UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Ana Margarita Pozo Méndez Madrid, 2015 © Ana Margarita Pozo Méndez, 1983 Aislamiento de antígenos cancerosos específicos de la membrana plasmática de la célula cancerosa Departamento de Bioquímica Ana Margarita Pozo Mendez llllllllllll ' 5 3 0 9 8 6 2 5 8 3 * UNIVERSIDAD COMPLUTENSE AISLAMIENTO DE ANTIGENOS CANCEROSOS ESFECIFICOS DE LA MEMBRANA PLASMATICA DE LA CELULA CANCEROSA Departamento de Bioqufmica Facultad de Ciencias Quimicas Universidad Complutense de Madrid 1983 HiBLiOTE r,! Coleccién Tesla Doctorales. 251/83 ^ Ana Margarita Pozo Mandez Edita e Imprime la Editorial de la Universidad Complutense de Madrid. Servlelo de Reprografla Novlclado, 3 Madrid-8 Madrid, 1983 Xerox 9200 XB iSO Depdslto Legal: M- 3 9 6 8 7-I9 8 3 ANA MARGARITA DEL I’OZO HLNDCZ AISLAMIF.NTO PE ANTIGGNQS CANCEROSOS I-S P E C I F I C O S .P E LA MEMBRANA PLASMATICA DE LA CELULA CANCEROSA TcA-ci doc^onaZ dO Uglda pofi eJt Pa. V&ZdKo VaJUiadan.z& S&nchtz, Pac^caoa dc lnvej>tXgacA.6n deZ CoMAejo SupeJiZoA. de. hivzAttgacioncs CXentZ^Lc/xh, PxAectoA deX. VepoAtamento d& RioquXnicca Onao£j6gZca, ceJitAo coofidinado deZ C. S . I . C. , iM tC tu to UacZomZ de OncoZogZk, Uadfiid 3 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS SECCION DE qUIMICAS AfiO 1981 I I AGRADECIMIENTO E s te t r a b a jo de in v e s t ig a c iô n ha s id o r e a l iz a d o en e l D e p a rta - mento de B ioquîm ica O n co lô g ica , d e l I n s t i t u t e N acio n a l de O ncolog îa (M i- n i s t e r i o d e l T ra b a jo , San idad y S eg u rid ad S o c ia l ) , c e n t r e co o rd in ad o d e l C onsejo S u p e r io r de In v e s t ig a c io n e s C i e n t î f i c a s . A t r a v é s de una ayuda p r iv a d a a l j e f e d e l D epartam ento se r e c ib e una im p o rta n te subvencion de l a Fundacion C i e n t î f i c a de l a A so c iac io n E spano la C on tra e l C ancer, que ayuda a f i n a n c ia r to d a s l a s in v e s t ig a c io n e s . Dey pues l a s g r a c ia s a d ich a Funda­ c io n po r h a b er c o n tr ib u id o a que e s te t r a b a jo se l l e v a r a a cabo . N i a g ra d e c im ie n to tam biên a l C onsejo S u p e r io r de In v e s t ig a c io n e s C i e n t î f i c a s , que me ha hecho b e n e f i c i a r i a de una b eca p r e d o c to r a l , e s tim u - lan d o a s î mi d e d ic a c iô n a l a in v e s t ig a c iô n . A gradezco mucho a l Dr. Y s id ro V a lla d a re s Sanchez , P ro fe s o r de In v e s t ig a c iô n d e l C onsejo S u p e r io r de In v e s t ig a c io n e s C i e n t î f i c a s y j e f e d e l D epartam ento de B ioquîm ica O n co lô g ica , a s î como a l D r. Ysmael A lvarez R o d rîg u ez , j e f e a d ju n to d e l mismo, su ayuda m oral y m a te r ia l d u ra n te l a d i - re c c iô n c i e n t î f i c a de e s t e t r a b a jo . G ra c ia s a l P ro fe s o r A. H a r t în M unic io , j e f e d e l D epartam ento de B ioquîm ica de l a F a c u lta d de C ie n c ia s de l a U n iv e rs id ad Com plutense de Ma­ d r i d , por c o n s id e r a r d ig n a de p re s e n ta c iô n a e s ta memoria p a ra o p ta r a l g rado de d o c to r . A gradezco asim ism o l a in e s tim a b le ayuda de l a D ra. J o s e f a A lvarez Noves en e l c u rso de l o s e x p erim en to s y a Rocîo A lv a rez por l a t r a n s c r i p - c iô n d e l m a n u sc r ito y l a la b o r f o to g r a f i c a . I l l E stoy ta trb ién carinosam ente. re co n o c id a p o r su ayuda y g r a ta com- p a n îa a mis companeros y amigos A l ic ia Ruano, Ma. D olores B r io n e s , A urora Munoz, E lena A lg a r ra , C oncepcion R e lano , Jo s e V icen te C a rc ia y A u re lia n o A lv a rez . IV PROLOGO E l D epartam ento de B ioquîm ica O n co lô g ica t i e n e p la n tc a d o un arabi- c io s o program s de in m u n o te rap ia a c t i v a e sp e c îC ic a c o r re g id a d e l c a n c e r , f i - n a n c iad o p o r l a A d m in is tra c iô n I n s t i t u c i o n a l de l a S an id ad N acio n a l (AISNA), d e l M in is te r io d e l T ra b a jo , S an idad y S eg u rid ad S o c ia l , e l Cortsejo S u p e rio r de In v e s t ig a c io n e s C i e n t î f i c a s , l a Fundaciôn C i e n t î f i c a de l a A so c iac iô n E spanola C o n tra e l C ancer y l a Com isiôn A seso ra de I n v e s t ig a c iô n C ie n t i f î c a y T êc n ic a , d e l M in i s te r io de E ducaciôn y C ie n c ia . E l p ro y e c to d e s a r r o l la d o en e s t e t r a b a jo forma p a r te de d icho program s. A ctualm en te se a p l i c a l a in m u n o te rap ia o l a m odulaciôn i n e s p c c î f i - c a s d e l c a n c e r , p o r e jem p lo , con BCG, su r e s id u o de e x tr a c c iô n m e ta n ô lic a o MER, e l C o rynebacterium parvimi, e l le v a m iso l y , en p len o d e s a r r o l lo , e l in ­ t e r f e r o n . En f a s e e x p e r im e n ta l s e h a l l a l a in m u n o te rap ia e s p e c î f ic a que , de momento, s e s i r v e de c e lu la s c a n c e ro sa s e n te r a s d e s v i ta l iz a d a s por i r r a d i a - c iô n y aum entada su inm unogenicidad p o r t r a ta m ie n to con io d o a c e ta to . Tam­ b iê n se ban em pleado e x t r a c to s a n t ig ê n ic o s b ru to s o com ple jos a n t ig ê n ic o s . P c ro , l a v e rd a d , e s que no se han a is la d o y c a r a c te r iz a d o lo s a n - t îg e n o s o n c o aso c iad o s y o n c o e s p e c îf ic o s y por lo t a n t o , no e x i s te to d a v îa una in m u n o te rap ia a c t i v a e s p e c î f i c a g e n u in a , d ig n a de t a l nom bre. En e l t e r r e n o d e l a is la m ie n to y c a r a c te r i z a c iô n de l o s a n tîg e n o s o n c o aso c iad o s y o n c o e s p e c îf ic o s , e s t e t r a b a jo p re te n d e c o n se g u ir l a p rim e­ r a p a r te : o b te n e r a n tîg e n o s c a n c e ro so s de t ip o s e s p e c î f ic o y a so c ia d o . P ara e l l o liemos p lan ead o una s e r i e de exp erim en to s o r i g in a l e s que comb in an-una m cto d o lo g îa b io lô g ic a y b io q u îm ic a , l a c u a l inc.luye una t ê c n i ­ ca de in m u nizac iôn s e l e c t i v a en c o n e jo s quim era inm unologica p a ra l a o b te n - c io n de a n tic u e rp o s a n tic a n c e ro s o s e s p e c î f ic o s , la p u r i f ic a c iô n de l a s in - m u n o g lobu linas e s p e c i f ic a s m ed ian te r e c i c lo a sc en d a n te en columna c rom ato - g r â f ic a de c u e n ta s de 10-40 ym de d ia m è tre , de d ex tran o e n tr e la z a d o con e p i - c lo r o h id r in a y l a c ro m a to g ra f îa de a fx n id ad en a g a ro sa a c t iv a d a con bromure de cianôgeno e n t r e in m u n o g lo b u lin as a n t ic a n c e ro s a s e s p e c i f ic a s y a n tîg e n o s de membrana p la sm â tic a de c e lu la s c a n c e ro sa s s o lu b i l i z a d a s por frag m en tac iô n u l t r a s o n ic s . Hemos a lcan zad o e s te prim er o b je t iv o , s i b ie n , p a ra s e r s in c e r o s , no e s ta com ple te . Con la m eto d o lo g îa u t i l i z a d a conseguiraos o b te n e r un com- p le jo de a n tîg e n o s o n c o aso c iad o s y o n c o e s p e c îf ic o s en pequena c a n t id a d . Es n e c e s a r io ah o ra p e n sa r en una tê c n ic a p rc p a r a t iv a p a ra p oder i n d iv id u a l i z a r y c a r a c t e r i z a r cada a n tîg e n o . VI INDICE P ag in as INTRODUCCION 1 MATERIAL Y METODOS 15 I . CULTIVO DE TEJIDOS ESTACIONARIOS EN MONOCAPA 15 A. C a r a c t e r î s t i c a s de l a s c e lu la s u t i l i z a d a s . 15 A . l . C e lu la s HeLa. 15 A .2 . C e lu la s EREA. 17 B. T êc n ic a de s u b c u l t iv o . 17 C. S o lu c io n e s y m edios de c u l t iv o , 19 I I . CULTIVO DE CELULAS EN SUSPENSION 22 A. C a r a c t e r î s t i c a s de l a s c e lu la s u t i l i z a d a s . 22 A . l . C ê lu la s CAE. 22 B. T êcn ica de s u b c u l t iv o . 22 I I I . CULTIVO DE CELULAS "IN VIVO" 24 A. C a r a c t e r î s t i c a s de l a s c ê lu la s u t i l i z a d a s . 24 A . l . C ê lu la s CAEL. 24 B. T êc n ic a de t r a s p l a n t e . 24 IV. AISLAMIENTO DE LA MEMBRANA PLASMATICA 24 A. T êc n ic a u t i l i z a d a . 24 A . l . P a ra c ê lu l a s c u l t iv a d a s " in v i t r o " . 25 A .2 . P a ra c ê lu la s c u l t iv a d a s " in v iv o " . 28 V II A .3. P a ra t e j i d o s . 28 B. D iso lu c io n e s em pleadas ' 30 V. SOLUBILIZACION DE LA MEMBRANA PLASMATICA 32 A. Tê c n ic a u t i l i z a d a . 33 B. D iso lu c io n e s em p lead as. 34 VI. INMUNIZACION DE CONEJOS , 34 A. T êcn ica de in m u n izac iô n s im p le . 35 B. T êcn ica de inm uniza c iô n en co n e jo s qu im era in m u n o lo g ica . 36 V II . OBTEN.CION DE INMUNOSUEROS 36 A. T ê c n ic a . 36 V II I . AISLAMIENTO DE INMUNOGLOBULINAS POR CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN RECICLO ASCENDENTE 37 A. T ê c n ic a . 40 B. D iso lu c io n e s em p lead as. 42 IX. aislam iento DE ANTIGENOS POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD 43 A. T ê c n ic a . - 44 A .l . P re p a ra c iô n d e l le c h o . 44 A .2 . O fe r ta de l a m ezcla de a n tîg e n o s . 45 B. D iso lu c io n e s em p lead as. 48 X. valoracion de PROTEINAS 50 A. T êcn ica de a n â l i s i s . 50 B. D iso lu c io n e s em pleadas. 51 X I. INMUNODIFUSION 53 A. T êc n ic a . 53 V I I I B. D iso lu c io n e s e m p lead as . 55 X II. INMIINOELECTRO PORES IS ' 56 A. T ê c n ic a . 56 B. D iso lu c io n e s em p lead as . 57 X I I I . MICROMETODO PARA TITULACION DE CITOTOXICIDAD 58 A. T êc n ic a de t i t u l a c i o n de c i t o to x ic id a d de lo s a n t i s u e r o s . 58 B. T êc n ic a de t i t u l a c i o n de in h ib ic io n de c i to to x ic id a d de l o s a n t i s u e r o s p rev iam en te ab so rb id o s con a n t i - g e n o s . 59 XIV. PRUEBA DEL ANILLO 59 A. T ê c n ic a . 60 XV. CURVA DE PRECIPITACION CUANTITATIVA 60 A. T ê c n ic a . 60 XVI. INMUNOGENICIDAD 61 A. T ê c n ic a . " 61 XVII. INMUNOPEROXIDASAS - 62 A. T ê c n ic a de co n .ju g ac io n . 62 B. T êc n ic a p a ra l a o b se rv ac io n a l m ic ro sc o p ic o p t i c o . 63 C. T êc n ic a p a ra l a o b se rv a c io n a l m ic ro sc o p ic e l e c t r o - n i c o . 64 D. D iso lu c io n e s em p lead as . 65 X V III. MEDIDA DE RADIACTIVIDAD 67 A. T ê c n ic a . 67 B. D iso lu c io n e s e m p lead as . 68 IX XIX. METODOS CITOLOGICOS 68 A. T êcn ica de f i j a c i o n y t in c io n de c u l t iv o s c e l u l a r e s . 68 B. T êcn ica p a ra re c u e n to de cê lu l a s t o t a l e s . 69 C. T êcn ica p a ra re cu e n to de v i a b i l id a d ce l u l a r . 69 D. D iso lu c io n e s , f i j a d o r e s y c o lo ra n te s em pleados. 70 RESULTADOS 72 I . OBTENCION DE LA MEMBRANA PLASMATICA 72 A. Ensayos p r e v io s . 72 A .l . H om ogeneizaciôn. 72 A .2. E s tu d io d e l g ra d ie n te de s a c a ro s a . 85 B. R e s u l ta d o s . , 99 B . l . C ê lu la s HeLa. 99 B .2 . C ê lu la s CAEL. 99 B .3 . C ê lu la s CAE. 100 B .4 . T e jid o s norm ale's. 101 I I . SOLUBILIZACION DE MEMBRANAS 101 A. E s tud io de a g re g a c io n . 101 A . l . F a c to re s que in f lu y e n en l a a g re g a c io n y e v o lu c iô n en e l tiem po . 102 A .2. D iso lu c io n e s em p leadas. 114 I I I . INMUNOSUEROS OBTENIDOS 118 A. Inm unosuero a n ti - p e r o x id a s a s . 118 A . l . P rueba d e l a n i l l o . 118 A .2 . T î tu lo d e l inm unosuero . 119 A .3. C urva de p r e c ip i t a c io n c u a n t i t a t i v a . 119 A .4 . P u n to de e q u iv a le n c ia . 119 A .5 . V a len c ia a n t ig e n ic a . 120 B. Inm unosueros an ti-m em b ran as . 120 B . l . P ru eb a d e l a n i l l o . 122 \ B .2 . M icrom etodo p a ra t i t u l a c i o n de c i t o to x ic id a d 123 a . Inm unosuero an ti-m em branas de c e lu la s n o rm a le s . 123 b . Inm unosuero an ti-m em brana de c e lu la s CAEL. 123 c . Inm unosuero anti-m em brana de c e lu la s CAEL o b te n id o de co n e jo s q u im e r iz a d o s . 124 c . l . V a io rac io n c u a l i t a t i v a de lo s inm iinosueros o b te n id o s p o r d i f e - r e n te s p ro c e d im ie n to s . 127 C.2 . E s p e c if ic id a d de lo s a n t i c u e r ­ pos o b te n id o s p o r in m u n izac iô n s e l e c t i v a en c o n e jo s quim era in m u n o lô g ica . 131 IV. AISLAMIENTO DE INMUNOGLOBULINAS ̂ 134 A. Ensayos p r e v io s . 134 B. R e s u l ta d o s . 144 V. OBTENCION DE ANTIGENOS POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD 150 A. P ru eb as p r e v ia s . 150 XI A .l . E s tu d io de l a d e s n a tu ra l iz a c iô n d e l l ig a n d o . 150 A .2. F i ja c io n de p r o te în a s a Sepharosa 4B a c t iv a ­ da con CNBr. 151 B. E xperim entos c o n t r o l . 151 B . l . S istem a p e ro x id a s a s /a n t ic u e rp o s a n t ip e ro - x id a s a s . 151 C. O btencion de a n tîg e n o s o n c o e s p e c îf ic o s y oncoaso­ c ia d o s . 172 C . l . C ro m ato g rafîa de a f in id a d en m icrocolum nas con a n tîg e n o s r a d ia c t iv o s . 172 C .2 . S istem a membranas de CAEL/an.ticuerpos a n t i - a n tîg e n o s n o rm ales . 186 C .3 . S istem a membranas de C A E L/anticuerpos a n t i - a n tîg e n o s c a n c e ro s o s . 188 V I. PRUEBAS DE INMUNOGENICIDAD 191 DISCUSION 216 I . INTRODUCCION Y ESQUEMA GENERAL DEL PROYECTO 216 I I . OBTENCION DE FRAGMENTOS DE MEMBRANA PLASMATICA SOLUBILIZADA 219 I I I . OBTENCION DE ANTICUERPOS ANTICANCEROSOS ESPECÎFICOS 221 IV. OBTENCION DE ANTIGENOS CANCEROSOS ESPECIFICOS POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD 223 CONCLUSIONES 234 X II BIBLIOGRAFIA 236 INTRODUCCION Uno de lo s o b je t iv o s p r i o r i t a r i o s en l a in v e s t ig a c iô n o n c o lô g ic a ha s i ­ do l a busqueda de d i f e r e n c ia s en l a com posiciôn de l a s c ê lu la s c a n c e ro sa s y norm ales cap aces de in d u c i r una r e s p u e s ta in m u n o lô g ica . D uran te mucho tiem po se d e b a tiô l a e x i s te n c i a de e s ta s d i f e r e n c i a s , p e - ro e l d e s a r r o l lo de l a s t ë c n ic a s inm uno lôg icas e x p é r im e n ta le s penn t i ô d e - m o s tra r l a p re s e n c ia en l a s c ê lu la s c a n c e ro sa s de a n tîg e n o s no d é te c ta b le s en l a s c ê lu la s no rm ales de lo s t e j i d o s hom ôlogos. P . E h r lic h (1906) demost r ô que lo s r a to n e s a lo s que se t r a s p la n t a b a un tum or e ra n cap aces de r e d ia z a r un segundo t r a s p la n t e d e l mismo tum or. L. G ross (1943) u t i l i z ô cepas î n s i t a s de r a to n e s (a n im ale s h o m o zig ô tico s r é s u l ­ ta n t e s d e l c ru ce consangu îneo d u ra n te 25 geneV aciones) lo g ran d o una mayor B u p e rv iv e n c ia en lo s grupos de an im ales que h a b îa n s id o p rev ia m e n te inm uni- zados con l a s mismas c ê lu la s tu m o ra le s . Gross provocô sarcom as con m c t i lc o - la n t r e n o y lo s t r a s p la n tô a r a to n e s s in g ê n ic o s m ed ian te in o c u la c iô n i n t r a - d ê rm ica . A lred ed o r d e l 20 % de lo s a n im a le s d e s a r r o l l a r o n d u ra n te c i e r to tiem po tum ores in tra d ê rm ic o s que luego r e g re s a ro n ; e s to s r a to n e s e r a n r e ­ s i s t e n te s a p o s t e r io r e s t r a s p la n t e s de l a misma l în e a tu m o ra l. D iez anos mas t a r d e , E .J . F o ley (1953) ob tuvo lo s mismos r e s u l ta d o s e s tu d ia n d o l a c ap a c id a d de rech azo de i s o t r a s p l a n t e s de tum ores in d u c id o s po r m e t i lc o la n t r e n o en a n im a le s en lo s que se h a b îa hecho r e g r e s a r c l m is­ mo tum or i n t e r rum piendo l a c i r c u la c iô n p o r l ig a d u r a v a s c u la r . Los ra to n e s em pleados p o r .F o ley e ra n endogâm icos p e ro no i s o a n t ig ê n ic o s y su s r e s u l t a ­ dos fu e ro n c r i t i c a d o s dada l a p o s ib le in f lu e n c i a de f a c to r e s h e t e r o z i g ô t i - COS residuales. En 1957 e s to s ex p erim en to s fu e ro n am pliados y co n firm ados por R.T. Prehn y J.M . Main , q u ien e s e lim in a ro n e l p rob lem s de lo s f a c to r e s h e te r o z i - g o tic o s r e s id u a le s u t i l i z a n d o an im ales ad ecuados, de jando a s î to ta lm e n te dem ostrada l a e x is te n c i a de a n tîg e n o s e s p e c î f ic o s en l a s c ê lu l a s can cero ­ s a s . En lo s tum ores in d u c id o s p o r c a n c e rîg e n o s q u îm ico s, lo s a n tîg e n o s en - c o n tra d o s se com portaban como e s p e c î f ic o s de cada tumor e in d iv id u a le s , e s to e s , dos tum ores in d u c id o s en e l mismo an im al p o r e l mismo can c e rîg e n o dem ostraban p ro p ied a d es a n t ig ê n ic a s d i f e r e n te s y p a r t i c u l a r e s , no e x i s t i e n - do re a c c io n e s c ru za d as e n tr e lo s a n tîg e n o s de ambos tum ores. En lo s tum ores p ro d u c id o s por v i r u s oncôgenos se pudo d e m o s tra r p o s te - r io rm e n te que, ademas de a n tîg e n o s e s p e c î f ic o s de cada tum or, se pueden de- t e c t a r a n tîg e n o s comunes muy p o te n te s en to d o s lo s tum ores p ro d u c id o s por un mismo v i r u s , sea en d i s t i n t o s an im ales de l a misma r a z a , en d i s t i n t a s ra z a s de una misma e s p e c ie , e in c lu s o en tum ores in d u c id o s p o r e l mismo v i ­ ru s en an im ales de d i s t i n t a s e s p e c le s . Las c ê lu la s tu m o ra les que p re se n ta n l a mayor gama de a n tîg e n o s son l a s tran s fo rm a d as p o r v i r u s oncogenos; en e l l a s se pueden d i s t i n g u i r : 1. A n tîg en o s que forman p a r te de l a s p a r t î c u l a s v î r i c a s m aduras, 2. a n tîg e n o s n e c e s a r io s d u ra n te l a s î n t e s i s de lo s a n te r io r e s y 3. a n tîg e n o s v ir o in d u c id o s : a ) que s o lo fu n c io n an como te c u e rd o d e l d e s a r r o l lo f i l o g e - n ê t i c o , pueden d a r lu g a r a re a c c io n e s c ru z a d a s , b) que so lo fun c io n an como re cu e rd o de a lg u n o s momentos d e l d e s a r r o l lo o n to g ê n ic o , como pueden s e r lo s a n tîg e n o s e m b rio n a rio s y c) que ponen en m archa fu n c io n e s e s p e c î f ic a s de l a s d i s t i n t a s c e ­ l u l a s p lenam en te d i f e r e n c i a d a s . En l a t a b l a I tomada de Y. V a lla d a re s (1 9 7 7 ), s e puede v e r l a c o m p le ji- dad y v a r ie d a d a n t ig é n ic a de lo s v i r u s de l a leu cera ia m urina . E s to s a n t îg e ­ nos pueden s e r d e te ç ta d o s en to d o s lo s tum ores in d u c id o s po r e s to s \ v i r u s (F . L i l l y y R. S te e v e s , 1974). . En l a t a b l a I I s e r e la c io n a n lo s a n tîg e n o s d é te c ta b le s en l a s d ê lu la s l in f o id e s humanas tra n s fo rm a d a s p o r c l v i r u s de E p s te in -B a rr . E s te a g en te e s e l mas p ro b a b le c a n d id a te de e t i o l o g î a v î r i c a de un tum or humano, e l lin fo m a de B u r k i t t , p e ro p a rec en e x i s t i r o t r o s h e r p e s v i r u s r e la c io n a d o s con tum ores humanos (H. zu r H ausen, 1975; Y. V a l la d a r e s , 1977). En l a t a b la a n t e r i o r s e h ace r e f e r e n c i a a l a s té c n ic a s u t i l i z a d a s p a ra i d e n t i f i c a r lo s a n tîg e n o s tu m o ra les c o n o c id o s , p e ro c x is te n ademas o t r o s a n tîg e n o s en e se modelo que s o lo pueden d e te c ta r s e p o r experim en to s de r e ­ chazo de t r a s p l a n t e . P or s î s o lo s lo s p roced im ien tcfs que e s tu d ia n e l rech azo de t r a s p la n t e p e rm iten d e te rm in a r un numéro muy l im ita d o de a n tîg e n o s , ya que so lo d e te c - ta n a q u e l lo s a n tîg e n o s que son inm unogénicos y e f i c a c e s , o s e a , que son c a ­ p a ce s de in d u c i r una r e s p u e s ta inm uno lôg ica e f e c t iv a c o n tra l a s c ê lu l a s tu ­ m o ra le s . Hoy sabemos que e x i s t e n , adem as, num erosos a n tîg e n o s que son inmu- n o g ên ico s pero no e f i c a c e s , e s d e c i r , que inducen una r e s p u e s ta in m uno lôg i­ c a , d e te c ta b le p o r d i s t i n t o s p ro c e d im ie n to s , pe ro in c a p a z de re c h a z a r a l t u ­ mor y sabemos que e x is te n tam biên a n tîg e n o s tu m o ra les no inm unogén icos, que no provocan n in g u n t ip o de r e s p u e s ta y que so lo pueden s e r d e te ç ta d o s p o r TABLA I ANTIGENOS DE LOS VinUS DE LA LEUCEMIA MURINA (MuLV) Glicoprolelnas 69-7J (gp69/71) = anligeno Jntcrespecifico 11; 8 % de 1ns proteinas viricas; antîgeno intciespecHlco (2 nioléculas de 69.000 y 71.000 dallons); form a la cubierta. El antîgeno gp69/7l se ha cncontrodo en algunos tum ores humanos. Prolelna 12 (pl2) (12.000 dallons); posee déterm inantes de grupo y de tlpo; es superficial. VEA («Virus Envelope Antigens*):. Subgrupo virico MiiLV-i: especifico de) virus de Cross. Subgrupo virico MuLV-2: Tipo A Virus LLV-Friend, virus de Graffi, virus B/T-L de Tennant. virus SimLV, virus de Rowson-Parr. Tipo B: Virus de Moloney, virus de Abclson. Tipo C: LLV-Rauscher, virus de Rich, virus de Breycre Moloney. Tipo D: Virus de Buffet 334C. gs-] (grup specific-1) 30 % de las prcteinas viricas; envuelve al nu cleoide; especie especifico (solo en virus murinos) r: antipeno interespe- cifico I = pro ieina 30 (p30) (30.000 dallons) contiene el déterm inante gs-3. Antîgeno Interespeclfico (en virus de raton, ra ta , criceto y gato, pero no en virus de polio y primates). p30 se ha cncontrado recientem ente en algunos tum ores humanos. . T ranscrip tasa Inversa, 70.000 dallons, es subunidad de un complejo pro teico mayor. Se encuentra en el nucleoide. Posee déterm inantes Inter- especlficos y de grupo. La contienen algunos tum ores humanos. Protelna 15 (pis) (15.000 daltons). Antîgeno del nucleoide no asociado a la BNP. Protelna 10 (plO) • (lO.CCO daltons); se asocia a la RNP del nucleoide; es grupo especîfica CSA («Cell Surface Antigens*): Grupo G (antîgenos de la leucemia de Gross) antîgeno G y antlgc- no Cix. El antîgeno G existe solo en m em brana celular y en form a so­ luble en el suero, pero no en cl viriôn; el antîgeno Gix es controlado genéticam ente y aparece en linfocitos AKR no Icucémicos y en tlino de cepas como la 129, caren'.c de MuLV. Grupo FMR (Friend Moloney Rauschor) Existe en los virus de Friend. Moloney, Reuscher y Graffi. El antîgeno FMR se révéla en la superficie celu lar y en forma soluble en el suero. No obstante, parece existir antl- geno FMR en proyecciones de la cubierta, en form a no inmunogénica. NA: antîgenos niicleares viroinformados y viroinducidos. s > w > g Jz; l.i 5 M g «n K WW OTO P4 M b] M OT < .. o M d O- O Q) p, to «c a %,% w a|cr> R * r . p d « 01 « . o il 00 c H 0) d d 8'-' Sô S t ) •H d . 0) 4 4 Sid H d p. f «0 ^ W g d d | ^ O s “ “=d .« T ' g pè t o ^•H *H & G ig ^ w i g î j & o d :d | u :;i! s S'g a iP .m ^ d x-\ M •-* CO.VO o . w 011^ wj re a c c io n e s h e te ro lo g a s . ' La f a l t a de e f i c a c i a de a lg u n o s a n tîg e n o s p a ra promover una r e s p u e s ta inm unolog ica e s uno de lo s to p ic o s mas a p a s io n a n te s de l a inm unolog îa tumo­ r a l . La cap ac id ad de r e s p u e s ta a n te c u a lq u ie r a n tîg e n o e s ta g e n é tica m e n te c o n tro la d a y lo s genes im p licad o s en e s te c o n tr o l în tim am en te re la c io n a d o s con lo s que d e te rra in an lo s a n tîg e n o s de h is to c o ra p a t ib i l id a d ( I . G reen , 1974). F o r o t r a p a r te , e l s is te m a de v ig i l a n c i a inm uno log ica ju eg a un p a p e l muy im­ p o r ta n te en e l re co n o c im ien to y l a r e s p u e s ta d e l organism e c o n tra c u a lq u ie r a n tîg e n o , de t a l m anera que a n tîg e n o s p ro p io s d e l organism e que s e producen en l a s p rim e ras f a s e s d e l d e s a r r o l lo e m b rio n ario y d e ja n de p r o d u c ir s e an­ t e s de que se d e s a r r o l l e e l s is te m a in raunolog ico pueden s e r cap aces de d e s- p e r t a r u l te r io rm e n te una r e s p u e s ta inm unolog ica (enferm edades a u to in m u n es ) . Por e l c o n t r a r io , a n tîg e n o s e x tra n o s a l o rgan ism e que se produzcan a n te s de la m aduracion d e l s is te m a de v ig i l a n c i a in m u n o lo g ica , pueden s e r a ce p ta d ô s p a rc ia lm e n te como p ro p io s p a ra im p ed ir una r e s p u e s ta inm unolôg ica in te n s a que s e r î a l é t a l p a ra e l organ ism e (c o r io m e n in g i t is l i n f o c i t a r i a ) . U ti liz a n d o d iv e r s a s t é c n ic a s (JR. W e il , 1978) se ha deraostrado l a e x is ­ te n c ia en d i s t i n t a s c ê lu la s tu m o ra les de a n tîg e n o s que no co rre sp o n d en a l t ip o h i s to lô g ic o d e l que d é r iv a e l tum or, pero que son norm ales y s e e x p re - san h a b itu a lm e n te en o t r o s t e j i d o s a d u lte s d e l mismo organ ism e. Tambiên se han d e s c u b ie r to en muchos tum ores a n tîg e n o s que no c s ta n p ré s e n te s en l a s c ê lu la s norm ales a d u l t a s , p e ro que s in embargo s e producen en d i s t i n t o s mo­ mentos d e l d e s a r r o l lo e m b rio n a rio y f e t a l . En la t a b l a I I I , tomada de Y. V all a d a re s (1 9 7 7 ), se recogen a lg u n o s de lo s a n tîg e n o s humanos b ie n c a r a c te r iz a d o s que inducen re a c c io n e s i n r a u n o l ô - TABLA H I ANIIGENOS DE MEMBRANA INDUCTORES DE REACCIONES INMUNOLOGICAS CITOTOXICAS T lp o d e tu m o r y a n t îg e n o s M o r illd o d e te c tro fo ré l i c a e n PA G E te n cm ) C o m p o sic iô n q u lm lc a P. M . a p ro x im a d o t*l C A R C IN O M A E PID E R M O ID E Ag F I Ag F 2 Ag F 3 Ag F 4 Ag HSV TA 5.3 8.4 9.2 10.2 3,25; 3.85 Protelna Lipoprolelna Protelna Protelna Protelna 51.000 d 100.000 d 400.000 d 500.000 d 61.000 d; 40.000 d A D E N O C A R C IN O M A Ag F 3 Ag F 4 Ag TA 1 Ag TA 2 9.2 10.2 5,4 7.3 Protelna Protelna Protelna Protelna 400.000 d 500.000 d 51.000 d 80.000 d T V M O R D E C EI.U LA S D E A V EN A Ag TA 1 Ag TA 2 Ag TA 3 5.4 7.3 6.6 Protelna Protelna LIpoproteIna 51.000 d 80.000 d 76:500 d PU L M O N F E T A I DE 7 S SE M A N A S Ag F 1 Ag F 3 Ag F 4 5.3 9.2 10.2 Protelna Protelna Protelna 51.000 d 400.000 d 500.000 d P U L M O N FE TA L D E S M E SE S Y PU L M O N A D U LTO N O R M A L Ag F 2 8.4 LIpoproteIna 100.000 d A ( o A n llK en o r = F * l« l . TA = Tumor-stociado H5V = Herpesviruf «Impie» hominis tlpo I * Juzgado por el P. M. de proteinas tipo de movilidnd electroforétira similar. PAGE = eleclroforesls en geles de poliacrllamida. g ic a s de c i to to x ic id a d en l e s tum ores de pulfnon. Gran p a r te de c so s a n t i ­ gènes son em b rio n a rio s o f e t a l e s . Los a n tîg e n o s f e t a l e s han s id o re v is a d o s por v a r ie s a u to r e s , e n t r e lo s que se puede d c s ta c a r P . A lexander (1 9 7 2 ). Los a n tîg e n o s o n c o fc ta le s pueden a p a re re c e r en c u a lq u ie r t ip o de c é lu la c a n c e ro sa , son m acrom oléculas p ré s e n te s en e l f e to y g en era lm en te a u se n te s en e l in d iv id u o norm al a d u l te . R ep resen tan e l fenomeno de e x p re s iô n r e t r o - g e n é t ic a . Ya en 1906, G. S ch One e n c o n tre que in y ec tan d o ra to n e s con t e j i d o s t’é ­ t a l e s , e s t e s a d q u ir îa n cap ac id ad de re c h a z a r t r a s p la n t e s de t e j i d o s tum ora­ l e s , m ie n tra s que lo s t e j i d o s a d u l te s no p ro d u c îa n e s t a r e s p u e s ta . En 1930, L. H ir s f e ld y W. M alber d e te c ta ro n l a p r e s e n c ia de a n tîg e n o s em b rio n ario s en e x tr a c to s de tu m o res, pero no se e s tu d ia r o n b ie n h a s ta mu­ cho despuês deb ido a la s c a n tid a d e s ta n pequehas que s e e n c o n tra b a u , que n e c e s i ta b a n té c n ic a s mas s o f i s t i c a d a s d e s a r r o l la d a s p o s te r io r m e n te , como e l rad io inm unoensayo . En 1963, G . I . A belev e s t a b l e c iô que l a a - f e to p r o te în a e n c o n tra d a en lo s tum ores de h îg ad o e r a a n tig é n ic a m e n te i d é n t i c a a una a - g lo b u l in a d e te c ta d a en 1957 por C. B e rg st r a n d y B. C zar en f e to s hum anos, que e s s in t e t i z a d a po r e l parénquim a d e l h îgado f e t a l y por l a ex trem id ad c e f â l i c a d e l tubo e m b rio n a rio d ig e s t iv e . La a - f e to p r o te în a t ie n e un peso m o le c u la r d e l o rden de 72.000 D, mo- t i l i d a d a , c o n s ta n te de se d im e n tac io n de 4 ,5 S y c o n tie n e 2 ,3 % de h id r a - to s de carb o n o . Se puede d e te c t a r su p re s e n c ia p o r dob le d i f u s io n y r a d io - i timon o en say o . O tra p r o te in a s e n c o n tra d a en cê lv ila s de o r ig e n f e t a l es l a H f e r r o p r o - t c în a e n c o n tra d a p o r D. B iiffe y c o l s . (1 9 7 0 ); tam bién se produce en e l h î - gado f e t a l y e s t a r e la c io n a d a con l a f e r r i t i n a ; es una a - g lo b u l in a . En 1965, P . Gold y S. Freedman d e scubr ie r o n una s u s ta n c ia e n c o n tra d a en c l carcinom a de co lon que denom inaron a n tîg e n o c a rc in o e m b rio n a r io ( a b re - v iad o CEA, p o r c^arcino-em bryonic a n t ig e n ) ; e s t e com puesto se d é te c ta tant- b ie n en lo s ô rganos de f e to s humanos de 2 a 6 m eses. Sobre lo s a n tîg e n o s c a rc in o e m b rio n a r io s se ban r e a l iz a d o muchos e s t u - d io s como e l de P. A lex an d er (1972) o e l de D.G. P r i t c h a r d y c o ls . (1978) so b re a qu îm ica de e s to s com puestos. E l a n tîg e n o c a rc in o e m b rio n a r io es una g l ic o p r o te în a con una r e la c io n . g lu c id o s tp r o te în a s v a r ia b le , d e l o rd en de 3 :1 , s ie n d o e l p r i n c i p a l h i d r a - to de carbono l a N -a c e t ilg lu c o s a m in a . Es re la tiv a m e n te a s t a b l e . Da un u n ico p ic o en u l t r a c c n t r i f u g a c io n a n a l î t i c a , con un c o e f i c i e n te de 6 ,8 5 , segun lo s e s tu d io s de J .E . C o lig an y c o ls . (1 9 7 2 ). Su peso m o le c u la r prom edio e s - tu d ia d o p o r H .S . S la y te r y J .E . C o ligan (1975) m ed ian te e l e c t r o f o r e s i s en g e le s de p o l ia c r i la m id a con d o d e c i l s u l f a to de so d io e s de 180.000 D. En in m u n o e le c tro fo re s is en a g a r a pH 8 ,6 lo s CEA em igran a l a re g io n de l a s P - g lo b u l in a s , segun e s tu d io s de J . Krupey y c o l s . (1 9 6 8 ). También s e han r e a l iz a d o e s tu d io s de lo s CEA a l m ic ro sco p io e l e c t r o n i - co (U .S . S la y te r y J .E . C o lig a n , 1975), que nos lo s m u estran como una p o - b la c iô n homogènes de p a r t i c u l e s con form a de v a r i l l a e n ro sc a d a con dim en- s io n e s de 9 x 40 nra. Los CEA po seen una cadena p o l ip e p t îd i c a s im p le , ya que 10 no s e p roduce v a r ia c io n en su peso m o lecu la r p o r a lq u i l a c io n o re d u c c io n . Los CEA tie n e n 6 p u en te s d is u l f u r o con c i s t i n a y no t ie n e n grupos c i s - t e in a l i b r e s , segun l a s in v e s t ig a c io n e s de J . l l . Westwood y P . Thomas (1 9 7 5 ), Debido a su a l t o co n te n id o en h id r a to s de carbono son s o lu b le s en a c i - do p e r c lo r i c o , lo que p e rm ite s e p a ra r lo s d e l r e s to de l a s p r o te in a s . Su p re s e n c ia puede s c r d e te c ta d a p o r in m u n o e le c tro fo re s is , doble d i f u ­ s io n y rad io inm unoensayo . O tra p ro te in a de o r ig e n f e t a l e s l a e n c o n tra d a p o r R.C. N airn y c o l s ■ (1 9 6 2 ), l a s u l f o g l ic o p r o te in a f e t a l , que ap a re ce en lo s carcinom as de e s t o - mago. En c o n d ic io n es norm ales e s un componente i n t e s t i n a l e m b rio n a rio y f e ­ t a l que d e sa p a re ce despues d e l n a c im ie n to , pcro que a p a re c e de nuevo en l a s n e o p la s ia s , ya sean b en ig n as o m a lig n as . O tro s a n tîg e n o s menos e s tu d ia d o s son y - f e to p r o t e în a , que no t ie n e e s - p e c i f ic id a d dc e sp e c ie y se ha d e s c r i to en e l 75 % de lo s t e j i d o s tu m o ra les y e l a n tîg e n o c a r c in o f e t a l g l i a l (CECA), d e s c r i to en g liom as humanos. S i hubo una epoca en l a que se dudaba de l a e x i s te n c i a de a n tîg e n o s p ro p io s de lo s tum ores, hoy e s t a l l a d iv e r s id a d de a n tîg e n o s tu m o ra les que e s n e c e s a r io u n i f i c a r co ncep tos y te rm in o lo g ie s . Al p r i n c i p l e todos lo s a u to re s d e s c r ib îa n como a n tîg e n o s o n c o e s p e c îf i - c o s , tu m o r-e s p e c îf ic o s o c â n c e r -e s p e c îf ic o s a c u a lq u ie ra de lo s a n tîg e n o s d e te c ta d o s en un tumor que no e x i s t i e s e n en l a s c e lu la s norm ales hom ologas d e l mismo t ip o de t e j i d o y ô rg an o . A sî se v ie n e h ab lan d o de a n tîg e n o s tumor- e s p e c î f ic o s de rech azo de t r a s p J a n te (a b re v ia d o TSTA p o r ^umor s p e c i f i c J t r a n s p la n ta t io n a n tig e n ) o de a n tîg e n o s tu m o r-e s p e c îf ic o s de l a s u p e r f i c i e c e l u l a r (a b re v iad o TSSA por _tumor s p e c i f i c £ u r fa c e ja n tig e n s ) . 11 Al d e s c u b r i r que g ran p a r te de lo s a n tîg e n o s d e s c r i t o s como e s p e c î f i - cam ente tu m o ra le s son unas v eces a n tîg e n o s v î r i c o s , o t r a s v eces p r o te în a s norm ales que se p r e s e n ta n con una l o c a l iz a c id n té m p o ro -e sp a c ia l an o rm al, a n tîg e n o s e m b r io n a r io s , f e t a l e s o e c tè p ic o s , a lgunos a u to re s em pezaron a h a b la r de a n tîg e n o s o n co aso c iad o s en g e n e ra l , re se rv a n d o e l te rm in o de o n c o e s p e c îf ic o s p a ra d e s ig n a r a q u e llo s a n tîg e n o s i n t r î n s e c a ÿ e s p e c î f i c a - mente re la c io n a d o s con l a t ra n s fo rm a c iô n n e o p lâ s ic a y e l c a r a c t e r c a n c e ro - 80 . S in em bargo, a c tu a lm e n te s e s ig u e n u t i l i z a n d o ambas te r m in o lo g îà s . Los a n tîg e n o s o n c o e s p e c îf ic o s y o n co aso ciad o s s e pueden c l a s i f i c a r de acuerdo con d i s t i n t o s c r i t e r i o s . Podemos d i s t i n g u i r : a ) De acu erd o a su o r ig e n . a . 1) P ro p io s d e l o rgan ism e - e m b rio n a rio s - ' f é t à l e s - e c tô p ic o s a . 2) E x tra n o s a l o rgan ism e - v î r i c o s - n e o a n tîg e n o s b) De acu erd o a su cap ac id ad p a ra p ro d u c ir una r e s p u e s ta inmu- n o lo g ic a : b.l) Inm unogénicos - e f ic a c e s - in e f i c a c e s b .2 ) No inm unogénicos 12 c) De acuerdo con su lo c a l iz a c io n to p o g ra f ic a a n iv e l dc l a c e - l u la c . l . ) I n te rn e s - n u c le a re s - c ito p la s in ic o s m lto c o n d r ia le s rib o so m ico s r e t ic u lo - e n d o p la s m a t ic o s . s o lu b le s C . 2 ) S u p e r f ic ia le s - de l a meirbrana p la sm a tic a o a so c iad o s a e l l a E s ta c l a s i f i c a c i o n d e s c r ip t i v e , m atizando l a lo c a l iz a c io n c e l u l a r , p e rm ite conocer s i l a s d i f e r e n c ia s o b se rv ad as en l a inm unogenicidad de un a n tîg e n o dependen de su a c c e s ib i l id a d a l reco n o c im ien to y so b re todo a l a r e s p u e s ta d e l s is te m a inm uno log ico . A s î, p o r e jem p lo , sabemos que todos lo s a n tîg e n o s TSTA son TSSA, p e ro no todos lo s a n tîg e n o s TSSA son TSTA. E.W. Lamon (1974) ha e s tu d ia d o l a r e s p u e s ta in im m ologica f r e n te a lo s a n tîg e n o s onco aso c iad o s in d u c id o s p o r lo s v i r u s y R .B. Herberman (1977) ha a n a liz a d o e l problem a de l a inm unogenicidad de lo s a n tîg e n o s tu m o ra les . Las p o s ib i l id a d e s de u t i l i z a c i o n p r â c t i c a que pueden d e r iv a r de un me- j o r conocim ien to de e s to s a n tîg e n o s son muy g ra n d es . Pero es n e c e sa r io po­ ne r a punto p ro c ed im ie n to s que p c rm itan su a is la m ie n to , i d e n t i f i c a c io n y p u r i f ic a c io n . Es to fue lo que nos movio a p la n e a r una s e r i e de ex p erim en to s con lo s c u a le s , combinando p ro c ed im ie n to s b io lo g ic o s y b io q u îm ic o s , fueram os capa- 13 ces de a i s l a r lo s a n tîg e n o s o n c o e s p e c îf ic o s y o n c o aso c iad o s . Al e f e c to disenam os e l p ro y e c to esq u em atizado en l a f ig u r a 1, 14 AISlAtCBrrO DE ANTIGENOS CAHCEKOSOS ESPECIFICOS E 5 Q D E M A C É H E K A L CROHATOCSAFIA DE SEEHAinSA AB (CNBr) CAECA DE Ig OFERIA DE ANTTCEBOSOFERIA DE ANTICENOS ( - lEMDHOSDEEOS OBTESCIOH DC PEUCBAS K tHHDWXZNIClDAS SEPHAWSA «B (CNBr) SCniABOSA «B (CNBr) AISLAMIEHTC T CAKACtEKIZACIOR qUUCRIZACIOM INMDHOLOCICA E TNMmiIZACION SELECT IVA AISLAHIEKtO DE Ig SEPHADEE C-150 AISLAMUno DC Ig FOC EECICIO SCFRADEE C-150 AISLAMIENTO DE Ig SEFHAOEX C-150 15 MATERIAL Y METODOS I . CULTIVO DE TEJIDOS ESTACIONARIOS EN MONOCAPA Se u t i l i z a r o n l a s l în e a s c e lu la r e s HeLa y EREA. Son l în e a s e s t a b l e c i - d a s o c o n t in u a s , ya que s e ban consegu ido a d a p ta r a c rec .e r " in v i t r o " de form a p o te n c ia lm e n te in d e f in id a . A. C a r a c t e r l s t i c a s dé l a s c e lu l a s u t i l i z a d a s . A .I . C e lu la s HeLa. (F ig u ra 2 ) . L as c e lu la s HeLa fu e ro n e s ta b le c id a s por G.O. Gey , W.D. Coffman y M.T. K ubicek en 1951 a p a r t i r de un carc inom a ep id e rm o id e de c u e l lo u t e ­ r in e humano, p ro c é d a n te de una m ujer n c g ra llam ada H elen L a n ts in g , a p ro v e - chando l a s l e t r a s i n i c i a l e s d e l nombre y a p e l l id o p a ra l a d e s ig n a c io n de l a l i n e a c e l u l a r . Las c e l u l a s p ro c éd a n te s d e l tum or fu e ro n c u l t iv a d a s en me­ d io e s e n c ia l mînimo de E ag le en so lu c io n s a l i n a e q u i l ib r a d a de Hanks y su - p lem en tada con 10 X de su e ro de t e r n e r a . La c a r a c t e r i z a c io n de e s t a l in e a c e l u l a r p ro p ro c io n o lo s d a to s s ig u i e n t e s : M o rfo lo g îa ; e p i t e l i o i d e . C ic lo c e l u l a r : tiem po de g e n e ra c io n , 19 b o r a s ; d u ra c io n de l a Ea­ se G1 , 6 b o ra s 25 m in u to s ; d u ra c io n de l a f a s e S , 8 b o r a s ; d u ra c io n de la f a s e G2, 3 b o ra s 30 m in u to s y d u ra c io n de l a f a s e M 65 m in u to s . Numéro de crom osom as: t ro n c o con numéro m odal de 82 croroosomas y 16 FIGURA 2 A specto de una monocapa p re ç o n f lu e n te de c é iu la s HeLa. Se observant num erosas m ito s i s . E sta l in e a c e l u l a r se o r ig in o de un carcinom a ep iderm oide de c u e l lo u te r in o humano. 17 on d e sp e rd ig am ien to d e l r e s t e de l a p o b lac iô n e n tr e 70 y 164 cromosomas. E f ic ie n c ia de p lan c h eo : 90 %. S u s c e p t ib le a v i r u s : p o l io v i r u s 1 y a d e n o v iru s 2 . A .2. C e lu la s EREA. (F ig u ra 3 ) . E s ta l in e a c e l u l a r fu e e s ta b le c id a en n u e s tro D epartam ento en 1978. Las c e lu la s p roceden de un c u l t i v e p r im a rio de c e lu la s t o t a l e s de em- b r iô n de r a to n . E n tre su s c a r a c t e r i s t i c a s podemos d e s ta c a r : M o rfo lo g îa : a t r a v ê s de lo s s u b c u l t iv o s r e a l iz a d o s d u ra n te v a r ie s anos han roantenido dos t ip o s c e l u l a r e s , une e p i t e l i o i d e y o t r o f i b r o b l a s t o i - de . Numéro de cromosomas: e l numéro m odal de cromosomas e s de 40 p a ra l a s c e lu l a s f ib r o b la s to id e s y de 70 p a ra l a s e p i t e l i o i d e s . Tiempo de g e n e ra c io n : 21 h o ra s p a ra l a s c e l u l a s f i b r o b l a s t i c a s y 28 h o ra s p a ra l a s e p i t e l i o i d e s . E f ic ie n c ia de p la n c h e o : menos d e l 10 % cuando se siem bran 10.000 c è lu la s /m l . T u m o rig e n ic id a d : l a in o c u la c iô n de 10^ a 10^ c e lu l a s por v ia su b - c u tâ n e a a r a to n e s r e c ié n n a c id o s c a re c e de p ro p ie d a d e s tu m o r ig é n ic a s . B. T écn ica de s u b c u l t iv o . Ambos t ip o s de c e lu l a s s e m an tienen por s u b c u l t iv o s s e r i a d o s , de acu erd o con lo s m étodos e s ta n d a r (R .C. P a r k e r , 1961). Las c e lu la s d e l c u l t i ­ v e a n t e r io r se d e sp ren d en con d is o lu c iô n de t r i p s i n a a l 0,2 %, se p ré p a ra una su sp e n s io n c e l u l a r homogênea y s e h ace un re c u e n to d e l numéro de c e lu ­ l a s . Se toman a l i c u o ta s que se siem b ran b ie n d is p e r s a d a s en f r a s c o s de c u l - •* FIGURA 1 P r r p n r / i L ' i ' j ! ? : ! c r r l u l x i s I R K A . S r î i ^ T i n g . i n n c i a i x m i l e l e s dcf: * i p c e c r l ü l f i r e . . , rp.' I c i , ' n / i r y f f h r o b l n t o i d e , que romponcn r s l a l i u e n c e l u l a r , p r e c e d e n c e de c e l u i ae e i n b r i n n n r i n s de r a t o n . 19 t iv o e s t e r i l e s , afiadienclo l a c a n tid a d n e c e s a r ia de m edio de c u l t i v o de f o r ­ ma que queden sem bradas 100.000 c e lu l a s /m l , se incuban a 37*C y se m a n tie ­ nen con cam bios p e r io d ic o s de m edio de c re c im ie n to , g en era lm en te a lo s 4 d i a s . Cuando l a s c e lu l a s a lc a n z a n e l e s ta d o de c o n f lu e n c ia en m onocapa, se p ro céd é a l s ig u i e n t e s u b c u l t iv o , lo que s u e le h a c e rse a lo s 7 d i a s . Las c e lu l a s se m an tienen con m edio e s e n c ia l mînimô de E ag le s u - p lem entado con 10 % de su e ro de t e r n e r a y 1 % de am inoacidos no e s e n c ia le s . C. S o lu c io n e s y m edios de c u l t i v o . 1. Rojo fe iio l a l 1 % Rojo f e n o l ----------------------------- ' 10 g NaOH 0 ,0 5 N ----------------------------------------------- — 60 ml HgO t r i d e s t i l a d a 20 ml A ju s ta r pH 7 ,0 -r7 ,5 con NaOH 0 ,0 5 N --------- 5 ml HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 100 ml E s t e r i l i z a r en a u to c la v e a 121®C d u ra n te 15 m in u to s . 2 . GKN Glu CCS a ---------------------------------------------------------- 1 ,0 g K C l----------------------------------------------------------------- 0 ,4 g N a C l--------------------------------------------------------------- 8 ,0 g Rojo f e n o l a l 1 % ----------------------------------------- 1 ,0 ml A g u a . t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 1000 ml E s t e r i l i z a r en a u to c la v e a 121*C d u ra n te 15 m in u to s . 1 l i t r o : 20 3. T r ip s in a a l 0 ,2 % T r ip s in a D ifco 1:250 ----------------------------------------- 2 , 0 g GKN, c . s . p . 1000 ml E s t e r i l i z a r por f i l t r a c i o n . 4. Medio e s e n c ia l minimo de E ag le modi f ic a d o E ste m edio se compone de l a s s ig u ie n te s f r a c c io n e s , r e f e r id a s a 4 .1 . M ezcla de am inoacidos e s e n c ia le s g /1 L -A rg in in a -H C l -------------------------------- 120,40 L - C i s t e î n a --------------------------------------------- 24,02 L -G lu ta m in a --------------------------- 292 ,30 L -H is tid in a -H C l'H 20 ----------------------------- 4 1 ,90 L - ls o le u c in a ----------------------------------------- 52 ,50 L - L e u c in a ----------------------------------------------- 52 ,50 L -L isin a -H C l ----------------------------------------- 73,06 L - M e tio n in a ------------------------------------------- 14,09 L -F e n ila la n in a -------------------------------------- 33,02 L -T reon ina --------------------------------------------- 47,64 L -T r ip to fa n o ----------------------------------------- 10,20 L - T i r o s i n a --------------------------------------------- 36,22 L - V a l i n a --------------------------------------------- — 4 6 ,9 0 4 .2 . M ezcla de v ita m in a s P a n te o te n a to de c a l c io ------------------------ 1 ,00 C lo ru ro de c o l i n a --------------------------------- 1 ,00 Acido f o l i c o ----------------------------------------- 1 ,00 21 N ic o ti i ia m id a --------------------------------------- 1,00 i - I n o s i t o l -------------------------------------------------- 2,00 P i r id o x a l - H C l ----------- '------------------------- 1 ,00 R i b o f la v i n a ------------------------------------------------ 0 ,1 0 T ia m in a -H C l-------------------------------- 1,00 4 .3 . S o lu c io n e q u i l ib r a d a de Hanks C lC lg ---------------------------------------------------------- 0 ,1 4 D -G lu c o sa ----------------------------------------------- 1,00 MgSO ̂ THgO------------------------------------- 0 ,2 0 K C l-------------------------------------------------------------- 0 ,4 0 N a C l :----------------------------------------------------- 8 ,0 0 Ro j o fe n o l ————————————————————————— 0 ,0 1 NagHPO^ H gO ------------------------------------------------ 0 ,0 6 4 . 4 . ‘Arainacidos no e s e n c ia le s L - A la n in a ----------------------------------------------- 8 ,9 0 L—A sp ara g in a H 2 0 ——— ——————————————— 15,00 A cido L - a s p a r t i c o ------------------------------------- 13,30 G l i c i n a ------------------------------------------------------- 7 ,50 Acido g lu ta m ic o ——— ——————————————— — 14,70 L - P r o l i n a ---------------------------------- ■;----------- . 11 ,50 L - S e r i n a ------------------------------------------------- 10,50 4 .5 . S o lu c io n de NaHCO^ a l 1 ,4 % ( i s o to n ic a ) NaHCOj--------------------------------------------------------- 7 ,0 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --------------------- 500 ml 22 El m edio de c u l t iv o se e s t e r i l i z a por f i l t r a c i o n . I I . CULTIVO DE CELULAS EN SUSPENSION A. C a r a c te r î s t ic a s de l a s c e lu la s U t i l i z a d a s . A .1. C e lu la s CAE. (F ig u ra 4 ) . Las c e lu la s CAE p roceden de c e lu la s de can cer a s c î t i c o de E h r lic h de ra to n a d ap tad a s en e l D epartam ento a l c u l t i v o en su sp en s io n " in v i t r o " , en 1972. P ara a d a p ta r l a s , se avenaron c e lu la s CAE c u l t iv a d a s " in v iv o " me­ d ia n te in o c u la c io n in t r a p e r i t o n e a l de r a to n e s . De l a p a r a c e n te s i s de un a n i ­ mal se o b tu v ie ro n 7 ml con 20*10^ c ê lu la s /m l , se la v a ro n en s o lu c io n s a l in a f i s i o lô g i c a y se sem braron en tu b o s de 25 x 150 mm a una c o n c e n tra c io n dft 3*10^ c é lu la s /m l en m edio e s e n c ia l mînimo de E ag le suplem entado con 20 % de su e ro de t e r n e r a , con un volumen t o t a l de 25 ml. Algunos tu b o s p ro g re sa ro n y d esp u es de v a r io s s u b c u l t iv o s s e con- s ig u ie ro n a d a p ta r a su s p e n s io n . B. T écn ica de s u b c u l t iv o . E s ta s c e l u l a s , a l e s t a r en s u s p e n s io n , se su b c u ltiv a n s in n e c e s i - dad de d e s p re n d e r la s . Se r e a l i z a un re c u e n to de l a su sp en s io n y se siem bran nuevos tu b o s con 200.000 c é lu la s /m l y 25 ml de volumen t o t a l , que s e in cu ­ ban en l a e s tu f a a 37®C c.olocados en un tam bor g i r a t o r i o a 55 re v o lu c io n e s por m in u to , p a ra m an tener l a s c e lu l a s en su sp en s io n m on o d isp ersa . Como medio de c re c im ie n to se u t i l i z e m edio e s e n c ia l mînimo de E ag le suplem entado con 20 % de su e ro de t e r n e r a y 1 % de am inoacidos no 23 FIGURA 4 # •e F rc p a ra c iô n de c e lu la s CAE p ro c é d a n te s d e l c an c er a s c î t i c o de E h r lic h de r a to n , puede o b se rv a rs e l a v a r ie d a d de form as y tamanos de e s t a s c e lu la s a s î como t r è s m e ta fa - 8e s a n o rm a le s . 24 e s e n c ia le s I I I . CULTIVO ÜE CELULAS IN VIVO A. C a r a c t e r i s t i c a s de l a s c e lu la s u t i l i z a d a s A .I , C e lu la s CAEL. E s ta s c e lu l a s son una v a r ia n te de l a s CAE, que se m an tien en por t r a s p l a n t e s i n t r a p e r i t o n e a l e s s e r ia d o s en r a to n e s de l a cepa S w iss. B. T écn ica de t r a s p l a n t e . El t r a s p la n t e s e r e a l i z a ex tray en d o d e l an im al donador e l l i q u i ­ de a s c î t i c o con l a s c é lu la s que c recen en ê l , d ilu y e n d o l a su sp e n s io n coA NaCl 0 ,14 M p a ra o b te n e r 1 ,5 x 10^ c é lu la s /m l e in o cu lan d o i n t r a p e r i t o n e a l - m ente 150.000 c é lu la s CAEL en 0 ,1 m l. S o lu c io n de NaCl 0 ,1 4 M ( so lu c io n s a l in a f i s i o lo g i c a ) N a C l------------------------------------------------------------ 8 ,1 8 g HjO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . -------------------- 1000 ml IV. AISLAMIENTO DE LA MEMBRANA PLASMATICA A. T éc n ic a u t i l i z a d a . E l p ro ced im ien to empleado p a ra e l a is la m ie n to de membrana p la s m a tic a de l a s c é lu l a s e s e l d e s c r i t o por T .K . Ray (1970) con a lg u n a s v a r ia n te s que ha s id o n e c e s a r io in t r o d u c i r p a ra a d a p ta r e l método a n u e s t r a s c o n d ic io n e s . E s te método c o n s i s te en l a s e p a ra c io n de lo s d i s t i n t o s com ponentes c e ­ l u l a r e s por su s d i f e r e n te s tam anos y d e n s id a d e s . 25 E squem âticaroen te, e l p ro ceso c o n s i s t e en : a) l a v a r l a s c e lu l a s p a ra e l im in a r e l medio de c u l t i v o y l a a cc iô n de su s com ponen tes; b) so m ete r a c o n tin u a c iô n l a s c é lu la s a un choque l i ip o tô n ic o , que l a s h in ch a y f a c i l i t a su r o tu r a d u ra n te l a ho m o g en e izacio n ; c) s e p a ra r lo s n u c le o s d e l r e s t o de lo s com ponentes c e lu l a r e s po r c e n tr i f u g a c iô n d i f e r e n c i a l a b a ja v e lo c id a d ; lo s n u c le o s se reco g en en l a p e l l a y e l r e s t o de lo s com ponentes c e l u l a r e s queda en e l so b re n a d a n te ; d) s e p a ra r lo s com ponentes s o lu b le s d e l c i t o p l a s - ma d e l r e s t o , e s t r u c t u r a l e s , m ed ian te c e n t r i f u g a c iô n d i f e r e n c i a l a a l t a v e ­ lo c id a d ; en la p e l l a s e e n c u e n tra n m ito c o n d r ia s , f r a c c iô n m icrosôm ica y mem­ b ra n e s p la s m a tic a y d e l r e t î c u l o endoplasm ico y e l so b re n ad a n te s e r a com­ p u e s to por e l c i t o s o l ; e) f in a lm e n te , l o s com ponentes de l a p e l l a d e l paso a n t e r io r se se p a ra n por c e n t r i f u g a c iô n en g r a d ie n te de d e n s id a d , en e l c ü a l coda e s t r u c t u r a em igra h a s ta a lc a n z a r una zona en l a que su d e n s id ad c o in ­ c id e con l a de l a zona. A sî se co n sig n e una p e l l a que c o n tie n s l a s m ito co n ­ d r i a s , y 4 bandas que c o rre sp o n d e s , de a b a jo a a r r i b a , a m icrosom as, membra­ n e s , l ip o p r o t é in e s y l î p i d o s . La p re p a ra c iô n de l a s so lu c io n e s a l a s que se h ace r e f e r e n d a a l d e s - c r i b i r l a té c n ic a s e in d ic e mas a d e la n te (IV . B ). A .1. T écn ica p a ra c é lu l a s c u l t iv a d a s " in v i t r o " . 1. De lo s c u l t i v e s en monocapa e s t a c io n a r i a s e recogen l a s c é lu l a s lav an d o lo s f r a s c o s con s o lu c io n s a l in a c i t r a t a d a (SSC ), ra sp an d o l a monoca­ pe con e s p a tu la p a ra d e sp re n d e r l a s c é lu la s y re su sp e n d iê n d o la s en s o lu c io n dc D ulbecco. S i l a s c é lu la s se c u l t iv a n en su s p e n s io n , s e o b tie n e n c e n t r i - fugando a b a ja v e lo c id a d (90 x y re su sp e n d ien d o l a p e l l a en l a s o lu c io n m cncionada. 26 2. Se t r a n s f ie r e n l a s c e lu la s a un tu b o de c e n t r î f u g a y se lav an con SSC u t i l iz a n d o un volumen 10 a 20 veces s u p e r io r a l de l a p e l l a c e l u l a r . Se mi de e l volumen f i n a l y s e toma a 'iic u o ta p a ra re c u e n to c e l u l a r . 3. Se c e n tr ifu g a n l a s c é lu la s a 300 x £ d u ra n te 15 m in u to s . 4 . Se d e ca n ta y d e s p re c ia e l so b re n a d a n te y s e mide e l volumen de p e l l a c e lu l a r o b te n id o . 5 . Se la v a o t r a s dos v eces en la s mismas c o n d ic io n e s , p e ro u t i l i ­ zando NaCl 0 ,1 4 M con T r is 20 mM a pH 7 ,4 . 6 . Se resu sp en d e l a p e l l a en 1 volumen ig u a l a l de e l l a de s o lu ­ c io n h ip o to n ic a de NaHCO^ y CaClg suplem entado con f lu o ru ro de f e n i l - m e t i l - s u l f o n i l como in h ib id o r de enzim as p r o t e o l î t i c a s . 7. A p a r t i r de e s te momento se t r a b a ja a 4°C. 8 . Se m antiene e l p ro d u c to a 4°C d u ra n te 2 h o ra s p a ra p ro d u c ir la r o tu r a de l a s c é lu la s po r l a h ip o to n ic id a d d e l m edio. 9 . Se p ro céd é a l a bom ogeneizaciôn , en un horoogeneizador de P o t t e r de v i d r io - t e f l ô n , g ira n d o a 3000 rpm d u ra n te 3 m inutos y a 3500 rpm 1 m inu to . 10. Se t r a n s f i e r e e l homogenado a un ti4>o de c e n t r î f u g a , s e mide e l volumen y se toma una a l î c u o ta p a ra a n â l i s i s c u a n t i t a t i v o de p ro te în a s p o r e l método de O.H. Lowry y c o ls . (1 9 5 1 ), que se d e s c r ib e mas a d e la n te . 11. Se c e n t r i f u g a a 300 x g d u ra n te 15 m in u to s . 12. Se recoge e l s o b re n a d a n te , que c o n tie n s c ito p la sm a y m enbrana, y se d e s p re c ia l a p e l l a , que e s t a form ada po r lo s n u c le o s . 13. Se t r a n s f i e r e e l so b re n ad a n te a o t r o tu b o de c e n t r î f u g a , s e mi­ de e l volumen y se toma una m u estra p a ra a n a l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o t e în a s . 14. Se c e n t r i f u g a a 14.000 x ^ d u ra n te 15 m in u to s . 27 15. Se re c o g e p o r sep a rad o e l so b re n ad a n te ( c i t o s o l ) y l a p e l l a ( p r o te în a s e s t r u c t u r a l e s de c ito p la sm a y m em brana). 16. Se la v a l a p e l l a con sd lu c io n h ip o to n ic a de NallCO^ y CaClg, c e n tr ifu g a n d o a c o n tin u a c iô n en l a s mismas c o n d ic io n es d e l paso 14. 17. Se d e s p r e c ia e l so b re n ad a n te y s e re su sp e n d e l a p e l l a en un volumen de s o lu c io n h ip o to n ic a de NaHCO ̂ y CaCl^ t a l que e l volumen f i n a l de l a su sp en s iô n se a de 3 ,4 m l. 18. Se anaden 7 ,5 ml de s a c a ro sa a l 70 % (p eso /v o lu m en ) y s e toma a l î c u o ta p a ra a n a l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o te în a s . 19. En un tu b o de u l t r a c e n t r î f u g a se form a un g r a d ie n te en ban d as de s a c a ro sa de 48 % a 37 %, con l a s s ig u ie n te s c a n t id a d e s , d e p o s ita d a s d e l fondo a l a boca con cu id àd o p a ra que no s e m ezclen : 10,9 ml de su s p e n s iô n con l a s membranes en s a c a ro sa a l 48 %, 9 ,7 ml de s a c a ro s a a l ,45 %, 12 ,0 ml de s a c a ro s a a l 41 % y 2 ,4 ml de s a c a ro s a a l 37 %. 20. Se c e n t r i f u g a e l p ro d u c to a 62 .000 x d u ra n te 120 m in u to s . 21. Se re co g e l a banda que a p a re c e en l a i n t e r f a s e 4 5 -4 1 , c o r r e s - p o n d ie n te a l a zona con una d e n s id ad 1 ,16 g /m l. Se m ide e l volumen y s e t o ­ ma una a l i c u o ta p a ra a n a l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o te în a s . 22. Se lav a n l a s membranas o b te n id a s con un volumen ab o n d an te de EDTA 1 mM, p a ra e l im in a r l o s io n e s c a lc io y l a s a c a ro s a . Se c e n t r i f u g a a 2 4 .000 X ^ d u ra n te 30 m in u to s . 23 . Se d e c a n ta y d e s p re c ia e l so b re n ad a n te y s e c o n g e la l a p e l l a a -90*C h a s ta su u t i l i z a c i o n , ex cep to s i va a s e r in m e d ia ta . 28 A .2. T écn ica p a ra c é lu la s c u l t iv a d a s " in v iv o " . 1. Se avenan lo s r a to n e s in o cu la d o s in t r a p e r i to n e a lm e n te con c é ­ l u l a s CAEL. 2. Se r e g i s t r a e l volumen de a s c i t i s y s e toma m u es tra p a ra r e ­ cu en to c e lu l a r . 3. Se t r a n s f i e r e a un tubo de c e n t r î f u g a y s e la v a con s o lu c io n de D ulbecco. 4 . A p a r t i r de e s t e momento se p ro céd é como en l a té c n ic a A . I . , d e sd e e l pun to 3. A .3. T écn ica p a ra t e j i d o s . 1. Los an im a le s a s a c r i f i c a r se d e ja n en ayunas d esd e e l d îa an­ t e r i o r , p a ra e v i t a r pesos f a l s o s d eb id o s a l exceso de g lu cô g en o . 2 . Se s a c r i f i c a n lo s an im a le s por f r a c t u r a c e r v i c a l . 3. Se e x ti r p a n lo s ô rg an o s n e c e s a r io s . 4 . Se co lo can en p la ç a s de P é t r i t a r a d a s p rev iam en te y se p e san . 5. Se fragm entan l a s p ie z a s con t i j e r a s p rim ero y d esp u és con b i s - , t u r î e s e n ca rad o s . 6 . Se t r a n s f i e r e n lo s frag m en tes a un tu b o de c e n t r î f u g a , se lav a n con 10-20 volum enes de so lu c iô n s a l in a de D ulbecco ( r e s p e c te a l p e s o ) . 7. Se c e n t r i f u g a e l m a te r ia l a 300 x d u ra n te 5 m inu tos y s e r e ­ g i s t r e e l volumen dé p e l l a . 8 . Se la v a o t r a vez en l a s mismas c o n d ic io n e s que en 6 y 7 . 9 . Se la v a con 10 volum enes de NaCl 0 ,1 4 M y t r i s 20 mM a pH 7 ,4 . 10. Se c e n t r i f u g a a 300 x £ d u ra n te 5 m in u to s . 11. Se d e c a n ta y d e s p re c ia e l so b re n ad a n te y s e la v a l a p e l l a o t r a s 29 clos v e ce s como en 9 y 10. > 12. Se re su sp e n d e l a p e l l a en 1 volumen (con r e s p e c te a l peso o r i g in a l ) de s o lu c io n h ip o to n ic a de NalICO^ y CaClg. 13. Se t r a n s f i e r e l a su sp e n s iô n a un hom ogeneizador de P o t t e r v i d r io - v i d r i o m anual. Se dan 10 em boladas en bano de h i e lo (4*C ). 14. Se t r a n s f i e r e e l homogenado a un tubo de c e n t r î f u g a , s e m ide e l volumen y se toman a l i c u o ta s p a ra re c u e n to de n u c le o s y a n â l i s i s c u a n t i ­ t a t i v o de p r o te în a s . 15. Se c e n t r i f u g a a 300 x d u ra n te 15 m in u to s . 16. Se d e ca n ta y g u ard a e l so b re n a d a n te a 4°C h a s ta su u t i l i z a ­ t io n . 17. Se re su sp en d e l a p e l l a en so lu c iô n h ip o tô n ic a y se p ro céd é a l a hom ogeneizaciôn m ecânica con un hom ogeneizador de P o t te r v i d r i o - t e f l ô n . 18. Sfe hom ogeneiza d u ra n te 90 segundos a 3 .000 rpm. 19. Se t r a n s f i e r e a tu b o de c e n t r î f u g a y s e c e n t r i f u g a a 300 x g d u ra n te 15 m in u to s . 20 . Se reco g e e l so b re n a d a n te y se mancomuna con e l o b ten id o en 16. Se d e s p re c ia l a p e l l a , que e s ta form ada por lo s n u c le o s . 21. Se r e g i s t r a e l volumen t o t a l d e l mancomunado y s e toma una m u es tra p a ra a n â l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o t e în a s . 22 . Se t r a n s f i e r e a tu b o de c e n t r î f u g a y s e c e n t r i f u g a a 14 .000 x g d u ra n te 15 m in u to s . 23 . A p a r t i r de e s t e momento s e p rocédé ig u a l que en A . I . , d esd e e l pun to 15. 30 B . S o lu c io n e s enipleadas . 1. SSC NaCl 0 ,1 5 M y CeHsNagO; 0 ,1 5 M) N a C l---------------------------------------------------------------- 8 ,7 7 g C i t r a to sôdico-^HgO ------------------------------------------ 4 4 ,1 5 g HjO t r i d e s t i l a d a , c . s . p , ----------------------------- 1000 ml 2. S o lu c io n s a l i n a de Dulbecco 1® F ra c c iô n : N a C l-------------------------------------------------------------- 8 ,0 g K C l ---------------------------------------------------------------- 0 ,2 g NagHPO^--------------------------------------------------------- 1 ,15 g KH2PO4 :--------------------------------------------------- 0 ,2 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --------------------------- 400 ml 2® F ra c c iô n : CaClg 2H2O —— ————'——-------------— ——-----— —— 0 ,1 2 5 2 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --------------- ------------ 200 n i 3^ F ra c c iô n : MgCl2 6H2O ---------------------------------------------------------- 0,1 g H2O t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --------------------------- 200 ml Se e s t e r i l i z a n la s f ra c c io n e s po r sep a rad o en e l a u to c la v e a 115“C d u ra n te 20 m in u to s . Se reunen después la s t r è s f r a c c io n e s , s e anaden 2 ml de ro jo f e n o l a l 1 % y se com pléta con agua t r i d e s t i l a d a h a s ta 1000 ml. Se e s t e r i l i z a p o r f i l t r a c i o n a p r e s iô n . 31 3. NaCl 0 .1 4 M, T r is 20 mM. pH 7 .4 N a C l ------------------------------------------------------- 8 ,1 8 g T r i s ------------------------------- ’------------------------------- 2 ,4 2 g HCl I N -------------------------------------------------------- 12 ml H2O t r i d e s t i l a d a , c .s .p * ——— ———————— 1000 ml A ntes de e n r a s a r s e debe com probar e l pH. Se e s t e r i l i z a en a u to c la v e a 11S®C d u ra n te 20 m in u to s . 4 . NaHCOj 1 mM, CaCl2 2 mM f lu o ru ro de f e n i l - m e t i l - s u l f o n i l 100 pM (s o lu c iô n h ip o tô n ic a de NaHOO ̂ y CaCl2) NaHCOg---------------------------------------------------- 84 n® C a d 2 ----------------- -------------------------------_ 294 mg F lu o ru ro de f e n i l - m e t i l - s u l f o n i l 17,42 mg H2O t r i d e s t i l a d a , c . s . p . -------------------- 1000 ml Se e s t e r i l i z a p o r f i l t r a c i ô n . 5 . EDTA 1 mM •EDTA ( s a l t e t r a s ô d i c a ) ---------------------------------- 0 ,4 2 g H2O t r i d e s t i l a d a , c . s . p . —— ——— ——— 1000 ml Se e s t e r i l i z a en a u to c la v e a 115"C d u ra n te 20 m in u to s . 6 . S a c a ro sa a l 70 % (peso /vo lum en) S a c a r o s a -------------------------- —-------------------- 70 ,0 g A zida s ô d ic a (Na^N) — — —---- —— ————————— . 0 ,2 g H2O t r i d e s t i l a d a , c . s . p . -------------------- 100 ml Se e s t e r i l i z a en a u to c la v e a 115® C d u ra n te 25 m in u to s . 32 7 . Sa c a ro sa a l 45 % (peso/volum en) S a c a r o s a ------------------------------------------------ 4 5 ,0 g Azida s ô d i c a ----------------- '------------------------ 0 ,2 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ------------------- 100 ml Se e s t e r i l i z a en a u to c la v e a 115®C d u ra n te 25 m in u to s . 8 . S a c a ro sa a l 41 % (peso/volum en) S a c a r o s a ------------------------------------------------ 4 1 ,0 g A zida s ô d i c a -------------------------------------- 0 ,2 g HjO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ------------------- 100 ml Se e s t e r i l i z a en a u to c la v e a 115*C d u ra n te 25 m in u to s. 9 . S a c a ro sa a l 37 % (peso/volum en) S acaro sa — --------------------------------------------- 37 ,0 g A zida s ô d i c a -------------------------------------- 0 ,2 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ------------------- 100 ml 10. HCl IN HCl 12N (37%) ---------------------------------------- 4 1 ,2 ml H2O t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ------------------- 500 ml V. SOLUBILIZACION DE LA MEMBRANA PLASMATICA P a ra l a s o lu b i l i z a c iô n de l a menbrana p la s m a tic a u t il iz a m o s l a t ê c n i - ca de d e s in te g ra c iô n p o r u l t r a s o n id o s , que c o n s is te en l a r u p tu r a a l a z a r de lo s frag m en tes de menbrana que se han o b ten id o en e l p ro c ed im ie n to a n te ­ r i o r , debido a l fenômeno de c a v i ta c iô n . 33 Cuando un l iq u id e se som ete a un s o n id o 'in te n s o , p o r encim a de unos v a lo re s c r î t i c o s (0 ,7 a tm ô sfe ra s en e l caso d e l agua s a tu r a d a de a i r e ) , e l t r a n s p o r te de l a s ondas so n o ra s a t r a v ê s d e l l iq u id o cau sa a l t e r a c io n e s b ru s c a s de p r e s iô n , l o que da lu g a r a l a fo rm aciôn de muchas m ic ro b u rb u jas que van c re c ie n d o h a s ta a lc a n z a r im v a lo r c r î t i c o , e l c u a l depende de l a f r e c u e n c ia d e l so n id o en e l que se d é s in té g r a s " im p lo s iv am en te" p ro d u c ie n - do a l t a s tem p e ra tu re s in s ta n tâ n e a s y m ic ro c o r r ie n te s en e l l iq u id e que p ro - vocan l a r u p tu r a de l a s cad en as que form an l a s membranas. A. T éc n ic a u t i l i z a d a . 1. Se des co n g ela rap id am en te l a p e l l a de meiibranas p u r i f ic a d a s o b te n id a en e l a is la m ie n to de membranas A . I . , pun to 23 . 2 . Se re su sp en d e en 6 a 7 ml de NaCl 0 ,1 4 M, T r is 20 mM f lu o ru ro de f e n i l - m e t i l - s u l f o n i l 100 pM y T r i tô n X-100 a l 0 ,0 5 %. 3 . Se. t r a n s f i e r e l a s u s p e n s iô n a un tubo de v id r io a d a p ta b le a l d e s in te g r a d o r p o r u l t r a s o n id o s . 4 . Se dan 6 c ib lo s de u l t r a s o n id o s de 30 segundos de d u ra c io n en bano de h i e l o (4*C) d is ta n c iâ n d o lo s e l tiem po s u f i c i e n t e p a ra que en n ingun momento s e c a l i e n t e e l m a te r i a l . 5 . Se t r a n s f i e r e a tubo de c e n t r i f u g a , s e mide e l volumen y se toma m u es tra p a ra a n a l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o t e în a s . 6 . Se u l t r a c e n t r i f u g a a 100.000 x g d u ra n te 60 m in u to s . 7 . Se reco g e e l so b re n a d a n te y s e guarda como a n tîg e n o s s o l u b i l i - z a d o s , r e g is t r a n d o e l volumen y tomando m u es tra p a ra a n a l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o t e în a s . 34 8 . Se re su sp en d e l a p e l l a como en 2 y se r e p i t e n lo s pu n to s 3 , 4 , 5 , 6 y 7. 9 . Se resu sp en d e l a p e l l a tomo en 2 y se r e p l i e e l p ro c eso como en 3, 4 , 5 , 6 y 7. 10. Se d e s p re c ia l a p e l l a f i n a l . B. D isG lu e!ones em p lead as . 1. NaCl 0 ,1 4 M, T r is 20 mM, f lu o ru ro de f e n i l - m e t i l - s u l f o n i l 100 pM y T r i to n X-100 a l 0 ,0 5 X, pH 7 .4 . N a C l------------------------------------------------------- 8 ,1 8 g T r i s ------------------------------------------------------- 2 ,42 g F lu o ru ro de f e n i t - m e t i l - s u l f o n i l 0 ,0 1 7 g T r i to n X -1 0 0 ----------------------------------------- 0 ,5 ml HCl I N ------------------------------------------------------- 12,0 ml HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . -------------------- 1000 ml Se e s t e r i l i z a p o r f i l t r a c i o n . En e s te p ro ced im ien to se u t i l i z e un d e s in te g ra d o r por u l t r a s o n i - dos PG 100, modelo 150W, de l a c asa MSB y un a sonda de t i t a n i o con forma c ô n ic a y un d iâm e tro i n f e r i o r de 3 mm. V I. INMUNIZACION DE CONEJOS La in m u n izac io n de un an im al t ie n e p o r o b je to l a o b te n c îo n de a n t i c u e r - pos c o n tra un deterro inado a n tîg e n o . El metodo c o n s i s te en l a a d m in is t ra c iô n de d o s is d e te rm in ad as d e l a n tîg e n o p a ra p ro v o car en e l an im al una r e s p u e s ta 35 injTKinologica c o n tr a e s t e a n tîg e n o . La q u im e riz a c iô n se b a sa en e l hecho de l a t o le r a n c i a in rouno lôg ica que se a d q u ie re cuando lo s a n tîg e n o s e x tra n o s se a d m in is tra n a n te s de que b ay a re s p u e s ta in m u n o lo g ica . A s î, s i se in o c u la un anim al r e c iê n n a c id o con un a n tîg e n o , e l an im al aun no ha d e s a r r o l l a d o su s is te m a inm u n o lô g ico , y p o r ta n to no reconoce como e x tra n o s e so s a n tîg e n o s cuando a lc a n z a * la madurez in m u n o lo g ica . P o s te r io rm e n te , cuando e l an im al l l e g a a a d u l to , l a a d m in is - t r a c iô n de e se a n tîg e n o no p ro v o c a râ n in g u n a r e s p u e s ta inm u n o lo g ica . S i e s e a n tîg e n o va m ezclado con o t r o s , e l s is te m a inm unolôg ico d e l an im al e s capaz de d i s c e m i r e n t r e e l que t o l é r a en s u c a r â c t e r de qu im era in m u n o lo g ica y e l que n o , e la b o ran d o a n tic u e rp o s un icam ente c o n tr a lo s r e s t a n t e s a n t îg e n o s . En e l caso que nos o cupa, se q u im e riza ro n conej o s in y ec tan d o a n tîg e n o s p ro c é d a n te s de c e lu la s de ra to n norm al en l a f a s e s in re s p u e s ta inm uno log i­ ca y p o s te r io rm e n te , cuando lo s a n im a le s a lc a n z a ro n l a madurez in m u n o lo g ica r e c ib ie r o n membranas s o lu b i l i z a d a s de c e lu la s c a n c e ro sa s de r a to n , f r e n t e a l a s c u a le s e l an im al no r e a c c io n a ra c o n tr a l a g ran c a n tid a d de a n tîg e n o s n o rm ales que ten g a ta n to l a c ô lu la c a n c e ro sa como l a n o rm a l, e la b o ra n d o s e - , le c t iv a m e n te a n tic u e rp o s c o n tr a a q u e l lo s a n tîg e n o s que sean p ro p io s de l a t ra n s fo rm a c iô n n e o p la s ic a , sean o n c o aso c iad o s u o n c o e s p c c îf ic o s . La p a u ta se g u id a p a ra l a in m u n izac io n s im p le y l a in m u n izac io n de c o n e - j o s qu im era inm uno log ica se d e s c r ib e a c o n tin u a c iô n . A. T é c n ic a de in m u n izac io n s in q ) le . Se s a n g ra a l con ejo a n te s de l a in m u n izac io n p a ra d is p o n e r de su e ro c o n t r o l . Se l e da una p rim e ra d o s i s de 200 pg d e l a n tîg e n o o m ezcla 36 de a n tîg e n o s por v îa in tr a v e n o s a . A lo s 10 d îa s se da l a segunda d o s i s , en e s t e caso de 2 mg de a n tîg e n o s m ezclados con coadyuvante de Freund complete p a ra p o te n c ia r l a r e s p u e s ta , que se pone r e p a r t id a en 5 in y e c c io n e s , una en cada p a ta y o t r a en l a zona in te r e s c a p u la r ; 10 d îa s mas ta rd e se da l a t e r - c e ra d o s is ; que es ex ac tam en te ig u a l a l a segunda; y 10d îa s d esp u ês de la d o s is a n t e r i o r , , a lo s 30 d îa s de i n ic i a d a l a in m u n izac io n , s e da l a u ltim a d o s i s , una d o s is de re cu e rd o de 200 üg p o r v îa in tr a v e n o s a . B. T ec n ic a de in m u n izac io n en co n e jo s qu im era in m u n o lo g ica . P a ra l a q u im e riz a c iô n se u t i l i z ô e l metodo d e s c r i t o p o r Y. A lv arez - R odrîguez y c o l s . (1 9 7 9 ). Se in o c u la n c o n e jo s r e c ié n n a c id o s de 40 a 50 g de peso con 3 mg de a n tîg e n o s no rm ales f r e s c o s de menfcrana p la s m â tic a de h îg ad o , bazo y u te r o de r a to n e s a d u l to s , in y e c ta d o s po r v îa su b c u tân e a p a ra p rovocar l a o t l e r a n c i a inm u n o lô g ica a e s to s a n tîg e n o s . Cuando e l con ejo e s a d u lto , a p a r t i r de lo s 7 m eses, s e sa n g ra a lo s co n e jo s p a ra d isp o n e r de su e ro c o n tro l y se in y e c ta n a n tîg e n o s de c e lu la s c an c e ro sa s po r l a t e c n ic a d e s c r i t a en e l a p a r ta d o A. A lo s 30 d îa s e l conejo r e c ib e l a u ltim a d o s is a n t ig ô n ic a y a p a r ­ t i r de una semana mas ta rd e se puede e x t r a e r e l inm unosuero. V II . OBTENCION DE INMUNOSUEROS A. T e c n ic a . Sangrado d e l c o n e jo . Se a f e i t a l a o r e ja d e l con ejo en l a zona de l a vena m a rg in a l, se la v a con a lc o h o l de 70“ , se se c a y se pone so b re l a s u p e r f i c i e unas g o tas de x i l o l p a ra p ro v o c a r l a v a s o d i la ta c iô n , se d e ja a c tu a r unos 15 segundos y se se c a con un algodôn e s t ê r i l . Con un b i s t u r î e s t é r i l sc h ace un c o r te lo n g i- 37 t u d in a l de l a vena m a rg in a l de l a o r e j a , en l a p a r te proxima a l extrem e de e s t a . Se re c o g e l a sa n g re d e jâ n d o la e s c u r r i r en tu b o s e s t e r i l e s . R ecogida d e l su e ro sa n g u în eo . La sa n g re o b te n id a s e incuba a 37®C d u ra n te 20 m in u te s . Se d e s - p rende d esp u ês e l c o ag u le con un go lp e se c o . Se guarda a 4 “C d u ra n te 24 bo­ r a s p a ra que e l coag u lo s e r e t r a i g a . Al d îa s ig u ie n te s e re cô g e el-, su e ro , s e c e n t r i f u g a a 200 x ^ d u ra n te 15 m in u te s y se d e s p re c ia l a p e l l a form ada. Se e s t e r i l i z a por f i l t r a c i o n . Se guarda a -90®C h a s ta su u t i l i z a c i o n . V I I I . 'AISLAMIENTO DE INMUNOGLOBULINAS POR CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN RECICLO ASCENDENTE E l p ro c ed im ie n to empleado p a ra e l a is la m ie n to de in m u n o g lo b u lin as lu e l a c ro m a to g ra f îa de f i l t r a c i o n p o r g e l de d e x tra n o (H. Determ ann, 1968; F i s h e r , 1976; Pharm acia F in e C hem icals, 1979a). E s ta te c n ic a c o n s i s t e en l a s e p a ra c iô n de l a s d i s t i n t a s m o lêcu la s que componen una m ezcla en fu n c io n de du tam ano, u t i l i z a n d o un g e l p o ro so . Las p a r t î c u l a s d e l g e l forman una m a l la ; en e l p ro ceso se c ré a un e q u i­ l i b r i a e n t r e l a f a s e l iq u i d a e x i s t e n t e a lr e d e d o r de l a s p a r t î c u l a s de g e l y l a f a s e d e l g e l p ro p iam en te d ic h o . D ependiendo d e l tamano d e l poro d e l g e l u t i l i z a d o , l a s m o lê c u la s p u e - den d i f u n d i r desde l a fa s e l iq u i d a a l a f a s e d e l g e l . Las m o lêcu la s g ra n d e s , po r encim a d e l l im i t e de e x c lu s io n d e l g e l , no p e n e tra n d e n tro de l a s m ic ro e s fe ra s y avanzan y s a le n râp id am en te de l a co - lum na, m ie n tra s que l a s m o lê c u la s pequenas p e n e tra n en l a s m ic ro e s fe ra s a 38 d i f e r e n te s p ro fu n d id ad e s segun su tamano y c o n f ig u ra c io n , ta n to mas cu an to menor se a su tam ano, s a l ie n d o p o r ta n to mas t a r d e ; es d e c i r , que l a s molê­ c u la s van s a l ie n d o en razo n in v e r s a a su tam ano. E l so p o r te debe cu m p lir lo s s ig u ie n te s r e q u i s i t e s ; - s e r un p o lîm ero iô n ic o p e ro no io n iz a b le , - s e r h i d r o f i l o pero in s o lu b le en agua, - p r e s e n ta r e s t a b i l id a d de t ip o m ecânico . Dependiendo d e l tamano de l a s m o lêcu las que queraroos s e p a ra r e s n ece - s a r i o e l e g i r e l g e l que ten g a e l tamano de p o ro c o r re c te p a ra que se l le v e a cabo l a tam iza c io n m o le c u la r . En c ro m a to g ra f îa de f i l t r a c i o n en g e l bay que te n e r en c u en ta l o s s i ­ g u ie n te s p a ra m é tré s : - volumen de e x c lu s io n , V^: volumen que ro d ea a l a s m ic ro e s fe ra s , ocu - pado por m olêcu las g ra n d e s , - volumen de in c lu s io n , V^: volumen i n t e r i o r e n t r e l a s m ic ro e s fe ra s , ocupado p or m o lêcu las pequenas (d e l e lu y e n te ) , - volumen t o t a l d e l le c h o , V^: suma de lo s volum enes de e x c lu s io n e in c lu s io n , - volumen de e lu c iô n , V^: ocupado p o r l a s m olêcu las de tamano in te rm e - d io , que p e n e tra n en l a s m ic ro e s fe ra s , aunque con menor l i b e r t a d que e l e lu y e n te . e s t a com prendido e n t r e y (L. Hudson y F .C . Hay, 1978). En c ro m a to g ra f îa de f i l t r a c i o n en g e l l a cap ac id ad de l a columna p a ra l a m u estra a o f e r t a r debe s e r como maxiroo d e l 3 a 4 % d e l volumen t o t a l de le c h o . La m u estra se p ré p a ra d i lu y ê n d o la de 3 a 6 v eces con re sp e c to a l a c o n c e n tra c iô n o r i g in a l . 39 P a ra n u e s tro ex p erim en to hemos u t i l i z a d o Sephadex G-150 s u p e r f in e , que e s un p o lîm e ro de d e x tra n o e n tr e la z a d o con e p ic lo r o h id r in a , que form a un r e - t î c u l o t r id im e n s io n a l de cadenas de p o l i s a c â r id o s , lo s c u a le s se h in c iian en c o n ta c te con e l agua d eb id o a su a l t o co n te n id o en g rupos h i d r o x î l i c o s . E l tiem po y l a te m p e ra tu ra a que se p roduce e l h in ch ara ien to d e l g e l depende d e l g rad e de e n tre c ru z a m ie n to ( " c r o s s - l in k in g " ) d e l d e x tra n p en n u e s tro ca­ s o , a 100®G s e n e c e s i ta n 5 h o ra s y a te m p e ra tu ra am bian te 3 d îa s . Las c a r a c t e r î s t i c a s de l a r é s in a so n : - tamano de p a r t î c u l a : 10-40 ym de d iam e tro en e l p rô d u c to s e c o , - campe de fra c c io n a m ie n to : 5 .000 - 150.000 D p a ra p r o te în a s , - l îm i t e de e x c lu s io n : 150.000 D, - volumen de led io /g ra ro o : 18-22 m l. Es e s t a b le a pH com prendidos e n t r e 2 y 10 y a a g e n te s d i s o c ia n te s co­ mo l a u r e a , d o r u r e de g u a n id in a y d o d e c i l s u l f a to s o d ic o . Se debe e v i t a r e l use de a g e n te s o x id a n te s f u e r t e s . Se ré g é n é ra p o r la v a d o . P a ra e l a is la m ie n to de in m u n o g lo b u lin as u t i l iz a m o s c ro m a to g ra f îa a s ­ cen d an te con r e c i c l o . U tiliz am o s f l u jo in v e rs o ( c o n tr a l a g ravedad) p o rque t ie n e l a v e n ta ja de im p e d ir e l apelm azam ien to d e l g e l y p o r ta n to p e rm ite e l f l u jo l i b r e d e l e lu y e n te (J . Vaage y S . A gatw al, 1978) . La v e lo c id a d de f l u j o v a r îa segOn e l d iam e tro de l a columna y l a p re - s iô n . P a ra una columna de 2 ,5 cm de d ia m e tro , que e s l a u t i l i z a d a , e l f l u ­ j o mâximo e s de 0 ,1 4 m l/m inu to p a ra una p re s io n de 9 a 36 cm de agua. AO A, T e c n ic a . P re p a ra c io n d e l le c h o . Se pesa l a c a n tid a d n e c e s a r ia de g e l , segun e l volumen de lec h o que se d e se e , se t r a n s f i e r e a un roatraz de E rlenm eyer y se anade un v o lu ­ men de b u f f e r f o s f a to aproxim adam ente do b le d e l volumen de le c h o . Se c o lo c a a l bano m aria d u ra n te 5 h o ra s , se d e ja e n f r i a r y se in tro d u c e en l a colum na. D espu is se la v a con dos volum enes de b u f f e r fo s f a to y h a s ta su u t i l i z a c i o n se m an tien e a 10”C en b u f f e r f o s f a to suplem entado con a z id a so d ic a a l 0 ,1 % p a ra e v i t a r co n tam in acio n es b a c te r i a n a s . Las c a n tid a d e s c o n c re ta s de g e l y b u f f e r u t i l i z a d a s en n u e s tro s ex p erim en to s se in d ic a n a l h a b la r de "R e su l- ta d o s " . P re p a ra c io n de l a m u es tra . a) I n a c t iv a c iô n de l a m u es tra : se r e a l i z e m anten iendo e l su e ro san g u în eo a 56®C d u ra n te 30 m in u te s . b ) C o n c en trac iô n de l a m u e s tra : se co lo c a e l su e ro en una membra- na C e n tr i f lo CF 50, se c e n t r i f u g a a 1 ,2 8 0 x ^ d u ra n te 30 m inu tes y se re c o ­ ge e l l iq u id e que queda en l a p a r te s u p e r io r . c) D i â l i s i s de l a m u es tra : se la v a con b u f f e r f o s f a to t r è s v e ce s como minime con e l mismo d i s p o s i t iv e de l a c o n c e n tra c iô n , c e n tr ifu g a n d o a 1 .280 X ^ d u ra n te 30 m inu tes cada v e z . In tro d u c c iô n de l a m u es tra . Una vez e lim in a d o e l a z id a s ô d ic a de l a colum na, se in tro d u c e l a m u estra segun l a f ig u ra i 5 . La m u es tra se c o lo c a en l a j e r in g a que e s t a c o n ec tad a a l a p a r te i n f e r i o r de l a columna m ed ian te una v a lv u la de 3 v î a s , e l b u f f e r de a r r a s t r e se co lo c a en un r e c ip ie n t e tam bién co nectado a d ich a 41 i l I I w w ■ïi ë% Q g OC O LU H S g cû üj CL -8 >rt «M •O ' i ^ : I g % 42 v a lv u la . La s a l id a de l a columna e s t a co n ec tad a a una bomba p e r i s t â l t i c a p a ra m antener e l f l u jo c o n s ta n te ; e l l îq u id o , d espuês de p a sa r por l a co~ lum na, pasa por l a c e l d i l l a de un a b so rc io m etro que r e g i s t r a g ra fic a m e n te l a d en sid ad o p t ic a en cada momento y de a h i pasa a s e r re co g id o m ed ian te un c o le c to r de f r a c c io n e s que s e puede r e g u la r en tiem pos o volum enes. R ecogida de l a s in m u n o g lo b u lin as . Una vez r e a l iz a d a l a c ro m a to g ra f îa se reco g en l a s f r a c c io n e s que c o n tie n e n l a s in m u n o g lo b u lin a s . En e l p rim er paso e s t a s s e e n cu e n tra n en l o s dos p rim ero s p ic o s , que s a le n so la p a d o s . Se mancomunan, se c o n c e n tra n y s e vu e lv en a p a sa r por l a colum na. En e l segundo p a so , e l t e r c e r p ic o es mucho mas pequeno y se recogen o t r a vez lo s dos p r im e ro s , que s a le n so la p a ­ d o s . Se r e p i t e e l p ro ceso y en l a te r c e r a pasada se v u e lv en a re c o g e r lo s dos p rim ero s p ic o s e lim in an d o tam bién l a pequena p a r te que co rre sp o n d e a l t e r c e r p ic o . B. D iso lu c io n e s em p lead as. 1. B u ffe r f o s f a to 0 ,0 5 M en NaCl 0 ,1 M S o lu c io n A; Na^HPO^ ------------------------------------------------------ 14,196 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p , 1000 ml S o lu c io n B: NaHgPO^ ----------------------------------------------------- 15,601 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --------------------------- 1000 ml s e r 6 ,9 . 4 3 S o lu c io n C: m C l -------------------------------------------------------------------- 11,69 g II2O t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ——————— — ——————— 1000 ml B u ffe r : S o lu c io n A --------------------------------------------------------- 580 ml S o lu c io n B ---------------------------------------------------------- • 420 ml S o lu c io n C 1000 ml Una vez m ezclad as l a s 3 d is o lu c io n e s se mide e l pH, que t i e n e que r 2 . B u ffe r f o s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M y 0 ,1 % de a z id a so d ic a B u ffe r f o s f a t o ;------------------------------;--------------- 1000 ml A zida s o d i c a 1 g IX . AISLAMIENTO DE ANTIGENOS POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD La c ro m a to g ra f îa de a f in id à d c o n s i s te en l a in m o v il iz a c io n de una mo- l e c u l a b io e s p e c î f i c a p o r co n ju g a c io n a una m a tr iz in s o lu b le se g u id a de l a a d ic io n de l a m ezcla de s u s ta n c ia s en l a que se e n c u e n tra l a que querem os s e p a r a r . La m o lécu la f i j a d a e s e n fo n ce s capaz de a b so rb e r de l a s o lu c io n l a s u s ta n c ia a a i s l a r , m ie n tra s que l a s demâs paëan s in r e a c c io n a r , a l cam biar l a s c o n d ic io n e s e x p é r im e n ta le s l a s u s ta n c ia deseada v u e lv e a qu ed ar l i b r e ( P harm acia F ine C h e m ic a ls , 1979b; H offm ann-O stenhof y c o l s . , 1977). La m a tr iz debe s e r f î s i c a , qu îm ica y term icam en te a s t a b l e , te n e r b u e - n a s p ro p ied a d es de f l u j o y e s t a r l i b r e de a b so rc io n e s no e s p e c i f i c a s . La m a tr iz e le g id a p a ra n u e s tro s ex p erim en to s fu e l a S ep h aro sa 4B a c t i - 44 vada con CNBr, que e s capaz de c o n ju g a r p r o te în a s y o t r a s m o lêcu la s que con tengan g rupos araino p r im a r io s . La S epharosa e s un p o lîm ero formado p o r b o la s de a g a ro sa en form a de r o s a r io (D -g a la c to s a y 3 ,6 ,a n h id ro -g a la c to s a ) . La S epharosa 4B t ie n e una a b so rc io n no e s p e c î f ic a extrem adam ente b a ja ; p a ra que se con jugue con p ro ­ te în a s e s n e c e s a r io a c t i v a r l a con CNBr (bromuro de c ianôgeno) , e l ç ita l r e a c c io n a con lo s g rupos h id r o x î l i c o s de l a Sepharosa c o n v i r t i in d o lo s en grupos im id a , que re a c c io n a n con lo s grupos n u c le o f î l i c o s . La Sepharosa a c - t iv a d a re a c c io n a con lo s g rupos amino p r im a r io s d e l l ig a d o p a ra form ar ; : i s o u r e a s . A. T é c n ic a . A. 1. P re p a ra c io n d e l le c h o . 1. Se pesa l a c a n tid a d n e c e s a r ia de S epharosa 4B a c t iv a d a con CNBr segun e l volumen de lech o deseado y se t r a n s f i e r e a un embudo de p la ç a de v id r io de 7 ym de d ia m e tro . La c a n tid a d u t i l i z a d a en cada caso s e in d ic a en e l c a p î tu lo de " R e s u l ta d o s " . 2 . Se la v a d u ra n te 15 m in u tes con HCl 0 ,001 M p a ra que se h in ch e e l g ra n o . E l volumen de lav ad o debe s e r como mînimo 200 m l/g de g e l seco . 3. Se la v a con b u f f e r NaHCO^ 0 ,1 pH 8 p a ra que e l pH d e l g e l sea b â s ic o a n te s de l a c o n ju g ac io n con l a s p r o te în a s . 4 . Se t r a n s f i e r e a un tu b o . 5 . Al tubo que c o n tie n e l a S epharosa se anaden l a s p r o te în a s a c o n ju g a r , tam bién a pH 8 y a una c o n c e n tra c iô n de 10-20 mg/ml. 6 . Se a g i t a d u ra n te 2 h o ra s a te m p e ra tu ra am bian te (h a c ién d o lo 45 o s c i l a r en p o s ic iô n h o r i z o n t a l ) . 7. Se t r a n s f i e r e a l embudo de p la ç a de v id r io y se la v a con b u f­ f e r NàHCOg reco g ien d o e l l îq u id o de s â l id a p a ra a n â l i s i s c u a n t i t a t i v o de l a s p r o te în a s que s a l e n , l a s c u a le s c o rre sp o n d e s a l a s p r o te în a s que no se han f i j a d o a l a S ep h a ro sa . 8 . Se t r a n s i f e r e a un tubo y se anaden 3 volumenes* de e ta n o la m i- n a 1 M con re s p e c to a l volumen d e l le c h o . 9 . Se a g i t a d u ra n te 2 h o ra s como en e l pun to 8 p a ra a g o ta r l o s cen t] >s a c t i v e s que no hayan reacc io n ad o con l a s p r o t e în a s . 10. Se t r a n s f i e r e a una columna de Pharm acia F in e C hem icals mode­ lo K 9/15. Se re co g e e l l îq u id o de s a l i d a p a ra a n a l i s i s de p r o te în a s .P ig - 6 . 11. Se la v a e l lê c h o con 4 volum enes de b u f f e r b o ra to 0 ,1 N pH 8 , re co g ien d o e l l îq u id o de s a l i d a p a ra a n â l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o te în a s . 12. Se la v a con 4 volum enes de b u f f e r a c e ta to 0 ,1 H pH 4 , re c o ­ g iendo e l l îq u id o de s a l i d a p a ra a n â l i s i s de p r o te în a s . 13. Se c o n tin u a s lo s lav ad o s p a ra e s t a b i l i z a r l a columna h a s ta que lo s cam bios de pH sean m înim os, reco g ien d o siem pre e l l îq u id o de s a l i ­ da p a ra d e sp u ês c a l c u l e r e l t o t a l de p r o te în a s que no se han f i j a d o y c a l ­ c u le r e l re n d im ie n to de c o n ju g a c io n . 14. Se g uarda h a s ta su u t i l i z a c i o n en b u f f e r T r is pH 7 ,4 con 0 ,1 % de a z id a s o d ic a p a ra e v i t a r co n tam in ac io n es . A .2. O fe r ta de l a m ezcla de a n tîg e n o s . 1. Se in tro d u c e l a m u estra en un r e c ip ie n t e co n ec tad o a l a p a r te s u p e r io r de l a colum na. 2 . Se c o n e c ta l a s a l i d a de l a columna a una bomba p e r i s t â l t i c a 46 U J O U CD W -=« • f - M ! 47 FIGURA 6 ESQUEHA DEL MONTAJE DE LA CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Se in tro d u c e l a o f e r t a p o r l a p a r te s u p e r io r de l a colum na, se la v a con b u f f e r NaCl 0 ,1 4 M T r is 20 mM, pH 7 ,4 y s e e l i d e con b u f f e r g l ic in a -U C l 0 ,2 M pH 2 ,8 . Cada uno de l o s b u f f e r s e s t a en un re c ip ie n te " y su e n tr a d a a l a columna s e ré g u la p o r una v a lv u la de 3 v îa s . La s a l i d a de l a colum na e s t a c o n ec ta d a a una bomba p e r i s t â l t i c a que l l e v a l a m u es tra a l c o le c to r de f r a c c io n e s despues de p a s a r p o r e l a b so rc io m e tro u l t r a v i o l e t s que r e g i s t r a l a d e n s id a d o p t ic a a 275 nm. • 4 8 que a su vez e s t a co n ec tad a a un ab so rc io m e tro p a ra c o n t r p la r l a s a l i d a de l a s p r o te în a s y a un c o le c to r p a ra re c o g e r l a s m u e s tra s . 3 . Se m antiene l a o f e r t a en r e c i c lo d u ra n te 2 h o ra s . 4 . Se la v a con b u f f e r T r is pH 7 ,4 h a s ta que e l a b so rc io m e tro no d e te c te s a l i d a de p r o te în a s . 5 . Se e l id e n la s p r o te în a s e sp e c îf ic a m e n te f i j a d a s con b u f f e r g l i c i n a pH 2 ,8 . 6 . Se recogen l a s m u estra s en T r is (100 m g/m l), en p ro p o rc io n 0,1 m l/m l de e lu a to p a ra cam biar a pH n e u tr e o l ig e ra m e n te b â s lc o , con ob­ j e t o de que l a s p r o te în a s e s té n e l menor tiem po p o s ib le a pH â c id o , lo que produce d e s n a tu r a l i z a c io n . 7 . Se v u e lv e a e l i d i r con b u f f e r g l i c i n a pH 2 ,8 c o n ten ien d o 10 % de d io x â n , p a ra r e s c a t a r l a s p r o te în a s (a n tîg e n o s ) u n id as mas fu e rte n je n te a la s p r o te în a s ( a n tic u e rp o s ) f i j a d a s a S ep h a ro sa . En e s t e caso ta n b ie n s e recogen l a s f ra c c io n e s so b re T r is (100 mg/ml) p a ra e v i t a r l a d e s n a tu r a l i ­ z a c io n . B. D is o lu c io nes e mp le a d a s . 1. HCl 0 ,001 M HCl 1 H 1 ml HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --------------------------- ;----- 1000 ml 2 . NaHCOg 0 ,1 M en NaCl 0 ,5 M pH 8 N allCO j---------------------------------------------------------------- 8 ,4 g NaCl 0 , 5 M, c . s . p . ---------------------------------------------------- 1000 ml 49 3. NaCl 0 .5 M N a C l ---------------------------------------- 29 ,25 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ------------------------ : 1000 ml 4 . E tan o lam in a 1 M E tano l a m i n a 6 , 1 ml HCl — —----------— ----------------- — — , 8 ,0 ml T ris -H C l pH 8 c . s . p . 100 ml Se gu ard a en f r a s c o to p a c io y en l a o s c u r id a d . 5 . T ris -H C l 0 .2 M en NaCl 0 .5 M pH 8 T r is ( h id ro x im e t i l ) a m in o e ta n o ---------------------------------- 12.114 g HCl 1 N 50 ml NaCl 0 ,5 M c . s . p . 500 ml 6 . T ris -H C l 0 .0 2 M en NaCl 0 ,1 4 M pH 7,4 In d ic a d a en e l a p a r ta d o IV-B 7. G l ic in a 0 .2 M en NaCl 0 ,5 M pH 2 .8 ■ G l i c i n a ----------------------------------------------------------------------- 7 ,5 g HCl 1 N ---------------------------------------------------------------------- 20 ,0 ml NaCl 0 ,5 M, c . s . p . 500 ml 8 . B u f fe r a c e ta to 0 ,1 M en NaCl 1 M pH 4 CgOgH^Na SHgO------------------------------------------------------------ 13 ,6 g H 4 C 2O 2 ---------------------- —-------------- ------------— — 5 ,8 ml NaCl 1 M, c . s . p . ————————————————— ————————— 1000 ml 9 . NaCl 1 M N a C l---------------------------------------------------- 5 8 ,44 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 1000 ml 50 10. B u ffe r b o ra to 0 ,1 H en NaCl 1 M pH 8 HjBOj — ------------------------------------------------- 6 ,1 8 g NagB^O^'lO H gO ----------- -------------------------------- 38 ,14 g NaCl 1 M c . s . p . 1000 ml 11. T r i s , 100 mg/ml T ris (h id ro x im e til)a m in o m e ta n o ------------------- 10,0 g H2O t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ------------------------------ 100 ml X. VALORACION DE PROTEINAS Las p r o te în a s se v a lo ra ro n por e l metodo de O.H. Lowry y c o l s . (1 9 5 1 ). E s ta te c n ic a c o n s is te en h a c e r r e a c c io n a r l a s p r o te în a s con unos ré a c ­ t i v e s que producen una c o lo ra c io n a zu l p ro p o rc io n a l a l a c o n c e n tr a t io n de p r o te în a s en l a m u es tra . E l c o lo r f i n a l e s e l r e s u l ta d o de l a re a c c io n d e l b i u r e t , que c o n s is te en l a fo rm acion de com plejos e n tr e l a s s u s ta n c ia s que c o n tie n e n mas de un e n la c e p e p tid ic o y l a s s a l e s de cobre en medio a l c a l i n o , a s î como l a ré d u c ­ t io n d e l r e a c t iv o fo s fo m o lîb d ic o - fo s fo tu n g s t ic o p o r l a t i r o s i n a y e l t r i p - to fan o p ré s e n te s en l a s p r o te în a s t r a t a d a s . A. T ecn ica de a n â l i s i s . 1. Curva p a tro n . Se c o n stru y e una cu rv a p a tro n p ro ced ien d o de l a s ig u ie n te m anera. Se toman a l î c u o ta s de l a d is o lu c iô n de se ra lb u m in a p a t r 6n com- p re n d id a s e n t r e 10 pg (0 ,0 5 ml) y 100 pg (Cf,5 m l) . Se anade 82© b i d e s t i l a d a 51 h a s ta C om plé tâ t un volumen de 0 ,6 tn l, s e a g i t a . Se anaden 3 ml d e l r e a c t i ­ vo C. Se d e ja en rep o so 10 m in u te s . Se anaden 0 ,3 ml d e l r e a c t iv o E. Se a g i t a m ecânicam ente . Se e s p e ra 1 h o ra p a ra que ten g a lu g a r l a r e a c c io n . Se le e l a d e n sid ad o p t ic a de cada tu b o en e l e s p e c tro fo tô m e tro a una lo n g itu d de O’- la de 750 nm. Se h ace una r e p re s e n ta c io n g r a f i c a en l a que f ig u r a l a c a n t id a d de p r o te în a s en pg en e l e j e de l a s a b s c is a s y l a d en sid ad o p t ic a en e l e je de l a s o rd e n a d a s . 2 . V a lo rac io n de una s o lu c io n problem a de p r o t e în a s . Se toman a l î c u o ta s de l a s o lu c io n prob lem a. Se com pléta h a s ta 0 ,6 ml con HgO o NaOH 0 ,5 N, segun e s t e l a s o lu c io n problem a o r i g i n a l en H2O o en NaOH 0 ,5 N. Se anaden 3 ml d e l r e a c t iv o C o D, segun e s t e l a s o lu ­ t io n en H2O o en NaOH 0 ,5 N. Se a g i t a . Se e sp e ra n 10 m in u te s . Se anaden 0 ,3 ml d e l r e a c t iv o E. Se l e e l a d e n s id ad o p t ic a en e l e s p e c tro fo tô m e tro a una lo n g itu d de onda de 750 nm d esp u es de 1 h o r a . Se l le v a n lo s v a lo r e s de den­ s id a d ô p t ic a a l a c u rv a p a tro n y s e e x t r a p o la s l a s c a n tid a d e s de p r o t e în a que producen e s a a b so rb a n c ia . B. D iso lu c io n e s e m p lead as . R eac tiv o A (NaOH 0 ,1 N) Na2C0g a n h i d r o 2,0 g KNaC^Hj^Og ( t a r t r a t o de so d io y p o t a s i o ) 0,2 g NaOH 0 , 1 N , c . s . p . ---------------------------------------------------- 100 ml 52 R eac tiv o A (HgO) Na^CO^ a n h id ro ---------------------------------------------------- 2,0 g NaKC^O^Hg ( t a r t r a t o de sô d io y p o ta s io ) ---------- 0,2 g HgO, c . s . p . 100 ml R e ac tiv o B CuSO^ SHgO----------------------------------------------------------- 0 ,5 0 g HgSO^ 1 g o t a HgO b i d e s t i l a d a , c . s . p . 100 ml R eac tiv o C R eac tiv o A (NaOH 0 ,1 N ) 50 ml R eac tiv o B ---------- 1 ,0 ml R eac tiv o D R eac tiv o A (H g O ) 50 ml R eac tiv o B --------------------------------------------- ------------- 1 ,0 ml R e ac tiv o E R eac tiv o de F o l in - C io c a lte a u -------------- 5 ,0 ml HgO b i d e s t i l a d a -------------------------------------------------- 4 ,7 ml D iso lu c iô n p a trô n de se ra lb u m in a con 200 pg/m l Sera lbum ina b o v i n a ----------------------------------- 0 ,1 0 g HgO b i d e s t i l a d a c . s . p . 500 ml E s t e r i l i z a r p o r f i l t r a c i ô n . NaOH 0 ,5 N NaOH---------------------------------------------------------------------- 2 0 ,0 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --------------------------------------- 1000 ml 53 X I. INMUNODIFUSION E sta te c n ic a se b a sa en l a re a c c io n de p r e c ip i t a c io n a n t ig e n o - a n t i - cu e rp o , que fu e d e s c r i t a po r p rim e ra vez p o r Kraus en 1897. A lo la rg o de e s t e s i g l o se fu e ro n in tro d u c ie n d o m o d if ic a c io n e s pava m e jo ra r l a r e a c c io n h a s ta l l e g a r a l a s t ê c n ic a s de p r e c ip i t a c io n p o r d i f u s iô n en un medio sem i- s ô l id o . La t e c n ic a que n o s o t r o s empleamos e s l a de d o b le in m u n o d ifu sio n de D u ch te rlo n y (1948) (A .J . C row le , 1973). La d o b le inm unodifusiôn- de O u ch terlo n y c o n s is te en p re p a ra r una p la ç a con un m edio s e m is ô lid o , p e r f o r e r en e l l a unos p o c i l l o s p e r i f é r i c o s y o t r o c e n t r a l y c o lo c a r en l a s e r i e p e r i f ê r i c a l o s a n tîg e n o s y en e l c e n t r a l l o s a n tic u e rp o s o a l c o n t r a r io , d e ja r lo s d i f u n d i r un tiem po en a tm ô sfe ra de h u - medad y r e v e l a r l o s . A. T é c n ic a . 1. Se c o lo c a una p la ç a de P é t r i de 4 cm de d iâm e tro so b re una me­ sa h o r i z o n ta l . 2 . Se d e p o s i ta n en e l l a 2 ,5 ml de a g a r o a g a ro sa a l 1 % "tam pona- do" a 6 0“c, p rocurando que no s e form en b u rb u ja s . 3 . Se d e ja s o l i d i f i c a r y se g uarda a 4 ”C d u ra n te 2 h o ra s . 4 . Se p e r fo ra n en e l a g a r 7 p o c i l l o s de 5 mm de d iâ m e tro : uno c e n t r a l y 6 p e r i f é r i c o s e q u id i s t a n te s d e l c e n t r a l . 5 . Se co lo can en lo s p o c i l l o s l o s a n tîg e n o s y a n tic u e rp o s segün cada esquema d e te rm in a d o , como se in d ic a en " R e s u l ta d o s " . 6 . Se gu ard a l a p la ç a a te m p e ra tu ra am bien te en un r e c ip ie n t e 54 s a tu ra d o de humedad d u ra n te 24 a 48 h o ra s . 7. Cuando ap arecen l a s bandas se p reced e a su lavado y t in c io n . Lavado de l a p la ç a . 1. Se la v a l a p la ç a con NaCl 0 ,1 4 M, a g ita n d o un poco y dec.antan- do con cu idado 2 v e c e s . 2 . Se cu b re la p la ç a con NaCl 0 ,1 4 M y se d e ja 30 m in u te s , d e s ­ pues de lo s c u a le s se d e ca n ta y se r e p i t e e s te lav a d o 4 -5 v e c e s . 3. Se d e ja l a p la ç a c u b ie r ta con l a so lu c iô n s a l i n a d u ra n te to d a l a noche. 4 . Al d îa s ig u ie n te se d e c a n ta , se anade o t r a vez NaCl 0 ,1 4 M y se d e ja d u ra n te 2 h o ra s , a l cabo de l a s c u a le s se r e p i t e e l lav ad o de 2 ho­ r a s . 5. Se la v a 3-4 v e c e s d u ra n te 10 m inutos con agua d e s t i l a d a . 6 . D espuês d e l u ltim o lav ad o s e seca l a p la ç a y l o s p o c i l l o s con un p a p e l f i l t r o y se co n se rv a en l a e s tu f a a 37°C h a s ta e l d îa s ig u i e n t e . 7. Se p rocédé a l a t i n c io n . T in c iô n de l a p la ç a 1. Se echan en l a p la ç a 5 ml de negro de amido a l 0 ,0 5 %. 2. Se d e ja a c tu a r d u ra n te 5 m in u to s . 3 . Se d e ca n ta y s e la v a con so lu c io n de m e ta n o l: âc id o a c ê t i c o : agua (4 :1 :5 ) h a s ta que no se d esp ren d a c o lo r . 4 . Se la v a 3 v eces con agua d e s t i l a d a . 5 . Se d e ja se c a r a l a i r e . 55 B. D iso lu c io n e s em p lead as. 1. Agar a l 1 % o a g a ro sa a l i % "tam ponados” F ra c tio n 1 Agar o a g a r o s a --------------------------------------------------- 10 ,0 g A zida so d ic a —— ——————— — ———— ———— ————— 1,0 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 500 ml F ra c tio n 2 A c e ta to de b a r b ito n a ——— — —————————— ———— 1 6 ,5 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 500 ml Ambas f r a c c io n e s se p ré p a ra s por s e p a ra d o , se c a l i e n ta n y s e mez- c la n . Se r e p a r t e en a l î c u o ta s de 20 ml y s e e s t e r i l i z a n en a u to c la v e a I15®C d u ra n te 20 m in u to s . 2 . NaCl 0 ,1 4 M N a C l------------------------------------------------------------------------- 8 ,1 8 g 3 . M e tan o l: â c id o a c ê t ic o :a g u a 4 :1 :5 M e ta n o l 400 ml Acido a c e t i c o ——————————————————————— ———— 100 ml HgO t r i d e s t i l a d a 500 ml 4 . Negro de amido 0 ,0 5 % Negro de amido ——— ———————————————— —— —— 0 ,2 5 g M e tan o l:âc id o a c ê t i c o :a g u a , c . s . p . ------------- 500 ml 56 X II. INMUNOELECTROFORESIS E ste metodo fue in tro d u c id o en 1^53 por P . G rabar y C.A. W illia m s . Es l a suma de dos tê c n ic a s : e l e c t r o f o r e s i s se g u id a de in m u n o d ifu siô n ( P .G. G rabar y P. B u r t in , 1964). E sta té c n ic a se u t i l i z a pa ra l a id e n t i f i c a c iô n de una m ezcla de a n t î ­ genos g r a c ia s a su d i f e r e n te m o v ilid ad e l e c t r o f o r ê t i c a , cuando d ich a m ezcla se som ete a un campo e l ê c t r i c o . A c o n tin u a c iô n , m ed ian te l a in m u n o d ifu s iô n , podemos i d e n t i f i c a r l a s bandas por re a c c iô n de p r e c ip i t a c iô n e s p e c î f ic a con a n t i c u e r p o s . A. T é c n ic a . 1. Se funden unos 60 ml de a g a r o a g a ro sa a l 1 % " tam ponados". 2. La p la ç a de p re p a ra c io n p a ra e le c t r o f o r e s i s se n iv e l a so b re una m esa. ca . 3. Se co lo can 8 p o r ta o b je to s p e rfe c ta m e n te l im p io s so b re l a p la - 4 . Se echa e l a g a r a 58°C. 5 . Se q u i ta e l ex ceso de a g a r con una r é g la n iv e la d o ra . 6 . Se d e ja s o l i d i f i c a r y se guarda 1 h o ra a 4®C. 7. U ti l iz a n d o e l in s tru m e n to a l e f e c to se hacen 2 ra n u ra s y 3 p o c i l lo s en cada p o r ta o b je to s . 8 . Se co lo can l a s m u es tra s en lo s p o c i l l o s . 9 . Se c o lo c a l a p la ç a en e l bano e l e c t r o f o r ê t i c o , en e l que p re - v iam en te se ha p u esto e l e l e c t r o ] i t o a 4 0 -5 0 “C p a ra c r e a r una a tm ô sfe ra de 57 lium edad. 10. Se h ace e l c o n ta c te e n t r e e l e l e c t r o l i t o y l a p la ç a m ed ian te p a p e le s Whatman g rad e n* 3mm. 11. Se c o n ec ta n lo s p o lo s a l a fu e n te de a lim e n ta c io n e l ê c t r i c o . 12. P a ra c o n t r o l a r e l r e c o r r id o e le c t r o f o r ê t i c o se co lo can en e l ex trem e de l a p la ç a unos g r a n i t é s de a z u l de b ro m o cre so l; cOando ê ^ te se em piece a s a l i r de l a p la ç a , l a e l e c t r o f o r e s i s se puede c o r ta r . Las c o n d ic io n e s de l a e l e c t r o f o r e s i s son : - I n t e n s i d a d ------------------------------------------- 35 mA - T ie m p o ----------------------------------- ;--------------- 90 m inu tos 13. Una vez te rm in ad a l a e l e c t r o f o r e s i s se r e t i r a l a p la ç a d e l bano y se echa e l a n t i s u e r o c o rre s p o n d ie n te en l a s r a n u ra s . 14. Se g u a rd a en a tm ô sfe ra de humedad a te m p e ra tu ra am b ien te du­ r a n te 24-48 h o ra s , h a s ta que se y i s u a l i c e l a re a c c iô n de p r e c ip i t a c iô n . 15. Se c o r ta e l a g a r s ig u ie n d o lo s b o rd e s de lo s p o r ta o b je to s y se p ro céd é a su lav a d o y t in c iô n de l a m anera d e s c r i t a p a ra l a s p la ç a s de inm u n o d ifu c iô n en e l m êtodo X I. B. D iso lu c io n e s e m p le ad a s . 1. Agar o a g a ro sa 1 % "tam ponada" D e s c r i ta en mêtodo XI. 2 . B u ffe r de Owen ( e l e c t r o l i t o de l a e l e c t r o f o r e s i s ) A c e ta to de b a r b i to n a — —————————————————— 16 ,5 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ———————— ——————— 1000 ml 58 X III . MICROMETODO PARA TITULACION DE CITOTOXICIDAD A. T ecn ica de t i t u l a c i o n de c i to to x ic id a d de lo s a n t i s u e r o s . U tiliz a m o s e s t a t e c n ic a p a ra fc a lcu la r e l t i t u l o c i t o to x ic o de lo s a n t i s u e r o s , a s i como l a in h ib ic io n que produce l a p re v ia in c u b a c io n de d i - chos a n t i s u e r o s con lo s a n tîg e n o s de menfcrana. E l p ro c e d im ie n to s e l l e v a a cabo de l a s ig u i e n t e m anera. Se d e sp e rd ig a n l a s c e lu l a s de lo s c u l t iv o s de t e j i d o s (en n u e s tro caso c e lu la s de l a l î n e a EREA). Se r e a l i z e un re c u e n to d e l numéro de c e lu ­ l a s con una can\ara h e m o c ito m e tr ica de Neubauer y se h ace l a d i lu c io n n ece ­ s a r i a con e l m edio de c u l t i v e h a b i tu a l p a ra o b te n e r una su s p e n s io n con 50.000 c l l u l a s /m l . En cada p o c i l l o de l a p la c e de m ic r o t i tu la c io n se ponen 10 p i de s u s p e n s io n c e l u l a r , que c o n tie n e n 500 c e lu l a s . Se c o lo c a l a p la c e en un r e c ip ie n t e en a tm ô sfe ra de 93 % de humedad r e l a t i v e y a i r e con 5 % de a n h id r id o c a rb ô n ic o . Se in c u b a l a p la c e en una e s tu f a a 37°C. Al d îa s i ­ g u ie n te , con l a s c e lu la s y a a d h e r id a s en e l fondo de lo s p o c i l l o s , se l a - van con medio de c u l t i v o b a se y se o n ade e l a n t i s u e r o a t i t u l a r en d i lu c io - nes c r e c ie n te s de f a c to r 2 en medio b a s e . Se incuban d u ra n te 1 h o ra a 37®C y se r e a l i z e l a l e c t u r a de v i a b i l id a d c e l u l a r p o r e x c lu s iô n de c o lo r a n te y c ito m o rfo lo g îa . Aquel p u n to c o r re sp o n d ie n te a l a u ltim a d i lu c iô n que p ro - .duzca l a m uerte d e l 100 % de l a s c e lu la s se tbm arâ como t î t u l o d e l a n t i ­ su e ro . En e l caso de c e lu la s GAEL, se p rocédé de l a s ig u ie n te m anera. Se e x tr a e l a su s p e n s io n c e l u l a r que c re c e i n t r a p e r ito n e a lm e n te en e l r a tô n me- 59 d ia n te p a r a c e n te s i s , se la v a l a su sp e n s io n c e l u l a r con NaCl 0 ,1 4 M, s e r e - su spenden l a s c e lu la s en medio b a se y se r e a l i z a un re c u e n to c e l u l a r . Se p ré p a ra una su s p e n s io n con 50 .000 c e lu la s /m l y s e ponen 10 p i en cada p o c i- l l o . Inm ediatam ente despues s e anaden l a s d i lu c io n e s c o r re s p o n d ie n te s de a n t i s u e r o , se in cu b a 1 b o ra a 37*C y se r e a l i z a e l re c u e n to de v ia b i l id a d c e l u l a r . La in cu b a c io n se h ace en a tro o sfe ra de a i r e con 5 % de CO2 y una humedad r e l a t i v a de 93 %. B. T e c n ic a de t i t u l a c i o n de in h ib i c io n de c i t o to x ic id a d de lo s a n t i s u e r o s p rev iam en te ab so rb id o s con a n t ig è n e s . E l p ro c ed im ie n to e s fundam entalm ente e l mismo, p e ro a n te s de a - n a d ir e l a n t i s u e r o a lo s p o c i l l o s , e s t e se 'in cu b a 1 b o r a 30 m in u tes con d i ­ lu c io n e s c r e c ie n te s de f a c to r 2 de lo s a n tig è n e s de membrana. A c o n tin u a - c io n se v a lo r a l a i n h ib ic iô n de l a c i t o to x ic id a d que h a p ro d u c id o l a ab - s o rc io n p re v ia con lo s a n tig e n o s . XIV. PRUEBA DEL ANILLO E s ta p ru eb a s i r v e p a ra s a b e r s i l o s a n tic u e rp o s c re a d o s c o n tr a uno o v a r io s a n tig e n o s d e te rm in ad o s son o no p r e c i p i t i n a s . La t e c n ic a se b a s a en l a re a c c iô n de p r e c ip i t a c iô n a n t ig e n o -a n t ic u e rp o . E s ta re a c c iô n fue d e s c r i - t a p o r p rim e ra vez p o r K raus en 1897. E l t e s t de p r e c i p i t a c i ô n en a n i l l o fu e in t ro d u c id o por A s c o li en 1902. La forma de r e a l i z a r d ic h a p ru eb a ha s id o d e s c r i t a p o r R .R.A. Coonbs y P .G .H . C e ll (1968) y o t r o s a u to r e s . 60 A. T e c n ic a . Se c o lo c a 0 ,1 ml de a n t i s u e r o en un tu b i to s in re b o rd e , se anade len ta m e n te p a ra que no s e m ezcle 0,1 ml de l a s o lu c io n d e l a n tig e n o a una c o n c e n tra c io n de 10 a 20 m g/m l. Se e sp e ra 1 a 2 m in u te s , en e l t r a n s c u r s b de lo s c u a le s s e forma un a n i l l o de p re c ip i ta d o en l a i n te r f a s e e n t r e e l an tig e n o y e l a n t i s u e r o . S i pasado e s te tierapo no se forma e l an illX ), e s que e l a n t i s u e r o no c o n tie n e p r e c i p i t i n a s . XV. CURVA DE PRECIPITACION CUANTITATIVA E sta p ru e b a , d e s a r r o l l a d a po r M. H e id e lb e rg y F .E . K endall (1 9 3 5 a , b ) , e s l a b a se de to d o s lo s e s tu d io s c u a n t i ta t i v o s de l a in te r a c c io n a n tig e n o - a n tic u e rp o (E.A. R abat y M.M. M ayer, 1948). La te c n ic a c o n s i s te en poner c a n tid a d e s c r e c ie n te s de a n tig e n o en p re - se n c ia de una c a n tid a d f i j a de a n t ic u e rp o , in cu b a r p a ra que se form e un p r e c ip i ta d o , v a lo r a r e s e p r e c ip i t a d o y de a h i sa c a r l a e q u iv a le n c ia o r e l a - c io n e s op tim as en l a s que hay que poner e l an tig e n o y e l a n tic u e rp o p a ra que l a r e a c c iô n de p r e c ip i t a c iô n se a maxima. A. T e c n ic a . Se p ré p a ra s 10 tu b o s de c e n t r i f u g a con c a n tid a d e s c r e c ie n te s de a n tig e n o en un volum es c o n s ta n te (0 ,5 m l) . Se anade a to d o s lo s tu b o s 0 ,5 ml de una d i lu c iô n c o n s ta n te de a n t i s u e r o y se m ezclan lo s r e a c t iv o s . Se incuban d u ra n te 1 h o ra a 37*C. Se guardan h a s ta e l d îa s ig u ie n te a 4°C. Se c e n tr ifu g a n a 3000 x ^ d u ra n te 15 m in u te s . Se e x tra e e l so b re n a d a n te , se 61 la v a l a p e l l a de p r e c ip i ta d o y s e d é te rm in a en e l l a l a c a n tid a d de p r o t e i - n a s . Se r e p ré s e n ta g ra f ic a m e n te ‘l a c a n tid a d de p r e c ip i ta d o f r e n t e a l a c a n tid a d de a n tig e n o en cada p u n to . El pun to in m ed iatam en te a n t e r io r a l mâ- ximo es e l pun to de e q u iv a le n c ia . En e l pun to de e q u iv a le n c ia s e c a lc u la l a c a n t id a d 'd e a n tic u e rp o que ha re a c c io n a d o , p o r d i f e r e n c i a e n t r e e l peso d e l p r e c ip i ta d o y e l peso d e l a n tig e n o . El v a lo r o b te n id o c o rre sp o n d e a l a c a n t id a d de in m u n o g lo b u li- n as e s p e c î f ic a s a c t i v a s que c o n tie n e e l s u e ro . XVI. INMUNOGENICIDAD E s ta t ê c n ie a c o n s i s t e en a d m in is t r e r s u s ta n c ia s a n t ig é n ic a s c e lu l a r e s o s u b c e lu la r e s en v a r i a s d o s is a g rupos de r a to n e s , e in o c u la r p o s t e r io r - m ente c ê lu l a s c a h c e r o s a s ,v iv a s ev a lu an d d l a a p a r ic io n o n ô id e tum ores y , en e l p rim e r c a s o , s i p ro g re s s o r e g re s a desp u es de un tiem po de e v o lu c io n . A. T ë c n ic a . 1 . Se fo rm as g ru p o s de 6 r a to n e s , de dos m eses de edad y d e l m is­ mo sexo ( fe m e n in o ) . 2 . E l d î a que s e denomina 0 s e l e s a d m in is t ra i n t r a p e r i t o n e a l - m ente e l 10 % de l a d o s i s a n t ig é n ic a t o t a l en un volum es de 0 ,2 m l. En la s e c c io n de "R e su lta d o s " s e an o ta n l a s d o s i s u t i l i z a d a s en lo s d i f c r e n te s e x p e r im e n to s . 3. E l d îa 8 s e l e s in y e c ta un 45 % de l a d o s is a n t ig é n ic a t o t a l 62 por v ia su b c u tan e a , en 0,2 m l. 4 . E l d îa 16 s e a d m in is tra e l 45 % r e s t a n t e d e l m a te r ia l a n t ig é - n ic o , nuevam ente por v ia su b c u tan e a , en 0,2 m l. 5. E l d îa 30 se in o cu la n 23 .000 c e lu l a s GAEL su sp en d id a s en 0 ,2 ml de NaCl 0 ,14 M, p o r v ia su b c u tan e a . 6 . A p a r t i r de e s te memento s e re v is a n d ia r ia m e n te lo s ra to n e s re g is tr a n d o l a a p a r ic io n y ev o lu c io n de tu m o res. XVII. INMUNOPEROXIDASAS La te c n ic a de l a s inm unoperox idasas c o n s i s te en la c o n ju g a tio n de a n tic u e rp o s con p e ro x id a sa s usando e l m etodo de l a s c a rb o d iim id a d e s c f i to por E. K u rs ta k (1 9 7 1 ), desp u es se hacen r e a c c io n a r lo s a n tic u e rp o s con l a s c e lu la s y se lo c a l iz a n lo s lu g a re s de r e a c t io n re v e lan d o con b e n c id in a s e - gun l a te c n ic a de E .D .P . De R o b e r tis y G rasso (1961) m o d ific ad a . La l o c a l i z a t i o n de lo s a n tig e n o s se puede v i s u a l i z a r a l m ic ro sco p ic o p t ic o como manchas a z u le s en l a s ç ê lu la s y a l m ic ro sco p io e le c trô n ic o co - mo zonas e le c trô n ic a m e n te d e n sa s . A. T ecn ica de c o n ju g a t io n . 1. Se m ezclan 15 mg de in m u n o g lo b u lin a s , 45 mg de p e ro x id a sa s y 120 mg de c a rb o d iim id a en un volumen t o t a l de 6 ml de b u f f e r T r is - a c ê t i c o 0 ,0 5 M a pH 7 ,2 . 2. La m ezcla se in cu b a d u ra n te 12 h o ra s a 4®C en un a g ita d o r mag­ n e t i t e . 6 3 3. Se c e n t r i f u g a a 3000 x d u ra n te 10 m in u to s . 4 . Se d e c a n ta y d e s p re c ia e l p r e c ip i t a d o . 5. E l so b re n ad a n te s e e s t e r i l i z a a t r a v é s de un f i l t r o Swinnex (M il l ip o re ) con membrana de 0,22 pm de d iâm e tro de poro y se gu ard a e t i - q u e tad o como " in m u n o g lo b u lin as c o n ju g a d a s" . B. T éc n ic a p a ra l a o b se rv ac io n a l m ic ro sc o p io o p t ic o . 1. Se f i j a n l a s c é lu la s anad ien d o a c e to n a a b s o lu ta a 4“C y man- te n ié n d o la d u ra n te 10 m in u to s. 2 . S e d e ca n ta y d e ja s e c a r a l a i r e , 3 . Se anaden l a s in m u n o g lo b u lin as co n ju g ad as con p e ro x id a sa s y se incu b an a 37“C d u ra n te 2 h o ra s o a 4“C d u ra n te 12 h o ra s . 4 . Se la v a l a p re p a r a t io n con b u f f e r f o s f a to 0 ,1 M pH 7 ,2 a 4*C d u ra n te 5 m in u to s , 5 . Se r e p i t e e l lav ad o 2 v eces m as, 6 . Se la v a con agua b i d e s t i l a d a a 4*C d u ra n te 5 m inu tos y s e d e ja s e c a r a l a i r e . 7 . Se c u b re l a p r e p a ra t io n con m o lib d a to amonico a l 0 ,1 % en NaCl 0 ,1 4 M d u ra n te 5 m in u to s . 8 . Se d e c a n ta y s e anade b e n c id in a f r e s c a , m an te n ié n d o la d u ra n te 90 seg u n d o s. 9 . Se la v a rap id am en te con NaCl 0 ,1 4 M y s e d e ja s e c a r a l a i r e , 10. Se anade s o lu t io n acuosa de s a f r a n in a a l 0 ,2 5 % y s e d e ja a c - t u a r 5 seg u n d o s. 11. Se d e c a n ta y la v a rap id a m e n te con agua b i d e s t i l a d a . 64 12. Se d e ja s e c a r a l a i r e y se monta con bâlsarao de C anada, p ro - ced ien d o a su o b s e rv a tio n a l m ic ro sco p io o p t ic o , en e l c u a l ap arecen l a s zonas p o s i t iv a s te n id a s de a z u l . C. T éc n ic a p a ra l a o b s e rv a tio n a l m ic ro sco p io e le c t r ô n i c o . 1. Se c u l t iv a n l a s c ê lu la s so b re c u b re o b je to s en tu b o s dç L e ig h to n . 2. Se lav an l a s c é lu l a s con b u f f e r f o s f a to 0 ,1 M a pH 7 ,2 y 4“C. 3 . Se f i j a n con g lu ta r a ld e h id o a l 2 ,5 % (F lu k a ) en e l mismo b u f­ f e r a te m p e ra tu ra am bian te d u ra n te 1 h o ra . 4 . Se ̂ lav a n dos v eces en b u f f e r f o s f a to 0 ,1 M a 4“C d u ra n te 15 in u to s . 5. Se anade b u f f e r de lav ad o y s e d e ja n l a s c é lu la s con é l h a s ta e l d îa s ig u ie n te . 6 . Se d e c a n ta y s e anaden l a s inm un o g lo b u lin as co n ju g ad as con pe­ r o x id a s a s , in cu b â n d o las d u ra n te 2 h o ra s a te m p e ra tu ra am bian te o to d a l a noche a 4“C. 7. Se la v a con b u f f e r f o s f a to 0 ,1 M a pH 7 ,2 y 4®C d u ra n te 8 mi­ n u to s . 8 . Se d e ca n ta y anade t e t r ô x id o de osmio (OsO^) a l 2 % en b u f f e r f o s f a t o , m an ten ién d o lo 1 h o ra a 4*C. 9 . Se h ace una in c lu s io n en a g a r a l 2 %. 10. Se d e s h id r a ta en s o lu t io n de a ce to n a a l 50 % una noche y a l 70 % dos banos de 15 m inu tos cada uno. 11. Se c o n tr a s ta con a c e ta to de u r a h ilo a l 0 ,5 % en a c e to n a a l 70 % d u ra n te una noche. 65 12. Se c o n tin u a l a d e s h id r a ta c io n con a c e to n a a l 90 % (2 b an cs de. 15 m inutos cada uno) y a ce to n a a l 100 % (2 banos de 30 m in u tes cada u n o ). 13. Se p ro céd é a su o b se rv a c io n a l m ic ro sc o p io e le c t r ô n i c o ; l a s re g io n e s p o s i t iv a s a p a re c e n en l a s c é lu la s como zonas e le c trô n ic a m e n te den­ sa s . D. D iso lu c ié n e s em plead as. 1. D iso lu c iô n s a tu r a d a de b e n c id in a . B e n c id in a — ——————————— ——— ———— —— —— 25 mg H2O t r i d e s t i l a d a , an ad id a a 80"C, c . s . p . - 100 ml 2 . D iso lu c iô n de t r a b a jo de b e n c id in a . P r e p a r a r la f r e s c a segôn uso D iso lu c iô n de b e n c id in a s a tu ra d a ---------------------- 10 ,0 ml P e rô x id o de h id rô g en o a l 3 % ---------------------------- 0 ,0 2 ml 3 . D iso lu c iô n acuosa de s a f r a n in a a l 0 ,2 5 %. S a f r a n i n a --------------------------------------------------------- 0 ,2 5 g H2O t r i d e s t i l a d a , c . s ^ p . ------------------ 100 ml 4 . D iso lu c iô n de m o lib d a to amônico a l 0 ,1 % M o lib d a to amônico ----------------------------------------------- 0 ,1 g NàCl 0 ,1 4 M, c . s . p . -------------------------- 100 ml 5 . D iso lu c iô n de te t r ô x id o de osmio a l 2 % O s O ^ ----------------------------------------------------- 2 ,0 g B u f f e r f o s f a t o 0 , 1 M, c . s . p . ------------ 100 ml 66 6 . D iso lu c iô n de a c e ta to de u r a n i lo a l 0 ,5 % A ceta to de u r a n i l o ----------------------------------------------- 0 ,5 g A cetona , c . s . p . ---------- ---- --------------------------------- 100 ml 7. B u ffe r T r i s - a c e t a to 0 ,0 5 M pH 7 ,2 T r is (h id ro x im e til)a ra in o m e ta n o ---------------------------- 6 ,0 5 g Acido a c é t i c o , c . s . p , ------------------------------------------- pH 7 ,2 HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 1000 ml 8 . B u ffe r f o s f a to 0 ,1 M pH 7 ,2 NaHgPO^'HgO------------------------------------------ 15 ,6 g N ajHFO ^------------------------------------------------------------------ 14 ,2 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 1000 ml 9 . A cetona a l 50 % A c e to n a 50 ml HgO t r i d e s t i l a d a 50 ml 10. A cetona a l 70 % A c e to n a 70 ml HgO t r i d e s t i l a d a 30 ml 11. A cetona a l 90 % A c e to n a 90 ml HgO t r i d e s t i l a d a 10 ml 12. G lu ta ra ld e h id o a l 3 % en b u f f e r de M illo n ig G lu ta ra ld e h id o ———————— ———— —— ——————— ——— 3 g B u f f e r de M i l l o n i g , c . s . p . ------------------------------- 100 ml 67 13. B u ffe r de M illo n ig F o s fa to m onosodico a l 2 ,26 % --------------------------- 83 ml KaOH a l 2 ,32 % ——— ———————————— ——————— ————— 17 ml HgO t r i d e s t i l a d a ------------------------------------------------- 10 ml G lu c o s a ---------------------- ------------------------------------------ 0 ,54 g X V III. MEDIDA DE RADIACTIVIDAD La medida de l a r a d ia c t iv id a d de l a s m u es tra s se h iz o p o r re c u e n to de c e n te l l e o l iq u id e ( J .B . B i r k s , 1967; B.W. Fox, 1976), que c o n s is te en a p ro - v ech a r e l c e n te l l e o que p o r em isio n de fo to n e s p roducen l a s d e s in te g r a c io - nes r a d ia c t iv a s b e ta a l c h o ca r c o n tr a c i e r t a s s u s ta n c ia s o rg a n ic a s l i q u i ­ das que a c tu a n como c e n te l l e a d o r a s y d e te c t a r d ich o s fo to n e s con un tubo fo to m u lt ip 1i c a d o r . A. T e c n ic a . ' Se toman 500 p i de m u es tra a l a que p rev iam en te se l e h a an ad id o 10 % de NaOH 1 N, p a ra d is m in u ir e l ap ag am ien to . Se co lo can en un v i a l p a ra re c u e n to . Se in tro d u c e p a ra a b so rb e r l a m u estra un d is c o Whatman GF/C de f i b r a de v id r io de 2 ,5 cm de d iâ m e tro . Se d e ja en l a e s t u f a a 60*C d u ra n te 24 h o ra s p a ra que e l d is c o s e seque b ie n . Se anaden a cada v i a l 2 ,7 ml de m ezcla de c e n te l l e o . Se tap a n con tap ô n de p l a s t i c o y se in tro d u c e n d e n tro de o t r o s v i a l e s que se a d ap tan a l c o n ta d o r . Se p rocédé a l re c u e n to de lo s v i a l e s d espués de d e ja r que s e e n f r î e n en 15*C, m an ten iên d o lo s p rev iam en te en l a * o s c u r id a d p a ra e l im in a r l a f lu o r e s c e n c ia d eb id a a l a s ra d ia c io n e s s o l a r e s . 68 P ara e l re c u e n to s e u t i l i z a un c o n ta d o r de c e n te l l e o l îq u id o I n te r te c h n iq u e modelo SL 4000. B. Dis o lu c io n e s em pleadas . 1. M ezcla de c e n te l l e o PPG ( 2 - 5 - d i f e n i lo x a z o l) ------------------------------------------- 5 ,0 g Dimetil-POPOP ( d i m e t i l - p - b i s - { 2 - 5 - ( f e n i l oxa- z o l i l ) } -b e n c e n o ) ---------------------------------------------------- 0,20 g T o lu èn e , c . s . p . 1000 ml 2. NaOH 1 N NaOH---------------------------------------------------- 4 0 ,0 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 1000 ml XIX. METODOS CITOLOGICOS A. T éc n ic a de f i j a c i on y t in c io n de c u l t i v e s c e l u l a r e s . 1. Se la v a e l f ra s c o de c u l t i v e con so lu c io n GKN. 2. Se anade f i j a d o r de Bouin y s e m an tien e d u ra n te 2 h o ra s a tem­ p e r a tu r a am bian te o to d a l a noche a 4“C. 3. Se la v a dos v eces con e ta n o l de 70? 4 . Se la v a con agua c o r r i e n te . 5 . Se anade h e m a to x ilin a de C a ra c c i d u ra n te 1 m in u te . 6 . Se la v a con agua c o r r i e n te . 7. Se la v a con agua b i d e s t i l a d a y s e m antiene en agua d u ra n te 5 m in u to s . gundos. 69 8 . Se anade e o s in a d e ja n d o la a c tn a r d u ra n te unos 10 segundos, 9 . Se la v a con agua b i d e s t i l a d a . 10. Se d e s h id r a ta con e ta n o l de 96” d u ra n te 1 m inu to , 11. Se d e s h id r a ta con e ta n o l de 99” d u ra n te 1 m inuto , 12. Se d e s h id r a ta con e ta n o l de 99”y x i l o l (1 :1 ) d u ra n te 15 se - 13. Se d e s h id r a ta con x i l o l d u ra n te 1 m in u to . 14. Se d e ja s e c a r a l a i r e . 15. Se monta con b a l s amp de Canada. B. T e c n ic a p a ra re c u e n to de c é lu l a s t o t a l e s . 1. Se toma una m u estra de l a su sp e n s io n c e l u l a r . 2. Se t i n e con c r i s t a l y i o l e t a ( c o lo r a n te de n û c le o s ) . 3 . Se c o lo c a una m u estra en l a çâm ara h e m o c ito m ê trica de Neu- b a u e r . 4 . Se c u e n ta n l a s c ê lu la s de l a s dos c u a d rx c u la s de l a caiqara. t 5 . Se m u l t i p l i c a e l numéro de c é lu la s de l a câm ara por e l f a c ­ to r de l a câm ara, e l f a c to r de d i l u t i o n y e l volumen o r i g in a l de s u s p e n s io n c e l u l a r , con o b je to de con o cer e l numéro de c é lu la s en é s t a . C. T éc n ic a p a ra re c u e n to de y i a b i l id a d c e l u l a r . 1. Se toma u n a :m u e stra de l a su s p e n s io n c e l u l a r . 2 . Se r e a l i z a l a d i l u t i o n n e c e s a r ia p a ra f a c i l i t a r e l r e c u e n to , D icha d i lu t i o n depende de l a c o n c e n tra c io n o r i g in a l de l a su sp e n s io n c e l u l a r y s e h ace a c a lc u le de m anera que s e ob ten g an c o n c e n tr a c io n e s f i n a l e s de 70 100.000 a 800.000 c e lu la s /m l . 3. Se toman 0 ,5 ml de l a d i lu c iô n y s e anade 0 ,1 5 ml de e r i t r o - s in a ( c o lo r a n te de e x lu s iô n v i t a l que t i n e un icam en te l a s c e lu la s ro u e r ta s ) , e sperando unos ocho m in u to s . 4 . Se toman 20 p i de l a su sp en s io n a n t e r io r te n id a y s e c o lo c an en una câm ara h e m o c ito m êtrica de N eubauer, 10 p i en cada campo. Se c u e n ta e l numéro de c ê lu l a s en l a s c âm ara s . 5. E l numéro t o t a l de c é lu la s en l a su sp en s io n o r i g in a l s e c a lc u ­ l a m u lt ip l ic a n d e e l numéro de c é lu l a s c o n ta d as en l a câm ara por lo s f a c to - re s p ro p io s de l a câm ara, po r e l f a c to r de d i lu c iô n y po r e l volumen de l a su sp e n s io n o r i g in a l . D. D is o lu c io n e s , f i j a d o r e s y c o lo ra n te s em pleados. 1. GKN. D e s c r i ta en e l a p a t ta d o I C de " M a te r ia l y M étodos". 2 . F i ja d o r de Bouin D iso lu c iô n s a tu ra d a de âc id o p ic r i c o a l 1 ,4 % en a g u a -------------------------------------------------------------------- 75,0 ml F o rm alin a n e u tra (fo rraa ld eh id o a l 40 % ) -------------- 25 ,0 ml A cido a c e t ic o g l a c i a l ---------------------------------------------- 5 ,0 ml 71 3. H em ato x ilin a de C a ra c c i H e m a to x i l in a ---------------------------- 0 ,5 g lo d a to p o tâ s ic o ----------------------------------- 0 ,1 g Alumbre p o tâ s ic o --------------------------------- 2 5 ,0 g G l ic e r in a b i d e s t i l a d a 100 ml HgO t r i d e s t i l a d a 400 ml 4 . E o sin a E o s i n a --------------------------------------------------- 1 ,0 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . ---------------— — 100 ml 5 . E ta n o l de 70® E t a n o l 70 ml HgO t r i d e s t i l a d a 30 ml 6 . E ta n o l de 96® E t a n o l 96 ml HgO t r i d e s t i l a d a 4 ml 7. E r i t r o s i n a B a l 0 ,4 % E r i t r o s i n a B ----------------,------------------------ 4 ,0 g Solucxon GKN, c . s . p . — — 1000 ml 8. C r i s t a l v i o l e t a a l 0 ,0 5 % C r i s t a l v i o l e t a --------------------------------- 1 ,125 g Acido c î t r i c o — :-------------------------------- 4 ,8 0 g HgO, c . s . p . ---------------------------------------------- 2 5 0 ,0 ml 72 RESULTADOS I . OBTENCION DE MEMBRANA PLASMATICA A. Ensayos p r é v in s . P a ra l a p u e s ta a punto de l a te c n ic a s c han re a l iz a d o a lg u n o s ensayos p re v io s que p e rm it ie ro n c o n tr o la r l a s e ta p a s , m ejorando e l re n d im ien to y l l e g a r con se g u r id a d a l o b je t iv o , que e ra l a o b ten c io n de a n tig e n o s onco- a so c ia d o s y o n c o e s p e c îf ic o s l i b r e s de lo s num erosos a n tig e n o s que com parten l a s c ê lu la s norm ales y c a n c e ro s a s . A . l . H om ogeneizaciôn. Al hom ogeneizar l a s c é lu l a s , e ra n e c e sa r io c o n se g u ir l a ru p tu ra de l a membrana p la s m â tic a s in que se rom piera l a menbrana n u c le a r , p e ro quedando lo s n u c le o s lim p io s de r e s to s de c ito p la sm a a l r e d e d o r . P a ra cono­ c e r l a fu e rz a de hom ogeneizaciôn n e c e s a r ia se r e a l i z e una c in é t i c a de rup ­ tu r a con c é lu la s HeLa, en l a s d i f e r e n te s c o n d ic io n es que se expondrân . Una vez e le g id a s l a s m ajo res c o n d ic io n es p a ra l a s c é lu la s HeLa s e a p lic ô a o - t r o s t ip o s c e lu l a r e s . La c in é t i c a de ru p tu ra p o r hom ogeneizaciôn de la s c é lu la s CAE y CAEL es p râ c tic a m e n te l a misma que l a de l a s c é lu la s HeLa. En c an b io , lo s t e j i d o s se rom pian s ig u ie n d o una c in é t ic a d i f e r e n te . C in é t ic a de ru p tu ra de l a s c é lu la s HeLa. Se han probado dos t ip o s de hom ogeneizadores de P o t t e r y v a r ia s v e lo c id a d e s de g iro d e l m o to r, cuyos r e s u l ta d o s quedan se n a la d o s en l a s t a ­ b la s IV a V II , que c o rre sp o n d e s , re sp e c tiv a m e n te , a l a s f ig u r a s 7 a 10. 73 TABLA IV CURVA DE RUPTURA DE CELULAS HeLa CON- HOMOGENEIZADOR DE POTTER DE VIDRIO-VIDRIO EN TUBO DE FONDO'CONICO, A 2000 rpm TIEMPO SEG CELULAS ENTERAS 0 PARCIALMEOTE ROTAS % NUCLEOS LIMPIOS X NUCLEOS ROTOS % 10 87 13 0 20 71 29 0 30 55 4 4 ,5 0 ,5 40 30 6 7 ,5 2 ,5 50 25 71 4 60 22 73 5 70 11 82 7 80 0 84 8 74 FIGURA 7 CINETICA DE HOMOGENEIZACION DE CELULAS HeLa ICO H n u c le o s lim p io s n u c le o s r o to s -o- 18060 120 tiempo en segundos Ln c i n é t i c a de hom oR cncizacion de c é lu la s HeLa s e r e a l i z e en e s t e c a so i i t i l iz a n d o un h om ogèneizador de P o tt e r de v id r i o - v i d r i o en tubo de fondo c o n ic o , a 2000 rpm. 75 TABLA V CURVA DE RUPTURA DE CELULAS HeLa CON HOMOGENEIZADOR DE POTTER DE VIDRIO-TEFLON EN TUBO DE FONDO CILINDRICO, A 3000 rpm TIEMPO SEG CELULAS ENTERAS 0 PARCIALMENTE ROTAS % NUCLEOS LIMPIOS % NUCLEOS ROTOS % 30 60 40 0 60 39 61 0 90 28 72 0 120 25 75 0 150 20 80 0 180 18 82 0 210 19 81 0 76 • FÎGURA 8 CINETICA DE HOMOGENEIZACION DE CELUl.AS lIcLa 100-1 S ■ I - V ■° 5 0 - 1 o. 24018012060 tiem po e n se g u n d o s En l a hom ogeneizaciôn de l a s m u es tra s que s i r v i e r o n p a ra t r a z a r e s t a cu rv a se empleô un hom ogèneizador de P o t t e r de v i d r io - t e f l ô n en tu b o de fondo c i l î n d r i c o , a 3000 rpm. 77 TABLA VI CURVA DE RUPTURA DE CELULAS HeLa CON HOMOGENEIZADOR DE POTTER DE VIDRIO-TEFLON EN TUBO DE FONDO CILINDRICO, A 3500 rpm . TIEMPO CELULAS ENTERAS 0 NUCLEOS LIMPIOS NUCLEOS ROTOS SEG PARCIALMENTE ROTAS % % % 30 41 59 0 60 28 71 1 90 12 83 5 120 2 90 8 150 0 81 19 78 F I GURA 9 CINRTICA DE UObK3GENEIZA(;iON DE CET.Ul.AS HcLa 100-1 I i n fic lco s l im p io s n u c le o s ro to sb Z ë b CL 18012060 t ie m p o -e n segundos Las c é lu la s fueron hom ogeneizadas en e s te ex p erim en to con un horoogenei- zador de P o t t e r de v i d r io - t e f l o n en tubo de fondo c i l î n d r i c o a 3500 rpm. 79 TABLA V II CURVA DE RUPTURA DE CELULAS HeLa CON HOMOGENEIZADOR DE POTTER DE VIDRIO-TEFLON EN TUBO DE FONDO CILINDRICO, COMBINANDO DOS VELOCIDADES TIEMPO SEG VELOCIDAD rpm CELULAS ENTERAS 0 PARCIALMENTE ROTAS % NUCLEOS LIMPIOS % NUCLEOS ROTOS % 30 3000 60 40 0 60 3000 39 61 0 90 3000 28 72 0 120 3000 25 75 0 150 3000 20 80 0 180 3000 18 82 0 210* 3500 14 86 0 240 3500 9 90 1 80 FIGURA 10 CINETICA DE HOMOGENEIZACION DE CEl.UIAS H el.a 10 0 -, «n oV y c ^ 5 0 - tcV 60 180 240120 tiem po en seg u n d o s E l tra z a d o de e s t a g r â f i c a r é s u l t e de hom ogeneizar l a s c é lu la s en un a p a ra to de P o t t e r de v i d r io - t e f l o n en tubo de fondo c i l î n d r i c o , conibinando 3000 y 3500 rpm. 81 TABLA V I I I CURVA DE RUPTURA DE CELULAS CAEL CON HOMOGENEIZADOR DE POTTER DE VIDRIO-TEFLON EN TUBO DE FONDO CILINDRICO, COMBINANDO DOS VELOCIDADES TIEMPO SEG VELOCIDAD rpm CELULAS ENTERAS 0 PARCIALMENTE ROTAS % NUCLEOS LIMPIOS % NUCLEOS ROTOS % 30 3000 83 37 0 60 3000 40 60 0 90 3000 30 70 0 120 3000 26 74 0 150 3000 21 79 0 180 3000 17 83 0 210 3500 13 87 0 240 3500 10 89 1 250 3500 9 87 4 82 FIGURA II CINFÏICA DE HOMOGENEIZACION DE CELUI.AG CAEL 100-1 n u c le o s e n to ro s n û c le o s ro to s 5 0 - S s â . o 24060 120 180 tiem po en se g undos Curva o b te n id a p o r hom ogeneizaciôn en a p a ra to de P o t t e r de v id r io - t e f l ô n , combinando 3000 y 3500 rpm. 83 TABLA IX CURVA DE RUPTURA DE LAS CELULAS PROCEDENTES DE TEJIDOS NORMALES DE RATON SWISS (HIGADO, BAZO Y UTERO) CON HOMOGENEIZADOR DE POTTER DE VIDRIO-TEFLON. A 3000 rpm TIEMPO SEG CELULAS ENTERAS 0 PARCIALMENTE ROTAS % NUCLEOS LIMPIOS X NUCLEOS ROTOS % 15 69 21 0 30 51 49 0 45 31 69 0 60 22 78 0 75 15 85 0 90 10 89 1 105 9 85 6 84 FIGURA 12 CINRTICA DE HOMOGENEI ZACION DE TEJIDO NORMAL 100-1 in 2 ■ï n û c lc o s e n te r o s n û c le o s ro to s cj X I g S' I â 60 120 ISO tiem po en se g u n d o s E v o lu c io n de l a hom ogcneizaci.ôn de lo s t e j i d o s norm ales u t i l i z a n d o hom ogencizacion con a p a ra to de P o t t e r de v i d r i o - t c f l o n , a 3000 rpm. 85 Se h a c o n tro la d o l a ru p tu ra de l a s c ê lu la s tomando m u es tra s a d i s t i n t o s i n te r v a l o s de tiem p o , t in e n d o ccfn c r i s t a l v i o l e t a y h ac ien d o e l rè c u e n to c e l u l a r en un m ic ro sc o p ic o p t ic o . Las c o n d ic io n e s e le g id a s p a ra p ro s e g u ir e l ex perim en to son la s , o b te n id a s en l a f i g u r a 10, e s d e c i r , horoogeneizacion a 3000 rpm d u ra n te 3 m in u tes y desp u es a 3500 rpm d u ra n te 1 m in u to , pa ran d o cada, 30 segundos pa­ r a d e ja r que s e e n f r i e e l homogenado y e v i t a r l a d e s n a tu r a l iz a c iô n de l a s p r o te in a s de m enbrana. Una vez e le g id a s l a s c o n d ic io n e s de hom ogeneizacicn se r e p i t i o l a c in ê t i c a de r u p tu r a con lo s o t r o s t ip o s c e l u l a r e s . Los r e s u l ta d o s fu e ro n lo s mismos p a ra l a s c ê lu l a s CÂEL ( t a b l a V III y f i g u r a 11) y l a s c ê lu la s CAE. C o n tra r ia m e n te , como m u estran l a t a b l a IX y l a f i g u r a 12, l a c in ê t i c a de ro - t u r a de l a s c ê lu la s p ro c é d a n te s de t e j i d o s , e s muy d i f e r e n t e . La n a tu r a le z a de lo s o rg an o s e x t r a id o s de an im a le s o b l ig a ro n a r e a l i z a r p rim eram en te una h o m ogeneizacion m anual y desp u ês una m ecan ica . Es d i f e r e n te l a c o n s i s te n c ia de lo s d i s t i n t o s t e j i d o s . L as c o n d ic io n e s e le g id a s ,p a r a rom per l a s c ê lu la s de l o s t e j i d o s c o n s i s t i e r o n en d a r 10 e n b o la d as en un horoogeneizador de P o t t e r manual con tu b o y m ajador de v i d r i o , s e g u id a s de hom ogeneizacion m ecanica en un a p a ra ­ to de P o t t e r con tubo de v id r io y m ajador de t e f lo n g iran d o a 3000 rpm du­ r a n te 90 se g u n d o s , p a ran d o cada 30 segundos p a ra que no se c a l i e n t e y d e s - n a tu r a l i c e e l homogenado. A.2 . E s tu d io d e l g ra d ie n te de s a c a f o s a . •E s te e s tu d io se r e a l i z e p a ra s a b e r ex ac tam en te en quê f r a c c io n e s 86 se e n cu e n tra n l a s membranas p a ra r e c o g e r la s s in p é rd id a s . En p rim er lu g a r s e p ré p a re e l g ra d ie n te d is c o n tin u e de s a c a ro s a 48-37 % (p /v ) cerne se in d ic a en e l a p a r ta d o de " M a te r ia l y M étodos", I V .17 a IV .19, quedando corne se ve en l a f e to g r a f î a de l a f i g u r a 13. T ras c e n t r i ­ fu g e r a 62 .000 X d u ra n te 20 m in u te s , como se in d ic a en e l pun to IV .20, se s é p a ra e l m a te r ia l en bandas come se ve en l a f ig u r a 14. P a ra a n a l i z a r l a s b a n d a s , se f r a c c io n a e l g r a d ie n te en a l î c u o ta s de 1 m l, m ed ian te un s i f o n c o lo cad e a 8 mm d e l fondo d e l tu b o , co nec tado p e r e l o t r o ex trem e a un c o le c to r de f ra c c io n e s a l que l le g a n l a s m u estra s d espues de p a sa r p o r una bomba p e r i s t a l t i c a y un a b so rc iô m e tro UV que r e g i s ­ t r e l a s bandas a una le n g i tu d de onda de 257 nm. En l a f ig u r a 15 se ha e s - q u em atizad e e l m ontaje p a ra e l f ra c c io n a m ie n to en g ra d ie n te y en l a s f ig u ­ ra s 16 y 17 se m uestran lo s r e s u l ta d o s o b ten id o s.- Tambiên se m idio en cada f r a c c io n e l in d ic e de r e f r a c c iô n , e l p e r ­ c en tag e de s a c a ro s a (p e so /p e so y peso /vo lum en) y l a c o n c e n tra c iô n de p r o t e i - n a s . Los r e s u l ta d o s se r e g i s t f a n en l a s ta b la s X a X II I . Los v a lo re s d e l in d ic e de r e f r a c c iô n p a ra lo s t e j i d o s norm ales es a lg o v a r ia b le , d eb ide a l a g ran c o n c e n tra c io n de m a te r i a l . Asimismo s e en - m ascara e l v e rd ad e ro v a lo r de c o n c e n tra c io n de s a c a ro s a . Se h iz o un b a r r id o a lo l a r g o d e l e s p e c tro v i s i b l e y u l t r a v i o l e t s de cada una de l a s b an d as , e n t r e l a s lo n g itu d e s de onda de 700 a 200 nm ( f ig u r a s 18 y 1 9 ). 87 FIGURA 13 ri’: i:r;.i A specto d e l tubo p rep arad o con e l homogenado a n te s de p ro c é d e r a l a c e n t r i f u g a c io n en g ra d ie n te de s a c a ro s a . FIGURA 14 R e su lta d o de t r è s experim e.ntos de f ra c c io n a m ie n to en g ra d ie n te d is c o n tin u e de s a c a ro s a 48-37 % ( p /v ) . Se puede com- p ro b a r que e l p ro c ed im ie n to dà r e s u l ta d o s r e p ro d u c ib le s . 89 O UJ > O o CQ UJ U) G 90 ( d / d ) DS OJ DDDS a p a f o ^ u a D J O d oo o ID o E inO'o uju 09Z D DDiîdp pDpisuag 91 (d/d) DsoJDDds ap afo^uaDJOd oo oin "CO o .o o in lUU 082 D DDIjdo pDplSUaQ in 92 FIGURA 17 PERFIL DEL FRACCIONAMIENTO DE MEMBRANAS DE CELULAS NORMALES EN UN GRADIENTE DISCONTINUO DE DENSIDAD EN SACAROSA 48-37 % (p /v ) La n a tu r a le z a de l a s bandas e s l a in d ic a d a en l a t a b la X III . 9 3 TABLA X DE 1.AS FRACCIONES OBTENIDAS DEL GRADIENTE DE MATERIAL DE CELULAS CAEL DE FRACCION INDICE DE REFRACCION SACAROSA % DENSIDAD g/cm^ a 20"C(V = 1 ml) a 20" C P/P p /v 1 1,4017 41 48 1,1817 5 1,4006 4 0 ,5 4 7 ,5 1,1791 10 1,3958 38,5 • 45 1,1688 15 1,3930 36,5 4 1 ,5 1,1588 20 1,3920 36 41 1,1563 25 1,3915 35 ,7 4 0 ,7 1,1548 30 1,3905 3 4 ,3 39 1,1478 34 1,3865 33 37 1,1414 94 TABLA XI INDICE DE REFRACCION, CONCENTRACION DE SACAROSA Y DENSIDAD DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS DEL GRADIENTE DE MATERIAL DE TEJIDOS NORMALES N” DE FRACCION INDICE DE REFRACCION SACAROSA % DENSIDAD g/cm^ a 20"C(V = 1 ml) a 20" C p /p p /v I 1,4045 4 2 ,5 50 1,1896 5 1,4031 4 1 ,7 49 1,1854 10 1,4006 40 ,5 4 7 ,5 1,1791 15 1,39 75 38,9 4 6 ,5 1,1704 20 1,39 6 8 38 ,5 4 4 ,7 1,1688 25 1,3915 35 ,7 4 0 ,5 1,1548 30 1,3905 3 5 ,3 40 1,1528 34 1,3865 ' 33 37 1,1262 95 TABLA X II BANDAS OBTENIDAS DEL HANCOHUNADO DE FRACCIONES DEL GRADIENTE DE SACAROSA DE MATERIAL DE CELULAS CAEL N" DE BANDA FRACCION CELULAR PROTEINAS % INDICE DE REFRACCION SACAROSA % p /p \ FRACCIuNES DEL GRADIENTE (* ) I MITOCONÜRIAS 58 1,4030 4 1 ,7 PELLA 2 MICROSOMAS 24 1,4012 4 0 ,8 1-14 3 MEMBRANAS n 1,3930 36 ,5 15-23 4 LIPOPRGTEINAS 7 1,3875 33 ,5 24-33 5 LIPIDOS 0 1,3865 33 34 (* ) CADA FRACCION CORRESPONDE A 1 ml 96 TABLA X I I I BANDAS OBTENIDAS DEL KANCOMUNADO DE FRACCIONES DEL GRADIENTE DE SACAROSA DE MATERIAL DE CELULAS NORMALES N“ DE BANDA FRACCION CELULAR PROTEINAS % INDICE DE REFRACCION SACAROSA % p /p FRACCxONES DEL GRADIEOTE (*) 1 MITOCONÜRIAS 45 1,4056 43 PELLA 2 MICROSOMAS 29 1,4017 41 1-14 3 MEMBRANAS 15 1,3940 37 15-26 4 LIPOPROTEINAS 11 1,3915 35.5 27-33 5 LIPIDOS 0 1,3865 33 34 (* ) CADA FRACCION CORRESPONDE A 1 ml 9 7 2 ,0 i ihi to co n d rif ls m icrosom as membranas l ip o p r o te în a s l îp id o s lo HQ . 500300 Longitud de onda (A) en nm FIGURA 18 CURVAS OBTENIDAS DEL BARRIDO ESPECTROFOTOMETRICO DE LAS BANDAS RECOGIDAS DEL GRADIENTE DE DENSIDAD EN SACAROSA DE LAS CELULAS CAEL 98 m ito c o n d ria s membranas l îp id o s d U -O U d I wc O 30 t o 50 60 Numéro de froccidn E l p e r f i l de e lu c id n de l a s p r o te în a s de su e ro de con ejo de e s t a cu rv a co rre sp o n d e a l p rim er paso po r una columna de SepLadex 0-150 s u p e r f in e . Se a p lic o una m u estra de 3 ml p re - v iam cnte c o n c e n tra d a has t a 1 ml en una columna con unas d i - ■ en s io n es de 2 ,6 x 40 cm. Las p ro te în a s fu e ro n e lu îd a s con b u f f e r f o s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M a pfl 6 ,9 . 139 FIGURA 33 PERFIL DR ELUCION DE PROTEINAS POR RECICLO CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN’SEPIIADEX G -150 SUPERFINO 2,0 - g CM 1,0 XJ XJ 60 Numéro de froccidn E l p e r f i l de e lu c io n de l a s p r o te în a s de su e ro de conejo de e s t a cu rva co rresp o n d e segundo paso po r una columna de Sephadex G-150 s u p e r f in o . Se a p lic o con» m u es tra lo s p ico s 1 y 2 d e l p rim e r p a so , c o n ce n tra d o s has ta un volumen de 1 ml en uns columna con unas d im ensiones dé 2 ,6 x 40 cm. Las p ro te în a s fu e ­ ron e lu îd a s con b u f f e r fo s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M pH 6 ,9 . 140 FIGURA 34 PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS POR RECICLO CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN'SEFHADEX G -150 SUPERFINO 2 .0-1 Ec 8 CM ri 3 1.0 - 1 6030 40 50 Nümerp de fraccion E l p e r f i l de e lu c io n de l a s p ro te în a s de su e ro de co n e jo o b te n id o d espués d e l t e r c e r p aso p o r una columna de Sephadex G-150 s u p e r f in o . Se a p lic o como m u es tra lo s p ic o s 1 y 2 d e l segundo p a so , c o n ce n tra d o s h a s t a un volumen de 1 m l, en una columna de 2 ,6 x 40 cm. Las p r o te în a s fueron e lu îd a s con b u f f e r f o s f a to 0 ,0 ^ M en ClNa 0 ,1 M pH. 6 ,9 . 141 FIGURA 35 PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS POR RECICLO CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN SEPHADEX G -150 SUPERFINO 2,0 - E c S rsi d O u ÛL 'O 10- XJ d ;d tnc 143 FIGURA 37 PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS POR RECICLO CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN SEPHADEX G -150 SUPERFINO 2 .0-1 I . S i..: I - g •g - 20 40 60 80 100 120 Numéro de fracciôn P e r f i l de e lu c io n de p r o te în a s de su e ro de conejo o b ten id o después d e l p r im e r paso p o r una columna de Sephadex G-150 s u p e r f in o . Se a p l ic o como m u es tra 9 ml de su e ro de co­ n e jo c o n ce n tra d o s h a s ta 3 ml en una columna de 2 ,6 x 40 cm. Las p r o te în a s fu e ro n e lu îd a s con b u f f e r f o s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M pH 6 ,9 . La l e c t u r a de a b s o rc ié n se h iz o d ilu y en d o l a s f ra c c io n e s 1/10 con e l b u f f e r de e lu c io n . 144 lo s c u a le s in d lc a n que l a columna K 26/40 es dem asiado pequena p a r a p o d er r e s o lv e r lo s p ic o s d e l volumen de su e ro an o d id o , aunque se haga un segundo p aso , como s e n a la l a f ig u r a 38 ap a re c ie n d o so la p ad o s lo s p ic o s 1, 2 y 3. P ru eb a 4 (p aso u n ico de 3 ml de su e ro en columna K 2 6 /1 0 0 ): p a ra e s t e ensayo se u t i l i z o una colum na K 26 /1 0 0 , d e l mismo d iam ptro que l a an­ t e r i o r p e ro de 100 cm de a l t u r a , con un volumen de le c h o de 480 ml. Se in ­ tro d u je ro n tam bién 3 ml de su e ro y con un so lo paso s e obtuvo una r e s b lu - c io n t o t a l , como se r e f l e j a en l a f ig u r a 39. Prueba 5 ( r e c i c l o d is c o n tin u o de 9 ml de su e ro en colum na K 2 6 / 100): se u t i l i z o l a colum na K 2 6 /1 0 0 , in tro d u c ie n d o en e l l a 9 ml de s u e ro . La g r a f ic a d e l p rim er p a so , f i g u r a 4 0 , nos m u es tra l a a p a r ic io n de t r è s p ic o s , e l 1 y e l 2 so la p a d o s y e l te r c e r o a p a r te . Se toman lo s p ic o s 1 y 2 c o n ju n tam en tey s e pasan nuevam ente p o r l a colum na, a p a re c ie n d o mucho menos su p e rp u e s to s lo s p ic o s 1 y 2 q u e , adem as, t ie n e n muy poca c o n tam in ac io n d e l m a te r ia l d e l p ic o 3 , que s e a d e n tr a lig e ra m e n te en l a c o la d e l p ic o 2 ( f i ­ g u ra 4 1 ) . El mancomunado de l o s p ic jjs 1 y 2 se v o lv iô a p a s a r p o r l a colum ­ na o b ten ié n d o se l a g r a f i c a de l a f ig u r a 42 , en l a que lo s p ic o s 1 y 2 q u e , como se verd", e s tâ n com puestos p o r in m u n o g lo b u lin a s , quedan se p a ra d o s t o - ta lm e n te d e l p ic o 3, com puesto p o r a lb u m in as , segun se coroprobô u l te r io rm e n - t e . B. R e su lta d o s . En n ingun caso s e c o n s ig u ie ro n r e s o lv e r to ta lm e n te lo s p ic o s 1 y 2 , aunque quedaron razo n ab lem en te se p a ra d o s en l a p ru e b a 4 , que c o rre sp o n d en 145 •FIGURA 38 PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS POR RECICLO CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN SEPHADEX G -150 SUPERFINO 2.0 -, I S •4 .3 I I ICO 120 Ndmero dé fraction P e r f i l de e lu c io n de p r o te în a s de su e ro de c o n e jo o b ten id o d esp u és d e l segundo paso p o r una columna de Sephadex G-150 su ­ p e r f in o . Se a p lic o como m u es tra lo s p ic o s 1 y 2 d e l p rim e r paso c o n ce n tra d o h a s ta 3 m l, en una columna de 2 ,6 x 40 cm. Las p ro ­ te în a s fu e ro n e lu îd a s con b u f f e r f o s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M pH 6 ,9 . La l e c t u r a de a b so rc iô n se h iz o d ilu y e n d o l a m uestra s e h iz o d ilu y en d o l a m u es tra l / lO con e l b u f f e r de e lu c io n . 146 FIGURA 39 PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS POR RECICT.O CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN SEPHADEX G -150 SUPERFINO 2.0-, .ÿ 1.0- •o 50 9070 110 130 150 Nücnero de fraction P e r f i l de e lu c io n de p r o te în a s de su e ro de co n e jo o b te n id o después d e l p rim er p aso p o r una colum na de Sephadex G-150 su p e r­ f in o . Se a p l i c o como m u es tra 3 ml de su e ro de c o n e jo co n ce n tra d o a 1 m l, en una columna de 2 ,6 x 100 cm. Las p r o te în a s fu e ro n e l u î ­ das con b u f f e r f o s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M pH 6 ,9 . 147 ■FIGURA 40 PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS POR RECICLO CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN SEPHADEX G -150 SUPERFINO 2 .0 -, Ec o 00 m 3 .1 5 M C VXJ 90 150110 13050 70 Nilmero de fraccidn P e r f i l d e l e lu c io n de p r o te în a s de su e ro de co n ejo o b ten id o d espués d e l p r im e r paso p o r una columna de Sephadex G-150 su p e r­ f in o . Se a p l ic o como m u es tra 9 ml de su e ro de co n ejo co n cen trad o a 3 m l, en una columna de 2 ,6 x 100 cm. Las p r o te în a s fu e ro n e l u î ­ das con b u f f e r f o s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M pH 6 ,9 . La l e c tu r a de a b so rc io n se h iz o d ilu y e n d o l a s f ra c c io n e s 1/10 con e l b u f f e r de e lu c io n . 148 FIGURA 41 PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS POR RECICLO CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN SEPHADEX G -150 SUPERFINO 2.0 n Ec 8 « y 1 0 - •o tt X ) M I 15050 70 110 13090 Ntiinero de fraccidn P e r f i l de e lu c io n de p r o te în a s de su e ro de co n ejo o b ten id o d esp u és d e l segundo p aso p o r una colum na de Sephadex G-150 s u p e r f in o . Se a p l ic o como m u estra lo s p ic o s 1 y 2 d e l p rim e r p aso co n cen trad o h a s ta un volumen de 3 m l, en una colum na con unas d im ensiones de 2 ,6 X 100 cm. Las p r o te în a s fu e ro n e lu îd a s con b u f f e r f o s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M pH 6 ,9 . La l e c t u r a de a b so rc io n se r e a l i z ô h a c ien d o d i lu - c iô n 1/10 de l a s f r a c c io n e s con e l b u f f e r de e lu c io n . 149 FIGURA 42 PERFIL DE ELUCION DE PROTEINAS POR RECICLO CROMATOGRAFICO ASCENDENTE EN SEPHADEX G -150 SUPERFINO 2.0 -1 i s n .3 1.0 - IT» 90 110 Nümero de fraccidn 130 150 P e r f i l de e lu c io n de p r o te în a s de su e ro de co n ejo o b te n id a s d e s - piiës d e l t e r c e r paso p o r una columna de Sephadex G-150 s u p e r f in o . Se a p l ic o como m u es tra lo s p ic o s 1 y 2 d e l segundo paso co n cen trad o h a s ­ t a un volumen de 3 m l, en una columna con unas d im ensiones de. 2 ,6 x 100 cm. Las p r o te în a s fu e ro n e lu îd a s con b u f f e r f o s f a to 0 ,0 5 M en ClNa 0 ,1 M pH 6 ,9 . La l e c t u r a de a b so rc io n se h iz o d ilu y e n d o l a s f r a c c io n e s 1/10 con e l b u f f e r de e lu c io n . 150 a in m u n o g lo b u lin as M y G re sp e c t iv a m e n te . P a ra re co n o c e r l a n a tu r a le z a de lo s p ic o s y l a e x i s t e n c i a o no de co n ta m in a c io n , s e p ro c ed io a r e a l i z a r una in m u n o e le c tro fo re s is de lo s mismos. E sto p e rm it io d e d u c ir que e l p ic o 1 son IgM, e l p ic o 2 IgG y e l p i ­ co 3 a lb u m in as . P a ra c a l c u l a r l a p u re z a de l a s gam m aglobulinas o b te n id a s u t i l i - zamos tam bién e l I n d ic e c a r a c t e r î s t i c o que se o b tie n e d iv id ie n d o l a d e n s i - dad o p t ic a de l a s f ra c c io n e s o b te n id a a 278 nm y a 251 nm, que p a ra l a s gam m aglobulinas humanas e s d e l o rden de 2 ,8 y p a ra l a s de c o n e jo 2 ,7 -2 ,6 . En e l caso de l a s in m u n o g lo b u lin as an tim eirbrana s e probo s i con l a p u r i f ic a c iô n s e p ro d u c ia p ê rd id a de l a a c t iv id a d b io lô g ic a , v iên d o se que no s e p ie rd e l a a c t iv id a d c i t o t ô x ic a s i se anade 'Complemento a l a s inmunt»- g lo b u lin a s cuando se ponen en p re s e n c ia de l a s c é lu l a s . La c o n c e n tra c iô n d è l su e ro o de l a s f r a c c io n e s mancomunadas en lo s d i s t i n t o s p aso s supone una p é rd id a de m a te r ia l d e l o rden d e l 2 a l 4 %. Cada paso p o r l a columna supone una p é rd id a d e l o rden d e l 10 % de l a s p ro ­ t e în a s c a rg a d as cada v ez . V. OBTENCION DE ANTIGENOS POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD A. P ruebas p r e v ia s . A . l . E s tu d io de l a d e s n a tu r a l i z a c iô n d e l l ig a n d o . Oebido a que l a t é c n ic a de l a c ro m a to g ra f îa de a f in id a d a p lic a d a a l a s e p a ra c iô n de a n tîg e n o s e s p e c î f ic o s im p lic a e l cambio de pH n e u tro (7 ,0 ) a pH â c id o ( 2 ,8 ) , es n e c e s a r io s a b e r s i l a s in m u n o g lo b u lin a s que a c - 151 tuan como lig a n d o f i j a d a s a l a S ep h aro sa se d e sn a tu ra li .z a n con v a r io s cam- b io s de pH in u t i l iz a n d o l a columna p a ra e x tr a c c io n e s s u c e s iv a s . Al e f e c to se in cu b a ro n in m unog lobu linas a n ti - p e r o x id a s a s a pH ac id o d u ra n te 10 m in u te s , se n e u t r a l i z a r o n y se r e p i t i ô c l p ro ceso v a r ia s veces p a ra com probar s i , en caso de u t i l i z a r s e como lig a n d o , l a columna e ra r e u t i l i z a b l e . . Después de cada cambio de pH se tomo una m uestra y se h iz o una in m u n o d ifu siô n , obse rv ân d o se que d espués de 4 cantbios de pH e l tx tu lo d e l a n tis u e ro h a b ia pasado de 1/16 a 1 /8 , in d ic io de c i e r to g rade de d esn a- t u r a l i z a c io n . E l mismo ex p erim en to se r e a l i z o i n v i r t i e n d o e l s is te m a y c o n s id e - rando à l a s p e ro x id a sa s como su p u e s to l ig a n d o . En e s t e caso se v io que no h a b ia d e s n a tu r a l i z a c iô n , a l menos en cu an to a su a n tig e n ic id a d se r e f i e r e . A .2. F i ja c iô n de p r o te în a s a Sepharosa 4B a c t iv a d a con CNBr. Se o f e r ta r o n p a ra su co n ju g a c iô n a l g e l d i s t i n t a s c a n tid a d e s de in m unog lobu linas p a ra c a l c u l a r l o s r e q u i s i t o s p a ra l a f i j a c i ô n d e l l ig a n d o . Los r e s u l ta d o s s e rouestran en l a t a b l a XXH y l a f ig u r a 43 p a ra una columna de 5 ml de S ep h aro sa 4B (CNBr). En fu n c iô n de l a misma, p a ra lo s experim en- to s p o s te r io r e s s e e l i g i ô o f e r t a r 30 mg, con lo que se o b tie n e una buena f i ­ j a c iô n . Una o f e r t a e x c e s iv a de s u s ta n c ia puede a c a r r e a r p roblèm es p o r impe- dim ento e s t ê r i c o . B. E xpérim entes c o n t r o l . B . l . S is te m a .p e ro x id a s a s /a n t ic u e rp o s a n t ip e r o x id a s a s . P a ra l a p u e s ta a p un to de l a c ro m a to g ra f îa de a f in id a d se empleô e l s is te m a p e ro x id a s a s - a n t ip e r o x id a s a s . E ste s is te m a e s f â c i l de a n a l i z a r con o b je to de c a lc u la r rend im ien- 152 to s y form as de e lu s io n . P e rm its u t i l i z e r en l a in rau n izac iô n de lo s c o n e jo s una p r o te în a p u ra , f â c i l de d e te c t a r p o r in m u n o d ifu siô n e in c lu s o por a n â l i - s i s e n z im â tic o s . TABLA XXII FIJACION DE PROTEINAS A SEPHAROSA 4B ACTIVADA CON CNBr VOLUMEN DE SEPHAROSA 4B (CNBr) ml PROTEINA AHADIDA mg PROTEINA FIJADA mg EFICACIA % DE PROTEINA FIJADA 5 5 4 ,5 95 5 15 14 93 5 30 27 90 5 60 48 80 Las p ru eb as en c o n ju n to se pgrupan en dos m o d è le s , segun e l l i ­ gando u t i l i z a d o : Modelo I : S e p h a ro sa -p e ro x id a s a s , que u t i l i z e e l a n tîg e n o como l i ­ gando. Se con jugan p e ro x id a sa s a S ep h aro sa y d espués s e h ace p a s a r a n t i ­ su e ro a n t i - p e r o x id a s a s de co n ejo o in m u n o g lo b u lin as p re v ia m e n te p u r i f ic a d a s . Modelo I I : S cp h a ro sa -in m u n o g lo b u lin as a n t i - p e r o x id a s a s , que em- p le a e l a n tic u e rp o como l ig a n d o . 153 FIGURA 43 FIJACION DE PROTEINAS A SEPHAROSA 4B (CNBr) 50-1 3 0 - X} 20- 10- 20 .3 0 40 Proteîna anadida en mg R e la c io n e n t r e l a s p r o te în a s a n ad id as a 5 ml de Sepharosa 4B (CNBr) y l a s p r o te în a s f i j a d a s como lig a n d o . 154 Se co n jugan l a s in m u n o g lo b u lin a s y se o f e r ta n l a s p e ro x id a sa s s o ­ l a s o m ezcladas con o t r a s p r o te în a s p a ra y e r l a e s p e c i f ic id a d de l a r e a c c io n . a) C on jugaciôn de p r o te în a s a S ep h a ro sa 4B (CNBr). La c o n ju g a c iô n de p r o te în a s a S e p h a ro sa , sean p e ro x id a sa s o in m u n o g lo b u lin a s , se r e a l i z a por e l p ro c e d im ie n to h a b i tu a i ya d e s ç r i t o . H a sta su u t i l i z a c i ô n , l a s colum nas se guardan a \10 ° C en a z i - da sô d ic a 0 ,1 %. b ) O f e r ta d e l a n tîg e n o o a n t ic u e r p o . En to d o s lo s caso s se r e a l i z a l a o f e r t a en r e c i c l o con l a ayuda de una bomba p é r i s t â l t i c a p a ra m an tener e l f l u jo c o n s ta n te . E l lav a d o de l a columna s e r e a l i z a con b u f f e r NaCl 0 ,1 4 M y T r is 20 mM, pH 7 ,4 y l a e lu s iô n con b u f f e r g l i c i n a 0 ,2 M pH 2 ,8 . c) A is la m ie n to de in m u n o g lo b u lin as en e l modelo I . c . l ) U t i l iz a n d o una c o n c e n tra c iô n de p e ro x id a sa s de 0 ,4 mg/inl de g e l . C on jugaciôn de p e ro x id a sa s a S ep h aro sa 4B (CNBr). 1. Se pesan 3 ,0 g-de S epharosa 4B (CNBr), que p ro p o rc io n a n un volumen de g e l de 10 m l. 2 . Se o f e r t a n 5*0 mg de p e ro x id a sa s (2 ,5 m g/m l). E l a n â l i s i s d e l p ro d u c to no f i j a d o in d ic a que s e f i j a n 4 ,3 mg, é q u iv a le n te a un ren d im ien - •,to* de 86 %. 3 . E l com plejo g e -l- lig an d o s e r e p a r te en dos colum nas ig u a le s de 5 mi de S ep h aro sa 4B (CNBr) con 2^15 mg de p e ro x id a s a s . O fe r ta de p r o t e în a s . 1. A una de l a s dos colum nas se l e o f e r t a un su e ro c o n t r o l . 155 to n d ic io n e s en l a s c u a le s no ha de h a b e r f i j a c i ô n e s p e c î£ ic a . 2 . La o t r a columna r e c ib e l a o f e r t a de un inm unosuero a n t i - p e ro x id a s a s , que d eb erâ p ro d u c ir una co n ju g ac iô n e s p e c i f ic a con l a s inmuno­ g lo b u lin a s e s p e c i f i c a s . 3 . Se o f e r ta n 0 ,1 , 0 ,5 , 1 ,0 y 5 ,0 ml de s u e ro , ta n to c o n tr o l como e s p e c î f i c o , en un volumen f i n a l de 10 m l, h a c ien d o l a d i lu c iô n en b u f ­ f e r NaCl 0 ,1 4 M T r is 20 mM pH 7 ,4 . 4 . Se lav a n con b u f f e r NaCl pH 7*4. 5 . Se e lu y e n con b u f f e r g l i c i n a pH 2 ,8 . 6 . Una vez r e a l iz a d a s l a s 4 o f e r t a s y l a e lu s iô n a c id a con . g l i c in a en cada colum na, s e lav an con b u f f e r _ g lic in a a l que se l e ha a n a d i- do 10 % de d io x an , con l o que se o b tie n e n l a s p r o te în a s que h a b îa n quâdado u n idas fu e rte m e n te . 7. Despues s e o f e r t a a cada una de l a s colum nas 1 ml de a n t i ­ su e ro e s p e c î f i c o , e luyendo su cesiv am en te con g l i c i n a y g l i c in a - d io x a n , c a l - cu lando e l p o r c e n ta je de p r o te în a s que s e e lu y e n con una s o la o f e r t a de d io ­ xan . A e f e c to s dé r e u t i l i z a c i ô n de l a colum na, co n v ien s comprobar que l a colu im a no s e ha d e s n a tu ra l iz a d o porque f i j a l a s c a n tid a d e s c a lc u la - das de l ig a n d o . Los r e s u l ta d o s o b ten id o s e s ta n resum idos en l a s t a b la s XXIII a XXV. En l a f ig u r a 44 se recogen g râ fic a m e n te lo s r e s u l ta d o s de l a t a b l a XXIV. La t a b l a XXV-A y l a f ig u r a 44a hacen r e f e r e n c i a a l a s c a r a c t e r î s t i c a s compara- das de l a s in m u n og lobu linas e lu id a s con g l i c i n a s o l a y con g l ic in a - d io x a n . 156 TABLA-X X III COLUMNA DE SEPHAROSA 4B (CNBr)-PEROXIDASAS OFERTA DE SUERO CONTROL VOLUMEN DE 1SUERO CANTIDAD DE PROTEINAS CANTIDAD DE PROTEINAS1 FIJACION OFERTADAS ELUIDAS EN % ml mg pg 0 ,1 6 ,8 ■ 38 0 ,5 0 ,5 34 41 0 ,1 2 1,0 68 65 0 ,096 5 ,0 340 330 0 ,0 9 7 TABLA XXIV COLUMNA DE SEPHAROSA 4B (CNBr)- PEROXIDASAS OFEkTA DÉ ANTISUERO ESPECIFICO VOLUMEN DE CANTIDAD DE CANTIDAD CANTIDAD FIJACION EN % SUERO PROTEINAS teOrica de REAL DE mg OFERTADAS mg PROTEINAS ELIDIBLES (* ) Jig PROTEINAS ELUIDAS Pg REAL/TEORI- CO . REAL/OFER- TADO 0 ,1 6 ,7 134 54 40 0 ,8 0 ,5 33,5 670 209 31 0 ,6 2 1,0 67 1340 372 28 0 ,5 6 5 ,0 335 6700 2760 41 0 ,8 2 1,0 67 1340 690 51 1,02 1,0 67 1340 700 52 1,04 (*) V alo r t e ô r ic o maximo c a lc u la d o a p a r t i r d e l p u n to de e q u iV a le n c ia , que co rre sp o n d e a l 2 % de l a s p r o te în a s d e l su e ro y a l 20 % de l a s gamma­ g lo b u lin a s . 157 FIGURA 44 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD ENTRE PEROXIDASAS Y ANTISUERO ANTI-PEROXIDASAS 2.0 - § CM 5 - 10- X) Numéro de fracciôn A is la m ie n to de a n tic u e rp o s usando como lig a n d o a n tîg e n o s f i ja d o s a Sepharosa 4B (CNBr). Se u t i l i z o una columna de 5 ml de g e l en l a que se h a b îa n con jugado 2 mg de p e ro x id a sa s y se o f e r t a r o n d i s t i n t o s v o lu ­ menes de inm unosuero a n ti - p e r o x id a s a s . La f lé c h a in d ic a e l punto en que se em pieza a a n a d ir e l b u f f e r â c id o . ’ ___________ o f e r t a de 0 ,1 ml de a n ti s u e r o ............................ o f e r t a de 0 ,5 ml de a n tis u e ro — — - — ---- o f e r t a de 1,0 ml dé a n t i s u e r o ------------------------- o f e r t a de 5 , 0 ml de a n t i s u e r o 158 Con o b je to de com probar l a e x i s te n c i a de inm uno p ero x id asas en e l m a te r ia l e lu id o , l a s p r o te în a s o b te n id a s de 5 ,0 ml de volumen de su e ro ( t a ­ b la XXIV) se c o n c e n tra ro n h a s t a 1 ,0 mg/ml y se so m e tie ro n a una inm unodifu- s io n , comprobando que l a a c t iv id a d de a n tic u e rp o s a n tip e ro x id a s a s e r a s e i s v eces mayor. TABLA XXV RENDIMIENTO DE LA ELISION CON GLICINA + 10 % DE DIOXAN PROTEINAS TOTALES ELUIDAS vg PROTEINAS ELUIDAS POR EL DIOXAN Ug PORCENTAJE DE PROTEINAS ELUIDAS POR EL DIOXAN 3395 936 27 983 293 30 960 260 27 C.2) U ti l iz a n d o una c o n c e n tra c iô n de p e ro x id a sa s de 2 mg/ml de g e l . C on ju g ac iô n de p e ro x id a sa s a S ep h aro sa 4B (CNBr). P a ra un volumen de lec h o de S ml s e co n ju g an 10 mg de p e ro x id a sa en una c o n c e n tra c iô n de 5 mg/ml con un re n d im ie n to de co n ju g ac iô n de 94 %. . O f e r ta de p r o t e în a s . Se o f e r t a n 0 ,1 , 0 ,5 , 1 y 5 ml de a n t i s u e r o a n t ip e ro x i - TA|1LA Juffer y se e liiÿ en lo s an - t îg e n o s (p e ro x id a sa s ) con g l ic in a -H C l 0 ,2 M pH 2 ,8 y a c o n tin u a c io n con g l i - c in a -IlC l 0 ,2 M + 10 % de d io x ân . Los r e s u l ta d o s o b te n id o s se resumen en l a s f ig u r a s 46 a 4 8 , que co rre sp o n d en a lo s ex p erim e n to s r e a l iz a d o s u t i l i z a n d o c o n c e n tra c io - n es de 3 , 6 y 12 mg de Ig /m l de g e l , a s î como en l a s t a b la s XXVII y XXVIII. d .2 ) V a ria c io n d e l volumen de lec h o p a ra l a c o n c e n tra ­ c io n menor de in m u n o g lo b u lin as ' (3 mg de Ig /m l de g e l ) . C on jugacion de inm unoperoxidasas a Sepharosa 4B (CNBr). Se con jugan 105 mg de in m u nog lobu linas a 35 ml de Sepha­ ro sa y se r e p a r te n en t r è s colum nas de 5 , 10 y 20 ml re sp e c tiv a ro e n te . O fe r ta de p r o te în a s . Se r e a l i z a ex ac tam en te ig u a l que en e l a p a r ta d o d . l . Los lav a d o s y l a s e lu s io n e s tam bien se l le v a n a cabo de l a misma m anera. Los r e s u l ta d o s o b te n id o s se resumen en l a s f ig u r a s 46 a 50 163 y en l a s t a b la s XXIX y XXX. La e s p e c i f ic id a d de l a re a c c io n se compiobo e sp e c tro fo to m é tr ic a m e n te ( f ig u r a s 50a y 50 b ), TABLA XXVII VARIACION DE LA CONCENTRACION DE Ig OFERTA CONCENTRACION Ig /m l SEPHAROSA CANTIDAD TEORICA CANTIDAD ELUIDA MAXIMA PB Pg R % P + S 3 225 58 25 F + S 6 450 78 17 P + S 12 900 101 11 P 3 225 31 14 P 6 450 34 8 P 12 900 74 8 P: PEROXIDASAS, 1 mg S: SUERO SANGUINEO, 0 ,1 ml (PROTEINAS INESPECIFICAS) TABLA XXVIII RENDIMIENTO DE LA ELISION CON GLICINA + 10 % DE DIOXAN CONCENTRACION PROTEINAS ELUIDAS PROTEINAS TOTALES mg lg /m l GEL POR EL DIOXAN ELUIDAS (* ) Pg Pg FORCENTAJE DE PROTEINAS ELUIDAS POR EL DIOXAN 3 39 128 30 6 80 192 31 12 41 343 49 (*) VOLUMEN DEL LÊCHO: 5 ml 164 TABLA XXIX VARIACION DEL VOLUMEN DE LECHO VOLUMEN DEL LECHO ml OFERTA CANTIDAD TEORICA DE PROTEINAS ELUIBLES Pg CANTIDAD REAL DE PROTEINAS ELUIDAS Pg FIJACION EN % REAL/TEORICO FIJACION EN % REAL/OFERTADO 5 P + S 225 58 25 0 ,7 2 5 10 P + S 450 . 116 26 1,45 20 P + S 900 213 24 2 .66 5 10 20 P 225 P 450 P 900 31 81 161 14 18 18 3 .1 8.1 16,1 P ; PEROXIDASAS, 1 mg S: SUERO SANGUINEO, 0 ,1 ml (PROTEINAS INESPECIFICAS) TABLA XXX RENDIMIENTO DE LA ELUSION CON GLICINA + 10 % DE DIOXAN VOLUMEN DEL LECHO (*) ml PROTEINAS TOTALES ELUIDAS, Pg PROTEINAS ELUIDAS POR EL DIOXAN Pg PORCENTAJE DE PROTEINAS ELUIDAS POR EL DIOXAN 5 . 128 39 30 10 287 90 31 20 334 160 30 (* ) CON 3 mg Ig /m l 165 ^FIGURA CROMATOGRAFIA DC AFINIDAD ENTRE ANTISUERO ANTI-PEROXIDASAS Y PEROXIDASAS 10- ofp.rta de peroxidasas o f e r t a de p e ro x id a sa s mas su e ro de conejo ■ o Q 5 - 2 2 14 Numéro de fraccion A isla m ie n to de a n tîg e n o (p e ro x id a sa s ) usando como lig an d o a n t i - cuerpos con jugados a S ep h aro sa AB (CNBr). Se u t i l i z o uha columna de 5 ml con 3 mg de Ig /m l de g e l . La f lé c h a in d ic a e l momento en que se i n i c i a l a e lu s io n â c id a . 166 FIGURA 47 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD ENTRE ANTISUERO ANTI-PEROXIDASAS Y PEROXIDASAS o f e r t a de p e ro x id a sa s o f e r t a de p e ro x id a sa s mas su e ro de c o n e jo O cO CM 2 142 Numéro de fraccion A is la m ie n to de a n tig e n o s (p e ro x id a s a s ) usando como l ig a n d o a n t i - cuerp o s con jugados a S ep h aro sa 4B (CNBr). Se u t i l i z o una columna de 3 ml con 6 mg de Ig /m l de g e l . La f lé c h a in d ic a e l momento en que s e i n i c i a l a e lu s io n â c id a . 167 FIGURA A 8 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD ENTRE ANTISUERO ANTI-PEROXIDASAS Y PEROXIDASAS 1.0 - o f e r t a de p e ro x ida.sa.^ o f e r t a de p e ro x id a sa s mas su e ro de conejo § .5-0.5- Nümero de fraccion A is la m ie n to de a n tig e n o s (p e ro x id a sa s ) usando como lig a n d o a n t i - cuerpos con jugados a S ep h aro sa AB (CNBr). Se u t i l i z o una columna de 5 ml con 12 mg de Ig /m l de g e l . La f lé c h a in d ic a e l momento cn que se i n i c i a l a e lu s io n a c id a . 168 FIGURA 49 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD ENTRE ANTISUERO ANTI-.PEROXIDASAS Y PEROXIDASAS 1,0- o f e r t a de p e ro x id a sa s o f e r t a de p e ro x id a sa s mas su e ro de co n ejo O 00 CM O Numéro de fraccion A is la m ie n to de a n tîg e n o ( p e ro x id a s a s ) usando como lig a n d o a n t i - cuerp o s con jugados a S ep h a ro sa 4B (CNBr). Se u t i l i z o una columna de 10 ml con 3 mg de Ig /m l de g e l . La f lé c h a in d ic a c l momento en que se i n i c i a l a e lu s io n â c id a . 169 FIGURA 50 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD ENTRE ANTISUERO ANTI-PEROXIDASAS Y PEROXIDASAS o f e r t a do p e ro x id a sa s o f e r t a de p e ro x id a sa s mas su e ro de conejoE c o COfN d o u |-0 ,5- X»d "d m g O Numéro de fraccion A isla m ie n to de a n tîg e n o (p e ro x id a sa s ) usando como lig a n d o a n t i - cu erp o s con jugados a Sepharosa 4B (CNBr). Se u t i l i z o una columna dé 20 ml con 3 mg de Ig /m l de g e l . La f l é c h a in d ic a e l momento en que se i n i c i a l a e lu s io n â c id a . 170 FIGURA 50a. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD DEL SISTEMA FEROXIDASA-INMUNOPEROXIDASA o f e r t a de p e ro x id a sa s p r o te în a s e lu id â s a pH â c id o 300 500 Longitud de onda (A) en nm 700 B a rr id o e s p f c t r o f o to m e tr ic o c o n tr o l de l a c a rg a de p e ro x id a sa p u ra ( l î n e a c o n tin u a ) y de l a e lu s io n de p e ro x id a sa con g l i c i n a a pll 2 ,8 ( l în e a d i s c o n t in u a ) . 171 FIGUM 50b CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD DEL SISTEMA PEROXIDASA-INUDNüFEROXIDASA Uui d ■D Io - o f e r t a de pcro^:idasas mas suer o de c o n ’ j o * p r o t e î n a s e l u i d a s a pH â c i do 0 > T Longitud de onda (X) en nm B arrid o e s p e c tro fo to m é tr ic o de l a s p r o te în a s e lu id a s a pH âc id o en l a columna de S ep h aro sa AB (CNBr) con jugada con Ig a n t i - p e r o x id a s a s . Se o f e r ta r o n 10 ml de b u f f e r co n ten ien d o 1 mg de p e ro x id a sa y 0 ,1 ml de su e ro de conejo norm al con unos 8 mg de s e r o p r o t e în a s . E l b a r r id o mues- t r a l a e s p e c i f ic id a d de l a re a c c io n , ya que l a banda de p r o te în a s de su e ro no aparece en e l m a te r ia l e lu id o con l a g l i c in a a pH 2 ,8 ( l în e a d i s c o n t in u a ) . E s ta cu rv a de e l i s i o n â c id a a p a r t i r de una m ezcla de p r o te în a s es é q u iv a le n te a l a de l a f ig u r a 5 0 a , donde no bay mâs que p e ro x id a sa p u ra . 172 C. O b tencion de a n tig e n o s o n c o e s p e c îf ic o s y o r ico a so c ia d o s . C . l . C ro m a to g ra fîa de a f in id a d en m icrocolum nas con a n tig e n o s r a d ia c - t i v o s . * ’ La c a n tid a d de a n tig e n o s o n c aso c iad o s y o n c o e s p e c îf ic o s e s v a r i a ­ b l e en cada t ip o de tum or y es siem p re muy b a j a . P o r e s t a razô n h ic im o s l a p u e s ta a punto d e l método de c ro m a to g ra f îa de a f in id a d u t i l i z a n d o a n tîg e n o s p ro c e d e n te s de c e lu ia s c a n c e ro s a s m arcados con un p ro d u c to r a d ia c t iv o que p e r m i t ie r a e l a n â l i s i s de pequenas c a n t id a d e s de a n tîg e n o s . a) P ru eb as p r e v ia s . Los e s tu d io s r e a l iz a d o s p a ra d e te rm in a r l a s c o n d ic lo n e s o p tim as fu e ro n lo s s ig u i e n t e s : a . 1) C a lc u le d e l volumen mînimo de la v a d o , a . 2) r e te n c iô n in e s p e c î f i c a p o r l a S ep h aro sa AB (CNBr), a . 3) re te n c iô n in e s p e c î f i c a p o r S ep h a ro sa AB (CNBr) co n ju g ad a a in m u n o g lo b u lin as i n e s p e c î f i c a s y no c i t o t ô x ic a s y a.A ) a is la m ie n to de a n tîg e n o s e s p e c î f ic o s con S ep h aro sa AB (CNBr) co n ju g ad a a in m u n o g lo b u lin as e s p e c î f i c a s . E l ex p erim en to s e r e a l i z ô en m icrocolum nas de 1 ml de c a p a c id a d . Se u t i l i z a r o n c e lu i a s CAE m arcadas con h id r o l i z a d o p ro te ic o -^ ^ C como se in d ic a mâs a d e la n te . Las c é lu l a s se p ro c esa n de l a form a in d ic a d a en e l a p a r ta d o de " M a te r ia l y M etodos" p a ra e l a is la m ie n to de m enbrana. En e s to s e n sa y o s se u t i l i z a r o n t a n to lo s a n tîg e n o s de m enbrana s o - lu b i l i z a d a como lo s a n tîg e n o s s o lu b le s ( c i t o s o l ) . En to d o s lo s c a s o s , lo s a n tîg e n o s se o f e r t a r o n a pli 7 ,A, se la v a ro n con N aC l-T ris pH 7 ,A y s e e lu y e - ro n con g l i c i n a pH 2 ,8 . 173 b) C ro m ato g ra fîa de a f in id a d en m icrocolum nas con a n tîg e n o s r a d i a c t i v o s . b . l ) F in a lid a d . E s tu d io a n a l î t i c o d e l a is la m ie n to de a n tîg e n o s o n co aso ciad o s y o n c o e s p e c îf ic o s m arcados con am inoâcidos r a d ia c t iv o s . b .2 ) Fundamento t e ô r i c o . La t i c n i c a c o n s is te en l a in m o v il iz a c iô n de una m o lecu la b io - e s p e c î f i c a o l ig a n d o , in m u n o g lo b u lin as en e s t e e x p e rim e n to , p o r co n ju g ac io n a una m a tr iz in s o lu b le c o n s t i t u id a p o r p a r t î c u l a s de g e l de Sepharosa 4B (CNBr); se g u id a de l a a d ic iô n de l a m ezcla de s u s ta n c ia s en l a que se encuen- t r a n l a s que queremos s e p a ra r ( a n tîg e n o s e s p e c î f ic o s en n u e s tro caso ) . E l l ig a n d o e s e n to n c es capaz de r e a c c io n a r con l a s s u s ta n c ia s con a f in id a d e s - p e c î f i c a de l a m ezcla , m ie n tra s que l a s demâs pasan s in r e a c c io n a r . P o s te - r io rm e n te lo s a n tîg e n o s e s p e c î f ic o s se pueden r e c u p e ra r v a ria n d o la s c o n d i- c io n e s e x p é r im e n ta le s . Las c a n tid a d e s n e c e s a r ia s p a ra p o n e r a p u n to e s ta tê c n ic a me- d ia n te a n â l i s i s co n v en c io n a le s son muy g ra n d es . Debido a c s to , hemos cornen- zado p o r u t i l i z e r a n tîg e n o s m arcados con ^^C. Las c e lu ia s em pleadas fueron CAE en vez de CAEL, p a ra poder r e a l i z a r e l marcado " in v i t r o " con mayor f a c i l i d a d , em pleando un p rep arad o de sus membranas. b .3 ) P ro c e d im ien to . - P re p a ra c iô n de a n tîg e n o s m arcados. 1. Sem brar à u f ic ie n t e numéro de tu b o s con 25.000 c ê lu la s CAE/ml y 25 ml en cada tu b o . 174 2. R e a l iz a r cada do ce ho r a s canibios de medio de c u l t iv o p a ra f a v o re c e r e l c re c im ie n to . 3. S e g u ir e l c re c im ie n to m ediante re c u e n to s c e lu l a r e s d ia - r i o s . 4 . Cuando e l numéro de c ê lu la s en cada tubo so b re p a se e l 1 X 10^, g e n era lraen te a l t e r c e r d ia d esp u ês de l a s i e n b r a , se r e a l i z a un can b io de medio con s o lu c iô n que co n ten g a e l p ro d u c to r a d ia c t iv o , que se man- t i e n e 24 h o r a s . Se em plea p a ra e l m arcado 0 ,5 pC i/m l de h id r o l iz a d o p r o t e i c o - {U -^^C ), con una a c t iv id a d e s p e c î f i c a de 50 pC i/m l y 57 m C i/m iliâtom o de C. 5 . A l a s 24 h o ra s se p ro céd é a l a re c o g id a de l a s c ê lu la s y o b te n c io n de m enbranas segun e l p ro c e d im ie n to h a b i t u a i (v e r " M a te r ia l y Mê- t o d o s " ) . - C onjugacion de in m u n o g lo b u lin a s a S ep h aro sa 4B a c t iv a d a con CNBr. 1. P e sa r 1 g de S ep h a ro sa 4B (CNBr), que p ro p o rc io n a a p ro x i- madamente 3 ,5 ml de g e l . 2 . T r a n s f e r i r a un embudo de p la ç a de v id r io de 7 pm de d ia - m e tro . 3 . L avar d u ra n te 15 m in u tes con 200 ml de HCl 10 ^ M. 4 . L avar con NallCO^ 0 ,1 M en NàCl 0 ,5 M, pli 8 b as t a que e l l iq u id o de s a l i d a ten g a e l m encionado pH. 5 . T r a n s f e r i r a un tu b o C orex de 15 ml cou tapon de s i l i c o n a . 6 . C e n tr i fu g a r a 160 x ^ d u ra n te 3 m in u te s . 7. E lim in a r con p ip e ta e l l iq u id o s o b re n a d a n te , con lo que 175 q u e dan l o s 3 ,5 de g e l . 8. A nadir 20 mg de in m u n o g lo b u lin as a pH 8 en b u f f e r b i c a r - b o n a ta d o . 9 . A g i ta r d u ra n te dos h o ra s a te m p e ra tu ra am hren te . 10. T r a n s f e r i r a un enbudo de p la ç a de v id r io y re c o g e r e l l iq u id e so b re n a d a n te ; g u a rd a r lo r e g is t r a n d o e l volumen p a ra a n â l i s i s de p ro - t e i n a s . 11. L avar con 15 a 20 ml de b u f f e r b ic a r b o n a te , r e c o g e r y g u a rd a r e l l iq u id e de lav a d o y r e g i s t r a r e l volum en, d e s t in â n d o lo a l a n â l i ­ s i s de p r o te în a s . 12. A nadir 3 volôm enes (1 0 ,5 ml) de e ta n o lam in a 1 M a pH 8. 13. T r a n s f e r i r a un tu b o C orex de 30 ml de cap a c id a d . 14. A g i ta r d u ra n te 2 h o ra s a tem p e ra tu ra a n b ie n te . 15. T r a n s f e r i r a un embudo y re c o g e r e l l iq u id e s o b re n a d a n te , g u a rd ân d o lo p a ra a n â l i s i s de p r o t e în a s . ■ 16. L avar con 4 volûm enes (14 ml) de b u f f e r b o ra ta d o a pH 8, guardando e l l iq u id e de lav ad o p a ra a n â l i s i s de p r o te în a s . 17. L avar con 4 volûm enes de b u f f e r a c e ta te a pH 4 y g u a rd a r e l l iq u id e de lav ad o p a ra a n â l i s i s de p r o t e în a s . 18. R e p e tir e s to s lav ad o s o t r a s dos v e c e s , guardando siem p re lo s l iq u id e s de lav ad o p a ra a n â l i s i s de p r o t e în a s . 19. G uardar e l g e l en NaCl 0 ,1 4 M T r is 20 mM con a z id a so d ic a a l 0 ,1 T a 4®C h a s ta su u t i l i z a c i ô n en l a s m icrocolum nas. - P re p a ra c iô n de l a s m icroco lum nas. 1. P re p a ra r t ib o s de 2 ml de c ap a c id a d , de 7 mm de d iâm e tro 176 i n t e r i o r en l a enbocadura y te rm in ad p s en form a c ô n ic a . Se c i e r r a l a s a l i d a empacando l a p o rc iô n te rm in a l con una pequena c a n tid a d de f i b r a de v i d r io . 2. D isponer e l numéro n e c e s a r io de m icroco lum nas, s e l e c c io - nando a q u e l la s que ten g an ig u a l v e lo c id a d de f l u jo , a lre d e d o r de 5 ml p o r h o ra . 3. A fiadir 50 p l de S ep h aro sa 4B (CNBr) in a c t iv a d a con e ta n o ­ lam ina p a ra que r e l l e n e lo s huecos de l a f i b r a de v id r io y no d e je p a s a r a l a S ep h aro sa 4B (CNBr) a c t iv a d a . 4 . A nad ir 750 p l de S ep h aro sa 4B (CNBr) co n jugada con l a s in ­ m unog lobu linas c o r re s p o n d ie n te s segun e l ex p erim en to . 5 . A n ad ir 250 p l de S ep h aro sa 4B (CNBr) in a c t iv a d a p a r a e v i - t a r que s e mueva l a p a r te s u p e r io r de l a colum na a l a n a d ir l îq u i d o s . 6 . L av ar b ie n con b u f f e r NaCl pH 7 ,4 p a ra e l im in a r e l a z id a s o d ic a . - A d ic iô n de a n tîg e n o s y o b te n c iô n de a n tîg é n o s e s p e c î f i c o s . . 1. O f e r ta r a l a s m icrocolum nas 5 ,0 mg de a n tîg e n o s m arcados con am inoâcidos ^^C a una c o n c e n tra c io n de 0 ,5 mg/ml. 2 . R ecoger en f ra c c io n e s de 1 m l. 3. L avar con 15 ml de b u f f e r NaCl 0 ,1 4 M T r is 20 mM pH 7 ,4 . 4 . R ecoger en f r a c c io n e s de 1 m l. 5 . E l i d i r con 6. ml de b u f f e r g l i c i n a pH 2 ,8 . 6 . R ecoger en f ra c c io n e s de 0 ,5 m l. 7 . G uardar to d a s l a s f r a c c io n e s p a ra a n â l i s i s de r a d i a c t i v i ­ dad. 177 b .4 ) E xperim entos r e a l iz a d o s , . - C a lc u lo d e l volumen mînimo de lav ad o . E ste ex p erim en to t i e n e .p o r o b je to conocer l a minima c a n tid a d de b u f f e r de lavado n e c e s a r ia p a ra que e l p ic o de p r o te în a s i n e s p e c î f i c a s no se so la p e con l a e lu s io n de p r o te în a s e s p e c î f i c a s . Se l le v ô a cabo con 4 m icrocolum nas de 1 ml cada una, c a rg a ­ das con S ep h aro sa i n a c t iv a d a . Las colum nas se h ic ie r o n po r d u p lic a d o , lav an d o dos de e l l a s con 15 ml y . l a s o t r a s dos con 5 ml ( t a b la s XXXI y XXXII). Los r e s u l ta d o s o b te n id o s ( f ig u r a 5 1 ) in d ic a ro n que 5 mJ r e ­ s u l t a n i n s u f i c i e n t e s , r e q u ir iê n d o s e unos 10 m l. P a ra t r a b a j a r con un margen de s e g u r id a d u t il iz a m o s 15 ml. TABLA XXXI RELACION ENTRE VOLUMEN DE LAVADO Y CANTIDAD DE ANTIGENOS ELUIDOS MICROCOLUMNAS VOLUMEN DE LAVADO ANTIGENOS-^^C ELUIDOS A pH 2 ,8 ml pg A - 1 15 8 ,7 A - 2 15 8 ,5 A - 3 5 12,5 A - 4 5 12,2 - R e ten c iô n I n e s p e c î f ic a por S epharosa 4B (CNBr) E s te ex p erim en to t i e n e p o r o b je to c a l c u l â t e l fondo que apa­ re c e deb ido a unà re te n c iô n i n e s p e c î f i c a de p r o te în a s por p a r te de l a Sepha- 178 TABLA XXXII RECUENTO DE RADIACTIVIDAD DE LOS AN TIGENOS-ELUIDOS VOLUMEN cpm EN LAS DISTINTAS COLUMNAS ml A — 1 A — 2 A — 3 A — 4 SALIDA DE MATERIAL TRAS LA OFERTA DE ANTIGENO 1 12500 6000 6050 8500 2 42500 43500 38500 45000 3 45800 46000 43800 50000 4 47000 50000 46850 49800 5 50000 52500 . 49580 5200 SALIDA DE MATERIAL TRAS EL LAVADO 6 51500 53000 51000 50900 7 30000 10500 28300 17300 8 10500 2000 7600 5400 9 3200 650 1980 1300 10 1000 450 .950 430 SALIDA TRAS TRATAMIENTO CON GLICINA 11 330 235 355 460 11.5 625 650 12 160 150 400 320 12.5 360 220 13 110 120 . 180 190 14 85 96 120 106 15 83 80 16 61 90 17 ' 65 66 18 55 50 19 50 70 20 37 70 SALIDA TRAS TRATAMIENTO CON ____________ GLICINA___________ 21 310 140 21 .5 500 310 22 280 225 22 .5 170 165 23 130 120 24 • 40 • 60 179 H 5u s - CO u : i o O ë Éi fn rrr ° 2 UjdD u a pD plAIpDIpDH oo 180 E l ex p erim en to s e r e a l i z ô con 4 columnas de 1 ml cada uno que r e c ib ie r o n como o f e r t a lo s a n tîg e n o s m arcados. La c a n tid a d de a n tîg e n o s e lu - id o s fu e de 7 ,5 pg en prom edio . Los r e s u l ta d o s nos dan una id e a d e l fo n d o , que hay que d es­ cen t a r de lo s v a lo re s de r e te n c iô n e s p e c î f i c a en lo s o t r o s e x p e rim e n to s . - R e te n c iô n in e s p e c î f i c a p o r S epharosa 4B(CNBr) co n jugada a in m u n o g lo b u lin as no e s p e c î f i c a s n i c i t o t ô x ic a s . E s te ex p erim en to s e h iz o p a ra c o n firm er que l a d i f e r e n c i a que e x i s t e e n t r e lo s b la n c o s y l a s colum nas con S ep h aro sa con jugada a inm unoglo­ b u l in a s e s p e c î f ic a s no e r a d e b id a a una re te n c iô n in e s p e c î f i c a de l a s inmu­ n o g lo b u lin a s p o r ra zo n e s e s t e r i c a s , s in o a una v e rd a d e ra re a c c iô n e s p e c î f i ­ ca a n t îg e n o -a n t ic u e rp o . .P a r a r e a l i z a r l o s e u t i l i z a r o n 4 colum nas, 2 b lan c o s con Sepha- •ro sa in a c t iv a d a y dos con S ep h aro sa co n ju g ad a a in m u n o g lo b u lin as humana s , to - ta lm e n te i n e s p e c î f i c a s p a ra l o s a n tîg e n o s usados y s e o f e r t a r o n , como en lo s caso s â n t e r io r e s , 5 ,mg*de. an tîg en o s« m arcad o s con a m i n o â c i d o s - ( t a b l a s XXXIII y XXXIV) y f ig u r a 52. TABLA XXXIII RETENCION INESPECIFICA DE PROTEINAS POR INMUNOGLOBULINAS INESPECIFICAS MICROCOLUMNAS SEPHAROSA ANTIGENOS ELUIDOS pH 2 ,8 PB A - 1 I n a c t iv a d a 6 ,3 A - 2 In a c t iv a d a 7 .5 A - 3 C onjugada a Ig 6 ,7 A - 4 Conjugada a Ig 9 ,5 181 TABLA XXXIV RECUENTO DE LA RADI/vCTIVIDAD DE LAS PROTEINAS ELUIDAS EN EL EXPERIMENTO DE RETENCION INESPECIFICA VOLUMEN cpm EN LAS DISTINTAS COLUMNAS A - 1 A - 2 A - 3 A - 4 \ ■■■ ■ ....... SALIDA DE MATERIAL TRAS LA OFERTA DE ANTIGENO 1 14000 20700 29000 6000 2 46000 45000 45900 44300 3 47500 46500 43000 47000 4 45000 48700 47000 45200 5 47200 45000 48500 48300 SALIDA DE MATERIAL TRAS EL LAVADO 6 46000 42000 43100 43200 7 12000 18500 31500 28900 8 3000 7000 9200 8200 9 1000 800 2300 800 10 500 450 500 400 11 200 160 200 300 12 140 120 100 200 13 100 100 80 100 14 80 90 90 95 15 60 70 70 80 16 50 j6(T 60 75 17 50 40 50 90 18 50 60 40 50 19 40 50 60 40 20 40 40 50 60 SALIDA DE MATERIAL TRAS TRATAMIENTO CON GLICINA 21 21.5 22 22 .5 23 24 275 380 150 60 50 40 660 190 95 60 30 20 400 350 120 50 40 40 150 750 400 120 80 60 182 p o. . OOH 60 nu OT - O ■ iO (4n OO '.i u y