de metilo. Otros disolventes relativamente sostenibles, bajo este estudio, considerando que pueden ser destilados y reutilizados (o en su caso incinerados) son: acetato de etilo, acetato de butilo, etilbenceno, 1-propanol, 1- butanol, xileno, etilmetilcetona, tolueno, isopropanol y la acetona (Esquema 11). Esquema 11. Evaluación de la sostenibilidad de disolventes orgánicos tradicionales basados en la escala LCA y EHS. La flecha gris indica la tendencia hacia disolventes más sostenibles. (Imagen tomada y traducida de la referencia original(Capello y col. 2007)). Introducción 56 I.3.2.4. Disolventes orgánicos fluorados La extracción por disolvente es una técnica muy utilizada en química orgánica, siendo los disolventes más utilizados el éter dietílico, diclorometano, cloroformo y agua. Este proceso se realiza normalmente mediante la explotación de la inmiscibilidad de dos fases líquidas, por lo general una acuosa y otra orgánica (De Simone 2002). En este sentido los compuestos fluorados se conocen como la "tercera fase líquida", ya que los disolventes orgánicos, el agua y los compuestos fluorados son mutuamente inmiscibles (Figura 11) (De Simone 2002). Esta propiedad es a menudo una función dependiente de la temperatura y permite obtener a mayores temperaturas un sistema monofásico que luego desaparece a bajas temperaturas, facilitando obtener el producto deseado en una de las fases (Horváth y col. 1994; De Simone 2002; Xiang y col. 2002; Wende y col. 2003; Hobbs, Kirke, y col. 2007; Correa da Costa y col. 2011). Dada su variable solubilidad, los disolventes fluorados pueden ser empleados en reacciones químicas a temperaturas en las que solo existe una fase y posteriormente, se pueden enfriar hasta separar los reactivos y productos en la fase correspondiente. Esta característica aumenta la eficiencia de los sistemas de reacción y permite además recuperar el disolvente disminuyendo su impacto en el ambiente. Algunos disolventes fluorados (DF) son derivados perfluorados de alcanos, éter dietílico o trietilaminas. Estos disolventes fluorados se caracterizan por que sus interacciones moleculares son muy débiles, teniendo un menor punto de ebullición y una menor polaridad que los correspondientes alcanos (Khmelnitsky y col. 1991; Pérez y col. 2010). El disolvente perfluorado más barato Figura 11. Fotografía de tres fases: orgánica, inorgánica y fluorada. Introducción 57 disponible comercialmente es el conocido como “FC-72” ó perfluorohexano (C6F14). Sin embargo se han descrito muchas reacciones en el perfluorometil ciclohexano (PFMC), que es en si mismo una alternativa más costosa. Sin embargo, el uso a gran escala de DF se encuentra limitado por el alto coste que supone (Khmelnitsky y col. 1991; Hobbs and Thomas 2007). Respecto a la síntesis enzimática de glicoconjugados, los DF se han utilizado en forma de fluidos supercríticos (fluoroformo) con la β-galactosidasa de B. circulans, para la síntesis del 1-O-(5-fenilpentil)-β-D-galactopiranósido (Mori y col. 2002) y con lipasas para catalizar reacciones de transesterificación (tetrafluoroetano y fluoroformo) (Horváth 2005). I.3.2.5. Líquidos iónicos (LIs) Los líquidos iónicos (LIs) son una nueva clase de disolventes que han sido recientemente desarrollados y su uso se ha extendido ampliamente a varios campos de estudio, entre ellos, reacciones bajo catálisis enzimática (Kragl y col. 2002; van Rantwijk y col. 2003). Los LIs generalmente están formados por cationes orgánicos y aniones que pueden ser, tanto orgánicos como inorgánicos. Actualmente son sustancias que despiertan gran interés en cuanto a su uso, debido a sus muchas propiedades: son líquidos a temperatura ambiente (Galínski y col. 2006; van Rantwijk y col. 2007), térmicamente estables (Kosmulski y col. 2004), polares (Dzyuba y col. 2002), relativamente inertes (Chiappe y col. 2005), tienen una presión de vapor casi nula (Earle y col. 2006), no son inflamables (Fox y col. 2003), presentan una buena conductividad iónica (Tsuzuki y col. 2005), bajos puntos de fusión (Wasserscheid y col. 2000) y amplias ventanas electroquímicas (Hagiwara y col. 2000). Los bajos puntos de fusión de los LIs (generalmente inferior a 100ºC) (Welton 2004), se han explicado por el gran tamaño que poseen sus iones y la pequeña carga de los mismos, por lo que la energía necesaria para romper los enlaces entre éstos es más Introducción 58 baja que la energía requerida para disociar una sal clásica como el cloruro de sodio (Dupont y col. 2006). Respecto a su polaridad, los estudios espectroscópicos sugieren que es similar a la de los alcoholes de bajo peso molecular como el metanol y el etanol (Poole 2004). Muchas de las propiedades de los LIs tales como viscosidad, presión de vapor, polaridad, y solubilidad, entre otras, se pueden modificar con una correcta selección de los aniones y cationes, llegando incluso a diseñar LIs solubles en disolventes como hexano o incluso insolubles en agua (Wasserscheid y col. 2003; Poole 2004). Algunos de éstos disolventes pueden disolver cantidades relativamente grandes de hidratos de carbono, hasta 200 g/l de sacarosa, glucosa, lactosa y ciclodextrina (Liu y col. 2005), razón por la cual pueden ser una fuente de interés en la síntesis de enzimática de oligosacáridos. Inicialmente estas sustancias se consideraron como disolventes sostenibles útiles para procesos catalíticos (Sheldon 2001), ya que se pueden reciclar (Gathergood y col. 2004), aumentan en muchos casos los rendimientos y se pueden utilizar en lugar de disolventes orgánicos volátiles (incluso a temperaturas altas para reacciones enzimáticas y con mejores rendimientos), evitando con esto la emisión de vapores a la atmósfera (Sheldon 2001) y de riesgos a la salud humana (por inhalación). Por éste motivo, existen varias publicaciones que promocionan los LIs como disolventes sostenibles y de notorios resultados en catálisis enzimática (Madeira Lau y col. 2000; Earle y col. 2002; Park y col. 2003). Algunos autores sostienen que la biodegradabilidad de los LIs puede ser, en algunos casos, difícil de alcanzar y que la ecotoxicidad de los mismos puede superar la de disolventes orgánicos tradicionales (García 2005), sin embargo la estructura de cada LI puede ser utilizada para estimar teóricamente las probabilidades de su ecotoxicidad, lo cual es una herramienta que permite evitar el escalado de reacciones y procesos que luego pueden ser perjudiciales ambientalmente (Jastorff y col. 2003). Introducción 59 I.3.3. Galactosidasas en disolventes sostenibles Las galactosidasas son enzimas que tradicionalmente han sido utilizadas en medios acuosos tamponados, tanto para las reacciones de hidrólisis como de síntesis. Sin embargo, el uso de disolventes o cosolventes con este tipo de enzimas es un tema poco explorado. Por ejemplo la β-galactosidasas de E. coli y de Kluyveromyces fragilis han sido utilizadas caracterizadas en mezclas con hasta un 50% v/v de disolvente orgánico: acetona, acetonitrilo, monoglima, diglima, triglima y tetraglima entre otros. En estas condiciones presentaron menos del 40% de actividad hidrólitica (medida como Velocidad máxima (Vmax) en cinéticas tipo Michaelis-Menten) (Yoon y col. 2005). Se conocen también datos de la β-galactosidasa de A. oryzae en la síntesis de glicoconjugados con 1-feniletanol (Majumder y col. 2008). Una de las enzimas de interés para este trabajo es la β-galactosidasa de B. circulans, que tolera disolventes orgánicos como acetonitrilo, acetona y terc-butanol en bajas cantidades debido a que puede ser desnaturalizada, sin embargo en terc-butanol al 10% parece mostrar mejores resultados de actividad (Bridiau y col. 2010). Por otra parte, muchos de los datos medidos no corresponden a disolventes que se puedan considerar sostenibles, sino disolventes orgánicos tradicionales. En contraposición a la literatura, recientemente, en nuestro grupo de han desarrollado estudios de síntesis de disacáridos y glicoconjugados en presencia de disolventes derivados del glicerol (García y col. 2010) con la β-galactosidasa de E. coli.(Pérez-Sánchez, Cortés-Cabrera, y col. 2011). Los LIs ofrecen una serie de ventajas en la síntesis de carbohidratos debido a que éstos pueden ser solubles o insolubles, permitiendo obtener distintos procesos de transporte, separación y purificación de los carbohidratos (Sheldon y col. 2002; Murugesan y col. 2005; Prasad y col. 2010), sin embargo su uso junto con las β- galactosidasas es todavía un campo limitado. Se tiene constancia de que las β- galactosidasas del preparado comercial Biolacta de B. circulans (Kaftzik y col. 2002), Pyrococcus furiosus (Lang y col. 2006) y Aspergillus oryzae (Singh y col. 2010), se Introducción 60 han empleado en presencia de LIs. En el primer caso se han obtenido mayores rendimientos en la síntesis del disacárido (Galβ(1-4)GlcNAc) y mayor estabilidad de la enzima (Kaftzik y col. 2002), mientras que la enzima de P. furiosus, ha presentado moderados incrementos en la actividad sintética de la enzima (aproximadamente un aumento del 10% respecto a las condiciones en agua), pero también se han presentado efectos inhibitorios a altas concentraciones del LI (Lang y col. 2006). Respecto a la enzima de Aspergillus oryzae, se han obtenido mayores velocidades de hidrólisis del sustrato donador (oNF-β-Gal) (Singh y col. 2010). Recientemente, en nuestro grupo de investigación se han hecho estudios del efecto de LIs sobre la actividad de la enzima TTP0042 de Thermus thermophilus HB27, provocándose un aumento en la actividad y un cambio de regioselectividad hacia el Gal-β(1-4)-GlcNAc (Sandoval, Cortés, y col. 2012). I.3.4. Estudio de la influencia de los disolventes sostenibles en la actividad enzimática Los disolventes pueden ejercer numerosos efectos sobre las enzimas, que en muchos casos no son fáciles de dilucidar. El entorno químico de una enzima y en particular su centro activo, durante una reacción química, es muy complejo. Existen iones (en caso de que se use un medio tamponado), sustratos y disolventes, valores de pH y temperaturas, que afectan las interacciones entre las distintas partes de la reacción. Dada la complejidad del sistema, pueden darse interacciones tales como: enzima- disolvente, enzima-sustrato, sustrato-sustrato, sustrato-disolvente. Por ello resulta difícil comprender la globalidad de factores que determinan el resultado final de una reacción enzimática. En la actualidad, existen distintas herramientas tecnológicas que permiten medir en condiciones bastante sensibles y exactas, algunas de las interacciones que pueden darse durante una determinada reacción química. En el caso de las reacciones enzimáticas, se requiere desarrollar sistemas de alta sensibilidad y bajo consumo de muestra. Dentro de las opciones existentes para Introducción 61 estudiar las interacciones moleculares se puede la espectroscopía de fluorescencia, que es una herramienta útil para detectar cambios estructurales de las proteínas debido a la presencia de disolventes orgánicos en el medio de reacción. Otra herramienta que permite predecir, interpretar o explicar las posibles interacciones en ambientes microscópicos, es la bioinformática, a través del modelado molecular y el “docking” (Cardin y col. 1989; Uppenberg y col. 1995; Fotin y col. 2004; Stone y col. 2007). En el presente trabajo se utilizarán la espectroscopía de fluorescencia y el modelado molecular como herramientas para el análisis de los resultados obtenidos. I.3.4.1. Espectroscopia de Fluorescencia La fluorescencia es el resultado de la emisión de luz fotoinducida por un grupo fluoroforo. Este fenómeno requiere de una excitación previa, por medio de una radiación incidente a una determinada longitud de onda, que provoca la excitación de los electrones a un nivel energético excitado de la molécula (singlete excitado). La relajación de este estado provoca la emisión de luz con un máximo de emisión en una longitud de onda mayor que la inicial (Hovius y col. 2000; Michalet y col. 2006). Este fenómeno esta asociado a la presencia de fluoroforos que son estructuras rígidas y conjugadas que estabilizan el estado excitado. En el caso de las proteínas, la emisión de fluorescencia está directamente relacionada con la presencia del triptófano (anillo rígido conjugado) y en menor medida de la tirosina y de la fenilalanina (Vivian y col. 2001). Una alta presencia de triptófanos en la proteína garantizará un espectro de emisión intenso y fácil de medir, incluso en equipos de baja sensibilidad. Los cambios en el micro-entorno químico de un triptófano modifican la estructura del complejo excitado y con ello la longitud de onda de emisión y con ello los valores de longitud de onda en los que se obtienen los máximos de fluorescencia. Esta información permite obtener datos sobre la estructura terciaria de una proteína y permite medir el efecto de factores externos como el pH o agentes químicos sobre su Introducción 62 estructura terciaria (particularmente el entorno de los triptófanos), ya que la presencia de sustancias que afectan la estructura de la proteína repercutirá directamente en su espectro de fluorescencia (Vivian y col. 2001; Peng y col. 2004). I.3.4.2. Herramientas de Bioinformática Las simulaciones por ordenador han probado ser herramientas eficaces para entender las estructuras de las proteínas y sus dinámicas con el medio (Colombo y col. 2000; Colombo y col. 2002; Eswar y col. 2003). Existen varios programas informáticos, bases de datos y servidores que ofrecen numerosas herramientas para analizar y predecir características estructurales de las proteínas como por ejemplo: punto isoeléctrico, puentes disulfuro, plegamientos, etc. Estas predicciones se realizan en su mayoría basándose en algoritmos creados por homología con información de proteínas previamente caracterizadas. I.3.4.2.1. Bases de datos En los últimos años las bases de datos reúnen la información de genes y proteínas de numerosos organismos, así también ofrecen importantes herramientas de comparación entre la secuencias de un gen o proteína, lo que ha facilitado el acceso a este tipo de información a nivel mundial. Dentro de las bases de datos de mayor importancia para el análisis de proteínas se pueden citar las siguientes: NCBI: El NCBI es la base de datos del “Nacional Center for Biotechnology Information” de los Estados Unidos de América. Su dirección web es la siguiente: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Esta es una base de datos con múltiples funciones, ofreciendo: base de datos de literatura (PubMed, especializada en biomedicina), nucleótidos, herramientas para análisis de secuencia (GenBank) y herramientas para el diseño de estructuras Introducción 63 tridimensionales, entre otras. De ellas, una de las más utilizadas para el análisis comparativo de proteínas es el alineamiento de secuencias proteicas por medio de la herramienta “BLAST” (“Basic Local Alignment Search Tool”) (Altschul y col. 1990), la que permite obtener valores porcentuales de identidad entre dos ó mas proteínas. Protein Data Bank (PDB): El PDB (Bernstein y col. 1977), es una base de datos online del “Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)” de los Estados Unidos de América, que acepta el depósito de estructuras tridimensionales de proteínas. Su dirección web es la siguiente: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do Las macromoléculas disponibles en esta base de datos pueden encontrarse aisladas o bien en forma de complejos: proteína-proteína, proteína-ácido nucleíco y macromolécula-ligandos. Los modelos depositados provienen fundamentalmente de difracción de rayos-X y algunos de espectroscopía de RMN. A cada una de las entradas se les asigna un código de identificación formado por 4 caracteres denominado “PDB ID”. ExPASy (Expert Protein Analysis System): Esta es una herramienta online del “Swiss Institute of Bioinformatics” que permite determinar características de una determinada enzima a partir de su secuencia de aminoácidos en formato “Fasta(Fast Alignment)” (Pearson y col. 1988). Su dirección web es la siguiente: http://web.expasy.org/ Las herramientas más populares en la predicción de propiedades de proteínas son “ProtParam” (Gasteiger y col. 2005) y “SWISSPROT” (Boeckmann y col. 2003). En la primera de ellas se obtienen varios parámetros estimados a partir de una secuencia escrita en formato FASTA (Pearson y col. 1988), tales parámetros son: peso Introducción 64 molecular, punto isoeléctrico teórico, composición de aminoácidos, composición atómica, coeficiente de extinción molar, vida media estimada, índice de inestabilidad, índice alifático y promedio de hidrofobicidad. En la segunda de ellas se indexan todas las proteínas secuenciadas y contiene múltiples referencias a otras bases de datos. CAZy: Para el presente trabajo, CAZy (“Carbohydrate Active Enzymes”) (Cantarel y col. 2009) es una base de datos de gran utilidad, ya que ofrece información especializada en visualización y análisis de información genómica, estructural y bioquímica en enzimas activas sobre carbohidratos. La página ha sido desarrollada por el grupo de glicogenómica en arquitectura y función de las macromoléculas Biológicas de la Universidad del Mediterráneo en Provenza, Francia. Su dirección web es la siguiente: http://www.cazy.org/ La base de datos CAZy inició como página web en 1998 y en ella se describe las familias de los módulos catalíticos estructuralmente relacionados y los hidratos de carbono vinculados (o dominios funcionales) de las enzimas que degradan, modifican o crean enlaces glucosídicos. I.3.4.2.2. Modelado molecular y docking. Con la gran cantidad de proteínas registradas en las distintas bases de datos, muchas de ellas en formato 3D a partir de las estructuras cristalizadas correspondientes, existen múltiples oportunidades para interpretar y predecir resultados entre proteínas y distintas moléculas con las cuales interaccionan éstas. Para proteínas cuya estructura cristalina no está disponible, se requiere alinear correctamente la secuencia de aminoácidos con proteínas de similitud estructural y funcional similar, este trabajo se puede realizar con distintos servidores que ofrecen esta herramienta, como por ejemplo: MUSCLE (Edgar 2004). La homología puede Introducción 65 ser estudiada por herramientas ofrecidas en servidores como SWISS-MODEL (Schwede y col. 2003; Arnold y col. 2006) y “CPHmodels-3.0” (Nielsen y col. 2010). En otros casos, se pueden generar predicciones basadas en la interpretación de estructuras cristalizadas y analizadas previamente por difracción de rayos X, como ha sido el caso de la β-galactosidasa de T. thermophilus A4, cuya estructura cristalizada ha sido analizada por medio de software para comparar su centro activo con el de otras enzimas como la β-galactosidasa de E. coli (Hidaka y col. 2002). El docking es la principal herramienta de trabajo en las simulaciones por ordenador que pretenden explicar fenómenos relacionados con catálisis enzimática. Esta herramienta se basa en el anclaje de moléculas sobre las proteínas con las que interaccionan. Su estudio requiere de contemplar numerosos parámetros como: tiempo de simulación puentes de hidrógeno, fuerzas columbimétricas, efectos estéricos de las moléculas, etc. Del anclaje obtenido se realizan superimpocisiones que simulan las distancias entre los átomos de la proteína cuando está anclada o cuando está libre, permitiendo analizar la flexibilidad o rigidez de la misma (Armougom y col. 2006; Damm y col. 2006; Edgar 2010). De los paquetes de software que permite realizar distintas pruebas en sistemas donde se simula un complejo enzima-ligando uno de los más usados es el programa Autodock (Morris y col. 2009), el cual permite simular la unión covalente de los ligandos, utilizando tanto un método basado en la red de acoplamiento y una modificación de la técnica de cadenas laterales flexibles. Sin embargo se pueden mencionar otros paquetes informáticos como PRODRG server (Schuttelkopf y col. 2004), Massively Parallel Quantum Chemistry Program (MPQC) (Janssen y col. 2004), GROMOS y GROMACS.(Hess y col. 2008) Introducción 66 I.4. Estudios de interacciónes moleculares entre glicoestructuras y ligandos La necesidad de aumentar la comprensión de las interacciónes moleculares entre glicoestructuras, como pueden ser los glicodendrímeros o los glicopéptidos, con sus respectivos ligandos, ha provocado el desarrollo de sistemas de alta sensibilidad y bajo consumo de muestra. Dentro de las opciones existentes para estudiar las interacciones moleculares se pueden citar la resonancia magnética nuclear (RMN) por medio de diferencia de la transferencia de saturación (STD, del inglés Saturation Transfer Difference) que permite determinar los sitios de unión entre dos moléculas que interactúan entre sí (Klein y col. 1999; Wang y col. 2004; Wen y col. 2005), y la resonancia de plasmón de superficie (SPR, del inglés Surface Plasmon Resonance), una herramienta que permite inmovilizar macromoléculas y fluir sobre ellas una solución de analito o ligando, cuantificando la asociación y disociación entre ambas (D. G. Myszka 1997; Myszka y col. 2000; Rich y col. 2000; Homola 2003). Estas dos técnicas serán utilizadas en este trabajo para el estudio de interacciones moleculares. I.4.1. Resonancia de plasmón de superficie (SPR) La técnica de Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) permite llevar a cabo el análisis cinético de interacciones moleculares de un modo accesible, en tiempo real y sin la necesidad de marcar las moléculas. Como la detección es independiente de la naturaleza química de las muestras analizadas, en principio, todo tipo de moléculas son susceptibles de estudio por esta técnica: proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, fármacos, cofactores o carbohidratos(Karlsson 2004). La técnica de SPR se basa en la inmovilización de una molécula que actúa como receptora sobre una superficie de oro funcionalizado, con un grosor nanométrico. Esta superficie constituye en si misma un biosensor. Los biosensores de SPR (Esquema 12) detectan cambios en el índice de refracción en las proximidades de la superficie Introducción 67 de oro, utilizando luz polarizada, en la interfaz entre el soporte sólido y el medio líquido. La molécula inmovilizada pasa a formar parte de la superficie que es irradiada con un haz de luz, cuyo índice de refracción se modifica al fluir una disolución de ligando sobre la superficie ya que al fluir la disolución de analito se obtiene una asociación, mientras que al dejar de fluirla y pasar un medio distinto al analito (por ejemplo tampón) se obtiene una disociación, este efecto se mide en unidades de respuesta abreviadas como “RU” por sus siglas en inglés, normalmente se asocia el valor de 1 RU como el equivalente a 1 pg/mm2. Durante el experimento de SPR (D. G. Myszka 1997; Pattnaik 2005). Unidad de detección ópticaFuente de luz Luz polarizada Luz reflejada YYYYYY YY Chip sensor con lámina de oro Canal de flujo I II Prisma INTENSIDAD ÁNGULO III II I TIEMPO SEÑAL DE RESONANCIA Unidad de detección ópticaFuente de luz Luz polarizada Luz reflejada YYYYYY YYYYYYYY YY Chip sensor con lámina de oro Canal de flujo I II Prisma INTENSIDAD ÁNGULO III INTENSIDAD ÁNGULO III II I TIEMPO SEÑAL DE RESONANCIAII I TIEMPO SEÑAL DE RESONANCIA Esquema 12. Esquema del funcionamiento de un SPR. La luz incide sobre la superficie funcionalizada que está en contacto con una disolución de analito que fluye sobre ella. El cambio del índice de refracción es medido y con ello la interacción entre el receptor y el ligando. Los ensayos se llevan a cabo en presencia de un blanco, que es una superficie con las mismas características que la superficie original antes de inmovilizar al receptor, para obtener un valor que luego es restado a los ensayos de la superficie activada. La información obtenida genera un grafico denominado sensograma, en el cual se analizan los valores obtenidos entre la celda de interés y la celda control (Esquema 13) (D. G. Myszka 1997). Con esta técnica se pueden obtener datos de cinéticas Introducción 68 dentro de una gran variedad de interacciones macromoleculares, que incluyen sistemas de alta y baja afinidad entre el receptor y el ligando (Pattnaik 2005; Rich, Papalia, y col. 2009). El análisis cinético de la interacción, requiere eliminar los posibles falsos positivos, mediante la sustracción de la respuesta obtenida con la superficie de control. El modelo más simple es el de la interacción uno-uno (Langmuir), que puede ser aplicado en la mayoría de casos, sin embargo en determinadas situaciones, los procesos de asociación y disociación son tan rápidos que no permiten recoger información , lo que obliga a alcanzar el estado estacionario de la interacción, y con ello determinar la constante de disociación en el equilibrio (KD) o de asociación (KA) de la interacción entre analito y ligando (Homola 2008). Esquema 13. Representación de un sensograma. Inicialmente no hay inyección de analito y se observa una línea base. Cuando se inyecta el analito la señal aumenta a medida que se produce la interacción, es la fase da asociación. Cuando se deja de inyectar analito, se libera el espontáneamente el que está unido en la fase de disociación. Por último, se inyecta una disolución para recuperar la línea base evitando que quede analito asociado al ligando. Introducción 69 Parte de los avances en la técnica de SPR, radican en el diseño de los experimentos, en la actualidad existe gran variedad de chips funcionalizados, que ofrecen diversas alternativas para inmovilizar el receptor pero además existe la posibilidad de preparar chips en el laboratorio que luego son evaluados en el SPR (Smith y col. 2003; Suda y col. 2006; Linman y col. 2008; Muñoz y col. 2008; Munoz, Andre, y col. 2009), esto permite ampliar y mejorar las opciones de inmovilización y de cuantificación de interacciones moleculares. Gracias a los avances existentes y las numerosas opciones de trabajo en el SPR, muchas interacciones entre glicoestructuras y sus ligandos han llegado a ser cuantificadas (Duverger y col. 2003; Fernández-González y col. 2007; Hurtado-Gómez y col. 2008; Karamanska y col. 2008; Muñoz y col. 2009; Muñoz y col. 2010; Safina y col. 2011). La aplicación más común del SPR en glicobiología es el estudio de reconocimiento molecular carbohidrato-proteína. La mayoría de estos estudios de interacción carbohidrato-lectina se llevan a cabo con el glicoconjugado inmovilizado (Duverger 2003), puesto que de ese modo se intenta mimetizar la presentación de los glicoconjugados en las membranas biológicas. Sin embargo, la otra posibilidad, el inmovilizar la lectina en la superficie, ha sido por lo general menos empleada aunque según Shinohara y col. (1997) las constantes cinéticas y de afinidad determinadas son iguales por ambas aproximaciones. I.4.2. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) La espectroscopía de RMN proporciona un número elevado de técnicas para llevar a cabo el estudio de interacciones moleculares (Claridge 1999; Jiménez-Barbero 2003). Estas interacciones pueden ser estudiadas bajo condiciones muy diversas y con diferentes grados de complejidad (Kogelberg 2003). Desde la interacción de proteínas con proteínas en soluciones acuosas, o con proteínas embebidas en membranas, hasta la interacción de moléculas más pequeñas como los carbohidratos con proteínas que reconocen específicamente residuos glicosídicos. En este aspecto han sido muchos los estudios llevados a cabo en este tipo de interacciones, que se Introducción 70 puede analizar desde dos puntos de vista: por un lado, se puede estudiar la interacción desde el punto de vista de la proteína (receptor), y por otro, se puede basar el estudio en el análisis de las señales del carbohidrato o ligando. A pesar de que se obtenga una mayor información de la interacción desde el punto de vsta de las señales del receptor, se aplican con mayor frecuencia las técnicas basadas en los cambios en las señales del ligando. Entre los experimentos empleados para llevar a cabo esta determinación se encuentran los experimentos de transferencia del efecto nuclear Overhauser (tr-NOE) (Balaram 1972), que detectan la diferente movilidad rotacional del ligando en el estado libre frente al estado asociado y los experimentos de STD (Mayer 1999; Meyer 2003), que detectan la magnetización que se transfiere del receptor al ligando en el proceso de asociación. I.4.2.1. Experimentos de diferencia de la transferencia de saturación (STD) Los experimentos de STD se fundamentan en las diferentes propiedades entre la forma libre del ligando y el tamaño del complejo debidas principalmente a la diferencia de tamaño entre ambas (Mayer 1999; Mayer 2001; Meyer 2003). La utilidad de esta técnica radica en el potencial que tiene para la búsqueda de compuestos que se unan a ligandos y además la capacidad de determinar los epítopos de reconocimiento del ligando a nivel atómico (Mayer 1999) El experimento se basa, como ya se ha dicho, en la transferencia de la saturación desde la proteína al ligando en el estado asociado y que por su parte está en equilibrio con su estado libre en disolución, siendo en la forma libre en la que se detecta la saturación. De este modo, la sustracción del espectro en el que se saturan las resonancias de la proteína del espectro en el que no se saturan, se obtiene un nuevo espectro, diferencia, en el que sólo se observan las señales del ligando que se hayan visto afectadas por la saturación. Introducción 71 Con los experimentos STD, es posible detectar interacciones ligando-proteína cuando las constantes de disociación están entre 10-3 y 10-8 M. Las aplicaciones de estos experimentos de STD son muy variadas, por ejemplo se ha descrito la posibilidad de determinar los protones de los ligandos que interaccionan con la proteína de una mezcla de moléculas procedentes de extractos o bibliotecas (Klein 1999; Meinecke y col. 2001; Moller y col. 2002; Claasen y col. 2005). El STD, también permite llevar a cabo estudios de reconocimiento del sustrato por parte de una enzima (Berteau 2003; Angulo 2006; Blume 2006). Por ejemplo, el grupo del Prof. Peters y col. se ha estudiado la especificidad de la galactosiltransferasa humana responsable de la síntesis del determinante antigénico del grupo sanguíneo B por el sustrato donador (Angulo 2006; Blume 2006). Además, tiene aplicación para llevar a cabo un mapeo refinado de los epítopos de diferentes glicoconjugados en su unión a proteínas que reconocen selectivamente carbohidratos. Por ejemplo, Bhunia y col. (2004) y Haselhorst y col.(2001) han empleado estos experimentos STD para llevar a cabo el reconocimiento de sialil Lewisx mediante dos lectinas específicas de estos residuos. Incluso, para la aplicación de los experimentos STD a células enteras, se ha descrito una técnica de doble diferencia (STDD-NMR) que básicamente lo que hace es filtrar la señal de fondo de la célula (Claasen y col. 2005). Objetivos 73 II. OBJETIVOS Objetivos 74 II. Objetivos El objetivo general de la presente Tesis Doctoral es la obtención de biocatalizadores útiles en la síntesis de glicoestructuras de interés biológico en condiciones sostenibles. Para el desarrollo de este objetivo, se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Búsqueda de glicosidasas de organismos mesófilos y termófilos útiles en la síntesis de oligosacáridos de interés biológico. 2. Clonaje y caracterización de la enzima β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382 aplicada a la síntesis de disacáridos de interés biológico. 3. Síntesis enzimática de disacáridos de interés biológico (Gal-β(1-3)-GlcNAc y Gal-β(1-3)-GalNAc) utilizando la enzima β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382 en presencia de disolventes sostenibles. 4. Análisis estructural mediante espectrometría de fluorescencia y modelado molecular de la influencia de disolventes sostenibles en las reacciones enzimáticas catalizadas por la enzima β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382. 5. Inmovilización mediante diferentes aproximaciones (polímeros macroporosos activados con grupos epóxido y glioxil agarosas activadas con grupos aldehído) de la enzima β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382. 6. Obtención de glicosintasas útiles en la síntesis de glicoconjugados (β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382 y TmGalA D327G de Thermotoga maritima.) y caracterización del efecto de disolventes sostenibles sobre su actividad. Objetivos 75 7. Utilización de glicosiltransferasas o sialiltransferasas (α2,3SiaT y α2,3SiaT de Photobacterium sp) en la síntesis de glicodendrímeros funcionalizados con ácido siálico y derivados. 8. Estudio de la interacción carbohidrato-proteína de los glicodendrímeros preparados en el apartado 8 mediante Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) y Resonancia Magnética Nuclear (RMN). 9. Utilización de diferentes enzimas (glicosidasas, lipasas, proteasas, oxidasas) para la modificación estructural de antibióticos de tipo glicopéptido. 10. Estudio de interacciones de glicopéptidos con precursores de peptidoglicano bacteriano y superficies hidrofóbicas mediante SPR. Resultados y Discusión 77 III. RESULTADOS Y DISCUSÓN Resultados y Discusión 78 III.1. Capítulo 1. Búsqueda de glicosidasas útiles en la síntesis de oligosacáridos de interés biológico Como se ha explicado en lel apartado I.1 de la Introducción, para profundicar en el conocimiento acerca de las diferentes funciones de los glicoconjugados, es necesario disponer de herramientas que permitan obtener estos compuestos a gran escala y con un alto grado de pureza. Por ello, el objetivo inicial de esta Tesis Dosctoral fue la obtención de nuevas enzimas glicosidasas capaces de llevar a cabo reacciónes de síntesis de oligosacáridos. En este Capítulo se utilizaron técnicas de microbiología, biología molecular y bioinformática, para realizar una búsqueda de enzimas mesófilas y termófilas que pudieran realizar reacciones de transglicosidación. III.1.1. Selección de organismos mesófilos productores de glicosidasas Se partió de una colección de microorganismos perteneciente a nuestro grupo de investigación, todos ellos catalogados como nivel 1 de seguridad biológica, por lo que no es necesario tomar especiales medidas de seguridad en su manejo, crecimiento y conservación. Esta colección se denominó colección BTG. Los microorganismos de la colección BTG no estaban identificados, así que se comenzó por la revitalización generalizada de todas las bacterias que componían la misma, designadas con las siglas TCB y sumaban en total 122 ejemplares. Muchas de ellas llevaban varios años congeladas en glicerol al 20 % a -80 ºC, así que su viabilidad podía verse comprometida, por lo que se utilizó para la revitalización caldo cerebro-corazón enriquecido con glucosa al 20 %. Éste es un medio de cultivo enriquecido que se utiliza especialmente para crecer microorganismos que sean problemáticos en su crecimiento, o que hayan perdido las condiciones óptimas en su Resultados y Discusión 79 conservación, ya sea por su antigüedad o por falta de mantenimiento de la temperatura. En estos casos, este medio suele ofrecer mejores resultados que otros medios generales más convencionales, como puede ser el medio LB. De aquellos microorganismos que consiguieron ser revitalizados, se llevó a cabo una siembra en placa con LB agar para su crecimiento en césped, una inoculación en medio líquido LB, y un agotamiento de asa en placas de LB agar. Dado el gran número de organismos revitalizados con los que se contaba, para facilitar el trabajo con ellos y en previsión a su posterior escalado para la producción enzimática, se seleccionaron aquellos que en su crecimiento cumplían los siguientes requisitos: 1-Crecimiento en medio LB tanto sólido como líquido en 24 horas a 30 ºC. 2-Pureza de los cultivos, determinada a partir del agotamiento de asa en placas de LB agar y a través de observación en el microscopio de los crecimientos en LB líquido. De todos los microorganismos seleccionados, en total 82, se crearon copias en criotubos para su conservación a -20 ºC, a -80 ºC y liofilizados, tal y como se describe en el apartado V.2.1.2.2. III.1.1.1. Selección de microorganismos mesófilos productores de glicosidasas Se realizó según el protocolo que se detalla en el apartado V.2.4.1.1 de Materiales y Métodos. La reacción de hidrolisis se llevo a cabo empleando células en condiciones de no crecimiento, es decir, cultivadas en medio liquido hasta alcanzar la fase estacionaria. La selección se basó en la búsqueda de actividades glicosidasa, para lo que se utilizó una batería de sustratos hidrolizables por estas enzimas, que, tras producirse la reacción, liberan al medio una molécula de p-nitrofenol (pNF). Los Resultados y Discusión 80 sustratos utilizados fueron p-nitrofenil-α-D-fucopiranósido (pNF-α-Fuc), p- nitrofenil-β-D-fucopiranósido (pNF-β-Fuc), p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido (pNF-α-Gal), p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (pNF-β-Gal), p-nitrofenil-α-D- glucopiranósido (pNF-α-Glu), p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (pNF-β-Glu), p- nitrofenil-α-D-manopiranósido (pNF-α-Man), p-nitrofenil-β-D-manopiranósido (pNF-β-D-Man), p-nitrofenil-α-N-acetilglucosaminopiranósido (pNF-α-GlcNAc) y p-nitrofenil-β-N-acetilglucosaminopiranósido (pNF-β-GlcNAc). Este compuesto en disolución adquiere una coloración amarillenta que es detectable espectrofotométricamente a 405 nm. El uso de lector de microplacas facilitó la labor de medición de absorbancia, dado el gran número de microorganismos y de sustratos a estudiar. Para considerar los resultados positivos o negativos se aplicaron los siguientes criterios: -Absorbancia entre 0 y 0,05 se consideró resultado negativo (-). -Absorbancia entre 0,05 y 0,5 se consideró resultado positivo (+). -Absorbancia mayor de 0,5 se consideró resultado doble positivo (++). Los resultados se muestran en la Tabla 2, en la que solo aparecen aquellos que presentaron actividad al menos en uno de los ensayos. Como se puede observar, se obtuvieron resultados positivos y doble positivos para prácticamente todas las actividades glicosidasa ensayadas. Las únicas actividades de las que no se obtuvo ningún candidato positivo fueron la hidrólisis de pNF-α-Fuc y pNF-α-GlcNAc. El encontrar organismos que no son capaces de producir ningún tipo de actividad puede ser debido al hecho de utilizar medios de crecimiento ricos sin inducción, por lo que la producción basal de este tipo de enzimas es demasiado baja como para ser detectada.(Madigan y col. 2003) Resultados y Discusión 81 Tabla 2. Resultados del screening de actividades de microorganismos productores de glicosidasas. pNF- β-Fuc α-Fuc β-Glu α-Glu β-Gal α-Gal β-Man α-Man β-GlcNAc α-GlcNAc TCB 4 - - + - - - - - - - TCB 5 - - + - - - - - - - TCB 6 - - + - - - - - - - TCB 104 + - ++ - + - - - ++ - TCB 112 - - + + - - - - ++ - TCB 118 - - - + - - - - - - TCB 1600 - - + - - - - - - - TCB 1607 - - - - - - - - + - TCB 1613 - - - - - - - - + - TCB 1614 - - ++ + + - - - + - TCB 1616 - - ++ + + - - - + - TCB 1620 - - - - - - - - + - TCB 1628 - - + + + + - - ++ - TCB 1638 - - + - + - - - ++ - TCB 1639 - - ++ - + - - - ++ - TCB 1642 - - + - + - - - - - TCB 1645 + - ++ - + - + - - - TCB 165 - - ++ - - - - - + - TCB 1652 - - + - + - - - - - TCB 1659 - - + + ++ + + + ++ - TCB 1662 - - + - - - - - - - TCB 1675 - - + - + - - - ++ - TCB 1689 - - + + + + - + ++ - TCB 1692 - - ++ - + - - - - - TCB 1699 + - ++ ++ - - - - + - TCB 1704 ++ - ++ ++ + - - - ++ - TCB 1705 - - ++ - + - - - ++ - TCB 1706 - - ++ + + - - - + - TCB 1707 - - + - + - - - - - TCB 1715 - - + - + - - - ++ - TCB 1716 - - ++ - + - - - ++ - TCB 1718 - - ++ - - - - - ++ - Resultados y Discusión 82 pNF- β-Fuc α-Fuc β-Glu α-Glu β-Gal α-Gal β-Man α-Man β-GlcNAc α-GlcNAc TCB 1719 - - ++ - + - - - ++ - TCB 1724 - - + - + - - - - - TCB 1727 - - ++ - + - - - ++ - TCB 1728 - - + - + - - - - - TCB 1733 - - + + + - - - - - TCB 1734 + - + ++ + - - - - - TCB 1740 - - - - + - - - ++ - TCB 1742 + - + - - - - - - - TCB 190 - - + ++ - - - - - - TCB 255 - - ++ - + - - - + - TCB 308 - - + - - - - - - - TCB 329 ++ - ++ ++ + + - + ++ - TCB 355 - - + - - - - - - - TCB 368 - - + - - - - - - - TCB 369 - - + - - - - - - - TCB 408 - - - - - - - - ++ - TCB 410 - - + + + + - + + - TCB 423 - - + - + - - - - - TCB 427 - - + + + + - + + - TCB 432 ++ - + + ++ - - - - - TCB 441 - - - ++ - + - - ++ - TCB 448 - - ++ + + + - + + - TCB 449 + - + - - - - - - - TCB 464 + - + - - - - - - - TCB 468 - - - ++ - - - - ++ - TCB 47 - - ++ ++ - + - ++ + - TCB 471 - - + ++ - - - - - - TCB 472 - - + - - - - - + - Resultados y Discusión 83 Al recibir la colección sin identificar, se corría el riesgo de seleccionar microorganismos productores de enzimas ya caracterizadas, poco novedosas o de poco interés. Por ello, se decidió comenzar la búsqueda de microorganismos capaces de sintetizar oligosacáridos por aquellos candidatos que presentaron actividad β- fucosidasa, los cuales aparecen en la Tabla 3. Tabla 3. Selección de microorganismos con actividad β-fucocosidasa Código p-nitrofenil-β-D-fucopiranósido TCB 104 + TCB 1645 + TCB 1699 + TCB 1704 ++ TCB 1734 + TCB 1742 + TCB 329 ++ TCB 432 ++ TCB 449 + TCB 464 + III.1.1.2. Búsqueda de actividad de transglicosidación con células enteras de organismos mesófilos Como se explicó en la Introducción de esta memoria (apartado I.2.1), las glicosidasas, además de llevar a cabo reacciones de hidrólisis, en determinados casos también pueden utilizar el sustrato como donador para realizar reacciónes de transglicosidación. Por ello, una vez elegidos los candidatos para la búsqueda, éstos se utilizaron como biocatalizadores en reacciones de transglicosidación, tal y como se explica en el apartado V.2.4.1.3, utilizando como donador pNF-β-Fuc frente a una batería de monoscaridos aceptores compuesta por D-(+)-fucosa (Fuc), D-(+)-fructosa (Fru), D-(+)-galactosa (Gal), D-(+)-glucosa (Glu), D-(+)-galactosamina (GalNH2), D-(+)-manosa (Man), N-acetilgalactosamina (GalNAc) y N-acetilglucosamina (GlcNAc). Resultados y Discusión 84 En ninguna de las 80 reacciones se obtuvo ningún resultado positivo para la síntesis de disacáridos. Esto demuestra por una parte que no todas las enzimas capaces de hidrolizar azúcares son capaces de realizar reacciones de transglicosidación, por otro lado, trabajar con células enteras dificulta el control estricto sobre las condiciones de reación, ya que puede haber reacciones secundarias que inhiban la síntesis o degraden los productos. Además, al no estar identificada la colección BTG, no conocer la especie de los microorgnismos con los que que se han realizado las reacciones impide conocer las condiciones óptimas de crecimiento, recursos genéticos o caracterizaciones enzimáticas previas. Por todo lo citado anteriormente se seleccionó uno de los microorganismos más activos para la hidrólisis de PNF-β-Fuc, el TCB 329, para ser identificado genéticamente y poner a punto las condiciones de purificación de la enzima β- fucosidasa. TCB 329 es, entre los doble positivos para β-fucosidasa, la que más actividades presenta (Tabla 4). Tabla 4. Resultados actividades hidrolíticas de TCB 329 pNF- β-Fuc α-Fuc β-Glu α-Glu β-Gal α-Gal β-Man α-Man β-GlcNAc α-GlcNAc TCB 329 ++ - ++ ++ + + - + ++ - La bacteria TCB 329 se creció en medio LB líquido y su DNA fue extraído tal y como se describe en el apartado V.2.2.1. Para confirmar que la extracción fue correcta se realizó una electroforesis en gel de agarosa (apartado V.2.2.7) (Figura 12), en el que se pueden observar dos bandas. La banda 1 se corresponde con el cromosoma en conformación de círculo abierto, y la banda 2, con el cromosoma covalentemente cerrado. El DNA extraído fue enviado para su identificación a la Unidad de Genómica del Parque Científico de Madrid. La identificación fue llevada a cabo mediante la secuenciación de la subunidad 16s ribosómica. La bacteria fue identificada como Cellulomonas gelida. Resultados y Discusión 85 Figura 12. Gel de agarosa. Extracción de DNA. Banda 1: Cromosoma en conformación de círculo abierto. Banda 2: Cromosoma en conformación de círculo covalentemente cerrado. C. gelida es una bacteria celulolítica que fue originalmente aislada de suelos ricos en materia vegetal. Se sabe que es capaz de utilizar como fuente de carbono los siguientes compuestos: Celulosa, almidón, D-xilosa, L-arabinosa, D-glucosa, D- manosa, D-galactosa, celobiosa, maltosa, trehalosa, sacarosa y acetato, y su genoma no está secuenciado (Stackerbrandt 2005). III.1.1.3. Inducción de la producción de β-fucosidasa de Cellulomonas gelida La enzima β-fucosidasa produce la hidrólisis de residuos de fucosa. Es frecuente que las enzimas con esta actividad también presenten actividad β-galactosidasa, y en muchos caso también β-glucosidasa, debido a fenómenos de promiscuidad de sustrato (Nord y col. 1972; Wiederschain y col. 1973; Calvo y col. 1983; Melgar y col. 1985; Den Tandt 1987; Nunoura y col. 1996; Srisomsap y col. 1996). Cabría esperar que la presencia de disacáridos en el medio de crecimiento bacteriano provoque la activación de los sistemas genéticos implicados en la fabricación de esta enzima, al igual que ocurre con el operón lac, que es activado por la presencia de lactosa para la síntesis de β-galactosidasa, entre otras enzimas y transportadores (Mathews y col. 2003). Resultados y Discusión 86 Al utilizar medio LB diluido, se pretendió forzar a la bacteria a utilizar los disacáridos como fuente de carbono y así, aumentar la producción de las enzimas implicadas en el metabolismo de estos. Para ver el efecto inductor de los distintos disacáridos se procedió a realizar cultivos en presencia de un 1 % de los disacáridos celobiosa lactosa, maltosa, melibiosa y sacarosa, tal y como se muestra en el apartado V.2.1.3.1. Llevada a cabo la producción por triplicado en presencia de los distintos disacáridos y roto las células y liofilizados los estractos (apartados V.2.1.6 y V.2.5.7 respectivamente), se midió su actividad hidrolítica tal y como se describe en el apartado V.2.4.1.2, cuyos resultados se muestran en la Figura 13. La lactosa y la sacarosa muestran una actividad muy similar a la del control no inducido. La maltosa y la melibiosa aumentan en cierta medida la producción de β-fucosidasa respecto al control (3 y 2,5 veces respectivamente), pero el resultado más notable se encuentra cuando se utiliza celobiosa (Glu-(β(1-4)-Glu) como inductor. En este caso la actividad es más de ocho veces mayor que en el control (167,9 frente a 21,1 UI). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 A ct iv id ad [µ m ol /(m in .m g) ] Control Celobiosa Lactosa Maltosa Melibiosa Sacarosa Figura 13. Actividad β-fucosidasa de C. gelida después de haber crecido en presencia de los inductores celobiosa lactosa, maltosa, melibiosa y sacarosa. Resultados y Discusión 87 Hsing y Canale-Parola en 1992 descubrieron que C. gelida presenta quimiotaxis positiva hacia celobiosa, es decir, es capaz de detectar gradientes de celobiosa y, al ser una bacteria móvil, desplazarse hacia los puntos donde la concentración de ésta sea mayor (Hsing y col. 1992). También descubrieron que esta bacteria posee en su pared dos tipos de receptores: el Cb1, que es exclusivo de celobiosa y es inducible, y el Cb2, que es capaz de detectar tanto celobiosa como glucosa y que es constitutivo. Todo esto es compatible con el hecho de que C. gelida es una bacteria celulolítica y que la celobiosa es el producto mayoritario de la hidrólisis de la celulosa. Estos investigadores propusieron un modelo del mecanismo de supervivencia de esta bacteria en su medio natural. En él, determinan que las celulasas extracelulares producidas por otras bacterias hidrolizan la celulosa proveniente de restos de plantas. Esta hidrólisis genera un gradiente de concentración de celobiosa. C. gelida detecta este gradiente con su receptor Cb2 constitutivo, lo que hace que migre hacia el origen de la celobiosa. A su vez, se activan los sistemas para la síntesis del receptor Cb1, lo que multiplica la respuesta quimiotáctica. La llegada de más bacterias celulolíticas provoca mayor degradación de celulosa, manteniendo el gradiente de celobiosa mientras esta es consumida. Este modelo, que demuestra que la presencia de celobiosa en el medio induce la síntesis del receptor Cb1, podría explicar por qué este disacárido aumenta considerablemente la producción de la enzima con actividad β-fucosidasa. Esto es debido a que las enzimas con actividad β-fucosidasa también presentan actividad β- galactosidasa y β-glucosidasa (Nord y col. 1972; Wiederschain y col. 1973; Calvo y col. 1983; Melgar y col. 1985; Den Tandt 1987; Nunoura y col. 1996; Srisomsap y col. 1996), la celobiosa (compuesta por dos moléculas de β-glucosa) induce la síntesis de la enzima por su actividad β-glucosidasa para la hidrolisis del disacárido. Debido a la promiscuidad de sustrato, indirectamente también aumenta la actividad β-fucosidasa ya que se trataría de la misma enzima. Resultados y Discusión 88 III.1.1.4. Purificación de la enzima β-fucosidasa de Cellulomonas gelida La β-fucosidasa de C. gelida es una enzima intracelular, por lo que es necesario romper las células para poder extraerla (Apartado V.2.1.6). Esto implica que la enzima va acompañada de todos los componentes intracelulares. Para poder llevar a cabo la caracterización estructural de la enzima, así como su secuenciación, es necesario purificarla. III.1.1.4.1. Precipitación fraccionada con sulfato amónico El sulfato amónico aumenta la fuerza iónica del medio forzando a las proteínas a unirse por sus regiones menos hidrofílicas, formando agregados y precipitando. Dependiendo de la estructura de las dferentes proteínas presentes en el medio, el aumento gradual de concentración de la sal provoca su precipitación escalonada. III.1.1.4.1.1 Efecto del sulfato de amonio sobre la actividad enzimática Puesto que para determinar la fracción en la que precipita la enzima era necesario realizar una prueba de actividad (apartado V.2.4.1.2.1), antes de llevar a cabo la precipitación se midió la actividad del extracto en presencia de sulfato amónico, tal y como se explica en el apartado V.2.3.3.1.1. El resultado de este ensayo fue una pérdida total de actividad en el 20 % de concertación de este. Por ello es necesario retirar la sal de la disolución para poder determinar la fracción en la que se encuentra la enzima, para lo que se utilizaron tubos vivaspin (Sartorius) de 30 kDa. Al no conocer el peso molecular de la enzima β-fucosidasa de Cellulomonas gelida, se comprobó que ésta no atraviesa la membrana de 30 kDa. Tras centrifugar una alícuota en vivaspin y hacer lavados con tampón, se comprueba que la actividad permanece en la fracción que no atraviesa la membrana, lo que concuerda con los datos bibliográficos, en los que la β-fucosidasa de menor peso molecular localizada en otro organismo es la de Bifidobacterium breve, de 47 kDa (Nunoura y col. 1996). Resultados y Discusión 89 III.1.1.4.1.2 Precipitación fraccionada con sulfato amónico Al realizar la precipitación, añadiendo concentraciones crecientes de sulfato amónico (como se detalla en el apartado V.2.3.3.1.2), se localizaron fracciones positivas para actividad β-fucosidasa en todos los pasos entre el 30 y el 70% de saturación de sal. Esto se debe a que ésta es una técnica de purificación muy poco precisa, utilizada sobre todo para concentrar proteínas. Para perder la menor cantidad de enzima posible se conservó todo el intervalo de proteínas que precipitan entre 30 y 70%. Además, con una concentración del 30 % de sulfato amónico ya han precipitado la mayoría de proteínas y contaminantes no proteicos del extracto. Las muestras se analizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) para observar el grado de pureza (apartado V.2.3.2.1). El rendimiento de los distintos pasos de purificación y la electroforesis se muestran aprupados en el apartado III.1.1.4.4. III.1.1.4.2. Aislamiento por cromatografía de intercambio iónico discontinua Tras la precipitación fraccionada con sulfato amónico se llevó a cabo una cromatografía de intercambio iónico en discontinuo. Para poner a punto las condiciones de la purificación, se utilizaron distintos tipos de sefarosa (Q, DEAE, S y CM), cuyas características se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Tipos de resinas empleadas para la purificación de la β-fucosidasa de C. gelida. Intercambio Tipo Nombre Carga de la resina Carga de las moléculas retenidas Aniónico Catiónicas Q + - pH>pI DEAE + - Catiónico Aniónicas S - + pH Precipitación con sulfato amónico. 2 -> Cromatografía de intercambio aniónico. 3->Fracción 10 de la cromatografía de exclusión molecular. 4-> Proteínas patrón preteñidas. 5, 6 y 7 -> Fracciones 11, 12 y 13 respectivamente de la cromatografía de exclusión molecular. Se puede observar que tras cada paso de la purificación se van obteniendo menos bandas y las bandas predominantes se observan más concentradas, aunque no se ha logrado una purificación total. Al no conocer el peso molecular de la β-fucosidasa de C. gelida, no se puede saber qué banda o bandas corresponden a la enzima. III.1.1.4.5. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas. La electroforesis nativa no ofrece datos concretos sobre peso molecular, ya que debido a que las proteínas mantienen su estructura nativa, el avance se ve afectado por su carga neta, forma y número de subunidades, entre otros factores. Se llevó a cabo esta electroforesis en gel de poliacrilamida al 12,5 % para poder hacer uso del sustrato 4-metilumbeliferil-β-D-fucopiranosido (Fuc-β-MU) y localizar la banda en la que se encuentra la enzima. Este sustrato, al ser hidrolizado, libera la molécula de 4-metil-umberiferona, que emite fluorescencia cuando se expone a luz UV. Puesto que se debe producir la reacción de hidrólisis de este sustrato para poder localizar la Resultados y Discusión 96 banda, es importante que en todo el proceso de purificación y en la propia electroforesis la enzima mantenga su actividad. Para llevar a cabo la electroforesis se siguió el protocolo expuesto en el apartado V.2.3.2.2, y el revelado con el sustrato de Fuc-β-MU según el apartado V.2.3.3.4 (Figura 18). Como se puede observar, con este procedimiento se puede localizar con claridad la banda que corresponde con la enzima. 1 2 3 4 5 6 7 Figura 18. Electroforesis en condiciones nativas de las distintas etapas de purificación de la enzima con actividad β-fucosidasa. Carriles: 1. Precipitación con sulfato amónico. 2. Cromatografía de intercambio aniónico. 3, 4, 5 y 6. Fracciones 10, 11, 12 y 13 respectivamente de la cromatografía de exclusión molecular. 7. Carril con fracción 13 de la cromatografía de exclusión molecular, cortado del gel, incubado con Fuc-β-MU y revelado con luz UV. Para poder profundizar en la caracterización estructural de la enzima y su actividad, se debe conseguir un grado de pureza homogéneo. Para ello, es necesario utilizar otro tipo de procedimientos cromatográficos, como cromatografía de hidrofobicidad, o mejorar los protocolos aquí expuestos, como por ejemplo, llevar a cabo la cromatografía de intercambio iónico en DEAE-sefarosa en columna y en gradiente continuo de cloruro sódico, para así conseguir una mayor resolución. Otra opción puede ser realizar esta cromatografía, en lugar de a pH 7, en el que todas las Resultados y Discusión 97 proteínas estarán cargadas negativamente, a uno más bajo, como puede ser pH 5, para aumentar las diferencias de afinidad por punto isoeléctrico. Obtenido este grado de pureza de la enzima β-fucosidasa de C. gelida, se utilizó la fracción 13 de la cromatogafía de exclusión molecular para llevar a cabo la búsqueda de actividad de transglicosidación III.1.1.5. Búsqueda de actividad de transglicosidación con β- fucosidasa semipurificada de C. gelida Se llevaron a cabo reacciones de transglicosidación con la enzima β-fucosidasa obtenida en la fracción 13 de la cromatografía de exclusión molecular (apartado III.1.1.4.3). Las reacciones se realizaron como se describe en el apartado V.2.4.2.2, utilizando como donador pNF-β-fuc y como aceptores una batería de monosacáridos compuesta por Fuc, Fru, Gal, Glu, GalNH2, Man, GalNAc y GlucNAc. No se produjo síntesis de disacáridos en ninguna de las reacciones ensayadas. Se ha obtenido por primera vez una enzima con actividad β-fucosidasa de la bacteria C. gélida. Esta enzima, a pesar de no presentar actividad de transglicosidación, muestra una elevada actividad hidrolítica, lo que evidencia su gran potencial para ser utilizada en procesos de hidrólisis de β-fucósidos. Resultados y Discusión 98 III.1.2. Búsqueda de termozimas con actividad glicosidasa y glicosiltransferasa La segunda parte de este capítulo consiste en la búsqueda de enzimas termófilas (termozimas) de tipo glicosidasa y glicosiltransferasa en la cepa PRQ25 de Thermus thermophilus. Primero se llevó a cabo un screening de actividad hidrolítica con las células enteras de este microorganismo. Después se realizó una búsqueda bioinformática en el genoma de la bacteria para localizar las secuencias que transcriben para los genes de posibles enzimas con actividad glicosidasa y glicosiltransferasa, para su posterior clonaje en E. coli y caracterización. III.1.2.1. Búsqueda de actividades glicosidasa con células enteras de T. thermophilus PRQ25 Se realizó un cribado en presencia de una batería de monosacáridos activados con una molécula de pNF según las condiciones del apartado V.2.4.1.1. Los sustratos utilizados fueron pNF-α-Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF- β-Glu, pNF-α-Man, pNF-β-D-Man, pNF-α-GlcNAc y pNF-β-GlcNAc. Las reacciones de hidrólisis se llevaron a cabo empleando células en condiciones de no crecimiento, es decir, cultivadas en medio líquido hasta alcanzar la fase estacionaria. Los resultados se muestran en la Tabla 7. Para considerar los resultados positivos o negativos se aplicaron los siguientes criterios: -Absorbancia entre 0 y 0,05 se consideró resultado negativo (-). -Absorbancia entre 0,05 y 0,5 se consideró resultado positivo (+). -Absorbancia mayor de 0,5 se consideró resultado doble positivo (++). Como se puede observar, las células enteras de T. thermophilus PRQ25 son capaces de hidrolizar pNF-α-Glu y pNF-α-Man. Resultados y Discusión 99 Tabla 7. Resultados del screening de actividades glicosidasa en T. thermophilus PRQ25. pNF- β-Fuc α-Fuc β-Glu α-Glu β-Gal α-Gal β-Man α-Man β-GlcNAc α-GlcNAc TtPRQ25 - - - ++ - - - + - - III.1.2.2. Búsqueda de actividades de transglicosidación con células enteras de T. thermophilus PRQ25 Una vez descubiertos los sustratos para los que la cepa PRQ25 es activa hidróliticamente (pNF-α-Glu y pNF-α-Man), se procedió a usarlos como donadores para comprobar si estas bacterias son capaces sintetizar disacáridos mediante reacciones de transglicosidación. Se llevó a cabo el screening tal y como se explica en el apartado V.2.4.1.3 frente a una batería de monosacáridos aceptores compuesta por Fuc, Fru, Gal, Glu, GalNH2, Man, GalNAc y GlcNAc. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 8. Tabla 8. Reacciones de transglicosidación con células enteras de T. thermophilus PRQ25 y pNF-α-Glu o pNF-α-Man como donadores frente a una batería de monosacáridos aceptores compuesta por Fuc, Fru, Gal, Glu, GalNH2, Man, GalNAc y GlcNAc. Fuc Fru Gal Glu GalNH2 Man GalNAc GlcNAc pNF-α-Glu - + - + - - - - pNF-α-Man - - - - - + - - Las células enteras de T. thermophilus PRQ25 presentan actividad de transglicosidación cuando se utiliza pNF-α-Glu como donador y Fru o Glu como aceptor, y cuando se utiliza pNF-α-Man como donador y Man como aceptor. En el año 2005, Silva y col. observaron que T. thermophilus presenta en su superficie transportadores específicos para sacarosa (Glu-α-(1-2)-β-Fru), isomaltulosa (Glu-α- (1-6)-Fru), maltosa (Glu-α-(1-4)-Glu) y trehalosa (Glu-α-(1-1)-α-Glu), además no reconocen Gal y Fru (Silva y col. 2005), lo que se corresponde con los resultados obtenidos. Resultados y Discusión 100 III.1.2.3. Búsqueda de potenciales glicosidasas y gicosiltransferasas en el genoma T. thermophilus PRQ25 Puesto que el genoma de T. thermophilus PRQ25 ha sido secuenciado y anotado en el laboratorio del Dr. Berenguer (Alvarez y col. 2011), se llevó a cabo un rastreo bioinformático en busca de marcos abiertos de lectura (ORFs, del inglés Open Reading Frames) que pudieran presentar similitud de secuencia con enzimas de tipo glicosidasa. Se encontraron 6 ORFs codificantes para proteínas con potencial actividad glicolítica y glicosiltransferasa, utilizando para ello la anotación realizada por los autores de la secuenciación y el programa BLAST del Instituto Bioinformático Suizo, para comparar las secuencias encontradas con otras ya conocidas y caracterizadas (Tabla 9). Para poder predecir las características estructurales de las proteínas codificadas por esos genes se utilizaron las herramientas bioinformáticas del apartado V.2.8.1. Tabla 9. Genes seleccionados en el genóma de T. Thermophilus PRQ25 con posible codificación para enzimas de tipo glicosidasa o glicosiltransferasa Gen Hipotética función PRQ25_0443 Trehalasa PRQ25_0794 α-manosidasa Glicosidasas PRQ25_2319 Amilopululanasa PRQ25_0528 α-glucosiltransferasa PRQ25_1525 Manosiltransferasa Glicosiltransferasas PRQ25_1926 Glicógeno sintasa Para el clonaje se utilizaron los vectores pET22b(+) y pET28b(+) (apartado V.1.2). Con el primero se clonan las proteínan en su forma nativa, mientras que el segundo, introduce una cola de histidinas en su extremo N-terminal, lo que facilita su purificación. Se analizaron las secuencias mediante el software bioinformático Vector NTI (apartado V.2.8.1) y seleccionaron las enzimas de restricción NdeI y EcoRI para clonar los genes, ya que estas no se encuentran en el interior de las secuencias y sí en la región de clonaje de los vectores. En caso de seleccionar una enzima de restricción cuya diana se encontrara dentro de la secuencia, esta sería Resultados y Discusión 101 cortada en el proceso de digestión, provocando que el gen quedara truncado. Se diseñaron oligos para la amplificación de cada una de las secuencias incluyendo la diana de NdeI en el oligo FW y la de EcoRI en el oligo RV, para que al amplificar, fueran introducidas en los extremos 5’ y 3’ respectivamente, y estos fueran cohesivos con los de los plásmidos empleados (Tabla 30 en apartado V.1.3). Para obtener el DNA molde para las distintas PCRs se creció T. Thermophilus PRQ25 y se extrajo su DNA total, tal y como se describe en el apartado V.2.2.1. III.1.2.4. Amplificación de secuencias de genes de T. thermophilus PRQ25 A continuación se detallan las condiciones de PCR finales con las que fue posible la amplificación de cada uno de los genes de T. thermophilus PRQ25. III.1.2.4.1. Genes de posibles glicosidasas de T. thermophilus PRQ25 Gen PRQ25_0443 Este gen, de 1263 pb, codificaba para una hipotética trehalasa (EC3.2.1.28). Estas enzimas son glicosil hidrolasas que hidrolizan trehalosa, liberando dos moléculas de glucosa (Kalf y col. 1958). El gen codificaba para una proteína de 420 aminoácidos y 49 kDa, que no incluía péptido señal, se predecía como una proteína soluble y no presentaba dominios transmembrana. El gen fue amplificado utilizando los oligos PRQ25_0443FW y PRQ25_0443RV (apartado V.2.2.3), que además, introdujeron en los extremos de la secuencia de DNA dianas para las enzimas de restricción NdeI y EcoRI respectivamente. Se probaron distintas condiciones de PCR hasta que se consiguió obtener una banda del tamaño esperado en gel de agarosa (Figura 19). Las condiciones finales de PCR se detallan en la Tabla 10. La banda de tamaño deseado se cortó del gel y fue purificada como se detalla en el apartado V.2.2.7. Resultados y Discusión 102 Figura 19. Gel de agarosa que muestra el resultado de la PCR en la que se han obtenido bandas del tamaño esperado para el gen PRQ25_0443. En los carriles de los extremos se localizan los marcadores de peso molecular. Tabla 10. Condiciones de PCR para la amplificación del gen PRQ25_0443 Ciclo 1: (1x) - 96 ºC 5 min Ciclo 2: (5x) - 94 ºC 1 min - Gradiente de 43 a 50 ºC 1 min - 69 ºC 3 min Ciclo 3: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo 4: (25x) - 94 ºC 1 min - 50 ºC 1 min - 72 ºC 1,40 min Ciclo 5: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo : (1x) - 4 ºC ∞ min Componente Concentración final Tampón Tth 10X 10 % (v/v) Tth polimerasa 0,75 μl Pfu polimerasa 0,5 μl dNTPs 1,25 mM (cada uno) Oligonucleótido FW 0,5 mM Oligonucleótido Rv 0,5 mM DNA molde 1 ng.μl-1 MgCl2 2 mM DMSO 8 % (v/v) mqH2O hasta 50 μl Resultados y Discusión 103 Gen PRQ25_0794 Este gen, de 1563 pb, codificaba para una hipotética α-manosidasa (EC3.2.1.24). Se trataba de una proteína de 520 aminoácidos y 59 kDa, que no incluía péptido señal, se predecía como una proteína soluble y no presentaba dominios transmembrana. El gen fue amplificado utilizando los oligos PRQ25_0794FW y PRQ25_0794RV (apartado V.2.2.3), que además, introdujeron en los extremos de la secuencia de DNA dianas para las enzimas de restricción NdeI y EcoRI respectivamente. Se probaron distintas condiciones de PCR hasta que se consiguió obtener una banda del tamaño esperado en gel de agarosa (Figura 20). Las condiciones de PCR se detallan en la Tabla 11. La banda de tamaño deseado se cortó del gel y fue purificada como se detalla en el apartado V.2.2.7. Figura 20. Gel de agarosa que muestra el resultado de la PCR en la que se han obtenido bandas del tamaño esperado para el gen PRQ25_0794. En el carril del extremo izquierdo se localizan los marcadores de peso molecular. Resultados y Discusión 104 Tabla 11. Condiciones de PCR para la amplificación del gen PRQ25_0794 Ciclo 1: (1x) - 96 ºC 5 min Ciclo 2: (30x) - 94 ºC 1 min - Gradiente de 45 a 60 ºC 1 min - 72 ºC 3 min Ciclo 3: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo 4: (1x) - 4 ºC ∞ min Componente Concentración final Tampón Tth 10X 10% (v/v) Tth polimerasa 0,75.μl Pfu polimerasa 0,25.μl dNTPs 1,25 mM (cada uno) Oligonucleótido FW 0,5 mM Oligonucleótido Rv 0,5 mM DNA molde 1 ng.μl-1 MgCl2 2 mM DMSO 8 % (v/v) mqH2O hasta 50 μl Gen PRQ25_2319 Este gen, de 2796 pb, codificaba para una amilopululanasa (EC2.4.1.11). Estas enzimas tienen la capacidad de hidrolizar los enlaces α(1-6) que unen las unidades de maltotriosa del pululano y amilopectina. Es una proteína de 976 aminoácidos y 110 kDa, no incluía péptido señal, pero en su secuencia, las herramientas bioinformáticas predijeron la presencia de una α-hélice transmembrana de 22 aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína (Figura 21). Esto sería compatible con la posible función de la proteína, ya que el pululano es un polímero demasiado grande como para entrar en la célula, así que debe ser degradado en el periplasma de la misma o incluso en el exterior (Prajapati y col. 2013). Figura 21. Representación de la región transmembrana predicha para la proteína PRQ25_2319 Resultados y Discusión 105 Para poder obtener una proteína soluble y evitar los problemas de plegamiento que podían derivarse de clonar una proteína con un dominio transmembrana, se diseñaron oligos para amplificar el gen justo por delante de esta región. La nueva predicción bioinformática dio como resultando una proteína soluble. Para conseguir esto, se utilizaron los oligos PRQ25_2319FW y PRQ25_2319RV (apartado V.2.2.3), que además, introdujeron en los extremos de la secuencia de DNA dianas para las enzimas de restricción NdeI y EcoRI respectivamente. Se probaron distintas condiciones de PCR hasta que se consiguió obtener una banda del tamaño esperado en gel de agarosa (Figura 22). Las condiciones de PCR se detallan en la Tabla 12. La banda de tamaño deseado se cortó del gel y fue purificada como se detalla en el apartado V.2.2.7. Figura 22. Gel de agarosa que muestra el resultado de la PCR en la que se han obtenido bandas del tamaño esperado para el gen PRQ25_2319. En el carril del extremo derecho se localizan los marcadores de peso molecular. Resultados y Discusión 106 Tabla 12. Condiciones de PCR para la amplificación del gen PRQ25_2319 Ciclo 1: (1x) - 96 ºC 5 min Ciclo 2: (5x) - 94 ºC 1 min - Gradiente de 45 a 60 ºC 1 min - 69 ºC 3 min Ciclo 3: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo 4: (25x) - 94 ºC 1 min - 60 ºC 1 min - 72 ºC 1,40 min Ciclo 5: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo : (1x) - 4 ºC ∞ min Componente Concentración final Tampón Tth 10X 10% (v/v) Tth polimerasa 0,75.μl Pfu polimerasa 0,25.μl dNTPs 1,25 mM (cada uno) Oligonucleótido FW 0,5 mM Oligonucleótido Rv 0,5 mM DNA molde 1 ng.μl-1 MgCl2 2 mM DMSO 4 % (v/v) mqH2O hasta 50 μl III.1.2.4.2. Genes de posibles glicosiltransferasas de T. thermophilus PRQ25 Gen PRQ25_0528 Este gen, de 2898 pb, codificaba para una hipotética α-glucosiltransferasa (EC2.4.1). La proteína tiene 965 aminoácidos y 110 kDa, no incluía péptido señal, se predecía como una proteína soluble y no presentaba dominios transmembrana. El gen fue amplificado utilizando los oligos PRQ25_0528FW y PRQ25_0528RV (apartado V.2.2.3), que además, introdujeron en los extremos de la secuencia de DNA dianas para las enzimas de restricción NdeI y EcoRI respectivamente. Se probaron distintas condiciones de PCR hasta que se consiguió obtener una banda del tamaño esperado en gel de agarosa (Figura 23). Las condiciones de PCR se detallan en la Tabla 13. La banda de tamaño deseado se cortó del gel y fue purificada como se detalla en el apartado V.2.2.7. Resultados y Discusión 107 Figura 23. Gel de agarosa que muestra el resultado de la PCR en la que se han obtenido bandas del tamaño esperado para el gen PRQ25_0528. En el carril del extremo derecho se localizan los marcadores de peso molecular. Tabla 13. Condiciones de PCR para la amplificación del gen PRQ25_0528 Ciclo 1: (1x) - 96 ºC 5 min Ciclo 2: (5x) - 94 ºC 1 min - Gradiente de 45 a 60 ºC 1 min - 69 ºC 3 min Ciclo 3: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo 4: (25x) - 94 ºC 1 min - 60 ºC 1 min - 72 ºC 1,40 min Ciclo 5: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo : (1x) - 4 ºC ∞ min Componente Concentración final Tampón Tth 10X 10% (v/v) Tth polimerasa 0,75.μl Pfu polimerasa 0,25.μl dNTPs 1,25 mM (cada uno) Oligonucleótido FW 0,5 mM Oligonucleótido Rv 0,5 mM DNA molde 1 ng.μl-1 MgCl2 2 mM DMSO 8 % (v/v) mqH2O hasta 50 μl Resultados y Discusión 108 Gen PRQ25_1525 Este gen, de 1023 pb, codifica para una hipotética manosiltransferasa (EC2.4.1). Es una proteína de 340 aminoácidos y 37 kDa, que no incluía péptido señal, se predecía como una proteína soluble y no presentaba dominios transmembrana. El gen fue amplificado utilizando los oligos PRQ25_1525FW y PRQ25_1525RV (apartado V.2.2.3), que además, introdujeron en los extremos de la secuencia de DNA dianas para las enzimas de restricción NdeI y EcoRI respectivamente. Se probaron distintas condiciones de PCR hasta que se consiguió obtener una banda del tamaño esperado en gel de agarosa (Figura 24). Las condiciones de PCR se detallan en la Tabla 14. La banda de tamaño deseado se cortó del gel y fue purificada como se detalla en el apartado V.2.2.7. Figura 24. Gel de agarosa que muestra el resultado de la PCR en la que se han obtenido bandas del tamaño esperado para el gen PRQ25_1525. En el carril del extremo izquierdo se localizan los marcadores de peso molecular. Resultados y Discusión 109 Tabla 14. Condiciones de PCR para la amplificación del gen PRQ25_0794 Ciclo 1: (1x) - 96 ºC 5 min Ciclo 2: (10x) - 94 ºC 1 min - Gradiente de 45 a 55 ºC 1 min - 72 ºC 3 min Ciclo 3: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo 4: (20x) - 94 ºC 1 min - 55 ºC 1 min - 72 ºC 1,40 min Ciclo 5: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo : (1x) - 4 ºC ∞ min Componente Concentración final Tampón Tth 10X 10% (v/v) Tth polimerasa 0,75.μl Pfu polimerasa 0,25.μl dNTPs 1,25 mM (cada uno) Oligonucleótido FW 0,5 mM Oligonucleótido Rv 0,5 mM DNA molde 1 ng.μl-1 MgCl2 2 mM DMSO 2 % (v/v) mqH2O hasta 50 μl Gen PRQ25_1926 Este gen, de 1323 pb, codifica para una glicógeno sintasa (EC2.4.1.11). Estas enzimas son de tipo glicosiltransferasa y catalizan la transferencia del monosacárido de una UDP-glucosa a otra glucosa aceptora, quedando en configuración α(1-4). Es una proteína de 440 aminoácidos y 49 kDa, que no incluía péptido señal, se predecía como una proteína soluble y no presentaba dominios transmembrana. El gen fue amplificado utilizando los oligos PRQ25_1926FW y PRQ25_1926RV (apartado V.2.2.3), que además, introdujeron en los extremos de la secuencia de DNA dianas para las enzimas de restricción NdeI y EcoRI respectivamente. Se probaron distintas condiciones de PCR hasta que se consiguió obtener una banda del tamaño esperado en gel de agarosa (Figura 25). Las condiciones de PCR se detallan en la Tabla 15. La banda de tamaño deseado se cortó del gel y fue purificada como se detalla en el apartado V.2.2.7. Resultados y Discusión 110 Figura 25. Gel de agarosa que muestra el resultado de la PCR en la que se han obtenido bandas del tamaño esperado para el gen PRQ25_1926. En el carril del extremo izquierdo se localizan los marcadores de peso molecular. Tabla 15. Condiciones de PCR para la amplificación del gen PRQ25_1926 Ciclo 1: (1x) - 96 ºC 4 min Ciclo 2: (30x) - 94 ºC 1 min - 55 ºC 1 min - 72 ºC 3 min Ciclo 3: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo 4: (1x) - 4 ºC ∞ min Componente Concentración final Tampón Tth 10X 10% (v/v) Tth polimerasa 0,75.μl Pfu polimerasa 0,25.μl dNTPs 0,5 mM (cada uno) Oligonucleótido FW 0,5 mM Oligonucleótido Rv 0,5 mM DNA molde 1 ng.μl-1 MgCl2 2 mM DMSO 0 % (v/v) mqH2O hasta 50 μl III.1.2.5. Producción de termozimas de T. thermophilus PRQ25 Una vez obtenidas todas las secuencias de DNA purificadas se procedió a la digestión de éstas con las enzimas de restricción NdeI y EcoRI, y posterior ligación de las secuencias digeridas con los plásmidos pET28b(+) y pET22b(+), tal y como se describe en el apartado V.2.2.4. Con la mezcla de ligación se transformaron células Resultados y Discusión 111 de E. Coli DH5α por choque térmico, tal y como se describe en el apartado V.2.1.4. De las colonias crecidas (Figura 26) se realizó una digestión con NdeI y EcoRI y se corrió un gel de agarosa para detectar bandas del tamaño deseado y del plásmido. Además de cada placa se seleccionaron 3 colonias que fueron secuenciadas (apartado V.2.2.6). De esta forma se confirmó que todas las secuencias habían sido clonadas correctamente. Figura 26. Colonias de E.coli DH5α con el gen PRQ25_0443 clonado en el plásmido pET28b(+), crecidas en medio LB con kanamicina. Una vez confirmado que todas las construcciones eran correctas, se utilizaron los plásmidos recombinantes obtenidos para transformar células de E. coli BL21 (DE·3) (apartado V.2.1.4). Se procedió a la expresión de las mismas añadiendo iPTG, según el protocolo del apartado V.2.1.5. Finalizada la producción, de las proteínas se corrió un gel de acrilamida para evaluar los niveles de expresión (Figura 27) (apartado V.2.3.2.1). Como se puede observar en la figura, ninguna de las proteínas de PRQ25 fueron expresadas en estas condiciones de crecimiento, solo aparecen las bandas típicas del crecimiento de E. coli. Para solventar esta situación se realizaron pruebas de inducción cambiando los tiempos de exposición al IPTG (4, 12 y 24 horas) y cambiando las temperaturas de expresión (25, 30 y 37 ºC) sin obtener mejores resultados. Resultados y Discusión 112 0443 0528 0794 23191525 1926 Figura 27. Prueba de expresión de los genes de T. thermophilus PRQ25 clonados en E. Coli BL21 (DE3) La falta de expresión de estos genes en E. coli BL21 (DE3) se atribuye al hecho de haber llevado a cabo una recombinación heteróloga entre un organismo termófilo y un organismo mesófilo. Las distintas temperaturas a las que se producen los plegamientos de las proteínas en cada una de estas dos especies puede implicar que en E. coli, las proteínas resultantes no plieguen correctamente, no sean solubles y se acumulen como cuerpos de inclusión. Para conseguir expresar adecuadamente las proteínas de T. thermophilus PRQ25 se decidió dejar de usar E. coli BL21 (DE3) para usar E. coli Rosetta-Gami2. La cepa Rosetta-Gami2 de E. coli se utiliza para la expresión heteróloga de proteínas que dan problemas en otras cepas (como BL21). Está modificada para favorecer la formación de puentes disulfuro en el citoplasma y además, lleva un segundo plásmido que codifica para la formación de 7 tipos “raros” de tRNA que no se encuentran en bacterias mesófilas como E. coli. La transformación se llevó a cabo por electroporación (apartado V.2.1.4.2). Para la selección de estas células al crecer, además del antibiótico específico de cada plásmido (kanamicina para pET28b(+) y ampicilina para pET22b(+)), se debe añadir Resultados y Discusión 113 cloranfenicol, ya que es la resistencia incluida en el segundo plásmido. Una vez crecidas las colonias, se realizaron pruebas de expresión (apartado V.2.1.5), consiguiéndose buenos resultados a 30 ºC y 18 horas (Figura 28) (condiciones de electroforesis en el. apartado V.2.3.2.1) Figura 28. Prueba de expresión de los genes de T. thermophilus PRQ25 clonados en E. Coli Rosetta-Gami2 La Figura 28 muestra cómo en todos los casos se consiguieron bandas de proteínas del tamaño esperado para los genes clonados de T. Thermophilus PRQ25. El éxito de este experimento puso de manifiesto la importancia de utilizar un hospedador adecuado para transferir material genético. Para transformaciones heterólogas, como es el caso, la cepa Rosetta-Gami2 de E.coli ofreció mejores que la BL21 (DE3), a pesar de requerir una metodología más complicada, cómo es la electroporación, o el uso de dos antibióticos para mantener sus dos plásmidos. Una vez lograda la expresión de las proteínas clonadas de T. thermophilus PRQ25 se llevó a cabo la producción (apartado V.2.1.5) y purificación por cromatografía de afinidad (apartado V.2.3.4) de las seis enzimas obtenidas en pET28b(+) con cola de histidinas en el extremo N-terminal (a las que se denominó -NTag). Las seis enzimas clonadas en pET22b(+), que no tenían un sistema de purificación como son las colas Resultados y Discusión 114 de histidina, fueron sometidas a rotura celular (apartado V.2.1.6) y concentración en tubos vivaspin (Sartorius). III.1.2.6. Caracterización de actividades de termozimas de T. thermophilus PRQ25 Como se explicó anteriormente, se han localizado en el genoma, amplificado y clonado los genes de 6 hipotéticas enzimas de T. thermophilus PRQ25: 3 glicosidasas y 3 glicosiltransferesas. Como esta asignación se basa en la predicción por comparación de las secuencias hecha por los autores de la secuenciación del genoma (Alvarez y col. 2011), a la hora de llevar a cabo la búsueda de actividades, se usaron las seis enzimas para buscar tanto actividades glicosidasa, como actividades glicosiltransferasa. Se produjeron un total de doce enzimas, ya que cada una se clonó en dos vectores diferentes (pET28b(+) y pET22b(+)) por lo que cada enzima se tiene por duplicado, una con cola de histidinas en el extremo N-terminal (-NTag), lo que facilita su purificación pero podría inactivar la enzima, y otra sin cola. III.1.2.6.1. Búsqueda de actividades glicosidasa y de transglicosidación con enzimas clonadas de T. thermophilus PRQ25 Se midió la actividad glicosidasa de las 12 enzimas purificadas de T. thermophilus PRQ25 por el método continuo según el protocolo descrito en el apartado V.2.4.1.2 frente a una batería de sustratos hidrolizables. Los sustratos utilizados fueron pNF-α- Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF-β-Glu, pNF-α-Man, pNF- β-D-Man, pNF-α-GlcNAc y pNF-β-GlcNAc. Los resultados se muestran en la Tabla 16. Como se puede observar, solo la enzima PRQ25_528 en sus dos formas (con cola de histidinas y sin ella) ha mostrado actividad de hidrólisis, la cual ha sido α- glucosidasa, hidrolizando el pNF-α-Glu. La versión de la enzima con cola de histidina era más activa (257 frente a 106 UI/mg) debido a que al estar puríficada por Resultados y Discusión 115 cromatofrafía de afinidad estaba más concentrada. Este resultado confirma que la cola de histidina no inhibe la actividad enzimática, puesto que se obtuvo actividad frente a los mismos sustratos. En la base de datos, esta enzima estaba anotada como α-glucosiltransferasa, lo que demuestra que la predicción bioinformática no había sido correcta, aunque la anotación sí la había identificado como enzima relacionada con azúcares, concretamente con glucosas. Tabla 16.Resultados del screening de actividades glicosidasa con las enzimas clonadas de T. thermophilus PRQ25. Resultados mostrados en UI/mg. pNF- β-Fuc α-Fuc β-Glu α-Glu β-Gal α-Gal β-Man α-Man β-GlcNAc α-GlcNAc PRQ25_0443- NTag - - - - - - - - - - PRQ25_0443 - - - - - - - - - - PRQ25_0528- NTag - - - 257 - - - - - - PRQ25_0528 - - - 106 - - - - - - PRQ25_0794- NTag - - - - - - - - - - PRQ25_0794 - - - - - - - - - - PRQ25_1525- NTag - - - - - - - - - - PRQ25_1525 - - - - - - - - - - PRQ25_1926- NTag - - - - - - - - - - PRQ25_1926 - - - - - - - - - - PRQ25_2319- NTag - - - - - - - - - - PRQ25_2319 - - - - - - - - - - Se utilizó esta nueva α-glucosidasa de T. thermophilus PRQ25 para realizar reacciones de transglicosidación y evaluar su capacidad para sintetizar disacáridos, utilizando pNF-α-Glu como donador frente a una batería de aceptores compuesta por Fuc, Fru, Gal, Glu, GalNH2, Man, GalNAc y GlcNAc, tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.2. No se obtuvo síntesis en ninguna de las reacciones ensayadas. Resultados y Discusión 116 III.1.2.6.2. Búsqueda de actividades glicosiltransferasa con enzimas clonadas de T. thermophilus PRQ25 Se llevaron a cabo reacciones glicosiltransferasa utilizando como donador guanosin difosfato-α-D-manosa (GDP-Man) y uridin difosfato-α-D-glucosa (UDP-Glu) según el protocolo del apartado V.2.4.3.1. Se seleccionaron estos donadores puesto que la anotación de los genes realizada por los autores de la secuenciación,identificaba a las enzimas como diferentes formas de manosiltransferasas o glucosiltransferasas (apartado III.1.2.3). Como aceptores se utilizó una batería de sustratos compuesta por Fuc, Fru, Gal, Glu, GalNH2, Man, GalNAc y GlcNAc. No se obtuvieron resultados positivos en las reacciones llevadas a cabo con las hipotéticas glicosiltransferasas de T. Thermophilus PRQ25. Una posible explicación para la ausencia de actividad detectable de algunas de las proteínas expresadas satisfactoriamente en E. coli desde T. thermophilus PRQ25, tanto de glicosidasas como de glicosiltransferasas, podría estar relacionada con las diferencias de temperaturas de expresión entre el organismo nativo y el hospedador, así como sus diferentes maquinarias enzimáticas, que provocaría la formación de intermediarios de plegamiento no activos. Otra explicación podría ser que la búsqueda de genes basada en la anotación del genoma al ser secuenciado, no haya predicho correctamente todas las posibles actividades glicosidasa y glicosiltransferasa, y por ello no hayan sido seleccionados y clonados aquellos genes que sí mostraron actividad al llevar a cabo las reacciones con células enteras (apartado III.1.2.2) Como conclusión, cabe destacar que en los dos apartados del primer capítulo de esta Memoria, se han encontrado dos nuevas enzimas glicosidasa con actividad hidrolítica que no habían sido identificadas hasta la fecha, una β-fucosidasa mesófila de la bacteria C. gelida, y una α-glucosidasa termófila de T. thermophilus PRQ25. Si bien es cierto que no han demostrado ser capaces de realizar reacciones de Resultados y Discusión 117 transglicosidación, son muchas las aplicaciones biotecnológicas para las que se han usado reacciones de hidrólisis catalizadas por glicosidasas. En la industria alimentaria se han utilizado amilasas y xilanasas para hidrolizar azúcares de cadena larga no metabolizables, lo que aumenta el valor nutritivo y mejora las características organolépticas de los alimentos (Collins y col. 2005; Yegani y col. 2013). También se han utilizado lactasas para hidrolizar la lactosa de los productos lacteos y así evitar los problemas de salud ligados a la intolerancia a este disacárido (Oliveira y col. 2011). Las glicosidasas relacionadas con el procesado del almidón (α-amilasa, glucoamilasa, β-amilasa y pululanasa) suponen cerca del 30 % de la producción enzimática industrial a nivel mundial (Buchholz y col. 2005). Las celulasas tienen aplicaciones para la degradación de materiales vegetales de desecho (hidrólisis de celulosa a glucosa), lo que se aprovecha para la producción de etanol (Karnaouri y col. 2013). En la industria del papel se utilizan xilanasas para extraer hemicelulosa de la pasta de papel (Hakala y col. 2013). También se añaden glicosidasas a los detergentes para el lavado de los tejidos de algodón y ayudar en el mantenimiento de los colores (Ito y col. 1998). En biotecnología clínica, se han usado α-galactosidasas para modificar el antígeno de la sangre tipo B para producir sangre tipo 0 (Goldstein y col. 1982; Hata y col. 2004). En biología molecular, la β-galactosidasa de E. coli (LacZ) se usa habitualmente como marcador para confirmar el correcto clonaje de genes, gracias a su capacidad para hidrolizar el sustrato cromogénico X-gal (5- bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) (Xiong y col. 2012). Resultados y Discusión 118 III.2. Capítulo 2: Síntesis de disacáridos de interés biológico mediante glicosidasas Tal y como se describió en la Introducción, una de las estrategias enzimáticas empleadas en la síntesis de oligosacáridos de interés biológico consiste en la utilización de glicosidasas. Concretamente, en la síntesis de los disacáridos Gal-β(1- 3)-GlcNAc y Gal-β(1-3)-GalNAc destaca una enzima producida por Bacillus circulans ATCC 31382, la β-Gal-3. Esta enzima fue descrita por Ito y col. (1997), pero desde entonces no existían demasiados estudios de los procesos catalizados por ella. Ante el potencial de la β-Gal-3 aplicado a la síntesis de disacáridos de interés biológico, se decidío llevar a cabo un nuevo proceso de producción que permitiera su fácil purificación para su posterior utilización y caracterización. III.2.1. Producción y puridicación de la enzimas β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 La cepa ATCC 31382 de la bacteria B. circulans fue adquirida de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, del inglés American Type Culture Collection). Una vez crecida se extrajo su DNA total (apartado V.2.2.1) para poder amplificar el gen de la β-Gal-3. Se diseñaron dos juegos de oligos, un par previsto para el clonaje del gen en el plásmido pET28b(+) y el otro para el clonaje en pET22b(+) (Tabla 30). El par para clonar en pET28b(+), llamados B-gal-3-FW y B-gal-3-28RV se diseñaron para integrar en la enzima la cola de histidinas del extremo N-terminal que lleva este plásmido y respetar el codón STOP al final del gen. A esta enzima la denominamos β-Gal-3-NTag. Por otro lado, para clonar en el pET22b(+), se utilizó el mismo B-gal-3-FW que anteriormente, y se diseñó B-gal-3-22RV, para que integrara en el extremo C- Resultados y Discusión 119 terminal de la enzima, la cola de histidina que lleva el plásmido integrada. El oligo reverso llevaba cambiado el codón STOP del final del gen, para que la traducción del ribosoma pudiera continuar hasta el siguiente codón STOP. En ambos casos, los oligos reversos llevaban la diana para la enzima de restricción HindIII. No fue necesario añadir ninguna diana para enzimas de restricción al inicio del gen, puesto que este ya incluía de forma natural una diana para NdeI, por lo que los oligos directos se diseñaron de forma que fueran complementarios de una región anterior a la del inicio del gen. A esta enzima la denominamos β-Gal-3-CTag. Una vez crecida la bacteria se extrajo su DNA total (apartado V.2.2.1), y se amplificó el gen de la β-Gal-3, según las condiciones de PCR de la Tabla 17 y la metodología del apartado V.2.2.3. Finalizada la PCR, se corrió un gel de agarosa para comprobar que la amplificación fuera correcta y purificar el DNA (apartado V.2.2.7). Tabla 17. Condiciones de PCR par amplificar la secuencia del gen de β-Gal-3. Ciclo 1: (1x) - 95 ºC 5 min Ciclo 2: (30x) - 95 ºC 1 min - Gradiente de 45 a 60 ºC 1 min - 72 ºC 3 min Ciclo 3: (1x) - 72 ºC 10 min Ciclo 4: (1x) - 4 ºC ∞ min Componente Concentración final Tampón Tth 10X 10% (v/v) Tth polimerasa 0,75.μl Pfu polimerasa 0,25.μl dNTPs 1,25 mM (cada uno) Oligonucleótido FW 0,5 mM Oligonucleótido Rv 0,5 mM DNA molde 1 ng.μl-1 MgCl2 2 mM DMSO 8 % (v/v) mqH2O hasta 50 μl Una vez purificado el DNA del gel de electroforesis, se llevó a cabo la digestión con las enzimas NdeI y HindIII sobre la secuencia amplificada y los plásmidos, para crear extremos cohesivos entre ellos. Después se realizó la ligación (apartado V.2.2.4) y posterior transformación por choque térmico en E. coli DH5α para Resultados y Discusión 120 seleccionar las construcciones correctas y multiplicar el número de plásmidos (apartado V.2.1.4.1). De las colonias que crecieron se seleccionaron tres de cada (β- Gal-3-NTag y tres de β-Gal-3-CTag), para extraer su plásmido y ser enviadas a secuenciar y confirmar que las secuencias eran correctas (apartado V.2.2.6). También se realizó una digestión con NdeI y HindIII (apartado V.2.2.4) y se corrió un gel de agarosa (apartado V.2.2.7) para confirmar la presencia de una banda del tamaño del plásmido y otra del tamaño del gen. Con los plásmidos extraídos de E. coli DH5α se realizó una transformación por choque térmico en E. coli BL21, cepa especializda en al producción de proteínas recombinantes. Entre las colonias crecidas, se tomaron tres de β-Gal-3-NTag y 3 de β-Gal-3-CTag para realizar una prueba de inducción (apartado V.2.1.5). Con los cultivos crecidos se corrió un gel de acrilamida para comprobar los niveles de expresión (apartado V.2.3.2.1). El resultado se muestra en la Figura 29. Como se puede observar, hay una gran banda expresada en todos los plásmidos en aquellos carriles que fueron inducidos con IPTG. β-Gal-3-NTag β-Gal-3-CTag + + + + + +------ Figura 29. Prueba de inducción de la enzimas β-Gal-3-NTag y β-Gal-3-CTag. Los carriles etiquetados con – no están inducidos con IPTG. Los carriles + están inducidos con IPTG Resultados y Discusión 121 Para poder caracterizar las enzimas, se crecieron ambas (β-Gal-3-NTag y 3 de β-Gal- 3-CTag) y se llevó a cabo un proceso de producción (apartado V.2.1.5), rotura de células (apartado V.2.1.6) y purificación por colas de histidina en columna de niquel (II) (apartado V.2.3.4). En la Figura 30 se muestra un perfil de purificación de la enzima β-Gal-3-NTag. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 30 60 90 120 A bs T (min) 21 5 43 Figura 30. Perfil de purificación de la enzima β-Gal-3-NTag. 1: Proteínas no unidas a la columna. 2: Proteínas no unidas debido a la saturación de la columna. 3: Proteínas unidas por unión inespecífica eluidas con el tampón de adhesión. 4: Proteínas unidas por unión inespecífica eluidas con el tampón de lavado. 5: Enzima β-Gal-3-Ntag eluida con el tampón de elución. Una vez purificadas las enzimas se midió su concentración por el método de Bradford (apartado V.2.3.1) y se corrió un gel SDS-PAGE para comprobar su pureza (apartado V.2.3.2.1). Como se puede observar en la Figura 31, las bandas de los carriles 3 y 4, correspondientes a las enzimas β-Gal-3-Ntag y β-Gal-3-Ctag purificadas, presentan un alto grado de pureza. Resultados y Discusión 122 1 2 3 4 5 Figura 31. Gel SDS-PAGE de la purificación de β-Gal-3-NTag y β-Gal-3-CTag. Carril 1: Extracto celular sin inducir con IPTG. Carril 2: Extracto celular inducido con IPTG. Carril 3: β-Gal-3-Ntag purificada. Carril 4: β-Gal-3-Ctag purificada. Carril 5: Patrones de peso molecular. La cantidad total de cada una de las dos enzimas purificadas es de 21 mg por litro de cultivo en el caso de la β-Gal-3-NTag y de 9 mg por litro en el caso de la β-Gal-3- CTag (dato proveniente del valor medio de varias producciones). Estas diferencias se deben a que en presencia de kanamicina, el antibiótico utilizado para la selección cuando se usa el plásmido pET28b(+), la cantidad de biomasa de E. coli contenida en el cultivo es mayor a la obtenida usando ampicilina, el antibiótico utilizado para la selección cuando se usa el plásmido pET22b(+). III.2.2. Estudio de potenciales actividades glicosidasa de las enzimas β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 Se realizó un cribado de potenciales actividades glicosidasa de las enzimas β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382 preparadas en el laboratorio. Para ello, se utilizó una batería de sustratos activados en la posición anomérica con una molécula de pNF, tal y como se muestra en el apartado V.2.4.1.2. Los sustratos utilizados fueron Resultados y Discusión 123 pNF-α-Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF-β-Glu, pNF-α- Man, pNF-β-D-Man, pNF-α-GlcNAc y pNF-β-GlcNAc. Los resultados (Tabla 18) muestran que las enzimas solo son activas frente a pNF-β-gal, resultado que se corresponde con la bibliografía consultada (Ito y col. 1997; Fujimoto y col. 1998). Las actividades detectadas fueron 12,2 UI/mg para β-Gal-3-NTag y 12,5 UI/mg para β-Gal-3-CTag. Tabla 18. Cribado de actividades glicosidasa en las enzimas recombinantes β-Gal-3-NTag y β-Gal-3-CTag de Bacillus circulans ATCC 31382. Los valores están mostrados como unidades enzimáticas (UI/mg). pNF- β-Fuc α-Fuc β-Glu α-Glu β-Gal α-Gal β-Man α-Man β-GlcNAc α-GlcNAc β-Gal-3- NTag - - - - 12,2 - - - - - β-Gal-3- CTag - - - - 12,5 - - - - - Como se puede observar en los resultados, la actividad β-galactosidasa de ambas enzimas es muy similar, por lo que la disposición de la cola de histidinas (en el extremo N o C-terminal) no afecta negativamente a la actividad. Esta actividad es mayor que la descrita por Fujimoto y col. (1998) (5,5 UI/mg), los cuales, llevan a cabo la producción de la enzima sin cola de histidina. Estos resultados demuestran que la incorporación de la cola de histidina (indistintamente en el extremo N o C- terminal) facilita la purificación de la enzima y hace que esta sea más eficaz, obteniéndose una actividad 2,3 veces mayor que la obtenida por Fujimoto y col. (1998), por lo que es una metodología apropiada para esta enzima en su aplicación a la síntesis de disacáridos. Como se comentó en el apartado anterior (III.2.1), la producción total de la enzima β- Gal-3-NTag es mayor (21 mg por litro de cultivo) que la de β-Gal-3-CTag (9 mg por litro de cultivo). Teniendo en cuenta que las actividades mostradas por estas dos enzimas son muy similares, se seleccionó a la β-Gal-3-NTag para ser utilizada en futuros experimentos. Todos los experimentos de este capítulo de la presente Tesis Resultados y Discusión 124 Doctoral fueron realizados con la enzima β-Gal-3-NTag, pero nos referiremos a ella como β-Gal-3. III.2.2.1. Cálculo de pH óptimo de reacción de β-Gal-3 Para poder establecer las condiciones óptimas de reacción con la enzima β-Gal-3 se procedió al cálculo de su pH óptimo, según el protocolo del apartado V.2.4.1.3. Para ello, se midió la actividad enzimática utilizando pNF-β-Gal como sustrato a diferentes valores de pH según la metodología descrita en el apartado V.2.4.1.3. El pH óptimo de la enzima resultó estar próximo a 6, aunque mantuvo una destacable actividad en el rango de pH de 5 a 7 (Figura 32). Estos resultados se corresponden con los mostrados en la bibliografía por Fujimoto y colaboradores (1998). 0 20 40 60 80 100 4 5 6 7 8 9 A ct iv id ad (% ) pH Figura 32. Cáculo del pH óptimo de la enzima β-Gal-3. Se utilizó pNF-β-Gal 5 mM como sustrato a una temperatura de 37 ºC. Las actividades están referidas en términos relativos al valor máximo determinado. III.2.2.2. Termoestabilidad de β-Gal-3 Una vez determinado el pH óptimo de trabajo de la enzima, el siguiente paso fue determinar su estabilidad térmica. Para llevar a cabo este estudio se utilizó tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6 y se midió su actividad a 37 ºC, después de incubar la enzima a diferentes temperaturas (30, 40, 50 y 60 ºC), tal y como se explica en el Resultados y Discusión 125 apartado V.2.4.1.4. Dependiendo de la temperatura utilizada para la incubación, se obtuvo un comportamiento muy diferente en el descenso de la actividad de la enzima (Figura 33). A 30 y 40 ºC, no se observa apenas descenso en la actividad, manteniéndose el 94% a las 24 h de incubación. A 50 ºC se mantiene más del 50% de actividad a las 12 h de incibación. Por el contrario, a 60 ºC se observa un pérdida total de la actividad enzimática después de 4 h de incubación (Figura 33). 0 20 40 60 80 100 0 6 12 18 24 A ct iv id ad (% ) Tiempo (h) 30 40 50 60 Figura 33. Estabilidad témica de la enzima β-Gal-3. Las actividades están referidas en términos relativos al valor máximo determinado en cada una de las series. Estos estudios se realizaron con pNF-β-Gal 5 mM en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6 a 37 ºC. III.2.2.3. Temperatura óptima de reacción de β-Gal-3 Una vez establecido el pH óptimo para la reacción y analizada la termoestabilidad de la enzima, el siguiente paso fue determinar la temperatura óptima de trabajo de la enzima. El protocolo se realizó como se describe en el apartado V.2.4.1.5. Como se puede observar en la Figura 34, la temperatura óptima detectada para la enzima fue de 50 ºC.actividad aumentó a medida que aumentaba la temperatura, encontrándose la máxima actividad a 50 ºC. Para posteriores reacciones se determinó 37 ºC como temperatua de trabajo, ya que a esta temperatura la enzima conserva el 94% de actividad tras 24 h.. Resultados y Discusión 126 0 20 40 60 80 100 30 35 40 45 50 55 60 A ct iv id ad (% ) T (ºC) Figura 34. Efecto de la temperatura en la actividad de la enzima β-Gal-3 sobre el sustrato pNF-β-Gal 5 mM en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6 a distintas temperaturas. Las actividades están referidas en términos relativos al valor máximo determinado. III.2.3. Síntesis de disacáridos catalizada por la enzima β- Gal-3 DE B. circulans ATCC 31382 Puesto que el objetivo pincipal de esta Tesis Doctoral es la síntesis de oligosacárdos de interés biológico y esta enzima tiene un gran potencial para ello, en primer lugar se propuso llevar a cabo un estudio detallado de su capacidad sintética. En nuestro grupo de investigación se ha trabajado ampliamente con otras glicosidasas y se han puesto a punto las condiciones de trabajo que han permitido desarrollar procesos sintéticos con buenos rendimientos. En esos estudios, ha sido clave la relación entre el aceptor y el donador, obteniéndose en todos los casos que la relación óptima es 1:5, por lo que se decidió tomar este dato como punto de partida (Pérez-Sánchez, Cortés-Cabrera, y col. 2011; Pérez-Sánchez, Sandoval, y col. 2011; Pérez-Sánchez y col. 2012; Sandoval, Cortés, y col. 2012). Se relizó un estudio de los diferentes aceptores que podían ser reconocidos por la enzima β-Gal-3. Se utilizó como donador pNF-β-Gal, y como aceptores, una batería Resultados y Discusión 127 de azúcares compuesta por Fuc, Fru, Gal, Glu. GalNH2, Man, GalNAc y GlcNAc, según las condiciones de reacción que se exponen en el apartado V.2.4.2.2. Los resultados aparecen en la Tabla 19, en la que se puede apreciar que los únicos aceptores reconocidos por la enzima son Man, GalNAc y GlcNAc Estos resultados concuerdan con lo expuesto por otros autores en la bibliografía, donde describen el recnonocimiento de estos tres mismos aceptores (Fujimoto y col. 1998; Miyasato y col. 2004). Tabla 19. Cribado de aceptores para la reacción de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382 utilizando pNF-β-gal como donador frente a una batería de monosacáridos. Fuc Fru Gal Glu GalNH2 Man GalNAc GlcNAc β-Gal-3 - - - - - + + + A raíz de estos resultados, se decidió caracterizar la reacción de transglicosidación de β-Gal-3 utilizando pNF-β-gal y como aceptores GalNAc y GlcNAc, para sintetizar Gal-β(1-3)-GalNAc y Gal-β(1-3)-GlcNAc (Esquema 14), cuya importancia como disacáridos de interés biológico se describe en el apartado I.1.1 de la Introducción. O O O NH HO OH OH HO OH OH O OH + O O OH HO OH OH NO2 GalNAc GlcNAc pNP-ββββ-Gal HO O NH HO OH O OH HO O NH HO OH O OH O O O NH HO OH OH HO OH OH O OH ββββ−−−−Gal-3 ββββ−−−−Gal-3 Gal-ββββ((((1111−−−−3333))))-GalNAc Gal-ββββ((((1111−−−−3333))))-GlcNAc Esquema 14. Reacción de trasglicosidación catalizada por la enzima β-gal-3 utilizando como donador pNF-β-gal y como aceptores GlcNAc o GalNAc, para la síntesis de Gal-β(1- 3)-GalNAc y Gal-β(1-3)-GlcNAc Resultados y Discusión 128 El seguimiento de las reacciones de transglicosidación se realizó por HPLC, como se describe en el apartado V.2.7.1.1. En la Figura 35 se muestra un cromatograma de la reacción de síntesis de Gal-β(1-3)-GlcNAc. En A) se muesta el tiempo 0 h, en el que aparecen los sustratos de partida pNF-β-Gal y GlcNAc. En B) se muestra el tiempo 3 h, en el que el sustrato limitante, el donador pNF-β-Gal, se ha consumido completamente para la síntesis del disacárido Gal-β(1-3)-GlcNAc. Se mantiene el pico de aceptor GlcNAc debido a que se encontraba 5 veces más concentrado que el donador. G lc N A C pN F- β -G al G lc N A C G al G al -β (1 -3 )- G lc N A c Figura 35. Cromatogramas de HPLC-ELSD de la reacción de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6 utilizando pNF-gal como donador y GlcNAc como aceptor. A) Tiempo 0 h. B) Tiempo 3 h. Finalizadas las reacciones, los productos se purificaron purificados en una columna de carbono-celite, según el protocolo del partado V.2.5.1. El procedimiento de purificación consistió en pasar por la columna volúmenes con concentraciones crecientes de etanol para ir eluyendo gradualmente los diferentes azúcares existentes en el medio de reacción, es decir, dos monosacáridos (GlcNAC o GalNAc y Gal), el disacárido producto, el pNF liberado de la hidrólisis o transglicosidación del pNF- Gal y las sales del tampón. El disacárido eluyó en la fracción del 10 % de etanol, obteniéndose el cromatograma de la Figura 36. En ella se puede observar la completa purificación del disacárido Gal-β(1-3)-GalNAc. Resultados y Discusión 129 Figura 36. Compuestos eluidos en las diferentes concetración de etanol en la columna de carbono-celite y cromatograma de la fracción del 10 % de etanol con el disacárido Gal-β(1- 3)-GalNAc purificado. La caracterización de los dos productos obtenidos Gal-β(1-3)-GalNAc y Gal-β(1-3)- GlcNAc se llevó a cabo mediante RMN (apartado V.2.7.2), confirmando la estrucutra de los mismos: Gal-β(1→→→→3)GalNAc:(Yu y col. 2010) 1H-NMR (500 MHz, D2O): 1.92 (s, Ac), 4.58 (d, J1β,2 =8.47Hz, H-1β), 5.11 (d, J1α 2=3.71Hz, H-1α). 13C-NMR (125 MHz, D2O): δ 21.96 (Me of Ac, α), 22.19 (Me of Ac, β), 48.92 (C-2α), 52.39 (C-2β), 60.89 (C-6α), 60.93 (C-6β), 61.11 (C-6’), 68.01 (C-4’), 68.51 (C-4α), 68.68 (C-4β), 70.13 (C-5α), 70.57 (C-2’), 72.48 (C-3’), 74.78 (C-5β), 74.90 (C-5’), 76.99 (C-3α), 80.01 (C-3β), 91.13 (C-1, α), 95.12 (C-1β), 104.64 (C-1’β), 104.81 (C-1’α), 174.61 (C=O of Ac, α), 174.91 (C=O of Ac, β). Gal-β(1→→→→3)GlcNAc:(Vetere y col. 2000; Yu y col. 2010) 1H-NMR (500 MHz, D2O): 1.96 (s, 3H, Ac), 5.11 (d, J1α,2=3.45Hz, H-1α). 13C-NMR (125 MHz, D2O): δ 22.39 (Me of Ac, α), 22.64 (Me of Ac, β), 53.28 (C-2α), 56.02 (C-2β), 60.98 (C-6), 61.39 (C-6’), 68.94 (C-4’), 69.10 (C-4), 71.12 (C-2’), 71.62 (C-5α), 72.95 (C-3’), 75.63 (C-5’), 75.85 (C-5β), 80.57 (C-3α), 83.01 (C-3β), 91.42 (C-1α), 95.11 (C-1β), 103.83 (C-1’β), 103.96 (C-1’ α), 174.93 (C=O of Ac, α), 175.19 (C=O of Ac, β). Fracción de etanol Eluido Agua → pNF 2,50% → - 5% → Monosacáridos 7,50% → - 10% → Disacárido 12,50% → - 15% → - G al -β (1 -3 )- G al N A c Resultados y Discusión 130 Habiendo caracterizado los productos de reacción y preparado rectas de calibrado para medir concentraciones de disacárido por HPLC, se procedió a medir los rendimientos las reacciones. Para ello, estas se llevaron a cabo tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.2 utilizando como pNF-β-gal donador y como aceptores GalNAc y GlcNAc respectivamente. Se tomaron alícuotas cada 30 min durante 5 h, que se midieron por HPLC. Los resultados se muestran en la Figura 37. Los resultados muestran que en estas condiciones de reacción, el pNF-gal se consume totalmente a las 3 h, habiéndose obtenido un rendimiento del 51 % en la síntesis del disacárido Gal-β(1-3)-GlcNAc y del 49 % en la de Gal-β(1-3)-GalNAc. A partir de ese tiempo los disacáridos, al ser sustratos de la enzima, comienzan a ser hidrolizados, aumentando la concentración del producto de hidrólisis (Gal). Esto confirma la importancia de conocer la evolución del proceso de reacción para que se pueda detener en el momento en el que la producción de los disacáridos sea mayor. Además, las reacciones muestran una total regioselectividad hacia la síntesis del disacárido β(1-3). A) B) 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 C om pu es to (% ) Tiempo (h) pNP-gal Gal-β(1-3)-GlcNAc Gal 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 C om pu es to (% ) Tiempo (h) pNP-gal Gal-β(1-3)-GalNAc Gal Figura 37. Evolución de las reacciones de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 utilizando como donador pNF-gal y: A) GlcNAc como aceptor para la síntesis de Gal-β(1-3)- GlcNAc o B) GalNAc como aceptor para la síntesis de Gal-β(1-3)-GalNAc. Resultados y Discusión 131 Los resultados de rendimiento obtenidos son mayores que aquellos que muestra la bibliografía, que eran del 12% en la síntesis del disacárido Gal-β(1-3)-GlcNAc y del 10% en la de Gal-β(1-3)-GalNAc (Fujimoto y col. 1998). Esto se debe probablemente a que, según la metodología aplicada por estos autores, las reacciones de transglicosidación tenían una duración de 8 h. Según nuestros experimentos, esta es una duración de reacción demasiado larga, puesto que los disacáridos son hidrolizados a partir del momento en que el sustrato limitante (pNF-β-gal) es consumido (Figura 37). Además, la relación entre donador y aceptor que aplican estos autores es 1:2, a diferencia de la relación optima de 1:5 previamente comentada (Pérez-Sánchez, Cortés-Cabrera, y col. 2011). III.2.3.1. Reacciones de transglicosidación en presencia de disolventes sostenibles derivados de biomasa Como ya se ha comentado en la Introducción, estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación (Pérez-Sánchez, Cortés-Cabrera, y col. 2011; Pérez-Sánchez, Sandoval, y col. 2011; Pérez-Sánchez y col. 2012; Sandoval, Cortés, y col. 2012), han demostrado que la presencia de determinados disolventes sostenibles como co- solventes de la reacción de transglicosidación, producen un incremento en el rendimiento y un cambio en la regioselectividad. Estos disolventes sostenibles son en su mayoría derivados producidos de subproductos de la industria (como el glicerol) y de biomasa (como los derivados de la N,N-dimetilamida. Dado que uno de los objetivos de esta Tesis Doctoral es la síntesis de disacáridos de interés biológico, se decidió estudiar el efecto de estos disolventes sobre la actividad de la β-Gal-3 de B. circulans. Para ello, se utilizaron diferentes disolventes sostenibles obtenidos a partir de biomasa para modificar el medio de reacción y comprobar los efectos que producen en ella. Las estructuras de los mismos aparecen representadas en el Esquema 15. Por su procedencia y tipo de estructura, éstos disolventes se clasifican en tres grupos: i) derivados cíclicos del glicerol, ii) derivados acíclicos del glicerol, Resultados y Discusión 132 iii) derivados de N,N-dimetilamida. En la Tabla 20 se muestran las características físico-químicas, tales como su densidad y LogP (Pérez-Sánchez y col. 2012). También se muestra si el sistema es bifásico o monofásico, lo que fue obtenido experimentalmente en el laboratorio. O O O O O O OH OH O OH S1 S2 S3 N O OH N O S13 S14 N O S15 O O OH O O OH O O OH O O OH CF3 O O OH O O OH S4 S5 S6 S7 S8 O O OCH3 S11S10 O O OH CF3F3C S9 O O OCH3 CF3F3C S12 Esquema 15. Disolventes sostenibles derivados de biomasa utilizados como co-solventes en reacciones de transglicosidación: 1- Los disolventes S1-S3 corresponden a derivados cíclicos del glicerol. Los disolventes S4-S12 corresponden a derivados acíclicos del glicerol y los disolventes S13-S15 corresponden a derivados de la N,N-dimetilamida. Resultados y Discusión 133 Tabla 20. Características físico-químicas de los diferentes disolventes sostenibles derivados de biomasa.(Pérez-Sánchez y col. 2012) Disolvente Densidad (g/ml) Log P Sistema S1 1.24 -0.057 monofásico S2 1.41 -0.024 monofásico S3 1.06 0.030 monofásico S4 1.07 -0.60 monofásico S5 0.94 0.14 monofásico S6 0.91 0.27 monofásico S7 1.12 1.14 bifásico S8 1.36 1.42 bifásico S9 1.27 1.71 bifásico S10 0.90 1.93 bifásico S11 0.89 2.07 bifásico S12 0.89 2.48 bifásico S13 1.06 -0.69 monofásico S14 1.15 1.41 monofásico S15 0.91 1.42 bifásico Las reacciones se llevaron a cabo tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.2 utilizando como aceptores GlcNAc y GalNAc, y añadiendo una concentración 2M de cada uno de los disolventes sostenibles. Esta concentración fue obtenida como óptima en estudios previos de nuestro grupo de investigación.(Pérez-Sánchez, Cortés-Cabrera, y col. 2011; Pérez-Sánchez, Sandoval, y col. 2011; Pérez-Sánchez y col. 2012)Los resultados se muestran en la Figura 38 y Figura 39. En la Figura 38 se pueden observar los resultados cuando la reacción de transglicosidación se realizó en presencia de disolventes sostenibles derivados de biomasa y utilizando como aceptor GlcNAc para la síntesis de Gal-β(1-3)-GlcNAc. Anteriormente se indicó que el rendimiento de producción de disacárido en la reacción solo con tampón y transcurridas 3 h fue del 51%, respecto a un 49% de hidrólisis (Gal). Los diferentes resultados se pueden reunir en tres grupos. Aquellos Resultados y Discusión 134 en los que la reacción transcurrío de forma muy similar a la reacción control en solo en tampón: S1, S11 y S15 (con rendimientos de 48, 46 y 58% respectivamente). Aquellos en los que los rendimientos obtenidos fueron más bajos que en la reacción control, que se caracterizaron por una inhibición de la actividad enzimática: S3, S5, S6 y S14, llamando la atención estos dos últimos por la casi total inhibición que causan a la enzima. Por último se encuentran aquellos que mejoraron el rendimiento de la reacción: S2, S4, S7, S8, S9, S10, S12 y S13 (con rendimientos de 65, 68, 86, 71, 86, 93, 74 y 99%). Llama la atención cómo S8 provocó un cambio en la regioselectividad de la enzima, obteniéndose un 28% de disacárido Gal-β(1-6)- GlcNAc. De todos los disolventes que mejoraron el rendimiento de la reacción, el que ofreció mejor resultado fue el S13, con un rendimiento del 99%. 0 50 100 18 3 51 13 82 100 12 26 92 5 51 48 65 27 68 18 86 71 86 93 46 74 99 8 58 28 C on ve rs ió n (% ) pNF-Gal no reaccionado Gal-β-(1→3)-GlcNAc Gal-β-(1→6)-GlcNAc Figura 38. Reacciones de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 utilizando como donador pNF-gal, como aceptor GlcNAc y como co-colventes una batería de disolventes sostenibles derivados de biomasa. En la Figura 39 se muestran los resultados cuando la reacción de transglicosidación se realizó en presencia de disolventes sostenibles derivados de biomasa y utilizando como aceptor GalNAc para la síntesis de Gal-β(1-3)-GalNAc. Anteriormente se indicó que el rendimiento de producción de disacárido en la reacción solo con tampón y transcurridas 3 h fue del 49%, respecto a un 51% de hidrólisis (Gal). Los resultados de nuevo fueron diversos. Aquellos en los que la reacción transcurrió de forma muy similar a la llevada a cabo solo en tampón: S1, S8 y S15 (con rendimientos de 41, 47 y 48% respectivamente). Aquellos en los que los Resultados y Discusión 135 rendimientos obtenidos fueron más bajos que en la reacción en solo tampón, que se caracterizaron por una inhibición de la actividad enzimática: S2, S3, S5, S6, S7, y S14. Por último se encuentran aquellos que mejoraron el rendimiento de la reacción: S4, S9, S10, S11, S12 y S13 (con rendimientos de 69, 81, 86, 60, 83, 95%). Como también ocurrió en la reacción con GlcNAc, de todos los disolventes que mejoraron el rendimiento, el co-solvente que ofreció mejor resultado fue el S13, obteniéndose un rendimiento del 95 % hacia la síntesis. Debido a estos buenos resultados, este disolvente fue seleccionado como co-solvente para posteriores experimentos. 0 50 100 46 6 84 3 79 80 92 15 17 96 35 49 41 35 22 69 21 8 47 81 86 60 83 95 4 48 C on ve rs ió n (% ) pNF-Gal no reaccionado Gal-β-(1→3)-GalNAc Gal-β-(1→6)-GalNAc Figura 39. Reacciones de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 utilizando como donador pNF-gal, como aceptor GalNAc y como co-colventes una batería de disolventes sostenibles derivados de biomasa. A juzgar por las estructuras de los disolventes que aportaron resultados importantes con esta enzima y aquellos que la inactivaron, es difícil establecer una correlación entre su naturaleza química y los resultados obtenidos durante las reacciones. Estos disolventes han sido utilizados anteriormente con la β-galactosidasa comercial Biolacta (Pérez-Sánchez y col. 2012) y de E. coli (Pérez-Sánchez, Cortés-Cabrera, y col. 2011), obteniéndose con ellas variaciones en la regioselectividad de las enzimas y mejoras en la síntesis de disacáridos, que han sido explicadas en términos de polaridad, hidrofobicidad e interacciones moleculares con los disolventes. Con el objetivo de comprobar el efecto de distintas concentraciones del disolvente derivado de biomasa S13 como co-solvente, se llevaron a cabo las reacciones de Resultados y Discusión 136 transglicosidación (apartado V.2.4.2.2) utilizando pNF-β-gal como donador, como aceptores GlcNAc y GalNAc, y distintas concentraciones de S13: 1, 2 y 3M. Los resultados (Figura 40) muestran, en ambas reacciones, que la concentración óptima para obtener el mayor rendimiento fue 2M. A concentraciones diferentes (1 y 3 M) los valores de rendimiento fueron menores, aun obteniendo mejores resultados que los obtenidos previamente con solo tampón (51 y 49% respectivamente). Estos resultados demostraron la importancia de trabajar en concentraciones adecuadas de co-solvente y confirmaron que 2 M es la concentración óptima, como en los resultados obtenidos previamente con otas enzimas por nuestro grupo de investigación (Pérez-Sánchez, Cortés-Cabrera, y col. 2011; Pérez-Sánchez, Sandoval, y col. 2011; Pérez-Sánchez y col. 2012). 0 50 100 S13 1M S13 2M S13 3M 13 0 29 79 95 75 C o nv er si ón ( % ) pNF-Gal no reaccionado Gal-β-(1→3)-GalNAc 0 50 100 S13 1M S13 2M S13 3M 12 0 33 69 99 65 C on ve rs ió n (% ) pNF-Gal no reaccionado Gal-β-(1→3)-GlcNAc A) B) Figura 40. Efecto de la concentración de S13 en el rendimiento de las reacciones de transglicosidación de la enzima β-Gal-3 utilizando como donador pNF-gal y como aceptor: A) GlcNAc y B) GalNAC. III.2.3.2. Reacciones de transglicosidación en presencia de líquidos iónicos (LIs) Para evaluar este tipo de disolventes sostenibles, se utilizaron diferentes tipos de LIs como co-solventes de las reacciones de transglicosidación. Los LIs utilizados en este estudio aparecen representados en el Esquema 16. La cantidad de LI utilizada para cada reacción fue de un 30%, ya que los datos bibliográficos previos demuestran que las enzimas β-galactosidasa que emplearon presentan mejores rendimientos y una Resultados y Discusión 137 mayor estabilidad cuando se utilizan en esta concentración (Kaftzik y col. 2002) y confirmados en nuestro grupo de investigación con la enzima TTP0042 de T. thermophilus HB27 Sandoval, Cortés, y col. 2012. Se evaluaron en total 10 diferentes LIs, en su mayoría insolubles en agua a temperatura ambiente e incluso a las temperaturas de reacción (37ºC) (Tabla 21), siendo este hecho, una gran ventaja porque posibilita la recuperación del LI por simples procedimientos como la centrifugación o la decantación. Este es el caso de: [Bmim][PF6], [Omim][PF6] y [Troma][Ntf2]. En algunos casos se utilizaron cationes derivados del imidazolio ([Bmim][PF6] y[Omim][PF6]) y en otros casos derivados de amonio cuaternario [CPMA][MeSO4] y [Troma][ Ntf2]. Como aniones se utilizaron de forma predominante el hexafluorofosfato (PF6 -), la bis-triflimida (Ntf2 -), y el monometilsulfato (MeSO4 -). El detalle de las estructuras moleculares de los diferentes LIs utilizados se muestra en el Esquema 16, mientras que las características físico-químicas aparecen en la Tabla 21. [Bmim] [BF4] [Bmim] [FAP] [Bmim] [PF6] [CPMA][MS] [Emim ] [BF4] [Emim][MeSO 4] [Troma][NTF 2] [Hmim][NTF 2] [Bmim] [NTF2] [Omim][PF6] [CPMA][MS] [Emim][MeSO 4] [Troma][NTF 2] Esquema 16. Líquidos iónicos utilizados como co-solventes en reacciones de transglicosidación. Resultados y Discusión 138 Tabla 21. Características físico-químicas de los diferentes líquidos iónicos. Compuesto Masa molar (g.mol-1) Densidad (g.mL-1) Conductividad (mS-1) Log P Solubilidad en agua (30% m/v) [Bmim][BF4] 226,03 1,12 2,3 N/D insoluble [Bmim][FAP] 584,2 1,63 (Xiao y col. 2012) 2,3a (Xiao y col. 2012) N/D insoluble [Bmim][NTf2] 419,36 1,44 N/D N/D insoluble [Bmim][PF6] 284,2 1,24 (Fredlake y col. 2004) 0,146 (Suarez y col. 1998) -2,39 (Kaar y col. 2003) insoluble [Emim][MeSO4] 174 1,34 N/D insolube [Emim][BF4] 198,0 1,24 1,4 (Fuller y col. 1997) -2,66 (Lee 2005) soluble [Hmim][NTf2] 475,5 1,25 N/D 0,79 (Lee 2005) insoluble [Omim][PF6] 340,3 1,37 (Kumar 2008) N/D -0,35 (Lee 2005) insoluble [Troma][NTf2] 648,9 1,08 (Kilaru y col. 2007) 0,04a, c N/D (Zhao y col. 2009) insoluble [CPMA][MeSO4] 517,7 1,21 N/D N/D soluble Las reacciones con la enzima β-Gal-3 se llevaron a cabo tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.2 utilizando pNF-β-Gal como donador, y como aceptores GalNAc y GlcNAc, añadiendo una concentración del 30% de cada uno de los LIs. Los resultados se muestran en la Figura 41 y en la Figura 42. En la Figura 41 se pueden observar los resultados cuando la reacción de transglicosidación se realizó en presencia LIs y utilizando como aceptor GlcNAc para la síntesis de Gal-β(1-3)-GlcNAc. Anteriormente se indicó que el rendimiento de producción de disacárido en la reacción solo con tampón y transcurridas 3 h, fue del 51%, respecto a un 49 % de hidrólisis (Gal). Las reacciones con los LIs [Bmim][Bf 4], [Bmim][Ntf 2], [CPMA][MeSO4], [Emim][Bf4], [Hmim][Ntf 2] y [Omim][PF6] mostraron un rendimiento similar al de la reacción solo con tampón, pero un cambio de regioselectividad hacia el disacárido Gal-β(1-6)-GlcNAc, por lo que provocaban en la enzima una pérdida de regioespefificidad. [Bmim][FAP] Resultados y Discusión 139 inhibió la actividad enzimática casi completamente, con una conversión del sustrato de partida pNF-β-Gal de solo un 4%. Es probable que esto se debiera al efecto del anión [FAP] en el medio de reacción, puesto que en otro LIs que presentan el catión [Bmim] se obtuvieron buenos resultados. Con [Emim][MeSO4], aun siendo consumido completamente el sustrato pNF-β-Gal, la reacción estaba orientada hacia la hidrólisis, mostrando solo un 20% de transglicosidación. [Bmim][PF6] y [Troma][Ntf2] aumentaron el rendimiento de disacárido producido (97 y 88% respectivamente), siendo el primero el que mejores resultados ofreció, con un rendimiento casi del 100%. 0 50 100 16 96 32 51 40 4 51 97 53 37 20 37 43 88 14 27 33 26 19 16 C on ve rs ió n (% ) pNF-Gal no reaccionado Gal-β-(1→3)-GlcNAc Gal-β-(1→6)-GlcNAc Figura 41. Reacciones de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 utilizando como donador pNF-gal, como aceptor GlcNAc y como co-colventes una batería de líquidos iónicos. En la Figura 42 se muestran los resultados obtenidos cuando la reacción de transglicosidación se realizó en presencia de LIs y utilizando como aceptor GalNAc para la síntesis de Gal-β(1-3)-GalNAc. [Bmim][Bf4], [Bmim][Ntf 2] y [Emim][Bf4] provocaron un rendimiento muy similar al obtenido en la reacción solo con tampón, pero perdiendo regioespecificidad ya que se produjo síntesis de disacárido β(1-6). [CPMA][MeSO4] es el LI con el que se produjo más disacárido β(1-6), un 23%, respespecto al 32% de β(1-3). Con [Emim][MeSO4], aun siendo consumido completamente el sustrato de partida pNF-gal, la reacción estaba orientada hacia la hidrólisis, mostrando solo un 22% de transglicosidación. [Hmim][Ntf2] y [Omim][PF6] mejoraron el rendimiento de Gal-β(1-3)-GalNAc respecto a la reacción Resultados y Discusión 140 solo en tampón (61 y 64% respectivamente), aunque con una pequeña producción de β(1-6). [Bmim][PF6] y [Troma][Ntf2] aumentaron el rendimiento de disacárido producido (97 y 91 % respectivamente), siendo nuevamente el primero el que mejores resultados ofreció, con una selectividad casi total hacia la transglicosidación. Debido a estos buenos resultados, este disolvente fue seleccionado como co-solvente para posteriores experimentos. 0 50 100 12 95 25 49 55 5 50 97 32 59 22 61 64 91 5 8 23 10 6 4C on ve rs ió n (% ) pNF-Gal no reaccionado Gal-β-(1→3)-GalNAc Gal-β-(1→6)-GalNAc Figura 42. Reacciones de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 utilizando como donador pNF-gal, como aceptor GalNAc y como co-colventes una batería de líquidos iónicos. Existen pocas referencias bibliográficas sobre el efecto de los LIs con enzimas de tipo β-galactosidasas (Kaftzik y col. 2002; Lang y col. 2006; Sandoval, Cortés, y col. 2012). Así por ejemplo, en los resultados de Kaftzik y col.(2002) con la β- galactosidasa de Biolacta, los rendimientos de Gal-β(1-4)-GlcNAc pasan de un 30%, de la reacción realizada en tampón, a 58% para la reacción catalizada en el LI [Mmim][MeSO4] (metilsulfato de 1,3-dimetil imidazolio). Mientras que los resultados obtenidos por Lang y col.(2006) con la β-galactosidasa termófila de P. furiosus en presencia del mismo LI, mejoran en aproximadamente un 10% los rendimientos de las reaciones de síntesis de distintos galactósidos, que los autores no identifican en dicho estudio. En nuestro grupo de investigación se han hecho estudios de interacción LI-enzima por SPR, espectroscopía de fluorescencia y modelado molecular, sobre el efecto de LIs sobre la actividad de la enzima TTP0042 de Resultados y Discusión 141 Thermus thermophilus HB27, los cuales provocan un cambio de regioselectividad en la transglicosidación desde el Gal-β(1-6)-GlcNAc hacia el Gal-β(1-4)-GlcNAc (Sandoval, Cortés, y col. 2012). La variedad de entornos químicos y medios de reacción hacen suponer, que las interacciones propias de cada LI con el medio de reacción y la enzima son las responsables en las modificaciones de la regioselectividad de la reacción. Por este motivo, es que más adelante se planteará un estudio de modelado molecular con [Bmim][PF6] con la finalidad de explicar este tipo de fenómenos (apartado III.2.4). Para comprobar el efecto de distintas concentraciones del LI [Bmim][PF6] como co- solvente de la reacción de β-Gal-3, se llevaron a cabo las reacciones de transglicosidación (apartado V.2.4.2.2) utilizando como aceptores GlcNAc y GalNAc y distintas concentraciones del LI: 15, 30 y 45%. Por encima de esta concentración el medio se volvía demasiado viscoso como para permitir una adecuada agitación. Los resultados (Figura 43) muestran que la concentración óptima en ambas reacciones es 30% de [Bmim][PF6], con una conversión total del sustrato pNF-β-Gal y un rendimiento cercano al 100%. En las reacciones con concentraciones diferentes de 30%, los valores de rendimiento son más bajos, aun obteniendo valores de mayores que los obtenidos usando solo tampón (51 y 49% respectivamente). Estos resultados demostraron la importancia de trabajar en concentraciones adecuadas de co-solvente y confirmaron los obtenidos en la bibliografía (Kaftzik y col. 2002) y en estudios previos por nuestro grupo de investigación con la enzima TTP0042 de Thermus thermophilus HB27 (Sandoval, Cortés, y col. 2012). Resultados y Discusión 142 0 50 100 [Bmim] [PF6] 15% [Bmim] [PF6] 30% [Bmim] [PF6] 45% 3 0 5 66 97 78 C on ve rs io n (% ) pNF-Gal no reaccionado Gal-β-(1→3)-GlcNAc 0 50 100 [Bmim] [PF6] 15% [Bmim] [PF6] 30% [Bmim] [PF6] 45% 3 0 5 68 99 80 C on ve rs io n (% ) pNF-Gal no reaccionado Gal-β-(1→3)-GalNAc A) B) Figura 43. Efecto de la concentración de [Bmim][PF6] en el rendimiento de las reacciones de transglicosidación de la enzima β-Gal-3 utilizando como donador pNF-gal y como aceptor: A) GlcNAc y B) GalNAC. De los resultados podemos concluir, que la concentración de LI afecta de forma significativa a los rendimientos, sin embargo, teniendo en cuenta que los LIs utilizados, son en su mayoría insolubles en agua, el fenómeno queda en la interfase del agua y el LI. De ser así, la agitación cumple un papel crucial en la síntesis, pues una eficiente agitación conlleva que el LI se subdivida en pequeñas partículas a modo de emulsión, lo que aumenta significativamente el área de contacto entre el LI y el medio acuoso, haciendo más notorio el efecto del LI sobre la enzima. III.2.3.3. Escalado de la producción de disacáridos β(1-3) en presencia de S13 y [Bmim][PF6] En apartados anteriores se ha mostrado cómo el uso de determinados disolventes sostenibles como co-solventes en la reacción de transglicosidación con la enzima β- Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 puede aumentar el rendimiento de la reacción de transglicosidación para la síntesis de disacáridos β(1-3). Concretamente, el uso del derivado de biomasa S13 y el LI [Bmim][PF6] modifican la selectividad hacia de la enzima hacia el sustrato, de forma que la producción de disacárido se acerca al 100 % con ambos co-solventes (apartados III.2.3.1 y III.2.3.2) Resultados y Discusión 143 Una vez caracterizada la producción de una molécula en escala analítica, un punto importante que debe ser tenido en cuenta a la hora de pasar a escala preparativa, es la capacidad de purificar dicha molécula de la mezcla de reacción. En el apartado anterior se utilizó una columna de carbono-celite para separar los distintos azucares de la reacción. Ahora, se debe poner a punto un protocolo para extraer los co- solventes que se añaden a la reacción para aumentar el rendimiento, ya que deben ser eliminados antes de ser cargados en la columna. Las reacciones se llevaron a cabo tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.2 pero en esta ocasión aumentando la escala para 2 g de pNF-gal y un volumen total final de 80 ml. La reacción fue seguida por HPLC (apartado V.2.7.1) y detenida las 3 h. A continuación se exponen por separado los protocolos establecidos para la extracción de cada uno de los co-solventes: -Extracción del S13: El S13 es un derivado de N,N-dimetilamida líquido a temperatura ambiente y soluble en agua en el que los azúcares son solubles. No pudo ser separado por decantación, percolación, extracción orgánica, liofilización, evaporación rotatoria o durante la purificación en la columna de carbono-celite (resultados no mostrados). Finalmente se desarrolló un procedimiento eficaz para la extracción del S13, descrito en el apartado V.2.5.1. Éste se basó en la precipitación de los azúcares en hexano a - 196 ºC, mientras que el S13 permaneció soluble en el disolvente, que fue retirado por filtración (Figura 44). Es importante destacar, que el hexano pudo ser separado del S13 en rotavapor y completamente recuperado. Esta metodología permitió la reutilización del S13 en futuras reacciones (Figura 45). Resultados y Discusión 144 Figura 44. Sólidos del medio de reacción separados de S13 Figura 45. S13 purificado del medio de reacción -Extracción de [Bmim][PF6] Como se explicó en el apartado III.2.3.2, una ventaja del [Bmim][PF6] es que es insoluble en fase acuosa. Esto permite la separación del LI mediante métodos sencillos como la centrifugación. Lo importante es que los azúcares de la reacción permanezcan en la fase acuosa y no sean arrastrados por el LI. Para comprobar esto, finalizada la reacción de transglicosidación, la mezcla fue centrifugada a 14.000 r.p.m, obteniéndose dos fases diferenciadas, la acuosa y el [Bmim][PF6]. Se tomó una alícuota de cada una de ellas y se corrió una TLC (apartado V.2.5.4) utilizando como fase móvil acetato de etilo:hexano 50:50. El resultado (Figura 46) muestra que los azúcares se encuentran en la fase acuosa (carril 3), quedando el [Bmim][PF6] libre de estos (carril 2). El poder separar el [Bmim][PF6] mediante centrifugación supone una gran ventaja en el uso de este LI respecto a lo expuesto en el apartado anterior sobre S13, ya que la extracción es muy sencilla y una vez recuperado puede ser reutilizado en posteriores reacciones. Resultados y Discusión 145 1 32 Figura 46. TLC que muestra la cómo los azúcares de la reacción no son solubles en [Bmim][PF6]. En el carril 1 aparece la muestra de reacción antes de centrifugar, en el carril 2 aparece la fase de [Bmim][PF6] después de centrifugar y en el carril 3 aparece la fase acuosa después de centrifugar. [Bmim][PF6] revela como una mancha blanca y los azúcares como una mancha oscura. Fase móvil: acetato de etilo:hexano 50:50 Una vez extraídos los co-solventes de la mezcla de reacción, se llevó a cabo una purificación en columna de carbono-celite según el procedimiento descrito en el apartado V.2.5.1 y con resultados similares a los obtenidos en la purificación a menor escala en el apartado . Las fracciones del 10% de etanol fueron rotadas y liofilizadas obteniéndose los siguientes resultados: -En la reacción con S13 se obtuvieron 2,25 g de Gal-β(1-3)-GlcNAc lo que implica un rendimiento del 88% respecto a la cantidad esperada. -En la reacción con [Bmim][PF6] se obtuvieron 2,17 g de Gal-β(1-3)-GlcNAc lo que implica un rendimiento del 85% respecto a la cantidad esperada. Resultados y Discusión 146 III.2.4. Modelado molecular y docking Con el objetivo de obtener una explicación a nivel molecular del aumento de rendimiento observado en las reacciones con la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC31382 en presencia de algunos disolventes sostenibles, se decidió realizar un estudio de interacción enzima-disolvente mediante modelado molecular, docking y dinámica molecular. Para ello se construyó un modelo tridimensional de la enzima en presencia de estos disolventes sostenibles, y el sustrato donador (pNF-β-Gal) y aceptor (GlcNAc) fueron situados en el centro activo de dicho modelo. Posteriormente se llevaron a cabo dinámicas moleculares en presencia y en ausencia del derivado de biomasa S13 y el LI [Bmim][PF6] y se compararon los resultados entre ellas. III.2.4.1. Modelado por homología Puesto que no existe un modelo tridimensional de la estructura de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC31382, se realizó un modelado por homología basado en la estructura de la proteína cristalizada más parecida disponible en el Protein Data Bank (PDB). Esta era la β-galactosidasa de Bacterioides thethaiotaomicron (PDB ID: 3D3A), con un 42% de indentidad de secuencia (e-value: 1e-146). Se utilizaron los servidores de modelado SWISS-Model y CPHmodels-3.0 (apartado V.2.8.2.1) para crear el modelo basándose en el alineamiento de entre estas dos enzimas (Figura 47). Resultados y Discusión 147 Figura 47. Modelado por homología de la enzima β-Gal-3 de B.circulans ATCC 31382 (en verde) sobre β-galactosidasa de Bacterioides thethaiotaomicron (en morado) III.2.4.2. Centro activo de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 El centro activo fue localizado usando una combinación de la secuencia de la enzima, alineamiento estructural y un docking ciego. El modelo de la enzima reveló que el centro activo podría ser similar al de la β-galactosidasa de E. coli (LacZ). La superimposición de la estructura de un monómero y el modelo utilizado llevaron a la identificación del par de aminoácidos del centro catalítico, siendo éstos: Glu-157 y Glu-233. Con este proceso se consiguió también determinar el comportamiento químico de cada uno de ellos: el residuo Glu-233 corresponde con el residuo Glu-537 de LacZ el cual está actualmente aceptado como nucleófilo (Juers y col. 2001). Mientras que el residuo Glu-157 fue identificado como el ácido catalítico (Glu-461 en LacZ), este hecho es concordante con los primeros resultados de docking (Figura 48). Se detectaron otros dos aminoácidos en el centro activo que parecen interaccionar con el sustrato: Trp-235 y Tyr-450. Este tipo de interacciones han sido ampliamente investigadas, y se han identificado como cruciales en otras galactosidasas, porque orientan el sustrato dentro del centro activo (Spiwok y col. 2004) (Figura 49). 2 1 Figura 48. Superposición de las ectructuras del centro activo de β-Gal-3 de B. Circulans ATCC 31382 (en verde) y LacZ de E. Coli (en azul). El aminoácido 1 es el ácido catalítico y Resultados y Discusión 148 corresponde con Glu-157 en β-Gal-3 y con Glu-461 en LacZ. El aminoácido 2 es el residuo nucleófilo y corresponde con Glu-233 en β-Gal-3 y con Glu-537 en LacZ. III.2.4.3. Resultados de Docking Se modeló el complejo sustrato-enzima con el pNF-gal en el centro activo para crear el intermedio de reacción Glu-233-gal. Después se realizó el docking de GlcNAc en el centro activo de la enzima. Se seleccionó la mejor solución para este docking como punto de inicio para simular las dinámicas moleculares. El GlcNAc se orienta en el centro activo gracias a interacciones con el Trp-235 y el Tyr-450, creándose puentes de hidrógeno entre este último con la cadena N-acetilo del sustrato (Figura 49). Esta interacción provocaría que el hidroxilo del carbono 3 (O3) del GlcNAc quedara enfrentado al carbono anomérico (C1) de la galactosa integrante del intermedio de reacción Glu 233-gal y al Glu 157, lo que permitiría que la reacción de transglicosidación tuviera lugar, liberando el producto formado del intermedio de reacción. GluGlu 157157 GluGlu 233233 GlcNAcGlcNAc GalGal TrpTrp 235235 TyrTyr 450450 GluGlu 157157 GluGlu 233233 GlcNAcGlcNAc GalGal TrpTrp 235235 TyrTyr 450450 Figura 49. Modelado molecular del centro activo de β-Gal-3 en el que se muestra el intermedio de reacción Glu 233-Gal y docking de GlcNAc III.2.4.4. Dinámica molecular La forma y distancia a la que se sitúa el GlcNac en el centro activo respecto al intermedio de reacción Glu 233-gal, puede variar dependiendo de la flexibilidad de la Resultados y Discusión 149 enzima y del disolvente utilizado. Las distancias entre el carbono anomérico (C1) y los hidroxilos de la molécula del aceptor, se confirmaron como indicadores validos de la mejor posición para ser atacada y correlacionada con la regioespecificidad de varias enzimas utilizadas en la síntesis de carbohidratos (Brás y col. 2009). Con este objetivo, se midió las distancias entre C1 de la galactosa del intermedio de reacción y el grupo O3 del GlcNAc en presencia de solo agua, en presencia de S13 2M-agua y en presencia del 30% de [Bmim][PF6]-agua. Los resultados (Figura 50) muestran que en presencia de co-solventes como S13 o [Bmim][PF6] (azul y negro respectivamente), el C1 y el O3 se mantienen próximos durante más tiempo que en presencia de solo agua (verde). Figura 50. Distancia entre el O3 del GlcNAc y el C1 del intermedio de reacción Glu 233- Gal dentro del cento activo de β-Gal-3. En verde sistema solo con agua, en negro [Bmim][PF6]-agua y en azul S13-agua. Según la predicción de la energía de las uniones no covalentes entre el sustrato y el centro activo de la enzima (Tabla 22) se puede observar que las uniones son más estables cuando el medio está compuesto por una mezcla de agua y co-solvente que cuando está compuesto solo por agua, por lo que el aumento en el rendimiento podría ser debido a un efecto Circe (Jencks 1975), el cual postula que los aumentos de actividad de una enzima son debidos a un aumento de la afinidad del sustrato por el centro activo. Además, debido a la naturaleza polar de los azucares y del centro activo, éstos interaccionan fuertemente con las moléculas de agua, por lo que la Resultados y Discusión 150 energía de desolvatación es mayor cuando el disolvente solo está compuesto por agua que cuando esta está mezclada con los co-solventes S13 y [Bmim][PF6] (Tabla 22). Tabla 22. Energías de interacción de la enzima β-Gal-3 con el disolvente obtenidas en el estudio de dinámica molecular (media de los valores), cuando el disolvente está compuesto solo por agua, por agua con S13 2M, y por agua con 30 % de [Bmim][PF6]. Disolvente Sustrato-Centro activo (kJ/mol) Sustrato-Disolvente (Fuerzas de van der Waals) (kJ/mol) Agua -13.27 -76.54 S13-agua -14.64 -74.62 [BMIM][PF6]-agua -19.13 -74.83 III.2.5. Estudio del efecto del disolvente en la estructura terciaria de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 por espectroscopía de fluorescencia Para estudiar el efecto del co-solvente sobre la estructura de la enzima y sus posibles cambios conformacionales, se midieron las variaciones de fluorescencia a diferentes concentraciones del derivado de biomasa S13. Este ensayo no pudo ser realizado con [Bmim][PF6] debido a que no es soluble en agua, condición fundamental para el experimento. La enzima fue disuelta en tampón fosfato de sodio 10 mM pH 6 para medir su emisión en forma nativa, obteniéndose su máximo a 340,63 nm. Después, se fueron añadiendo sucesivamente alícuotas de S13, tal y como se explica en el protocolo del apartado V.2.7.3. Como resultado, se fueron obteniendo desplazamientos del máximo de emisión con tendencia hacia el rojo. En la Figura 51 se muestran los Resultados y Discusión 151 máximos de emisión para las concentraciones de S13 utilizadas en las reacciones de transglicosidación del apartado III.2.3.1 (1, 2 y 3 M). Con una concentración 1 M el máximo de emisión se desplazó hasta 344,76 nm, a 2M se desplazó a 345,87 nm y a 3M el máximo se desplazó a 346,59 nm. Este desplazamiento sugiere una modificación en el ambiente químico de los triptófanos de la enzima, lo que se asocia con una modificación conformacional de su estructura (Vivian y col. 2001). Figura 51. Espectro de emisión de fluorescencia de β-Gal-3 en tampón fosfato de sodio 10 mM pH 6,0 y a diferentes concentraciones de S13. El triptófano es un aminoácido altamente hidrofóbico que se localiza en regiones internas y no expuestas de la enzima. Los resultados sugieren que S13 afecta a la disposición de los triptófanos y, por lo tanto, provoca una modificación en la estructura terciaria de la proteína. Además, los cambios estructurales demuestran ser mayores según va aumentando la concentración del co-solvente S13. Los resultados de la Figura 51 confirman lo obtenido en el modelado molecular (apartado III.2.4). Los co-solventes son capaces de modificar la estructura de la enzima, aumentando la afinidad del GlcNAc por el centro activo cuando se encuentra formado el intermedio de reacción entre el Glu-233 y la galactosa (Tabla 22). Además, la mezcla de agua con los co-solventes tiene menos afinidad por el GlcNac Resultados y Discusión 152 cuando este se encuentra en el centro activo que cuando el disolvente se trata de agua exclusivamente (Tabla 22). Estos dos factores conllevan que el hidroxilo del carbono 3 del GlcNAc permanezca más tiempo a una distancia óptima del carbono anomérico de la galactosa para que se produzca la reacción (Figura 50). La concentración de co-solvente que maximiza estos efectos es 2M para S13 (Figura 40, apartado III.2.3.1) y 30% para [Bmim][PF6] (Figura 43, apartado III.2.3.2). III.2.6. Inmovilización de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 Como se explicó en el apartado I.2.5 de la Introducción, la inmovilización de enzimas supone importantes ventajas como la mejora de la estabilidad, la posibilidad de reutilizar el biocatalizador ya que se puede separar facilmente de la mezcla de reacción, lo que además previene la contaminación por proteínas en el producto final (Bornscheuer 2003). Por ello se desarrolló un proceso de inmovilización para la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 utilizando dos estrategias: 1. Inmovilización sobre polímeros macroporosos como Eupergit CM, y los polímeros macroporosos de tamaño de poro controlado sintetizados por el Grupo de Investigación. 2. Inmovilización sobre olímeros de glioxil agarosas facilitados por el grupo del Prof. Dr. Guisán Los resultados obtenidos en cada uno de estos experimentos se detallan a continuación. Resultados y Discusión 153 III.2.6.1. Inmovilización de β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 sobre polímeros macroporosos de tamaño de poro controlado Se inmovilizó la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 sobre diferentes polímeros funcionalizados con grupos epóxidos. La estructura de los monómeros y la caracterización de los polímeros se presentan en el apartado V.2.6.1. El proceso de inmovilización se siguió midiendo la cantidad de proteína inmovilizada a las 24 horas, para ello se utilizó la metodología del procedimiento experimental descrito en el apartado V.2.6.1.1. Los resultados obtenidos en el proceso de inmovilización de la enzima a los soportes sintetizados, y sobre el Eupergit C, aparecen en la Tabla 23. Como puede observarse en dicha Tabla, los resultados obtenidos con los distintos polímeros han sido muy diversos, obteniéndose los mejores porcentajes de inmovilización con los polímeros más hidrofílicos (poli(AGE-co-DAPE-DVB)-4, poli(ADGGE-co-DAPE-DVB)-10 y Poli(ATGPE-co-DAPE-DVB)-6 con el 100% de inmovilización). Por el contrario, los polímeros que dan lugar a los peores porcentajes de inmovilización son los más hidrofóbicos (poli(GE-co-DVB)-4 (28%) y poli(BGMPME-co-DVB)-5 (31%) y poli(TGPME-co-DVB)-3 (32%)), dato compatible con el hecho de que la enzima es hidrófila. Una vez finalizado el proceso de inmovilización, se determinó la actividad enzimática de los derivados inmovilizados siguiendo la metodología del procedimiento general, descrito en el apartado V.2.4.1.2. Los resultados aparecen en la Tabla 23. Como se puede observar, el proceso de inmovilización llevado a cabo con todos los polímeros, origina una drástica pérdida de actividad enzimática, siendo el mejor resultado el obtenido con el polímero Poli(AGE-co-DVB)-74, que conserva un 3,4% de la actividad respecto a la enzima libre. Resultados y Discusión 154 Tabla 23. Resultados de la inmovilización de β-Gal-3 y actividad enzimática sobre soportes macroporosos funcionalizados con grupos epóxido. Soporte Enzima inmoviliz ada (%) Carga enzimática (mg enzima/g soporte) Actividad enzimática UI/m g (%) Enzima libre - - 10,7 100 Poli(AGE-co-DVB)-74 85 8,5 0,36 3,4 Poli(ADGGE-co-DVB)-50 78 7,8 0,11 1 Poli(ATGPE-co-DVB)-13 73 7,3 0,13 1,2 Poli(AGE-co-DAPE-DVB)-4 100 10 0 0 Poli(ADGGE-co-DAPE-DVB)-10 100 10 0,12 1,1 Poli(ATGPE-co-DAPE-DVB)-6 100 10 0 0 Poli(GMA-co-EGDMA)-11 41 4,1 0 0 Poli(GMA-co-HDDMA)-2 34 3,4 0 0,1 Poli(BGMPMA-co-EGDMA)-8 43 43 0,06 0,6 Poli(TGPMA-co-EGDMA)-9 38 3,8 0,03 0,3 Poli(GMA-HEMA-co-EGDMA)-9 71 7,1 0,25 2,3 Poli(BGMPMA-HEMA-co-EGDMA)-2 60 6 0,11 1 Poli(TGPMA-HEMA-co-EGDMA)-1 46 4,6 0,19 1,8 Poli(GMA-DEAEMA-co-EGDMA)-1 48 4,8 0 0 Poli(BGMPMA-DEAEMA-co-EGDMA)-1 35 3,5 0 0 Poli(TGPMA-DEAEMA-co-EGDMA)-1 34 3,4 0 0 Poli(GMA-HEMA-DEAEMA-co-EGDMA)-9 65 6,5 0 0 Poli(TGPMA-HEMA-DEAEMA-co- EGDMA)-1 57 5,7 0 0 Poli(GE-co-DVB)-4 28 2,8 0 0 Poli(BGMPME-co-DVB)-5 31 3,1 0 0 Poli(TGPME-co-DVB)-3 32 3,2 0 0 Eupergit C 45 4,5 0,15 1,4 Esta inactivación, originada por el proceso de inmovilización, puede ser debida a la modificación de la estructura terciaria activa de la enzima, originada por la inmovilización de la enzima por diversos residuos (lisina, cisteína ó histidina) del centro activo de la enzima ó próximos a él. También puede ser debido a la naturaleza de los soportes. Según han descrito otros autores, la inmovilización de enzimas hidrófilas, como las β-glucosidasa de Aspergillus niger o la α-quimiotripsina, en polímeros acrílicos como el Eupergit, causan bajos rendimientos debido a las interacciones de la enzima (altamente hidrofílica) con los grupos oxiranos del Eupergit (Levitsky y col. 1999; Tu y col. 2006). Resultados y Discusión 155 En nuestro grupo de investigación, el Dr. Antonio Aires y el Dr. Manuel Sandoval, obtuvieron resultados similares al tratar de inmovilizar las enzimas de Biolacta y TTP0042 de T. thermophilus HB27 en el desarrollo de sus Tesis Doctorales (Aires- Trapote 2012; Sandoval 2012). Evaluando los resultados obtenidos en este proceso de inmovilización y estabilización de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 sobre los polímeros sintetizados y sobre el Eupergit C, se decidió no continuar con la caracterización de la enzima inmovilizada y su aplicación en la síntesis enzimática de oligosacáridos en este tipo de soportes. III.2.6.2. Inmovilización de β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 sobre glioxil agarosas Debido a que la inmovilización de β-Gal-3 sobre polímeros macroporosos funcionalizados con grupos epóxido no dio buen resultado al no superar el 3,4% de retención de actividad enzimática en el mejor de los casos, se decidió explorar otro tipo de soporte de inmovilización. Este fue glioxil agarosa (Guisán 1988), un polímero funcionalizado con grupos aldehido. III.2.6.2.1. Estabilización de la enzima en medios alcalinos (pH 10) El proceso de inmovilización en soportes de glioxil agarosa (Guisán 1988) implica la exposición de la enzima a condiciones de pH en las que no es estable (apartado V.2.6.2.2). Para evitar la desnaturalización de la enzima durante la inmovilización se probaron diferentes agentes estabilizantes para ser añadidos al tampón de inmovilización. Estos fueron: glicerol, trehalosa y polietilenglicol-600 (PEG-600). Estos compuestos se caracterizan por crear múltiples puentes de hidrógeno con las proteínas, lo que evita posibles cambios conformacionales (Jain y col. 2011; Attri y col. 2012; Qiang y col. 2012; Romeo 2012). Resultados y Discusión 156 Se llevó a cabo la incubación de la enzima en presencia de los diferentes agentes estabilizantes, tal y como se describe en el apartado V.2.6.2.1. Los resultados se muestran en la Figura 29. Sin ningún agente estabilizante, después de 30 min a 4 ºC y pH 10, la enzima conserva el 70% de la actividad inicial, y después de 120 min el 30%. En presencia de glicerol, después de 30 min se observa un 90% de actividad y un 50% después de 120 min. La trehalosa conserva el 80% de actividad después de 30 min, manteniendo este valor constante a los 120 min. El mejor resultado fue obtenido con el PEG-600, que mantenía el 100% de actividad de la enzima a los 30 min y solo perdía un 3% a los 120 min, por lo que fue seleccionado como agente estabilizante de la enzima durante el proceso de inmovilización. 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 120 A ct iv id ad (% ) Tiempo (min) Control PEG-600 Trehalosa Glicerol Figura 52. Mantenimiento de la actividad enzimática de β-Gal-3 a 4 ºC en presencia de diferentes agentes estabilizantes en las condiciones del proceso de inmovilización en glioxil agarosa: tampón bicarbonato de sodio 100 mM pH10. Con el objetivo conservar el máximo posible de actividad a 25 ºC, que es la temperatura a la que se lleva a cabo el proceso de inmovilización (apartado V.2.6.2.1), se procedió a probar la incubación a distintas concentraciones de PEG- 600, entre 5 y 50 % de PEG-600. Los resultados se muestran en la Figura 53. Los mejores fueron obtenidos a una concentración del 50 % de PEG-600 en buffer de inmovilización, en la que la enzima mantenía el 86% de actividad después de 30 min Resultados y Discusión 157 y el 56 % después de 120 min. Este agente y esta concentración fueron seleccionados para la inmovilización. 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 120 A ct iv id ad (% ) Tiempo (min) 5% 10% 20% 30% 50% Figura 53. Mantenimiento de la actividad enzimática de β-Gal-3 a 25 ºC en presencia de diferentes concentraciones de PEG-600 en las condiciones del proceso de inmovilización en glioxil agarosa: tampón bicarbonato de sodio 100 mM pH10. III.2.6.2.2. Estudio de carga enzimática del biocatalizador Con el objetivo de calcular la cantidad óptima de enzima que puede ser inmovilizada sobre el soporte se estudiaron diferentes valores de carga de proteína. Se llevó a cabo el proceso de inmovilización (apartado V.2.6.2.2) con cantidades crecientes de enzima, desde 0,1 y 2 mg por gramo de soporte (apartado V.2.6.2.3), y posteriormente, se midió su actividad hidrolítica frente a pNF-gal (apartado V.2.4.1.2). En todos los casos se inmovilizó la totalidad de la enzima. Los resultados se muestran en la Figura 54. Como se puede observar, la cantidad de enzima con la que se obtiene un mejor resultado es 0,5 mg por gramo de soporte, que mantiene un 85% de actividad respecto a la misma cantidad de enzima libre. Con concentraciones diferentes de enzima se obtienen resultados más bajos, que pueden ser debidos a problemas difusionales por limitaciones en el transporte de masa del sustrato dentro del soporte. Con cantidades de enzima por debajo de 0,5 mg/g el sustrato tiene dificultad para llegar a la enzima debido a su baja concentración. Con cantidades por encima se pueden dar efectos de colmatación de los poros del soporte, o bien que las Resultados y Discusión 158 enzimas agregan unas sobre otras, evitando al sustrato acceder al centro activo de las mismas, por lo que no pueden reaccionar tan bien como la enzima libre 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0,5 1 1,5 2 A ct iv id ad (% ) mg enzima/g soporte Figura 54. Inmovilización con distintas cantidades de enzima β-Gal-3 por gramo de agarosa glioxal a 25 ºC en tampón bicarbonato de sodio 100 mM pH10 con 50% de PEG-600. III.2.6.2.3. Influencia del pH en la actividad de la enzima β-Gal-3 inmovilizada La mayor parte de las enzimas modifican su intervalo de pH de trabajo cuando se inmovilizan, al variar el microentorno de la proteína (Moreno, Arroyo, y col. 1997; Moreno, Hernáiz, y col. 1997). Para poder establecer las condiciones óptimas de reacción con la enzima β-Gal-3 inmovilizada en soportes de glioxil agarosa se procedió al cálculo de su pH óptimo, según el protocolo del apartado V.2.6.2.4. Para ello se realizó la reacción de hidrólisis utilizando pNF-β-Gal en distintas condiciones de pH por el método discontinuo. En la Figura 55 se muestran los resultados superpuestos con los obtenidos previamente para la enzima libre (apartado III.2.2.1), en la que se puede observar que los valores optimos coinciden, manteniéndose en pH 6. La diferencia fundamental que se puede encontrar es que en los extremos (pH 4 y 9) la enzima inmovilizada conserva más actividad que la enzima libre, siendo un 58% a pH 4 respecto al 32% que mantenía la enzima libre, y un 43% a pH 9 respecto al 12% que mantenía la enzima libre. Estos valores indican un aumento en la estabilidad de la enzima a pHs ácidos y básicos, lo que hace de esta se convierta en Resultados y Discusión 159 un biocatalizador más versátil ya que puede abarcar un abanico más amplio de condiciones. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 A ct iv id ad (% ) pH Inmovilizada Libre Figura 55. Efecto del pH en la actividad de la enzima β-Gal-3 libre e inmovilizada sobre glioxil agrosa sobre el sustrato pNF-β-Gal e 5 mM a 37 ºC. El pH se ajustó con tampones citrato/fosfato de sodio y fosfato de sodio 50 mM. Las actividades están referidas en términos relativos al valor máximo determinado III.2.6.3. Síntesis de disacáridos catalizada por la enzima β-Gal-3 inmovilizada en soportes de glioxil agarosa Se estudió la capacidad de la enzima β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382 inmovilizada en glioxil agarosa para llevar a cabo la reacción de transglicosidación, siguiendo el protocolo del apartado V.2.6.2.5. Se realizaron las reacciones utilizando como aceptores GlcNAc y GlcNac en presencia de solo tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6 y con disolventes sostenibles como co-solventes, concretamente del derivado de biomasa S13 y del líquido iónico [Bmim][PF6], ya que con estos se habían obtenido los que mejores resultados en las reacciones con la enzima libre (apartados III.2.3.1 y III.2.3.2). Los resultados se muestran en la Figura 56. Como se puede observar, en la reacción control, con solo tampón, se obtuvo un resultado del 34% de Gal-β(1-3)-GlcNAc, frente al 51% de la enzima libre. En la síntesis de Gal- β(1-3)-GalNAc se obtuvo un 30% con la enzima inmovilizada, frente al 49% de la Resultados y Discusión 160 enzima libre. La disminución de rendimiento es mayor en el caso de las reacciones con S13, puesto que se pasó de un rendimiento del 99% con la enzima libre a un 55% con la enzima inmovilizada en la síntesis de Gal-β(1-3)-GlcNAc, y de un 95% en la síntesis de Gal-β(1-3)-GalNAc con la enzima libre a un 29% con la enzima inmovilizada. Los mejores resultados se produjeron con el LI [Bmim][PF6], con el que la síntesis de Gal-β(1-3)-GlcNAc con la enzima libre y con la enzima inmovilizada pasó de un 97 a un 74% respectivamente, y la síntesis de Gal-β(1-3)- GalNAc disminuyó solo de un 97 a un 91%. 0 100 51 99 97 34 55 74 R en di m ie nt o( % ) Libre Inmovilizada A) 0 100 49 95 97 30 29 91 R en di m ie nt o (% ) Libre Inmovilizada B) Gal-β(1-3)-GlcNAc Gal-β(1-3)-GalNAc Figura 56. Rendimientos de la reacción de transgicosidación con la enzima β-Gal-3 libre e inmovilizada utilizando pNF-gal como donadador y como aceptor, en A) GlcNAc y en B) GalNAc. La bibliografía muestra que la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 había sido inmovilizada en CNBr-sefarosa y ensayada su actividad de transgliosidación utilizando pNF-gal como donador y benzil-α-D-GalNAc como donador en presencia de DMF con un rendimiento del 62%, y un 53% utilizando como donador metil-α-D- GalNAc, aunque no midieron la capacidad de reutilización de la enzima (Naundorf y col. 1998). Este rendimiento es mayor que el que se obtuvo en nuestros estudios en la reacción con solo tampón o con S13 como co-solvente, pero inferior al que se obtuvo utilizando como co-solvente [Bmim][PF6] que llega al 91% en caso del GalNAc. Guisan y col. compararon la inmovilización de la β-galactosidasa de Kluyveromyces Resultados y Discusión 161 lactis en CNBr-sefarosa y en glioxil agarosa (Bernal y col. 2013). Estos autores obtienen menor actividad con el soporte de glioxil agarosa pero mejor estabilización de la enzima. Atribuyen estos resultados a que la glioxil agarosa es un sistema de inmovilización covalente multipuntual, frente al soporte CNBr-sefarosa, que inmoviliza a la enzima por un solo punto de unión, lo que permite que la enzima se comporte de una manera similar a la enzima libre. Por otro lado, la inmovilización multipuntual aumenta la rigidez de la enzima, y por lo tanto, la estabilidad, pero esto a su vez suele implicar un descenso de actividad (Pedroche y col. 2007). Esto se corresponde con los resultados obtenidos, ya que al inmovilizar la β-gal-3 se perdió parte de la actividad comparada con la enzima libre, pero se aumentó la estabilidad frente al pH (Figura 55 y Figura 56). A pesar de que el rendimiento obtenido en la reacción de transglicosidación utilizando GalNAc como aceptor, con la enzima inmovilizada en glioxil agarosa en tampón (30%, Figura 56), fue menor que el obtenido en la bibiografía inmovilizando en CNBr-sefarosa (62% y 53%) (Naundorf y col. 1998), esta menor actividad obtenida, debido a la mayor rigidez que adquiere la enzima en la inmovilización con glioxil agarosa, quedó compensada con la adición de [Bmim][PF6] como co-solvente, con el que se alcanzó un rendimiento del 91% (Figura 56). Los rendimientos son menores con la enzima inmovilizada en glioxil agarosa que con la enzima libre (Figura 56), pero se debe tener en cuenta que la principal ventaja de la inmovilización es la posibilidad de reutilizar el biocatalizador. Si puede ser reutilizado, esto podría compensar con creces la pérdida de rendimiento. III.2.6.4. Reutilización de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 inmovilizada en glioxil agarosa Se estudió la posibilidad de reutilizar la enzima inmovilizada en glioxil agarosa. Para ello, primero se comprobó su capacidad de reutilización en la reacción de hidrólisis de pNF-β-Gal, según las condiciones del apartado V.2.6.2.6.1. Como se puede ver en la Figura 57, después de 25 reúsos la enzima todavía conserva el 53% de la actividad Resultados y Discusión 162 inicial, lo que indica un gran potencial para ser reutilizada en reacciones de transglicosidación. 0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 25 A ct iv id ad (% ) Reúsos Figura 57. Reutilización de la enzima β-Gal-3 de B. Circulans ATCC 31382 en la hidrólisis de pNF-gal. A continuación se llevaron a cabo las reacciones de transglicosidación para medir la evolución de la actividad de la enzima al ser reutilizada (apartado V.2.6.2.6.2). Para ello se utilizó como aceptor GlcNAc tal como describe el protocolo del apartado V.2.6.2.6, en tres medios de reacciacción: en solo tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6, usando como co-solvente el derivado de biomasa S13 y usando como co- solvente el el LI [Bmim][PF6]. Como se puede ver en los resultados (mostrados en la Figura 58), las enzimas fueron sufriendo una desactivación gradual que fue más pronunciada en las reacciones con solo tampón y S13. En el reúso número 10, la enzima inmovilizada que había reaccionado en el medio con solo tampón, conservaba el 55% de actividad de transglicosidación, con S13 conservaba el 67%, y con [Bmim][PF6] el 76%. En el reúso número 20 las enzimas inmovilizadas que habían reaccionado en el medio con solo tampón y con S13 ya habían perdido completamente la actividad, pero la enzima con [Bmim][PF6] conservaba el 62% de esta. En el reúso número 30, la enzima de la reacción con [Bmim][PF6] conservaba el 47%, y en el reúso número 40 conservaba el 30% de actividad. Resultados y Discusión 163 0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 A ct iv id ad d e tr an sg lic os id ac ió n (% ) Reúsos [Bmim][PF6] S13 BufferControl Figura 58. Reutilización de la enzima β-Gal-3 de B. Circulans ATCC 31382 en reacciones de transglicosidación utilizando como aceptor GlcNAc en solo tampón o en presencia de S13 o [Bmim][PF6] como co-solventes. Cabe destacar, como se expuso en el apartado III.2.3.3, que el [Bmim][PF6] no es soluble en agua y los azúcares no quedan disueltos en él, así que se puede separar del medio de reacción por centrifugación. Al someter a centrifugación la mezcla de reacción, se obtienen tres fases: una superior, compuesta por el tampón y los azúcares; una intermedia, compuesta por el soporte con la enzima inmovilizada; y una inferior, compuesta por el [Bmim][PF6] (Figura 59). Esta separación permite retirar la fase acuosa con los productos de reacción, lavar el soporte con tampón y volver a añadir nueva mezcla de reacción, reutilizando tanto la enzima como el líquido iónico. Esta reutilización del co-solvente no es posible en las reacciones con el derivada de biomasa S13, ya que es soluble Resultados y Discusión 164 1 2 3 Figura 59. Separación de fases por centrificación de reacción de transglicosidación utilizando β-Gal-3 inmovilizada en glioxil agarosa, pNF-gal como donador y GlcNAc como aceptor. 1) Fase acuosa. 2) Glioxil agarosa con enzima inmovilizada. 3) [Bmim][PF6] A la vista de los resultados obtenidos, el [Bmim][PF6] se convierte en el candidato idóneo para ser utilizado como co-solvente en las reacciones de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 inmovilizada. Por un lado, con él se obtienen resultados de rendimiento muy elevados, 74% en la síntesis de Gal-β(1-3)-GlcNAc y 91% en la síntesis de Gal-β(1-3)-GalNAc. Estos resultados de rendimiento son mayores al 60% en la síntesis de Gal-β(1-3)-GalNAc-α-OBn o al 53% en la síntesis de Gal-β(1-3)- GalNAc-α-OMe encontrados en la bibliografía en la que utilizaban la misma enzima (Naundorf y col. 1998), Además, alarga el número de reúsos en los que el biocatalizador puede llevar a cabo la reacción, conservando ésta más de un 75 % de actividad después de reaccionar 10 veces; manteniendo más de un 65% de actividad después de 20 reúsos, número en el que pierden completamente su actividad la enzima inmovilizada en medio con solo tampón o con S13; conserva alrededor del 50% de actividad después de 30 reúsos y todavía mantiene el 30% después de 40. Por último, debido a que el co-solvente se puede separar de la mezcla de reacción, así como del soporte, el [Bmim][PF6] puede ser reutilizado en todas las reacciones que se lleven a cabo con la enzima inmovilizada. Resultados y Discusión 165 III.3. Capítulo 3: Síntesis de glicoconjugados mediante glicosintasas Como se expuso en el apartado I.2.2 de la Introducción, la principal ventaja de las glicosintasas frente a las glicosidasas, a la hora de sintetizar disacáridos, radica en que su centro activo ha sido modificado de forma que no pueden realizar reacciones de hidrólisis. Por lo tanto, los productos de la reacción de síntesis no pueden ser hidrolizados por la enzima, como ocurre con las glicosidasas. Debido al potencial de estas enzimas, se decidió preparar diferentes glicosintasas para aplicarlas a la síntesis de glicoconjugados, y posteriormente, evaluar el efecto que los disolventes sostenibles ejercían sobre su actividad, estudio del que no hay descrito ningún trabajo hasta la fecha. III.3.1. Mutagénesis dirigida de la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 para la obtención de glicosintasas Debido a los buenos resultados obtenidos con la enzima β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 en el Capìtulo 2 de esta Tesis Doctoral, se decidió someterla a un proceso de mutagénesis dirigida, para así obtener su derivado glicosintasa y aprovechar las ventajas de este tipo de enzimas. En el apartado III.2.4 del capítulo anterior se mostró el modelado molecular por homología de la enzima β-Gal-3 (Figura 47). La superposición del modelo de β-Gal- 3 con la enzima LacZ de E. coli identificó en su centro activo, dos residuos de ácido glutámico encargados de la actividad catalítica de la enzima, el Glu-157 y el Glu-233 (Figura 48). A pesar de que la metodología para la transformación de glicosidasas en glicosintasas se basa en la mutagénesis del residuo nucleófilo (Glu-233 en β-Gal-3), se decidió mutar los dos glutámicos del centro activo (Glu-157 y Glu-233). De esta forma, además de la obtención de la glicosintasa de β-Gal-3, se podía confirmar la Resultados y Discusión 166 predicción bioinformática y evaluar el efecto que tenía la modificación del centro activo sobre la actividad hidrolítica de la enzima nativa. Cuando se publicó la mutagenesis de la β-glucosidasa de Agrobacterium sp., el aminoácido por el que se había mutado el residuo nucleófilo de su centro activo (Glu-358), fue la alanina, creándose el mutante E358A (Mackenzie y col. 1998). Posteriormente, los mismos autores probaron distintos aminoácidos en esa posición, observando también actividad glicosintasa cuando el glutámico era sustituido por serina (E358S) (Mayer y col. 2000), glicina (E358G) y cisteína (E358C) (Mayer y col. 2001). Los mejores resultados en cuanto a actividad sintética con estos mutantes fueron obtenidos con el E358G, siendo éste 102 veces más activo que el que mostraba actividad más baja, el E358C. A su vez, presentaba 51 veces más actividad que el mutante original E358A, y más del doble que E358S (Mayer y col. 2001). Estudiando la estructura tridimensional del mutante de la β-manosidasa de Cellvibrio japonicus, en el que se había sustituido el residuo nucleófilo por glicina, Jahn y col. concluyeron que la causa de que los resultados con este aminoácido fueran mejores que con serina, alanina o cisteína, se debía a que la glicina, al tener la cadena lateral más pequeña, dejaba unespacio libre mayor en el centro activo. Este espacio adicional era ocupado por moléculas de agua, que podían interaccionar con el carbono anomérico del donador, facilitando que se liberara el buen grupo saliente del carbono anomérido del donador (generalmente fluor) y favoreciendo la reacción de transglicosidación (Jahn y col. 2003). Debido a los buenos resultados previos utilizando glicina como sustituto del glutámico en el residuo nucleófilo, se eligió este aminoácido para crear los mutantes de la β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 en sus posiciones Glu-157 y Glu-233, el β-Gal-3 E157G y el β-Gal-3 E233G (Figura 60). Resultados y Discusión 167 Figura 60. Modelado del centro activo de las enzimas mutantes β-Gal-3 E157 y G β-Gal-3 E233G. Para la mutagénesis de los aminoácidos del centro activo se aplicó el protocolo Quick-Change (Stratagene). Este método se basa en la amplificación por PCR del plásmido que contiene el gen a mutar, utilizando para ello oligonucleótidos que incluyan en su secuencia la mutación deseada (apartado V.2.2.5). Se diseñaron dos parejas de oligonucleótidos, una para producir la proteína β-Gal-3 E157G (llamados B-gal-3-E157G-FW y B-gal-3-E157G-RV) y otra para la β-Gal-3 E233G (llamados B-gal-3-E233G-FW y B-gal-3-E233G-RV) (Tabla 30 del apartado V.1.3). Se llevaron a cabo las PCRs del protocolo Quick-Change (apartado V.2.2.5) y los plásmidos obtenidos se utilizaron para transformar E. coli DH5α, bacteria cuy función es seleccionar y copiar los plásmidos recombinantes (apartado V.2.1.4.1). De las colonias crecidas se tomaron tres de cada una (E157G y E233G), de las que se extrajeron sus plásmidos y se secuenciaron (apartado V.2.2.6) para confirmar que la mutación se había introducido adecuadamente en el lugar deseado. En la Figura 61 se puede observar el resultado de la secuenciación de los plásmidos mutados, en los cuales, para cambiar el glutámico (tripletes GAG y GAA respectivamente) por glicina solo fue necesaria la sustitución de la adenina central por guanina en ambos casos, obteniéndose los tripletes GGG y GGA respectivamente (correspondientes a glicina). Posteriormente con ellos se transformaron células de E. coli BL21, cepa apropiada para la expresión de proteínas (apartado V.2.1.4.1). Glu-233 Gly-157 β-Gal-3 E157G Gly-233 Glu-157 β-Gal-3 E233G Resultados y Discusión 168 Glutámico Glicina Glutámico Glicina A) B) Figura 61. Alineamiento de las secuencias genéticas de la enzima β-Gal-3 nativa, la enzima β-Gal-3 mutante secuenciada y el oligonucleótido Fw utilizado para la PCR del protocolo Quick-Change. A) mutante E157G y B) mutante E233G III.3.1.1. Síntesis de disacáridos utilizando las glicosintasas β-Gal-3 E157G y β-Gal-3 E233G Para comprobar si las enzimas mutantes β-Gal-3 E157G y β-Gal-3 E233G mantenían su actividad nativa, se llevaron a cabo reacciones de hidrólisis siguiendo el protocolo descrito en el apartado V.2.4.1.2, utilizando como sustrato pNF-β-Gal. No se obtuvo actividad con ninguna de las dos enzimas, esto permitió confirmar empíricamente la predicción bioinformática del centro activo que se llevó a cabo el capítulo anterior (apartado III.2.4.2). Como se explico en el apartado I.2.1de la Introducción, en el centro activo de las glicosidasas, ambos glutámicos participan en la formación del intermedio de reacción (Esquema 17A). La sustitución de alguno de estos residuos provoca la inactivación de la enzima (Esquema 17B). Resultados y Discusión 169 O O OH HO OH OH NO2pNF-ββββ-Gal O O H -O O O HO OH HO OH OH NO2 -O O O O Glu-233 Glu-157 Glu-157 Glu-233 O O OH HO OH OH NO2pNF-ββββ-Gal O O H -O O Glu-233 Glu-157 O O OH HO OH OH NO2pNF-ββββ-Gal O O H -O O Glu-233 Glu-157Gly-157 Gly-233 H H A) B) pNF Esquema 17. A) Formación del intermedio de reacción en el centro activo de la enzima β- Gal-3 de B. Circulans ATCC 31382 entre pNF-β-gal y el residuo nucleófilo (Glu-233). B) La sustitución de alguno de los residuos catalíticos del centro activo (Glu-157 o Glu-233) inactiva la enzima. Una vez confirmada la pérdida de actividad hidrolítica de las enzimas mutantes β- Gal-3 E157G y β-Gal-3 E233G al sustituir los residuos catalíticos del centro activo, se procedió a caracterizar su actividad glicosintasa. Para ello se realizaron las reacciones de transglicosidación para la síntesis de disacáridos como se expone en el apartado V.2.4.2.4, utilizando como donador 1-desoxi-1-fluoro-α-D- galactopiranósido (Gal-β-F), ya que la presencia de un buen grupo saliente en el carbono anomérico del donador permite que se produzca la reacción de transglicosidación en glicosintasas, siendo ésta catalizada únicamente por el residuo ácido del centro activo, tal y como se explicó en el apartado I.2.2 de la Introducción. Como aceptores se utilizó una batería de azúcares compuesta por GlcNAc, GalNAc y pNF-GlcNAc. Las glicosintasas no suelen mantener las mismas condiciones óptimas de reacción que sus versiones nativas. Por un lado, se ha observado que un exceso de aceptor puede competir con el donador fluorado por la entrada al centro activo Resultados y Discusión 170 (Cobucci-Ponzano, Strazzulli, y col. 2011), por otro, la sustitución del residuo nucleófilo puede causar la disminución del pKa del residuo ácido, que debe permanecer protonado para que se produzca la reacción (McIntosh y col. 1996). Por estos motivos, se utilizaron diferentes condiciones de reacción: tampón citrato/fosfato de sodio 50 mM pH 4 y tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6, y con ambos tampones se utilizaron distintas relaciones de donador:aceptor, 1:1, 1:3 y 1:5. Se tomaron alícuotas de las reacciones a distintos tiempos (1, 8 y 24 h). En ninguna de las 18 reacciones con β-Gal-3 E157G ni en las 18 de β-Gal-3 E233G se obtuvo actividad. Hidaka y col. postularon que para que se pudiera conseguir transformar una enzima glicosidasa en una glicosintasa activa, se debía cumplir el requisito fundamental de que en el espacio que quedaba al quitar el residuo nucleófilo en el centro activo, se debía situar una molécula de agua orientada de tal forma que interaccionara con el carbono anomérico del donador (Hidaka y col. 2010). Estos autores llegaron a la conclusión de que si la sustitución del residuo nucleófilo no permitía la entrada y orientación adecuada del agua en el centro activo, se deberían modificar otros aminoácidos cercanos al residuo nucleófilo para posibilitar que esto ocurriera. Esto es una posible explicación de la dificultad que supone crear glicosintasas activas, y es que de las 112 familias existentes de glicosidasas (Cantarel y col. 2009), los intentos para obtener sus respectivas mutantes glicosintasas hasta la fecha, solo han sido fructíferos para 17 de ellas (Cobucci-Ponzano y col. 2012). No se ha conseguido obtener ninguna glicosintasa de la familia GH35, a la que pertenece la β-Gal-3 de B.circulans ATCC 31382. La única enzima de la familia GH35 de la que se ha podido obtener un mutante activo ha sido la β-Galactosidasa de Xanthomonas manihotis, en la que se ha mutado su residuo ácido para la obtención de una tioglicoligasa, enzima que sintetiza análogos de disacáridos unidos por un átomo de azufre (Kim, Chen, y col. 2007). Resultados y Discusión 171 III.3.2. Síntesis de disacáridos utilizando la enzima mutante TmGalA D327G-HisTag de Thermotoga maritima en presencia de disolventes sostenibles El grupo del Dr. Marco Moracci ha desarrollado recientemente una glicosintasa activa derivada de la α-galactosidasa TmGalA de Thermotoga maritima, la TmGalA D327G , que es capaz de sintetizar glicoconjugados utilizando como donador una molécula de galactosa activada con un grupo azida en posición β (Gal-β-N3) (Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011) Gracias a una colaboración con este grupo, se decidió estudiar el efecto de los disolventes sostenibles sobre esta nueva enzima. III.3.2.1. Mutagénesis de las enzimas TmGalA y TmGalA D327G de T. maritima para la adición de colas de histidinas La metodología utilizada hasta la fecha para la purificación de las enzimas de T. maritima, tanto la glicosidasa TmGalA como la glicosintasa TmGalA D327G, se basaba en columnas de intercambio iónico y de hidrofobicidad (Miller y col. 2001). El plásmido en el que se clonaron las enzimas, el pET24d(+) (Novagen), incluye la secuencia para añadir una cola de histidinas en la región C-terminal de la proteína. Esta cola no se aprovecha debido al codón Stop de la propia proteína, que termina el proceso de traducción justo al final del gen (Figura 62). Para añadir la secuencia de la cola de histidinas al final del gen no bastaría con retirar el triplete del codón Stop, puesto que, como se puede observar en la secuencia 1 de la Figura 62, la continuación de la traducción generaría una cola de treoninas (Thr) y no de histidinas (His). Por lo tanto, además de retirar el codón Stop de la secuencia, es necesario desplazar el marco de lectura para que se produzca la adecuada traducción de la cola de histidinas. Para conseguir estos dos objetivos en un solo paso, se llevó a cabo el protocolo Quick-Change de mutagénesis dirigida (apartado V.2.2.5 de Materiales y Métodos). Para esto se diseñaron los oligos para PCR TmGalA-HisTag (Tabla 30 del apartado V.1.3 de Materiales y Métodos) que funcionaban de modo que al amplificar delecionaran las bases T y G del codón Stop, marcadas en amarillo en la Resultados y Discusión 172 Figura 62. Esta deleción eliminaría el codón Stop y desplazaría el marco de lectura de la secuencia posterior, de modo que la cola de histidinas entrara en fase (secuencia 2 de la Figura 62). Figura 62. Parte final de la secuencia de los genes de las enzimas α-galactosidasa TmGalA y la α-glicosintasa TmGalA D327G de T. Maritima y zona de inserción en el plásmido pET24d(+). En rojo aparece el codón Stop del gen y en amarillo las bases delecionadas. 1) Es la secuecia de aminoácidos original. 2) Es la secuencia de aminoácidos después de la deleción de las dos bases marcadas en amarillo. Se llevaron a cabo las PCRs del protocolo Quick-Change (apartado V.2.2.5) y los plásmidos obtenidos se utilizaron para transformar E. coli DH5α para seleccionar y aumentar el número de plásmidos (apartado V.2.1.4.1). De las colonias crecidas se tomaron tres de cada una (TmGalA-HisTag y TmGalA D327G-HisTag), de las que se extrajeron sus plásmidos y se secuenciaron (apartados V.2.2.2 y V.2.2.6), para confirmar que la mutación se había introducido adecuadamente en el lugar deseado. En la Figura 63 se muestra el alineamiento de las secuencias originales frente a la secuenciación de las mutadas para añadir la cola de histidina, y el oligonucleótido Fw que se utilizó en la PCR. En este alineamiento se puede observar que en ambas secuencias se han delecionado correctamente las dos bases necesarias. Con los plásmidos mutantes se transformaron células de E. coli BL21, cepa apropiada para la expresión de proteínas (apartado V.2.1.4.1). Posteriormente, se produjo la enzima y se purificó según los protocolos descritos en los apartados V.2.1.5 y V.2.3.4. Resultados y Discusión 173 Figura 63. Alineamiento de las secencias originales de las enzimas α-galactosidasa TmGalA y la α-galactosintasa TmGalA D327G de T. Maritima frente a las secuencias mutadas para añadir la cola de histidinas y el oligonucleótido Fw utilizado para la PCR. III.3.2.2. Reacciones con la enzima TmGalA nativa de T. maritima Para poder continuar con la caracterización de las enzimas, era importante confirmar, que la adición de la cola de histidinas en el extremo C-terminal no afectaba a la actividad. Para ello se llevó a cabo una producción de las enzimas TmGalA y TmGalA-HisTag, tal y como se describe en el apartado V.2.1.5. Finalizada la producción, se rompieron las células y se realizaron reacciones de hidrólisis con el extracto celular, tal y como se describe en los apartados V.2.1.6 y V.2.4.1.2. Las reacciones se llevaron a cabo a 65 ºC, en tampón acetato de sodio 50 mM pH 5,5, utilizando pNF-α-gal 5 mM como sustrato. Los resultados mostraron que el extracto de la enzima TmGalA nativa presentaba una actividad de 45,4 UI/mg de proteína y la TmGalA-HisTag de 44,6 UI/mg de proteína, una diferencia inferior a una unidad que indica que la cola de histidina no afecta a la actividad. Los autores que clonaron por primera vez esta enzima obtuvieron una actividad de 48,2 UI/mg de proteína (Miller y col. 2001), resultado muy similar al obtenido en nuestro laboratorio. Se midió la actividad glicosidasa de la enzima TmGalA-HisTag de T. maritima por el método continuo según el protocolo descrito en el apartado V.2.4.1.2, frente a una batería de sustratos hidrolizables, compuesta pNF-α-Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF-β-Glu, pNF-α-Man, pNF-β-D-Man, pNF-α-GlcNAc y pNF-β-GlcNAc, en tampón acetato de sodio 50 mM pH5,5, a 65 ºC durante 10 min. Los resultados se muestran en la Tabla 24. Como se puede ver, solo se ha obtenido actividad hidrolítica cuando se usa como sustrato el pNF-α-Gal (216,3 UI/mg), lo Resultados y Discusión 174 que se corresponde con lo expuesto en la bibliografía, realizando las reacciones en las mismas condiciones (Miller y col. 2001). Tabla 24. Resultados del screening de actividades glicosidasa con la enzima TmGalA- HisTag de T. maritima. Resultados mostrados en UI/mg. pNF- β-Fuc α-Fuc β-Glu α-Glu β-Gal α-Gal β-Man α-Man β-GlcNAc α-GlcNAc TmGalA- HisTag - - - - - 216,3 - - - - Una vez confirmado que la enzima solo es activa frente pNF-α-Gal, se procedió a usar este compuesto como donador para realizar un cribado para detectar su posible actividad de transglicosidación frente a una batería de aceptores compuesta por Glu, Man, Gal, Fuc, Fru, GalNAc, GlucNAc, pNF-α-fuc, pNF-β-fuc, pNF-α-gal, pNF-β- gal, pNF-β-glu, pNF-α-man, pNF- β -D-man, pNF-β-GalNAc y pNF-β-GlcNAc, tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.2, en tampón acetato de sodio 50 mM pH 5,5, a 65 ºC y tomando alícuotas a 1, 5 y 18h. La enzima TmGalA no es capaz de llevar a cabo reacciones de transglicosidación con ninguno de los sustratos utilizados. Esto era lo esperado según lo consultado en la bibliografía, y de ahí la importancia de la capacidad sintética de su versión mutante glicosintasa, la TmGalA D327G (Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011). III.3.2.3. Reacciones de transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G-HisTag de T. maritima La enzima glicosintasa TmGalA D327G-HisTag obtenida de la mutagénesis de TmGalA de T. maritima sintetiza disacáridos utilizando como donador Gal-β-N3 (Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011). Se utilizó este compuesto como donador (14 mM) frente a una batería de aceptores (14 mM) para la reacción de transglicosidación con la enzima TmGalA D327G-HisTag, según el protocolo del apartado V.2.4.2.4, en tampón acetato de sodio 50 mM pH 5,5, a 65 ºC durante 18 h. Las reacciones fueron seguidas por HPLC (apartado V.2.7.1). Los resultados se Resultados y Discusión 175 muestran en la Tabla 25, en la que se puede observar que los sustratos reconocidos como aceptores son el pNF-α-Glu y el pNF-α-Man para la síntesis de Gal-α(1-6)- Glu-α-pNF y Gal-α(1-6)-Man-α-pNF respectivamente ( Esquema 18), resultados que se corresponden con los obtenidos por el grupo del Dr. Moracci (Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011). Tabla 25. Reacciones de transglicosidación con la enzima TmGalA D327G-HisTag de T. Maritima utilizando Gal-β-N3 14mM como donador y una batería de mososacáridos como aceptores en concentración 14mM relación en tampón acetato de sodio 50 mM pH 5,5, a 65 ºC durante 18h. Donador: Gal-β-N3 Aceptores Glucosa - pNF-β-fuc - Manosa - pNF-α-gal - Galactosa - pNF-β-gal - Fucosa - pNF-α-glu + Fructosa - pNF-β-glu - Galactosamina - pNF-α-man + GalNAc - pNF- β -man - GlcNAc - pNF-β-GalNAc - pNF-α-fuc - pNF-β-GlcNAc - Resultados y Discusión 176 + O N3 OH HO OH OH pNF-αααα-Man pNF-αααα-Glu Gal-ββββ-N3 TmGalA E327G-HisTag Gal-αααα((((1111−−−−6666))))-Man-αααα-pNF Gal-αααα((((1111−−−−6666))))-Glu-αααα-pNF O O OH HO HO OH NO2 O O OH HO HO OH NO2 O O OH HO HO O NO2 O OH HO OH OH O OH HO OH OH O O OH HO HO O NO2 TmGalA E327G-HisTag Esquema 18. Reacción de trasglicosidación catalizada por la enzima TmGalA D327G- HisTag de T. Maritima utilizando como donador Gal-β-N3 y como aceptores pNF-α-Glu y el pNF-α-Man, para la síntesis de Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF y Gal-α(1-6)-Man-α-pNF. Para confirmar sintetiza los disacáridos α(1-6) que describe la bibliografía (Cobucci- Ponzano, Zorzetti, y col. 2011), los productos puros deben ser caracterizados por RMN (apartado V.2.7.2). Además, para poder cuantificar los rendimientos de reacción es necesario preparar rectas de calibrado que relacionen el área detectada en el HPLC con la concentración de muestra (apartado V.2.7.1). Por todo esto, el primer paso fue obtener los productos purificados. Se llevaron a cabo dos reacciones en un volumen de 35 ml según las condiciones descritas en el apartado V.2.4.2.4. Se utilizaron como donador Gal-β-N3 (14 mM), y como aceptor en un caso pNF-α-Glu y en otro pNF-α-Man 14 mM (relación donador:aceptor 1:1). Las reacciones se siguieron por HPLC (apartado V.2.7.1. Figura 64). Para calcular rendimientos de reacción, el porcentaje de hidrólisis del sustrato (galactosa producida) se obtendrá de la diferencia entre sustrato limitante sin consumir (Gal-β-N3) y disacárido producido. Resultados y Discusión 177 A) B) G al -β -N 3 G al -α (1 -6 )- M an -α -p N F G al pN F- α -m an pN F- α -m an G al -β -N 3 Figura 64. Cromatogramas de HPLC-ELSD de la reacción de transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G-HisTag en tampón acetato de sodio 50 mM pH 5,5 utilizando Gal-β-N3 como donador y pNF-α-man como aceptor en relación 1:1. A) Tiempo 0h y B) Tiempo 18h. Finalizada la reacción, transcurridas 18 h, esta fue detenida añadiendo 9 volúmenes de metanol, ya que al tratarse de una enzima termófila, la reacción no puede ser detenida por choque térmico. La mezcla de reacción fue filtrada, el metanol recuperado en rotavapor y la mezcla liofilizada (apartado V.2.5.7). La purificación se llevó a cabo en una columna de sílica gel. La fase móvil empleada en esta cromatografía estaba compuesta por acetato de etilo:metanol:agua en relación 70:20:10, tal y como se describe en el apartado. Los compuestos a separar presentes en el crudo de reacción eran: los monosacáridos (Gal-β-N3, Gal y pNF-α-Glu en un caso o pNF-α-Man en otro) y el disacárido producto, Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF o Gal- α(1-6)-Man-α-pNF. En la Figura 65 se muestra la separación de los crudos de reacción por TLC (apartado V.2.5.4, Figura 65A) y el seguimiento de la purificación (Figura 65B). Resultados y Discusión 178 Figura 65. TLC de la reacción de la transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G utilizando como donador Gal-β-N3 y como fase móvil acetato de etilo:metanol:agua en relación 70:20:10. A) Separación de los crudos de reacción donde „G“ se corresponde con la reacción con pNF-α-Glu como aceptor en la que 1 es pNF-α-Glu, 2 es Gal-β-N3, 3 es Gal- α(1-6)-Glu-α-pNF y 4 es Gal. „M“ se corresponde con la reacción con pNF-α-Man como aceptor en la que 5 es pNF-α-Man, 6 es Gal-β-N3, 7 es Gal-α(1-6)-Man-α-pNF y 8 es Gal. B) Diferentes tubos recolectados de la cromtografía en columna de sílica gel de la reacción con pNF-α-Glu como aceptor. La flecha roja marca el disacárido Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF. Las fracciones que contenían los disacáridos purificados se llevaron a sequedad en rotavapor y se analizaron por RMN (apartado V.2.7.2), lo que confirmó la identidad y pureza de los disacáridos sintetizados y permitió además preparar rectas de calibrado para medir su concentración por HPLC (apartado V.2.7.1). Gal-α(1-6)-Glu-α-pNP (Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011). 1H NMR (500 MHz, D2O): δ 5.87 (d, 1H, JH-1,H-2 = 3.6 Hz, H-1A), 4.88 (d, 1H, JH-1,H-2 = 3.7 Hz, H- 1B), 3.95 (t, 1H, H-3A), 3.93 (d, 1H, H-4B), 3.90 (t, 1H, H-5A), 3.87 (d,1H, H-6aA), 3.87 (d, 1H, H-5B), 3.82 (dd, 1H, H-2A), 3.75 (d, 1H, H-6aB), 3.74 (d, 1H, H-2B), 3.72 (d, 1H, H-6bB), 3.71 (d, 1H, H-6bA), 3.58 (dd, 1H, H-3B), 3.56 (t, 1H, H-4A); 13C NMR (125 MHz, D2O): δ 99.2 (C-1B), 97.7 (C-1A), 74.5 (C-3A), 73.2 (C-5B), 72.2 (C-2A), 72.2 (C-5A), 70.8 (C-4A), 70.8 (C-3B), 70.5 (C-4B), 69.6 (C-2B), 66.9 (C-6A), 62.4 (C-6B). Resultados y Discusión 179 Gal-α(1-6)-Man-α-pNP(Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011). 1H NMR (500 MHz, D2O): δ 5.87 (bs, 1H, H-1A), 4.95 (d, 1H, JH-1,H-2 = 3.8 Hz, H-1B), 4.30 (dd, 1H, H-2A), 4.14 (dd, 1H, H-3A), 4.00 (d, 1H, H-4B), 3.98 (t, 1H, H-5A), 3.97 (dd,1H, H-6aA), 3.90 (t, 1H, H-5B), 3.89 (t, 1H, H-4A), 3.82 (dd, 1H, H-6aB), 3.81 (dd, 1H, H-2B), 3.78 (dd, 1H, H-6bB), 3.74 (dd, 1H, H-6bA), 3.66 (dd, 1H, H-3B); 13C NMR (125 MHz, D2O): δ 99.3 (C-1B), 99.2 (C-1A), 73.8 (C-5B), 72.3 (C-5A), 72.0 (C-3A), 71.1 (C-2A), 71.0 (C-3B), 70.6 (C-4B), 69.8 (C-2B), 68.0 (C-4A), 67.0 (C-6A), 62.4 (C-6B). III.3.2.3.1. Reacciones de transglicosidación en presencia de disolventes sostenibles derivados de biomasa Para medir su efecto sobre la actividad de la enzima glicosintasa TmGalA D327G- HisTag se utilizaron como co-solventes los derivados de biomasa descritos en el apartado III.2.3.1, cuyas estructuras aparecen en el Esquema 15 y sus características físico-químicas en la Tabla 20 de ese apartado. Las reacciones se llevaron a cabo según las condiciones descritas en el apartado V.2.4.2.4, en tampón acetato de sodio 50 mM, pH 5,5 y 2M de disolvente sostenible, a 65 ºC durante 18 h, con Gal-β-N3 como donador. Los resultados de las reacciones usando pNF-α-Glu como aceptor se muestran en la Figura 66 y los de las reacciones usando pNF-α-Man en la Figura 67. En la Figura 66 se pueden observar los resultados de la reacción de transglicosidación, cuando se utiliza pNF-α-Glu como aceptor para la síntesis de Gal- α(1-6)-Glu-α-pNFen presencia de disolventes sostenibles derivados de biomasa. En la reacción control, se produjo una conversión del 55% de Gal-β-N3, quedando un 45% de este sustrato sin reaccionar, obteniéndose un rendimiento del 35% de disacárido y un 20% de hidrólisis (Gal). Prácticamente todos los derivados de biomasa inhibieron la actividad enzimática, evitando que se produjera la reacción. Con S9, S11, S12 y S15 se produjo reacción, pero con rendimientos en la síntesis de disacárido inferiores a los obtenidos en la reacción solo con tampón (14, 4, 19, Y Resultados y Discusión 180 15% respectivamente). En la reacción con S8 se mejora la conversión, ya que permanece sin reaccionar el 27% de Gal-β-N3, comparado con el 45% de la reacción de la reación control en tampón. Este aumento de conversión se traduce en un aumento de la hidrólisis, ya que pasa del 20% de la reacción control al 36% obtenido en S8, permaneciendo el rendimiento de síntesis de disacárido prácticamente constante (pasando de un 35 a un 37%). 0 50 100 45 100 100 100 100 100 100 100 27 78 91 69 100 100 56 35 37 14 4 19 15 20 36 9 5 12 29 C on ve rs ió n (% ) Gal-β-N3 no reaccionado Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF Gal Figura 66. Reacciones de transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G- HisTag utilizando como donador Gal-β-N3, como aceptor pNF-α-Glu y como co-colventes una batería de disolventes sostenibles derivados de biomasa. En la Figura 67 se muestran los resultados obtenidos en la reacción de transglicosidación cuando se utiliza pNF-α-Man como aceptor, para la síntesis de Gal-α(1-6)-Man-α-pNF en presencia de disolventes sostenibles derivados de biomasa. En la reacción control, solo con tampón, se produjo una conversión de sustrato del 57%, quedando un 43% de Gal-β-N3 sin reaccionar. El rendimiento de disacárido fue del 25%, frente a un 32% de hidrólisis (Gal). En las reacciones con derivados de biomasa como co-solventes, se obtuvieron unos resultados muy similares a aquellos en los que se utilizó pNF-α-Glu como aceptor. Casi todos los derivados de biomasa inhiben la actividad enzimática. Con S9, S11, y S12 se produjo reacción, pero con rendimientos en la síntesis de disacárido inferiores a los obtenidos en la reacción solo con tampón (1, 2 y 12% respectivamente). S15 es el que mayor conversión de sustrato muestra (21% frente al 43% de la reacción control), pero el Resultados y Discusión 181 rendimiento de síntesis de disacárido es menor (15% frente a 25%), con un gran aumento en la hidrólisis (64% frente al 32% del control). S8 muestra unos resultados muy parecidos a los del control, con algo más de conversión de sustrato de partida (66% frente a 57%), pero con un aumento por igual de síntesis de disacárido y de hidrólisis (30 y 36% respectivamente frente a 25 y 32% del control). 0 50 100 43 100 100 100 100 100 100 100 34 98 95 71 100 100 2125 30 1 2 12 15 32 36 1 3 17 64 C on ve rs ió n (% ) Gal-β-N3 no reaccionado Gal-α(1-6)-Man-α-pNF Gal Figura 67. Reacciones de transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G- HisTag utilizando como donador Gal-β-N3, como aceptor pNF-α-Man y como co-colventes una batería de disolventes sostenibles derivados de biomasa. Los resultados de las reacciones con ambos aceptores demuestran que los disolventes sostenibles derivados de biomasa utilizados como co-solventes, no solo no mejoran la síntesis de disacáridos, sino que en la mayoría de los casos inhiben la actividad enzimática, reduciendo la conversión hasta el punto de hacer que la reacción no se produzca en absoluto. Como ya se ha explicado previamente en el capítulo III.2, los co-solventes modifican la estructura terciaria de las enzimas y modifican las características físico-químicas del medio de reacción. A la vista de los resultados obtenidos, los derivados de biomasa afectan a la estructura de la enzima de forma que se inhibe la reacción en la mayoría de los casos, por lo que no son buenos co- solventes para las reacciones con la enzima glicosintasa TmGalA D327G-Histag y por ello no se profundizó más en su estudio. Resultados y Discusión 182 III.3.2.3.2. Reacciones de transglicosidación en presencia de líquidos iónicos Al igual que en el punto anterior con los derivados de biomasa, se utilizaron LIs como co-solventes para medir su efecto sobre la actividad de la enzima glicosintasa TmGalA D327G-HisTag. Estos LIs fueron descritos en el apartado III.2.3.2, cuyas estructuras aparecen en el Esquema 16 y sus características físico-químicas en la Tabla 21 de dicho apartado. Las reacciones se llevaron a cabo según las condiciones descritas en el apartado V.2.4.2.4, en tampón acetato de sodio 50 mM, pH 5,5 y 30% de LI, a 65 ºC durante 18 h, con Gal-β-N3 como donador. Los resultados de las reacciones usando pNF-α-Glu como aceptor se muestran en la Figura 68 y los de las reacciones usando pNF-α-Man en la Figura 69. En la Figura 68 se pueden observar los resultados de la reacción de transglicosidación, cuando se utiliza pNF-α-Glu como aceptor para la síntesis de Gal- α(1-6)-Glu-α-pNF en presencia de LIs. En la reacción control se produjo una conversión del 55% de Gal-β-N3, quedando un 45% de este sustrato sin reaccionar y se obtuvo un rendimiento del 35% de disacárido y un 20% de hidrólisis (Gal). En ningún caso se ha producido la total inhibición de la actividad enzimática. En las reacciones con [Bmim][BF4], [Bmim][PF6], [Bmim][MeSO4], [Emim][BF4], [Hmim][Ntf 2] y [Omim][PF6] se obtuvo un rendimiento en la síntesis de disacárido inferior al obtenido en la reacción control sin IL 7, 15, 7, 16, 20 y 25% respectivamente). En los casos concretos de [Bmim] [PF6] y [Emim] [BF4] se observa que la conversión de sustrato de partida es mucho mayor que en el control (93 y 89% respectivamente frente al 55% de la reacción control), pero este aumento en la conversión solo favorece la hidrólisis, siendo la producción de Gal del 78 y 73% respectivamente. En el caso de [Bmim][Ntf2] y [Emim][MeSO4] se obtiene un resultado de rendimiento de disacárido casi idéntico al de la reacción control (34 y 37% repectivamente), llamando la atención en el segundo como la hidrólisis ha sido reducida al 7% frente al 20% del control. Con [Bmim][FAP] el rendimiento de producción de disacárido aumenta hasta el 43%, obteniéndose el mejor resultado con Resultados y Discusión 183 [Troma][Ntf2] en el que la conversión de sustrato es casi total y se obtiene un rendimiento de síntesis de Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF del 49%. 0 50 100 45 55 24 36 7 60 11 56 45 33 2 35 7 43 34 15 7 16 37 20 25 49 20 38 33 31 78 33 73 7 35 42 49 C on ve rs ió n (% ) Gal-β-N3 no reaccionado Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF Gal Figura 68. Reacciones de transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G- HisTag utilizando como donador Gal-β-N3, como aceptor pNF-α-Glu y como co-colventes una batería de líquidos iónicos. En la Figura 69 se muestran los resultados obtenidos en la reacción de transglicosidación, cuando se utiliza pNF-α-Man como aceptor para la síntesis de Gal-α(1-6)-Man-α-pNF en presencia de LIs. En la reacción control, solo con tampón, se produjo una conversión de sustrato del 57%, quedando un 43% de Gal-β-N3 sin reaccionar. El rendimiento de disacárido fue del 25%, frente a un 32% de hidrólisis (Gal). Los LIs [Bmim][BF4], [Bmim][MeSO4] y [Omim][PF6] inhiben parte de la actividad enzimática, puesto que permanece un 92%, un 66% y un 82% respectivamente de sustrato Gal-β-N3 sin reaccionar y apenas presentan síntesis de disacárido. [Bmim][FAP], [Bmim][Ntf2], [Bmim][PF6] y [Hmim][Ntf 2] muestran un rendimiento en la síntesis de disacárido muy parecido al encontrado en la reacción control (23, 28, 32 y 23% respectivamente) aunque con mayor tendencia hacia la hidrólisis. [Emim][BF4] cambia la regioselectividad de la enzima hacía la hidrólisis en detrimento de la transglicosidación, de la que se obtivo un 14%. Lo contrario ocurre con [Emim] [MeSO4], que aun mostrando una conversión de sustrato inicial similar a la del control, disminuye la tendencia hacia la hidrólisis, aumentando la síntesis de disacárido hasta el 45% (frente al 25% del control). El mejor resultadose Resultados y Discusión 184 obtuvo con el IL [Troma][Ntf2], que potencia la conversión del sustrato de partida hasta hacerlo casi desaparecer (3%) orientando la regioselectividad hacia la transglicosidación, obteniéndose con este IL un 80% de Gal-α(1-6)-Man-α-pNF. 0 50 100 43 92 24 17 8 66 31 39 46 82 3 25 3 23 28 32 6 14 45 23 1 80 32 5 52 55 60 28 55 16 32 17 17 C on ve rs ió n (% ) Gal-β-N3 no reaccionado Gal-α(1-6)-Man-α-pNF Gal Figura 69. Reacciones de transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G- HisTag utilizando como donador Gal-β-N3, como aceptor pNF-α-Man y como co-colventes una batería de líquidos iónicos El IL [Troma] [Ntf2] demostró ser el co-solvente más apropiado para usar en las reacciones de transglicosidación con la enzima glicosintasa TmGalA D327G, no solo porque potenciaba la conversión hasta la casi total desaparición del sustrato,sino porque aumentaba el rendimiento de producción de disacáridos respecto a la reacción solo con tampón, tanto en la reacción con pNF-α-Glu como aceptor, como en la reacción con pNF-α-Man, hasta el 49 y 80 % respectivamente. Por esto, se seleccionó este co-solvente para observar la evolución de la reacción a lo largo del tiempo, hasta las 36 h. Para ello se llevaron a cabo las reacciones tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.4, en tampón acetato de sodio 50 mM, pH 5,5 a 65 ºC. Se utilizó Gal-β-N3 como donador y pNF-α-Glu o pNF-α-Man como aceptores, para la síntesis de Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF y Gal-α(1-6)-Man-α-pNF. Se añadió un 30% de [Troma] [Ntf2] y se tomaron alícuotas a 18, 24 y 36 h, siguendo las reacciones por HPLC (apartado V.2.7.1). Los resultados se muestran en la Figura 70, en la que se puede observar que una vez finalizada la reacción a las 18h, la Resultados y Discusión 185 concentración de disacárido sintetizado permanece constante con el paso del tiempo, hasta las 36h. 0 50 100 0 18 36 C on ve rs ió n (% ) Tiempo (h) Gal-α(1-6)-Man-α-pNF Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF Figura 70. Evolución la concentración de disacáridos sintetizados por la enzima glicosintasa TmGalA D327G-HisTag una vez finalizada la reacción midiendo a las 18, 24 y 36 h. En morado aparece Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF y en verde Gal-α(1-6)-Man-α-pNF. La tecnología de glicosintasas puede conseguir que una enzima glicosidasa que no muestra actividad transglicosidasa sintetice disacáridos, como en el caso de la α- galactosidasa de TmGalA de T. maritima (Cobucci-Ponzano, Zorzetti, y col. 2011). Además, la incapacidad de las glicosintasas para hidrolizar el producto de la transglicosidación es una ventaja respecto a las glicosidasas, ya que se evita la pérdida de producto final una vez terminada la reacción, pero el inconveniente de muchas glicosintasas es su bajo rendimiento hacia la síntesis (Cobucci-Ponzano y col. 2012). Los estudios llevados a cabo en este capítulo concluyen que el uso de co- solventes apropiados puede aumentar la actividad enzimática y el rendimiento en síntesis de las enzimas glicosintasa, lo que unido a la ausencia de hidrólisis del producto puede aumentar el interés de estas enzimas aplicadas a bioprocesos, como por ejemplo el acoplamiento en tándem con otras enzimas (Oroz-Guinea y col.) o el escalado a nivel industrial. Resultados y Discusión 186 III.4. Capítulo 4. Funcionalización de glicodendrímeros mediante sialiltransfersas Las moléculas multivalentes, como los glicodendrímeros, pueden simular las interacciones de las estructuras biológicas (Krishnamurthy y col. 2006), lo que presenta una gran utilad para el estudio de procesos de interacciones biológicas (Boas y col. 2004) (apartado I.1.2 de la Introducción). Por otro lado, los ácidos siálicos, como en Neu5Ac y Neu5Gc, son el tipo de azucares que se localiza más frecuentemente en el extremo terminal de las cadenas glucídicas de los glicoconjugados de la superficie celular en sistemas eucariotas y procariotas, y por lo tanto, su participación en procesos de reconocimiento e interacción es vital (Schauer 1982; Chen y col. 2010) (apartado I.1.1 de la Introducción). Gracias a una colaboración con el Dr. Woody Fessner, se utilizaron dos tipos de enzimas sialiltransferasa, la α-2,6-sialiltransferasa (α2,6SiaT) de Photobacterium leiognathi (Yamamoto y col. 2007) y la α-2,3-sialiltransferasa (α2,3SiaT) de Photobacterium phosphoreum (Tsukamoto y col. 2007), desarrolladas en su laboratorio, para unir los derivados de ácido síalico Neu5Ac y Neu5Gc a la galactosa terminal de glicodendrímeros sintetizados por nuestro grupo de investigación (apartado V.2.4.3.2.4). El objetivo de esta funcionalización era el estudio de interacciónes carbohidrato-proteína, para poder evaluar la eficacia de la presentación multivalente de los distintos productos obtenidos. Se han utilizado dos tipos diferentes de glicodendrímeros con distinto grado de funcionalización: los G1, de carácter hidrófilo (Esquema 19) y los G2, de carácter más hidrofóbico y con grupos cromóforos ( Esquema 20). Resultados y Discusión 187 Esquema 19. Estructuras de los glicodendrímeros de tipo G1. Esquema 20. Estructuras de los glicodendrímeros de tipo G2. N N N O O O OH OH OH OH HO HO O HO N N N O O O HO HO HO OH OH OHO OH N N N O O O HO HO HO HO OH OH O HO NN N O O OHO HO HO OH OH OH O OH NN N O O OHO HO HO OH OH OH O OH N N N O O O OH OH OH HO HO HO O HO N N N O O O OH OH OH HO HO HO O HO G2.4 G2.3 G2.2 COOMe O N N N O O O HO HO HO OH OH OHO OH O N N N O O O HO HO HO OH OH OH O OH O O NN N O O O HO HO HO OH OH OH O OH O N N N O O O HO HO HO OH OAc OH O OH N N N O O O OH OH HO OH OH OH O OH G1.2 G1.3 G1.4 Resultados y Discusión 188 III.4.1. Síntesis de los sialoconjugados Neu5Ac-CMP y Neu5Gc-CMP Antes de la funcionalización de los glicodendímeros (Esquema 19 y Esquema 20), se procedió a la activación de los ácidos siálicos con citidin monofosfato (CMP), para que fueran sustratos reconocibles por las sialiltransferasas. Pero previamente, fue necesario sintetizar el siálico Neu5Gc, puesto que no era un sustrato comercial. III.4.1.1. Síntesis químio-enzimática de Neu5Gc El proceso de síntesis de Neu5Gc partió de la D-manosamina y pasó por dos etapas: la primera, de síntesis química, para la obtención de N-glicolil-D-Manosamina, y la segunda, de síntesis enzimática, para la final obtención del Neu5Gc. La metodología aplicada fue desarrollada en el laboratorio del Dr. Fessner (He y col. 2011). Para la síntesis química de N-glicolil-D-Manosamina, se llevó a cabo la reacción descrita en el apartado V.2.4.3.2.1.1, en la que se utilizaron hidrocloruro de D- manosamina y ácido glicólico como sustratos, en presencia de trietilamina y con 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) y N,N’-Diisopropil carbodiimida (DIC) como catalizadores, todo disuelto en N,N-dimetilformamida anhidra (DMF), en atmosfera inerte de argón, con agitación magnética y temperatura ambiente (Esquema 21) D-manosamina Ácido glicólico N-glicolil-D-manosamina Esquema 21. Síntesis química de N-glicolil-D-Manosamina a partir de D-manosamina. Resultados y Discusión 189 El seguimiento de la reacción se realizó mediante TLC (Figura 71), utilizando como fase móvil cloroformo:metanol en relación 2:1. Finalizada la reacción el crudo fue filtrado, concentrado en rotavapor y purificado en una columna de sílica gel (apartado V.2.5.5) con la misma fase móvil utilizada anteriormente en la TLC. Para retirar toda la trietilamina posible de la muestra purificada, se utilizó una columna de intercambio catiónico, como se describe en el apartado V.2.5.3. El compuesto fue caracterizado por RMN (apartado V.2.7.2). Se obtuvo un rendimiento en la reacción del 72%. Figura 71. TLC de la reacción de síntesis de N-glicolil-D-Manosamina utilizando como fase móvil cloroformo:metanol en relación 2:1. N-glicolil-D-Manosamina: (He y col. 2011) 1H NMR (500 MHz, D2O): δ= 5.10 (d, 1H, J=1.6 Hz, 1α-H), 5.02 (d 1H, J=1.7 Hz, 1β-H), 4.43 (dd, 1H, J=1.7, 4.4 Hz, 2β- H), 4.30 (dd 1H, J=1.6, 4.7 Hz, 2α-H), 4.13 (s, 2H, 8α-H), 4.09 (s, 2H, 8-β-H), 4.03 (dd, 1H, J=4.7. 9.9 Hz. 3α-H), 3.85 (dd, 1H, J=2.3, 12.2 Hz, 6β-Ha), 3.81-3.77 (m, 4H, 5α-H, 6α-H, 3β-H, 3.73 (dd, 1H, J=5.4, 12.5 Hz, 6β-Hb), 3.56 (t, 1H, J= 9.9 Hz, 4α-H), 3.46 (t, 1H, J= 9.8 Hz, 4β-H), 3.38 (ddd, 1H, J= 2.2, 5,2 9.9 Hz, 5β-H); 13C NMR (125 MHz): δ=176.0 (C-7β), 175.1 (C-7α), 92.9 (C-1α,β), 76.5 (C-5β), 72.1, 72.0 (C-3β, 5α), 68.8 (C-3α), 66.8, 66.6 (C-4α,β), 61.0, 60,9 (C-8α,β), 60.5, 60.4 (C- 6β,α), 53.8 (C-2β), 52.9 (C-2α). En el siguiente paso para la síntesis del Neu5Gc, se llevó a cabo la reacción con aldolasa comercial (Neu5Ac aldolasa. Sorachim) tal y como se describe en el Resultados y Discusión 190 apartado V.2.4.3.2.1.2, utilizando como sustratos la N-glicolil-D-Manosamina y piruvato en tampón fosfato de sodio 0,1 M pH 7,6 a 37 ºC y 18h (Esquema 22). O O- O O HO HO HN OH OH OH O OH OH HO OH O N H HO O O O- O OH OH HO OH HO N H HO O NeuA aldolasa Piruvato OH HO HO HN OH OH O O 1 2 3 4 5 6 123 4 5 6 1 2 34 5 6 OH O- O OH OH HO O HO N H HO O N-glicolil-D-manosamina Ácido N-glycolilneuraminico (Neu5Gc) Esquema 22. Síntesis enzimática de Neu5Gc mediante la reacción con NeuA aldolasa, utilizando como sustrato N-glicolil-D-Manosamina y piruvato. Se marca en rojo el enlace creado por la enzima. El seguimiento de la reacción se realizó por TLC, utilizando como fase móvil butanol:acetona:etanol:agua en relación 35:35:7:23 (Figura 72). Se finalizó la reacción con etanol y baño de hielo. El crudo fue centrifugado y el sobrenadante concentrado en rotavapor y purificado en una columna Bio Gel P-2 de Biorad, utilizando agua destilada como fase móvil según lo descrito en el apartado V.2.5.6. Las fracciones que contenían el compuesto fueron concentradas en rotavapor. El proceso de purificación se repitió una segunda vez en las mismas condiciones. El Resultados y Discusión 191 compuesto final fue caracterizado por RMN (apartado V.2.7.2). Se obtuvo un rendimiento del 80%. Figura 72. TLC de la reacción de síntesis de Neu5Gc utilizando como fase móvil butanol:acetona:etanol:agua en relación 35:35:7:23. En 1) T0 de la reacción donde se observa N-glicolil-D-Manosamina. En 2) se observa el Neu5Gc Ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5GC): (He y col. 2011) 1H NMR (500 MHz, D2O): δ= 3.92-3.82 (m, 4H, 4-H, 6-H, 11-H), 3.73 (t, 1H J=10.1Hz, 5-H), 3.55 (dd, 1H, J=2.9, 11.9 Hz, 9-Ha), 3.50-3.43 (m, 1H, 8-H), 3.34 (t, 1H, J=6.2, 11.8 Hz, 9- Hb), 3.26 (dd, 1H, J=1.2, 9.2 Hz, 7-H), 2.05 (dd, 1H, J=13.1, 4.9 Hz, 3-Ha), 1.62 (dd, 1H, J=13.1, 6.9 Hz, 3-Hb); 13C NMR (125 MHz): δ=176.0 (C-1), 173.7 (C-10), 95.7 (C-2), 70.6 (C-4, C-8), 68.5 (C-7), 66.8 (C-6), 63.5 (C-9), 61.4 (C-11), 52.1 (C- 5), 39.3 (C-3). III.4.1.2. Activación de ácidos siálicos con CMP Una vez obtenidos los ácidos sálicos, el Neu5Ac y el Neu5Gc, se procedió a su activación con citidina monofosfato (CMP) para que pudieran ser utilizados como sustrato por las enzimas sialiltranferasas. Para ello se realizó la reacción de activación con la enzima CMP-sialato sintetasa de Neisseria meningitidis, según el protocolo del apartado V.2.4.3.2.2, con citidina trifosfato (CTP) en tampón Tris/HCl 50 mM pH 8,6, a 37 ºC y 24h (Esquema 23). La enzima utiliza Mg2+ como cofactor, por lo que el tampón está enriquecido con MgCl2 en una concentración 50 mM. A pH inferior a 8 el siálico activado no es estable y puede hidrolizarse el CMP, por lo Neu5Gc 1 2 Resultados y Discusión 192 que la reacción se llevó a cabo en un aparato tritiador (Metrohm 665 Dosimat) programado para mantener el pH a 8,6 con NaOH 2M. En la reacción, para unir el CMP al siálico se produce la hidrólisis del CTP y se libera pirofosfato (PPi). Éste inhibe la actividad enzimática, por lo que se añadió otra enzima, la pirofosfatasa inorgánica, para hidrolizar el pirofosfato a fosfato (Esquema 23). Neu5Ac Neu5Gc Neu5Ac-CMP Neu5Gc-CMP Esquema 23. Reacción de activación de ácidos siálicos con CMP mediante el uso de la enzima CMP-sialato sintetasa. El seguimiento de la reacción se llevó a cabo por TLC, utilizando como fase móvil N-propanol/H2O/NH3 en relación 8:2:1 (Figura 73). El medio de reacción se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 3 min y el sobrenadante fue liofilizado (apartado V.2.5.7) y conservado a -20 ºC para su posterior utilización. Figura 73. TLC de la reacción de activación de ácidos siálicos con CMP mediante el uso de la enzima CMP-sialato sintetasa. En 1) CTP, en 2) CMP, en 3) Neu5Ac y en 4) crudo de reacción con Neu5Ac-CMP Neu5Ac-CMP 4 3 2 1 Resultados y Discusión 193 III.4.2. Funcionalización de glicodendrímeros con derivados de ácido siálico mediante el uso de enzimas sialiltransferasa Los sialoconjugados, Neu5Ac-CMP y Neu5Gc-CMP, fueron utilizados para la funcionalización de glicodendrímeros mediante sialiltransferasas. Éstos llevan incorporada una molécula de lactosa en el extremo de cada uno de sus brazos, con la galactosa como azúcar terminal, aceptor natural de las sialiltransferasas. Para las reacciones de sialización se utilizaron dos tipos de enzimas sialiltransferasa: la α-2,6- sialiltransferasa (α2,6SiaT) de Photobacterium leiognathi, que enlaza el carbono 2 del siálico al carbono 6 de una molécula de galactosa (Yamamoto y col. 2007), y la α-2,3-sialiltransferasa (α2,3SiaT) de Photobacterium phosphoreum, que une el carbono 2 del siálico con el carbono 3 de una molécula de galactosa (Tsukamoto y col. 2007). Las reacciónes con α2,6SiaT se llevaron a cabo según las condiciones descritas en el apartado V.2.4.3.2.3, en tampón Tris/HCl 50 mM pH 8,6, a 30 ºC, enriquecido con MgCl2 50 mM como cofactor. Se añadieron 2 equivalentes de siálico activado con CMP como donador por cada brazo de glicodendrímero. Puesto que el siálico-CMP no es estable a pH inferior a 8, éste se controló en todo momento con NaOH 0,5 M. En la reacción se libera el CMP, que inhibe la actividad enzimática, por ello se añadió una segunda enzima, la fosfatasa alcalina, que lo hidroliza a citidina y fosfato. Cuando dejaba de disminuir el pH de la reacción, evidencia de que ésta había terminado, se tomaba una alícuota para seguir la reacción por HPLC (apartado V.2.7.1.2) y se añadía otro equivalente de donador por cada brazo del dendrímero, hasta los cinco equivalentes. Finalizadas las reacciones, el crudo fue centrigugado a 13.000 r.p.m. y concentrado en rotavapor. En el Esquema 24 se muestra la reacción de α2,6SiaT con Neu5Ac-CMP como donador y una de las lactosas de un glicodendrímero como aceptor. Resultados y Discusión 194 α- Glicodendrímero Glicodendrímero Esquema 24. Reacción de funcionalización de un glicodendrímero con la enzima α2,6SiaT utilizando Neu5Ac-CMP como donador Se siguió la misma metodología (apartado V.2.4.3.2.3) para las reacciones con NeuGc-CMP como donador y con la enzima α2,3SiaT con NeuAc-CMP y NeuGc- CMP como donadores, esperándose los productos del Esquema 25. Glicodendrímero Glicodendrímero Glicodendrímero α-2,6-sialiltransferasa α-2,3-sialiltransferasa Esquema 25. Productos de la reacción de sialización de glicodendrímero con las enzimas α2,6SiaT y α2,3SiaT utilizando Neu5Ac-CMP y Neu5Gc como donadores. Resultados y Discusión 195 III.4.2.1. Reacciones con la enzima α2,6SiaT de P. leiognathi Las reacciones se realizaron tal y como se describe anteriormente, en el apartado III.4.2, En la Figura 74 se muestran, como ejemplo, los cromatogramas del seguimiento por HPLC (apartado V.2.7.1.2) de la reacción de funcionalización del glicodendrímero G1.4 (Figura 74A), utilizando Neu5Ac-CMP como donador. En la Figura 74B aparece el cromatograma del patrón del glicodentrímero G1.4 sin reaccionar, en la Figura 74C se muestra un cromatograma de un punto intermedio de la reacción, donde se pueden observar diferentes picos, resultado de la progresiva funcionlización de los diferentes brazos del D1.4. En la Figura 74D se muestra el cromatograma con la reacción terminada. Según avanza la reacción, el CMP es liberado e hidrolizado por la fosfatasa alcalina para dar citidina, pico que también aparece en los cromatogramas, a un tiempo menor que el glicodendrímero. Figura 74. Cromatogramas que muestran la evolución de la reacción de la enzima α2,6SiaT de P.leiognathi. A) G1.4-2,6-Neu5Ac. B) Patrón de glicodendrímero. C) Reacción en estadío intermedio. D) Reacción finalizada. C) D) A) B) Resultados y Discusión 196 III.4.2.2. Reacciones con la enzima α2,3SIAT de P. phosphoreum Las reacciones se realizaron tal y como se describe anteriormente en el apartado III.4.2, utilizando Neu5Ac-CMP y Neu5Gc-CMP como donadores y los glicodendrímeros como aceptores. La muestra un cromatograma de la reacción con la enzima α2,3SiaT con el glicodendrímero G1.4 como aceptor después de haber añadido cinco equivalentes de Neu5Ac-CMP. Como se puede observar, la enzima no fue capaz de completar la reacción, obteniéndose una mezcla de productos compuesta por el glicodendrímero con distinto número de brazos funcionalizados con Neu5Ac. Este resultado se obtuvo con todos los glicodendrímeros, y utilizando tanto Neu5Ac-CMP como Neu5Gc-CMP como donadores, por lo que se concluyó que la enzima α2,3SiaT no es apropiada para la unión de siálicos a este tipo de moléculas. A pesar de ello, se intentaron purificar los distintos productos para tratar de obtener algo de producto final puro, tal como se describe en el apartado siguiente (III.4.2.3) Figura 75. Cromatograma que muestra la evolución de la reaccion con la enzima α2,3SiaT de P.phosphoreum con el glicodendrímero DA4 como aceptor después de haber añadido cinco equivalentes de Neu5Ac-CMP. 1. Citidina. 2. Intermedio de reacción. Intermedio de reacción Resultados y Discusión 197 III.4.2.3. Purificación de sialilglicodendrímeros Finalizadas las reacciones se procedió a la purificación de los 24 productos sializados (seis con 2,6-Neu5Ac, seis con 2,6-Neu5Gc, seis reacciones inacabadas con 2,3- Neu5Ac y seis con 2,3-Neu5Gc) en una columna de BioGel P-2 (BioRad), tal y como se describe en el apartado V.2.5.6. Esta columna, de 170 por 2 cm separaba los distintos componentes del crudo de reacción por tamaño molecular, utilizando como fase móvil agua destilada. Se analizaron por TLC las diferentes fracciones obtenidas de la separación, utilizando como fase móvil butanol:acetona:acético:agua en relación 32:33:7:28. En la Figura 76A se muestra, como ejemplo, la TLC de purificación del sialilglicodendrímero G1.2-2,6-Neu5Ac. Todos las purificaciones de las reacciones con las enzima α2,6SiaT mostraban el mismo aspecto, en el que se obtiene un solo producto purificado. En la Figura 76B se muestra, como ejemplo, la purificación del compuesto DA3-2,3-Neu5Gc. Como se puede observar, la columna, incluso después de dos pasadas, no es capaz de separar los intermedios de reacción del producto final. Esto ocurrió con todas las purificaciones de las reacciones con la enzima α2,3SiaT, por lo que después de la purificación, todos los compuestos obtenidos seguían siendo una mezcla. La localización de los tubos que contenían glicodendrímeros de tipo G2 se podía simplificar gracias a las cualidades fluorescentes de éstos, ya que brillaban bajo luz UV (Figura 76C). A) B) C) Figura 76. A) TLC de lapurificación del sialilglicodendrímero G1.2-2,6-Neu5Ac. B) TLC de purificación del compuesto G1.3-2,3-Neu5Gc. C) Localización de los tubos de compuestos de la serie G2 vistos bajo luz UV. Resultados y Discusión 198 Se calcularon los rendimientos de los productos purificados, una vez liofilizados, respecto a los glicodendrímeros de partida en cada una de las reacciones, tal y como se muestra en la Tabla 26. Tabla 26. Rendimientos de las reacciones de funcionalización de glicodendrímeros utilizando Neu5Ac-CMP y Neu5Gc-CMP como donadores mediante las enzimas α2,6SiaT y α2,3SiaT α2,6SiaT Rendimiento (%) α2,3SiaT Rendimiento (%) G1.2-2,6-Neu5Ac 44 G1.2-2,3-Neu5Ac 44 G1.3-2,6-Neu5Ac 54 G1.3-2,3-Neu5Ac 54 G1.4-2,6-Neu5Ac 55 G1.4-2,3-Neu5Ac 48 G1.2-2,6-Neu5Gc 43 G1.2-2,3-Neu5Gc 43 G1.3-2,6-Neu5Gc 52 G1.3-2,3-Neu5Gc 52 G1.4-2,6-Neu5Gc 54 G1.4-2,3-Neu5Gc 52 G2.2-2,6-Neu5Ac 48 G2.2-2,3-Neu5Ac 37 G2.3-2,6-Neu5Ac 44 G2.3-2,3-Neu5Ac 49 G2.4-2,6-Neu5Ac 47 G2.4-2,3-Neu5Ac 43 G2.2-2,6-Neu5Gc 53 G2.2-2,3-Neu5Gc 42 G2.3-2,6-Neu5Gc 54 G2.3-2,3-Neu5Gc 52 G2.4-2,6-Neu5Gc 52 G2.4-2,3-Neu5Gc 53 III.4.2.4. Caracterización estructural de los 2,6- sialoglicodendrímeros Los sialoglicodendrímeros purificados, obtenidos en la reacción con la enzima α2,6SiaT y funcionalizados con Neu5Ac y Neu5Gc, fueron caracterizados por RMN (apartado V.2.7.2), como se describe a continuación: Resultados y Discusión 199 - G1.2-2,6-Neu5Ac Figura 77. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G1.2-2,6-Neu5Ac. 1H RMN (500 MHz, D2O) δ (ppm): 1.70 (4H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 1.99 (6H, s, H- 11´´´), 2.17 (4H, m, H-13), 2.68 (4H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.28 (2H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.45 (2H, H-5´), 3.45 (2H, H-2´´), 3.45 (4H, H-14B), 3.53 (2H, H-5´´´), 3.53 (2H, H-3´´´), 3.57 (2H, H-3´), 3.57 (2H, H-4´), 3.58 (2H, H-7´´´), 3.60 (4H, H-6´´B), 3.68 (4H, H-8´´´), 3.75 (2H, H-5´´), 3.75 (4H, H-14A), 3.76 (4H, H- 6´B), 3.80 (2H, H-4´´´), 3.80 (2H, H-6´´´), 3.80 (4H, H-6´´A), 3.85 (3H, s, H-8), 3.88 (4H, H-6´A), 3.90 (2H, H-4´´), 4.25 (2H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.37 (2H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.55 (4H, t, J=6.6 Hz, H-12), 5.25 (4H, s, H-9), 6.88 (1H, H-4), 7.25 (2H, s, H-2 y H-6), 8.08 (2H, s br, H-11). 13C RMN (150 MHz, D2O) δ 22.08 (C11´´´), 29.46 (C13), 40.14 (C2´´´), 47.13 (C12), 51.82 (C4´´´), 52.95 (C8), 59.37 (C8´´´), 60.25 (C6´), 61.73 (C9), 62.68 (C6´´), 66.24 (C14), 68.4 (C3´´´), 68.56 (C4´´), 68.56 (C7´´´), 70.82 (C2´´), 71.83 (C6´´´), 72.36 (C5´´´), 72.44 (C3´´), 72.72 (C2´), 73.73 (C5´´), 74.61 (C3´), 74.61 (C5´), 79.64 (C4´), 100.32 (C1´´´), 102.03 (C1´), 103.27 (C1´´), 108.00 (C4), 109.67 (C2 y C6), 125.62 (C11), 131.8 (C1), 142.90 (C10), 158.61 (C3 y C5), 168.00 (C7), 173.51 (C9´´´), 174.94 (C10´´´). Resultados y Discusión 200 - G1.2-2,6-Neu5Gc Figura 78. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G1.2-2,6-Neu5Gc. 1H RMN (500 MHz, D2O) δ (ppm): 1.73 (4H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 2.19 (4H, m, H- 13), 2.71 (4H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.30 (2H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.50 (4H, H-14B), 3.74 (2H, H-3´´´), 3.58 (2H, H-3´), 3.58 (2H, H-4´), 3.58 (2H, H-7´´´), 3.60 (2H, H-2´´), 3.60-3.80 (2H, H-5´´´), 3.65 (4H, H-6´´), 3.71 (4H, H-8´´´), 3.80 (2H, H-5´´), 3.80 (2H, H-5´), 3.80 (2H, H-6´´´), 3.78 (4H, H-6´B), 3.82 (4H, H-14A), 3.87 (4H, H-6´´A), 3.90 (3H, s, H-8), 3.90 (4H, H-6´A), 3.92 (2H, H-4´´), 3.93 (2H, H-4´´´), 4.09 (4H, s, H-11´´´), 4.27 (2H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.39 (2H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.54 (4H, t, J=6.6 Hz, H-12), 5.26 (4H, s, H-9), 6.88 (1H, H-4), 7.26 (2H, s, H-2 y H-6), 8.09 (2H, s br, H-11). 13C RMN (150 MHz, D2O) δ 29.49 (C13), 40.23 (C2´´´), 47.16 (C12), 51.58 (C4´´´), 52.99 (C8), 59.41 (C8´´´), 60.29 (C6´), 61.49 (C11´´´), 61.76 (C9), 62.68 (C6´´), 66.27 (C14), 68.15 (C3´´´), 68.41 (C7´´´), 68.60 (C4´´), 70.85 (C2´´), 71.90 (C6´´´), 72.32 (C5´´´), 72.47 (C3´´), 72.76 (C2´), 73.79 (C5´´), 74.64 (C3´), 74.64 (C5´), 79.66 (C4´), 100.37 (C1´´´), 102.06 (C1´), 103.30 (C1´´), 108.51 (C4), 109.70 (C2 y C6), 125.64 (C11), 131.85 (C1), 142.96 (C10), 158.65 (C3 y C5), 168.10 (C7), 173.52 (C9´´´), 175.72 (C10´´´). Resultados y Discusión 201 G1.3-2,6-Neu5Ac Figura 79 Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G1.3-2,6-Neu5Ac. 1H RMN (500 MHz, D2O) δ (ppm): 1.69 (6H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 1.97 (9H, s, H- 11´´´), 2.15 (6H, m, H-11), 2.66 (6H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.28 (3H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.45 (3H, H-5´), 3.46 (6H, H-12B), 3.51 (3H, H-2´´), 3.60-3.80 (3H, H-5´´´), 3.55 (3H, H-3´), 3.55 (3H, H-4´), 3.60 (3H, H-7´´´), 3.60 (6H, H-6´´B), 3.70 (6H, H-8´´´), 3.75 (3H, H-3´´´), 3.75 (3H, H-5´´), 3.75 (6H, H-6´B), 3.79 (6H, H-12A), 3.80 (3H, H-4´´´), 3.80 (3H, H-6´´´), 3.80 (6H, H-6´´A), 3.86 (6H, H-6´A), 3.90 (3H, H-4´´), 4.27 (3H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.36 (3H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.51 (6H, t, J=6.5 Hz, H-10), 5.15 (6H, s, H-7), 6.31 (3H, s, H-2, H-4 y H-6), 8.04 (3H, s br, H-9). 13C RMN (150 MHz, D2O) δ 22.09 (C11´´´), 29.49 (C11), 40.10 (C2´´´), 47.16 (C10), 51.83 (C4´´´), 59.36 (C8´´´), 60.25 (C6´), 61.51 (C7), 62.67 (C6´´), 66.12 (C12), 68.26 (C3´´´), 68.40 (C7´´´), 68.55 (C4´´), 70.81 (C2´´), 71.79 (C6´´´), 72.42 (C5´´´), 72.57 (C3´´), 72.73 (C2´), 73.71 (C5´´), 74.59 (C3´), 74.59 (C5´), 79.62 (C4´), 96.63 (C2, C4 y C6), 100.28 (C1´´´), 102.02 (C1´), 103.27 (C1´´), 125.54 (C9), 143.06 (C8), 159.40 (C1, C3 y C5), 173.41 (C9´´´), 175.08 (C10´´´). Resultados y Discusión 202 G1.3-2,6-Neu5Gc Figura 80. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G1.3-2,6-Neu5Gc. 1H RMN (500 MHz, D2O) δ (ppm): 1.71 (6H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 2.17 (6H, m, H- 11), 2.70 (6H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.28 (3H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.43 (6H, H-12B), 3.50 (3H, H-5´), 3.50 (3H, H-7´´´), 3.57 (3H, H-3´), 3.57 (3H, H-4´), 3.60 (3H, H-2´´), 3.60-3.80 (3H, H-5´´´), 3.63 (6H, H-6´´B), 3.72 (6H, H-8´´´), 3.72 (3H, H-3´´´), 3.73 (6H, H-6´B), 3.75 (6H, H-12A), 3.78 (3H, H-5´´), 3.82 (6H, H- 6´´A), 3.83 (3H, H-6´´´), 3.87 (6H, H-6´A), 3.88 (3H, H-4´´), 3.90 (3H, H-4´´´), 4,07 (6H, s, H-11´´´), 4.28 (3H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.37 (3H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.51 (6H, t, J=6.5 Hz, H-10), 5.15 (6H, s, H-7), 6.30 (3H, s, H-2, H-4 y H-6), 8.02 (3H, s br, H-9). 13C RMN (150 MHz, D2O) δ 29.50 (C11), 40.17 (C2´´´), 47.16 (C10), 51.54 (C4´´´), 59.90 (C8´´´), 60.25 (C6´), 61.51 (C11´´´), 61.73 (C7), 62.64 (C6´´), 66.29 (C12), 68.11 (C3´´´), 68.36 (C7´´´), 68.56 (C4´´), 70.81 (C2´´), 71.91 (C6´´´), 72.29 (C5´´´), 72.42 (C3´´), 72.74 (C2´), 73.74 (C5´´), 74.61 (C3´), 74.61 (C5´), 79.64 (C4´), 96.60 (C2, C4 y C6), 100.30 (C1´´´), 102.03 (C1´), 103.31 (C1´´), 125.53 (C9), 143.06 (C8), 159.40 (C1, C3 y C5), 173.46 (C9´´´), 175.68 (C10´´´). Resultados y Discusión 203 G1.4-2,6-Neu5Ac Figura 81. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G1.4-2,6-Neu5Ac. 1H RMN (500 MHz, D2O) δ (ppm): 1.69 (8H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 1.98 (12H, s, H- 11´´´), 2.09 (8H, m, H-20), 2.68 (8H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.28 (4H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.45 (4H, H-5´), 3.45 (8H, H-21B), 3.50 (4H, H-2´´), 3.52 (4H, H-3´´´), 3.57 (4H, H-3´), 3.57 (4H, H-4´), 3.60 (4H, H-5´´´), 3.60 (8H, H-6´´B), 3.65 (4H, H-7´´´), 3.70 (8H, H-8´´´), 3.73 (8H, H-6´B), 3.69 (8H, H-21A), 3.80 (4H, H- 5´´), 3.80 (3H, s, H-8), 3.80 (4H, H-4´´´), 3.80 (4H, H-6´´´), 3.80 (8H, H-6´´A), 3.87 (8H, H-6´A), 3.90 (4H, H-4´´), 4.34 (4H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.37 (4H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.37 (8H, t, J=6.5 Hz, H-19), 4.60 (4H, s br, H-9), 4.84 (8H, s br, H-16), 6.41 (4H, s, H-4), 6.41 (4H, s, H-11 y H-15), 6.41 (2H, H-13), 6.81 (3H, s, H-2 y H-6), 7.85 (3H, s br, H-18). 13C RMN (150 MHz, D2O) δ 22.04 (11´´´), 29.59 (C20), 40.11 (C2´´´), 47.14 (C19), 51.85 (C4´´´), 52.76 (C8), 59.36 (C8´´´), 60.26 (C6´), 60.96 (C16), 62.67 (C6´´), 66.30 (C21), 68.28 (C3´´´), 68.41 (C7´´´), 68.56 (C4´´), 69 (C9), 70.81 (C2´´), 71.79 (C6´´´), 72.45 (C5´´´), 72.57 (C3´´), 72.74 (C2´), 73.68 (C5´´), 74.62 (C3´), 74.62 (C5´), 79.61 (C4´), 100.31 (C1´´´), 101.10 (C13), 102.03 (C1´), 103.31 (C1´´), 106.74 (C4), 106.74 (C11 y C15), 108.41 (C2 y C6), 125.00 (C18), 131.41 (C1), 139.27 (C10), 143.12 (C17), 158.91 (C3 y C5), 158.91 (C12 y C14), 167.52 (C7), 173.44 (C9´´´), 174.90 (C10´´´). Resultados y Discusión 204 G1.4-2,6-Neu5Gc Figura 82. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G1.4-2,6-Neu5Gc. 1H RMN (500 MHz, D2O) δ (ppm): 1.70 (8H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 2.05 (8H, m, H- 20), 2.66 (8H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.30 (4H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.42 (8H, H-21B), 3.43 (4H, H-5´), 3.51 (4H, H-2´´), 3.50 (4H, H-7´´´), 3.52 (4H, H-3´), 3.52 (4H, H-4´), 3.60 (8H, H-6´´B), 3.69 (8H, H-21A), 3.70 (8H, H-6´B), 3.70 (4H, H-3´´´), 3.72 (8H, H-8´´´), 3.72 (4H, H-5´´´), 3.73 (3H, s, H-8), 3.73 (4H, H-5´´), 3.80 (4H, H-6´´´), 3.80 (8H, H-6´´A), 3.85 (8H, H-6´A), 3.88 (4H, H-4´´), 3.89 (4H, H-4´´´), 4.07 (12H, s, H-11´´´), 4.30 (4H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.35 (4H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.38 (8H, t, J=6.5 Hz, H-19), 4.59 (4H, s br, H-9), 4.82 (8H, s br, H-16), 6.41 (4H, s, H-4), 6.41 (4H, s, H-11 y H-15), 6.41 (2H, H-13), 6.82 (3H, s, H-2 y H-6), 7.85 (3H, s br, H-18). 13C RMN (150 MHz, D2O) δ 29.61 (C20), 39.93 (C2´´´), 47.18 (C19), 51.54 (C4´´´), 52.75 (C8), 59.92 (C8´´´), 60.28 (C6´), 61.05 (C16), 61.72 (C11´´´), 62.72 (C6´´), 66.30 (C21), 67.90 (C3´´´), 68.37 (C7´´´), 68.54 (C4´´), 69 (C9), 70.79 (C2´´), 71.98 (C6´´´), 72.37 (C5´´´), 72.46 (C3´´), 72.76 (C2´), 73.66 (C5´´), 74.60 (C3´), 74.60(C5´), 79.69 (C4´), 100.01 (C1´´´), 101.18 (C13), 102.02 (C1´), 103.32 (C1´´), 106.73 (C4), 106.73 (C11 y C15), 108.40 (C2 y C6), 125.03 (C18), 131.41 (C1), 139.27 (C10), 143.08 (C17), 158.96 (C3 y C5), 158.96 (C12 y C14), 167.52 (C7), 172.93 (C9´´´), 175.67 (C10´´´). Resultados y Discusión 205 G2.2-2,6-Neu5Ac Figura 83. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G2.2-2,6-Neu5Ac. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1.34 (4H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 1.89 (6H, s, H-11´´´), 2.15 (4H, m, H-18), 2.63 (4H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.11 (2H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.20 (2H, H-7´´´), 3.31 (2H, H-4´), 3.31 (2H, H-2´´), 3.32 (2H, H-5´), 3.33 (2H, H-5´´´), 3.36 (2H, H-4´´´), 3.37 (2H, H-3´), 3.34 (4H, H-6´´B), 3.48 (4H, H-8´´´), 3.49 (4H, H-19B), 3.52 (2H, H-3´´´), 3.56 (2H, H-5´´), 3.59 (4H, H-6´´A), 3.60 (2H, H-4´´), 3.60 (2H, H-6´´´), 3.62 (4H, H-6´B), 3.76 (4H, H-6´A), 3.82 (4H, H-19A), 4.21 (2H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.24 (2H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.54 (4H, t, J=6.6 Hz, H-17), 7.66 (4H, d, J=7.3 Hz, H-3, H-5, H-10 y H-14),7.92 (4H, d, J=7.3 Hz, H-2, H-6, H-11 y H-13), 8.64 (2H, s br, H-16). 13C RMN (150 MHz, DMSO-d6) δ 23.02 (C11´´´), 30.38 (C18), 42.17 (C2´´´), 47.14 (C17), 53.43 (C4´´´), 59.72 (C8´´´), 60.94 (C6´), 63.82 (C6´´), 65.79 (C19), 67.78 (C3´´´), 68.68 (C4´´), 69.49 (C7´´´), 70.99 (C2´´), 71.82 (C6´´´), 73.31 (C5´´´), 73.4 (C3´´), 73.57 (C2´), 74.27 (C5´´), 75.34 (C3´), 75.34 (C5´), 81.09 (C4´), 90.48 (C7 y C8), 100.71 (C1´´´), 102.96 (C1´), 104.21 (C1´´), 121.88 (C4 y C9), 122.84 (C16), 125.79 (C2, C6, C11 y C13), 131.54 (C1 y C12), 132.48 (C3, C5, C10 y C14), 145.97 (C15), 171.65 (C9´´´), 172.70 (C10´´´). Resultados y Discusión 206 G2.2-2,6-Neu5Gc Figura 84. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G2.2-2,6-Neu5Gc. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1.35 (4H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 2.15 (4H, m, H-18), 2.66 (4H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.15 (2H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.20 (2H, H-2´´), 3.21 (2H, H-7´´´), 3.32 (2H, H-5´), 3.33 (2H, H-4´), 3.34 (4H, H- 6´´B), 3.38 (2H, H-3´), 3.43 (2H, H-4´´´), 3.48 (2H, H-5´´´), 3.50 (4H, H-8´´´), 3.51 (4H, H-19B), 3.57 (2H, H-5´´), 3.61 (4H, H-6´´A), 3.62 (4H, H-6´B), 3.62 (2H, H- 6´´´), 3.64 (2H, H-4´´), 3.68 (2H, H-3´´´), 3.78 (4H, H-6´A), 3.82 (4H, H-19A), 4.07 (4H, s, H-11´´´), 4.22 (2H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.26 (2H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.55 (4H, t, J=6.6 Hz, H-17), 7.66 (4H, d, J=7.3 Hz, H-3, H-5, H-10 y H-14),7.92 (4H, d, J=7.3 Hz, H-2, H-6, H-11 y H-13), 8.69 (2H, s br, H-16). 13C RMN (150 MHz, DMSO-d6) δ 30.35 (C18), 42.43 (C2´´´), 47.13 (C17), 53.08 (C4´´´), 59.80 (C8´´´), 60.99 (C6´), 61.72 (C11´´´), 63.98 (C6´´), 65.77 (C19), 67.63 (C3´´´), 68.54 (C4´´), 69.58 (C7´´´), 71.00 (C2´´), 71.88 (C6´´´), 73.01 (C5´´´), 73.37 (C3´´), 73.59 (C2´), 74.20 (C5´´), 75.34 (C3´), 75.34 (C5´), 81.06 (C4´), 90.48 (C7 y C8), 100.93 (C1´´´), 102.97 (C1´), 104.20 (C1´´), 121.88 (C4 y C9), 122.90 (C16), 125.79 (C2, C6, C11 y C13), 131.55 (C1 y C12), 132.48 (C3, C5, C10 y C14), 145.96 (C15), 171.16 (C9´´´), 175.12 (C10´´´). Resultados y Discusión 207 G2.3-2,6-Neu5Ac Figura 85. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G2.3-2,6-Neu5Ac. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1.32 (6H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 1.89 (9H, s, H-11´´´), 2.15 (6H, m, H-18), 2.64 (6H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.11 (3H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.19 (3H, H-7´´´), 3.31 (3H, H-4´), 3.30 (3H, H-2´´), 3.32 (3H, H-5´), 3.33 (6H, H-6´B), 3.33 (6H, H-6´´B), 3.35 (3H, H-5´´´), 3.35 (3H, H- 4´´´), 3.37 (3H, H-3´), 3.48 (6H, H-8´´´), 3.49 (6H, H-19B), 3.50 (3H, H-3´´´), 3.56 (3H, H-5´´), 3.58 (6H, H-6´´A), 3.62 (3H, H-4´´), 3.60 (3H, H-6´´´), 3.76 (6H, H- 6´A), 3.81 (6H, H-19A), 4.21 (3H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.25 (3H, d, J= 7.9 Hz, H- 1´), 4.55 (6H, t, J=6.6 Hz, H-17), 7.70 (6H, d, J=7.3 Hz, H-10 y H-14), 7.82 (3H, s, H-2, H-4, H-6), 7.95 (6H, d, J=7.3 Hz, H-11 y H-13), 8.70 (2H, s br, H-16). 13C RMN (150 MHz, DMSO-d6) δ 23.02 (C11´´´), 30.35 (C18), 42.35 (C2´´´), 47.07 (C17), 53.48 (C4´´´), 59.92 (C8´´´), 60.97 (C6´), 63.91 (C6´´), 65.68 (C19), 67.91 (C3´´´), 68.59 (C4´´), 69.56 (C7´´´), 71.00 (C2´´), 71.80 (C6´´´), 73.27 (C5´´´), 73.39 (C3´´), 73.59 (C2´), 74.25 (C5´´), 75.33 (C3´), 75.33 (C5´), 81.09 (C4´), 88.60 (C7), 91.50 (C8), 100.93 (C1´´´), 102.94 (C1´), 104.19 (C1´´), 121.36 (C9), 122.85 (C16), 124.24 (C1, C3 y C5), 125.83 (C11 y C13), 132.01 (C12), 132.72 (C10 y C14), 134.20 (C2, C4 y 6), 145.87 (C15), 171.36 (C9´´´), 172.70 (C10´´´). Resultados y Discusión 208 G2.3-2,6-Neu5Gc Figura 86. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G2.3-2,6-Neu5Gc. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1.32 (6H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 2.15 (6H, m, H-18), 2.66 (6H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.10 (3H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.18 (3H, H-7´´´), 3.30 (3H, H-2´´), 3.31 (3H, H-4´), 3.31 (3H, H-5´), 3.32 (6H, H- 6´´B), 3.36 (3H, H-3´), 3.40 (3H, H-4´´´), 3.40 (6H, H-8´´´), 3.44 (3H, H-5´´´), 3.49 (6H, H-19B), 3.55 (3H, H-5´´), 3.61 (6H, H-6´B), 3.65 (3H, H-3´´´), 3.58 (6H, H- 6´´A), 3.62 (3H, H-4´´), 3.61 (3H, H-6´´´), 3.76 (6H, H-6´A), 3.81 (6H, H-19A), 3.88 (6H, s, H-11´´´), 4.20 (3H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.25 (3H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.54 (6H, t, J=6.6 Hz, H-17), 7.70 (6H, d, J=7.3 Hz, H-10 y H-14), 7.82 (3H, s, H-2, H-4, H-6), 7.95 (6H, d, J=7.3 Hz, H-11 y H-13), 8.71 (2H, s br, H-16). 13C RMN (150 MHz, DMSO-d6) δ 30.32 (C18), 42.50 (C2´´´), 47.09 (C17), 53.11 (C4´´´), 58.83 (C8´´´), 61.00 (C6´), 61.74 (C11´´´), 64.01 (C6´´), 65.56 (C19), 67.61 (C3´´´), 68.59 (C4´´), 69.62 (C7´´´), 71.01 (C2´´), 71.88 (6´´´), 73.39 (C5´´´), 73.51 (C3´´), 73.71 (C2´), 74.20 (C5´´), 75.34 (C3´), 75.34 (C5´), 81.15 (C4´), 88.57 (C7), 91.41 (C8), 100.98 (C1´´´), 102.95 (C1´), 104.21 (C1´´), 121.29 (C9), 122.86 (C16), 124.23 (C1, C3 y C5), 125.83 (C11 y C13), 131.97 (C12), 132.72 (C10 y C14), 134.19 (C2, C4 y C6), 145.86 (C15), 171.19 (C9´´´), 175.10 (C10´´´). Resultados y Discusión 209 G2.4-2,6-Neu5Ac Figura 87. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G2.4-2,6-Neu5Ac. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1.33 (8H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 1.89 (12H, s, H-11´´´), 2.18 (8H, m, H-26), 2.64 (8H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.10 (4H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.20 (4H, H-7´´´), 3.32 (4H, H-2´´), 3.32 (4H, H-4´), 3.33 (4H, H-5´), 3.34 (4H, H-4´´´), 3.34 (8H, H-6´´B), 3.35 (4H, H-5´´´), 3.38 (4H, H-3´), 3.47 (8H, H-8´´´), 3.51 (4H, H-3´´´), 3.53 (8H, H-27B), 3.55 (4H, H-5´´), 3.58 (8H, H-6´´A), 3.59 (4H, H-6´´´), 3.62 (4H, H-4´´), 3.63 (8H, H-6´B), 3.76 (8H, H- 6´A), 3.82 (8H, H-27A), 4.21 (4H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.26 (4H, d, J= 7.9 Hz, H- 1´), 4.56 (8H, t, J=6.6 Hz, H-25), 7.72 (4H, s, H-10, H-11, H-13 y H-14), 8.02 (3H, s, H-2, H-4, H-18 y H-22), 8.46 (6H, d, J=7.3 Hz, H-6 y H-20), 8.79 (2H, s br, H-24). 13C RMN (150 MHz, DMSO-d6) δ 23.02 (C11´´´), 30.32 (C26), 42.15 (C2´´´), 47.39 (C25), 53.47 (C4´´´), 59.80 (C8´´´), 60.94 (C6´), 63.89 (C6´´), 65.94 (C27), 67.74 (C3´´´), 68.6 (C4´´), 69.52 (C7´´´), 71.01 (C2´´), 71.80 (C6´´´), 73.38 (5´´´), 73.60 (C3´´), 73.70 (C2´), 74.21 (C5´´), 75.32 (C3´), 75.32 (C5´), 81.07 (C4´), 89.65 (C8 y C15), 91.16 (C7 y C16), 100.70 (C1´´´), 102.98 (C1´), 104.34 (C1´´), 122.30 (C6 y C2), 122.8 (C24), 122.91 (C3 y C17), 123.00 (C9 y C12), 127.59 (C2 ,C 4, C18 y C22), 132.38 (C10, C11, C13 y C14), 132.59 (C1, C5, C19 y C21), 145.61 (C23), 171.65 (C9´´´), 172.70 (C10´´´). Resultados y Discusión 210 G2.4-2,6-Neu5Gc Figura 88. Asignación numérica de los carbonos del glicodendrímero G2.4-2,6-Neu5Gc. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1.33 (8H, t, J= 12 Hz, H-2´´´B), 2.18 (8H, m, H-26), 2.66 (8H, dd, J= 12 y 5 Hz, H-2´´´A), 3.09 (4H, dd, J= 9.5 y 7.9 Hz, H-2´), 3.19 (4H, H-7´´´), 3.32 (4H, H-2´´), 3.32 (4H, H-4´), 3.32 (8H, H-6´´B), 3.33 (4H, H- 5´), 3.35 (4H, H-5´´´), 3.38 (4H, H-3´), 3.41 (4H, H-4´´´), 3.45 (8H, H-8´´´), 3.53 (8H, H-27B), 3.54 (4H, H-5´´), 3.59 (8H, H-6´´A), 3.60 (4H, H-6´´´), 3.62 (8H, H- 6´B), 3.63 (4H, H-4´´), 3.67 (4H, H-3´´´), 3.76 (8H, H-6´A), 3.83 (8H, H-27A), 3.87 (8H, s, H-11´´´), 4.22 (4H, d, J= 7.5 Hz, H-1´´), 4.27 (4H, d, J= 7.9 Hz, H-1´), 4.55 (8H, t, J=6.6 Hz, H-25), 7.72 (4H, s, H-10, H-11, H-13 y H-14), 8.02 (3H, s, H-2, H- 4, H-18 y H-22), 8.46 (6H, d, J=7.3 Hz, H-6 y H-20), 8.79 (2H, s br, H-24). 13C RMN (150 MHz, DMSO-d6) δ 30.32 (C26), 42.23 (C2´´´), 47.28 (C25), 53.10 (C4´´´), 60.00 (C8´´´), 60.85 (C6´), 61.77 (C11´´´), 63.96 (6´´), 65.97 (C27), 67.60 (C3´´´), 68.60 (C4´´), 69.58 (C7´´´), 71.01 (C2´´), 71.85 (C6´´´), 73.40 (C5´´´), 73.62 (C3´´), 73.71 (C2´), 74.25 (C5´´), 75.32 (C3´), 75.32 (C5´), 81.05 (C4´), 89.60 (C8 y C15), 91.10 (C7 y C16), 100.90 (C1´´´), 102.99 (C1´), 104.33 (C1´´), 122.10 (C3 y C17), 122.23 (C2 y C6), 122.70 (C9 y C12), 122.83 (C24), 127.50 (C2, C4, C18 y C22), 132.38 (C10, C11, C13 y C14), 132.60 (C1, C5, C19 y C21), 145.67 (C23), 171.13 (C9´´´), 175.10 (C10´´´). Resultados y Discusión 211 Capítulo 5. Modificación estructural de glicopéptidos y estudio de interacciónes con precursores de peptidoglicano Como se explicó en la Introducción, entre las funciones de los azúcares se encuentra, además de su implicación en procesos de reconocimiento e interacción molecular, formar parte de diferentes tipos de glicoestructuras, como son los antibióticos de tipo glicopéptido (Esquema 26) (Courvalin 2006; Walsh y col. 2009; Xie y col. 2012). Éstos están formados por un esqueleto peptídico al que se unen átomos de cloro, diferentes residuos glicosídicos y, en algunos casos, cadenas lipídicas (formando los llamados lipoglicopéptidos). Son activos frente a bacterias gram positivas, y su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la síntesis de la pared bacteriana, ya que se unen al extremo Lys-D-ala-D-ala de los precursores del peptidoglicano (Nieto y col. 1971). Sin embargo, estos antibióticos no son activos frente a enterococos resistentes a vancomicina (VRE), ya que han sustituido su precursor Lys-D-Ala-D- Ala por Lys-D-Ala-D-Lactato, lo que provoca que los glicopéptidos pierdan afinidad de unión al precursor (Walsh y col. 1996) (apartado I.1.3 de la Introducción). Solo dalbavancina y MDL 63,246 presentan una pequeña actividad frente a S. aureus resistentes a vancomicina (VRSA) (Goldstein y col. 1995; Colabella y col. 2008), y esto esdebido a que las variaciones en los residuos unidos al heptapéptido diferencian la actividad de unos glicopéptidos a otros (Esquema 26). La modificación de estos residuos podría alterar la actividad de estos glicopeptidos. Gracias a una colaboración con el grupo del Dr. Francesco Molinari, se decidió utilizar diferentes enzimas como lipasas, glucosa oxidasas, serín proteasas o glicosidasas para modificar la estructura de los lipoglicopéptidos, con el objetivo de obtener moléculas derivadas que pudieran ser activas frente a organimos resistentes. Además, se estudió la interacción de los antibióticos de tipo glicopéptido vancomicina, teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246 (Esquema 26) con análogos de precursores de la pared bacteriana, AcLys-D-ala-D- ala y el AcLys-D-ala-D-lac, para profundizar en el conocimiento del proceso de unión de los glicopéptidos a los microorganismos, tanto sensibles como resistentes. Resultados y Discusión 212 Vancomicina Teicoplanina Mideplanina MDL 63,246 Dalbavancina A-40926 Esquema 26. Estructuras de los antibióticos de tipo glicopéptido utilizados en este trabajo Resultados y Discusión 213 III.4.3. Modificación enzimática de la estructura de lipoglicopéptidos Se utilizaron diferentes tipos de enzimas para la modificación estructural de los lipoglicopéptidos. Cada región del antibiótico tiene una función, por lo que la modificación de los residuos podría cambiar su actividad, llegando a redefinir su espectro de acción o solventar los problemas de afinidad con el precursor Lys-D-Ala- D-lactato presente en las cepas resistentes (Allen y col. 2002; Sosio y col. 2003; Zhanel y col. 2008). En el apartado I.1.3.1 de la introducción se explica detalladamente la función de cada región estructural de estos antibióticos. III.4.3.1. Hidrólisis enzimática de la cadena hidrofóbica de lipoglicopéptidos Se partió de la hipótesis de que cuanto mayor sea la polaridad de la cadena hidrofóbica de la región 1 (Figura 8 del apartado I.1.3.1), mayor será la capacidad de anclaje del lipoglicopéptido a la membrana celular, por lo que podría aumentar el tiempo de unión al precursor del peptidoglicano. El objetivo de estos experimentos era localizar una enzima que pudiera hidrolizar la unión de esta cadena hidrofóbica (Esquema 27), para posteriormente unir otra más polar por transesterificación. O O O N H O H N N H HN O O Cl O HNO HO O O N H O HOHO HO O OH O NH2 O OH HO O OH OH OH OH Cl OH HN O O NH O HO HO OH O O O N H O H N N H HN O O Cl O HNO HO O O N H O HOHO HO O OH O NH2 O OH HO O OH OH OH OH Cl OH H2NO O NH O HO HO OH OH + Enzima Esquema 27. Hidrólisis enzimática de la cadena hidrofóbica de teicoplanina. Resultados y Discusión 214 Se llevaron a cabo las reacciones con teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A- 40926 y MDL 63,246 como sustratos, utilizando tres tipos de enzimas: lipasas de Candida rugosa y de Pseudomonas stutzeri, y subtilisina de Bacillus subtilis. Cada enzima tenía unas condiciones óptimas, por lo que las reacciones se realizaron según el protocolo descrito en el apartado V.2.4.3.3.1. Se tomó una alícuota cada 1, 5, 8 y después cada 24 h hasta las 96 h. Las muestras se analizaron por HPLC (apartado V.2.7.1.3.1). No se obtuvo actividad en ninguno de los ensayos con las tres enzimas. III.4.3.2. Oxidación enzimática del residuo N-acil-glucosamina de lipoglicopéptidos La oxidación del carbono 6 de la región 2 de los glicopéptidos (Figura 8 del apartado I.1.3.1), aumenta su actividad antibiótica (Zhanel y col. 2008). Se utilizó la enzima glucosa oxidasa de Aspergillus niger para la reacción de oxidación con teicoplanina, mideplanina y MDL 63,246, según las condiciones del apartado V.2.4.3.3.2 (Esquema 28). Se añadió catalasa de Aspergillus niger como enzima acoplada para descomponer el H2O2 formado en la oxidación. Se tomó una alícuota cada 1, 5, 8 y después cada 24 h hasta las 96 h. Las muestras se analizaron por HPLC (apartado V.2.7.1.3.2). No se obtuvo actividad en ninguno de los ensayos. O O O N H O H N N H HN O O Cl O HNO HO O O N H O HOHO HO O OH O NH2 O OH HO O OH OH OH OH Cl OH HN O O NH O HO HO OH + Glucosa oxidasa O O O N H O H N N H HN O O Cl O HNO HO O O N H O HOHO HO O OH O NH2 O OH HO O OH OH OH OH Cl OH HN O O NH O HO HO OH O O2 H2O2 Catalasa 1/2 O2 + H2O Esquema 28. Oxidación enzimática del residuo N-acil-glucosamina de teicoplanina mediante el uso de la enzima glucosa oxidasa. Resultados y Discusión 215 III.4.3.3. Eliminación enzimática del residuo β-GlcNAc de lipoglicopéptidos Como se explicó previamente, la eliminación del GlcNAc de la región 3 de los glicopéptidos (Figura 8 del apartado I.1.3.1) disminuye su polaridad, lo que puede mejorar su capacidad de anclaje a la membrana (Kim, Kuti, y col. 2007). Se utilizaron tres tipos de enzimas N-acetil-hexosaminidasa: Canavalia ensiformis, Aspergillus oryzae y riñón bovino para la reacción con teicoplanina y mideplanina (Esquema 29), según las condiciones del apartado V.2.4.3.3.3. Se tomó una alícuota cada 1, 5, 8 y después cada 24 h hasta las 96 h. Las muestras se analizaron por HPLC (apartado V.2.7.1.3.1). No se obtuvo actividad en ninguno de los ensayos con las tres enzimas. O O O N H O H N N H HN O O Cl O HNO HO O O N H O HOHO HO O OH O NH2 O OH HO O OH OH OH OH Cl OH HN O O NH O HO HO OH + N-acetil- hexosaminidasa O O O N H O H N N H HN O O Cl O HNO HO HO O N H O HOHO HO O OH O NH2 O OH HO O OH OH OH OH Cl OH HN O O NH O HO HO OH OH + Esquema 29. Eliminación del residuo β-GlcNAc de teicoplanina mediante el uso de la enzima β-N-hexosaminidasa. III.4.3.4. Eliminación enzimática de residuo α-manosa de lipoglicopéptidos Como se explicó previamente, la eliminación del residuo de α-manosa de la región 6 de los glicopéptidos (Figura 8 del apartado I.1.3.1) aumenta su vida media (Zhanel y col. 2010). Se utilizó la enzima α-manosidasa de Canavalia ensiformis para la reacción con teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246, según las condiciones del apartado V.2.4.3.3.3 (Esquema 30). Se tomó una alícuota Resultados y Discusión 216 cada 1, 5, 8 y después cada 24 h hasta las 96 h. Las muestras se analizaron por HPLC (apartado V.2.7.1.3.1). No se obtuvo actividad en ninguno de los ensayos. O O O N H O H N N H HN O O Cl O HNO HO O O N H O HOHO HO O OH O NH2 O OH HO O OH OH OH OH Cl OH HN O O NH O HO HO OH + a-manosidasa O O O N H O H N N H HN O O Cl O HNO HO O O N H O HOHO HO OH OH O NH2 O OH HO O OH OH OH OH Cl OH HN O O NH O HO HO OH OH Esquema 30. Eliminación del residuo α-manosa de teicoplanina mediante el uso de la enzima α-manosidasa. En ninguna de las reacciones se consiguió modificar la estructura de los lipoglicopéptidos. A pesar de que las técnicas enzimáticas generalmente llevan a cabo reacciones sobre residuos específicos de estructuras complejas, las enzimas utilizadas en este trabajo no has sido capaces de reconocer a los lipoglicopéptidos como sustratos. En trabajos anteriores del grupo del Dr. Molinari, se utilizaron células enteras para la modificación de estas moléculas (Gandolfi y col. 2007). Las cepas Nonomuraea sp. ATCC 39727 (productor de A-40926) (Goldstein y col. 1987; Colabella y col. 2008), y Actinomadura parvosata ATCC 53463, (productor de parvodicina) (Christensen y col. 1987), fueron capaces de oxidar el carbono 6 del residuo N-acil-glucosamina de MDL 63,246 para obtener dalbavancina. Por otro lado, las cepas Actinoplanes sp. NRRL 3884 (productor de A-477) (Hamill RL 1973), Actinoplanes missouriensis ATCC 23342 (productor de actaplanina) (Debono y col. 1984) y Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 (productor de teicoplanina) (Parenti y col. 1978; Parenti y col. 2000), deacilaron la cadena hidrofóbica de dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246 (Gandolfi y col. 2007). En ese trabajo también trataron de biotransformar los glicopéptidos con una batería de diferentes enzimas libres, sin éxito. Cabe destacar que todas las cepas que modificaron la estructura de los antibióticos eran cepas productoras de alguna Resultados y Discusión 217 variedad de glicopéptido, lo que indica que es necesario poseer una maquinaria enzimática muy específca para manipular moléculas tan complejas como éstas. III.4.4. Análisis de interacción glicopéptido-precursor de peptidoglicano mediante SPR El estudio de las interacciones entre los glicopéptidos y los precursores de peptidoglicano y la superficie celular puede aumentar el conocimiento sobre el mecanismo de acción de estas molécular, permitiendo un desarrollo racional de derivados más potentes farmacológicamente. Se analizó por SPR la interacción de los antibióticos de tipo glicopéptido vancomicina, teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246 (Esquema 26) con los análogos de precursores de peptidoglicano de la pared bacteriana AcLys-D-ala-D-ala y AcLys-D-ala-D-lactato. Para ello primero se preparó un chip CM5 de SPR uniendo AcLysDAlaDAlaOH en la celda 2 y ALysDAlaDLactato en la celda 3 según la metodología del apartado V.2.7.4.1. La celda 1 fue activada y bloqueada para ser utilizada como superficie de referencia. Se llevaron a cabo las mediciones de interacción en el SPR fluyendo los antibióticos sobre el chip, tal y como se describe en el apartado V.2.7.4.2.2.1. Los sensogramas obtenidos mostraron una excesiva densidad de ligando unido en la superficie del chip, lo que llevaba a errores de medida por saturación y limitación de transporte de masa (Figura 89). Resultados y Discusión 218 Figura 89. Sensogramas de SPR de la unión de los glicopéptidos con AcLysDAlaDAlaOH inmobilizado sobre un chip CM5, mostrando las fases de asociación y disociación. Para evitar los problemas de saturación, se sustituyó el chip CM5 por un CM4. Éste es similar al CM5, pero presenta menor grado de carboximetilación en el dextrano de su superficie, por lo que se une menos analito al chip y permite evitar los problemas encontrados con el CM5. Se llevaron a cabo las mediciones de interacción en el SPR fluyendo los antibióticos sobre el chip CM4, tal y como se describe en el apartado V.2.7.4.2.2.2. Los resultados de obtenidos se muestran en la Figura 90 Resultados y Discusión 219 Figura 90. Sensogramas de SPR de la unión de los glicopéptidos con AcLysDAlaDAlaOH inmobilizado sobre un chip CM4 (lineas negras), mostrando las fases de asociación y disociación. Los datos obtenidos en los sensogramas se ajustaban a un modelo de interacción bivalente (Biacore 1997), que se explicaría como la unión de una primera molécula de glicopéptido al AcLysDAlaDAlaOH y posteriormente la unión de una segunda. Esto se correspondería con el mecanismo de unión expuesto previamente por otros autores para vancomicina, según el cual, se produciría una dimerización de las moléculas de glicopéptido en la superficie celular, siendo este efecto aumentado en presencia de ligando (Williams y col. 1998). Este mecanismo podría explicar las señales de asociación obtenidas, que muestran un incremento inicial causado por la unión de una molécula de glicopéptido al AcLysDAlaDAlaOH de la superficie del chip, seguido de un aumento más gradual y menos marcado, que se asociaría con la unión de una segunda molécula de glicopéptido. Por otro lado, los perfiles de disociación muestran una fase inicial muy rápida y una segunda fase de disociación más lenta, que podrían ser debidas a que la unión de los glicopéptidos dimerizados y el AcLysDAlaDAlaOH de la superficie es más fuerte. Resultados y Discusión 220 En la Tabla 27 se muestran los parámetros cinéticos de la interacción, dos de cada tipo debido al modelo bivalente. Las KD1 y KD2 obtenidas, que se calcularon como kd1/ka1 y kd2/ka2 respectivamente, estaban en el rango nanomolar. Teicoplanina, mideplanina, dalbavancina y MDL 63,246 mostraron unas KD menores, lo que denota uniones más fuertes al AcLysDAlaDAlaOH. Por el contrario, vancomicina y A- 40926 muestran unas KD más elevadas, lo que implica que la unión es más débil. Tabla 27. Determinación de los parámetros cinéticos de la interacción entre los glicopéptidos y AcLysDAlaDAlaOH unido al chip CM4. Glicopéptido ka1 (M-1s-1) kd1 (s-1) ka2 (RU-1s-1) kd2 (s-1) KD1 (nM) KD2 (RU) Vancomicina 2.36 × 105 8.2 × 10-1 3.8 × 10-5 4.2 × 10-3 3466 110 Teicoplanina 5.52 × 105 9.1 × 10-2 6.0 × 10-5 4.1 × 10-3 165 68 Mideplanina 2.77 × 105 1.06 × 10-1 3.5 × 10-5 2.93 × 10-3 383 83 Dalbavancina 8.9 × 105 2.9 × 10-1 9.6 × 10-5 7.1 × 10-3 327 74 A-40926 2.42 × 104 2.53 × 10-1 2.06 × 10-6 6.1 × 10-3 10455 2981 MDL63,246 1.70 × 105 1.21 × 10-1 2.0 × 10-5 4.1 × 10-3 712 200 Hasta la fecha, se había atribuido la capacidad de dimerización solo a la vancomicina (Gerhard y col. 1993; Mackay, Gerhard, Beauregard, Westwell, y col. 1994; Schafer y col. 1996; Beauregard y col. 1997; Nitanai y col. 2009), ya que estudios con teicoplanina y lipoglicopéptidos similares evidenciaron que estos no dimerizan en soluciones acuosas (Mackay, Gerhard, Beauregard, Maplestone, y col. 1994). Los resultados obtenidos en las interacciones por SPR demuestran que no solo la vancomicina, sino también los lipoglicopétidos, forman dímeros, pero la unión de la segunda molécula de lipoglicopéptido solo se produce cuando la primera ya está unida al AcLysDAlaDAlaOH en la superficie, produciéndose entonces la dimerización, lo que estabiliza la unión con el AcLysDAlaDAlaOH. Por lo tanto, existe dimerización, pero no en solución. Ninguno de los glicopeptidos analizados produjo una señal de unión detectable frente al AcLysDAlaDLactato. Esto se corresponde con lo expuesto en la bibliografía, ya Resultados y Discusión 221 que la sustitución de la amida de unión de la alanina por el ester del lactato en el precursor Lys-D-Ala-D-Lactato, elimina uno de los puentes de hidrógeno entre el glicopéptido y el precursor (Figura 9 del apartado I.1.3.2), provocando que la interacción de la vancomicina en solución acuosa sea mil veces menor que con el precursor Lys-D-Ala-D-Ala, causando que este fármaco sea inútil frente a cepas resistentes por sustitución de un precursor por otro (VRSA y VRE) (Bugg y col. 1991; Walsh y col. 1996). III.4.5. Modelado molecular del complejo formado entre glicopéptidos y precursores de peptidoglicano Se utilizaron técnicas de modelado molecular para la obtención de la estructura tridimensional de los complejos formados entre los glicopéptidos y los precursores de peptidoglicano, como se describe en el apartado V.2.8.3. La combinación de protocolos de docking y los cálculos de mecánica y dinámica molecular ofrecieron diferentes soluciones a la estructura de los complejos. El complejo más estable formado entre teicoplanina y AcLysDAlaDAlaOH se muestra en la Figura 91, y se corresponde con aquellos modelos propuestos previamente para la unión de diferentes antibióticos frente a precursores de peptidoglicano (Barna y col. 1984). En la Figura 91A se muestra la estructura de mínima energía obtenida después de las simulaciones de dinámica molecular. En ella se muestra que los puentes de hidrógeno más importantes en la formación del complejo, son los tres unidos con el grupo carboxilo y el de la amida de la D-alanina terminal. Estas uniones se mantenían más del 90% del tiempo del proceso de dinámica molecular. Un puente de hidrógeno adicional (no mostrado en la figura), unido al CO de la lisina, se mantenía más del 50% del tiempo de la dinámica molecular. En la Figura 91B se observa la superposición de diez estructuras diferentes obtenidas durante la simulación, y muestra que el complejo está bien definido durante todo el proceso, contrastando con la libertad de movimiento de la cadena lateral de la lisina y la cadena hidrofóbica del glicopeptido, ya que no participan en la unión con el precursor. Resultados y Discusión 222 Figura 91. Modelado molecular del complejo formado entre teicoplanina y el precursor de peptidoglicano AcLysDAlaDAlaOH. A) Estructura de mínima energía. B) Superposición de diez estructuras obtenidas durante el proceso de dinámica molecular. Se llevó a cabo una superposición de los complejos de teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246 con AcLysDAlaDAlaOH, obtenidos por dinámica molecular y posterior minimización de energía (Figura 92). Los puentes de hidrógeno más importantes (descritos más arriba) estaban presentes en todos los casos durante más del 90% del tiempo de la simulación de dinámica molecular. La forma de los complejos formados es muy similar en todos ellos, así como el reconocimiento del extremo D-Ala-D-ala del precursor. También se pudieron observar diferencias en la orientación de las cadenas hidrofóbicas y en la cadena lateral de la lisina, debido a su libertad de movimiento. A) B) Resultados y Discusión 223 Figura 92. Superposición de los complejos de teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A- 40926 y MDL 63,246 con AcLysDAlaDAlaOH Figura 93. Estructura de mínima energía del complejo formado entre teicoplanina y el precursor de peptidoglicano AcLysDAlaDLactato. En la dinámica molecular con el precursor AcLysDAlaDLactato no se observó la formación de un complejo estable en su interacción con los glicopéptidos (Figura 93). Durante el proceso, el precursor se separaba del sitio de unión, lo que indica que los tres puentes de hidrógeno formados con el grupo carboxilo terminal no eran capaces de mantener la molécula unida a la teicoplanina, a falta del puente de hidrógeno con el grupo NH, desaparecido al sustituir el D-Ala terminal por lactato. Resultados y Discusión 224 La estructura de menor energía obtenida era 10 kJ/mol menos estable que la obtenida para el complejo teicoplanina con AcLysDAlaDAlaOH. Este resultado se corresponde con los obtenidos previamente en el chip CM4 por SPR. A pesar de estos resultados obtenidos tanto por SPR como por modelado molecular, dos de los derivados semisintéticos de la teicoplanina: la dalbavancina y el MDL 63,246, presentan una casi inapreciable, aunque existente, actividad frente a algunas cepas VRSE (Goldstein y col. 1995; Malabarba y col. 1995; Colabella y col. 2008), por lo que la principal diferencia estructural entre la vancomicina y los lipoglicopéptidos, sus cadenas hidrofóbicas deberían ser la causa de esa actividad. En el siguiente apartado se estudiará la interacción de los glicopéptidos con superficies hidrofóbicas que simulan el entorno de la superficie celular. III.4.6. Análisis de interacción de glicopéptidos con superficies hidrofóbicas mediante SPR Entre las diferencias estructurales que se pueden encontrar entre la vancomicina y lipoglicopéptidos como la teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246, destaca la presencia en estos últimos de una cadena hidrofóbica en la glucosamina unida al anillo D del heptapéptido (Esquema 26). Se ha atribuido que esta cadena permite a los lipoglicopéptidos anclarse a la membrana celular (Mackay, Gerhard, Beauregard, Westwell, y col. 1994). Para confirmarlo, se analizarón por SPR los diferentes glicopéptidos sobre un chip HPA según la metodología del apartado V.2.7.4.2.2.3. Este chip está cubierto por una superficie hidrofóbica compuesta por alcanotioles de cadena larga, por lo que es apropiado para simular el entorno de la membrana plasmática (Figura 94A). Los resultados (mostrados en la Figura 94B) sugieren que los lipoglicopéptidos presentan una interacción más fuerte con la superficie hidrofóbica de la que se obtiene co n vancomicina, causado por su cadena lipofílica, sobretodo en el caso de MDL 63,246. La vancomicina, que no Resultados y Discusión 225 presenta en su estructura cadenas de tipo hidrófobico, demostró una interacción muy baja con el chip. Figura 94. A) Representación de la superficie del chip HPA.(Dameron y col. 2007) B) Sensogramas de SPR de la unión de los glicopéptidos a la superficie hidrofóbica del chip HPA, mostrando las fases de asociación y disociación. Los resultados obtenidos en los experimentos con el chip CM4 y el HPA confirman que la efectividad farmacológica de estas moléculas está directamente relacionada con su capacidad para unirse a los precursores de peptidoglicano de la pared bacteriana, la posibilidad de formar dímeros en la superficie estabiliza esta unión y poder anclarse a la membrana celular con sus cadenas lipofílicas la refuerza. La mayor interacción de los lipoglicopéptidos semisintéticos se podría relacionar con la menor Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) que necesitan estas moléculas para actuar contra estafilococos coagulasa negativos, estreptococos y enterococos (Goldstein y col. 1995; Malabarba y col. 1997; Candiani y col. 1999; Colabella y col. 2008). El hecho de que solo dos de los lipoglicopeptidos, los derivados semisintéticos dalbavancina y MDL 63,246, presenten actividad, aunque muy baja, frente a cepas VRSE (Goldstein y col. 1995; Malabarba y col. 1995; Colabella y col. 2008), indica que la capacidad de anclaje de estas moléculas a la membrana celular, gracias a sus cadenas lipofílicas, es capaz de compensar la pérdida de afinidad por el precursor de peptidoglicano Lys-D-Ala-D-Lactato (Figura 9 del apartado I.1.3.2). A) B) Resultados y Discusión 226 En este estudio se ha demostrado, gracias a la obtención de un modelo de unión bivalente a la superficie del chip CM4, que los lipoglicopéptidos también dimerizan al unirse a los precursores de peptidoglicano, efecto que hasta ahora se consideraba exclusivo de de los glicopéptidos no lipofílicos, como la vancomicina (Figura 95A) (Gerhard y col. 1993; Mackay, Gerhard, Beauregard, Westwell, y col. 1994; Schafer y col. 1996; Beauregard y col. 1997; Nitanai y col. 2009). Los lipoglicopéptidos, además de anclarse a la membrana plásmática mediante sus cadenas hidrofóbica (Figura 95B), también dimerizan entre sí, generando un nuevo modelo de interacción no considerado hasta la fecha (Figura 95C). Estos dos efectos contribuyen de forma sinérgica a la actividad antibiótica de estas moléculas, lo que puede ser aprovechado para la búsqueda de mejores fármacos contra los organismos resistentes. Figura 95. (A) Dimerización de la vancomicina al unirse a los precursores de peptidoglicano. (B) Anclaje de los lipoglicopéptidos a la membana celular mediante su cadena hidrofóbica. (C) Modelo de unión propuesto para los lipoglicopéptidos que combina el anclaje a la superficie con la dimerización Conclusiones 227 IV. CONCLUSIONES Conclusiones 228 IV. Conclusiones Una vez presentados los resultados obtenidos y considerando los objetivos propuestos en la realización de éste trabajo, se plantean las siguientes conclusiones: 1. Se ha llevado a cabo una búsqueda de microorganismos productores glicosidasas en una colección de 122 ejemplares. De las actividades obtenidas, se purificó por primera vez una β-fucosidasa de la bacteria Cellulomonas gélida, cuya producción es inducible por celobiosa y presenta una elevada actividad en la hidrólisis de residuos de β-fucosa en condiciones mesófilas (309,63 UI/mg). 2. Se ha realizado una búsqueda de enzimas glicosidasas y glicosiltransferasas en el genoma de la bacteria Thermus thermophilus PRQ25, de la que se clonaron seis genes candidatos en E. coli BL21 y E. coli Rosetta-Gami2, consiguiendo en esta última la correcta producción de todos ellos. Se ha obtenido por primera vez de esta cepa, una enzima α-glucosidasa con elevada actividad en la hidrólisis de residuos de α-glucosa en condiciones termófilas (257 UI)mg). 3. Se ha clonado en E. coli BL21 la enzima β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382, y caracterizado sus condiciones óptimas de reacción, obteniéndose un pH de 6 y una temperatura de 37 ºC. En reacciones de transglicosidación presenta un rendimiento máximo del 51 % en la síntesis del disacárido Gal-β(1-3)-GlcNAc y del 49 % en la de Gal-β(1-3)-GalNAc a las 3h. 4. La presencia de disolventes sostenibles como co-solventes de la reacción, como los derivados de biomasa, potencian la especificidad de la reacción de transglicosidación de la enzima β-Gal-3 hacia la síntesis, llegándose a obtener un rendimiento en la producción de estos discáridos del 99 y del 95 % respectivamente con el derivado de dimetilamida S13, con una concentración óptima del co-solvente de 2 M. Conclusiones 229 5. El uso de LIs como co-solventes de la reacción de tranglicosidación con la enzima β-Gal-3, también aumenta el rendimiento de la síntesis de Gal-β(1-3)- GlcNAc y Gal-β(1-3)-GalNAc, llegándose a obtener con el [Bmim][PF6], un rendimiento del 97 % en ambos disacáridos, con una concentración óptima del co-solvente del 30%. 6. Se ha desarrollado un proceso de escalado de la producción de los disacáridos, Gal-β(1-3)-GlcNAc y Gal-β(1-3)-GalNAc en condiciones sostenibles, utilizando la enzima β-Gal-3, en presencia del derivado de biomasa S13 y el LI [Bmim][PF6]. Se han puesto a punto las condiciones de recuperación de los co- solventes, posibilitando su reutilización, y la separación de los distintos productos de reacción, obteniéndose un rendimiento final después de la purificación del 85% con S13 y del 88% con [Bmim][PF6]. 7. Se ha estudiado el efecto del derivado de biomasa S13 y el LI [Bmim][PF6] sobre la estructura de la enzima β-Gal-3, mediante técnicas de modelado molecular y espectroscopía de fluorescencia. Se ha concluido que en concentración 2 M y 30% respectivamente, estos co-solventes causan modificaciones estructurales que aumentan la afinidad del sustrato por el centro activo de la enzima, y disminuyen la afinidad de la fase acuosa por éstos, aumentando el tiempo que permanecen situados a distancia óptima de reacción. 8. Se ha inmovilizado la enzima β-Gal-3 utilizando dos estrategias, polímeros macroporosos activados con grupos epóxido y glioxil agarosas activadas con grupos aldehído, obteniéndose con éste último los mejores resultados, con una inmovilización total de la enzima y un mantenimiento de la actividad del 86% respecto a la enzima libre, llevando a cabo el proceso de inmovilización en presencia del agente estabilizador PEG-600. Conclusiones 230 9. En las reacciones de transglicosidación con la enzima β-Gal-3 inmovilizada en glioxil agarosa para la síntesis de Gal-β(1-3)-GlcNAc y Gal-β(1-3)-GalNAc, se han obtenido unos rendimientos en condiciones de solo tampón de 34 y 30 % respectivamente, con S13 del 55 y 29%, y con [Bmim][PF6] del 74 y 91% respectivamente. 10. La inmovilización de la enzima β-Gal-3 en glioxil agarosa permite la recuperación y reutilización del biocatalizador. En el reúso número 10, la enzima inmovilizada mantiene una actividad sintética reaccionando en medio con solo tampón del 55%, con S13 del 67%, y con [Bmim][PF6] del 76%. En el reúso número 20 la enzima inmovilizada del medio con solo tampón y con S13 ya no eran activas, pero la enzima con [Bmim][PF6] conservaba el 62% de actividad. En el reúso número 40, la enzima inmovilizada en medio con [Bmim][PF6], conservaba el 30% de actividad. 11. El LI [Bmim][PF6] utilizado como co-solvente de las reacciones con la enzima β-Gal-3 inmovilizada en glioxil agarosa, es el que ofrece mejores rendimientos en la síntesis de disacáridos, el que más reúsos permite, y además, al no ser soluble en agua, se puede separar del medio de reacción por centrifugación, permitiendo su reutilización y aumentando la sostenibilidad del proceso. 12. La mutagénesis dirigida de los residuos catalíticos del centro activo de la enzima β-Gal-3 conlleva su inactivación. La sustitución del glutamico-233 (residuo nucleófilo) por glicina no genera una enzima con actividad glicosintasa, y es que hasta la fecha, no existe la descripción de ningún glicosintasa derivada de ninguna glicosidasa de la familia GH35, a la que pertenece la Gal-3. 13. La mutagénesis del extremo C-terminal de la enzima TmGalA de Thermotoga maritima, y su derivada glicosintasa (TmGalA D327G), en su extremo C- Conclusiones 231 terminal para añadir una cola de histidinas, simplifica el proceso de purificación y no afecta a su actividad, comparada con su versión sin cola. 14. Se ha utilizado la enzima mutante TmGalA D327G para la síntesis de los glicoconjugados Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF y Gal-α(1-6)-Man-α-pNF, obteniéndose una conversión del sustrato de partida del 55 y del 57%, y un rendimiento en síntesis de los glicoconjugados del 35 y 25% respectivamente 15. Se ha evaluado por primera vez el efecto de los disolventes sostenibles sobre una enzima glicosintasa, utilizándolos como co-solventes de la TmGalA D327G en la síntesis de los glicoconjugados Gal-α(1-6)-Glu-α-pNF y Gal-α(1-6)-Man-α- pNF. Los derivados de biomasa han demostrado no ser co-solventes apropiados para esta glicosintasa, debido a los bajos resultados de conversión obtenidos. Por otro lado, los LI han mejorado el rendimiento de síntesis, obteniéndose los mejores resultados con el [Troma][Ntf2], obteniéndose una conversión del sustrato de partida del 98 y 97%, y un rendimiento en síntesis del 49 y del 80% respectivamente. 16. Se han utilizado dos enzimas sialiltransferasas, la α2,6SiaT de Photobacterium leiognathi y la α2,3SiaT de Photobacterium phosphoreum, para la funcionalización con derivados de ácido siálico (Neu5Ac y Neu5Gc) de seis glicodendrímeros de multivalencia variable. La enzima α2,6SiaT fue capaz de completar la reacción con todos los glicodendrímaros, pero la α2,3SiaT solo generó productos intermedios. El rendimiento final de los doce productos purificados varió entre el 42 y el 54% respecto al glicodendrímero de partida. 17. La modificación estructural de antibióticos de tipo glicopéptido mediante enzimas de tipo glicosidasa, lipasa, glucosa oxidasa y serín proteasa no ha mostrado resultado positivos, evidenciando la dificultad de encontrar enzimas que reconozcan este tipo de moléculas. Conclusiones 232 18. El análisis mediante SPR y modelado molecular de la interacción entre antibióticos de tipo glicopéptido y los derivados de peptidoglicano, y el estudio de su unión a superficies hidrofóbicas, demostró por primera vez que los lipoglicopéptidos son capaces de dimerizar entre sí, no en solución, sino cuando se unen al precursor de peptidoglicano, aumentando la estabilidad de la unión de forma sinérgica. Esto crea un nuevo modelo de acción para estos antibióticos, según el cual, la efectividad farmacológica de estas moléculas está directamente relacionada con su capacidad para unirse a los precursores de peptidoglicano de la pared bacteriana, donde la posibilidad de formar dímeros en la superficie estabiliza esta unión y poder anclarse a la membrana celular con sus cadenas lipofílicas la refuerza. Materiales y Métodos 233 V. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 234 V.1. Materiales V.1.1. Reactivos y disolventes V.1.1.1. General Todos los reactivos se obtuvieron de diferentes casas comerciales y se usaron directamente sin necesidad de purificación previa: Bio-Rad, Fisher, Fluka, Merck, Pierce, Scharlau, SDS, Sigma-Aldrich. Los estándares de azúcares y otros reactivos utilizados en la presente Tesis Doctoral, fueron, en su mayoría, adquiridos de Sigma-Aldrich: p-nitrofenol (pNF), p-nitrofenil- β-D-galactopiranósido (pNF-β-Gal), p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (pNF-β-Glu), p-nitrofenil-β-D-fucopiranósido (pNF-β-Fuc), N-acetil-D-lactosamina (Gal-β(1→4)- GlcNAc), D-(+)-galactosa (Gal), D-(+)-manosa (Man), D-(+)-fucosa (Fuc), D-(+)- fructosa (Fru), D-(+)-glucosa (Glu), clorhidrato de D-glucosamina (GluNH2), clorhidrato de D-galactosamina (GalNH2), N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc), N- acetil-D-galactosamina (GalNAc), 4-metilumbeliferil-β-D-fucopiranosido, (Fuc-β- MU), 1-desoxi-1-fluoro-α-D-galactopiranósido (Gal-α-F), β-D-galactopiranosil-azida (Gal-β-N3) fosfato dihidrógeno de sodio, fosfato hidrógeno de sodio, citrato de sodio, ácido cítrico, hidróxido de sodio. V.1.1.2. Electroforesis Los siguientes reactivos para electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) y análisis de proteínas fueron comprados a Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA): dodecil sulfato de sodio para electroforesis (SDS), tris-(hidroximetil)aminometano (Tris), glicina, persulfato de amonio (PSA), page blue 83 (tinción para geles), glicerol para uso en biología molecular y el estándar de albúmina de suero bovina 98%. Mientras que los siguientes reactivos fueron comprados a la casa comercial de BioRad: Dye Reagent (tinción para método Bradford), solución de bis acrilamida Materiales y Métodos 235 29:1 (40%), tetrametiletilendiamina (Temed), estándares de peso molecular de electroforesis (Kaleidoscope, dual color y SDS-PAGE standards broad range). V.1.1.3. Resonancia de Plasmón de Superficie Los estudios de interacción mediante esta técnica se realizaron en un aparato BIAcore-3000 (Biacore). Los datos se analizaron empleando BIAEvaluation software versión 4.1, 2003 (Biacore). Los Chips para inmovilización de ligandos en SPR, surfactantes y el kit de unión covalente (amino coupling kit) fueron de GE Healthcare, Uppsala, Suecia. V.1.1.4. Disolventes derivados de biomasa Los disolventes obtenidos de fuentes renovables derivados de glicerol (García y col. 2010): 1,3-dimetoxipropan-2-ol (S4), 2-butoxi-3-metoxipropan-2-ol (S5), 1-terc- butoxi-3-metoxipropan-2-ol (S6), 1-isopropoxi-3-(2,2,2-trifluoroetoxi)propan-2-ol (S7), 1,3-bis(2,2,2-trifluoroetoxi)propan-2-ol (S8), 2-metoxi-1,3-bis(2,2,2- trifluoroetoxi)propano (S9), 1-butoxi-3-isobutoxipropan-2-ol (S10), 1,3- dibutoxipropan-2-ol (S11), 1-(3-butoxi-2-metoxipropoxi)butano (S12), fueron proporcionados por el Prof. Dr. José I. García del Instituto de Ciencias Materiales de Aragón perteneciente al CSIC, Zaragoza. Otros disolventes fueron: i) derivados cíclicos de glicerol: 1,3-dioxan-5-ol (S1), 5- hidroxi-1,3-dioxan-2-ona, (S2) y (2,2-dimetil-1,3-dioxolan-1-il)metanol (S3) y ii) derivados de dimetilamida: 2-hidroxi-N,N-dimetilpropanamida (S13), N,N- dimetilbenzamida (S14), N,N-dimetilhexanamida (S15). Estos fueron proporcionados por la empresa COGNIS IP Management GMBH (Alemania) Materiales y Métodos 236 V.1.1.5. Líquidos Iónicos (LI) Los LI: hexafluorofosfato bistriflimida de trioctilmetilamonio [Troma][NTf2], metilsulfato de cocosalquil pentaetoxi metil amonio [CPMA][MeSO4], hexafluorofosfato de octil metil imidazolio [Omim][PF6], hexafluorofosfato de butil metil imidazolio [Bmim][PF6], tetrafluoroborato de etil metil imidazolio [Emim][BF4], tris-(pentafluoroetil)trifluorofosfato de butil metil imidazolio [Bmim][FAP], fueron fueron adquiridos de Meck-Chemicals (Alemania). V.1.1.6. Soportes para inmovilización: Los soportes utilizados para inmovilización fueron: i) Eupergit CM comprado a Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA), ii) soportes macroporosos funcionalizados con grupos epóxidos, que fueron preparados y caracterizados en nuestro grupo de investigación por el Dr. Antonio Aires como parte de su Tesis Doctoral (Aires- Trapote 2012). iii) glioxil agarosas, que fueron cedidass por el grupo del Dr. José Manuel Guisán. V.1.1.7. Glicodendrímeros Se utilizaron diferentes glicodendrímeros que fueron sintetizados y caracterizados en nuestro drupo de investigación por el Doctorando Mario Kaspar-Deir como parte de su Tesis Doctoral (en preparación) V.1.1.8. Glicopéptidos Los glicopéptidos vancomicina, teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246 fueron suministrados por el grupo del Dr. Francesco Molinari, Sección de Microbiología Industrial del Departamento de Ciencia y Tecnología Aimentaria y Microbiológica, Universidad de Estudios de Milán (Italia). Materiales y Métodos 237 V.1.2. Microorganismos y plásmidos Se llevó a cabo la búsqueda de microorganismos productores de glicosidasas a partir de una colección de 122 bacterias del grupo de Biotransformaciones de la Universidad Complutense (Colección BTG). Estos organismos no estaban identificados por lo que no se conocía su especie, condiciones óptimas de crecimiento o a existencia de actividad frente a diferentes carbohidratos. La cepa PRQ25 de Themus thermophilus (da Costa 2001), fue cedida por el grupo del Dr. José Berenguer. El genoma de esta cepa ha sido secuenciado y anotado por su grupo de investigación (Alvarez y col. 2011). La cepa ATCC 31382 de Bacillus circulans fue adquirida de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Los procedimientos relativos al clonaje y mutagénesis de enzimas se realizaron en el laboratorio del Dr. José Berenguer del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO) ubicado en el Campus de la Universidad Autónoma de Madrid (UAM), con la ayuda de la Dra. Laura Álvarez y el Dr. Aurelio Hidalgo. La cepa de Escherichia coli DH5α (Hanahan 1983) se utilizó para amplificar y reproducir plásmidos. Las enzimas recombinantes se expresaron en E. coli BL21 y en E. coli Rosetta-Gami2 (Tabla 28). Como vectores se utilizaron los plásmidos pET28b(+), pET22b(+) y el pET24d(+) (Tabla 29). Materiales y Métodos 238 Tabla 28. Cepas de Escherichia coli empleadas para la transformación con plásmidos recombinantes Microorganismo Características genotípicas o fenotípicas destacables Referencia Escherichia coli DH5α F- φ80dlacZ∆M15 endA1 recA1 hsdR17 (rk -mK +) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 ∆(lacaya-argF)U169 λ- Novagen Escherichia coli BL21 (DE3) F- ompT hsdSB (rB -mB -) gal dcm (DE3) Invitrogen Escherichia coli Rosetta- Gami2 Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F′[lac+ lacIq pro] gor522::Tn10 trxBpRARE2 (CamR, StrR, TetR) Novagen Tabla 29. Plásmidos empleados para la obtención de proteínas recombinantes. Plásmido Características Referencia pET28b(+) KanR f1Ori T7p lacI tamaño: 5,3kb Novagen pET22b(+) AmpR f1Ori T7p lacI tamaño: 5,5kb Novagen pET24d(+) KanR f1Ori T7p lacI tamaño: 5,3kb Novagen V.1.3. Oligonucleótidos sintéticos Los oligonucleótidos sintéticos utilizados fueron suministrados por Sigma (EEUU). En la Tabla 30 se muestran los oligos empleados para la amplificación de los genes de Thermus thermophilus PRQ25, Bacillus circulans y Thermotoga maritima. Materiales y Métodos 239 Tabla 30. Oligonucleótidos utilizados para amplificación en PCR. NOMBRE SECUENCIA PRQ25_0443FW 5’- AAAACATATGGCGCCTTTGAGGATGAAG-3’ PRQ25_0443RV 5’- AAAAGAATTCATCGCGTCCAGAAGAG-3’ PRQ25_0528FW 5’- AAAACATATGGACCCCCTCTGGTACAAG-3’ PRQ25_0528RV 5’- AAAAGAATTCTAGGCTTTACCGGCCTTG–3’ PRQ25_0794FW 5’-AAAACATATGGCGCGCTTCGCCC–3’ PRQ25_0794RV 5’-AAAAGAATTCAAGCCCCCTCTTGGAGGTAG–3’ PRQ25_1525FW 5’-AAAACATATGTTCGGCCTCGGGTGG–3’ PRQ25_1525RV 5’-AAAAGAATTCACGGCCGCCCTCC–3’ PRQ25_1926FW 5’-AAAACATATGGGCGTTATGCGCGTG–3’ PRQ25_1926RV 5’-AAAAGAATTCCTAGCCCAAGGCCTCC–3’ PRQ25_2319FW 5’-AAAACATATGCACCAGCCCCCTTACG–3’ PRQ25_2319RV 5’-AAAAGAATTCTAGGGCCAGGCCACG–3’ B-gal-3-FW 5’-GAATAACACATAATTTACGGG-3’ B-gal-3-28RV 5’-ATGCAAGCTTATTTCAAGGTG-3’ B-gal-3-22RV 5’-TTTAAGCTTAGGTGTTTTTGGT-3' B-gal-3-E157G-FW 5’-ATTGCTTTGCAAATTGAGAATGGGTACGGAAGTTTTGGAAATGAC-3’ B-gal-3-E157G-RV 5’-GTCATTTCCAAAACTTCCGTACCCATTCTCAATTTGCAAAGCAAT-3’ B-gal-3-E233G-FW 5’-CTCCTCTAATGTGCATGGGATTTTGGCATGGTTGGTT-3’ B-gal-3-E233G-RV 5’-AACCAACCATGCCAAAATCCCATGCACATTAGAGGAG-3’ TmGalA-HisTag-FW 5'-ACGAAGAGGGTGAGAGAGAAAAGCTTGCGGC-3' TmGalA-HisTag-FW 5'-GCCGCAAGCTTTTCTCTCTCACCCTCTTCGT-3' En verde se indica la diana para la enzima de restricción NdeI, en azul la diana para la enzima de restricción EcoRI y en morado la diana para la enzima de restricción HindIII V.1.4. Enzimas Las enzimas empleadas en este trabajo fueron: - β-fucosidasa de Cellulomonas gélida, producida en el laboratorio. - α-galactosidasa de Thermus thermophilus PRQ25, producida en el laboratorio. - β-Gal-3 de Bacillus circulans ATCC 31382, producida en el laboratorio. Materiales y Métodos 240 - TmGalA y TmGalA D327G de Thermotoga maritima, plásmidos cedidos por el grupo del Dr. Marco Moracci, del Instituto de Bioquímica de Proteínas de Nápoles (Italia) y producida en el laboratorio. - α2,6SiaT de Photobacterium leiognathi, α2,3SiaT de Photobacterium phosphoreum y CSS de Neisseria meningitidis, producidas durante una estancia científica en el laboratorio del Dr. Woody Fessner, Instituto de Química Orgánica y Bioquímica de la Universisad de Darmstadt (Alemania). - Fosfatasa alcalina de mucosa intestinal bovina, Fluka. - Pirofosfatasa inorgánica, Sigma-Aldrich - Ácido N-acetil neuramínico aldolasa, Sorachim. - Lipasas de Candida rugosa y Pseudomonas stutzeri, Sigma-Aldrich. - Subtilisina de Bacillus subtilis, Sigma-Aldrich. - Glucosa oxidasa de Aspergillus niger, Sigma-Aldrich. - Catalasa, Sigma-Aldrich. - N-acetil-hexosaminidasa: Canavalia ensiformis, Aspergillus oryzae y riñón bovino, Sigma-Aldrich. - Pfu polimerasa y Tth polimerasa, Promega. - Endonucleasas de restricción DpnI, EcoRI, HindIII, NdeI, New England Biolabs. V.2. Procedimientos generales V.2.1. Métodos microbiológicos V.2.1.1. Medios de cultivo La composición de los distintos medios de cultivo usados fue la siguiente: -Caldo Cerebro-corazón enriquecido con glucosa: Medio rico utilizado para revitalizar cepas microbianas 30 g/l de infusión cerebro-corazón. Glucosa 2 % Materiales y Métodos 241 El medio fue esterilizado en autoclave (modelo Presoclave 75 de P Selecta) a 115 ºC durante 15 min y conservado a 4 ºC. -Medio LB (Luria-Bertani) (Miller 1972): Medio rico utilizado para el crecimiento de cepas bacterianas Peptona 1 % Extracto de Levadura 0,5 % Cloruro sódico 0,5 % El pH del medio se ajustó a 7, posteriormente fue esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 20 min y conservado a 4 ºC. -Medio LB enriquecido con glucosa: Medio rico en el que la glucosa se usa para reprimir catabólicamente la expresión de la RNA polimerasa del fago T7 bajo el control de Plac, y así tener el control sobre el momento de la expresión de la proteína y poder evitar, en la medida de lo posible, reacciones de toxicidad durante el crecimiento del cultivo. Peptona 1 % Extracto de Levadura 0,5 % Cloruro sódico 0,5 % Glucosa 0,5 % El pH del medio se ajustó a 7, posteriormente fue esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 20 min y conservado a 4 ºC. -Medio LB-agar: Medio sólido utilizado para el crecimiento en placa. 30 gr/l de LB-agar El medio, introducido en una botella de vidrio pyrex, fue esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 20 min. Una vez esterilizado se dejó enfriar hasta unos 60 ºC, fue dispensado en placas petri estériles y conservado a 4 ºC. Materiales y Métodos 242 -Medio TB: (Ramirez-Arcos y cols.,1998) Triptona 0,8 % Medio utilizado para el crecimiento de microorganismos termófilos Extractode levadura 0,4 % Cloruro Sódico 0,3 % El pH del medio se ajustó a 7,5, posteriormente fue esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 20 min y conservado a 4 ºC. -Medio SOC (Maniatis y col. 1982): Medio utilizado para la expresión de la resistencia a antibióticos después de una transformación. Triptona 2 % Extracto de levadura 0,5 % Cloruro sódico 0,05 % Cloruro potásico 0,02 % El pH del medio se ajustó a 7, posteriormente fue esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 20 min. Una vez enfriado se añadieron por microfiltración y en condiciones de esterilidad 10 mL de glucosa 2 M y 10 mL de MgCl2 1 M. V.2.1.2. Revitalización y mantenimiento de la colección BTG V.2.1.2.1. Revitalización Los microorganismos fueron suministrados en forma de criotubos, en una suspensión con glicerol al 20% y congelados a -80 ºC. Se descongeló cada criotubo y se tomó una alícuota de 100 µl que fue introducida en un matraz con 15 ml de medio cerebro- corazón enriquecido con glucosa. Los matraces fueron incubados a una temperatura de 30 ºC y a una agitación de 180 revoluciones por minuto (r.p.m.) en un incubador Unitron HT Infors con agitación orbital. Los matraces fueron observados cada 24 horas para ver si había aparecido la turbidez característica del crecimiento microbiano. Materiales y Métodos 243 De cada matraz crecido se tomó una alícuota de 100 µl y se traspasó a una placa de medio LB-agar y extendida para su crecimiento en césped, para lo que se incubó en estufa a 30 ºC. Posteriormente se realizó una inoculación en placa mediante la técnica de agotamiento de asa para comprobar la pureza de los cultivos. V.2.1.2.2. Conservación de colección BTG Se tomó una alícuota de 100 µl de cada matraz crecido en caldo cerebro- corazón enriquecido con glucosa, la cual se utilizó para inocular un matraz con 15 ml de medio LB líquido, incubado a 30 ºC y a 180 r.p.m durante 24 horas en un incubador Unitron HT Infors con agitación orbital. -Congelación: En criotubos estériles, en condiciones de esterilidad se introdujeron 800 µl del medio crecido y se añadieron 200 µl de glicerol estéril (para una concentración final del 20 %). Cinco criotubos de cada microorganismo se almacenaron a -20 ºC y otros tres se almacenaron a -80 ºC. -Liofilización: En condiciones estériles se introdujeron 800 µl del medio crecido y se añadieron 200 µl de leche desnatada sin calcio, utilizando algodón estéril como tapón. Los criotubos se congelaron a -80 ºC y posteriormente fueron liofilizados. En condiciones estériles se sustituyó el algodón por un tapón de rosca estéril. Se conservaron a 4 ºC. V.2.1.3. Crecimiento de microorganismos V.2.1.3.1. Colección BTG En condiciones estériles, un matraz de 250 ml con 50 ml de medio LB se inoculó con 100 µl del contenido de un criotubo guardado a -20 ºC Se incubó a 30 ºC y a 180 r.p.m. durante 16 horas. Materiales y Métodos 244 V.2.1.3.2. T. Thermophilus PRQ25 En condiciones estériles, un matraz de 250 ml con 50 ml de medio TB diluido a la mitad, se inoculó con el contenido de un criotubo guardado a -20 ºC Se incubó a 65 ºC y a 180 r.p.m. durante 16 horas. V.2.1.3.3. E. coli recombinante En condiciones estériles, un matraz con medio LB se inoculó con 100 µl del contenido de un criotubo guardado a -80 ºC Se incubó a 37 ºC y a 180 r.p.m. durante 16 horas. Cada matraz llevaba el antibiótico de selección para el cual la cepa de E. coli recombinante presentaba resistencia, según las concentraciones de la Tabla 31 Tabla 31. Atibióticos utilizados para el crecimiento de cepas de E. coli recombinante. Antibiótico Concentración (mg/ml) Ampicilina 100 Kanamicina 30 Cloranfenicol 20 V.2.1.4. Transformación bacteriana V.2.1.4.1. Choque térmico Las células competentes de E. coli se prepararon según el método descrito por Inoue (1990) y se conservaron en alícuotas de 50 µl en tubos de 1,5 mL a -80⁰C. La transformación de las cepas E. coli DH5α y BL21 se realizó siguiendo una modificación del método descrito por Inoue (1990). Se tomó una alícuota de células competentes, manteniéndola en todo momento a 4⁰C, y se añadió el DNA purificado en un volumen no superior al 5% del total. Se mantuvieron las células a 4⁰C durante 30 min y a continuación se introdujeron en un baño con agua a 42⁰C, sin agitación, durante 90 segundos, transfiriéndose inmediatamente a 4⁰C. A continuación se añadieron 800 µL de medio LB a las células, se mezclaron suavemente por inversión, Materiales y Métodos 245 y se incubaron a 37⁰C y 150 r.p.m. para permitir la expresión de la resistencia al antibiótico, durante una hora en caso de la ampicilina y dos horas en caso de la kanamicina. Transcurrido el tiempo, se pipetearon distintos volúmenes en placas conteniendo el antibiótico de selección adecuado, añadiendo esferas de vidrio para la correcta dispersión del líquido sobre la superficie. Tras retirar las esferas, las placas se incubaron a 37 ºC. V.2.1.4.2. Electroporación La electroporación fue el método preferente para la transformación en E. coli Rosetta-Gmai2. La preparación de células electrocompetentes se realizó de acuerdo con el método propuesto por el fabricante del electroporador (Micropulser, BioRad). Para ello, se centrifugó un cultivo de 500 mL en LB cuando alcanzó una DO600= 0,5-0,7. (Nota: a partir de este momento, todo el proceso se realizó lo más cerca posible de 0⁰C) Las células se resuspendieron suavemente en 500 mL de glicerol 10% (p/v), y se centrifugaron a 4.000 x g durante 15 min. Se repitió el proceso con 250, 20 y 1 mL de glicerol 10% y se distribuyó el volumen final en alícuotas de 50 µL para su conservación a -80⁰C. La transformación se realizó añadiendo DNA purificado y desalado a 50 µL de células electrocompetentes, manteniendo la mezcla a 4⁰C durante 30 min, tras lo cual se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2 cm previamente enfriada. El programa de electroporación se eligió siguiendo las indicaciones del fabricante, evitando pulsos de más de 5 ms. Tiempos más largos indican una elevada concentración de sales en la muestra y producen daños en las células, reduciéndose dramáticamente la eficiencia de transformación. Inmediatamente tras el pulso, se añadieron 800 µL de medio SOC atemperado a las células, se transfirieron a tubos de 1,5 mL y se cultivaron a 37⁰C para permitir la expresión de la resistencia al antibiótico, durante una hora en caso de la ampiclina y dos horas en caso de la kanamicina. Transcurrido el tiempo, se pipetearon distintos volúmenes en placas conteniendo el antibiótico de selección adecuado, añadiendo esferas de vidrio para la Materiales y Métodos 246 correcta dispersión del líquido sobre la superficie. Tras retirar las esferas, las placas se incubaron a 37 ºC. V.2.1.5. Expresión de proteínas recombinantes en E. coli. Una vez obtenidas, las construcciones fueron utilizadas para transformar células de E. coli BL21 (DE3) y E. coli Rosetta-Gami2, se crecieron en medio LB a una temperatura que osciló entre los 21 y los 37ºC en función de las características de la proteína, en presencia del antibiótico frente al que la cepa presentara resistencia. Al medio se añadió un 0,5% de glucosa para reprimir catabólicamente la expresión de la RNA polimerasa del fago T7 bajo el control de Plac, y así tener el control sobre el momento de la expresión de la proteína y poder evitar, en la medida de lo posible, reacciones de toxicidad durante el crecimiento del cultivo. Cuando los cultivos alcanzaron una DO550 de 0,6-0,9, una vez más dependiendo de la expresión de la proteína, se indujo la expresión del promotor Plac con una concentración de IPTG de 1 mM y se mantuvo en agitación entre 5 y 16 h, a la temperatura correspondiente. V.2.1.6. Rotura de microorganismos La rotura de células de los microorganismos utilizados se realizó en un procesador ultrasónico (sonicador) modelo LABSONIC M de la casa Sartorius y en un sonicador Branson Sonifier 450. La ruptura se realizó en 10 ciclos de 25 segundos en tubos de vidrio (Corex) o en su defecto de plástico (Falcon). En todos los casos se realizó sobre un baño de hielo para evitar calentamientos. La intensidad de cada sonicación fue de aproximadamente 12.000 microns (intensidad referida entre pico y pico). V.2.2. Manipulación de DNA V.2.2.1. Preparación de DNA total El DNA de bacteriano fue aislado a partir de 2-10 ml de cultivo en fase estacionaria, siguiendo el protocolo descrito en el kit comercial DNeasy Blood & Tissue de Materiales y Métodos 247 Qiagen, siguiendo el protocolo del fabricante. Mediante este protocolo se obtienen habitualmente fragmentos de DNA de un tamaño medio de 25 kpb, apropiados para ser utilizados como molde en ensayos de PCR. V.2.2.2. Preparación de DNA plasmídico de E. coli La obtención del DNA plasmídico se realizó a partir de cultivos saturados de E. coli, utilizando el método de lisis alcalina (Sambrook 1989) o bien, cuando la pureza requerida para el DNA era mayor, utilizando el kit Wizard Plus SV Minipreps de Promega. V.2.2.3. Técnicas de amplificación de DNA por reacción en cadena de polimerasa (PCR) Para la amplificación de DNA se utilizó la DNA polimerasa de de T. thermophilus (Biotools B&M), y en determinados casos se añadió la de Pyrococcus furiosus (Roche Molecular Biochemicals o Biotools B&M), en una relación 3:1 para aumentar la fidelidad del fragmento amplificado. Se utilizó 1 unidad de la enzima, con el tampón suministrado por la casa comercial, entre 0 y 8 % DMSO, entre 3 y 5 mM de Cl2Mg, 0,5 mM de una mezcla igualada de dNTP y 50 pmol de cada oligonucleótido (Isogen y Sigma-Aldrich), cuya secuencia se muestra en la Tabla 30 del apartado V.1.3, con un volumen final de reacción de 50 μl. Para la amplificación se ha utilizado el modelo iCycler de Bio-Rad. Las condiciones de PCR fueron optimizadas siguiendo las recomendaciones descritas por Ausubel y colaboradores (Ausubel 1994). V.2.2.4. Clonaje de genes La digestión del DNA, tanto del procedente de una PCR como del plasmídico, fue realizada siguiendo las condiciones de tampón, temperatura y concentración, recomendadas por la casa suministradora para cada una de las diferentes enzimas de restricción utilizadas, NdeI en 5’ y HindIII o EcoRI en 3’ (MBI Fermentas). La Materiales y Métodos 248 ligación de fragmentos de DNA fue llevada a cabo con la enzima DNA ligasa del bacteriófago T4 (New England Biolabs), utilizando las condiciones recomendadas por la casa comercial, con 0,5 unidades en un volumen final de 10 μl, ajustando la relación vector:inserto a 1:4. Las muestras fueron incubadas a 16 ºC durante toda la noche o a temperatura ambiente durante 2 horas. Estas ligaciones fueron utilizadas para transformar 50 μl de células competentes (apartado V.2.1.4). V.2.2.5. Protocolo Quick-Change para generación de mutantes puntuales Para la realización de mutaciones puntuales, se utilizó el kit QuikChange II Site- Directed mutagenesis Kit (Stratagene). Se amplificó por PCR (apartado V.2.2.3) el gen a mutar junto con el plásmido correspondiente en el que estuviera clonado, con la enzima Pfu plus (Eurx), utilizando los oligonucleótidos correspondientes portadores de la mutación (Tabla 30). Las condiciones de PCR utilizadas se muestran en la Tabla 32. Una vez finalizada, se utilizó la enzima de restricción DpnI, que digiere DNA metilado, para eliminar el DNA molde no mutado, en una reacción que dura 2 horas a 37 ºC. A continuación se transformaron células de E. coli DH5α con el resultado de la digestión y se seleccionaron los mutantes (apartado V.2.1.4.1). Tabla 32. Condiciones de PCR utilizadas en el protocolo Quick-Change. Ciclo 1: (1x) - 95 ºC 2 min Ciclo 2: (16x) - 94 ºC 0,5 min - 55 ºC 1 min - 68 ºC 1 min por kpb Después del ciclo 10 se incrementa en 20 s cada ciclo. Ciclo 3: (1x) - 68 ºC 10 min Ciclo 4: (1x) - 4 ºC ∞ min Componente Concentración final Tampón Pfu 10X 10 % (v/v) Pfu plus polimerasa 0,5 μl dNTPs 1 mM (cada uno) Oligonucleótido FW 0,5 mM Oligonucleótido Rv 0,5 mM DNA molde 0,3 ng.μl-1 Materiales y Métodos 249 DMSO 2 % (v/v) mqH2O hasta 50 μl V.2.2.6. Secuenciación de DNA El DNA (plasmídico o procedente de PCR) fue secuenciado de forma automática mediante una variante del método de terminación por dideoxinucleótidos (Sanger y col. 1977) en el servicio de Secuencación de la Unidad de Genómica del Parque Científico de Madrid. V.2.2.7. Electroforesis de en geles de agarosa y purificación de DNA Para analizar el peso molecular de los plásmidos, fragmentos y ligaciones de DNA se utilizó la técnica de electroforesis en geles de agarosa. Para ello se midieron 40 mL del tampón TAE 1X (Tris 40 mM, EDTA disódica 2 mM y ácido acético glacial 0,1142 % v/v), se les adicionaron 0,32 g de agarosa y se calentó la mezcla hasta fundir. Antes de que la disolución gelificara, se le adicionaron 10 μL de bromuro de etidio (1 mg/mL). Se vertió la mezcla en la cámara ensamblada y se enfrió hasta endurecer. Se adicionó disolución de TAE 1X hasta cubrir ligeramente el gel de agarosa. Se tomaron entre 5 y 15 μL de tampón de carga y se mezclaron con 5 μL de muestra de DNA. Se colocó la muestra de DNA-Tampón de carga en los pocillos del gel. Se colocó una muestra de marcadores de DNA en uno de los pocillos. Finalmente las muestras se sometieron a una diferencia de potencial eléctrico de 90 V para iniciar la electroforesis. Los resultados se revelaron con luz ultravioleta. La purificacion de fragmentos de DNA de bandas cortadas de los geles de agarosa se llevo a cabo mediante el kit PCR-Prep QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen), siguiendo las instrucciones del fabricante. V.2.3. Manipulación de proteínas V.2.3.1. Cuantificación de Proteínas Materiales y Métodos 250 Se determinó la cantidad de proteína presente en las disoluciones según el método de Bradford (1976), que se basa en la variación en el espectro de absorción visible del colorante azul brillante de Coomasie G-250 en presencia de una proteína. La adsorción de proteína provoca que el valor del máximo de absorción se desplace de 465 nm a 595 nm. La preparación del reactivo de Bradford se llevó a cabo partiendo de un concentrado comercial de Bio-Rad (Dye reagent) siguiendo las instrucciones del fabricante (dilución 1:5 para el método estándar y sin dilución para el método micro). Como patrón de proteína se utilizó una solución de albúmina de suero bovina (BSA) de concentración 0,75 mg/mL en agua milli Q o en el tampón de muestra, según fuera el caso. Se realizaron disoluciones sucesivas de la proteína patrón como se muestra en la Tabla 33, completándose con agua milliQ (o tampón) hasta un volumen total de 0,1 mL. A continuación se añadieron 5,00 mL de reactivo de Bradford y se homogenizó la mezcla. La adsorción de la proteína al colorante se produce instantáneamente siendo máxima y estable entre los 5 y 20 primeros minutos. Todos los ensayos se realizaron a temperatura ambiente y por triplicado según la tabla de dilución utilizada (Tabla 33). Tabla 33. Disoluciones sucesivas de proteína patrón para realizar la recta de calibrado en la determinación de proteínas por el método de Bradford (1976). Nº µµµµL de Proteína (1 mg/mL) μL de Agua MilliQ mL de Bradford BSA (μg/mL) 0 * 0 100 5,00 0 1 20 80 5,00 2,94 2 30 70 5,00 4,41 3 40 60 5,00 5,88 4 50 50 5,00 7,35 5 60 40 5,00 8,82 6 70 30 5,00 10,29 7 80 20 5,00 11,76 Materiales y Métodos 251 8 90 10 5,00 13,23 9 100 0 5,00 14,71 * El valor de cero se midió para establecer el blanco de trabajo en la recta de calibrado, pero este valor no se representó puesto que no está ubicado en el rango lineal de éste método. Los resultados de absorbancia en función de la concentración de proteína, en μg/ml para el volumen final de 5,10 mL, se ajustaron por regresión lineal al modelo de una recta de primer grado, cuya linealidad se valoró según el valor de R2. V.2.3.2. Electroforesis de proteínas V.2.3.2.1. Electroforesis de en geles de poliacrilamida SDS-PAGE Para analizar la pureza de las proteínas y el peso molecular de las mismas, utilizó la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida basada en el método de Laemmli (1970). Se usaron geles de separación de 12,5 % de acrilamida preparados con 1,25 de bis:acrilamida (29:1 al 40%) respectivamente, 1 mL de tampón Tris-HCl pH 8,80 1,50 M, 1,69 de agua destilada, 40 µL de SDS al 10%, 10 µL de Temed y 30 µL de PSA. Para los geles de acrilamida de 7,5% se utilizó 0,75 mL de bis-acrilamida y 2,19 mL de agua destilada, las demás concentraciones de reactivos fueron iguales a las descritas anteriormente. El gel concentrador utilizado fue al 3% de acrilamida. Se preparó utilizando 150 µL de bisacrilamida (29:1 al 40 %), 1 mL de tampón Tris- HCl pH 6,80 0,50 M, 822 µL de agua destilada 18 µL de SDS al 10 %, 5 µL de Temed y 15 µL de PSA. Las muestras con proteínas se mezclaron en proporción 1:1 (v:v) con tampón de carga, que se preparó con 773 µL de SDS al 10 %, 613 µL de Tamón Tris-HCl 0,50 M pH 6,80, 233 µL de β-mercaptoetanol, 400 µL de glicerol y 0,8 mg de azul de bromofenol. Una vez mezcladas con el tampón de carga, se calentaron a 96ºC durante 10 min y se centrifugaron 3 min. El líquido remanente se cargó en los geles y se corrieron a 175V en tampón de electroforesis (30,3 g SDS, 144 g tris, 10 g de glicina, Materiales y Métodos 252 1L de agua destilada). El revelado de los geles se alcanzó con una disolución del tinte comercial Page Blue 83 al 0,1% (metanol: agua: ácido acético, 5:4:1) y se destiñó con la misma mezcla sin Page Blue 83. V.2.3.2.2. Electroforesis de proteínas en condiciones nativas Se llevó a cabo siguiendo el mismo procedimiento que en el apartado V.2.3.2.1 suprimiendo el uso de agentes desnaturalizantes (SDS y β-mercaptoetanol) y sin llevar a cabo la desnaturalización a 96 ºC de las muestras previa a la carga del gel. V.2.3.3. Purificación de β-fucosidasa de C. gelida V.2.3.3.1. Precipitación fraccionada con sulfato amónico Esta técnica se utilizó como primer paso para la purificación de la enzima β- fucosidasa de C. gélida. V.2.3.3.1.1 Actividad en sulfato amónico Puesto que las proteínas se precipitaron con sulfato amónico en distintos porcentajes de concentración, es necesario comprobar que esta sal no provoca la inactivación de la enzima. Para ello se llevó a cabo la reacción tal y como se explica en el apartado V.2.4.1.2, habiendo añadido previamente una concentración del 50 % de sulfato amónico al tampón de trabajo. V.2.3.3.1.2 Precipitación fraccionada con sulfato amónico Se añadieron concentraciones crecientes de sulfato amónico para precipitar las proteínas de forma fraccionada. Se tomaron 10 ml de solución enzimática con 1 mg/ml de proteína en tampón fosfato de sodio 30 mM, pH 7. En la Tabla 34 se observan las cantidades de sulfato amónico necesarias para conseguir cada porcentaje de saturación. En el primer paso (20 %), este fue añadido lentamente a la solución enzimática, en condiciones de agitación leve y a 4 ºC. Una vez disuelto Materiales y Métodos 253 completamente se dejaron transcurrir 30 min y se centrifugó a 15.000 r.p.m a 4 ºC durante 30 min en una centrífuga RC6 Plus de Sorvall, con rotor F14S-6x250. El precipitado se resuspendió en tampón fosfato de sodio 30 mM, pH 7 y conservado 4 ºC. En el sobrenadante se continuó añadiendo sulfato amónico para alcanzar el siguiente punto de saturación. Tabla 34. Cantidad de sulfato amónico que debe ser añadido para alcanzar los distintos porcentajes. Los gramos indicados deben ser añadidos al porcentaje inmediatamente anterior. Sulfato de amonio Porcentaje de saturación 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Gramos a añadir a 1l de solución 106 55 56 58 60 62 65 67 70 Posteriormente, todas las fracciones fueron centrifugadas a 5000 r.p.m. en tubos vivaspin de Sartorius con un tamaño de poro de 30 kDa en una centrífuga Universal 320R, de Hettich, con rotor 1620A-6x130g, y lavadas con tampón fosfato 30 mM, pH 7 para retirar los restos de sulfato amónico. Se midió su actividad por triplicado en lector de placas multipocillo Expert Plus de Asys a 405 nm. V.2.3.3.2. Cromatografía de intercambio iónico Esta técnica se utilizó como segundo paso para la purificación de la enzima β- fucosidasa de C. gélida, después de la precipitación fraccionada en sulfato amónico. V.2.3.3.2.1 Estudio del efecto de la fuerza iónica sobre la actividad enzimática Puesto que una vez unidas las proteínas a la resina de purificación, estas son eluídas con concentraciones crecientes de cloruro sódico, lo primero que se realizó fue un estudio sobre la actividad de la β-fucosidasa en presencia de esta sal. Para ello se llevó a cabo la reacción tal y como se explica en el apartado V.2.4.1.2, habiendo añadido previamente una concentración de 1M de cloruro sódico al tampón de trabajo. Materiales y Métodos 254 V.2.3.3.2.2 Selección del tipo de resina de intercambio iónico Se utilizaron cuatro tipos de resinas: Q-sefarosa, DEAE-sefarosa, S-sefarosa y CM- sefarosa. Se preparó una solución enzimática en tampón fosfato 30 mM pH 7 con la cantidad suficiente de polvo liofilizado para conseguir una concentración de proteínas de 1 mg/ml. En un eppendorf de 2 ml se añadieron 1400 µl de esta solución enzimática y 600 µl de cada resina, equilibrada en tampón fosfato de sodio 30 mM, pH 7, el cual fue sometido a agitación leve durante 60 min a 4 ºC. Transcurrido ese tiempo se centrifugó a 10.000 r.p.m. durante 10 segundos a 4 ºC (Centrífuga Mikro 120, Hettich). La resina fue lavada dos veces con tampón, centrifugando como anteriormente y conservando los sobrenadantes de los dos lavados (lavado 1 y lavado 2). A la resina se le añadieron 1400 µl de tampón de elución (tampón fosfato 30 mM, pH 7 con cloruro sódico 1M) y se sometió a agitación leve durante 30 min a 4ºC. Se centrifugó y se conservó el sobrenadante (eluido 1). Se repitió el proceso de elución (eluido 2). Se midió la actividad en todas las muestras anteriores, junto con una pequeña cantidad de la propia resina. V.2.3.3.2.3 Elución con concentraciones crecientes de cloruro sódico Se siguió el protocolo del apartado V.2.3.3.2.2 con DEAE-sefarosa y Q-sefarosa hasta el paso de la elución, en el que se aplicaron tampones de elución con concentraciones crecientes de cloruro sódico: 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1 M. Se midió la actividad en cada eluído. Posteriormente se realizó con las siguientes concentraciones de cloruro sódico: 0,2 0,25, 0,3, 0,35 y 0,4 M V.2.3.3.3. Cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-150 Esta técnica se utilizó como tercer paso para la purificación de la enzima β- fucosidasa de C. gélida, después de la cromatografía de intercambio iónico. Se utilizó resina Sephadex G-150 superfino. Este gel fue previamente hidratado con agua miliQ y equilibrado con tampón fosfato 30mM, pH 7 siguiendo las Materiales y Métodos 255 instrucciones del fabricante. Posteriormente se empaquetó un volumen de 50 ml en una columna cromatográfica de 75 x 1,8 cm y se eluyó con dos volúmenes de tampón. El flujo de elución fue de 0,3 ml/min. Se cargó en la columna un volumen de 3 ml de la muestra proveniente de la cromatografía de intercambio iónico (apartado anterior). Se recogieron fracciones de 2 ml en las que se midió su absorbancia a 280 nm y su actividad β-fucosidasa (apartado V.2.4.1.2). V.2.3.3.4. Detección de la banda correspondiente a la β-fucosidasa de C. gelida en electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas Se llevó a cabo una electroforesis en condiciones nativas (apartado V.2.3.2.2) con 10 µl de la muestra purificada en el apartado anterior, con una concentración de 1 mg/ml. Una vez finalizada, se cortó el carril del gel y se incubó en 5 ml de tampón fosfato de sodio 50 mM con una concentración 10 mM del sustrato Fuc-β-MU, a 30 ºC durante 30 min en agitación leve. Pasado el tiempo, el gel se reveló bajo luz UV. V.2.3.4. Purificación de proteínas recombinantes mediante cromatografía de afinidad Las enzimas recombinantes con colas de histidina expresadas en E. coli se purificaron por medio de cromatografía de afinidad Ni(II)–agarosa. Este procedimiento se realizó a temperatura ambiente en el dispositivo para purificación de proteínas (Biologic LP, BioRad) sobre una serie de columnas de afinidad IMAC (del inglés “immobilized metal affinity cromatography”), cargadas con iones de Ni(II), se utilizaron los siguientes tampones (por orden de elución) como fase móvil: - Tampón de adhesión: 300 mM de NaCl, pH 8,00 de fosfato de sodio 50 mM y 1 mM de imidazol. - Tampón de lavado de 300 mM de NaCl, pH 8,00 de fosfato de sodio 50 mM y 10 mM de imidazol. Materiales y Métodos 256 - Tampón de elución 300 mM de NaCl, pH 8,00 de fosfato de sodio 50 mM y 500 mM de imidazol. La purificación se llevó a cabo por métodos convencionales detectando la presencia de proteínas con luz UV (280nm) Se centrifugaron los cultivos de bacterias a 6500 r.p.m. durante 10 min a 4 ºC. El pellet obtenido se resuspendió con tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7. Las células fueron resuspendidas y se rompieron por sonicación con las condiciones descritas en el apartado V.2.1.6. Los extractos obtenidos se centrifugaron a 15.000 r.p.m. por 30 min a 4 ºC. Se eliminó el sólido generado y se calentó el líquido durante 30 min a 70 ºC para eliminar por precipitación térmica proteínas de E. coli desnaturalizadas. Después se eliminó el precipitado por centrifugación durante 30 min a 4 ºC y 15.000 r.p.m.. El extracto celular generado, conocido como “extracto clarificado” se hizo pasar por columnas cargadas de Ni(II) en un aparato de purificación de proteínas Biologic LP (BioRad) siguiendo el protocolo dado por el fabricante. Se eluyeron como máximo, el equivalente a 500 ml de cultivo bacteriano en forma de extracto celular sobre 3 columnas de 1 ml, disuelto en tampón fosfato de sodio 50 mM, 300 mM de NaCl y pH 8,00. La elución dio inicio después de equilibrar la columna con tampón de adhesión. Se cargó la muestra de extracto celular a un flujo de 0,5 mL/min. Una vez finalizado el proceso de carga de la muestra, se realizó la elución con tampón de lavado, que debido a su concentración de imidazol (10 mM) facilitó la eliminación de otras proteínas que pudieran tener cierta afinidad por el Ni(II). Finalmente se lavó la columna con tampón de elución obteniéndose una serie de fracciones enriquecidas en proteínas recombinantes con cola de histidinas. Las fracciones con la enzima recombinante (His6tag) se desalinizaron y se concentraron con un tubo de ultra centrifugación Amicon (Millipore) a 4.000 r.p.m. durante 10 min a 4 ºC, repitiendo la desalinización tres veces con tampón fosfato de sodio 50 Materiales y Métodos 257 mM, pH 7,00. Posteriormente, se determinó la actividad relativa de cada proteína purificada y se analizó su pureza por electroforesis SDS-PAGE. V.2.4. Ensayos enzimáticos V.2.4.1. Determinación de la actividad enzimática de glicosidasas Para determinar la actividad hidrolítica de las diferentes glicosidasas utilizadas en esta memoria se usaron azúcares activados en la posición anomérica por una molécula de pNF (Esquema 31). Este pNF se cuantificó espectrofotométricamente a 405 nm para determinar la cantidad equivalente de azúcar liberado. Finalmente la actividad enzimática específica se determinó en función de los micromoles de pNF liberados por minuto y por un miligramo de proteína. O O HO O OH HO NO2 OH + p-nitrofenil glicósido (incoloro) monosacárido liberado p-Nitrofenol (amarillo) Enzima Esquema 31. Representación de la hidrólisis de p-nitrofenil glicósidos para su cuantificación enzimática. La actividad enzimática se determinó a diferentes valores de pH, según los requerimientos de la enzima y a un valor de absorbancia de 405 nm (máximo de absorbancia del pNF). Se definió una unidad internacional enzimática (UI) como los micromoles de pNF liberados por minuto en las condiciones de un determinado ensayo. Se define la unidad de actividad específica cuando se refiere a la cantidad de enzima en miligramos (UI/mg) Para cuantificar el pNF liberado se pesaron 25 mg de sólido (pNF comercial calidad HPLC. Sigma-Aldrich) y se disolvieron en un matraz aforado de 100 ml con agua Materiales y Métodos 258 destilada. De este primer patrón (1,98 mM) en agua destilada se tomaron 1,6 ml y se le adicionaron 3,48 ml del tampón de interés, para ajustar el pH en las mismas condiciones de la matriz de trabajo. De éste segundo patrón (566 µM) se tomaron alícuotas de 20 µL cada una (Tabla 35) y se añadieron a una cubeta de cuarzo con 2,5 ml de carbonato de sodio 0,20 M (o tampón ajustado al valor de pH deseado en la recta calibrado) y se leyó la absorbancia a 405 nm. Con los datos obtenidos de la Tabla 35 se elaboró un gráfico de absorbancia leída a 405 nm en función de la concentración milimolar de pNF. Cada uno de los puntos se repitió por triplicado. Tabla 35. Disoluciones sucesivas de un patrón de pNF (0,566 mM) para realizar la recta de calibrado a 405 nm. Nº Volumen añadido de pNF (0,566 mM) Concentración en cubeta pNF (mM) 0 0 0,0000 1 20 0,0045 2 40 0,0089 3 60 0,0133 4 80 0,0176 5 100 0,0218 6 120 0,0259 7 140 0,0300 8 160 0,0341 9 180 0,0380 10 200 0,0419 11 220 0,0458 12 240 0,0496 13 260 0,0533 14 280 0,0570 15 300 0,0606 Materiales y Métodos 259 V.2.4.1.1. Selección de microorganismos productores de glicosidasas Se crecieron los microorganismos como se indica en el apartado V.2.1.3, en matraces de 250 ml con 50 ml de medio de cultivo. Los caldos de cultivo, una vez crecidos los microorganismos, fueron traspasados a tubos falcon y centrifugados a 7000 r.p.m. durante 10 min en una centrífuga RC6 Plus de Sorvall, con rotor F14S-6x250. El sobrenadante se conservó para comprobar la presencia de enzimas extracelulares. Las células precipitadas fueron lavadas con tampón fosfato 30 mM, pH 7 y de nuevo centrifugadas, para eliminar el medio de cultivo que pudiera quedar. Posteriormente fueron resuspendidas en 5 ml en ese mismo tampón. Las reacciones de hidrólisis de glicósidos se llevaron a cabo en tubos Eppendorf, en los que se introdujeron 450 µl de cada microorganismo y 50 µl de cada sustrato en una concentración 5 mM, para obtener una concentración final de 0,5 mM. Los sustratos utilizados fueron pNF-α-Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α- Glu, pNF-β-Glu, pNF-α-Man, pNF-β-D-Man, pNF-β-GalNAc y pNF-β-GlcNAc. Los tubos se mantuvieron en agitación durante 10 min a 30 ºC en caso de los microorganismos de la colección BTG, a 37 ºC y a 65 ºC en caso de T.Thermophilus PRQ25. Los tubos Eppendorf se centrifugaron a 7000 r.p.m. durante 10 min en una centrífuga de sobremesa (Mikro 120. Hettich). Se tomaron 200 µl del sobrenadante y se introdujeron en un pocillo de una placa multipocillo. Se midió su absorbancia en un lector de microplacas a una longitud de onda de 405 nm, utilizando como blanco tampón fosfato de sodio 30 mM, pH 7 con el sustrato correspondiente en una concentración de 0,5 mM. Para considerar los resultados positivos o negativos se aplicaron los siguientes criterios: -Absorbancia entre 0 y 0,05 se consideró resultado negativo (-). Materiales y Métodos 260 -Absorbancia entre 0,05 y 0,5 se consideró resultado positivo (+). -Absorbancia mayor de 0,5 se consideró resultado doble positivo (++). Los resultados positivos se repitieron tres veces para confirmar que se mantuvieran constantes y fueran reproducibles. Cada repetición corresponde a un crecimiento independiente de los microorganismos y su respectiva reacción con los sustratos. V.2.4.1.2. Cuantificación de la actividad de enzimas glicosidasa Fourage y col (1999), han explicado dos formas analíticas para cuantificar el pNF liberado en reacciones de hidrólisis enzimática donde se utilizan éstos glicósidos que liberan pNF. La primera forma es llamada el método continuo, y consiste en determinar el aumento de la absorbancia a 405 nm por liberación de pNF. En este método, la temperatura y el pH se deben controlar con precisión para reproducir con exactitud la recta de calibrado. La segunda forma de determinar la actividad se le conoce como método discontinuo, y consiste en detener la reacción en un momento determinado (por lo general adicionando NaOH ó Na2CO3 concentrados), cuantificando el pNF liberado en las mismas condiciones de fin de la reacción. El uso de NaOH ó de Na2CO3 garantiza alcanzar valores de pH tan altos que el equilibrio de ionización del pNF está completamente desplazado hacia la forma disociada (Fourage y col. 1999). Es importante mencionar que ambas metodologías (continua y discontinua) han sido utilizadas en varios estudios, resaltando entre éstos el clonaje y purificación de enzimas termófilas (Dion y col. 1999) y la purificación de tres enzimas β-galactosidasas de B. circullans ATCC 31382 (Vetere y col. 1998), por lo que su validez ha sido comprobada. V.2.4.1.2.1 Ensayo de actividad enzimática por liberación de pNF: método continúo En una cubeta de cuarzo se adicionaron 2 ml de pNF-glicopiranósido (5 mM) disuelto en tampón de trabajo a pH 7. Los sustratos utilizados fueron pNF-α-Fuc, Materiales y Métodos 261 pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF-β-Glu, pNF-α-Man, pNF-β-D- Man, pNF-β-GalNAc y pNF-β-GlcNAc. La mezcla se atemperó en el espectrofotómetro mediante un baño de agua circulante adaptado al sistema y se agitó con un agitador magnético adaptado al espectrofotómetro. La temperatura de este ensayo fue de 30 ºC para las enzimas mesófilas, 37 ºC para enzimas de B. circulans y 65 ºC para enzimas termófilas. Una vez que la cubeta se hubo atemperado por al menos 90 segundos, se adicionaron 10 µL de enzima (normalmente con una concentración de 1 mg/mL, para que la cantidad total de proteína sea de 1 µg). Al añadir la enzima se cuantificó el incremento de absorbancia a 405 nm y se midieron los resultados frente a una recta de calibrado de pNF realizada en las mismas condiciones experimentales: pH 7, tampón fosfato de sodio 50 mM. V.2.4.1.2.2 Ensayo de actividad enzimática por liberación de pNF: método discontinúo En un tubo Eppendorf se adicionaron 4 µL de disolución pNF-glicopiranósido 50 mM, a este se le añadió el tampón de trabajo en cantidad apropiada para que la suma de volúmenes incluyendo la enzima (por lo general con un volumen no mayor a 10 µL y de concentración exactamente conocida) fuese de 200 µL. Los sustratos utilizados fueron pNF-α-Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF- β-Glu, pNF-α-Man, pNF-β-D-Man, pNF-β-GalNAc y pNF-β-GlcNAc. Se agitó la mezcla en un vortex y se calentó a la temperatura adecuada del ensayo (30 ºC para la colección BTG, 37 ºC para B. circulans y 65 ºC para termófilos). Pasados 10 min, la reacción se detuvo por adición de 800 µl de Na2CO3 0,20 M y se enfriaron las muestras hasta su lectura en el espectrofotómetro. Se realizó un blanco de procedimiento, al cual no se le adicionó ninguna cantidad de enzima hasta después de agregar el Na2CO3. V.2.4.1.3. Cálculo de pH óptimo de actividad enzimática de β-Gal-3 Materiales y Métodos 262 La enzima β-Gal-3 se diluyó hasta obtener lecturas espectrofotométricas de hidrólisis de pNF-β-Gal entre 0,1 y 0,9 a 405 nm, utilizando el método discontinuo descrito en el apartado V.2.4.1.2. La hidrólisis se realizó a 37 ºC utilizando pNF-β-Gal como sustrato. Las mediciones enzimáticas se realizaron en presencia de tampones citrato/fosfato de sodio 50 mM en el rango de pH desde 4 hasta 5,5 y fosfato de sodio 50 mM desde pH 5,5 hasta 9. Los valores de pH de cada disolución se midieron a 37 ºC. En todos los casos el volumen del tampón superó al de la muestra en casi 20 veces, para garantizar un ajuste aproximado del pH al del tampón utilizado. La actividad enzimática obtenida para cada valor de pH se expresó como actividad relativa respecto al valor máximo hallado, y el error promedio del experimento (expresado como desviación estándar) no superó el 5%. V.2.4.1.4. Termoestabilidad de β-Gal-3 Para estudiar la termoestabilidad de la enzima β-Gal-3 de B. circulans, se prepararon alícuotas de la enzima de 200 µl con unca concentración de 1 mg/ml y se incubaron a diferentes temperaturas: 30, 40, 50 60. Cada 2 h y hasta las 24 h se midió la actividad hidrolítica de cada una de ellas según el método continuo descrito en el apartado V.2.4.1.2.1. V.2.4.1.5. Temperatura óptima de reacción de β-Gal-3 Se midió la actividad hidrolítica de la enzima β-Gal-3 de B. circulans según el método continuo descrito en el apartado V.2.4.1.2.1 variando la temperatura a la que se reliza la reacción: 30, 37, 45, 50, 55 y 60 ºC. V.2.4.1.6. Localización de actividad enzimática en bandas de gel de electroforesis Materiales y Métodos 263 El reactivo 4-metil-umberiferil-β-D-fucopiranósido fue utilizado para revelar geles de acrilamida en condiciones nativas y localizar la banda en la que se encuentra la enzima β-fucosidasa. Para ello se cortó el carril del gel y se incubó en una solución de sustrato en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 7 durante 30 min. Transcurrido este tiempo se reveló bajo luz UV. V.2.4.2. Reacciones de transglicosidación V.2.4.2.1. Reacciones de transglicosidación con células enteras Se crecieron los microorganismos como se indica en el apartado V.2.1.3, en matraces de 250 ml con 50 ml de medio de cultivo. Los caldos de cultivo, una vez crecidos los microorganismos, fueron traspasados a tubos Falcon y centrifugados a 7000 r.p.m. durante 10 min en una centrífuga RC6 Plus (rotor F14S-6x250. Sorvall). El sobrenadante se conservó para comprobar la presencia de enzimas extracelulares. Las células precipitadas fueron lavadas con tampón fosfato 30 mM, pH 7 y de nuevo centrifugadas para eliminar el medio de cultivo que pudiera quedar. Posteriormente fueron resuspendidas en 5 ml ese mismo tampón. Las reacciones se efectuaron con una concentración 85 mM de donador y 425 mM de aceptor (relación 1:5), para un volumen de reacción final de 1 ml en tampón fosfato de sodio 50 mM y pH 7. Los sustratos utilizados como donadores fueron: pNF-α- Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF-β-Glu, pNF-α-Man, pNF- β-D-Man, pNF-β-GalNAc y pNF-β-GlcNAc, y como aceptores: Fuc, Fru, Gal, Glu, GalNH2, Man, GalNAc y GlcNAc. Las reacciones se llevaron a cabo a 30 ºC en caso de los microorganismos de la colección BTG y a 70 ºC en caso de T. thermophilus PRQ25, y se iniciaron añadiendo 500 µl de células resuspendidas. De cada reacción se tomaron alícuotas de 50 µL cada 1, 3, 8 y 24 h. Cada alícuota se centrifugó a 14.000 r.p.m durante 5 min para separar las células y finalizar la reacción. Las reacciones se siguieron por HPLC (apartado V.2.7.1). Materiales y Métodos 264 V.2.4.2.2. Reacciones de transglicosidación con enzimas glicosidasa Las reacciones se efectuaron con una concentración 85 mM de pNF-β-Fuc como donador y 425 mM de aceptor (relación 1:5) para un volumen de reacción final de 1 ml. Los sustratos utilizados como donadores fueron: pNF-α-Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α- Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF-β-Glu, pNF-α-Man, pNF-β-D-Man, pNF-β- GalNAc y pNF-β-GlcNAc, y como aceptores: Fuc, Fru, Gal, Glu, GalNH2, Man, GalNAc y GlcNAc. Las reacciones se realizaron en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 7 con agitación magnética. Cada reacción se inició añadiendo 10 UI de enzima. De cada reacción se tomaron alícuotas de 20 µL cada 1, 3, 8 y 24 h. Cada alícuota se calentó a 80 ºC para finalizar la reacción y se diluyó 10 veces con agua en el caso de mesófilos, o se diluyó 10 veces con metanol en caso de termófilos. Las reacciones se siguieron por HPLC (apartado V.2.7.1). Las reacciones con β-fucosidasa de C. gélida se llevaron a cabo a 30 ºC usando como donador pNF-β-Fuc. Las reacciones con α-glucosidasa de T. thermophilus se realizaron a 70 ºC usando como donador pNF-α-Glu. Las reacciones con β-Gal-3 de B. circulans ATCC 31382 se llevaron a cabo utilizando como donador pNF-β-Gal. V.2.4.2.3. Reacciones de transglicosidación en presencia de disolventes sostenibles En las reacciones para medir el efecto de los diferentes disolventes sostenibles sobre la actividad enzimática, se realizaron tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.2, añadiendo los derivados de biomasa ( Esquema 15 del apartado III.2.3.1) en una concentración final 2M o los LI (Esquema 16 del apartado III.2.3.2) en una concentración final del 30%. En las reacciones para medir el efecto de diferentes concentraciones del derivado de biomasa S13 sobre la actividad enzimática, se añadió al medio de reacción en cantidad suficiente para obtener concentraciónes finales de 1, 2 y 3 M Materiales y Métodos 265 En las reacciones para medir el efecto de diferentes concentraciones del LI [Bmim][PF6] sobre la actividad enzimática, se añadió al medio de reacción en cantidad suficiente para obtener concentraciónes finales de 1, 2 y 3 M V.2.4.2.4. Reaccion de transglicosidación con enzimas glicosintasa V.2.4.2.4.1 Reacciones con las enzimas β-Gal-3 E157G y β-Gal-3 E233G de B. circulans Las reacciones se efectuaron con Gal-α-F 85 mM como donador y diferentes concentraciones de aceptor, en relación 1:1, 1:3 y 1:5, para lo que se utilizaron GlcNAc, GalNAc y pNF-GlcNAc. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 500 µl en tampón citrato/fosfato de sodio 50 mM para las reacciones a pH 4 y tampón fosfato de sodio 50 mM para las reacciones a pH 6. Las reacciones se llevaron a cabo a 37 ºC con 50 µg de enzima. Se tomaron alícuotas de 20 µl a distintos tiempos (1, 8 y 24 h). Cada alícuota se calentó a 80 ºC para finalizar la reacción y fueron diluidas 10 veces con agua. Las reacciones se siguieron por HPLC (apartado V.2.7.1). V.2.4.2.4.2 Reacciones con la enzima TmGalA D327G-HisTag de T. maritima Las reacciones se efectuaron con una concentración 14 mM de Gal-β-N3 como donador y 14 mM de diferentes aceptores: Glu, Man, Gal, Fuc, Fru, GalNAc, GlucNAc, pNF-α-Fuc, pNF-β-Fuc, pNF-α-Gal, pNF-β-Gal, pNF-α-Glu, pNF-β-Glu, pNF-α-Man, pNF-β-D-Man, pNF-β-GalNAc y pNF-β-GlcNAc (relación 1:1), para un volumen de reacción final de 100 µl en tampón acetato de sodio 50 mM y pH 5. Las reacciones se llevaron a cabo a 65 ºC durante 16 h. Cada reacción se inició añadiendo 10 µg de enzima. De cada reacción se tomaron alícuotas de 20 µL y se diluyeron 10 veces en metanol para finalizar la reacción. Las reacciones se siguieron por HPLC (apartado V.2.7.1). Materiales y Métodos 266 En las reacciones para medir el efecto de los diferentes disolventes sostenibles usados en esta memoria sobre la actividad enzimática, se añadieron los derivados de biomasa ( Esquema 15 del apartado III.2.3.1) en una concentración final 2M y los LI (Esquema 16 del apartado III.2.3.2) en una concentración final del 30%. V.2.4.3. Reacciones con glicosiltransferasas V.2.4.3.1. Reacciones con glicosiltransferasas de T. thermophilus PRQ25 Las reacciones se efectuaron con una concentración 20 mM de GDP-Man o UDP- Glu como donador, y 40 mM de Fuc, Fru, Gal, Glu, GalNH2, Man, GalNAc o GlcNac como aceptores, en tampón Tris/HCl 10 mM con MgCl2 5 mM pH 7 en un volumen de 500 µl a una temperatura de 70 ºC. Las reacciones se iniciaron añadiendo 50 µg de enzima al medio de reacción. De cada reacción se tomaron alícuotas de 20 µL cada 1, 3, 8 y 24 h. Cada alícuota se diluyó 10 veces en metanol en el caso de las enzimas termófilas para finalizar la reacción. Las reacciones se siguieron por HPLC (apartado V.2.7.1). V.2.4.3.2. Reacciones con sialiltransferasas en la síntesis de glicodendrímeros funcionalizados con ácidos siálicos V.2.4.3.2.1 Sintesis de quimio-enzimática de neu5gc V.2.4.3.2.1.1 Paso 1: Síntesis química de N-glicolil-D-manosamina La reacción se llevó a cabo en un matraz de dos bocas en 40 ml de N,N- dimetilformamida anhidra (DMF) en atmosfera inerte de argón, con agitación magnética y temperatura ambiente. Se añadieron 1,5 ml de trietilamina y 2 g de hidrocloruro de D-manosamina (9,3 mmoles, 1 equivalente) y se dejó solubilizar durante 30 minutos. Transcurrido ese tiempo se añadieron 848,7 mg de ácido glicólico (1,2 equivalentes). A continuación, en oscuridad, se añadieron 1,4 g (10,2 mmoles) de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt). Se introdujo la mezcla de reacción en un Materiales y Métodos 267 baño de hielo y, tras dejarlo enfriar, se añadieron 1,7 ml (11,1 mmol) de N,N’- Diisopropil carbodiimida (DIC). La reacción transcurrió durante 16 h y su seguimiento se llevó a cabo por TLC, usando como fase móvil una solución de cloroformo/metanol en relación 2:1. Finalizada la reacción el crudo se filtró a vacío. Posteriormente se concentró y purificó en una columna de sílica gel (apartado V.2.5.5) con la misma fase móvil utilizada anteriormente en la TLC, y el producto se caracterizó por RMN (apartado V.2.7.2). V.2.4.3.2.1.2 Paso 2: Síntesis enzimática de Neu5Gc (Reacción con aldolasa) La reacción se llevó a cabo en 10 ml de tampón fosfato de sodio 0,1 M pH 7,6 al que se añadieron 728 mg del manNgc obtenido en el apartado anterior (1 equivalente) y 1,021 g de piruvato de sodio (3 equivalentes). Al medio de reacción se añadió azida sódica hasta una concentración final de 0,025 M y 10 mg de aldolasa comercial (N- acetyl neuraminic acid aldolase. Sorachim). La reacción tuvo lugar a 37 ºC con agitación orbital. El seguimiento de la reacción se llevó a cabo por TLC (fase móvil butanol/acetona/etanol/agua en relación 35/35/7/23), la cual finalizó a las 18h. Fue detenida añadiendo 50 ml de etanol y manteniendo en baño de hielo durante 2 horas. Pasado ese tiempo el medio de reacción se centrifugó en una a 10.000 r.p.m. durante 10 minutos. El sobrenadante fue concentrado a vacío y purificado en una columna Bio Gel P-2 de Biorad, utilizando agua destilada como fase móvil (apartado V.2.5.6). El proceso de purificación se repitió en las mismas condiciones. El compuesto final fue concentrado a vacío, liofilizado y analizado por RMN (apartado V.2.7.2). V.2.4.3.2.2 Activación enzimática de ácidos sialicos con citidin trifosfato (CTP) La reacción se llevó a cabo en 16 ml de tampón Tris/HCl 50 mM con MgCl2 50 mM pH 8,6 al que se añadieron 504,2 mg de ácido siálico (1 equivalente) y 945,2 mg de citidina trifosfato (CTP) (1,2 equivalentes). El medio de reacción se incubó en baño a 37 ºC con agitación magnética en un aparato tritiador Metrohm 665 Dosimat, programado para mantener el pH a 8,6 con NaOH 2M. Una vez alcanzada la Materiales y Métodos 268 temperatura y el pH, se añadieron 60 mg de enzima CSS y 40 μl de pirofosfatasa inorgánica comercial. El seguimiento de la reacción se llevó a cabo por TLC (fase móvil N-propanol/H2O/NH3 8:2:1 respectivamente), la cual finalizó a las 24h. El medio de reacción se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 3 minutos. El sobrenadante fue liofilizado (apartado V.2.5.7) y conservado a -20 ºC para su posterior utilización. V.2.4.3.2.3 Reacción de sialiltransferasas α2,6SiaT y α2,3SiaT de Photobacterium sp. La reacción se llevó a cabo en 1,5 ml de tampón Tris/HCl 50 mM con MgCl2 50 mM pH 8,6 al que se añadieron 30 mg (1 equivalente) de glicodendrímero aceptor (descritos en el apartado V.2.4.3.2.4) y 5 equivalentes de donador (CMP-siálico) por cada brazo de glicodendrímero. Tras reajustar el pH a 8,6 se incubó durante 5 minutos a 30 ºC. Se añadieron 60 μl de sialiltransferasa α2,6SiaT o α2,3SiaT de Photobacterium sp (concentración 1 mg/ml) y 20 μl de fosfatasa alcalina comercial. El pH fue comprobado regularmente y ajustado a 8,6 con NaOH 2M. El seguimiento de la reacción se realizó por HPLC (apartado V.2.7.1.2). Finalizada la reacción a las 18 h, el medio de reacción fue centrifugado a 14.000 r.p.m durante 1 min y purificado en una columna Bio Gel P-2 de Biorad, utilizando agua destilada como fase móvil (apartado V.2.5.6). Los tubos que contenían el compuesto fueron reunidos y concentrados a vacio. El compuesto final fue concentrado a vacío, liofilizado y analizado por RMN (apartado V.2.7.2). V.2.4.3.2.4 Síntesis de glicodendrímeros aceptores para las reacciones con sialiltransferasas Se utilizaron diferentes glicodendrímeros que fueron sintetizados y caracterizados en nuestro drupo de investigación por el Doctorando Mario Kaspar-Deir como parte de su Tesis Doctora (en realización)l. La síntesis de estos compuestos se describe brevemente a continuación: Materiales y Métodos 269 V.2.4.3.2.4.1 Dendrímeros hidrofílicos (tipo G1) Con el fin de aumentar la hidrofilicidad del dendrímero, se utilizaron restos de hidroxibencenos como esqueleto del mismo, y como fuente del resto etinílico se empleó bromuro de propargilo en carbonato potásico. En este caso, la reacción elegida para la construcción de las diferentes multivalencias del dendrímero es la reacción de Mitsunobu (Mitsunobu 1981; Charette y col. 2001); en este sentido, para obtener los compuestos con multivalencia de 2 y 4 restos acetilénicos (compuestos 2 y 3, Esquema 32) se utiliza el 3,5-dihidroxibenzoato de metilo (compuesto 1) como producto de partida, mientras que para la síntesis del dendrímero con 3 restos acetilénicos (Compuesto 5), se ha partido del floroglucinol (compuesto 4, Esquema 32). Todos los dendrones y dendrimeros preparados tienen un resto de acetileno terminal, ya que el anclaje posterior del glicoconjugado se llevó a cabo mediante química “click” (cicloadición 1,3-dipolar entre el resto azida del glicoconjugado y un acetileno terminal). Estos dendrímeros fueron los precursores de los glicodendrímeros G1.2, G1.3 y G1.4. 1 4 2 5 3 Esquema 32. Síntesis de dendrímeros de tipo G1.Compuestos 1 y 4: compuestos de partida 3,5-dihidroxibenzoato de metilo y floroglucinol respectivamente, 2) precursor de G1.2, 3) precursor de G1.3 y 4) precursor de G1.4 Materiales y Métodos 270 V.2.4.3.2.4.2 Dendrímeros con grupos cromóforos (tipo G2) Se utilizaron como grupos cromóforos derivados de feniletinilo, que presentan alta fluorescencia. La síntesis se basó principalmente en la reacción de Sonogashira (1991) catalizada con PdCl2(PPh3)2; para ello, se partió de diferentes derivados de bromobenceno e iodobenceno (compuestos 1, 4 y 7 del Esquema 33), empleando como fuente del triple enlace el dimetiletinilcarbinol y trimetilsililacetileno (TMS) (compuestos 2 y 5 del Esquema 33). El diferente grado de multivalencia de los dendrones y dendrímeros se obtuvo utilizando adecuadamente los métodos de desprotección selectiva con NaOH seca/tolueno y K2CO3/THF de los restos carbinol y TMS (Takahashi y col. 1980; Ames y col. 1981; Dabdoub y col. 2001), y sucesivas reacciones de Sonogashira con los derivados halogenados adecuados. Estos dendrímeros fueron los precursores de los glicodendrímeros G2.2, G2.3 y G2.4. 1 4 3 6 8 7 2 5 Esquema 33. Síntesis de dendrímeros de tipo G2.Compuestos 1, 4 y 7: derivados de bromobenceno e iodobenceno de partida, 2 y 5) fuente del triple enlace: dimetiletinilcarbinol y TMS respectivamente. 3) precursor de G2.2, 6) precursor de G2.3 y 8) precursor de G2.4. Materiales y Métodos 271 V.2.4.3.2.4.3 Preparación de glicodendrímeros La formación de los glicodendrímeros se llevó a cabo mediante química “click” (Kolb y col. 2001; Rostovtsev y col. 2002; Tornoe y col. 2002) entre los dendrímeros sintetizados en el apartado anterior y glicoconjugados protegidos de forma acetilada (Lactosa-N3), utilizando CuSO4.5H20, ascorbato sódico y microondas. Finalmente, se llevó a cabo la desprotección de los restos acetilo con NaOH / MeOH, como se especifica en el Esquema 34. Esquema 34. Ejemplo de proceso de funcionalización con lactosa-N3 y desacetilación de un precursor de glicodendrímero: el G1.2, para la obtención del glicodendrímero final. V.2.4.3.3. Uso de enzimas no glicosidasas para la modificación estructural de glicopéptidos V.2.4.3.3.1 Reacción de desacilación con con lipasas y serín proteasas La reacción se llevó a cabo en 1 ml de tampón fosfato de sodio 10 mM con agitación magnética durante 96 h. Los glicopéptidos utilizados fueron teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246 en concentración final de 2 mg/ml. Se disolvieron en el tampón y se atemperó la solución. Cada reacción comenzó añadiendo 50 UI de lipasa de Candida rugosa, Pseudomonas stutzeri o subtilisina de Bacillus subtilis. Las reacciones con lipasas se realizaron a pH 7,5 y 40 ºC, y las reacciones con subtilisina a pH 7 y 45 ºC. El seguimiento de la reacción se llevó a cabo tomando una alícuota de 50 µl cada 1, 5, 8 y después cada 24 h hasta las Materiales y Métodos 272 96 h. Cada alícuota se calentó a 90 ºC durante 5 min y se mezcló con 50 µl de acetonitrilo, para después ser filtrada. Las muestras fueron analizadas por HPLC según el protocolo del apartado V.2.7.1.3 V.2.4.3.3.2 Reaccion de oxidación con glucosa oxidasa La reacción se llevó a cabo en 1 ml de tampón fosfato de sodio 10 mM pH 7 con agitación magnética a 37 ºC durante 96 h. Los glicopéptidos utilizados fueron teicoplanina, mideplanina y MDL 63,246 en concentración final de 2 mg/ml. Se disolvieron en el tampón y se atemperó la solución. Cada reacción comenzó añadiendo 10 UI de enzima glucosa oxidasa de Aspergillus niger y 50 UI de catalasa comercial. El seguimiento de la reacción se llevó a cabo tomando una alícuota de 50 µl cada 1, 5, 8 y después cada 24 h hasta las 96 h. Cada alícuota se calentó a 80 ºC durante 5 min y se mezcló con 50 µl de acetonitrilo, para después ser filtrada en un filtro de 0,2 µm de tamaño de poro. Las muestras fueron analizadas por HPLC según el protocolo del apartado V.2.7.1.3 V.2.4.3.3.3 Reacción de desglicosidación con N-acetil-hexosaminidasas y α- manosidasas La reacción se llevó a cabo en 1 ml de tampón citrato 10 mM pH 5 con agitación magnética a 30 ºC durante 96 h. Se usaron tres N-acetil-hexosaminidasas provenientes de diferentes orígenes: Canavalia ensiformis, Aspergillus oryzae y riñón bovino, con las que se utilizaron teicoplanina y mideplanina, y α-manosidasa de Canavalia ensiformis, con la que se utilizaron teicoplanina, mideplanina, dalbavancina, A-40926 y MDL 63,246 en concentración final de 2 mg/ml. Se disolvieron en el tampón y se atemperó la solución. Cada reacción comenzó añadiendo 50 UI de enzima. El seguimiento de la reacción se llevó a cabo tomando una alícuota de 50 µl cada 1, 5, 8 y después cada 24 h hasta las 96 h. Cada alícuota se calentó a 80 ºC durante 5 min y se mezcló con 50 µl de acetonitrilo, para después Materiales y Métodos 273 ser filtrada. Las muestras fueron analizadas por HPLC según el protocolo del apartado V.2.7.1.3 V.2.5. Purificación de compuestos V.2.5.1. Extracción del derivado de biomasa S13 Terminada la reacción de transglicosidación en presencia de S13, la mezcla fue centrifugada a 14.000 r.p.m. durante 10 min y filtrada por un filtro de 0,2 µm. Posteriormente fue liofilizada para retirar el agua, quedando el S13 con los azúcares disueltos. Se añadió un volumen igual de hexano y tras disolver, la mezcla fue introducida en un baño de nitrógeno líquido (-196 ºC). Esto provocó la precipitación de los azúcares, pero no la del S13, que permaneció disuelto en el hexano y pudo ser retirado por filtración a vacío, quedando la mezcla de azúcares separada del co- solvente. El hexano se separó del S13 en rotavapor y pudo ser completamente recuperado V.2.5.2. Cromatografía en columna de carbono-celite La purificación de disacáridos obtenidos en reacciones enzimáticas de transglicosidación se realizó por medio de columnas de 2 x 50 cm, con una altura de columna con aproximadamente 20 cm de fase estacionaria compuesta por un 50 % m/m de carbón activado y 50 % m/m de celite. Las columnas se lavaron como mínimo con 3 volúmenes de cada una de las fases móviles respecto al volumen de soporte. Las fases móviles usadas (por orden de elución) fueron: - 100 % agua milliQ, - 5 % de etanol absoluto en agua milliQ - 10% de etanol absoluto en agua milliQ. - 15 % de etanol absoluto en agua milliQ. Materiales y Métodos 274 Los disacáridos se recogieron en las fracciones de la última elución, correspondiente al 15% de etanol (analizadas inicialmente por CCF). Posteriormente se analizó la pureza por HPLC (apartado V.2.7.1.1) y se determinó su estructura por RMN (apartado V.2.7.2). V.2.5.3. Cromatografía de intercambio catiónico Esta técnica se utilizó para la separación de la trietilamina en la síntesis quimioenzimática de Neu5Gc (apartado V.2.4.3.2.1). Se realizó en una columna de 18x1 cm con una altura de 6 cm de fase estacionaria compuesta por resina de intercambio catiónico Dowex AG 50WX8 100-200 mesh hydrogen form (Sigma). Se labó la resina con agua miliQ. Se realizaron cinco lavados con ácido clorhídrico 2N, tras lo que se midió el pH de lo eluído de la columna para asegurar que se encontraba entre 1 y 2. Se cargó la muestra diluida en agua y se eluyó utilizando agua miliQ como fase móvil. Se recogieron fracciones y se localizó el producto por TLC, utilizando la fase móvil descrita en cada punto del apartado V.2.4.3.2.1. Se ajustó el pH a 5 para evitar la descomposición del producto debido a la acidez del medio, se liofilizó y se conservó a -20 ºC para su posterior utilización. V.2.5.4. Cromatografía en capa fina (TLC) Fase estacionaria: cromatoplacas de sílice 60 F254. Las fases móviles se descrben en cada caso. Reveladores: -Lámpara de ultravioleta/visible (UV/vis) de λ= 254nm. -Revelador de azúcares: 10% de ácido sulfúrico en metanol. Materiales y Métodos 275 V.2.5.5. Cromatografía en columna de sílica gel La cromatografía en columna se llevó a cabo en columnas de vidrio de diferentes diámetros. Como fase estacionaria se empleó sílica gel 60, AC, C 40-63 μm. Se localizaron por TLC los tubos que contenían la muestra, los cuales fueron reunidos y concentrados por evaporación rotatoria. V.2.5.6. Cromatografía de exclusión molecular en Biogel P-2 La cromatografía de exclusión molecular en Biogel P-2 se utilizó para la purificación de glicodendrímeros (apartado V.2.4.3.2.4). Se llevó a cabo en columnas de vidrio de 170 x 2 cm, usando como fase estacionaria resina BioGel P-2 Gel, fine, 45-90 μm, exclusion limits: 100-1800 (BioRad), y agua destilada como fase móvil. Se localizaron por TLC (fase móvil butanol/acetona/ácido acético/agua 32:33:7:28) las fracciones con la muestra fueron, que posteriormente fueron liofilizadas y analizadas por RMN (apartado V.2.7.2). V.2.5.7. Liofilización Los procesos de liofilización se efectuaron en un liofilizador Labconco, Lyph-Lock 12, (Hucha-Erlóss). Las muestras se congelaron introduciendo los viales en acetona con nieve carbónica de modo que tuvieran la mayor superficie posible. A continuación se conectaron al liofilizador hasta que se convertieron en un polvo seco. V.2.6. Inmovilización de la enzima Β-Gal-3 de B. circulans V.2.6.1. Inmovilización en polímeros macroporosos Se utilizaron diferentes soportes macroporosos, sintetizados y caracterizados en nuestro drupo de investigación por el Dr. Antonio Aires como parte de su Tesis Doctoral.( Materiales y Métodos 276 Esquema 35, Tabla 36) (Aires-Trapote 2012). Todos los soportes fueron funcionalizados con grupos epóxidos. En este trabajo, además, se ha utilizado un soporte comercial (Eupergit CM) que también está funcionalizado con grupos epóxidos, para comparar los resultados. O O Alil glicidil éter (AGE) O O O O O 2- alil-1,3-diglicil glicerol éter (ADGGE) O O O O O O O Alil triglicil pentaeritritiol éter (ATGPE) O O O O O O O O O O O O O p-{{2,2bis [(glicidiloxi) metil]} propil} metacrilato (GMPMA) O O O O 1,6-hexanodioldimetacrilato (HDDMA) O O O O O O O O Triglicidil pentaeritritil metacrilato (TGPMA) Divinil benceno (DVB) O OH OH O Dialil pentaeritritol éter (DAPE) O O O Glicidil metacrilato (GMA) O O O O Etilenglicol dimetacrilato (EGDMA) p-glicidil estireno (GE) p-{{2,2bis [(glicidiloxi) metil] propanoxi} metil } estireno (GMPME) O O O O O O O p-[(triglicidil pentaeritritoxi) metil] estireno (TGPME) Esquema 35. Estructura de los monómeros utilizados en la síntesis de los polímeros funcionalizados con grupos epóxido. Materiales y Métodos 277 Tabla 36. Composición de los polímeros macroporosor funcionalizados con grupos epóxido. Soporte Volumen de poro (ml) Tamaño de poro (nm) Superficie específica BET (m2/g) Grado de epoxidación (mmol/g) Enzima libre - - - - Poli(AGE-co-DVB)-74 0,55 25 97 2.0 Poli(ADGGE-co-DVB)-50 1,58 26 242 2.2 Poli(ATGPE-co-DVB)-13 1,22 24 208 1.2 Poli(AGE-co-DAPE-DVB)-4 1,6 20 333 0.9 Poli(ADGGE-co-DAPE-DVB)-10 0,86 19 191 0.5 Poli(ATGPE-co-DAPE-DVB)-6 1,47 22 280 0.9 Poli(GMA-co-EGDMA)-11 0,28 25 45 4.9 Poli(GMA-co-HDDMA)-2 0,15 26 27 4.3 Poli(BGMPMA-co-EGDMA)-8 0,33 30 44 4.6 Poli(TGPMA-co-EGDMA)-9 0,29 27 44 5.3 Poli(GMA-HEMA-co-EGDMA)-9 0,27 27 34 2.9 Poli(BGMPMA-HEMA-co-EGDMA)-2 0,13 25 22 1.9 Poli(TGPMA-HEMA-co-EGDMA)-1 0,2 25 33 1.6 Poli(GMA-DEAEMA-co-EGDMA)-1 0,29 31 38 2.4 Poli(BGMPMA-DEAEMA-co-EGDMA)-1 0,09 22 17 1.7 Poli(TGPMA-DEAEMA-co-EGDMA)-1 0,09 23 17 2.1 Poli(GMA-HEMA-DEAEMA-co- EGDMA)-9 0,34 28 51 2.7 Poli(TGPMA-HEMA-DEAEMA-co- EGDMA)-1 0,02 31 2,6 2 Poli(GE-co-DVB)-4 0,43 24 74 3.2 Poli(BGMPME-co-DVB)-5 0,33 22 64 2.9 Poli(TGPME-co-DVB)-3 0,2 23 39 4.0 Eupergit C 0,06 10 4.5 0,6 V.2.6.1.1. Proceso de Inmovilización en soportes macroporosos Para la inmovilización de la enzima β-Gal-3 en soportes macroporosos, se utilizó 0,1 mg de proteína en un tubo Eppendorf de 2 ml junto con 10 mg de soporte y 1,5 ml de tampón fosfato de sodio 50 mM pH 7 y 500 mM de NaCl. La mezcla se dejó en contacto a temperatura ambiente durante 24 h en agitador vertical a 25 r.p.m. Pasado Materiales y Métodos 278 este tiempo, se cuantificó la cantidad de proteína en el líquido sobrenadante, y se determinó la cantidad de enzima unida covalentemente al soporte. El derivado obtenido se dejó en contacto con glicina 3M pH 8,5, durante 16 h en agitador vertical a 25 r.p.m. La mezcla final se filtró sobre un plato poroso y se lavó con tampón fostato de sodio 50 mM pH 6. El derivado inmovilizado se conservó a 4ºC. V.2.6.2. Inmovilización en soporte de glioxil agarosa V.2.6.2.1. Estabilización de la enzima en medios alcalinos Se incubaron 0,5 mg de enzima β-Gal-3 a 4ºC en tampón bicarbonato de sodio 100 mM pH 10 con un 20% de diferentes agentes estabilizantes: glicerol, trehalosa y PEG-600. Se tomaron alícuotas de 10 µl a los 60 y 120 min para determinar la actividad le la enzima libre (apartado V.2.4.1.2) Posteriormente se repitió el proceso anterior a 25 ºC, utilizando diferentes concentraciones de PEG-600: 5, 10, 20, 30 y 50 %. V.2.6.2.2. Proceso de inmovilización en soporte de glioxil agarosa La inmovilización se realizó con 0,5 mg de enzima β-Gal-3, la cual se diluyó con tampón bicarbonato de sodio 100 mM pH 10,50 con un 50% de PEG-600 hasta un volumen final de 5 ml y el pH final de la disolución se ajustó hasta 10. Luego se añadió 1 g de soporte (agarosa entrecruzada al 10%). La mezcla se sometío a agitación orbital a 25 ºC durante 30 min. De la mezcla se tomaron 10 µl de muestra, que se filtraron para medir la actividad de la enzima en el líquido sobrenadante. Cuando se completó el proceso de inmovilización se adicionaron 5 mg de NaBH4. La mezcla se sometió a agitación orbital sin tapar durante 30 minutos. La mezcla final se filtró sobre un plato poroso y se lavó con tampón fostato de sodio 50 mM pH 6. El derivado inmovilizado se conservó a 4 ºC. Materiales y Métodos 279 V.2.6.2.3. Estudio de carga enzimática del biocatalizador Para optimizar la carga de proteína sobre el soporte de glioxil agarosa, se evaluaron diferentes cantidades de enzima por gramo de soporte. Las concentraciones utilizadas en la inmovilización fueron: 0,1, 0,5, 1, 1,5 y 2 mg enzima/ gramo de soporte. Se determinó en todos los casos la cantidad de proteína inmovilizada y su actividad en el derivado final (apartadoV.2.4.1.2). V.2.6.2.4. Estabilización frente a PH Se añadieron 10 mg de soporte con enzima inmovilizada para medir la actividad hidrolítica utilizando el método discontinuo descrito en el apartado V.2.4.1.2. La hidrólisis se realizó a 37 ºC utilizando pNF-β-Gal 5 mM como sustrato. Las mediciones enzimáticas se realizaron en presencia de tampon citrato/fosfato de sodio 50 mM en el rango de pH 4 - 5,5, y fosfato de sodio 50 mM en el rango de pH 5,5 - 9. La actividad enzimática obtenida para cada valor de pH se expresó como actividad relativa respecto al valor máximo hallado y el error promedio del experimento (expresado como desviación estándar) no superó el 5%. V.2.6.2.5. Reacción de transglicosidación con enzimas inmovilizadas Las reacción se llevó a cabo tal y como se describe en el apartado V.2.4.2.2, añadiendo 10 UI de soporte inmovilizado con la enzima. Pasado el tiempo de reacción, las muestras se centrifugaron a 14.000 r.p.m. durante 5 minutos para separar el biocatalizador y finalizar la reacción. El sobrenadante se conservó para medir la actividad enzimática por HPLC (apartado V.2.7.1). V.2.6.2.6. Reutilización V.2.6.2.6.1 Reutilización en reacciones de hidrólisis Materiales y Métodos 280 Se disolvieron 5 UI de β-Gal-3 inmovilizada en glioxil agarosa en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 7. Se midió su actividad hidrolítica usando como sustrato pNF-β- Gal 5 mM según el métido contínuo descrito en el apartado V.2.4.1.2.1. Pasado el tiempo de reacción, las muestras se centrifugaron a 14.000 r.p.m. durante 5 minutos. El sobrenadante se desechó y el soporte con la enzima inmovilizada fue lavado dos veces con tampón fosfato de sodio 50 mM pH 7. Para los sucesivos reúsos se añadió de nuevo medio de reacción. V.2.6.2.6.2 Reutilización en reacciones de transglicosidación Se disolvieron 10 UI de β-Gal-3 inmovilizada en glioxil agarosa en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6 con el objetivo de llevar a cabo la reacción en tres medios de reacción diferentes: i) tampón, ii) tampón y 2M del derivado de biomasa S13, y iii) tampón y 30% del LI [Bmim][PF6], para un volumen final de 1 ml. La reacción se llevó a cabo utilizando concentración final de 85 mM de pNF-β-Gal como donador, y 425 mM de GlcNAc como aceptor, a 37 ºC, durante 1,5 h en agitación orbital. Pasado el tiempo de reacción, las muestras se centrifugaron a 14.000 r.p.m. durante 5 minutos. El sobrenadante se conservó para medir la actividad enzimática por HPLC (apartado V.2.7.1). El soporte con la enzima inmovilizada fue lavado dos veces con tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6. Para los sucesivos reúsos se añadió de nuevo medio de reacción. Puesto que el [Bmim][PF6] se podía reutilizar porque precipitaba al centrifugar, no fue necesario volver a añadir este co-solvente en los distintos reúsos. V.2.7. Tecnicas Analíticas V.2.7.1. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) V.2.7.1.1. HPLC para el análisis de oligosacáridos El seguimiento de las reacciones enzimáticas de transglicosidación se realizó mediante un cromatógrafo Jasco 2000 equipado con una columna NH2P50-4E de Materiales y Métodos 281 grupos amino (Asahipak, Japón): diámetro interno: 4,6 mm, longitud 250 mm, tamaño de partícula: 5 µm. Las condiciones de operación fueron: Flujo 0,8 mL/min, fase móvil de 80 % acetonitrilo y 20 % de agua (v/v). El sistema tiene tres detectores: uno luz ultravioleta (UV) y otro de dicroismo circular (DC) fijados a 317 nm (máximo de absorción de los derivados de pNF y un detector de dispersión de la luz por evaporación (“evaporative light scattering detector”, ELSD). Las condiciones de trabajo con este último detector fueron: temperatura del tubo de deriva [DT]: 60 ºC y de la cámara de spray [SC]: 54 ºC Las alícuotas obtenidas de las distintas reacciones de este trabajo, se diluyeron 10 veces y se filtraron para ser analizadas por HPLC-ELSD. De los datos obtenidos en el cromatograma se estimaron las proporciones de disacáridos mediante la metodología de calibración absoluta (o del estándar externo): se utilizó un estándar externo de disacáridos puros (Gal-β(1-3)-GlcNAc, Gal-β(1-3)-GalNAc, Gal-β(1-6)- GlcNAc Gal-α-(1-6)-Glu-pNF y Gal-α-(1-6)-Man-pNF) de concentración conocida. Se realizó una recta de calibrado del área del compuesto en función de la concentración. Los datos se ajustaron a un modelo polinómico de primer grado y se evaluaron por su valor de R2. El detector UV se utilizó para estimar en el cromatograma la distribución de los grupos p-nitrofenol liberados y/o condensados durante la reacción, ya que éstos (sin ionizar) absorben normalmente a 317 nm. Los glicoconjugados con estos anillos aromáticos se detectaron también por DC (317 nm), ya que la presencia de dobles enlaces del sistema aromático cerca de un centro quiral como es el carbono anomérico permiten ser detectados con ésta técnica. V.2.7.1.2. HPLC para el análisis de glicodendrímeros El seguimiento de las reacciones enzimáticas de sialización de glicodendrímeros se realizó en un cromatógrafo Shimadzu equipado con un detector de diodo-array e Materiales y Métodos 282 inyector automático. La columna utilizada era de modelo XBridge. c18, de 3 mm de diámetro interno, 150 mm de longitud y un tamaño de partícula de 3,6 µm. Las condiciones de operación fueron: flujo 0,4 ml/min, fase móvil compuesta por disolvente A: agua 99,9%, ácido trifluoroacético 0,1%, y disolvente B: acetonitrilo 95%, agua, 4,9% y 0,1% ácido trifluoroacético. El gradiente programado para cada pinchazo aparece en la Tabla 37. Las alícuotas obtenidas de las distintas reacciones (50 µl) se diluyeron 10 veces con 225 µl de agua y 225 µl de acetonitrilo, y se filtraron. Posteriormente se introdujeron en los viales del inyector automático. Tabla 37. Condiciones de gradiente de la composición de la fase móvil para el análisis de glicodendrímeros por HPLC. Disolvente t (min) A (%) B (%) 0 100 0 25 55 45 30 0 100 35 0 100 45 100 0 V.2.7.1.3. HPLC para el análisis de glicopeptidos V.2.7.1.3.1 Método general para el análisis de glicopéptidos El seguimiento de las reacciones enzimáticas de modificación estructural de glicopéptidos se realizó en un cromatógrafo Agilent 1200 equipado con un detector UV programado a 270 nm. La columna utilizada era de modelo Mediterranea, Sea18, de 4,6 mm de diámetro interno, 150 mm de longitud y un tamaño de partícula de 5 µm. Las condiciones de operación fueron: flujo 1 ml/min, fase móvil compuesta por disolvente A: agua 99,9%, ácido trifluoroacético 0,1%, y disolvente B: acetonitrilo 99,9%, ácido trifluoroacético 0,1%. El gradiente programado para cada pinchazo aparece en la Tabla 38. Las alícuotas obtenidas de las distintas reacciones (50 µl) se diluyeron con 50 µl de acetonitrilo y se filtraron con un filtro de 0,2 µm. Materiales y Métodos 283 Tabla 38. Condiciones de gradiente de la composición de la fase móvil para el análisis de glicopéptidos por HPLC Disolvente t (min) A (%) B (%) 0 100 0 5 100 0 15 75 25 30 65 35 35 0 100 45 100 0 50 100 0 V.2.7.1.3.2 Método para el análisis reacciones de oxidación de glicopeptidos El seguimiento de las reacciones enzimáticas de oxidación de glicopéptidos se realizó en un cromatógrafo Agilent 1200 equipado con un detector UV programado a 270 nm. La columna era de modelo NH2P50-4E de grupos amino (Asahipak, Japón): diámetro interno: 4,6 mm, longitud 250 mm, tamaño de partícula: 5 µm. Las condiciones de operación fueron: Flujo 1 ml/min, fase móvil compuesta por tampón fosfato de sodio 10 mM pH 8 al 60 % y acetonitrol al 40%. Las alícuotas obtenidas de las distintas reacciones (50 µl) se diluyeron con 50 µl de acetonitrilo y se filtraron con un filtro de 0,2 µm. V.2.7.2. Especroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) Los espectros de 1H-RMN de los disacáridos purificados y los glicodendrímeros de la serie DA se realizaron con presaturación de agua deuterada (D2O) y los de la serie DD en DMSO deuterado, en un espectrómetro Bruker AC-250 de 250 MHz. En el caso de muestras muy diluidas o para espectros de 13C-RMN se utilizó el espectrómetro Bruker Av de 500 MHz ó de 700 MHz. Materiales y Métodos 284 V.2.7.3. Espectroscopía de Fluorescencia Se analizó el espectro de emisión de fluorescencia de la enzima β-gal-3 utilizando un espectrómetro Perkin Elmer LS50B. Se excitó la proteína a una longitud de onda de 295 nm, la emisión fue adquirida de 310 nm a 400 nm. La excitación y emisión de ancho de banda se ajustó a 3 nm, las mediciones se hicieron en celdas de 1 cm de paso de luz con un termorregulador TLC ajustado a 25ºC. El análisis se realizó utilizando el software Spectra Félix 32. Primero se analizó el espectro de S13 en una concentración 2M, depués el de la enzima β-gal-3 en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 6 para poder compararlos y confirmar que la emisión de S13 era inapreciable comparada con la de la enzima y que no interferiría en las mediciones. Después se realizaron varias adiciones de S13 en la cubeta con la enzima, logrando las siguientes concentraciones finales: 0, 1, 2 y 3M. Se registraron los espectros de emisión para dichas mezclas y se representó la fluorescencia normalizada en función de la λ. V.2.7.4. Resonancia de Plasmón de superficie (SPR) Los analisis se realizaron en un equipo Biacore 3000 (GE Healthcare). Se utilizaron tres tipos de chip: - CM5: contiene una superficie de oro funcionalizada con una matriz de dextrano de 100 nm. Esta matriz está funcionalizada con grupos carboxilo lo cual permite la inmovilización covalente mediante distintos métodos químicos. - CM4: similar al CM5 pero con una funcionalización del dextrano del 30%, lo que reduce la señal y evita uniones inespecíficas. - HPA: contiene cadenas de alcanotioles unidas directamente a la lámina de oro, lo que crea una superficie hidrofóbica que ermite el estudio de interacciones de componentes lipídicos. Los experimentos se llevaron a cabo en presencia de tampón PBST (fosfato de sodio 10 mM pH 7,4 con cloruro de sodio 150 mM y 0,005% de P20) con los chips CM5 y CM4, mientras que se utilizó el tampón HBS (tampón HEPES 10 mM pH 7,4 con Materiales y Métodos 285 cloruro de sodio 150 mM) para el chip HPA. Cada chip tiene cuatro celdas FC (Flow Cell). V.2.7.4.1. Preparación de chips CM5 y CM4 V.2.7.4.1.1 Activación de chips CM5 y CM4 Para llevar a cabo la activación de los grupos carboxilo de la matriz de dextrano los reactivos utilizados fueron: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N- hidroxisulfosuccinimida (NHS). El protocolo de activación consistió en la inyección de 35 µL de una mezcla de EDC (0,2 M) y NHS (0,05 M), a 5 µL/min de flujo, temperatura constante de 28 ºC y empleando como tampón de trabajo PBST. Tras este procedimiento general de activación la superficie queda lista para inmovilizar el ligando. V.2.7.4.1.2 Inmovilización de ligandos en la superficie del chip Una vez activado el chip, se fluyen los ligandos, que quedan unidos por sus grupos amino libres, como se muestra en la Figura 96. En este trabajo se desarrollaron dos tipos de experimentos para el estudio de interacciones moleculares por SPR, en los cuales, las condiciones de inmovilización de ligandos son diferentes. Por ello éstas, se explican en sus respectivos apartados: -Interacciones glicodendrímero-proteina, apartado ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. -Interacciones glicopéptido-percursor de péptidoglicano, apartado V.2.7.4.2. Materiales y Métodos 286 Figura 96. Activación de los grupos carboxilo de los chips CM5 y CM4 con EDC y NHS, y posterior unión del ligando a través de sus grupos amino libres. V.2.7.4.1.3 Bloqueo de grupos activados del chip CM5 y CM4. Después del proceso de inmovilización de los ligandos en los chips activados, es posible que queden grupos carboxilos de la matriz activados donde no se haya producido la inmovilización. Para evitar que estos grupos remanentes puedan interferir en los estudios de interacción, se bloqueó la superficie mediante una inyección de etanolamina (1 M, 35 µl) a un flujo de 5 µl/min y 28ºC y empleando como tampón de trabajo PBST. V.2.7.4.2. Estudio de interacciones glicopéptido-precursores de peptidoglicano V.2.7.4.2.1 Inmovilización de los tripéptidos AcLysDAlaDAla y AcLysDAlaDLactato sobre la superficie del chip CM5 y CM4 Los ligandos AcLysDAlaDAla y AcLysDAlaDLactato fueron inmovilizados en celdas independientes (FC2 y FC3 respectivamente), para ello se utilizó una concentración de 2 mg/ml en tampón fosfato de sodio 10 mM pH8, a un flujo de 5 µl/min. Las respuestas de inmovilización para AcLysDAlaDAla (FC2) y AcLysDAlaDLactato (FC3) fueron 166 RU y 196 RU respectivamente en el chip CM5 y 83 RU y 69 RU respectivamente en el chip CM4. La celda FC1 de cada chip fue activada y bloqueada sin ligando para ser utilizada como referencia. V.2.7.4.2.2 Estudio de interacciones moleculares de glicopéptidos con precursores de peptidoglicano V.2.7.4.2.2.1 Chip CM5 Las muestras fueron inyectadas a un flujo de 5 µl/min en tampón PBST durante 180 s y midiendo después durante 180 s. Las concentraciones para vancomicina fueron: Materiales y Métodos 287 25, 50 100, 150, 200 y 250 nM; para teicoplanina y A-40926: 5, 10, 15, 20, 25, 25, 30 nM; para mideplanina: 0,5, 1, 2, 5, 7,5 y 10 nM; para dalbavancina y MDL 63,246: 1, 2, 5, 7,5, 10 y 12,5 nM. V.2.7.4.2.2.2 Chip CM4 Las muestras fueron inyectadas a un flujo de 5 µl/min en tampón PBST midiendo durante 180 s y midiendo después la disociación se durante 180 s. Las concentraciones para vancomicina fueron: 200, 300, 400, 500 and 600 nM; para teicoplanina: 5, 10, 15, 20, 25 y 30 nM; para A-40926: 20, 40, 80, 120, 160 and 200 nM; para mideplanina, dalbavancina y MDL 63,246: 10, 20, 30, 40, 50 y 60 nM. V.2.7.4.2.2.3 Chip HPA Se inyectaron soluciones 10 µM de todos los glicopéptidos con un flujo de 5µl/min durante 180 s y la disociación se midió durante 180 s en tapón HBS El procesamiento de datos y los analisis de resultados se llevaron a cabo mediante el programa BiaEvaluation v.4.1.1 (GE Healthcare). A todas las señales se les restó el blanco y fueron ajustadas a un modelo matemático para obtener los parámetros cinéticos de la interacción. V.2.8. Herramientas informáticas V.2.8.1. Programas bioinformáticos V.2.8.1.1. Análisis de secuencias genéticas Para el ensamblado, comparación, y traducción de secuencias génicas, se utilizaron diferentes programas: Chromas Lite junto con ClustalW (EMBL-EBI European Bioinformatics Institute), Bioedit (Tom Hall Ibis Therapeutics) y Vector NTI (Invitrogen). Materiales y Métodos 288 V.2.8.1.2. Análisis de secuencias protéicas La comparación de secuencias peptídicas, búsqueda de proteínas homólogas o análisis de proteínas, como cálculo de su punto isoeléctrico, su masa molecular o la predicción de posibles fragmentos transmembrana de proteínas, se realizó con los paquetes de programas del servidor ExPASy: BLAST (Altschul y col. 1990), pI/MW, ProtParam, y otros programas en distintos servidores como “DAS” (Cserzo y col. 1997), “HMMTOP” (Tusnady y col. 1998), “TMMOD” (Kahsay y col. 2005) o “Sosui” (Hirokawa y col. 1998). V.2.8.2. Modelado molecular y docking de la interacción co-solvente- enzima β-Gal-3 V.2.8.2.1. Modelado por homología Debido a que no existía previamente una estructura cristalizada de la enzima β-Gal-3 de B. circulans, se generó un modelo tridimensional por homología. Para ello, mediante el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul y col. 1990) se localizó la estructura cristalizada con mayor similitud de secuencia que estuviera depositada en el Protein Data Bank (PDB), encontrándose la β- galactosidasa de Bacterioides thethaiotaomicron (PDB ID: 3D3A, resolución 2.15 A) con una identidad del 42% (e-value: 1e-146), por lo que fue seleccionada para desarollar el modelo. Se utilizaron dos servidores de modelado automático, el SWISS-Model (Schwede y col. 2003) y el CPHmodels-3.0, para construir el modelo basado en el alineamiento con la β-galactosidasa de B. thethaiotaomicron. Los modelos obtenidos fueron posteriormente refinados con el programa GROMOS 96 para obtener la estructura de mínima energía pasando por mil pasos del algoritmo Steepest Descent. Para la validación y selección del mejor modelo, se empleó el programa para calcular la torsión de los ángulos de la cadena principal: PROCHECK (Laskowski y col. 1993) (gráfico de Ramachandran) y se verificó mediante la línea software de ERRAT (Colovos y col. 1993) y VERIFY_3D54 en el servidor de Materiales y Métodos 289 análisis estructural y comprobación de UCLA-DOE. La mayoría de los parámetros analizados tuvieron valores estadísticos que estaban en el intervalo esperado para una proteína natural plegada y, por tanto, el modelo fue considerado validado. V.2.8.2.2. Localización del centro activo La ausencia de una estructura cristalina del complejo, obligó a deducir la localización del centro activo por medio de análisis de la conservación de los residuos, de docking ciego y estructura de superimposición. Un análisis comparativo de los residuos catalíticos de las secuencias de la β-galactosidasa de E. coli (LacZ) y la β-Gal-3 de B. circulans produjo, como resultado, una perfecta conservación de dos restos de ácido glutámico, Glu-157 y Glu-233, correspondiente a los residuos 461 (ácido catalítico) y 537 (nucleófilo) respectivamente en el sistema LacZ de E. coli (Juers y col. 2001). La estructura de la cadena A de lacZ (código PDB 1DP0) fue superpuesta al modelo utilizando PyMOL. Se observó una muy buena superposición de los residuos analizados, lo que podría representar un típico centro activo de β-galactosidasa en la que los dos residuos de glutámico se colocaron a una distancia de 5,5 Å, distancia usual para esta clase de enzimas. Finalmente, se realizó un docking ciego utilizando toda la estructura como la cuadrícula utilizada y los resultados confirmaron el hipotético centro activo. V.2.8.2.3. Docking Los procedimientos de docking se llevaron a cabo con el software Autodock 4 (Morris y col. 2009), utilizando el algoritmo genético Lamarckiano estándar y con una cuadrícula de 60 x 60 x 60 puntos alrededor del residuo Glu-233, para abarcar todos los residuos implicados en el mecanismo, y con un espaciado de malla de 0,375 Å. Se realizaron dos docking: inicialmente el pNF-β-Gal se acopló en el centro activo para determinar la posición de la molécula en el intermedio glicosil-enzima. Con este Materiales y Métodos 290 objetivo, se seleccionó la mejor estrucutra de acuerdo a la geometría (lo suficientemente cerca para el nucleófilo Glu-233) y criterios energéticos (energía favorable), para finalmente establecer un enlace covalente entre el residuo Glu-233 y la galactosa. El complejo Gal-enzima fue utilizado para realizar un acoplamiento con el GlcNAc, se seleccionó la mejor solución teniendo en cuenta, solamente, criterios energéticos. Este resultado se tomó como una estructura de partida para posteriores estudios de dinámica molecular. V.2.8.2.4. Parametrización del disolvente Los disolventes S13 y [Bmim][PF6] se utilizaron para simular el sistema de reacción y solvatar la proteína, con el fin de modelar el cambio en la estereoselectividad inducida por el disolvente y obtener una visión de los detalles moleculares de este proceso. Debido a la falta de parámetros de los disolventes para programa GROMOS 96 43a1, se llevó a cabo la parametrización de estas moléculas. La estructura fue optimizada dentro del marco de la densidad funcional teórica (DFT), en el nivel de B3LYP/6-31G**, utilizando el paquete MPQC (“Massively Parallel Quantum Chemistry”). Todos los parámetros (longitudes de enlace, ángulos y diedros) y las cargas fueron extraídos de los cálculos del campo de fuerza estándar. Para comprobar los parámetros, se estableció un sistema de prueba formando una caja cúbica con 216 moléculas de disolvente. Este cubo fue equilibrado durante 300 ps a 298 K y 1 atm. A continuación, se llevó a cabo una simulación de 5 ps en las mismas condiciones de presión y temperatura, grabando los valores de posición y energía cada 1ps. V.2.8.2.5. Dinamica molecular Se generaron simulaciones de dinámica molecular con la mejor solución de docking y el sistema intermedio glicosil-enzima. Los parámetros adoptados en GROMOS 96 43a1 se utilizaron para la proteína y para el residuo galactosa-glutámico. Los Materiales y Métodos 291 parámetros para el GlcNAc se extrajeron de Dundee PRODRG 2.5 Server (beta) y se comprobaron las cargas. Se utilizó el programa GROMACS v4.0.7 suite (Hess y col. 2008) para desarrollar una minimización inicial del complejo con 2000 pasos del algoritmo Steepest Descent seguido de 7000 pasos de gradientes conjugados de Polak-Ribiere. El complejo minimizado fue solvatado en tres cajas cúbicas diferentes, cumpliendo los requisitos mínimos de distancia de 1,2 nm entre cualquier átomo del complejo y las caras de las cajas. La primera caja se llenó con moléculas de agua para reproducir las condiciones experimentales para la enzima, mientras que la segunda y tercera cajas fueron llenadas con una mezcla de moléculas de agua y moléculas de S13 y [Bmim][PF6] respectivamente, para reproducir las condiciones experimentales en las que se observó el cambio en la regioselectividad. Luego, se realizó para cada caja, un nuevo proceso de 500 pasos de minimización de Steepest Descent y luego 3000 pasos de gradientes conjugados. Los sistemas fueron equilibrados por 300 ps a 300K para condiciones constantes de moles, volumen y temperatura utilizando el método y luego otros 300 pasos a 300K para condiciones constantes de moles, presión y temperatura. Finalment se llevó a cabo una simuloación de 2 ns midiendo la energía y las coordenadas cada 1 ps y un paso de 2 fs (Amadei y col. 1993). V.2.8.3. Modelado molecular y docking de la interacción glicopéptido-precursor de peptidoglicano Los cálculos de mecánica molecular de los antibióticos en presencia de los precursores de peptidoglicano se llevaron a cabo el programa Macromodel 9.6, del paquete de programas Maestro (versión 8.5.110). Las estructuras de los antibióticos fueron construidas a partir de los complejos entre precursores de peptidoglicano y vancomicina, teicoplanina y otros antibióticos relacionados, depósitados en el Protein Data Bank (códigos PDB 1FVM, 1QD8, 2WDX y 3MG9). Las cadenas lateralis de los diferentes antibióticos se modelaron desde estos archivos cuendo fue necesario. Materiales y Métodos 292 Para el modelado de AcLysDAlaDAlaOH, se seleccionó la geometría inicial del archivo 1FVM. AcLysDAlaDLactato se modeló modificando los átomos afectados. Una vez obtenidos los modelados de los precursores de peptidoglicano, se acoplaron manualmente para cumplir con el patrón de puentes de hidrógeno descrito. De los complejos obtenidos obtenidos se buscó su estructura de mínima energía utilizando el algoritmo OPLS* force field (Optimized Potentials for Liquid Simulations), con una constante dieléctrica de distancia de dependencia de 70 debyes. Los complejos de mínima energía obtenidos fueron utilizados para llevar a cabo simulaciones de dinámica molecular de 1 ns y 300 K, a partir del mismo algoritmo y sin restricciones intermoleculares para confirmar la estabilidad conformacional de los complejos. El tiempo de equilibrado fue 100 ps, el paso de integración fue 1,5 fs y se activó el protocolo de agitación para los enlaces C-H. Para todos los casos la temperatura fue estable en 2º. Para los complejos con AcLysDAlaDAlaOH, la geometría se mantuvo estable durante todo el proceso de dinámica molecular, manteniéndose los puentes de hidrógeno intermleculares durante más del 80% del tiempo de simulación. Se observaron variaciones en la orientación y los patrones de puentes de hidrógenos del extremo C-terminal del AcLysDAlaDAlaOH, mientras que los complejos con AcLysDAlaDLactato se disociaban después de 200 ps de simulación, indicando que tenían una estabilidad mínima. Adicionalmente, se utilizó el programa AutoDock 4.2 para buscar geometrías alternativas de los complejos. Los tipos de átomos y las cargas parciales de cada región de la molécula fueron calculados utilizando el programa Sybyl 8.0. Las geometrías iniciales de los antibióticos obtenidas del Protein Data Bank fueron optimizadas con el programa Macromodel, del paquete de programas Maestro. Concretamente, después de añadir los átomos de hidrógeno, las estructuras fueron optimizadas con el algoritmo OPLS-2005* force field utilizando gradientes conjugados por el método de Newton Truncado y los ligandos fueron fijados a sus posiciones cristalográficas. Entonces, los ligandos fueron extraidos de la zona de Materiales y Métodos 293 unión del antibiótico para obtener las nuevas coordenadas de la estructura de los antibióticos. Para los cálculos de AutoDock, con una cuadrícula de 54x54x54 puntos y 0,375 Å de tamaño de malla. Se calcularon 200 pasos de algoritmo genético lamarckiano, utilizando 2x107 evaluaciones. El análisis sistemático de las diferentes conformaciones de unión se obtuvo agrupando los resultados con una desviación típica de 1,8 Å. La conformación obtenida manualmente estuvo siempre entre las dos mejores conformaciones obtenidas por AutoDock. Bibliografía 295 VI. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 296 VI. Bibliografía Aires-Trapote, A. (2012). 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Tesis Carlos Santiago Bayón Sánchez PORTADA AGRADECIMIENTOS ABSTRACT LISTADO DE ABREVIATURAS INDICE I. INTRODUCCIÓN II. OBJETIVOS III.RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV.CONCLUSIONES V. MATERIALES Y MÉTODOS VI.BIBLIOGRAFÍA