UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María Cristina Tejedor Gilmartín Madrid, 2015 © María Cristina Tejedor Gilmartín, 1977 Incidencia de los bifenoles policlorados sobre los procesos metabólicos de ciertos microhongos liM i\/E.R3 JDAD COM.PLUTENSÇ M A O RI û UNIVERSIDAD COMPLUTENSE 5 3 2 4 4 7 4 3 FACiULTAD DE CIENCIAS Q U I n i CAS - T i I N C I D E N C I A DE LOS B I PENI LOS PÜLICLORADÜS SOBRE LOS PROCESOS HETABOLICOS DE CIERTOS MICROHONGOS CÔ M E M 0 R I A ^ PHESEMTADA PARA OPTAR AL GRADO DOCTOR EN C I ENCI A3 QUIMICAS POR nm C R IS T I NA TE3ED0R GILMARTIN UNIVERSIDAD COMPLUTENSE - MADRID Facultad de Ciencias Quimicas B I B L I O T E C A N- Registre ..... MADRID, DUNIG 1 97 7 E s t e t r a b a j o ha s i d e r e a l i z a d o en e l I n s t i t u t e de Q ü f m i c a O r g â n i c a G e n e r a l , b a j o l a d i r e c c i o n d e l D r * D* M i g u e l A n x e l Murado G a r c i a , a q u i e n e x p r e s ü mi s i n c e r e r e c e n e c i m i e n t e p e r sus a c e r t a d a s e r i e n t a c i e n e s y e n s e h a n z a s * A s i r n i s m e , hage p a t e n t e mi a g r a d o c i m i en t e a l Dr , D* G e n z a l e B a l u j a M a r c e s , D i r e c t e r d e l D e p a r t ^ men te de C e n t a m i n a n t e s A m b i e n t a l e s , p e r su e x - p e r i m e n t a d o c e n s o j o . Tambien he de e x p r e s a r mi a g r a d e c i m i e n t e a l e s D r s . 3 . M . L e p o z Sanche y M.C. R e f e l i o R o f e l i e , p e r su c e l a b e r a c i d n en e l t r a t a m i e n t o ma te r nâ t ^ ce de l e s r e s u l t a d o s n u m é r i c o s c e r r e s p e n d i e n - t e s a l e s en s a y os m a n o m e t r i c o s * F i n a l men t e , debe h a c e r c o n s t a r mi g r a t i t u d p a ­ r a con m i s compaMeres de l a b o r a t o r i o : M*3* G o n z a l e z , L . M * H e r n a n d e z S a i n t - A u b i n y 3 . A* L a z a r e Campes p e r sus c o n t i n u e s e s t i m u l e s , a s i cerne p a r a cen t o d a s l a s a yu da s q ue , aunque an£ n i m a s , han c e n t r i b u i d e a c o m p l é t a i e s t a mémo - r i a * I N D I C E Pag . " A " - CONSIDERACIONES TEORICAS I “ C o m p u e s t o s x e n o b i o t i c o s . A l c a n c e y l i m i t a c i o n e s d e l c o n c e p t o .............. 2 I I - D i n a m i c a de l e s c o m p u e s t o s x e n o - b i o t i c o s en e l m e d i o a m b i e n t e . . . ........... 5 I I I - M e t a b o l i s m o de c o m p u e s t o s x e n o - b i d t i c o s . ................ ................................................................ .. . . . 14 IV - B i f e n i l o s p o l i c l o r a d o s ( P C B s ) . 1 . - C a r a c t e r f s t i c a s f f s i c a s , q u f m i c a s y t é c n i c a s . . . . . . . . .................. 27 V - B i f e n i l o s p o l i c l o r a d o s . 2 . - A s p e c - t o s e s t r u c t u r a l es s u s c e p t i b l e s de a f e c t a r su d i n a m i c a b i o q u i m i c a . P r o b l e m a t i c s t o x i ­ c o l o g i e s y amb ien t a l ................. 32 VI - E n f o q u e y j u s t i f i c a c i d n d e l p r e ­ s e n t s t r a b a j o . . . . . . .................... 45 »«B»t - p a r t e EXPERIMENTAL B . I - METODOLOGIA Y MATERIALES 1 - T é c n i c a s de c u l t i v e ....................... 51 1 . 1 - I n c o r p o r a t i o n de l e s PCBs y o t r o s o r g a n o c l o r a d o s a l e s m e d i o s de c u l t i v e . . . ......................... 53 2 - E x t r a c d i o n de l e s c o m p u e s t o s o r g a n o - c l o r a d o s — PCBs, DDT y A l d r f n 56 i l 2 . 1 - P u r i f i c a t i o n de l o s e x t r a c t o s . . . . . 53 2 . 2 - D e t e r m i n a t i o n de c o m p u e s t o s o r g a n o c l o r a d o s p o r c r o m a t o g r a f f a g a s - l i q u i d o . .................... 60 2 . 3 - E v a l u a c i o n de l a s m e z c l a s de b i f e n i l o s p o l i c l o r a d o s . ............... 63 3 - F r a c c i o n a m i e n t o y d e t e r m i n a t i o n de c o m p o n e n t e s c e l u l a r e s . .................... 66 3 . 1 - V a l o r a c i O n d e l DNA ( R e a c c i o n de D i s c h e o de l a d i f e n i l a m i n a ) ............ 71 3 . 2 - V a l o r a c i o n d e l RNA ( R e a c c i o n de Mejbaum o d e l o r c i n o l ) . . . . ........... 74 3 . 3 - E x t r a c c i o n y v a l o r a c i o n de p r o t e f n a s . .................. 76 3 . 4 - V a l o r a c i O n de â c i d o k o J i c o . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 4 - Ensayo de a l g u n a s a c t i v i d a d e s e n z i m a t i c a s c a r a c t e r f s t i c a s de l a f r a c - c i o n m i c r o s o m i c a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4 . 1 - P r e p a r a c i o n d e l m a t e r i a l b i o - l o g i c o ....................... 80 4 . 1 . 1 - H o m o g e n e i z a c i O n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4 . 1 . 2 - S e p a r a c i O n de l a f r a c c i O n m i c r o s o m i c a . . . . . . . . . ............... 82 4 . 2 - C o n d i c i o n e s de l o s e n s a y o s e n z i m a t i c o s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 4 . 3 - V a l o r a c i d n de l a s a c t i v i d a d e s e n z i m a t i c a s . . . .................. 88 4 . 4 - I n v e s t i g a c i o n de l a p r e s e n c i a de c i t o c r o m o P - 4 5 0 . ............ 93 I l l 5 - U e t e r m i n a c i o n m i c r o n i a n o m e t r i c a d e l consurno de o x i g e n o p o r l o s m i c r o o r - g a n i s m o s . • • • • • .................. 95 6 - V a l o r a c i o n de l a a c t i v i d a d de t r a n s p o r t e e l e c t r O n i c o # . . , . , . . , . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 6 . 1 - E n s a y o s p a r a l a d e t e c c i o n de m u t a n t e s con d e f i c i e n c i e s r e s p i r a t o r i a s ( en S a c c h a r o m v c e s c e r e v i s s i a e ) , . ............... . . . . . . . . 103 B . I I - RESULTADOS Y SU INTERPRETACION 1 - L o s PCBs como e s t r u c t u r a s a l t a - m en te r é s i s t a n t e s a l a a c c i O n de l o s m i - c r o o r g a n i s m o s , . ........................................................ 106 2 - E l p r o c e s o de a c u m u l a c i O n de l o s P C B s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............... 116 3 - E f e c t o s de l o s PCBs s o b r e e l d e s a r r o l l o de l o s m i c r o o r g a n i s m o s e n s a - y a d o s . . ............... 127 3 . 1 - D e s a r r o l l o de Ao pe r q i l l u s f 1 a v u s en p r e s e n c i a de A r o c l o r - 1 2 5 4 : L a a p r o x i m a c i d n d o s i s - r e s p u e s t a ( p e s o seco y n i v e l a s r e l a t i v e s de RNA) ................. 130 3 . 2 - I n f l u e n c i a d e l g r a d o m e d io de c l o r a c i d n s o b r e l a t o x i c i d a d de l o s PCBs f r e n t e a A s p e r g i l l u s f l a v u s . . . . . ................. 139 3 . 3 - L a r e s p u e s t a de S a c c h a r o m y ces c e r e v i s s i a e a l o s P C B s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............ 145 4 - L o s PCBs como p o s i b l e s i n d u c - t o r e s e n z i m a t i c o s i n j u s t i f i c a d o s . ............... 154 iv 4 . 1 - M e t a b o l i s m o ” a l o i n d u c c i d o ” de o t r o s x o n o b i d t i c o s " i n ^ i v o " . . . . ............ 157 4 . 2 - E n s a y o s e n z i m a t i c o s " i n v i t r o " . A u s e n c i a de c i t o c r o m o P - 4 5 0 ....................................... 164 5 - E f e c t o s de l o s PCBs s o b r e e l consumo de o x i g e n o . . ....................... 165 6 - E f e c t o s do l o s PCBs s o b r e e l t r a n s p o r t e e l e c t r o n i c o en S a c c h a - r o m y c e s c e r e v i s s i a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 7 - I n f l u e n c i a de l o s PCBs s o b r e l a p r o d u c c i é n de a c i d o k o j i c o en A s p e r g i l l u s f l a v u s . . . . . .......................... . . . . . . . . . . . . . . 178 " C " - CONCLUSIONES ........................................................................................... 185 " D " - B IBL I OGRAFI A ................................................................................ 192 " A " - C O N S I D E R A C I O N E S T E O R I C A S I - COMPUESTOS XENOQIDTICOS. ALCANCE Y L I MI TACI ONES DEL CONCEPTO. Dg un modo g e n e r a l , p o d r i a n d e f i n i r o e como " x e n o b i o t i - c o s " ( e t i m o l o g i c a m e n t e : e x t r a n o s o a j e n o s a l a v i d a ) a q u e - l l o s c o m p u e s t o s c u y a s c a r a c t e r i s t i c a s e s t r u c t u r a l e s en c i e r ^ t o modo c o n t r a s t a n , o no g u a r d a n r e l a c i o n c on l a " n o r m a t i ­ v e " que r i g e l a d i n a m i c a b i o q u i m i c a de l a b i o s f e r a . Las i m p l i c a c i o n e s do e s t a d e f i n i c i o n , c i e r t a m e n t e no - d e m a s i a d o p r é c i s a , ban s i d o amp l i a m e n t e d e b a t i d a s , d e b a t e s on l o s q u e , p o r e l m e m e n t o , no so ha l l o g a d o a un a c u e r d o - g e n e r a l . S i n e m b a r g o , aun no s i e n d o p o s i b l s f i j a r do un mo­ do ü s t r i c t o l o s l i m i t e s d e l c o n c e p t o , s i puo de e x a m i n a r s e - su g r a d e de v a l i d e z y j u z g a r s e en t e r m i n e s a p r c x i m a d o s su - a l c a n c e . P r o b a b l e m e n t e e l u n i c o c r i t e r i o s a t i s f a c t o r i o a a p l i - c a r en t a l c a s o sea e l de l a b i o d e g r a d a b i l i d a d , y su n i v e l do a p l i c a c i o n e l e c o l o g i c o . E s t e modo de p r o c é d e r se b a s a - f u n d a r n e n t a l m e n t e en l a s i g u i e n t e c o n s i d e r a c i o n : c u a n t o mas t a r d i a m e n t e h a y a a p a r e c i d o , en e l t r a n s c u r s o de l a e v o l u — c i o n , un d e t e r m i n a d o t i p c m o l e c u l a r , meno r numér o de e n t i d _ a d e s b i o l o g i c a s p o s e e r a n , e v i d e n t e m e n t e , e l d o m i n i o de su -— b i o s i n t e s i s y de s u s m e c a n i s m o s d e g r a d a t i v o s . En e l e x t r e m a de l a e s c a l a , muc has de l a s n u e v a s e s t r u c t u r a s s i n t e t i z a d a s en l a s u l t i m a s d é c é d a s , a r i t r n o c r e c i e n t e , p o r e l n o m b r e , - 3 p o d r i a n no s e r en a b s o l u t e s u s c e p t i b l e s de e x p e r i m e n t a r p r £ c e s o s b i o d e g r a d a t i v o s , o b i e n d i e h o s p r o c e s o s d i s c u r r i r i a n a t r a v e s de m e c a n i s m o s e x t r e m a d a m e n t e l e n t o s . Una o b j e c i o n es i n m e d i a t a , y 3 . B o l l a g ( 1 9 7 4 ) l a ex p l i c i t a — en r e l a c i o n c o n e l c a s o c o n c r e t e de l a a c c i o n m i - c r o b i a n a s o b r e l o s p l a g u i c i d a s — p r e g u n t a r . ' d o s e s i p u e d e n — e x i s t i r r e a l m e n t e c o m p u e s t o s s i n t e t i c o s r e s i s t o n t e s a d i e h a a c c i o n , t e n i e n d o en c u e n t a que l o s m i c r o o r g a n i s m o s p u e d e n - p o n e r en j u e g o t o d a una s e r i e de a d a p t a c i o n e s , t a n t o n o - g e - n e t i c a s ( f e n o t i p i c a s ) como m u t a c i o n a l c s ( g e n o t i p i c a s ) , c on r c l a t i v a f a c i l i d a d , E l mismo a u t c r v i o n e a r e s p o n d e r a e s t a c u e s t i o n , d e l u n i c o modo en l a a c t u a l ! d a d p o s i h l e , c u a n d o - a f i r m a c|ue " n o hay d u d a de que c i e r t o s g r u p o s de p l a g u i c i — das r e s u l t a n d i f i c i l m e n t e a t a c a b l o s p o r l o s m i c r o o r g a n i s m o s , p u d i e n d o p e r m a n e c e r en e l m e d i o d u r a n t e c o n s i d e r a b l e s p e r i £ d os de t i e m p o " . Es c l a r o que a l g o a n a l o n o p o d r i a d e c i r s e de o t r a s m uc has e s t r u c t u r a s a m p l i a m e n t e d i f u n d i d a s hoy d i a en n u e s t r o e n t o r n o , E f e c t i v a m e n t e , e l f e n o m e n o , t a n t e s v o c e s c o n s t a t a d o en l o s u l t i m o s t i e m p o s , da l a a c u m u l a c i o n de c o n t a m i n a n t e s de e l e v a d a p e r s i s t e n c i a en l o s t e j i d o s de l a s e s p e c i e s que ocjj pan l o s e s l a b o n e s s u p e r i o r e s de l a s c a d e n a s t r o f i c a s , d e — m u e s t r a , c u a n d o m e n os , que l a d i l a t a d a v i d a m e d i a r e s i d u a l de e s t a e s t r u c t u r a s d é t e r m i n a un m a n i f i e s t o d e s a j u s t e e n t r e e l r i t m o de su i n g r e s o en l o s e c o s i s t e m a s y su t a s a de d e — g r a d a c i o n . P o d r i a a h a d i r s B que e l p r o p i o d e s a r r o l l o de m e c a n i s m o s a d a p t a t i v o s , a n t e s m c n c i o n a d o , p u e d e l l e g a r a c o n v e r t i r s e - 4 p r ü c i s a r n e n t e — como mas a d e l a n t o se c o m e n t a r a an uno de ~ l o s mas i m p o r t a n t e s f a c t o r e s de d e s a j u s t e f u n c i o n a l , t a n t o a n i v e l de i n d i v i d u o como de p o b l a c i o n y e c o s i s t e m a . En c u a l q u i e r c a s o , on r e l a c i o n c on l o s c o m p u e s t o s xen_o b i o t i c o s no p o r e c e i n j u s t i f i e ado e l r o f e r i r s e , como l o haco e l c i t a d o B o l l a g , a una " r e c a l c i t r a n c i a m o l e c u l a r i n t r i n s e - c a " , a u n q u e l a e v a l u a c i o n p r é c i s a de t a l p r o p i e d a d e x i j a — ■ u n o s c o n o c i m i e n t o s s o b r e e l t e ma de l a c o r r e l a c i o n e n t r e e_s t r u c t u r a q u i m i c a y b i o d e g r a d a b i l i d a d muy s u p e r i o r e s a l o s - quo p o r e l momen to se p o s o e n . I I - D INAMICA DE LOS COMPUESTOS XENOBIOTICOS EN EL ME­ DIO AMBIENTE. E l i n g r e s o de c o m p u e s t o s x e n o b i o t i c o s en e l m e d i o se - p r o d u c e a p a r t i r de muy d i v e r s e s o r i g en e s . L os d e s e c h o s u r - b a n o s e i n d u s t r i a l e s , j u n t o c o n l a s a p l i c a c i o n e s de p r o d u c - t o s f i t o y z o o s a n i t a r i o s , c o n s t i t u y e n s i n d u d a l a s c o n t r i b u c l o n e s de m a y o r s i g n i f i c a c i o r v . Au n q u e d e s d e c i e r t o s p u n t o s de v i s t a c a b r i a d i s t i n g u i r e n t r e u n a s e m i s i o n e s q u e , como l a s de d e s e c h o s , no r e s p o n — d o n a una e s t r a t e g i a d e f i n i d a (mas b i e n a una f a l t a de e s — t r a t o g i a ) , y l a i n t r o d u c c i o n de c o m p u e s t o s d e t e r m i n a d o s c on e l p r o p o s i t o c o n c r e t e de a l t e r a r de a l g u n modo l a d i n a m i c a e s p o n t a n é a de l o s s i s t e m a s n a t u r e l u s , en una o p t i c a e c o l o g y c a s u f i c i e n t e m e n t e amp l i a t a i e s d i s t i n c i o n e s , a s i como l a s c l a s i f i c o c i o n e s de c o n t a m i n a n t e s en b a s e a c r i t e r i o s como - su e s t a d o f i s i c o , e l m e d i o s o b r e e l que i n c i d e n , f u e n t e s — e m i s o r a s , t e c n o l o g i a s c o r r e c t o r a s , e t c , , r e s u l t a n i n n e c e s a - r i a s . L as c o n s e c u e n c i a s son en c u a l q u i e r c a s o l a s m i s m a s : r e g r e s i o n d e l e c o s i s t e m a a f e c t a d o p o r f a v o r e c i m i e n t o de l o s c o m p o n e n t e s que b a s a n su c a p a c i d a d de c o m p e t e n c i a en l a p r £ d u c c i o n de un e l e v a d o n um é r o de d e s c e n d i e n t e s , C o m o q u i e r a que s e a , l o s x e n o b i o t i c o s l i b e r a d o s en e l - m e d i o q u e d a n a d i s p o s i c i o n de una e x t e n s a gama de f a c t o r e s de o r d e n f i s i c o , q u i m i c o y b i o l o g i c o , c u y a a c c i o n c o r n b i n a d a t i e n d e s i m u l t a n e a m e n t e a su d i s p e r s i o n y a su d e g r a d a c i o n — transporte degradacion aplicacion AIRE BIOSFERA p- aplicacionaplcacion SUELOAGUA transporte degradacion transporte degradacicfn F i g . 1 - D i n a m i c a de l o s c o m p u e s t o s x e n o b i o t i c o s en e l m e d i o a m b i e n t e . 7 [ f i n . l ) . L os i n t e n s i d a d e s r e l a t i v e s de unoa y o t r o s p r o c e - l o s , e v i d o n t e m o n t e r e l e c i o n a d a s c o n l a s p e c u l i a r i d a d e s t o p £ i r a f i c s s , o d a f i c a s , c l i m a t i c a s , b i e s f u r i c a s , e t c . d e l e n t o r no en que se d e s o r r o l l a n , d e o e n d e n , en p r i m e r t e r m i n o , de - l a e s t a b i l i d a d q u i m i c a d e l p r o d u c t o quo se c o n s i d e r s , C uando t a l e s t a b i l i d a d es b a j a o m o d e r a d a , muchos de - l o s m e c a n i s m o s t r a n s p o r t a d o r e s p u e d e n c o n t r i b u i r de un modo i p r e c i a b l e a su d e g r a d a c i o n . Las e s t r u c t u r a s de e l e v a d a e s ­ t a b i l i d a d , p o r e l c o n t r a r i o , no s o l o son s u s c e p t i b l e s de — t r a n s f e r i r s e i n a l t o r a d a s o c o n l o v e s m o d i f i c a c i o n e s h a s t a - s u s t r a t o s muy a i e j a d o s de su p u n t o de i n g r e s o , s i n o q u e , a l e n t r o r on l a s r e d e s t r o f i c a s , t i e n d e n a c o n c e n t r a r s o en l o s o j e m c n t o s c o n s u m i d o r e s do o r d e n o s s u p e r i o r e s , que a l c o n s t ^ t u i r t a m b i e n , p o r l o g e n e r a l , l e s que e x h i b e r i u n a s t a s a s de r e n o v a c i o n mas mode r a d a s ( e s d e c i r , s on l o s mas l o n g e v o s ) , r e c i b e n un i r n p a c t o c o m p a r â t i v o r n e r i t e mas i n t e n s o que l o s r e ­ p r é s e n t a n t e s de l o s n i v e l a s mas i n f e r i o r os de o r g a n i z a c i o n . La f i g u r a 2 , e l a b o r a d a c on d a t e s r e l a t i v e s a l i n s e c t i ­ c i d e o r g a n o c l o r a d o DDT, i l u s t r a una i m p o r t a n t e c o n s e c u e n c i a p r a c t i c e de e s t e s h e c h o s : de i g u a l modo que e n t r e l a l i b e r a c i o n de un c o n t a m i n a n t e y l a a p a r i c i o n de s u s e f e c t o s a n i ­ v e l e c o l o g i c o m e d i a un p é r i o d e de l a t e n c i a a v e c e s muy p r o - l o n g a d o , un a n a l o g o p é r i o d e " d e r e t a r d e " t r a n s c u r r e e n t r e - e l momen to en que c e s a l a é m i s i o n y e l c e s e de l a s i n t o m a t ^ o l o n i a ( p r e s c i n d i e n d o de l a s p o s i b l e s y o s p e r a b l e s s e c u e l a s , que r e t a r d a n aun mas l a r e c u p e r a c i o n de l a s i t u a c i o n i n i — c i a l c u a n d o e l l a es p o s i b l e ) . P é r i o d e c u y a d u r a c i o n se d i l a t a c o n l a e s t a b i l i d a d d e l c o r n p u e s t e i m p l i e a d o y l a e l e v a — c i o n d e l n i v e l t r o f i c o c o n s i d e r a d o y q u e , en e l c a s o p a r t i - a/25anos ; anos aplicacion nivel en peces '• sueto t i e m p o F i g . 2 - R e t a r d o s en l a d e s a p a r i c i e n d e l DDT de d i f e — r e n t e s c o m p a r t i m e n t e s d e l e c o s i s t e m a . P a r a e x p l i c a c i d n , v e ^ se e l t e x t o . ( S e g u n R e n d e r s , 3 , y M e a do w s , D . L . 1 9 7 2 ) . c u l a r a q u i a l u d i d c , s i g n i f i c a r i a que l o s e f e c t o s d e l DOT sjo b r e l o s p e c e s no s o l o no r e m i t i r f a n i n m e d i a t a m e n t e d e s p u e s de que l a a p l i c a c i o n d e l i n s e c t i c i d a c o m e n z a s e a d e c l i n a r , s i n o que se a g u d i z a r i a n , a l c a n z a n d o un max imo de i n c i d e n c i a a l r e d e d o r de 11 a no s d e s p u e s de a q u e l m o me n t o . Y u n i c a m e n t e t r a n s c u r r i d o s u n o s 25 a n o s l o s n i v e l e s de DOT v o l v e r f a n a - s e r a n a l o g o s a l o s p r é s e n t e s en e l momento en que se i n i c i d l a r e s t r i c c i d n de su i n g r e s o en e l m e d i o . No t o d o s l o s m e c a n i s m o s c o n t r i b u y e n en l a m i sma m e d i d a a l a d e g r a d a c i o n y d e s a c t i v a c i o n de l o s c o m p u e s t o s x e n o b i d - t i c o s . E n t r e l o s de o r d e n f f s i c o l a f o t o d e s c o m p o s i c i d n e s , 9 s i n d u d a , e l mas r e l e v a n t e , y a que l a f r a c c i d n u l t r a v i o l e t s de l a r a d i a c i o n s o l a r es s u s c e p t i b l e de a l t e r a r l a c o n f i g u - r a c i d n e l e c t r o n i c s de l o s c o m p u e s t o s con e n l a c e s • Ap enas p r é s e n t a i n t e r e s s i no es q u i z a como m e c a n i s m o s que pue dan f a c i l i t a r o t r o t i p o de a c c i o n e s u l t e r i o r e s , l o s e f e c t o s d e - r i v a d o s de l a s e p a r a c i d n m e c a n i c a , f i l t r a c i o n , d i l u c i d n e - i n c l u s e e l e v a c i d n de l a t e m p e r a t u r a , p u e s t o que a u n q u e se - h a b l a de l a t e r m o l a b i l i d a d de a l g u n o s p l a g u i c i d a s , s u e l e c e r s e con r e f e r e n c i a a t e r n p e r a t u r a s s u p e r i o r e s a l a s que c ^ be a g u a r d a r en c o n d i c i o n e s n a t u r a l e s . Y t a n s o l o , d e n t r o de e s t e a p a r t a d o , c i e r t o s p r o c e s o s f f s i c o - q u f m i c c s v i n c u l a d o s a l o s f e n d m e n o s de a d s o r c i o n de s o l u t e s s o b r e s u p e r f i c i e s - s d l i d a s , p u e d e n c o n t r i b u i r a l a d e s a c t i v a c i d n de x e n o b i d t i - c o s p o r b l o q u e o de d e t e r m i n a d a s p o r c i o n e s de s u s m o l é c u l e s , h e c h o d e l que se c o n o c o n v a r i e s e j e m p l o s , p a r t i c u l a r m e n t e - e n t r e c i e r t o s g r u p o s de h e r b i c i d e s . Es c l a r o que l a s t r a n s f o r m a c i o n e s de o r d e n q u i m i c o , — e s e n c i a l m e n t 0 o x i d a c i o n e s , r e d u c i o n e s , h i d r d l i s i s , d e s c a r b £ x i l a c i o n e s , d e s c l o r h i d r a c i o n e s e i s o m e r i z a c i o n e s , d e s e m p e - - nan un p a p e l mas s i g n i f i c a t i v o . Con t o d o , es p r e c i s e t e n e r en c u e n t a de n u e v o qua en l a s u a v i d a d de l a s c o n d i c i o n e s n_a t u r a l e s — t e m p e r a t u r a s y p r e s i o n e s m o d e r a d a s , pH p r o x i m o a l a n e u t r a l i d a d —, i n c l u s o p r o c e s o s t a n c o n o c i d o s como l a - d e s c l o r h i d r a c i o n d e l DDT en m e d i o a l c a l i n e , o d e l l i n d a n e , o l a e p o x i d a c i d n de c o m p u e s t o s c i c l o d i e n i c o s t a l e s como e l a l d r i n , i s o d r i n y h e p t a c l o r o , no r e v i s t a n , c u a n d o se c o n s i ­ d é r a l a v f a e s t r i c t a m e n t e q u f m i c a , d e m a s i a d a i m p o r t a n c i a — cu a n t i t a t i v a . L o s m e c a n i s m o s de f n d o l e b i o q u i m i c a c o n s t i t u y e n , con - 10 t o d a s e g u r i d a d , l a mas i n t e r e s a n t e y s i g n i f i c s t i v / a c o n t r i - - b u c i d n a l a t r a n s f o r m a c i d n de l o s x e n o b i d t i c o s l i b e r a d o s a l m e d i o . Y a u n q u e en o c a s i o n e s a l g u n o de l o s p r o d u c t o s r é s u l ­ t a n t e s c o i n c i d a n con a l g u n o de l o s que d e r i v a n de a c c i o n e s p u r a m e n t e f i s i c a s o q u i m i c a s , es p o s i b l e a f i r m a r q u e , en l a i n r n e n s a m a y o r i a de l o s c a s e s , l o s a t a q u e s que t i e n e n l u g a r a t r a v e s de p r o c e s o s m e t a b d l i c o s son mas v e l o c e s — como c o ­ r r e s p o n d e a r e a c c i o n e s c a t a l i z a d a s e n z i m a t i c a m e n t e — s u s — p r o d u c t o s a b a r c a n un e s p e c t r o mucho mas a m p l i o de v a r i a c i o - n es q u i m i c a s , y en su t r a n s c u r s o se o r i g i n a n con m a y o r f r e - c u e n c i a m o l e c u l a s v e r d a d e r a m e n t e d e g r a d a d a s ( e n t e n d i e n d o — p o r d e g r a d a c i d n no l a m e r a v a r i a c i d n de un g r u p o f u n c i o n a l , p o r mucha r e l e v a n c i a t o x i c o l d g i c a que p u e d a p o s e e r , s i n o e l a c o r t a m i e n t o o d e s o r g a n i z a c i d n d e l e s q u e l e t o c a r b o n a d o de - l a m o l é c u l a o r i g i n a l ) . C o n v i e n e t e n e r en c u e n t a que no s i e m p r e l a t r a n s f o r m a ­ c i d n , p o r l a v i a que s e a , de l o s x o n o b i d t i c o s , l l e v a a p a r e - j a d a su d e s a c t i v a c i d n o l a p é r d i d a de su p e l i g r o s i d a d . C i e r t o s p r o c e s o s , p o r e l c o n t r a r i o , e x a c e r b a n l a t o x i c i d a d d e l p r o d u c t o o r i g i n a l , e l e v a n su e s t a b i l i d a d q u i m i c a o e j e r c e n ambos e f e c t o s — como o c u r r e , p o r e j e m p l o , en e l c a s o de l a e p o x i d a c i d n d e l a l d r i n p a r a d a r d i e l d r i n — . Cabe s e n a l a r , - adernâs , que e n t r e l o s p l a g u i c i d a s , e x i s t e un bu en numér o de e s t r u c t u r a s d i s e n a d a s " e x p r o f e s o " con e l f i n de que su t o ­ x i c i d a d se p o t e n c i e o i n c l u s o s u r j a , como c o n s e c u e n c i a de - t r a n s f o r m a c i o n e s m e t e b d l i c a s que t i e n e n l u g a r en e l o r g an i _s mo r e c e p t o r o en su e n t o r n o . F i n a l m e n t e , v a l e l a p e n a s u b r a y a r que m i e n t r a s que l a d e s a p a r i c i d n de un x e n o b i d t i c o s i g u e , c u a n d o e l p r o c e s o - - 11 u i e n c d e t e r n i i n a d o p o r m e c a n i s m o s f i s i c o s , f i s i c o - q u l m i c o s o q u i r n i c Q S , u n a c i n e t i c a de p r i m e r o r d e n ( f i g * 3 ) , l a s e g u i d a c u a n d o su t r a n s f o r m a c i d n t i e n e l u g a r a t r a v e s de m e c a n i s m o s de f n d o l e b i o l d g i c a , es de t i p o s i g m o i d a l * -o m ecan ism os bio lo 'g icos m e c a n is m os fis icoqu i'm icos ■o tiem po F i g * 3 - C i n e t i c a s do d e s a p a r i c i d n de un c o n t a m i n a n t e s u b s i g u i e n t e s a u n a s o l a a p l i c a c i d n . A: p o r m e c a n i s m o s f f s i ^ c o s o q u i m i c o s , B: p o r m e c a n i s m o s b i o l d g i c o s * ( S e g u n K e a r ­ n e y , P * C * ; N a s h , R* G. y I s e n s e e , A* R* - 1 9 6 9 ) * Es d i f i c i l , s i n e m b a r g o , q u e , en c o n d i c i o n e s n a t u r a l e s , p u e d a n d i s t i n g u i r s e c l a r a m e n t e l a s c o n t r i b u c i o n e s d e b i d a s a c a d a uno de l o s m e c a n i s m o s s e n a l a d o s , l o s c u a l e s no a c t u a n , e v i d e n t e m e n t e , de mcdo i n d e p e n d i e n t e , s i n o c o o p e r a t i v o * En c u a l q u i e r c a s o , c o n s t i t u y e un h e c h o o b j e t i v o e l que l a p e r - m a n e n c i a de l o s x e n o b i d t i c o s en e l m e d i o , es d e c i r , su g r a ­ do de v u l n e r a b i l i d a d a l a i n t e r a c c i d n do l a t o t a l i d a d de - - 12 l o s f a c t o r e s c o n s l d e r a d o s mas a t r a s , v a r i a e n t r e a m p l i o s l_f m i t e s ( T a b l a I ) . Y q u i z a e s t e d a t o c o n s t i t u y a , a l menos de m o m e n t o , l a m e d i d a mas v a l i d a de l a ” r e c a l c i t r a n c i a m o l e c u ­ l a r i n t r f n s e c a " de l a que B o l l a g h a b l a . T a b l a I - P e r s i s t e n c i a y t r a n s f o r m a c i o n e s e n z i m a t i c a s de d i v e r s e s g r u p o s do p l a g u i c i d a s en e l s u e l o (Segun 3 . M, B o l l a g , 1 9 7 4 ) GRUPO DE PLAGUICIDAS EJEMPLO PERIODO DE PERSISTENCIA EN SUELO TRA^'fSPUi&MACIONES ENZIMATICAS POR MICROORGANISMOS Rcaccioues Primarias Reacciones Secundarias ORGANO- FOSFORADOS 9 dfaa Hidrdlisis. Ruptura del anillo. METIL- CARilAMATGS DUzlnon 06 Carbarll 2-8 semanas Hidroxilacidn cadena lateral, hidroxilacidn anillo, hidrolisis. Hidrdlisis, ruptura del anillo. FENIL- CARBAMAÏOS AGIDOS ALCANOICOS MALOGENADOS' ACIOOS CLOROFENOXI- ALCANOICOS ACIDOS BENZOICOS FENIL- UREAS S-TRIAZINAS HIDROCARBUROS HALOGENADOS Cl PC 9 S H .C -C -C -O H ̂ I Cl OaUpon c xCI'Sx^Cl O -C H g -C O O H 2 . t - 0 COOH Amlbcn c X j s Llnuron SIm azlna HgC^-H N N H - Heptacloro 7 Hidrdlisis semanas del ester. 2-8 Deshalogenacidn. semanas Hidroxilacidn, ruptura del anillo. Hidroxilacidn on el anillo, ruptura del anillo. 4-14 p-Oxidacidn, semanas ruptura del enlace eter, V Hidroxilacidn en el anillo. 6 Descarboxilacidn, semanas deshalogenacidn. 4-15 N-Desalquilacidn, Hidrdlisis, meses hidrolisis. acetilacidn, condensacidn, 18 N-Desalquilacidn, Desaminacidn. meses deshalogenacidn. 9 afios Epoxidacidn, Hidrdlisis. deshalogenacidn. I l l - METABOLISMO DE COMPUESTOS XENOBIOTICOS. T r a s l a s a n t e r i o r e s c o n s i d e r a c l o n e s , p a r s c e c l a r o e l - i n t e r e s de l o s e s t u d i o s en t o r n o a l o s p r o c e s o s m e t a b d l i c o s en l o s que se e n c u e n t r a n i m p l i c a d o s c o m p u e s t o s x e n o b i d t i c o s . Un buen numéro de d a t o s , a s i como v a l i o s a s o r i e n t a c i o - n e s de f n d o l e m e t o d o l d g i c a p r o c é d a n t e s de l a f a r m a c o l o g f a - y c o n c e r n i e n t e s a l m e t a b o l i s m o y modo de a c c i d n de d r o g a s , p r o p o r c i o n an a a q u e l l o s e s t u d i o s un e s t i m a b l e p u n t o de p a r - t i d a . No hay d u d a , s i n e m ba rg o , de que una a p r o x i m a c i d n a - u n a t o x i c o l o g f a a m b i e n t a l — o a un a f a r m a c o l o g f a a m b i e n t a l — e x i g e c u b r i r un A r e a mucho mas e x t e n s a y , en c i e r t o modo, c u a l i t a t i v a m e n t e d i f e r e n t e . Aun cu an do l a i n f o r m a c i d n u t i l i z a b l e a e s t e r e s p e c t a - en e l caso d e l hombre y de a l g u n o s m a m f f o r o s a l c a n c e ya ------ u n a s n o t a b l e s p r o p o r c i o n e s , a l d e s c e n d e r a l o l a r g o de l a - e s c a l a a n i m a l , a l p a s a r a l r e i n o v e g e t a l y a l c o n s i d e r a r — l o s m i c r o o r g a n i s m o s — e x c e p t u a n d o t a l vez un e s c a s f s i m o nd~ mero do e s p e c i e s " c l â s i c a s " —, muy poco es l o que se puede a r l a d i r . F i n a l m e n t e , n u m e r o s o s a s p e c t o s r e l a t i v e s a l g r a d o - de v a l i d e z de l a e x t r a p o l a c i d n a c o n d i c i o n e s a m b i e n t a l e s de l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s en l a s c o n d i c i o n e s u s u a l e s de l a b £ r a t o r i o , a s i como a l s i g n i f i c a d o y t r a s c e n d e n c i a a n i v e l — e c o l o g i c o de l o s p r o c e s o s d e s c r i t o s on o r g a n i s m e s i n d i v i d u ^ l e s o p o b l a c i o n e s m o n o e s p e c f f i c a s , per manecen t o d a v f a i n e x - p l o r a d o s . 15 En e i caso de l o s m i c r o o r g a n i s m o s c o n c u r r e n , en e s t e ~ s e n t i d o , p a r t i c u l a r i d a d e s que mer ec en d e s t a c a r s e e s p e c i a l - m e n t e . En s f e c t o , l a s m e t o d o l o g f a s mas a m p l i a m e n t e e x t e n d i - das p a r a su a s t u d i o , se basan en l a u t i l i z a c i d n de c u l t i v o s a x e n i c o s y c e r r a d o s , l o c u a l no s o l o i m p i d e l a i n v e s t i g a - c i d n de l a a c t i v i d a d co rn b i na da de v a r i a s e s p e c i e s , que es - l o que c o n s t i t u y e l a s i t u a c i d n h a b i t u a i en c o n d i c i o n e s n a t j j r a i e s , s i n o que s i t u a a l m i c r o o r g a n i s m o a e s t u d i a r en u nas c o n d i c i o n e s de d e s a r r o l l o t o t a l m e n t e i n s o l i t e s : l a mayor — p a r t e de l a s o b s e r v a c i o n e s que se r a g i s t r a n an e s t a c l a s e - de B x p e r i e n c i a s c o n c i e r n e n a p r o c e s o s que t i e n e n l u g a r f u n - d a m e n t a l m e n t e en e l t r a n s c u r s o de un p e r i o d o d u r a n t e e l — c u a l l o s m i c r o o r g a n i s m o s o b j e t o de e ns ay o c r e c e n a r i t m o ex p o n e n c i a l en m e d i o s con e l è v a d a s p r o p o r c i o n e s de n u t r i e n t e s . No es e s t a l a c i n e t i c a d e l c r e c i m i e n t o en l a s p o b l a c i £ n és n a t u r a l e s , d o n d e , en s i t u a c i o n e s n o r m a l m e n t e mucho mas c o m p l e j a s que l a d e l c u l t i v e p u r o , d i s t i n t a s e s p e c i e s — s o - m e t i d a s , p o r o t r a p a r t e , a l a p r e s i d n de p a r a s i t e s y d e p r e - d a d o r e s — c o m p i t e n e n t r e s i p o r un s u m i n i s t r o l i m i t a d o de - n u t r i e n t e s . E l l e d é t e r m i n a , en p r i m e r l u g a r , una c i n e t i c a - a l e j a d a d e l m o de l o e x p o n e n c i a l , p e r o , p o r a h a d i d u r a , un e s ­ t a d o m e t a b d l i c o c a r a c t e r f s t i c o , de b a j a t a s a de c amb io — — que a v e c e s se c a l i f i c a i m p r o p i a m e n t e de " l a t e n t e " y que mas b i e n p o d r i a d e n o r n i n a r s e " b a s a i " — en e l c u a l l a v e l o c i - dad de l o s p r o c e s o s b i o q u i m i c o s , y t a l vez t a m b i e n su d i v e j r s i d a d , se m a n t i e n e n muy p o r d e b a j o de l o s l i m i t e s que a c o s - t u m b r a n a m a n e j a r s e en e l l a b o r a t o r i o . P u e s t o que segdn s e n a l a B r o c k ( 1 9 7 3 ) , e l c r e c i m i e n t o - m i c r o b i a n o en l a n a t u r a l e z a r a r a m a n t e es e x p o n e n c i a l , p a r e - 16 c i é n d o S3 mas a menudo a l que t i e n a l u g a r en un q u i m i o s t a t o ( q u i z a h a b r f a que a n a d i r î un q u i m i o s t a t o f u n c i o n a n d o a mod^ r a d o f l u j o de n u t r i e n t e s ) , e s t e d e b e r f a c o n s t i t u i r e l med io de ü l e c c i d n en l o s e s t u d i o s s o b r e l a n a t u r a l e z a de l a s i n - t e r a c c i o n e s m i c r o o r g a n i s m o s - c o m p u e s t o s x e n o b i o t i c o s . E x i s ­ t e r ! , p o r o t r a p a r t e , d a t o s que s u g i e r e n que l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s o p é r a n d e en r e g i m e n s s c o n t i n u e s pu ed en p r e s e n t e r d i f e r e n c i a s s i g n i f i c a t i v a s r e s p e c t e de l o s c o n s e g u i d o s me- d i a n t e l a s m e t o d o l o g i a s c o n v e n c i o n a l e s . D u r a n t e e l d e s a r r o l l o de e s t e t r a b a j o , p o r e j e m p l o , se e n c o n t r d — segun se d e s c r i b i r a en l a s e c c i d n c o r r e s p o n d i e n - t e — que en m i c r o o r g a n i s m o s d e s a r r o l l a d o s an c u l t i v e s c e r r ^ d os a d i c i o n a d o s con un a un i c a d o s i s i n i c i a l de b i f e n i l o s p£ 1 i c l o r a d o s , l a c o n c e n t r a c i d n de e s t e s c o m p u e s t o s p o r u n i d a d de peso seco de c o s e c h a d e s c e n d r a g r a r i u a l m e n t e a l o l a r g o - d e l p e r i o d o de i n c u b a c i d n , es d e c i r , a m e d i d a que a umen ta ba l a b i o m a s a . A l margon de l a s i m p l i c a c i o n e s que e s t e s r e s u l ­ t a d o s puedan t e n e r en r e l a c i d n con l a n a t u r a l e z a d e l p r o c e ­ so de a c u m u l a c i o n , y aunque en e l c as o de m i c r o o r g a n i s m o s - f i l a m e n t o s o s l a s i t u a c i o n q u i z a r é s u l t a mas c o m p l e j a , en — c u l t i v o s de m i c r o o r g a n i s m o s u n i c e l u l a r e s p a r e c e c l a r o que l a s s u c e s i va s g e n e r a c i o n e s de c e l u i as se encon t r a r a n expue_s t a s a d o s i s cada vez mas b a j a s , i n c l u s o en a u s e n c i a de mec^ n i s m o s c a p a c e s de t r a n s f o r m a r e l p r o d u c t o o r i g i n a l m e n t e a n^ d i d o . E l d a t o de l a c o n c e n t r a c i d n i n i c i a l , p u e s , s o l o t e n ­ d r a r e l e v a n c i a e x a c t a en r e l a c i d n con l a p o b l a c i o n c e l u i a r i n i c i a l ; e s t o es : e l i n d c u l o . Aun f u e r a d e l t e r r e n o m e t o d o l o g i c o de l a m i c r o b i o l o - g f a , e x i s t e n a s i m i s m o d a t o s a f a v o r d e l a n t e r i o r s u p u e s t o . 17 y a s f N e b e k a r y P u g l i s i ( 1 9 7 4 ) , en c u l t i v o s d e l c r u s t â c e o - D a p h n i a magna, l l e g a n a e n c o n t r a r que l a c o n c e n t r a c i d n de - A r o c l o r - 1 2 5 4 ( u n a m e z c l a de b i f e n i l o s p o l i c l o r a d o s ) en e l - agua que d é t e r m i n a una m o r t a l i d a d d e l 5 0 % — CL^ q — en t r è s semanas , es v e n t i c u a t r o v e c e s mayor en r e g i m e n e s t a c i o n a r i o que en r e g i m e n c o n t i n u a . Es é v i d e n t e , p u e s , que e l emp leo de l a s t é c n i c a s de — c u l t i v e c o n t i n u e h a b r â de g e n e r a l i z a r s e a m e d i d a que se ------ a v a n z a en e l campo de l a t o x i c o l o g f a a m b i e n t a l . No c a b e , — s i n e m b ar g o , d u d a r ya de l a v i g e n c i a de p r o c e d i m i e n t e s mas c o n v e n c i o n a l e s , p a r t i c u l a r m e n t e c uando e x i s t e n aun numéro - S O S p r o b l è m e s q u e t o d a v f a no han s i d o a b o r d a d o s a t r a v é s de e l l e s . E l " e n f o q u e de c u l t i v e c e r r a d o " , p o r o t r a p a r t e , pe£ m i t e a m p l i f i c a r c i e r t o s e f e c t o s f i s i o l é g i c o s q ue , s i n s e r a r t e f a c t u a t e s , se a c e n t d a n en e s t a d o s m e t a b o l i c o s c a r a c t e - r f s t i c o s de a l g u n a s e t a p a s de t a i e s c u l t i v o s , p e r m i t s t r a b ^ j a r en un a d i n a m i c a cuyo c i c l o es b i e n c o n o c i d o y r é s u l t a de a p l i c a c i d n mas s e n c i l l a — p a r t i c u l a r m e n t e en e l caso de m i ­ c r o o r g a n i s m o s f i l a m e n t o s o s — que l a que e x i g e a l t r a b a j o en q u i m i o s t a t o . M i e n t r a s que l a s i n t e r a c c i o n e s e n t r e c o m p u e s t o s xeno - b i d t i c o s y a n i m a l e s s u p e r i o r e s se han c o m t e n p l a d o con c i e r - t a a m p l i t u d t a n t o desde e l p u n t o de v i s t a de l a s t r a n s f o r m a c l o n e s que e x p é r i m e n t a l a m o l é c u l e e x t r a n a , como de l o s ------ e f e c t o s que e s t a d é t e r m i n a s o b r e e l o r g a n i s m e r e c e p t o r , en e l c aso de l o s m i c r o o r g a n i s m o s se ha d e s c u i d a d o con e x c e s i - 18 va f r e c u e n c i a e s t e u l t i m o a s p e c t o . A s i , aunque se han c a r a £ t e r i z a d o e s t r u c t u r a i ment e n u m e r o s o s m e t a b o l i t o s r é s u l t a n t e s de l a a c c i d n m i c r o b i a n a s o b r e d i s t i n t o s t i p o s de x e n o b i o t i ­ c o s , se s abe mucho menos a c e r c a de su s f o r m a s de t o x i c i d a d , l o s f a c t o r e s que a f e c t a n a l a s v i a s t r a n s f o r m a d o r a s , y l o s d e s a j u s t e s que e l p r o p i o p r o c e s o t r a n s f o r m a d o r puede i n d u - c i r en l o s m eca n i sm os f i s i o l d g i c o s de l o s m i c r o o r g a n i s m o s . En g e n e r a l , e l d e s a r r o l l o de un m i c r o o r g a n i s m o en p r e ­ s e n c i a de un x e n o b i d t i c o puede t e n e r como c o n s e c u e n c i a s a) L a mera a c u m u l a c i d n — y a s e a en v i r t u d de m e c a n i s ­ mos a c t i v o s o p a s i v o s de t r a n s p o r t e — d e l x e n o b i d t i c o , que p e r m a n e c e i n t r a n s f o r m a d o . b ) L a t r a n s f o r m a c i d n q u i m i c a d e l c o m p u e s t o e x t r a h o , — p r o c e s o q u e , a su v e z , p üede d e s a r r o l l a r s e segun dos m o d è ­ l e s î h i ) S i n quo t a l t r a n s f o r m a c i d n l l e v e a p a r e j a d o un a p o r t e e n e r g e t i c o p a r a l a e n t i d a d t r a n s f o r m a d o r a . Es e s t e - e l f end men o que P o s t e r ( 1 9 6 2 ) d e n o m i n d " c o o x i d a c i d n " , J e n ­ sen ( 1 9 6 3 ) " c o m e t a b o l i s m o " — es t a l vez e l t e r m i n o mâs a f o £ t u n a d o — y R u i z H e r r e r a y S t a r k e y ( 1 9 6 9 ) " c o d e s a s i m i l a c i d n " . 6 2 ) A t r a v é s d e l i n g r e s o d e l c o m p ue s to e x t r a n o en u n a v f a c a t a b d l i c a e s e n c i a l , con su c o r r e s p o n d i e n t e d e g r a d ^ c i d n q u f m i c a y , p o r l o t a n t o , e l c o n s i g u i e n t e a p o r t e de e n e r g f a . T a l v e z l a o c u r r e n c i a de l a s dos p r i m e r a s s i t u a c i o n e s 19 m e n c i o n a d a s — a c u m u l a c i d n d a l p r o d u c t o i n t r a n s f o r m a d o y ------ t r a n s f o r m a c i o n c o m e t a b d l i c a — sea l o que m e j o r c a r a c t e r i z a a l a d i n a m i c a de l o s c o m p u e s t o s t f p i c a m e n t e x e n o b i d t i c o s en e l med io a m b i e n t s . Es c l a r o que en e l p r i m e r caso no t i e n s l u g a r un v e r d a d e r o r e c i c l a d o b i o q u i m i c o d e l c o m pu es to e x t r a n o , e l c u a l e_s t a r a en d i s p o s i c i o n de e j e r c e r un e f e c t o c o n t i n u a d o s o b r e - l a e n t i d a d a c u m u l a d o r a y v o l v e r a a q u e d a r l i b r e cuando e s t a se d e s o r g a n i c e ; p e r o tampoco e l se gundo c o n s t i t u y e una s i - t u a c i d n u s u a l en l a s m o l é c u l a s de o r i g e n b i o s i n t e t i c o . E f e c t i v a m e n t e , l o s p r o c e s o s c o m e t a b d l i c o s , a l no s u m i n i s t r a r — e n e r g i a — p o r e l c o n t r a r i o , e x i g e n una f u e n t e a d i c i o n a l — son l e n t o s , en muchos c a s o s p a r e c e n n e c e s i t a r de l a p r e s e n - c i a de un a n a l o g o e s t r u c t u r a l b i o d e g r a d a b l e de l a m o l e c u l e i r n p l i c a d a y , p o r l o g e n e r a l , no p a r e c e n c o n d u c i r a f r a g m e n - t a c i o n e s d e m as i a d o e n e r g i c a s de d s t a , Desde e l p u n t o de v i s t a do su c o n t r i b u c i d n a l o s c i - c l o s b i o q u f m i c o s , es l a t e r c e r a s i t u a c i d n a n t e s d e f i n i d a — ( 6 2 ) l a que c o n s t i t u y e e l caso de mayor r e l e v a n c i a . Es c o n - v e n i e n t e , no o b t a n t e , t e n e r p r e s e n t s que n u m o r o s a s r e a c c i o - n es c o n j u g a t i v a s — l a s c u a l e s deben i n c l u i r s e en e s t e a p a r - t a d o _ t ampoco s i g n i f i c a n l a e l i m i n a c i o n d e f i n i t i v a de una e s t r u c t u r a t o x i c a . Po r med i o de l a c o n j u g a c i d n d e l x e n o b i o - t i c o i n t a c t o o l i g e r a m e n t e a l t e r a d o con un c o m p u e s t o e n d o g ^ no ( h i d r a t o s de c a r b o n o como e l a c i d o g l u c u r t S n i c o o a m i n o - a c i d o s o p e p t i d o s como e l g l u t a t i o n ) l a e n t i d a d b i o l o g i c a - que l l e v a a cabo e l p r o c e s s e l e v a l a h i ç j r o f i l i a d e l c o n j u - g a n t e e x d g e n o , f a c i l i t a n d o su e l i m i n a c i o n , P er o u l t e r i o r m s j n t e l a c o n j u g a c i d n puede d e s t r u i r s e con l o c u a l se pone de - 20 nuGvo en m o v i m i e n t o l a p r i m i t i v a e s t r u c t u r a . P o r o t r a p a r t e , es é v i d e n t e que a l t r a t a r s e d e l m e t a b £ l i s m o de c o m p u e s t o s c u y a e s t r u c t u r a no se da en l a n a t u r a l _ e z a , l a s e n z i m a s i m p l i c a d a s en t a i e s p r o c e s o s son en muchos c a s o s i n d u c i d a s . T a i e s e n z i m a s ( a u n q u e en o c a s i o n e s su deno mi na c i (5 n s u g i e r e su " n o v e d a d " , como o c u r r e en e l caso de l a DOT - a sa ) s o n , p o r l o comun, l a s mi smas que c a t a l i z a n p r o c e S O S m e t a b d l i c o s g é n é r a l e s , A s i m i s m o , l a s t r a n s f o r m a c i o n e s - que l o s x e n o b i d t i c o s e x p e r i m e n t a n b a j o su c a t a l i s i s s u e l e n a j u s t a r s e a m o d e l o s b i o q u f m i c o s que t a m b i é n se dan en e l m£ t a b o l i s m o de c o m p u e s t o s e n d d g e n o s , Con t o d o , y e l l e c o n s t i t u y e uno do l o s mas i m p o r t a n t e s p r o b l e m a s que t i e n e n p l a n t e a d o s l o s e s t u d i o s a m b i e n t a l e s a n i v e l b i o q u f m i c o , es p o s i b l e que e l m a n t e n i m i e n t o de e s t e - t i p o do p r o c e s o s c o m p o r t e d e s c o m p e n s a c i o n e s m e t a b d l i c a s o - d e s e q u i l i b r i o s e n z i m a t i c o s quo l l e v e n t a m b i é n a l a m e n c i o n a da s i t u a c i d n b2 a c o n s t i t u i r un a f o r m a mâs do a l t e r a c i d n de l a d i n a m i c a b i o q u f m i c a de l a b i o s f e r a . En l i n e a s g é n é r a l e s , e l m é t a b o l i s m e de l o s c o m p u e s t o s x e n o b i d t i c o s t i e n s l u g a r a t r a v é s de c u a t r o t i p o s de p r o c e ­ sos b a s i c o s : o x i d a c i o n e s , r e d u c c i o n e s , h i d r d l i s i s y c o n j u g a c i o n e s , cuy o r e s u l t a d o no s i e m p r e i m p l i c a una d e t o x i f i c a - c i d n , A menudo l a s t r a n s f o r m a c i o n e s de l o s t r è s p r i m e r o s t_i p o s , que s u e l e n t e n d e r a e l e v a r l a h i d r o f i l i a , p r e p a r a n a - l a m o l ê c u l a e x t r a n a p a r a l a c o n j u g a c i d n con un c o m p o n e n t s - endogeno de l a e n t i d a d b i o l d g i c a t r a n s f o r m a d o r a . L a s o x i d a c i o n e s c o n s t i t u y e n t a l vez e l p r o c e s o mas g e - 21 n a r a l i z a d o y , desde l u e g o , e l mas i n v e s t i g a d o . De l a s c u a ­ t r o c a t e g o r f a s en que se s u e l e n c l a s i f i c a r l a s e n z i m a s i m ­ p l i c a d a s en r e a c c i o n e s o x i d a t i v a s — d e s h i d r o g e n a s a s , o x i d a - s a s , d i o x i g e n a s a s y m o n o o x i g e n a s a s — son e s t a s u l t i m a s l a s q u e , d es de e l p u n t o de v i s t a d e l m é t a b o l i s m e de c o m p u e s t o s x e n o b i d t i c o s , p r e s e n t a n un mayor i n t e r e s . L a s m o n o o x i g e n a s a s se c a r a c t e r i z a n p o r p a r t i c i p e r en - p r o c e s o s en l o s que uno de l o s a t o me s d e l o x f g e n o m o l e c u l a r se t r a s f i e r e a l s u s t r a t o , an t a n t o que e l o t r o es r e d u c i d o a agua p o r i n t e r m e d i a de un c o f a c t o r que a c t u a como t r a n s - p o r t a d o r de e l e c t r o n e s . Es p r e c i s a m e n t e su p a p a l , en p a r t e s i m i l a r a l de l a s o x i d a s a s — en c uy o caso se r e d u c e n a agua ambos a to mo s d e l o x f g e n o m o l e c u l a r —, l o que l e s v a l e su — f r e c u e n t e d e n o m i n a c i d n de " o x i d a s a s de f u n c i d n m i x t a " ( O . F . M , ) . También se c o noc en como h i d r o x i l a s a s , y a q u e , p o r l o comun, e l s u s t r a t o c; y a t r a n s f o r m a c i d n c a t a l i z a n q ueda - h i d r o x i l a d o , b i e n de f o r m a d e f i n i t i v a o t r a n s i t o r i a # P o r su l o c a l i z a c i d n p r e f e r e n t e , a n i v e l c e l u l a r , en e l r e t f c u l o eri d o p l a s m i c o l i s o , se l l a m a n a v o c e s e n z i m a s m i c r o s d m i c a s y , f i n a l m e n t e , en l a l i t e r a t u r a a n g l o s a j o n a , p a r t i c u l a r m e n t e - en l a b i b l i o g r a f i a t o x i c o l d g i c a , se a l u d e a a l i a s como -------- " d r u g m e t a b o l i z i n g e n z y m e s " , nombre i n d i c a t i v e de l a s c a u ­ sas p o r l a s quo se l e s p r e s t a r a a t e n c i d n en e s t a m o m o r i a . Ademas de l a s p e c u l i a r i d a d e s que v i e n e n r e f l e j a d a s en l a v a r i a d a n o m e n c l a t u r a de l a s O . F . M . , uno da sus a s p e c t o s mas d e s t a c a b l e s , a l menos en l o s m a m i f e r o s , c o n s i s t e en su v i n c u l a c i d n a u na ca de na de t r a n s p o r t e e i e c t r d n i c o ( f i g . 4) c u yo u l t i m o e s l a b d n , r e s p o n s a b l e a l p a r e c e r de l a a c t i v a - c i d n d e l o x f g e n o m o l e c u l a r y de l a t r a n s f e r e n c i a de un a t o - If) CMX ca CM CS OIf) oIf) fO CM JC x: o X cc oIf) O O P 03 u d o 8d, 03 O d P o d o d B O r4 d 1 k 0) d Q> ' • fco bo •H *» P4 d 'H A o k A 23 mo de e s t e a l s u s t r a t o , es e l c i t o c r o m o P - 4 5 0 . E s t e c i t o c r £ mo es s u s c e p t i b l e de f o r m a r , cuando se e n c u e n t r a en e s t a d o r e d u c i d o , c o m p l e j o s i n s c t i v o s con e l m o n o x i d o de c a r b o n o , - que m u e s t r a n una f u e r t e a b s o r c i d n a 450 nm ( p r o p i e d a d en l a que se b a s a su i d e n t i f i c a c i o n e s p e c t r o s c o p i c a ) y que puer ien r e a c t i v a r s e p o r i r r a d i a c i d n a d i c h a l o n g i t u d de o n d a , También en b ase a d a t o s f i s i o l o g i c o s o b t e n i d o s f u n d a - m e n t a l m e n t e en e s t u d i o s l l e v a d o s a cabo con m a m f f e r o s , se - ha d e m o s t r a d o l a a m p l i a p a r t i c i p a c i é n de l a s O . F . M , en e l - m é t a b o l i s m e de l o s l i p i d o s , e s p e c i a l m e n t e de l o s e s t e r o i d e s , a c t i v i d a d que se l o c a l i z a muy p r e f e r e n t e m e n t e en e l h i g a d o y en l a c o r t e z a de l a s g l l n d u l a s s u p r a r e n a l e s . P e r o m i e n - t r a s que l a s O . F . M . d e l c é r t e x a d r e n a l — que se han l o c a l i - zado t a n t o en m i c r o s o m a s como en m i t o c o n d r i a s — p a r e c e n e n - c o n t r a r s e muy e s p e c i f i c a m e n t e i m p l i c a d a s en e l m e t a b o l i s m o de l a s h o r mo ne s e s t e r o f d i c a s , l a s O . F . M . h e p a t i c a s — l o c a l _ i z a d a s e x c l u s i v a m e n t e en l a f r a c c i d n m i c r o s é m i c a de l o s hep_a t o c i t o s —, ademas de l l e v a r a cabo l a d e g r a d a c i é n de l o s - e s t e r o i d e s e n d é g e n o s , c a t a l i z a n d o s e c u e n c i a s e a c t i v a s e s^ e c i f i c a s , i n t e r v i e n e n a c t i v a m e n t e en e l m e t a b o l i s m o de un — g r a n numéro de c o m p u e s t o s e x t r a M o s , c a s o s en l o s c u a l e s l a s p o s i c i o n e s s o b r e l a s que i n c i d e n l a s t r a n s f o r m a c i o n e s s u e ­ l e n s e r poco e s p e c f f i c a s . P o r muy d i v e r s e s p r o c e d i m i e n t o s , e n t r e l o s que se cuej i t a n l a d e t e r m i n a c i é n de l o s n i v e l e s de c i t o c r o m o P - 4 5 0 , l a v e l o c i d a d de c i e r t a s r e a c c i o n e s t i p i c a s — como l a h i d r o x i l a . c i o n de l a a n i l i n a y p e n t o b a r b i t a l , l a d e s m e t i l a c i o n de l a m e t i l a n i l i n a, e t c . — de l a s que se c o n o c e su c a t a l i s i s p o r 2 b d r a s a c a r b é n i c a ( a n z i m a r e s p o n s a b l e de l a l i b e r a c i d n de caJL c i o a n i v e l de o v i d u c t o en e l raomento de l a p u a s t a ) , i n h i b c i d n que s d l o se pudo p r o b a r en e l caso d e l DDE. E l p r o b l e ­ ms e s e n c i a l c o n s i s t e en l a s e s c a s a s p r o p o r c i o n e s de c a l c i c - q u e , ya d esde l a s p r i m e r a s f a s e s d e l c i c l o r e p r o d u c t o r , se d e p o s i t a n en l a m é d u l a d s e a de l a s aves a f e c t a d a s * D i c h o d ^ p d s i t o , que on c o n d i c i o n e s n o r m a l e s se m o v i l i z a en e l momen t o de l a p u e s t a , v i e n s c o n t r o l a d o p o r e l n i v e l de e s t r d g e - n o s c i r c u l a n t e s , y h a b i é n d o s e c omp ro ba do que t a l n i v e l es - muy i n f e r i o r a l n o r m a l en hembras d o s i f i c a d a s con d i v e r s o s i n s e c t i c i d a s o r g a n o c l o r a d o s y PCBs, t o d o i n d i c a que es l a s f n t e s i s i n d u c i d a de O . F . M . l o q u e , a l a c e l e r a r l a d é g r a d a c i o n de l o s e s t r o g a n o s , a l t e r a l a t o t a l i d a d de l o s p a s o a — s u b s i g u i e n t e s d e l m e t a b o l i s m o d e l c a l c i o . Es de l a m e n t e r que, p o r e l moment o, l o s c o n o c i m i e n t o s que se p o s e e n s o b r e e s t e t i p o de i n t e r f e r e n c i a s en e n t i d a - des b i o l é g i c a s d i s t i n t a s de l o s m a m f f e r o s y de l a s a v e s , — r e s u l t e n mucho mas l i m i t a d o s , a s f como n o t a b l e m e n t e i n c o n e - x o s . I n t e r e s a , no o b t a n t e , d e s t a c a r que se han e n c o n t r a d o i n d i c i o s — aunque no s i e m p r e d i r e c t o s — de l a i n d u c c i é n d e l c i t o c r o m o P -4 5 0 en i n s e c t o s b a j o l a a c c i d n de i n s e c t i c i d a s ( R a y , 1 9 6 7 ; B r o o k s y H a r r i s o n , 1 9 6 9 ; Hodgson e t a l . , 1 97 4 ) y de su p r e s e n c i a , con f u n c i o n e s a n â l o g a s a l a s que asume - en a n i m a l e s s u p e r i o r e s , en b a c t e r i a s ( K a t a g i r i e t a l . , 1 9 6 8 ) . De o t r o l a d o , e l p a r a l e l i s m o e x i s t a n t e e n t r e l a b i o s f n t e s i s de l a s h o r m on a s g i b e r e l f n i c a s en l o s v e g e t a l e s y l a s e s t e — r o f d i c a s en l o s m a m f f e r o s , se p r e s t a a s o s p e c h a r a n a l o g f a s en l o s m é c a n i s m e s d e t o x i f i c a n t e s a ambos n i v e l e s , aunq ue — p o r e l l o , p o r e l momento, sea u n i c a m e n t e m o t i v o de e s p e c u l a c i o n . 26 F i n a l m e n t e , cabe m e n c i o n a r q u e , en m a m f f e r o s , se ha m o s t r a d o que l a s n i t r o y a z o r e d u c c i o n e s que d e t e r m i n a d o s xje n o b i o t i c o s e x p e r i m e n t a n b a j o a c c i é n m e t a b d l i c a , quedan i n hi. b i d a s p o r l a p r e s e n c i a da m o n d x i d o de c a r b o n o , E l l o s u g i e ­ r e l a i m p l i c a t i o n d e l c i t o c r o m o P - 4 5 0 t a m b i é n f u e r a d e l me- t a b ü l i s m o o x i d a t i v o , l o c u a l s u p o n d r f a un a n o t a b l e g e n e r a l l y z a c i o n de s u s a c t i v i d a d e s d e t o x i f i c a n t e s , con l a s c o n s e c u e n c i a s que e l l o c o m p o r t a r i a a n i v e l de i m p i i c a c i o n e s de l a — r e s p u e s t a de l o s s e r e s v i v o s a l o s c o m p u e s t o s x e n o b i d t i c o s . Es de e s p e r a r que en l o s p r d x i m o s aPios, n u e v o s e s t u ­ d i o s en t o r n o a e s t e s temas c o n t r i b u y a n a l a c l a r i f i c a c i o n de l o s c o n o c i m i e n t o s , hoy s d l o e m b r i o n a r i o s , que en l a a c - t u a l i d a d p a r e c e n c o m en za r a c o n f i g u r a i e l campo de l a t o x i - c o l o g f a a r n b i e n t a l . l y - BIFENILOS POLICLORADOS ( P C B s ) . 1 . - CARACTERISTI - CAS F I S I C A S , QUIMtCAS Y TFCNICAS. L o s PCBs c o n s t i t u y e n una i n m a n s a f a m i l i a de c o m p u e s t o s _ c u y a m o l e c u l a p uede c o n t e n e r d esde una h a s t a l a s d i e z c l £ r o s u s t i t u c i o n e s que su e s t r u c t u r a p e r m i t s — c a r a c t a r i z a d a p o r su n o t a b l e e s t a b i l i d a d q u f m i c a . Son i n e r t e s , no o x i d a n - t e s , no c o r r o e n l o s m e t a l e s y r e s i s t e d e l t r a t a m i e n t o con a c i d o s , a l c a l i s y a g e n t e s c o r r o s i v o s . I n s o l u b l e s — a l menos a e f e c t o s p r a c t i c e s — en agua y s o l u b l e s en n u m e r o s o s d i s o j ^ v e n t e s o r g â n i c o s , su e s t a d o v a r i a d e s de e l l i q u i d e a l s d l i - d o , p a s a n do p o r d i v e r s e s g r a d o s de c o n s i s t e n c i a r e s i n o s a , a m a d i d a que se e l e v a e l numéro de c l o r o s u s t i t u c i o n e s * I n a l t ^ r â b l e s a l a c a l e f a c c i d n p r o l o n g a d a a 150 2 C, son t e r m o p l a s - t i c o s e s c a s a m e n t e v o l a t i l e s , d e s t i l a n s i n d e s c o m p o s i c i o n , - no m a n t i e n e n l a c o m b u s t i o n a t e m p e r a t u r a s i n f e r i o r e s a 360 2 C — c o m u n i c a n d o p r o p i e d a d e s r e t a r d a t o r i a s de l a c o t n b u s t i - b i l i d a d a o t r o s m a t e r i a l e s — y , e l é c t r i c a m e n t e , se c o m p o r ­ t é e como no c o n d u c t o r e s . C o m o q u i e r a que l a i n t e n s i d a d con que se m a n i f i e s t a n t £ das l a s a n t e r i o r e s p r o p i e d a d e s es f u n c i d n d e l numéro y p o s ^ c i d n de l a s c l o r o s u s t i t u c i o n e s , v a r i a b l e s que p ueden r e c o - r r e r un a m p l i o i n t e r v a l s , l a u t i l i z a c i d n de m e z c l a s de PCBs de d i f e r e n t e c o n t e n i d o en c l o r o p e r m i t s g r a d u a r con f a c i l i - dad t a i e s p r o p i e d a d e s y o b t e n e r d i v e r s e s c o m b i n a c i o n e s de - l a s m i s m a s . L o s PCBs c o n s t i t u y e n , p o r e l l o , a p a r t é de l o s - c a s o s en que se u t i l i z a n en f o r m a " p u r a " , a d i t i v o s de e l e c - 28 c i d n p a r a n u m e r o s o s m a t e r i a l e s de muy d i v e r s e s a p l i c a c i o - n e s . E n t r e sus m u l t i p l e s u s o s , caben d e s t a c a r l o s d e s a r r o - l l a d o s en l o s s i g u i e n t e s s e c t o r e s : a) Como l u b r i f i c a n t e s en s i s t e m a s de a l t o v a c i o o e l e - v a d a p r a s i d n . Como f l u i d o s h i d r a u l i c o s y de i n t e r c a m b i o t e j r m i c o . Como a n t i e s t a t i c o s y a i s l a n t e s en l a i n d u s t r i a e l e c - t r o t o c n i c a . Como a n t i i n f l a m a b l e s , p a r t i c u l a r m e n t e en l a i n ­ d u s t r i a de l a c e l u l o s a y pap e l . Como i m p e r m e a b i l i z a n t e s , ari t i h u m e c t a n t e s y a g e n t e s a n t i c o r r o s i v o s . b) Como a d i t i v o s en l a i n d u s t r i a de l o s m a t e r i a l e s sin^ t e t i c o s , donde a c t u a n como p l a s t i f i c a n t e s y f o r m a n p a r t e da gomas, c e r a s , r é s i n a s , m a s i l l a s , m a t e r i a l e s a s f a l t i c o s , l a ­ c e s , b a r n i c o s , p i n t u r a s , t i n t a s p e r m a n e n t e s y de i m p r i m i r , m e z c l a s g r a f i t a d a s p a r a e l p a p e l c a r b o n , p a p e l e s p a r a c o ­ p i a s t e r m o g r a f i c a s , p a p e l de f i b r a de v i d r i o , p a p e l da c e l o f a n , p o l i a m i d a s , espuma de p o l i u r e t a n o , c l o r u r o de p o l i v i n i ^ l o , a d h e s i v o s , e t c . c) Como a d i t i v o s en d i v e r s a s f o r m u l a c i o n e s p l a g u i c i d a s , f u n d a m e n t a l m e n t e de DDT y l i n d a n o , p e r o t a m b i é n de o t r o s , - i n c l u s o i n s e c t i c i d e s o r g a n o f o s f o r a d o s , donde p u ed en desemp£ n a r e l t r i p l e p a p e l de d i s p e r s a n t e s d e l p r i n c i p l e a c t i v o , - e s t a b i l i z a d o r e s que d i l a t e n su v i d a m e d i a r e s i d u a l o a g e n ­ t e s s i n é r g i c o s que p o t e n c i e n su a c t i v i d a d . L o s PCBs no se c o m e r c i a l i z a n como c o m p u e s t o s p u r o s , s_i no como m e z c l a s en l a s que i n t e r v i e n e n no s o l o i s o m e r o s con e l mismo c o n t e n i d o en c l o r o , s i n o t a m b i é n b i f e n i l o s de d i s - t i n t o g r a d o de c l o r a c i o n . V a r i a s f i r m a s c o m e r c i a l e s han r e - 28 c i o n p a r a n u m e r o s o s m a t e r i a l e s de muy d i v e r s a s a p l i c a c i o - n e s . E n t r e sus m u l t i p l e s u s o s , caben d e s t a c a r l o s d e s a r r o - l l a d o s en l o s s i g u i e n t e s s e c t o r e s : a) Como l u b r i f i c a n t e s en s i s t e m a s de a l t o v a c i o o e l e - v a da p r a s i d n . Como f l u i d o s h i d r a u l i c o s y de i n t e r c a m b i o t e £ m i c o . Como a n t i e s t a t i c o s y a i s l a n t e s en l a i n d u s t r i a e l e c - t r o t o c n i c a . Como a n t i i n f l a m a b l e s , p a r t i c u l a r m e n t e en l a i n ­ d u s t r i a de l a c e l u l o s a y p a p e l . Como i m p e r m e a b i l i z a n t e s , an̂ t i h u m e c t a n t e s y a g e n t e s a n t i c o r r o s i v o s . b) Como a d i t i v o s en l a i n d u s t r i a de l o s m a t e r i a l e s s i ^ t e t i c o s , donde a c t u a n como p l a s t i f i c a n t e s y f o r m a n p a r t e do gomas, c e r a s , r é s i n a s , m a s i l l a s , m a t e r i a l e s a s f a l t i c o s , l a ­ c a s , b a r n i c o s , p i n t u r a s , t i n t a s p e r m a n e n t e s y de i m p r i m i r , m e z c l a s g r a f i t a d a s p a r a e l p a p e l c a r b o n , p a p e l e s p a r a c o ­ p i a s t e r m o g r a f i c a s , p a p e l de f i b r a de v i d r i o , p a p e l da celo^ f a n , p o l i a m i d a s , espuma de p o l i u r e t a n o , c l o r u r o de p o l i v i n i ^ l o , a d h e s i v o s , e t c . c) Como a d i t i v o s en d i v e r s a s f o r m u l a c i o n e s p l a g u i c i d a s , f u n d a m e n t a l m e n t e de DDT y l i n d a n o , p e r o t a m b i é n de o t r o s , - i n c l u s o i n s e c t i c i d e s o r g a n o f o s f o r a d o s , donde p u ed en d es emp^ n a r e l t r i p l e p a p e l de d i s p e r s a n t e s d e l p r i n c i p i o a c t i v o , - e s t a b i l i z a d o r e s que d i l a t e n su v i d a m e d i a r e s i d u a l o a g e n ­ t e s s i n é r g i c o s que p o t e n c i e n su a c t i v i d a d . L o s PCBs no se c o m e r c i a l i z a n como c o m p u e s t o s p u r o s , s ^ no como m e z c l a s en l a s que i n t e r v i e n e n no s o l o i s o m e r o s con e l mismo c o n t e n i d o en c l o r e , s i n o t a m b i é n b i f e n i l o s de d i s - t i n t o g r a d e de c l o r a c i o n . V a r i a s f i r m a s c o m e r c i a l e s han r e - 29 g i s t r a d o , p a r a l a s m e z c l a s de PCBs de su p r o d u c c i o n , d i s t i n t a s d e n o m i n a c i o n e s , en l a s que una c l a v e n u m é r i s a convenc i o_ n a l que se anada a un nombre a r b i t r a r i o , i n d i c a l a p r o p e r - c i o n m e d i a de c l o r o c o n t e n i d a en l a m e z c l a . E s t e p r o c é d e r - no r e s p o n d s a o t r a r e a l i d a d que l a m e r c a n t i l , y a s f , p o r — e j e m p l o , A r o c l o r - 1 2 6 0 , P h e n o c h l o r - D P 6 , C l o p h e n - A 6ü y K a n e - c h l o r - K C 6 0 0 son m e z c l a s de b i f e n i l o s con un 50% de c l o r a - c i é n , f o r m a d a s e s e n c i a l m e n t e p o r l o s mismos c o m p o n e n t e s y c o m e r c i a l i z a d a s p o r l a s e n t i d a d e s M o n s a n t o ( Can ad a y E.E# U * U . ) , P r o d e l e c ( F r a n c i a ) ) , B a y e r ( S u i z a ) y K a n e g a f u c h i ( J a ­ p o n ) , r e s p B C t i v a m e n t e . A l o l a r g o de e s t e t r a b a j o se han u t i l i z a d o l a s m e z -- c l a s d e s i g n a d a s como A ( r o c l o r ) - 1 2 3 2 , A - 1 2 4 2 , A - 1 2 4 8 , A - 1 2 5 4 y A - 1 2 6 0 . L o s dos u l t i m e s d f g i t o s de l a c l a v e n u m é r i c a i n d i ^ can e l c o n t e n i d o med i o on c l o r o de c a d a m o z c l a , en u n i d a d e s p o r c e n t u a l e s ( e s d e c i r 32 , 4 2 , 4 8 , 54 y 60 % r e s p e c t i v a m e n t e . No t o d o s l o s PCBs t e o r i c a m e n t e p o s i b l e s p a r t i c i p a n — - i g u a l m e n t e en l a c o m p o s i c i o n de l a s m e z c l a s c o m e r c i a l e s . Es c l a r o que e l numéro de l o s t e o r i c a m e n t e p o s i b l e s se o b t i e n s e f e c t u a n d o t o d a s l a s c o m b i n a c i o n e s q u f m i c a m e n t e d i - f e r e n t e s que p e r m i t e n dos a n i l l o s b e n c ê n i c o s que pueden con^ t e n e r h a s t a 5 a tomos de c l o r o cada u n o . Cada a n i l l o , en e s ­ t a s c o r c u n s t a n c i a s , p e r m i t s 20 c o m b i n a c i o n e s ( t a b l a I I ) y , en l a c o m b i n a c i o n de dos a n i l l o s , cabe c o n s i d é r e r dos c a ­ so s : a) I g u a l numéro de a tomos de c l o r o en ambos a n i l l o s : s i e n d o ri e l numéro de i s o m e r o s que pu ed en f o r m a r s e a p a r t i r 30 T a b l a I I - Numéro de n - c l o r o b e n c e n o s p o s i b l e s (n e n t r e 0 y 5 ) . N G de at . C l / a n i l l o N9 de i somer . C l o r o s u s t i t u c i o n e s 0 1 1 3 2 / 3 / 4 . 2 6 2 , 3 / 2 , 4 / 2 , 5 / 2 , 6 / 3 , 4 / 3 , 5 3 6 2 , 3 , 4 / 2 , 3 , 5 / 2 , 3 , 6 / 2 , 4 , 5 / 2 , 4 , 6 / 3 , 4 , 5 . 4 3 2 , 3 , 4 , 5 / 2 , 3 , 4 , 6 / 2 , 3 , 5 , 6 . 5 1 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . de l a s c l o r o s u s t i t u c i o n e s de cada a n i l l o , y t e n i e n d o en *----- c u e n t a l a s r e d u n d a n c i e s que se p r o d u c e n a l s e r é q u i v a l e n t e s ambos a n i l l o s , e l numéro de PCBs p o s i b l e s en e s t e caso es : ^ 1 ^ ^ ( n —l ) 4* ( n ^ 2 ) 4 ——— 4 1 = ' ^ b ) D i f e r e n t e numéro de a tomos de c l o r o en c ad a a n i l l o : s i e n d o n^ e l numéro de i s o m e r o s que p e r m i t e n l a s c l o r o s u s t i ^ t u c i o n e s que c o n t i e n s e l a n i l l o A y ng l o s i s o m e r o s c o r r e s - p o n d i e n t e s a l a n i l l o B, e l numéro de PCBs en e s t e caso e s , s i m p l e m e n t e : ^ 2 = " A " " a A SI p u es e l numéro t o t a l de PCBs p o s i b l e s e s , segun se d e t a l l a en l a t a b l a I I I , de 2 09 , De e l l e s , l o s mas u s u a l e s a n i v e l i n d u s t r i a l son l o s que p os ee n un g r a d o de c l o r a c i o n c o r r e s p o n d i e n t e a una m e d i a de 5 a tomos de c l o r o p o r m o l é c u 31 T a b l a I I I - NS t o t a l de PCBs p o s i b l e s ( l o s e n c e r r a d o s en d o b l e c u a d r i c u l a c o r r e s p o n d e n a l a s m o l é c u l a s mas u s u a ­ l e s ) . n2 de Cl en anillo ) 0 1 2 3 4 5 m 0 1 3 6 6 3 1 jO 1 6 18 18 9 3 cOJ c 2 21 36 18 6 Ûf Ü .3 [21 18 6 a> X) A 6 3 c 5 1 l a ( e s d e c i r , un 5 8 , 6 % como t é r m i n o m e d i o ) , Mas r a r a s son - l a s m o l é c u l a s que c o n t i e n e n menos de c u a t r o o mas da o cho a t o m o s de c l o r o , l i m i t e s e n t r e l o s c u a l e s , p o r o t r a p a r t e , l a s e s t r u c t u r a s mas p r o b a b l e s ( J e n s e n , 1968) son a q u e l l a s - en l a s que l a d i f e r e n c i a e n t r e e l numéro de a tomos de c l o r o en c a d a a n i l l o no e x c e da l a u n i d a d . En e s t e caso se e n c u e n - t r a n l a s 102 e s t r u c t u r a s e n c e r r a d a s p o r l a d o b l e c u a d r f c u l a , en l a t a b l a I I I , y q u e , p o r c o n s i g u i e n t e , s e r a n l a s de ma­ y o r i n t e r é s en c u a n t o a l o que su p r o b l e m a t i c s a r n b i e n t a l se r e f i e r e . V - BIFENILOS POLICLORADOS, 2 , - ASPECTOS ESTRUCTURALES SUSCEPTIBLES DE AFECTAR SU DINAMICA BIÜQUIMICA, PRCBLEMATI- CA TOXICOLDGICA Y AMBIENTAL, Es c l a r o que l a d i n a m i c a b i o q u i m i c a de l o s PCBs — como l a de c u a l q u i o r o t r o t i p o de c o m p u e s t o s x e n o b i o t i c o s — s e r a u n a r é s u l t a n t s de su p e n e t r a b i l i d a d a t r a v é s de l a s rnembra- n a s b i o l o g i c a s , de l a n a t u r a l eza de l a s i n t e r f e r e n c i a s que p r o v o q u é e y l a s r e s p u e s t a s que d e t e r m i n e n en l o s s e r e s v i ­ v o s y de su s u s c e p t i b i l i d a d a l a t a q u e de l o s s i s t e m a s e n z i ­ m a t i c o s de que a q u e l l o s d i s p o n e n , N i n g u n o de e s t o s a s p e c t o s se e n c u e n t r a , h a s t a e l momen t o , l o s u f i c i e n t e m e n t e p o r m e n o r i z a d o como p a r a p e r r n i t i r ------ u n a s g o n e r a l i z a c i o n e s c o n v i n c e n t e s en t o r n o a l p r o b l e m s de l a s c o r r e l a c i o n es e s t r u c t u r a q u f m i c a - a c t i v i d a d b i o l d g i c a - - b i o d e g r a d a b i l i d a d en e s t e t i p o da c o m p u e s t o s . Es f r e c u e n t e a t r i b u i r e s t a c a r e n c i a , a s i como l a e s c a - sa c o h e r e n c i a de l o s d a t o s t o x i c o l d g i c o s d i s p o n i b l e s , a l a s d i f i c u l t a d e s que p l a n t e a e l no t r a b a j a r con c o m p u e s t o s pu - r o s , s i n o con m e z c l a s de a n a l o g o s e s t r u c t u r a l e s , E l mismo - h e c h o , s i n e m b a r g o , de que l a m a y o r i a de l o s t r a b a j o s en e s ­ t e campo G s t é n s i e n d o l l e v a d o s a cabo con t a i e s l i m i t a c i o - n e s , h a r t o c o n o c i d a s , p a r e c e i n d i c a r que es e l p l a n t e a m i e n - t o de b as e de e s t o s e s t u d i o s l o que no se l l e v a a l a s c o o r - d e n a d a s a p a r e n t e m e n t e mâs c o n v e n i e n t e s p a r a a c c é d e r a l a aji t e r i o r c a t e g o r i a de r e s u l t a d o s . 33 C a b r i a a M a d i r , p o r o t r a p a r t e - y e s t e e s , t a l v e z , e l f a c t o r mâs i m p o r t a n t e - que l a s f o r m a s de t o x i c i d a d a s o c i a - das a l o s PCBs r e s u l t a n , en c u a l q u i e r c a s o , b a s t a n t e d i f u - s a s . No s o n , an e f e c t o , d i r e c t a n i e x c l u s i v a m e n t e v i n c u l a - b l e s a l a i n t e n s a i n h i b i c i d n de n i n g u n a e n z im a c o n o c i d a , n i a l b l o q u e o d r a s t i c o da a l g u n paso m e t a b d l i c o c o n c r e t e , l o - c u a l n os a p a r t a de l a s c a s u f s t i c a s t o x i c o l d g i c a s mas ” c las_ i c a s ” . Y c o n v e n d r f a t e n e r p r e s e n t s que en e l e j e m p l o , c e r c a - n o , de l o s i n s e c t i c i d a s d r g a n o c l o r a d o s - e n t r e l o s c u a l e s - se e n c u e n t r a n e s t r u c t u r a s como l a de l o s c l o r o d i f e n i l e t a n o s , e m p a r e n t a d a s con l o s PCBs - tampoco se ha l l e g a d o p o r e l m£ m e n t o , p e so a l a s n u m e r o s a s a p r o x i m a c i o n e s " o r t o d o x a s ” a l - t e m a , a una e x p l i c a c l d n c o n c r e t e y s a t i s f a c t o r i a de su a c t i v i d a d b i o l d g i c a . Con t o d o , es p o s i b l e e l a b o r a r una s o r i e de c o n j e t u r a s en r e l a c i d n con l o s PCBs q ue , cuando menos, no d e j a n de prje s e n t a r v a l i d e z como h i p d t e s i s de t r a b a j o . En p r i m e r l u g a r , es en t e o r i a p e r f e e t a m e n t e a c e p t a b l e que l a p e n e t r a b i l i d a d , f u n c i d n de l a l i p o f i l i a de l a m o l ec u l a p é n é t r a n t s , a u m e n t a r a con e l numéro de c l o r o s u s t i t u c i o ­ n e s . E l tamaMo m o l e c u l a r de l o s PCBs no debe p e r m i t i r l a eri t r a d a en j u e g o de f a c t o r e s que m o d i f i q u e n e s t a s i t u a c i d n , y t amp oc o es I d g i c o e s p e r a r que l a h i p o t é t i c a i n t e r v e n c i d n de m é c a n i s m e s de t r a n s p o r t e a c t i v o l a a l t e r en s u s t a n c i a l m e n t e . Es p o s i b l e que l a c o r r e l a c i d n e n t r e b i o d e g r a d a b i l i d a d y g r a d o de c l o r a c i d n no r e s u i t e y a t a n d i r e c t s . E f e c t i v a m e r i t e , segun han s u g e r i d o S c h u l t e y A c k e r ( 1 9 7 4 ) , l a s u s c e p t i - 3 4 b i l i d a d de l o s PCBs a l a s a c c i o n e s m e t a b d l i c a s c a p a c e s de - d e q r a d a r - o p o n e r en d i s p o s i c i d n de d e g r a d a r - su m o l e c u l a , e x i g e n a l menos l a p r e s e n c i a de dos a tomos de c a r b o n o a d y a - c e n t e s i n s u s t i t u X d o s , h i p d t e s i s q u e , a l menos en r e l a c i d n - con a n i m a l e s s u p e r i o r e s , ha s i d o p a r c i a l m e n t e d e m o s t r a d a p o r J e n s e n y S u n d s t r b m ( 1 9 7 4 ) . En t a l c a s o , dos e s t r u c t u r a s t e t r a c l o r a d a s como l a I y l a I I de l a f i g . 5 p r é s e n t a i . f a n n o t a b l e s d i f e r e n c i a s en cuari t o a su b i o d e g r a d a b i l i d a d , ya que m i e n t r a s l a p r i m e r a o f r e c e c u a t r o p o s i b l e s p u n t o s de a t a q u e , l a se gun da no o f r e c e n i n ­ g u n o . I n c l u s o o c u r r i r f a que e s t r u c t u r a s t e t r a c l o r a d a s c o m o - l a I I r e s u l t a r f a n mâs r e s i s t e n t e s que o t r a s p e n t a - h e x a - y h e p t a c l o r a d a s ( I I I , I V , V y V I ) . Y q u i z â t a m b i é n que aun e s ­ t r u c t u r a s con e l mismo numéro de c l o r o s u s t i t u c i o n e s y p u n t o s de a t a q u e ( I I I y I V , p o r e j e m p l o ) m o s t r a s e n d i f e r e n t e g r a d o de v u l n e r a b i l i d a d d e b i d o a l a l o c a l i z a c i d n s o b r e e l mismo o d i f e r e n t e a n i l l o de t a i e s p u n t o s . F i n a l m e n t e , cabe r e f e r i r s e a l a p o s i b i l i d a d , no d e s c o - n o c i d a en o t r o s x e n o b i d t i c o s do e s t r u c t u r a mâs o menos r e l a - c i o n a d a , de que e l g r a d o de c o p l a n a r i d a d de l o s dos a n i l l o s a f e c t e l a a c t i v i d a d b i o l d g i c a de l a m o l é c u l a o / y su b i o d e ­ g r a d a b i l i d a d . De n u e v o , en t a l c a s o , l a p o s i c i d n r e l a t i v a de l a s c l o r o s u s t i t u c i o n e s p o d r f a j u g a r un p a p e l e s e n c i a l . En e f e c t o , es s a b i d o que l a m o l é c u l a de b i f e n i l o , c o - - p l a n a r en e l c r i s t a l p o r q u e e l e f e c t o de e m p a q u e t a m i e n t o se suma a l a t e n d e n c i a a l a c o p l a n a r i d a d p o r e l e f e c t o r é s o n a n ­ t e , en f a s e g a s e o s a e s t a b l e c e un c o mp ro mi s o e n t r e e s t a u l t i ­ ma t e n d e n c i a y l a s i n t e r a c c i o n e s e n t r e l o s h i d r d g e n o s en o r - Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl ' II III Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl IV F i g . 5 - I n f l u e n c i a d e l numéro y p o s i c i d n de l a s c l o ­ r o s u s t i t u c i o n e s en l a s u s c e p t i b i l i d a d de l o s PCBs a l a h i - d r o x i l a c i d n m i c r o s d m i c a . P a r a e x p l i c a c i d n , vé a se e l t e x t o . F i g , 6 - E n a n t i o m e r f a en b i f e n i l o s s u s t i t u f d o s . S i l o s o r t o s u s t i t u y en t e s son poco v o l u m i n o s o s , l a b a r r e r a de i n t e r ; c o n v e r s i o n de l o s en an t i d m e r o s es muy pequePia y ambas f o r ­ mas e s t a n en e q u i l i b r i a . S i son v o l u m i n o s o s , e l paso p o r l a c o p l a n a r i d a d e s t a r a i r n p e d i d o y no p o d r a t e n e r l u g a r l a i n - t e r c o n v e r s i d n . t o , que , mas c o r e a n o s e n t r e s f que l a suma de sus r a d i o s de van d e r U a a l s , t e n d e r f a n a p r o d u c i r un g i r o de 9 0 Q ( e l com­ p r o m i s o se r e s u e l v e on un g i r o de 4 2 9 ) . E v i d a n t e m e n t e , l a s u s t i t u c i d n de l o s h i d r d g e n o s on o r - t o p o r a t o mo s o g r u p o s mâs v o l u m i n o s o s e l e v a r f a e l g r a d o de i n t e r f e r e n c i a , p o r l o que, aun p r e s c i n d i e n d o d e l p a p e l que, en s o l u c i d n , j u g a r f a l a n a t u r a l e z a d e l d i s o l v e n t e , as c l a r o que en l o s PCBs y sus p o s i b l e s m e t a t a o l i t o s puede d a r s e t o - da una a m p l i a g r a d a c i o n en e l a n g u l o i n t e r a n u l a r , con e x i s - t e n c i a de f o r m a s e n a n t i o m e r i c a s mas o menos f a c i l m e n t e i n ­ t e r c o n v e r t i b l e s ( f i g . 6 ) , p r o b l e m a t i c s c uy a i n c i d e n c i a a - n i v e l de a c t i v i d a d b i o l d g i c a no ha s i d o t o d a v f a i n v e s t i g a - 3 7 da a d e c u a d a m e n t e * P e r o i n c l u s o a s p e c t o s mas ’’ c l â s i c o s * ’ de l a t o x i c o l o g f a de l o s PCBs p e rma ne ce n en l a a c t u a l i d a d c o n f u s e s , e x i s t i e n - d o , s o b r e muchos de e l l o s , r e f e r e n c i a s en e x t r e m o c o n t r a d i j c t o r i a s . En g e n e r a l , y aunque son e x t r e rn ad a me n t e e s c a s a s l a s ci^ t a s que p r o p o r c i o n a n v a l o r e s c o n c r e t e s p a r a l a s DL^ q , p a r e ­ ce a d m i t i d o que su t o x i c i d a d aguda es a l g o mâs b a j a que l a de l o s i n s e c t i c i d a s o r g a n o c l o r a d o s mâs u s u a l e s hace u n os - ahos ( y c u y a a p l i c a c i d n , hoy d f a , so e n c u e n t r a l e g a l m e n t e r e s t r i n g i d a en muchos p a f s e s ) , aunque p o r s e r muy n o t a b l e f r e n t e a p a c e s , c r u s t â c e o s y m o l u s c o s , es o b v i a su p e l i g r £ s i d a d como c o n t a m i n a n t e s a c u â t i c o s ( U i l d i s h , 1 970 ; Duke e t a l . , 1 9 70 ; Hanson e t a l . , 1 9 7 1 ) . Do o t r o l a d o , a l t r a t a r s e de t d x i c o s a c u m u l a t i v o s , es c l a r o que l o s a s p e c t o s rnâs r e ­ l e v a n t e s de su p r o b l e m â t i c a en e s t e s e n t i d o deben e n c o n t r a _ r se en e l e s t u d i o de l o s e f e c t o s d e b i d o s a e x p o s i c i o n e s c r o - n i c a s . En e s t e campo, p a r e c e f u e r a de t o d a d u d a , como y a se c o m e nt â en un c a p f t u l o p r e c e d e n t s , l a c o r r e l a c i d n e x i s t e n - t e e n t r e e l d e c a i m i e n t o de c i e r t a s p o b l a c i o n e s s i l v e s t r e s , en p a r t i c u l a r de a v e s , y sus n i v e l e s de PCBs en t e j i d o s , - p r o c e s o q u e , segun t o d a s l a s e v i d e n c i a s , t i e n e su o r i g e n en l a c a p a c i d a d de e s t o s x e n o b i d t i c o s p a r a l a i n d u c c i d n de en­ z i m a s m i c r o s d m i c a s , i n d u c c i d n que a s i m i s m o p a r e c e d e s e m p e - n a r un p a p e l d e s t a c a d o en l o s e f e c t o s c r d n i c o s de a q u e l l o s c o m p u e s t o s s o b r e l o s m a m f f e r o s ( S t r e e t e t a l . , 1 9 6 9 ) . 3 8 En e s t o s t r a b a j o s se e n c u e n t r a , p o r l o g e n e r a l , que l a i n t e n s i d a d d e l e f e c t o b i o l d g i c o aumen ta c o r r e l a t i v a m e n t e a l c o n t e n i d o med i o en c l o r o de l a m o z c l a de c o m p u e s t o s e n s a y a - d a , r e s u l t a d o s que c o n c u o r d a n con l o s de B i t m a n y C e c i l — • ( 1 9 7 0 ) an su e s t u d i o s o b r e l a a c t i v i d a d e s t r o g ê n i c a de una s e r i e de A r o c l o r s o b r e l a r a t a ; p e r o d i s c r e p a n de l o s o b t e - n i d o s en o t r o s d i v e r s o s e s t u d i o s ( L i c h t e n s t e i n e t a l . , 1973 ; S i v a l i n g a m e t a l . , 1973 y Haues e t a l , , 1 9 76 , e n t r e o t r o s ) . A s i m i s m o , aunque L i n c e r y P e a k a l l ( 1 9 7 0 ) e n c u e n t r a n - que e l i n c r e m e n t o en e l m e t a b o l i s m o d e l e s t r a d i o l p o r e f e c ­ t o de l o s PCBs c o r r e p a r o j o a l aumento do l o s n i v e l e s c i t o - p l â s r n i c o s de RNA, l o s r e s u l t a d o s de K e i l e t a l . ( 1 9 7 1 ) , auj i que en r e l a c i d n con o t r a s e n t i d a d e s b i o l d g i c a s - l o c u a l p£ d r f a e x p l i c a r e l d e s a c u e r d o - , m u e s t r a n como e l A r o c l o r - - 1 2 4 2 d é p r i m é s i g n i f i c a t i v a m e n t e l o s n i v e l e s r e l a t i v e s de - RNA. Con e l f i n de o b v i a r , a l menos en p a r t e , l o s p r o b J s - mas de e s t e c o n f u s o pano ra ma y no h a c e r a b s o l u t a m e n t e i nco m p a t i b l e s r e s u l t a d o s de e l e v a d a f i a b i l i d a d p e r o a p a r e n t e m e n ­ t e c o n t r a d i c t o r i e s , P e a k a l l y L i n c e r ( 1 9 7 0 ) han s u g e r i d o - ~ que m i e n t r a s l o s e f e c t o s l é t a l e s de l o s PCBs se e n c u e n t r a n i n v e r s ame n t e c o r r e l a c i o n a d o s con su c o n t e n i d o med io en c l o ­ r o , l o s e s f e c t o s s u b l e t a l e s l o e s t â n d i r e c t a m e n t e . Tampoco e s t a t e o r f a , s i n e mb ar g o , e x p l i c a s a t i s f a c t o r i a m e n t e l a t o ­ t a l i d a d de l a s c o n s t a t a c i o n e s e m p f r i c a s r e g o g i d a s h a s t a e l moment o , Cabe d e s t a c a r , en r e l a c i d n con l o s e f e c t o s p a t o l d g i - COS de l o s PCBs s o b r e a n i m a l e s s u p e r i o r e s - aves y m a m f f e - 39 r o s - q u e , aunque en ambos c a s o s se han e v i d e n c i a d o f e n d - menos de i n d u c c i d n a n z i m â t i c a mas o menos p a r a i e l o s , l o s - t r a s t o r n o s c o n c o m i t a n t e s , en l a s p r i m e r a s , se l o c a l i z a n pr_e f e r e n t e m e n t e en p e r i c a r d l o , r i r i d n y b a z o , m i e n t r a s que en l o s s e g u n d o s a f e c t a n muy p a r t i c u l a r m e n t e a l h i g a d o . De o t r o l a d o , e x i s t e n d i v e r s a s r e f e r e n c i a s r e l a t i v e s a c u a d r o s c l f - n i c o s de i n s u f i c i e n c i a h e p â t i c a , a t r o f i a d e l c d r t e x c e r e — b r a l y a n o m a l i e s e l e c t r o a n c e f a l o g r â f i c a s en p a c i e n t e s huma­ ne s que h a b i a n e x p e r i m e n t a d o e x p o s i c i o n e s c r d n i c a s a t a i e s c o m p u e s t o s . La c o r r e c t s e v a l u a c i d n t o x i c o l d g i c a de l o s PCBs t r o p i j e za f i n a l m e n t e con l a d i f i c u l t a d de que l a s m e z c l a s c o m e r c i ^ l e s u t i l i z a d a s en su e s t u d i o - ademas d e l p r o b l e m s , ya men- c i o n a d o , que r e p r e s e n t s e l s o l o l iecho de que se t r a t e de mez c l a s - p u ed e n c o n t e n e r t r a z a s de i m p u r e z a s ( u s u a l r n e n t e c o - - p r o d u c t o s de s i n t e s i s ) como l o s p o l i c l o r o d i b e n z o f u r a n o s y - p o l i c l o r o d i b e n z o d i o x i n a s ( l y I I r e s p e c t i v a m e n t e en l a f i g . 7 ) , c o m p u e s t o s de e x t r e m a d a i n c i d e n c i a t d x i c a , c u y o s s f e c - t o s s o l a p a n en o c a s i o n e s con l o s p r o d u c i d o s e s p e c f f i c a m e n t e p o r l o s PCBs. Cl, Cl, Cl. Cl, F i g . 7 - P o l i c l o r o d i b e n z o f u r a n o s ( I ) y p o l i c l o r o d i b e n ­ z o d i o x i n a s ( I I ) . 40 Vos y Koeman ( 1 9 7 0 ) , p a r a j e m p l ü , cornparando l a s t o x i - c i d a d s s de t r è s m e z c l a s c o m o r c i a l e s de PCDs m a n u f a c t u r a d o s p o r d i s t i n t a s f i r m a s , aunque t o d a s a l l a s con un c o n t e n i d o m£ d i o en c l o r o d e l 60 % ( P h e n o c l o r û P - 6 , C l o p h e n A-50 y Aro - c l o r - 1 2 ô0 ) e n c o n t r a r o n que , f r e n t e a l p o l i o , l o s dos p r i m e ­ r o s e x h i b f a n u na t o x i c i d a d s i g n i f i c a t i v a m e n t e mâs a c u s a d a - que e l t e r c e r o . E s t u d i o s p o s t e r i o r e s ( Vo s e t a l . , 1970) c o£ f i r m a r o n , v a l i â n d o s e de l a e s p e c t r o m e t r i a de masas , que t a ­ i e s d i f e r e n c i a s se d e b i a n a l a o r e s e n c i a , en l o s mâs t d x i c o s , de p r o p o r c i o n e s c o m p r e n d i d a s e n t r e l a s 5 y l a s 20 ppm de t e ­ t r a - y p e n t a c l o r o d i b e n z o f u r a n o s , i m p u r e z a s ausen t e s en e l - - A r o c l o r - 1 2 6 0 , a l menos p o r e nc ima d e l l i m i t e de d e t e c c i o n de 1 ppm. Con r e s p e c t o a l m e t a b o l i s m o de l o s PCBs, l o s d a t o s en l a a c t u a l i d a d d i s p o n i b l e s , s i b i e n en l i n e a s g é n é r a l e s r e v e - 1 an l a n o t a b l e r e s i s t e n c i a de e s t o s x e n o b i d t i c o s a n t e l a a c - c i d n de l o s s e r e s v i v o s , r e s u l t a n t o d a v i a i n s u f i c i e n t e s . D i ­ v e r s o s t r a b a j o s l l e v a d o s a cabo s o b r e e s t e tema (Koeman e t a l . , 1 969 ; G r a n t e t a l . , 1971) c o i n c i d e n en s e M a l a r , s o b r e - l a b ase de l a s v a r i a c i o n e s que, con r e s p e c t o a l p e r f i l c r o - m a t o g r â f i c o de l a m e z c l a a d m i n i s t r a d a , m u e s t r a n l o s de e x - t r a c t o s de t e j i d o s de l o s a n i m a l e s d o s i f i c a d o s , que son l o s c o m p o n e n t e s de mâs b a j o c o n t e n i d o en c l o r o l o s mâs s u s c e p t i ­ b l e s . No se d e t e c t a n n i se d e s c r i b e n , s i n embar go , m e t a b o l i - t o s , n i se c u a n t i f i c a e l g r a d o de t r a n s f o r m a c i d n de l a d o s i s o r i g i n a l . Mâs e x p l i c i t a s en e s t e s e n t i d o son l o s e s t u d i o s de Moza e t a l . ( 1 9 7 4 ) , s o b r e e l m e t a b o l i s m o d e l 2 , 2 ' - d i c l o r o b i f e n i - 41 l o en un s i sterna p l a n t a s - agua - s u e l o , s s i comc l o s de - Gr eb e t a l . ( 1 9 7 5 ) , i r n p l i c a n d o a l 2 , 4 ' - d i c l o r o b i f e n i l o y 2 , 5 , 2 ' - t r i c l o r o b i f e n i l o f r e n t e a l Macacus r h é s u s . En ambos c a s o s se c o n s t a t a l a f o r m a c i d n de m e t a b o l i t o s h i d r o x i l a d o s , s e n a l a n d o s e a s i m i s m o , en e l p r i m e r o de e l l o s , l a p o s i b i l i ­ dad de que se p r o d u z c a n t a m b i é n d e r i v a d o s p a r c i a l m e n t e d e s - c l o r a d o s . En e l segundo se s u b r a y a que aunque en l o s b i f e n i ­ l o s con b a j o c o n t e n i d o en c l o r o , como l o s e n s a y a d o s , l a h i - d r o x i l a c i é n y s u b s i g u i e n t e e x c r e c i é n p a r e c e n t e n e r l u g a r con r e l a t i v a r a p i d e z , e l p r o c e s o se hace mâs l e n t o y d i f i c u l t o - so a m e d i d a que se e l e v a e l p o r c e n t a j e de c l o r a c i d n . Todos l o s e s t u d i o s l l e v a d o s a cabo h a s t a a l momento s o ­ b r e d i s t r i b u c i d n t i s u l a r de l o s PCBs i n d i c a n , como e r a de - e s p e r a r d a da s sus c a r a c t e r f s t i c a s de s o l u b i l i d a d , su t e n d e n ­ c i a a a c u m u l a r s e p r e f e r e n t e m e n t e en l o s t e j i d o s r i c o s en l £ - p i d o s . En d i v e r s o s t r a b a j o s r e a l i z a d o s s o b r e e s p e c i e s s i l v e s - t r e s - f u n d a m e n t a l m e n t e de aves - con o c a s i d n de m o r t a l i d a - des c o n c e n t r a d a s en b r e v e s e s p e c i o s de t i e m p o , l a s c o r r e l a - c i o n e s h a l l a d a s e n t r e n i v e l e s r e s i d u a l e s de PCBs en d i s t i n - t o s t e j i d o s y m u e r t e , s d l o r e s u l t a n s i g n i f i c a t i v a s cuando e l t e j i d o i m p l i c a d o es e l n e r v i o s o ( c e r e b r o ) . Son , s i n embar go , a l t a m e n t e s i g n i f i c a t i v e s , como ya se c o m e n t d , l a s c o r r e l a - c i o n e s e n t r e d i s f u n c i o n e s c r d n i c a s que h acen d e s c e n d e r l a s t a s a s de n a t a l i d a d en p o b l a c i o n e s de aves y n i v e l e s r e s i d u a ­ l e s g l o b a l e s de PCBs. La i n f o r m a c i d n d i s p o n i b l e es c o n t r a d i c t o r i a en l o que 4 2 SB r e f i e r e a l a p a r t i c i p a c i d n o a u s e n c i a de mé ca n i sme s de - t r a n s p o r t e a c t i v a o f a c i l i t a d c de e s t a s x e n o b i o t i c o s h a c i a eJ. G s p a c i o i n t r a c e l u l a r , p r o b l e m s que r e v i s t a un e s p e c i a l - i n t e r é s en r e l a c i d n con l o s m i c r o o r g a n i s m o s . Poco c abe a n a d i r , d e s p u é s de l a s c o n s i d e r a c i o n e s p r é ­ c é d a n t e s , s o b r e l a p r o b l e m â t i c a a r n b i e n t a l de l o s PCBs. Des­ de su i n t r o d ü c c i o n en 1 9 2 9 , e s t o s c o m p u e s t o s han a l c a n z a d o un g r a d e de d i f u s i d n como c o n t a m i n a n t e s a m b i e n t a l e s que ha s u p e r a d o i n c l u s o a l de l o s i n s e c t i c i d a s o r g a n o c l o r a d o s . En 1 9 6 6 , Oensen i d e n t i f i e d como PCBs, c a l i f i c â n d o l o s - p o r v ez p r i m e r a como " u n nuevo r i e s g o q u f m i c o " , a l o s c o m ­ p u e s t o s r e s p o n s a b l e s de una s e r i e de i n t e r f e r e n c i a s que s u r - g f a n con f r e c u e n c i a en l a d e t e r m i n a c i d n de r e s i d u e s i n s e c t i ­ c i d a s o r g a n o c l o r a d o s p o r c r o m a t o g r a f f a de g a s - l f q u i d o , A p a£ t i r de e s t a f e c h a se m u l t i p l i c a r o n a b u n d a n t e m e n t e l a s c o n s - t a t a c i o n e s de su p r e s e n c i a en l o s mas d i v e r s o s s u s t r a t o s - - i n c l u f d o s l o s t e j i d o s humanos - , s i e n d o cada vez mâs f r e - c u e n t e s l o s c a s o s en que sus n i v e l e s r e p r e s e n t a n l a f r a c c i d n m a y o r i t a r i a d e l t o t a l de c o n t a m i n a n t e s o r g a n o c l o r a d o s d e t e c - t a d o s en l a s m u e s t r a s e s t u d i a d a s . A l a s m u l t i p l e s v i e s de i n g r a s o an e l med io q ue , p o r l a a m p l i t u d de sus u t i l i z a c i o n e s , e n c u e n t r a n , debe s u m a r s e , s e - gân una r e c i e n t e s u g e r e n c i a ( f i g . 8 ) , l a p o s i b i l i d a d de que l o s r e s i d u o s de DDT y o t r o s c l o r o d i f e n i l e t a n o s c o n s t i t u y a n , p o r e f e c t o de l a l u z s o l a r en l a s c a pas b a j a s de l a a t r n o s f e - r a , una n u e v a f u e n t e de PCBs ( M o i l a n e n y C r o s b y , 1973) • Ré­ s u l t a a s i m i s m o p l a u s i b l e que l a c o m b u s t i d n i n c o m p l e t s o a - Q Q - t (N D X LU Q o ou u l/î CD U CL w d V3 A G do d d •] '1-3 • m EH t '- A ON A rH Q) 'T? Ad w X ) o •H d W O Uo î> d do Q> ü do d -P Ao •H (H 1 CO bO • d boco ♦H P4 • d d U d *H «H «H 4 4 i n s u f i c i a n t e t e r n p e r a t u i ' a de m a t e r i a l e s que c o n t e n g a n PCBs de corno r e s u l t a d o l a l i b e r a c i o n de p o l i c l o r o d i b e n z o f u r a n o s y p o l i c l o r o d i b e n z o d l o x i n a s » o r i g i n a n d o f o r m a s de c o n t a m i n a - c i 6 n q ue , d ada l a e x t r e m a d a t o x i c i d a d y l a e s t a b i l i d a d de - G s tü s c o m p u e s t o s , r e v e s t i r f a n un a c o n s i d e r a b l e g r a v e d a d . Es muy p r o b a b l e que , dadas sus c a r a c t e r f s t i c a s f f s i c a s , q u i m i c a s , t 6 c n i c a s y t o x i c o l o g i c a s , l o s PCBs c o n s t i t u y a n , en l a a c t u a l i d a d , l o s x e n o b i o t i c o s mas u b i c u o s y de mas c o m p l e - j a s i . m p l i c a c i o n e s . Ml - ENFOQUE Y 3 U S T I F I C A G I ON DEL PRESENTE TRABAJG P a r su p o s i c i d n y p a p e l d e n t r o de l o s c i c l o s b i o g e o q u ^ m i c o s , e l s u e l o c o n s t i t u y e — j u n t o con l a s agues c o n t i n e n t e l e s y , s o b r e t o d o m a r i n a s — un s u s t r a t o p a r t i c u l a r m e n t e f a ­ v o r a b l e a l d e p 6 s i t o y a c u m u l a c i o n de p r o d u c t o s de l a r g a v i ­ da r e s i d u a l , e n t r e l o s c u a l e s , como se ha v i . s t o , l o s PCBs - o c u pa n un l u g a r d e s t a c a d o . P a r e c e é v i d e n t e , p u e s , que e l e s t u d i o de l a s i n t e r a c — c l o n e s e n t r e e s t o s x e n o b i d t i c o s y l a m i c r o f l o r a e d â f i c a , — p os e a que, p o r e l moment o, ha r e c i b i d o un a a t e n c i d n r e l a t i v a m en t e e s c a s a , o f r e c e un e s p e c i a l i n t e r é s , t a n t o desde e l - p u n t o de v i s t a de l a s p o s i b l e s t r a n s f o r m a c i o n e s que e x p e r i ­ ment t e n a q u e l l o s c o m p u e s t o s , como de l a s r e p e r c u s i o n e s que - p uedan t e n e r s o b r e l o s m i c r o o r g a n i s m o s , ■ S o b r e e s t a s p r e m i s a s , en l a p l a n i f i c a c i o n de e s t e t r a - b a j o se c e n t r o l a a t e n c i d n s o b r e m i c r o o r g a n i s m o s d e l t i p o - A s c o m i c e t o s , p o r dos r a z o n e s f o n d a m e n t a l e s ; a) L o s h o ng o s d e l s u e l o se c a r a c t e r i z a n p o r une permea b i l i d a d e s c a s a m e n t e s e l e c t i v a f r e r t t e a l a s s u s t a n c i a s p r é ­ s e n t e s en su m e d i o , m o s t r a n d o , p o r o t r a p a r t e , una a l t a c a - p a c i d a d m e t a b d l i c a f r e n t e a muy d i v e r s o s s u s t r a t o s , b) En l o s p r o c e s o s n a t u r a l e s de d e g r a d a c i o n de h i d r o - 4 6 c a r b u r o s , s u e l e s e r p r s c i s a m s n t e l a m i c r o f l o r a f u n g i c a l a - r e s p o n s a b l e de l o s p r i m s r o s pasos m e t a b d l i c o s . A s f p u e s , e l c u l t i v a de d i v e r s o s A s c o m i c e t o s en m e d i o s s d l i d o s y l i q u i d e s d o s i f i c a d o s con c o n c e n t r a c i o n e s v a r i a ­ b l e s do PCBs de d i f e r e n t e s p o r c e n t a j e s m e d i o s de c l o r a c i o n , p r o p o r c i o n o l o s p r i m e r o s m a t e r i a l e s para, e l e s t u d i o d e l pro_ c es o de a c u m u l a c i o n d e l x e n o b i o t i c o , l a c o n s t a t a c i d n do su r e s i s t e n c i a a l a t a q u e m e t a b d l i c o de l o s m i c r o o r g a n i s m o s e n - s a y a d o s y una a p r o x i m a c i d n c u a n t i t a t i v a a sus e f e c t o s t d x i - c o s s o b r e l o s misrnos. En e s t e p u n t o , y como s u e l e o c u r r i r cuando se a v a n z a - en e l d e s a r r o l l o de un p l a n de i n v e s t i g a c i d n , se c e r r a r o n - c i e r t o s c arn inos a l mismo t i e m p o que se a b r i e r o n n u e va s posi^ b i l i d a d e S e A s f , e l e s t u d i o mas o menos d e t a l l a d o — que se - p r e v e i a — en t o r n o a l a s r u t a s y c i n e t i c a de l o s mé ca n i sme s de b i o t r a n 3 f o r m a c i d n de l o s PCBs, p e r d i d su s e n t i d o a l com- p r o b a r s a l a i n e x i s t e n c i a de t a i e s m e c a n i s m o s . P a r a l e l a m e n - t G , l o s r e c u l t a d o s de e s t a p r i m e r a f a s e p u s i e r o n de m a n i - f i e s t o l a c o m p l e j i r i a d de l o s a s p e c t o s t o x i c o l d g i c o s i m p l i c a i dos en l a a c c i d n de l o s x e n o b i d t i c o s , l o c u a l pasd a r é c l a ­ mai- l a a t e n c i d n p r e f e r e n t e d e l d e s a r r o l l o e x p e r i m e n t a l p o s ­ t e r i o r . L a v a l o r a c i d n de d i v e r s o s c o m p o n e n t e s c e l u l a r e s con — v i s t a s a l a c u a l i f i c a c i d n y c u a n t i f i c a c i d n de a l g u n o de ------ a q u e l l o s a s p e c t o s l l e v d a l a c o n s t a t a c i d n de l o s e f e c t o s de l o s PCBs s o b r e l a b i o s f n t e s i s de RNA, l o c u a l , a su v e z , con^ d u j o a l a i n v e s t i g a c i d n d e l p o s i b l e p a p e l de l o s meca n i smo s 4 7 de i n d ü c c i d n e n z i m a t i c a en l a r e s p u e s t a d e l A s p e r g i l l u s f i a vu s a l o s t d x i c o s e n s a y a d o s , a s f c o m o de su r e p e r c u s i d n s o ­ b r e e l m e t a b o l i s m o , " i n v i v o " 0 " i n v i t r o " , de o t r o s xeno - b i d t i c G s , S i m u l t a n e a m e n t e , l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s en e l e s t u - d i ü de l o s i n t e r c a m b i o s de gases en e s p o r a s g e r m i n a n t e s de a q u e l A s p e r g i l l u s , en p r è s e n c i a de l o s d i f e r e n t e s A r o c l o r , - s u g i r i a r o n l a u t i l i d a d de e x t e n d e r e l t r a b a j o a l a l e v a d u r a S a c c h a r o my ces c e r o v i s s i a e . En e f e c t o , s i b i e n e s t a u l t i m a e s p e c i e no puede c o n s i - d o r a r s e un r n i c r o o r g a n i s m o d e l s u e l o , no se e n c u e n t r a exces_i v a m e n t e a l e j a d a de o t r a s l e v a d u r a s q ue , s i é n d o l o , no o f r e - cen l a v e n t a j a q ue , en S a c c h a r o m y c e s , r e p r é s e n t a e l hecho - de r i i s p o n e r s e de n u me ro s as cepas con una d i f e r e n c i a c i d n gr_a d u a l en l a s c o n t r i b u c i o n e s de mecan i smo s f e r m e n t a t i v o s y — r e s p i r a t o r i o s a su m é t a b o l i s m e e n e r g d t i c o , La c c m p a r a c i d n e n t r e l o s e f e c t o s de l o s PCS s s o b r e e s ­ t e r n i c r o o r g a n i s m o en ambas s i t u a c i o n e s m e t a b d l i c a s y su i n - f l u e n c i a s o b r e l a a c t i v i d a d de t r a n s p o r t e e l e c t r d n i c o s i r - v i d , f i n a l m e n t e , p a r a e n s a y a r una i n t e r p r e t a c i d n de su a c t ^ v i d a d en r e l a c i d n con e l f u n c i o n a m i e n t o de l a s c a de na s r e s - p i r a t o r i a s . E v i d e n t e m e n t e , no t o d a s l a s r e s p u e s t a s que en e s t a me- m o r i a se dan a l o s p r o b l e m a s p l a n t e a d o s en l o s campos que - s u m a r i a m e n t e acaban de e n u m e r a r s e , p o s es n e l mismo v a l o r , n i son i g u a l m e n t e d e f i n i t i v a s . B i e n e s t a b l e c i d a s a l g u n a s , - 4 8 c r e o m o s que e l i n t e r é s de o t r a s c o n s i s t e p r é c i s ame n t e — y - en e s t a f o r m a se han d e s c r i t o — en su c a p a c i d a d rie c o n v e r - t i r s e en n u e v a s h i p d t e s i s de t r a b a j o . " B " - P A R T E E X P E R I M E N T A L D . I - n E T O D O L O G I A M A T E R I A L E S 1 - TECNICAS DE CULTIVO. P a r a e l d e s a r r o l l o de A s p e r g i l l u s f l a v u s se u t i l i z d m e d i o de Czapek : S a c a r o s a .................... . 30 g NaNOg 2 " K 2PO4H ............................ 1 " MgSO^ .............................. 0 , 5 " FeS04 .......................... 0 , 0 1 " KCl ................................. 0 , 5 " H2O d e s t i l a d a • • • « . 1000 ml de S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s s i a e cabo en dos t i p o s de m e d i o s . Uno f e r m e n t a b l e c o m p ue s to p o r s E x t r a c t o de l e v a d u r a s 10 g NaCl .................................. .. 0 , 5 " M g C l 2 • 6 H2O . . . . . . . . 0 , 7 " ( N H^ j g S O ^ .......................... 1 , 2 " 0 , 1 " KPO4H2 .................................. 1 " F e C l g ..................................... 0 , 0 0 5 " G l u c o s a . . . . . . . . . . . 10 " H2O d e s t i l a d a ............. .. 100.0 ml Y o t r o no f e r m e n t a b l e , que se d i f e r e n c i a d e l a n t e r i o r u n i c a m e n t e en que l a g l u c o s a se s u s t i t u y e p o r e t a n o l a l 3 ^ ( p / v ) . L a es t e r i l i z a c i d n se e f e c t u a en a u t o c l a v e a 1 a tmdsf j s r a ( 1 2 1 9 C) d u r a n t e 15 m i n u t o s . 52 P a r a l o s c u l t i . v o s en m ed io i f q u i d o se u t i l i z e r o n m a t r a C B S E r l e n m e y e r de 250 ml de c a p a c i d a d , c o n t e n i e n d o 50 ml de s o l u c i d n * E l i n d c u l o c o n s i s t e en 0 , 2 5 ml de u na s u s p e n s i o n de e s p o r a s ( A. f l a v u s ) o c e l u l a s ( S . c e r o v i s s i a e ) en agua - d e s t i l a d a e s t e r i l con un 0 , 1 % de TUEEN-20. L a c o n c e n t r a - c i d n d e l i n d c u l o se a j u s t a p o r d i l u c i d n , r e a l i z a n d o s e l a — e n u m e r a c i d n p o r e l me t od o d e l c o n t e o d i r e c t e m e d i a n t e una - c a m a r a h e m a t o c i t o m é t r i c a . L o s c u l t i v o s s o b r e m e d i o s s d l i d o s — que se p r e p a r a n — p o r a g a r i z a c i d n a l 2 % de l o s m e d i o s i f q u i d o s c o r r e s p o n d i e n - t e s — se l l e v a n a cabo en p l a ç a s P é t r i de tamaMo v a r i a b l e , en c o n s o n a n c i a con l a e x p e r i e n c i a a r e a l i z a r , c o n s i s t i e n d o a l i n d c u l o en 0 , 0 1 m l / cm^ de una s u s p e n s i d n de e s p o r a s o c e l u l a s a n a l o g a a l a d e s c r i t a p a r a l o s c u l t i v o s en med i o — l i q u i d e . L a i n c u b a c i d n se p r o l o n g e a l o l a r g o de p é r i o d e s d i f e - r e n t e s segun l o s c a s o s , a un a t e m p e r a t u r a de 2 9 i 2 9 C. L o s c u l t i v o s en m e d i o l i q u i d e se m a n t i e n e n en a g i t a c i d n c o n s ­ t a n t e (80 c i c l o s / m i n ) a f i n de f a c i l i t a r l a a i r e a c i d n . 1 . 1 - INCORPORATION DE LOS PCSs Y OTROS ORGANOCLORADOS A LOS MEDIOS DE CULTIVO. L a s m e z c l a s de b i f e n i l o s p o l i c l o r a d o s e n s a y a d a s f u e r o n 1 as c o m e r c i a i i z a d a s b a j o l a s d e n o m i n a c i o n a s de A r o c l o r - 1 2 3 2 , 1 2 4 2 , 1 2 4 6 , 1 254 y 1260 p o r l a c a s a m o n s a n t o . L a a u s e n c i a - an e s t o s p r e p a r a d o s ( Vo s y Koeman, 1970) de i m p u r e z a s de —- e l e v a d a a c t i v i d a d b i o l d g i c a — p o l i c l o r o d i b e n z o f u r a n n s — ob­ v i a e l p r o b l e m s de l a i n t e r f e r e n c i a de e f e c t o s t d x i c o s . L a b a j a s o l u b i l i d a d en agua de e s t o s p r o d u c t o s d i f i c u J L t a su i n c o r p o r a c i d n a l o s m e d i o s do c u l t i v o , p o r l o que , p ^ SB a que a l g u n o s a u t o r e s s u g i e r e n l a c o n v e n i e n c i a de no u t ^ l i z a r d i s o l v e n t e s n i e m u l s i f i c a n t e s en e s t e t i p o de e x p e - r i e n c i a s , hubo de r e c u r r i r s e , p a r a l a a d i c i d n de l o s PCBs a m e d i o s a c u o s o s con un adec ua do g r a d o de h o m o g e n e i d a d , a l em p l e o de l o s p r i m e r o s . A s i p u e s , t o d o s l o s A r o c l o r e n s a y a d o s se i n c o r p o r a r o n a s e p t i c a m e n t e a l o s m e d i o s l i q u i d e s , d e sp ué s de su e s t e r i l i ^ z a c i d n y a n t e s de p r o c é d e r a su i n o c u l a c i d n , d i s u e l t o s an - 200 / j 1 ( 0 , 0 8 % d e l v o lu m e n d e l c u l t i v e ) de a c e t o n a . La a d i ­ c i d n de l o s PCBs a s u s t r a t o s s d l i d o s se l l e v d a cabo p o r — e v a p o r a c i d n de s o l u c i o n e s en h e x a n o , a l a s c o n c e n t r a c i o n e s a d e c u a d a s , s o b r e l a s u p e r f i c i e d e l med io g e l i f i c a d o . Es ------ i m p o r t a n t e l a e s t r i c t a i g u a l a c i d n de l o s v o l d m e n e s de d i s o l v e n t e , a f i n de p o d e r p r e s c i n d i r de sus e f e c t o s s o b r e e l d ^ s a r r o l l o d e l r n i c r o o r g a n i s m o , y p o r e l l e a n â l o g o s t r a t a m i e n - 54 t o s , con l o s d i s o l v e n t e s p u r e s , se r e a l i z a n s o b r e l o s c o n ­ t r ô l e s . En e l p r i m e r c as o — m ed io I f q u i d o — se o p e r a a l a s cori c e n t r a c i o n e s de 5 , 1 0 , 25 y 50 ppm de A r o c l o r ; en e l s e g u n - do — m e d io s o l i d o — con 1 , 6 ; 4 ; 8 y 20 / j g / cm^. L a a d i c i o n de a l d r f n ( 1 , 2 , 3 , 4 , 1 0 , 1 0 - h e x a c l o r o - 1 , 4 , 4 a , 5 , 8 , 8 a - h e x a h i d r o - 1 , 4 - e n d o - 5 , 8 - e x o - d i m e t a n o - n a f t a l o n o : I ) y DDT ( 1 , 1 , 1 - t r i c l o r o - 2 , 2 - b i s ( p - c l o r o - f e n i l ) - e t a n o : I I ) — a s i m i s m o e s c a s a m e n t e h i d r o s o l u b l e s — a l o s c u l t i v o s , en - l o s e n s a y o s d e s t i n a d o s a l a i n v e s t i g a c i d n de f en d me no s come t a b d l i c o s , se l l e v d a cabo en s i m i l a r e s c o n d i c i o n e s a l a s - d e s c r i t a s p a r a e l c a s o de l o s PCBs. L a s c o n c e n t r a c i o n a s da t r a b a j o f u e r o n de 5 ppm ( a l d r f n ) y 7 ppm ( D DT ) . C l C l C l C l C l C l ( I ) (II ) I g u a l m e n t e en r e l a c i d n con e l e s t u d i o de f en d me no s co m e t a b d l i c o s , se l l e v a r o n a c a b o , ademas de una s e r i e de en s a y o s e n z i m a t i c o s ” i n v i t r o " da A s p e r g i l l u s f l a v u s en p r e - s e n c i a de a n i l i n a y p e n t o b a r b i t a l . L o s c o r r e s p o n d i e n t e s mé- t o d o s a n a l i t i c o s se d e s c r i b i r a n en e l a p a r t a d o r e l a t i v e a - e n s a y o s e n z i m a t i c o s . 2 - EXTRACCION DE LOS COMPUESTOS ORGANOCLORADOS - PCBs, DOT Y ALDRIN A l f i n a l de l o s p e r i o d o s de i n c u b a c i d n , e l m i c e l i o de A . f l a v u s se s é p a r a d e l m ed io de c u l t i v o p o r f i l t r a c i d n , rje c o g i e n d o s e l a s c l l u l a s , en e l caso de l o s c u l t i v o s de S. ce r e v i s s i a e , p o r c e n t r i f u g a c i d n ( 10 00 g / 30 m i n ) , L o s m e d i o s de c u l t i v o se e x t r a e n p o r t r è s v e c e s c o n s e - c u t i v a s con v o l d m e n e s i g u a l e s de h e x a n o , e t e r o t f l i c o y he­ xano r e s p e c t i v a m e n t e , R e u n i d o s l o s e x t r a c t o s , se secan d u ­ r a n t e 30 s e g u n d o s s o b r e NagSO^ a n h i d r o y se c o n c e n t r a n h a s - t a un v o l u m e s c o n v e n i e n t e en un e v a p o r a d o r K u d e r n a - D a n i s h , L a b i o m a s a se d e s e c a s o b r e P2O5 ^ p r e s i d n l i g e r a m e n t e r e d u c i d a — c o n d i c i o n e s en l a s que se d é t e r m i n a su peso seco— y s e g u i d a m e n t e se r e hu m e d e c e — se ha comprobado que l a r e h u m e c t a c i d n f a v o r e c e l a e x t r a c c i d n — y h o m o g e n e i z a en m o r t e r o , e m p l ea n do como a b r a s i v o a r e n a de c u a r z o l a v a d a a l o s â c i d o s y a l a s b a s e s y a h a d i e n d o Na2S0 ^ a n h i d r o como d e s e c a n t e , de f o r m a que a l f i n a l de l a o p e r a c i d n se o b t e n g a un p o l v o f i n o y s e c o , L o s h o m o g e n e i z a d o s a s f o b t e n i d o s se someten a d i s t i n t a t é c n i c a de e x t r a c c i o n , segun l o s c o m p u e s t o s i m p l i c a d o s , Ha- b i é n d o s e c o m p ro b a d o que l o s b i f e n i l o s de b a j o g r a d o de c l o - r a c i d n p r é s e n t e s en l a s m e z c l a s A - 1 2 3 2 , A - 1 2 42 y A - 1 2 4 8 no se r e c u p e r a n d e b i d a m e n t e s i se s ometen a l p r o c e s o de c a l e - 57 f a c c i d n que c o m p o r t a l a u t i l i z a c i d n de un e x t r a c t o r S o x h l e t , l o s h o m o g e n e i z a d o s c o r r e s p o n d i e n t e s se d e p o s i t a n en un a c o ­ l u m n s de v i d r i o de 1 cm de d i â m e t r o con f o n d o de p l a ç a f i l ­ t r a n t e y se e l u y e e l s i s t e m a con 200 ml de h e x a n o , vo lumen que se ha c o n s t a t a d o r é s u l t a s u f i c i e n t e p a r a e x t r a e r complet t a m e n t e l o s h o m o g e n e i z a d o s p r o c é d a n t e s de l o s c u l t i v o s de - m a y o r c o n t e n i d o en PCBs, L a s m e z c l a s de A - 1 2 5 4 y A - 1 2 6 Ü , p o r e l c o n t r a r i o , a l - i g u a l que e l DDT y e l a l d r f n j u n t a m e n t e con sus m e t a b o l i t e s , se e x t r a e n en un a p a r a t o S o x h l e t con a c e t o n a : hexano ( 6 0 : 4 0 ) d u r a n t e 4 h o r a s , Cuando l o s e n s a y o s se e f e c t u a n s o b r e m e d i o s s d l i d o s l a t o t a l i d a d d e l g e l c o n t e n i d o on c ad a p l a ç a se somete a i d e n - t i c o s t r a t a m i e n t o s de h o m o g e n e i z a c i d n y e x t r a c c i d n que l o s a p l i c a d o s a l a s c e l u l a s y r n i c e l i o s d e s e c a d o s . En t o d o s l o s c a s o s , l o s e x t r a c t o s se d e s e c a n y c o n c e n ­ t r a n segun se ha d e s c r i t o p a r a l o s o b t e n i d o s a p a r t i r de — l o s m e d i o s de c u l t i v o . 2 , 1 - P U R I F I C A C I O N DE LOS E X T R A C T OS . P a r a l a d e t e r m i n a c i d n , c u a l i t a t i v a y c u a n t i t a t i v a , p o r c r o m a t o g r a f f a g a s - l f q u i d o (CGL) de c o m p u e s t o s o r g a n o c l o r a - dos en e x t r a c t o s p r o c e d e n t e s de m u e s t r a s b i o l d g i c a s , se h a - ce n e c B s a r i a l a p r e v i a e l i m i n a c i d n en d i c h o s e x t r a c t o s de - un a s e r i e de s u s t a n c i a s , g e n e r a l m e n t e de n a t u r a l e z a l i p f d i - ca o t e r p e n o i d e , que i n t e r f i e r e n en l a s r e s p u e s t a s c r o m a t o - g r â f i c a s , Con e l f i n de c o n s e g u i r e l adecuado g r a d o do pur ja z a , 30 han d e s a r r o l l a d o u na s e r i e de m e t o d o l o g f a s mas o me­ n o s é q u i v a l a n t e s , u na de l a s c u a l e s es l a r e p r e s e n t a d a p o r l a s e c u e n c i a de o p e r a c i o n e s c i t a d a en B a l u j a e t a l , ( 1 9 7 3 ) , Cuando e l c o n t e n i d o de l a s m u e s t r a s en m a t e r i a l o s l i p f d i c o s os e l e v a d o , e l p r i m e r paso d e l p r o c e s o de p u r i f i c a - c i d n s u e l e c o n s i s t i r en l a a p l i c a c i d n de t â c n i c a s de r e p a r ­ t e e n t r e d i s o l v e n t e s i n m i s c i b l e s , como l a s d e s c r i t a s p o r De E a u b e r t M a u nd e r e t a l , ( 1 9 6 4 ) e n t r e hexano y d i m e t i l f o r m a m i ^ d a , p o r O n l e y y M i l l s ( 1 9 6 2 ) e n t r e he xan o y a c e t o n i t r i l o . En o t r a s o c a s i o n e s — y e s t e es e l caso de l a m a y o r i a de l a s m u e s t r a s t r a t a d a s en e s t e t r a b a j o — l a e s c a s a p r o p o r c i d n de i m p u r e z a s p r é s e n t a s en l o s e x t r a c t o s p e r m i t e p r e s ­ c i n d i r de l o s m é t o d o s de r e p a r t e , a menudo mas i n s e g u r o s — d e s d e un p u n t o de v i s t a eu a n t i t a t i v o , p a r a u t i l i z a r e x c l u s ^ v a m e n t e l o s b a s a d o s en l a c r o m a t o g r a f f a de a d s o r c i d n s o b r e un s o p o r t e a c t i v o y que a c o n t i n u a c i d n d e s c r i b i m o s . 59 Una c o l u m n s de 1 , 5 cm de d i â m e t r o i n t e r n o se r e l l e n a - h a s t a una a l t u r a de 12 cm con F l o r i s i l ( s i l i c a t o de m a g n e - s i o s i n t ê t i c o ) do 6C-10D m a l l a s , p r e v i a m e n t e a c t i v a d o p o r - c a l e n t a m i e n t o a 650 9 C d u r a n t e dos h o r a s , c u i d a n d o que e l - e m p a q u e t a m i e n t o r e s u i t e a p r e t a d o y homogeneo. S o b r e e l F l o ­ r i s i l SB d e p o s i t s un a c a p a de 2 cm de e s p e s o r de NsgSO^ an­ h i d r o , p a r a a s e g u r a r que l a s s o l u c i o n e s pasen d e s e c a d a s p o r e l a d s o r b e n t s a c t i v o , E l e x t r a c t o a p u r i f i c a r se ahade c u a n t i t a t i v a m e n t e a - l a c o l u m n s en un v o l u m e n que no debe s o b r e p a s a r l o s 10 m l , E l s i s t e m a se e l u y e s u c e s i v a m e n t e con 100 ml de he xan o y — 200 ml de h e x a n o - é t e r e t f l i c o ( 8 5 : 1 5 ) , R e c o g i d o s s e p a r a d a - m e n t e l o s c o r r e s p o n d i e n t e s e l u a t o s y l l e v a d o s a un vo lu me n c o n v e n i e n t e en e v a p o r a d o r K u d e r n a - D a n i s h , en l a f r a c c i o n de h e x a n o son d é t e c t a b l e s l a t o t a l i d a d de l o s PCBs y en l o s e n s a y o s que se l l e v a n a cabo a d i c i o n a n d o i n s e c t i c i d a s p a r a i n v e s t i g a r su m e t a b o l i s m o i n d u c i d o — a l d r f n y DDE ( p r i n c i - p a l m e t a b o l i t o d e l DDT) , En l a F r a c c i d n mâs p o l a r , que s o l o SB o b t i e n e en l o s e x t r a c t o s p r o c e d e n t e s de c u l t i v o s a d i c i o - n a d o s con i n s e c t i c i d a s , e l u y e n d i e l d r f n ( m e t a b o l i t o e p o x i d ^ do d e l a l d r f n ) y TDE ( m e t a b o l i t o d s l DDT) caso de que se — f o r m e , L o s f n d i c e s de r e c u p e r a b i l i d a d o b t e n i d o s a l o l a r g o - - d e l p r o c e s o , i n c l u i d a s t o d a s l a s o p e r a c i o n e s , r e s u l t a n en - t o d o s l o s c a s o s l o s u f i c i e n t e m e n t e e l e v a d o s : e n t r e un 9 5 — 98% p a r a l o s PCBs y e l g r u p o d e l DDT, y e n t r e un 88 - 90% p a r a e l a l d r f n y e l d i e l d r f n . 2 , 2 - DETERMINACION DE COMPUESTOS ORGANOCLORADOS POR CRÜMATCGRAFIA GAS-L IQUIDO. C o n c l u i d a s l a s o p e r a c i o n e s de p u r i f i c a c i d r i , l o s e x t r a c t o s se e n c u e n t r a n en c o n d i c i o n e s de s e r e x a m i n a d o s p o r CGL. D i c h o examen se l l e v d a cabo en un a p a r a t o P e r k i n - E l ­ m e r , m o d e l o F - 1 1 , con d e t e c t o r de c a p t u r a e l e c t r d n i c a p r o - v i s t o de e l e c t r o d o c o n c é n t r i c o y f u e n t e de r a d i a c i o n de ------ N i ^ S , O p e r a n d o en c o n d i c i o n e s d p t i m a s de t e m p e r a t u r a , v o l - t a j e y c a u d a l de gas p o r t a d o r ( N g ) , p e r m i t e l a d e t e c c i d n y c u a n t i f i c a c i d n s i n e r r o r s i g n i f i c a t i v o de c a n t i d a d e s de ------ —X 2 m u e s t r a d e l o r d e n de 10 g . Pose a q u o , en l o s m e d i o s do c u l t i v o , l a s c o n c e n t r a c i o ^ n é s i n i c i a l e s de l o s c o m p u e s t o s o b j e t o de e ns ayo son de o r ­ den r n i c r o m o l a r , l a e l e v a d a s e n s i b i l i d a d d e l metodo p e r m i t s p a r t i r de m u e s t r a s l o s u f i c i e n t e m e n t e r e d u c i d a s como p a r a - que e l m a t e r i a l p r o c é d a n t s de una s o l a i n c u b a c i d n p ue da d i - v i d i r s e en v a r i a s a l f c u o t a s . Se u t i l i z a r o n c o l u m n a s de v i d r i o P y r e x , e s p i r a l e s , de 2 m de l o n g i t u d y 30 mm de d i â m e t r o i n t e r n e . P a r a su r e l l e - n a d o , l a s c a n t i d a d e s a d e c u a d a s de l a f a s e e s t a c i o n a r i a se - d i s u e l v e n en c l o r o f o r m o o d i c l o r o m e t a n o , se s u sp e n d e l u e g o en d i c h a s o l u c i o n e l s o p o r t e s d l i d o y a c o n t i n u a c i d n se el_i m i n a e l d i s o l v e n t e p o r r o t a c i d n con c a l e n t a m i e n t o y a v a c i o . Es i m p o r t a n t e , en b e n e f i c i o de l a r e p r o d u c t i b i l i d a d de l o s 61 r e s u l t a d o s , que l a p r e p a r a t i o n d e l r e l i e n o , en l a s c o l u m n a s m i x t e s , se l l e v a a cabo a h a d i e n d o e l s o p o r t e s d l i d o a una - s o l u c i d n que c o n t e n g a ya ambas f a s e s en l a s p r o p o r c i o n e s — p r é c i s a s , p r o c e d i m i e n t o que da m a j o r e s r e s u l t a d o s que e l — m e z c l a d o de l a s f a s e s s o p o r t a d a s a i s l a d a m e n t e * R e l l e n a l a c o l u m n s p o r a p l i c a c i d n de v a c i o a uno de — sus e x t r e m o s , y t a p o n a d c s ambos con l a n a de c u a r z o , se some t e a un p r o c e s o do a c o n d i c i o n a m i e n t o mant e n i e n d o l a d u r a n t e 3 d 4 d f a s a un a t e m p e r a t u r a que e x c e d a en 20 - 30 9 C l a ----- u s u a l de t r a b a j o * A l o l a r g o de e s t e p e r i o d o , l a c o l u m n a — queda c o n e c t a d a a l b l o q u e de i n y e c c i d n d e l a p a r a t o , con o b ­ j e t o de m a n t e n e r u n a c o r r i e n t e de gas p o r t a d o r a su t r a v e s , p e r o se d e j a l i b r e e l e x t r e m o o p u e s t o , que s o l o se c o n e c t a a l d e t e c t o r un a v e z f i n a l i z a d o e l a c o n d i c i o n a m i e n t o ( e l d e ­ t e c t o r , p o r su p a r t e , debe p e r m a n e c e r t o d o e s t e t i e m p o a una t e m p e r a t u r a no s u p e r i o r a l a que l e p r o p o r c i o n e e l s i s t e m a c a l e f a c t o r d e l h o m o ) . L a c o m p o s i c i o n de l a s f a s e s o s t a c i o n a r i a s e m p l e a d a s , a s f como l o s p a r a m é t r é s o p e r a t o r i o s , se dan en l a t a b l a I V . L a c o l u m n a d e s i g n a d a como I en d i c h a t a b l a , r e l l e n a — con b a j a c a r g a de un a f a s e de e s c a s a p o l a r i d a d — una m e t i l - s i l i c o n a — p e r m i t e , c ua nd o se t r a b a j a con s o l u c i o n e s que — c o n t i e n e n PCBs e x c l u s i v a m e n t e , l a o b t e n c i o n de c r o m a t o g r a - mas con un a d ec u ad o g r a d o de r e s o l u c i d n en p e r i o d o s de t i e m po r e l a t i v a m e n t e b r e v e s . P r é s e n t a , p o r o t r a p a r t e , l a v e n t a j a de q u e , caso de f o r m a r s e m e t a b o l i t e s de p o l a r i d a d m e d i a a p a r t i r de l o s PCBs, p o r l a a c c i d n de l o s m i c r o o r g a n i s m o s , c a b r f a l a p o s i b i l i d a d de su d e t e c c i d n . 62 T a b l a I V - F a s e s e s t a c i o n a r i a s y p a r a m é t r é s o p e r a t e - r i o s u t i l i z a d o s en l o s a n â l i s i s p o r CGL, Fase e s t a c i o n a r , (% s o b r e s o p o r t e ) S o p o r t e T e m p e r a t u r a s C D ! C a u d a l (N2) E - 3 0 1 ( 1 , 2 % ) ( I ) C h r o m o s o r b U-HP 8 0 - 1 0 0 m a l l a s 160 180 200 40 ml / min OC-200 ( 5 % ) , . QF-1 ( 7 , 5 % ) 1 1 ' C h r o m o s o r b U-HP 8 0 - 1 0 0 m a l l a s 200 210 220 60 ml / min L a c o l u m n a I I , p o r e l c o n t r a r i o , no p e r m i t i r f a e s t a ujL t i m a p o s i b i l i d a d , Con un a c a r g a muy s u p e r i o r , y c o n t e n i e n d o una a p r e c i a b l e p r o p o r c i d n de l a f l u o r s i l i c o n a QF-1 ( f a s e de a l t a p o l a r i d a d ) es de e s p e r a r que i n c l u s o p r o d u c t o s de p o l a r i d a d m o d e r a d a , como p o s i b l e s d e r i v a d o s de l a a c t i v i d a d m i - c r o b i a n a s o b r e l o s PCBs, q ued ase n r o t e n i d o s en l a f a s e e s t a c i o n a r i a , o e l u y e s e n con t i e m p o s de r e t e n c i d n t a n exagerada^ m e n t e e l e v a d o s que i m p o s i b i l i t a r i a n su d e t e c c i d n . L a c o l u m ­ na de f a s e m i x t a ( i l ) , s i n e m b ar g o , r é s u l t a de un a e f i c i e n - c i a muy s u p e r i o r a l a I y se h ace i m p r e s c i n d i b l e p a r a l a r ^ s o l u c i d n de e x t r a c t o s que c o n t e n g a n una m e z c l a de PCBs, DDT, a l d r f n y l o s m e t a b o l i t e s de ambos i n s e c t i c i d a s . N i n g u n o de l o s p r o d u c t o s i m p l i c a d o s en l o s a n â l i s i s — c r o m a t o g r â f i c o s o f r e c e p r o b l e m a s de t e r m o l a b i l i d a d a l a s — t e m p e r a t u r a s de t r a b a j o u t i l i z a d a s . 2 . 3 - EUALUACION DE LAS MEZCLAS DE BIFENILOS POLICLO­ RADOS. En t o d o s l o s c a s o s , l a s d e t e r m i n a c i o n e s c u a n t i t a t i v a s se l l e v a n a cabo c o m p a r a n d o , en l o s c r o m a t o g r a m a s c o r r e s p o n i d i e n t e s a l a s m u e s t r a s a v a l o r a r y a s o l u c i o n e s e s t a n d a r de c o n c e n t r a c i d n c o n o c i d a , l a s a r e a s de s e R a l e s con i d e n t i c o s t i e m p o s de r e t e n c i d n . A f i n da e v i t a r p o s i b l e s e r r o r e s deb_i dos a l a f a l t a do l i n e a r i d a d en l a r e s p u e s t a d e l a p a r a t o , - d i c h a c o m p a r a c i d n se l l e v a s i e m p r e a cabo e n t r e s e h a l e s de m a g n i t u d e s s e n s i b l e m e n t e i g u a l e s . E l g r a d o de c o n s e r v a c i d n de l a c o m p o s i c i d n de una mez­ c l a de PCBs — un A r o c l o r — d e s p u e s de cada e nsay o m i c r o b i o - I d g i c o , 38 é v a l u a a t r a v e s d e l c r i t e r i o do l a v a r i a c i d n d e l p e r f i l c r o m a t o g r â f i c o . T a l v a r i a c i d n se e s t i m a c u a n t i t a t i v a me n te d e t e r m i n a n d o , en l o s c r o m a t o g r a m a s de l a s s o l u c i o n e s e s t a n d a r , l a s r e l a c i o n e s e n t r e l a s s u p e r f i c i e s de t o d a s l a s s e r i a l e s f r e n t e a una p r e f i j a d a y c o m p a r a n d o l a s con l a s r e l a c l o n e s h o m d l o g a s c a l c u l a d a s s o b r e un c r o m a t o g r a m a p r o b l e m s o b t e n i d o en i d e n t i c a s c o n d i c i o n e s . D e n t r o de dos c r o m a t o - g r am as c o r r e s p o n d i e n t e s a d i f e r e n t e s i n y e c c i o n e s de l a m i s - ma s o l u c i d n e s t a n d a r , l o s c o c i e n t e s de l a s r e l a c i o n e s homd­ l o g a s se m a n t i e n e n s e n s i b l e m e n t e c o n s t a n t e s a l r e d e d o r de l a u n i d a d ( i 0 , 0 3 ) c u a nd o l a m a g n i t u d de l a s s e M a l e s se m a n - t i e n e e n t r e e l 40 y e l 60 % de l a d e f l e x i d n t o t a l de l a e s - c a l a de r e g i s t r o ( f i g . 9 ) . 5 ) 60 I OH A- 1 2 54 A. flavus F i g . 9 - R e l a c i o n e s e n t r e s e n a l e s de un A r o c l o r e s t a n d a r y un e x t r a c t s de m i c e l i o de A s p e r g i l l u s f l a v u s . 65 C o n s t a t a d a l a c o n s e r v a c i d n d e l p e r f i l c r o m a t o g r â f i c o , p a r a l a c u a n t i f i c a c i d n se c o n s i d é r a como s u p e r f i c i e s i g n i - f i c a t i v a l a c o r r e s p o n d i e n t e a l a suma de l o s 5 p i c o s mas — " r e l e v a n t e s " d e l c r o m a t o g r a m a . 3 - FRACCIONAHIENTO Y DETERMINACION DE COMPONENTES CELULARES. P a r a t o d o s a q u e l l o s e n s a y o s q u e , r e q u i r i e n d o una r e f e - r e n c i a e x a c t a a l a b i o m a s a de p r o c e d e n c i a, no e x i g e n l a co_n s e r v a c i d n de l a a c t i v i d a d e n z i m â t i c a , se p a r t e d e l m i c e l i o de seca do s o b r e P 2O5 a p r e s i d n l i g e r a m e n t e r e d u c i d a y en c a ­ mara f r i g o r i f i c a a 0 - 4 9 C. De l a s n u m e r o s a s s e c u e n c i a s de e x t r a c c i d n que se d e s - c r i b en en l a b i b l i o g r a f l a , l a s que c o m i e n z a n p o r l a s e p a r a - c i d n de l o s m a t e r i a l e s l i p f d i c o s ( p o r e j e m p l o ü g u r y Rosen, 1 950 ; H a r r i s , 1 957) o f r e c e n , en e l caso p a r t i c u l a r de e s t e t r a b a j o , l a v e n t a j a de que una a l f c u o t a d e l e x t r a c t o l i p i d i ^ co puede u t i l i z a r s e en l a d e t e r m i n a c i d n de l o s x e n o b i d t i c o s c o n t e n i d o s en e l m a t e r i a l b i o l d g i c o . Después de v a r i a s e n ­ s a y o s , s a t i s f a c t o r i o s en c u a n t o a l o que se r e f i c r e a l a — c u a n t i f i c a c i d n de l o s PCBs e x t r a i d o s con l a f r a c c i o n l i p f d i ^ c a , t a i e s s e c u e n c i a s m e t o d o l d g i c a s f u e r o n , no o b s t a n t e , r e ~ c h a z a d a s p o r p r o p o r c i o n a r v a l o r e s a n o r m a l m e n t e b a j o s de ----- o t r o s c o m p o n e n t e s . A s i m i s m o se e v i t a r o n l o s p r o c e d i m i e n t o s rnas o menos — f u n d a m e n t a d o s en e l c l â s i c o de S c h n e i d e r ( 1 9 4 5 ; 1957) y que u t i l i z a n a c i d o t r i c l o r o a c é t i c o p a r a l a e x t r a c c i d n de l o s — â c i d o s n u c l e i c o s . L as eu a n t i f i c a c i o n e s de e s t o s co mp on e n t es r e s u l t a b a n de e s t e modo menos r e p r o d u c i b l e s que en e l caso de u t i l i z a r â c i d o p e r c l d r i c o y , p ese a que hay a u t o r e s -------- 67 ( P a t t e r e t a l . 1 9 5 1 ; S c h n e i d e r , 1 9 5 7 ) que s e h a l a n l a i n t e r - f e r e n c i a en l a r e a c c i o n de l a d i f e n i 1 a m i n a ( v e a s e mâs a d e - - l a n t e ) de c i e r t o s c o m p o n e n t e s que c o e x t r a e n con l o s â c i d o s n u c l e i c o s t r a b a j a n d o con a c i d n p e r c l d r i c o s o b r e c e l u l a s h e - p â t i c a s , en e l c a s o de l a s c e l u l a s f u n g i c a s f u e e s t e u l t i m o m e t o d o e l q u e , d e s p u â s de d i v e r s o s e n s a y o s , r i n d i d r e s u l t a ­ dos mâs c o n s i s t a n t e s , A s i p u e s , y s i g u i e n d o con l i g e r a s m o d i f i c a c i o n e s l a s_e c u e n c i a m e t o d o l d g i c a de S n i b k n e t a l . ( 1 9 6 7 ) , se h o m o g e n e i - zan 5 0 - 1 0 0 mg d e l m a t e r i a l de p a r t i d a en m o r t e r o , con un - p e so d o b l e de a r e n a f i n a de c u a r z o l a v a d a a l o s â c i d o s y a l a s b a s e s y un v o l u m e n s u f i c i e n t e — 2 a 3 ml — de agua d e s ­ t i l a d a . E l h o m o g e n o t o se t r a n s f i e r e a un t u b o de c e n t r i f u g e y e l m o r t e r o se l a v a v a r i a s v e c e s con agua d e s t i l a d a , l a v a - d o s que se suman a l h o m o g e n a t o h a s t a c o m p l e t a r un v o l u m e n - de 8 m l . Se e n f r i a e l c o n j u n t o a 0 9 C y se aha den 0 , 8 ml de â c i d o p e r c l o r i c o 70 % . Se a g i t a i n t e r m i t e n t e m e n t e l a m e z c l a con u n a v a r i l J a de v i d r i o d u r a n t e 15 m i n u t o s y se c e n t r i f u ­ g e , e x t r a y c n r i o s e a c o n t i n u a c i â n e l s e d i m e n t o o t r a s d os v e - c e s c o n s é c u t i v e s — s i e m p r e a 0 9 C — con â c i d o p e r c l o r i c o a l 5 ^ . Tomando l o s s o b r e n a d a n t e s r e u n i d o s como f r a c c i d n " â c i - d o - s o l u b l e " , se p r a c t i c e s o b r e e l s e d i m e n t o u n a h i d r o l i s i s a l c a l i n a — NaOH - N / 10 h o r a s / 37 9 C — d e l RNA, La r e a c i d i f i ^ c a c i o n p r é c i p i t a p r o t e i n a s y DNA, d e j a n d o en s o l u c i o n l o s - p r o d u c t o s de l a h i d r o l i s i s d e l RNA, que se e x t r a e n con â c i ­ do p e r c l o r i c o a l 5 ^ , en f r i o . E l s e d i m e n t o o b t e n i d o d e s - - p u e s de d o s e x t r a c c i o n e s , c u y o s s o b r e n a d a n t e s r e u n i d o s se - u t i l i z a n p a r a l a v a l o r a c i o n d e l RNA, se s o m e t e a h i d r o l i s i s 6 8 a c i d a — de n u e v o c on â c i d o p e r c l o r i c o ( 1 , 5 % ) —■ a 90 9 C d u ­ r a n t e 20 m i n u t e s , t r a t a m i e n t o que d é g r a d a e l DNA d e j a n d o en s o l u c i o n l a s d e s o x i p e n t o s a s , E x t r a i d a s e s t a s t r a s d o s n u e ­ v a s c e n t r i f u g a c i o n e s , c u y o s s o h r e n a d a n t e s se e m p l e a n en l a v a l o r a c i o n d e l DNA, e l s e d i m e n t o se t r a t a s u c e s i v a m e n t e c o n : a) â c i d o p e r c l o r i c o a l 0 , 3 5 % on e t a n o l , b) e t a n o l - c l o r o f o r mo ( 3 : 1 ) , c ) d o s v e c e s c o n s é c u t i v e s con e t a n o l - é t e r e t i - l i c o a e b u l l i c i o n s u a v e . R e u n i d o s l o s s o b r e n a d a n t e s y l l e y a dos a un v o l u m e n c o n v e n i e n t e con é t e r de p e t r o l e o , se s ome- t e n a un l a v a d o a c u o s o , se f i l t r a n y se r e c o g e n en un r e c i ­ p i e n t s t a r a d o . E l i m i n a d o e l d i s o l v e n t e p o r e v a p o r a t i o n , e l p e s o d e l r e s i d u o r e p r e s e n t s una e v a l u a t i o n de l a c a n t i d a d - de I f p i d o s t o t a l e s ( l a f i g . 10 r e c o g e u n a e s q u e m a t i z a c i o n de l a a n t e r i o r s e c u e n c i a e x t r a c t i v a ) . En e l p r o c e d i m i e n t o o r i g i n a l do S h i b k o e t a l . ( 1 9 6 7 ) , e l s e d i m e n t o que q u e d a t r a s l a e x t r a c c i d n da l o o componentes l i p i d i c o s se u t i l i z e t o d a v i a en l a d a t e r m i n a c i d n do l a s p r £ t e i n a c , d e t e r m i n a t i o n que se r e d u c e a una m e ra g r a v i m e t r i a d e s p u é s do un p e r i u d o do 2 h o r a s do c a l e f a c c i o n a 105 9 C. N i l o s m i c e l i o s f u n g i c o s n i l a s l e v a d u r a s , s o n , s i n em ba r go — a l c o n t r a r i o que l a s c é l u l a s h e p â t i c a s , a l a s c u a l e s e s t a r o f e r i d o ' a q u e l p r o c e d i m i e n t o — a d e c u a d a m e n t e h o m o g e n e i z a - - b l e s con p r o o e d i m i e n t o s r e l a t i v a m e n t e s u a v e s , como e l a p a r ^ t o de P o t t e r - E l v e h j e m . L a n e c e s a r i a a d i c i O n de a b r a s i v o s , p o r t a n t o , y aun l l e v a n d o un r i g u r o s o c o n t r o l d e l p e s o a h a - d i d o , i n t r o d u c e e r r o r e s , que pue d en l l e g a r a s e r c o n s i d e r a ­ b l e s , en l a d e t e r m i n a t i o n de l a s p r o t e i n a s p o r g r a v i m e t r i a d e l s e d i m e n t o f i n a l s e c o , l o c u a l o b l i g a a v a l o r a r l a s s o b r e una a l l c u o t a d e l m a t e r i a l de p a r t i d a . De e s t e modo se o b v i a t a m b i é n e l p e l i g r o r e p r e s e n t a d o p o r l a s p o s i b l e s p é r d i d a s - 8 roi de HOMOGENATO l O p S m lH C l O ^ 70-;̂ a O a c / 1 5 min f -------- "SDBRENAD. FRACCION ACIDO SOLUBLE t f SOBRENAD, ¥ I— SOBRENAD. PENTOSAS (RNA) DESGXIPENTOSAS (DNA) f- - SOBRENAD. SOBRENAD. SOBRENAD. r D S C SEDIM. iB r o l HCIO^ S% (10 min/OOC) O Q C 2 veces % SEDIM. 4 4 ,5 ml NaOH-N (10 h /3 ? 0 C ) 4 2 roi HG104?0?SÙo roin/OGC) 0 9 C » SEDIM. 4 8 ml HCIO4 5% a OQC » SEDIM. 4 7 m l HCIO4 1,5^ (20 mln/90QC) 4 0 ,5 roi HCIO4 70^ a OQC i SEDIM. 4 8 roi HCIO4 1 , 5 ^ SEDIM. - GXtracc idn s u c e s i v a con : a ) 8 roi HC10^0,35/S en e t a n o l b) 8 roi e t a n o l - c l o r o f o r m o ( 3 : 1 ) c) 10 ml e t a n o l - e t e r e t f l i c o (3 :1 ) , 3 min a o b u ll. (2 veces ) 1 S08RENADS. 4 é t e r de p e t r o l e o a 60 ml 4 50 ml de aoua d e s t i l a d a SEDIM. r PROTEINAS FASE ORGANICA Se f i l t r a y recoga en un r e c i p i e n t e t a r a d o . FASE ACUOSA LIPIDOS F i g . 10 - S e c u e n c i a e x t r a c t i v e u t i l i z a d a p a r a e l f r a c c i o n a m i e n t o de c o m p o n e n t e s c e l u l a r e s * Segun S h i b k o e t a l * ( 1 9 6 7 ) , con l i g a r a s m o d i f i c a c i o n e s * 70 p o r s o l u b i l i z a c i d n i r r e v e r s i b l e d u r a n t e l a h i d r o l i s i s a l e s - l i n a d e l RNA, A s i m i s m o , e l e x t r a e t e l i p f d i c o r é s u l t a i n u t i l p a r a una c u a n t i f i c a c i o n c o r r e c t e de l o s x e n o b i d t i c o s a c u m u l a d o s p o r e l m i c r 0 0 r g a n i s r n o a l o l a r g o d e l p e r i o d o de i n c u b a c i d n , P e - 8 0 a l a e s c a s i s i m a h i d r o s o l u b i l i d a d da l o s PCBs, y a u n q u e - su e l e v a d a e s t a b i l i d a d q u f m i c a l e s p e r m i t e r e s i s t i r t o d o s - l o s t r a t a m i e n t o s d e s c r i t o s , l o s v a l o r e s d e t e r m i n a d o s s o b r e a q u e l e x t r a c t o v i e n e n a f e c t a d o s de u n o s i n d i c e s de r e c u p e r a ^ b i l i d a d t a n b a j o s , que es p r e c i s e l l e v a r a cabo su d e t e r m i - n a c i d n a p a r t i r da o t r a a l f c u o t a d e l m a t e r i a l b i o l d g i c o d e - S B c a d o . L o s e x t r a c t o s de RNA y DNA se c o n s e r v a n en r é f r i g é r a - d o r a 0 ~ 4 9 C h a s t a e l memento do su v a l o r a c i d n , qua an n i j i gun c a s e se p o s p o n c p o r un p e r i o d o s u p e r i o r a u na semana . 3 . 1 - VALORACION DEL DNA (REACCIÜN DE DISCHE 0 DE LA D I F E N I L A M I N A ) . E n t r e l a a b o n d a n t e m e t o d o l o g f a d i s p o n i b l e p a r a l a v a l o ­ r a c i d n d e l DNA — a t r a v d s de l a cu an t i f i c a c i d n de su con t e n do b i e n en f o s f a t o , b i e n en b a s e s n i t r o g e n a d a s o b i e n en des_ o x i r r i b e s a —, l a d o t e r m i n a c i d n de e s t e u l t i m o c o m p o n e n t s p o r m e d i o de m o d i f i c a c i o n e s mas o menos s u s t a n c i a l e s de l a c l a s i ^ c a r e a c c i d n ds D i s c h e ( 1 9 3 0 ) , con d i f e n i l a m i n a en un a m e z c l a do a c i d o a c e t i c o y a c i d o s u l f u r i c o a 100 9 C, c o n s t i t u y e uno de l o s p r o c e d i m i e n t o s mas amp 1 i amen t e u t i l i z a d o s y a l que se ha d e d i c a d ü u n a m a y o r a t o n c i d n . B u r t o n ( 1 9 5 6 ) r n a j o r d l a s e n s i b i l i d a d y l a e s p e c i f i c i d a d de d i ci 10 m e t o d o s u s t i t u y e n d c l a c a l e f a c c i d n a 100 S C / 100 mj^ n u t o s d e l o r i g i n a l , p o r u n a " i n c u b a c i d n " a 30 9 C / 16 - 20 h a ­ r a s , y e x a l t a n d o c l d e s a r r o l l o de l a c o l o r a c i d n — max ima de a b s o r b a n c i a a 600 nm — m e d i a n t e l a a r i i c i d n de a c e t a l d e h i d c - a l r é a c t i v a , a d i c i o n que m e j o r a a s i m i s m o l a p r o p o r c i o n a l i r i a d de l a r e s p u ü s t a e s p e c t r o f o t o m d t r i c a y que no s u r t e e f e c t o — c on c a l e f a c c i o n e s mas d r â s t i c a s . E l m e t o d o de B u r t o n , p u e s , c o n s i s t e en : REACTIUG D i f e n i l a m i n a 1 , 5 g A c i d o a c e t i c o ...................... 100 ml A c i d o s u l f u r i c o c o n c . . . . 1 , 5 " 72 La m e z c l a d ob e g u a r d a r s e en f r a s c o t o p a c i o y l u g a r o s - e u r o , y r é s u l t a i n u t i l i z a b l e s i d e s a r r o l l a c o l o r a c i d n a z u l a - da ( f r G c u e n t e m e n t e d e b i d a a u n a c a l i d a d i n a d e c u a d a d e l a c i d o a c e t i c o ) . I n m e d i a t a m e n t a a n t e s de l a v a l o r a c i d n se l e ana d e un 0 , 5 % ( v / v ) de u n a s o l u c i d n a c u o s a a l 1 , 6 % ( p / v ) ds a c e t a l d e h i d o , Un v o l u m e n ( 1 - 2 ml ) de l a s o l u c i d n a v a l o r a r se m e z c l a con d a s v o l u m e n e s d e l r e a c t i v o a s i p r e p a r a d o y , — d e s p u e s de l a i n c u b a c i d n en l a s c o n d i c i o n e s i n d i c a d a s , se mi de su a b s o r b a n c i a a 600 nm f r e n t e a un p a t r d n a d e c u a d o ( u n a s o l u c i d n de DNA s o m e t i d a a i d e n t i c o t r a t a m i e n t o , o u n a s o l u ­ c i d n de d e s o x i r r i b o s a ) . Po 3 t e r i o rrrien t o , G i l e s y M y e r s ( 1 9 6 5 ) i n t r o d u j e r o n o t r a m o d i f i c a c i d n q u e , e s p e c i a l r n e n t e en t e j i d o s v é g é t a l e s , s i g n i ­ f i e s un p e r f e c c i o n a m i en t o d e l m e t o d o de B u r t o n î e l e v a r o n l a c a n t i d a d de d i f e n i l a m i n a en e l a n t e r i o r r e a c t i v o a 4 g — s u - p r i m i e n d o e l a c i d o s u l f u r i c o s i l a s o l u c i d n a v a l o r a r c o n t i ^ no y a a c i d o p o r c l d r i c o a l 1 0% — , a n a d i e n d o e l a c e t a l d e h i d o no a l r é a c t i v a , s i n o a l a m e z c l a de i n c u b a c i d n , en l a c u a l , p o r o t r a p a r t e , s o l u c i d n a v a l o r a r y r e a c t i v o c o n t r i b u y e n — - c on v o l u m e n e s i q u a l e s . A s i , a 2 ml de l a s o l u c i d n a v a l o r a r se l e a n a de n 2 ml de r e a c t i v o y 0 , 1 ml de u n a s o l u c i d n a c u o - s a a l 0 , 1 6 % ( p / v ) de a c e t a l d e h i d o ( q u e v i e n e a r e p r e s e n t a r un 0 , 0 0 4 % p / v en l a m e z c l a , f r e n t e a l 0 , 0 0 5 % p / v d e l c a ­ se a n t e r i o r ) . D e s a r r o l l a d o e l c o l o r en l a s m is ma s c o n d i c i o ­ n e s qua l a s e s p e c i f i c a d a s p o r B u r t o n , l a a b s o r b a n c i a se m i - de a h o r a a 5 95 nm, c o r r i g i e n d o e l v a l o r o b t e n i d o p o r s u s t r a £ c i d n d e l h a l l a d o a 700 nm, con o b j e t o de m i n i m i z a r e l e r r o r d e b i d o a l a t u r b i d e z , muy f r e c u e n t e en e x t r a c t o s v e g e t a l e s . En e s t e t r a b a j o se h an t e n i d o en c u e n t a t o d o s l o s a s p e c 73 t o 3 de l a a n t e r i o r e v o l u c i d n m e t o d o l o g i c a , p e r o h a b i e n d o s e c o n s t a t a d o que l a a p l i c a c i d n d e l m e t o d o de G i l e s y M y e r s — mas s e n s i b l e que e l de B u r t o n — c o n d u c i a a menudo a v a l o ­ r e s e x c e s i v o s de l a c o r r e c c i o n p o r t u r b i d e z , y e n s a y a d a s d i - f e r e n t e s p r o p o r c i o n e s e n t r e l o s c o m p o n e n t e s d e l r e a c t i v o a n ­ t e s a n o t a d o , se e n c o n t r d que l o s r e s u l t a d o s mas s a t i s f a c t o - r i o s c o r r e s p o n d £ a n a u n a s o l u c i d n de 3 g de d i f e n i l a m i n a y 1 ml de a c i d o s u l f u r i c o c o n c e n t r a d o en 100 ml de a c i d o a c é t i ^ c o . En e l r e s t a d e l p r o c e s o se o p e r d s e gu n l a s e s p e c i f i c a c i £ n é s de G i l e s y M y e r s , s a l v o en l o que c o n c i e r n o a l a p r o p o r - c i d n de a c e t a l d e h i d o ( a l a m e z c l a de i n c u b a c i d n se a n a de 0 , 1 m l de un a s o l u c i d n a c u o s a a l 0 , 2 % de é s t e ) . L a s c o n c e n t r a c i o n e s de d e s o x i r r i b o s a en l o s e x t r a c t o s - se o b t i e n e n p o r i n t e r p o 1 a c i d n do l a s a b s o r b a n c i a s l e f d a s en u n a r e c t a de c a l i b r a d o d e t e r m i n a d a p o r a j u s t e — s egu n e l me­ t o d o de l o s m f n i m o s c u a d r a d o s — de l a s l e c t u r a s c o r r e s p o n - - d i e n t e s a u n e s e r i e de d i l u c i o n e s do u n a s o l u c i d n s t a n d a r d - do d e s o x i r r i b o s a . L a s s o l u c i o n e s a c u o s a s de d e s o x i r r i b o s a , a l menos a c o £ c e n t r a c i o n e s que no e x c e d a n de 1 mM, se c o n s e r v a n e s t a b l e o , r e f r i g e r a d a s a 0 - 4 9 G, d u r a n t e a l menos 3 - 5 m e s e s , p u d i e n - do s e r u t i l i z a d o s como e s t a n d a r d e n t r o de e s t e p e r i o d o . An­ t e s de su e rnp l eo es p r e c i s e a c i d i f i c a r 1 as con a c i d o p e r c l d r i ^ co h a s t a un pH é q u i v a l e n t e a l de l o s e x t r a c t o s de DNA a de - t e r m i n e r ; de o t r o modo l a s i n t e n s i d a d e s de c o l o r en s t a n d a r d s y p r o b l è m e s no r e s u l t a n h o m o l o g a b l e s . Es c o n v e n i e n t e , as imi_s mo, p r e p a r a r e l r e a c t i v o de d i f e n i l a m i n a i n m e d i a t a m e n t e a n ­ t e s de su u t i l i z a c i o n . 3 . 2 - VALORACION DEL RNA (REACCIDN DE ME3BAUM, 0 DEL D R C I N O L ) . En s i t u a c i d n a n a l o g a a 1 a d e l c a s o a n t e r i o r , de l o s d i - v e r s o s p r o c e d i m i c n t o s d i s p o n i b l e s p a r a l a v a l o r a c i d n d e l RNA, sa o p t o p o r l a d e t e r m i n a c i d n de r i b o s a . B a s ad o en l a tarn b i e n c l a s i c a r e a c c i d n de Mejbaurn ( 1 9 3 9 ) , e l m e t o d o d e s c r i t o p o r S c h n e i d e r ( 1 9 5 7 ) , y a l que en l a a c - t u a l i d a d s i g u e r e c u r r i en do se a m p l i a m e n t e , c o n s i s t e on : REACTIVO G r c i n o l ......................... 1 , 0 g F e C l ^ 0 , 5 n CIH c o n c e n t r a d o • • • 100 ml E l r e a c t i v o d eb e p r e p a r e r s o p o r a d i c i d n d e l o r c i n o l a - l a s o l u c i d n de c l o r u r o f e r r i c o en c l o r h f d r i c o i n m e d i a t a m e n t e a n t e s de c o m e n z a r e l p r o c e s o de v a l o r a c i d n . E s t a se l l e v a a c a b o a n a d i e n d o un v o l u m e n — 1 , 5 a 2 ml — de r e a c t i v o a un V £ l u m e n i g u a l de l a s o l u c i d n a v a l o r a r y s o m o t i e n d o e l c o n j u n ­ t o a c a l e f a c c i d n en bano de a gu a a e b u l l i c i d n d u r a n t e 20 m i ­ n u t e s , L a i n t e n s i d a d d e l c o l o r v e r d e d e s a r r o l l a d o se mi de s_e g u i d a m e n t e a 650 nm. En e s t e t r a b a j o se u t i l i z a un r e a c t i v o en e l que l a coj i c e n t r a c i d n de C l ^ F e se r e b a j a h a s t a un 0 , 0 3 3 % ( p / v ) , l o - c u a l , segu n s e n a l a n O g u r y Rosen ( 1 9 5 0 ) , c o n t r i b u y e a r e d u - 75 c i r l a r e s p u e s t a de l o s b l a r s c o s a l misn io t i e r n p o que e l e v a l a s e n s i b i l i d a d d e l m e t o d o . L a s c o n c e n t r a c i o r . e s de l a s s o l u c i o n e s a v a l o r a r se mi - den f r e n t e a s o l u c i o n e s p a t r o n de r i b o s a c o n s e r v a d a s y t r a t a d a s en modo s i m i l a r a como que d d d e s c r i t o p a r a l a s de d e s o x £ r r i b o s a , l l e v a n d o s e a c a b o e l c a l c u l e , a s i m i s m o , p o r a n a l o g o p r o c e d i m i e n t o . 3 . 3 - E X T R A C C I O N Y V A L OR A C I ON DE P R O T E I N A S . Una a l f c u o t a — 20 a 40 mg — de m a t e r i a l b i o l d g i c o d e s e - c a d o se h o m o g e n e i z a en m o r t e r o con a r e n a f i n a de c u a r z o y un v o l u m e n c o n v e n i e n t e — 1 a 2 ml — de Na OH- I N , R e c o g i d o e l h £ m o g e n a t o en un t u b o de c e n t r f f u g a a l que se ana den l o s l a v a - d o s d e l m o r t e r o ( t a m b i e n con NaOH- I N ) h a s t a a l c a n z a r un v o ­ l u m e n de a p r o x i m a d a m e n t e 8 m l , se m a n t i e n e e l c o n j u n t o en ba no de a gu a a e b u l l i c i d n , d u r a n t e 1 0 m i n u t a s , a g i t a n d o i n t e r ­ m i t en t emen t e con u n a v a r i l l a da v i d r i o . D e s p u e s de c e n t r i f u - g a r , e l s e d i r n e n t o se r e e x t r a e a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e d e l m i £ mo modo , L o s s o b r e n a d a n t e s r e u n i d o s se u t i l i z a n on l a d e t e r ­ m i n a c i d n de p r o t e i n a s . E s t a so l l e v a a c a b o s i g u i e n d o e l p r o c e d i m i e n t o d e l m i ­ c r o b i u r e t d e s c r i t o p o r Goa ( 1 9 5 3 ) y q u e , p r o p o r c i o n a n d o u n o s v a l o r e s c o h e r e n t e s con l o s o b t e n i d o s p o r e l m e t o d o do K j e l - d a h l , r é s u l t a , e n t r e l a s t e c n i c a s u s u a l e s , l a de a p l i c a c i d n mas s e n c i 1 1 a . P a r a e l l o , se m e z c l a n en e l o r d e n y p r o p o r c i o n e s v o l u n m t r i c a s i n d i c a d a s : 1 - e x t r a c t o p r o t e i c o a v a l o r a r . . . 0 , 5 ml 2 - NaOH - IN 2 , 0 " 3 - R e a c t i v o de B e n e d i c t 0 , 2 " 77 C o n s i s t i e n d o e l r e a c t i v o de B e n e d i c t : C i t r a t o s d d i c o c r i s t a l i n o . « • 1 7 , 3 0 g N a 2 C0 2 a n h i d r o 1 0 , 0 0 " CUSO4 . SH^O 1 , 7 3 " Agua d e s t i l a d a ......................... c . s . p . 100 ml D e s p u e s de un i n t a r v a l o de a l r e d e d o r de 20 m i n u t e s a - - t e m p e r a t u r e a m b i e n t e , d u r a n t e e l c u a l so d e s a r r o l l a y es t ab_ i l i z a e l c o l o r , se m i d e l a a b s o r b a n c i a a 330 nm f r e n t e a un - b i a n c o en e l que l a s o l u c i d n p r o t e i c a so s u s t i t u y e p a r un v £ l u m e n e q u i v a l e n t s de NaOH - I N , E l c a l c u l e de l a s c o n c e n t r a c i o n e s de p r o t e r n a se l l e v a a c a b o , de modo a n a l o g o a l e m p l e a d o en l o s c a s e s ds l a r i b o ­ s a y d e s o x i r r i b o s a , p o r i n t e r p o l a c i d n on una r e c t a de c a l i ­ b r a d o o b t e n i d a con un s t a n d a r d de a l b u m i n a b o v i n e . En l a s s £ l u c i o n e s de a l b u m i n a p a r a e l c a l i b r a d o no c o n v i e n s e x c s d e r - l a c o n c e n t r a c i d n de 5 r n g / ml ( a l r e d e d o r de 1 m g / ml en l a s - c u b e t a s de m e d i d a ) . Un i n t e r v a l e a c o n s e j a b l e p a r a t a l e s s o - l u c i o n e s es e l c o m p r e n d i d o e n t r e 0 , 1 y 3 , 0 m g / m l . 3 . 4 - V A L OR A C I O N DE A C I DO K O J I C O . A p a r t i r de l a r e v i s i o n de F o s t e r ( 1 9 4 9 ) e l m e t o d o mas g e n e r a l i z a d o p a r a l a v a l o r a c i d n d e l a c i d o k d j i c o ( 2 - h i d r o - x i m e t i l - 5 - h i d r o x i - % - p i r o n a : I ) 0 se b a s a en l a f o r m a c i d n de un com- HO p i e j o f e r r i c o en m e d i o de a c i d o — c l o r h f d r i c o d i l u i d o , con u l t e r i o r OH m e d i d a a 540 nm do l a c o l o r a c i d n - ^ ^ d e s a r r o l l a d a , ( I ) La e l e v a d a h i d r o s o l u b i l i d a d d e l a c i d o k d j i c o ( 3 , 9 5 g / 1 0 0 m l ) d e t e r m i n e que l a m a y o r p a r t e d e l s i n t e t i z a d o p o r e l m i c r o o r g a n i s m o se l i b e r e a l m e d i o de c u l t i v o , don de p u e d e - v a l o r a r s n d i r e c t a r n e n t e , s i n n e c c s i d a d do p r o c e s o e x t r a c t i v e p r e v i o . En o c a s i o n e s es n e c e s a r i a , on c a m b i o , l a p r e v i a d e £ p r o t e i n i z a c i d n d e l m e d i o de c u l t i v o , quo p u e de l l e v a r s e a - c a bo p o r p r e c i p i t a c i d n do l a s p r o t e i n a s con a c i d o t r i c l o r o - a c e t i c o en c o n c e n t r a c i o n e s do h a s t a e l 1 % en l a s o l u c i d n - f i n a l . S i g u i e n d o l a m o d i f i c a c i d n de B e n t l e y ( 1 9 5 7 ) a l m e t o d o do A r n s t e i n y B e n t l e y ( 1 9 5 3 ) , p a r a l a v a l o r a c i d n so ana d en 4 m l do u n a s o l u c i d n a l 1 % de F e C l g en HCl 0 , 1 n a u n a a l ^ c u o t a d e l m e d i o o b j e t o de e n s a y o . D i l u i d o e l con j u n t o a 10 m l con m e d i o de c u l t i v o f r e s c o , se m i d e ^ c o n t i n u a c i d n l a - a b s o r b a n c i a a 540 nm f r e n t e a un b i a n c o o b t e n i d o p o r a d i - - c i d n de m e d i o f r e s c o y r e a c t i v o en p r o p o r c i o n e s e q u i v a l e n - 79 t e s a i as de l o s e n s a y o s . P a r a o i c a l c u l e de l a s c o n c e n t r a - c i c n e s se u t i l i z a u n a r e c t a de c a l i b r a d o d e t e r m i n a d a de mo­ do a n a l o g o a como se d e s c r i b i d en a n t e r i o r e s a p a r t a d o s . C o n v i e n s a d v e r t i r que en l o s c a s a s en que se h a c e n e c e s a r i a l a u t i l i z e c i d n d e l a c i d o t r i c l o r o a c e t i c o , l a r e a c c i d n p i e r d e s e n s i b i l i d a d , i n c o n v é n i e n t s que p u e d e o b v i a r s e e l e - v a n d o l i g e r a m e n t e — h a s t a un 2 % — l a c o n c e n t r a c i d n d e l F e C l g en e l r e a c t i v o . L a d o t e r m i n a c i d n d e l a c i d o k d j i c o que p e r m a n e c o en e l m i c e l i o se p u e d e l l c v a r a c abo s o b r e e s t e m a t e r i a l d e s e c a d o y h o m o g e n e i z a d o en l a f o r m a u s u a l . D e s p u es de un a e x t r a c — c i d n p r e v i a con e t o r de p e t r o l e o ( L a h o z e t a l . , 1 9 6 5 ) a f i n de e l i m i n a r i n t e r f e r e n c i a s l i o i d i c a s , se r e e x t r o e en S o x h l e t con d t e r e t f l i c o . E l i m i r . a d o e l d i s o l v e n t e en r o t a v a p o r , se t r a t a e l r o s i duo s d l i d o con H9 Ü d e s t i l a d a en bano de agua a 60 2 C d u r a n ­ t e u n o s m i n u t o s . 5e f i l t r a a t r a v é s de p a p e l Ua tman y , a - - c o n t i n u a c i d n , se p a s a n s o b r e e s t e dos l a v a d o s mds d e l r e c i ­ p i e n t e en e l que se l l e v d a cabo l a e v a p o r a c i d n con a g u a — d e s t i l a d a t e m p l a d a . Una v e z l l e v a d a l a s o l u c i d n f i l t r a d a a un v o l u m e n c o n v e n i e n t e , se p r e c e d e a l a v a l o r a c i d n d e l a c i ­ do k d j i c o en l a f o r m a y a i n d i c a d a . 4 - ENSAYO DE ALGUNAS ACTIVIDADES ENZÎMATICAS CARACTE- RISTICAS DE LA FRACCION MICROSOMICA. 4 . 1 - PREPARATION DEL MATERIAL BIOLDGICO. S i e n do e l o b j e t o de e s t o s en s a y o s l a c o m p a r a c i d n e n t r e l o s n i v e l e s de c i e r t a s a c t i v i d a d e s e n z i m â t i c a s — r e l a c i o n a - d a s , en o t r a s e n t i d a d e s b i o l d g i c a s , con e l m e t a b o l i s m o de - x e n o b i d t i c o s , y l o c a l i z a d a s en l a f r a c c i d n m i c r o s d m i c a — en m i c r o o r g a n i s m o s d e s a r r o l l a d o s en c o n d i c i o n e s " c o n t r o l " , ------ T r e n t e a l o s i n c u b a d o s en p r è s e n c i a de d i s t i n t o s A r o c l o r , - e l m a t e r i a l b i o l d g i c o de p a r t i d a c o n s i s t e en l a s c o s e c h a s - q ue , a l cabo de i d é n t i c o s p e r i o d o s de i n c u b a c i d n , se o b t i e ­ ns de t a i e s c u l t i v o s . L a c o n c e n t r a c i d n de A r o c l o r u t i l i z a d a e s , en t o d o s l a s c a s a s , de 25 ppm. S e p a r a d o s m ed io y m i c e l i o y l a v a d o e s t e u l t i m o v a r i a s v e c e s con ta mp dn f o s f a t o 0 , 1 M, pH = 7 , 4 , s o b r e un embudo B ü c h n e r , se p r o c é d é s e g u i d a m e n t e a s u . h o m o g e n e i z a c i d n . 4 . 1 . 1 - HOMOGENEIZACIDN. I n t e n t a d a e s t a m e d i a n t e e l d i s p o s i t i v o de P o t t e r - E l - v e h j e m , se c o m p r ob d que e l metodo r e s u l t a b a a b s o l u t a m e n t e i n a d e c u a d o p a a e l A. f l a v u s . S i b i e n l o s a g l o m e r a d o s de - m i c e l i o se d i s g r e g a n con f a c i l i d a d , l a s h i f a s a i s l a d a s pre_ s e n t a n un g r a d o muy e s c a s o de r o t u r a aun d e sp u é s de p e r i o - 8 1 d o s de t r a t a m i e n t o p r o l o n g a d o s ( d e s p u é s de un c i e r t o t i e r n p o , l a p r o l o n g a c i o n d e l t r a t a m i e n t o no a u m e n t a s i g n i F i c a t i vameni t e e l g r a d o de r o t u r a ) . M a j o r e s r e s u l t a d o s , p e r o t o d a v f a i n s a t i s f a c t o r i o s , p r £ p o r c i o n a l a p r e n s a de F r e n c h , d i s p o s i t i v o m e d i a n t e e l c u a l u n a r n u e s t r a de m a t e r i a l c e l u l a r — s o b r e e n f r i a d a a - 2 5 9 C — se h a c e p a s a r a t r a v é s de un o r i f i c i o de r e d u c i d a s d i m e n s i £ n é s , a p l i c a n d o , con un a p r e n s a " a d h o c " , u n a p r e s i d n e l e v a ­ d a . A u n q u e e l g r a d o de r o t u r a a s f c o n s e g u i d o es muy s u p e ­ r i o r a l que se o b t i e n s c on e l P o t t e r , se e s t a b i l i z a t a m b i ê n , d e s p u é s de 4 a 5 r e p e t i c i o n e s d e l p r o c e s o , en u n a p r o p o r - c l o n e s i n s u f i c i e n t e s . L a h o m o g e n e i z a c i d n de l a r n u e s t r a s o b r e e n f r i a d a a - 2 5 3 C con a r e n a f i n a de c u a r z o , en m o r t e r o de p o r c e l a n a no e s m a l - t a d a , se r e v e l o como l a t e c n i c a mas a c e p t a b l e . D u r a n t e e l - t r a t a m i e n t o , e l m o r t e r o se m a n t i e n e en un baho de h i e l o — N a C i ^ e t a n o l . P a r a que e l p r o c e s o p r o p o r c i o n g un r e n d i m i e £ t o mas o menas s a t i s f a c t o r i o , que d e b s s a g u i r s a p o r o b s e r - v a c i d n m i c r o s c o p i e s , e l h o m o g e n e i z a d o o b t e n i d o d e s p u é s de - u n o s 1 5 — 20 m i n de m a n i p u l a c i d n se s u s p e n d e en un v o l u m e n - c o n v e n i e n t e d e l t a m p o n a n t e s i n d i c a d o y se c e n t r i f u g e 15 m£ n u t o s a b a j a v e l o c i d a d . R e c o g i d o e l s o b r e n a d a n t e , se r e p i t e c o n e l s e d i m e n t o e l p r o c e s o s o b r e e n f r i a m i e n t o / h o m o g e n e i z a ­ c i d n / c e n t r i f u g a c i d n . C u a t r o de e s t a s r e p e t i c i o n e s son s u f £ c i e n t e s , p o r l o g e n e r a l , p a r a a l c a n z a r un g r a d o a d e c u a d o de r o t u r a . L o s s o b r e n a d a n t e s r e u n i d o s d e b en s o m e t e r s e , u l t e r i o r - m e n t e , a 5 - 6 s e s i o n e s de s o n i c a c i d n — m e t o d o que a p l i c a d o 8 2 a l m i c e l i o i n t a c t o m o a t r o u n a e s c a s i s i m a e f i c a c i a ~ de 30 s e g u n d o s c a d a u n a . A u n q u e con e l l o no se a l c a n z a n o r m a l m e n - t e un m a y o r g r a d o de r o t u r a , se c o n s i g u e e x t r a e r de muchos f r a g m e n t e s h i f a l e s e l c o n t e n i d o c i t o p l â s m i c o aun a d h e r i . d o a l a s p a r e d e s c e l u i a r e s . 4 . 1 . 2 - SEPARACION DE LA FRACCION MICROSOMICA. E l p r o c e d i m i e n t o e s t a n d a r p a r a l a o b t e n c i d n de m i c r c j somas a p a r t i r de u n a s u s p e n s i o n de m a t e r i a l c e l u l a r d e b i d a m e n t e h o m o g e n e i z a d o , p u e d e e s q u o m a t i z a r s e como s i g u e : HÜMOGENEIZ. f SEDIM 9 000 g / 10 - 30 m i n / 0 - 4 Q C SOBRENAD. SOBRENAD. 105 000 g / 50 - 120 m in / 0 - 4 9 C y SEDIM. (FRACCION MICROSOMICA) C o n v i e n e s e n a l a r no o b t a n t e , que en l a b i b l i o g r a f i a -■ a b u n d a n l a s r e f e r e n c i a s a " f r a c c i o n e s m i c r o s d m i c a s " que d i - f i c i l m e n t e p u e d e n c o n s i d e r a r s e h o r n o l o g a b l e s . 83 En p r i m e r l u g a r , e l m a t e r i a l b i o l d g i c o de p a r t i d a , a s i como l a s m a n i p u l a c i o n e s p r e v i a s a que se s o m e t e , a f e c t a n t a n t o a l t a m a n o m e d i o como a l r a n q o de t a m a n o s de l o s f r a g - m o n t o s de r e t i c u l o e n d o p l â s r n i c o q u e , en r i g o r , c o n s t i t u y e n l a f r a c c i d n r n i c r o s d m i c a . P o r l o q u e , d e l mismo modo que es p o s i b l e l a p e r d i d a de f r a g m e n t e s g r a n d e s en e l s e d i m e n t o de 9 000 g , l o es t a r n b i é n l a c o n t a m i n a c i d n d e l s e d i m e n t o de 105 000 g c on o t r o s c o m p o n e n t e s c e l u l a r e s ( e s p e c i a l m e n t e m i - t o c o n d r i a s de p e q u e n o t a m a n o ) . E l a n t e r i o r esquerna , a m p l i a y s a t i s f a c t o r i a m e n t e a p l i c a d o a m a t e r i a l e s como e l h i g a d o - de m a m f f e r o s , no g a r a n t i r a , p u e s , l a o b t e n c i d n de f r a c c i o - n e s m i c r o s d m i c a s p u r a s en o t r o s c a s a s , p r o c e s o que e x i g e , - aun en e l a n t e r i o r t o j i d o , un s o g u i m i e n t o m i c r o s c d p i c o de - l a s e c u e n c i a o p e r a t o r i a . P o r o t r a p a r t e , son f r e c u e n t e s l o s a u t o r e s que u t i l i ­ zan f r a c c i o n o s m i c r o s d m i c a s aun menos d e p u r a d a s , como e l s £ b r e n a d a n t o de 22 000 g / 25 m i n ( Yu e t a l . 1 9 7 1 , t r a b a j a n d o - c on r a i z de j u d f a ) o i n c l u s o o l s o b r e n a d a n t e do 9 000 g / 30 m i n ( S m i t h y van L o o n , 1969 y L i t t e r s t e t a l . 1 9 7 2 , ambos - g r u p o s t r a b a j a n d o c on h f g a d o de r a t a ) . E s t e u l t i m o p r o c é d e r p r é s e n t a l a v e n t a j a , a l menos en l o s e s t u d i o s que i r n p l i c a n a l a s o x i d a s a s de f u n c i d n m i x t a , de no s é p a r e r l a f r a c c i d n m i c r o s d m i c a p r o p i a m e n t e d i c h a de u n a s e r i e de c o f a c t o r e s p r é s e n t e s en l a f r a c c i d n s o l u b l e y e s e n c i a l e s p a r a e l f u n c i o n a m i e n t o de l a s O . F . M . m i c r o s d m i ­ c a s . M i t o m a e t a l . ( 1 9 5 5 ) , p o r e j e m p l o , e s t u d i a n d o e l p r o c e so de h i d r o x i 1 a c i d n a r o m â t i c a en h f g a d o de c o n e j o , e n c u e n - t r a n que l a a c t i v i d a d e n z i m â t i c a que se m a n i f i e s t a en e l so_ b r e n a d a n t e de 9 000 g / 10 m i n u t o s — m i c r o s o m a s mas f r a c c i d n 8 4 s o l u b l e — , f lO üs d e r n u s t r a b l e n i en e l s e d i m e n t o dE3 100 000 g / / 3 0 m i n u t o s — m i c r o s o m a s — , n i cn e l e n r r e s p o n d i e n t e s o b r e - n a d a n l e — f r a c c i d n s o l u b l e — on s a y ado s a i s i a d a m e n t e . L o s ya c i t a d ü s Yu e t a l , ( l 9 7 l ) , p a r o t r a p a r t e , e n c u e n t r a n que — t a n t o l a e p o x i d a c i o n como l a d i h i d r o x i l a c i d n d e l a l d r i n en r a f z de j u d i o , se l o c a l i z a n muy p r e f e r e n t e m e n t e en e l s o b r £ n a d a n t e de 22 000 g / 2b m i n u t o s , m a n i T e s t a n d o s e a c t i v i d a d e s mas rnod B r a d a s — a v e c e s muy b a j a s — on e l co r r es po n d i en t e - s e d i m e n t o , a s f como en s o b r e n a d a n t e y s e d i m e n t o de 105 0 0 0 g / / 1 2 Ü m i n u t o s . En o l c a s o d e l h f g a d o do c o n e j o , l a a d i c i d n de un s i s - t c m a g o n o r a d n r de NADPH4 H'*’ (NADP'^en p r c s e n c i a , p o r e j o m p l o , d e l s i s t o i n a g l u c a s a - 6 - f o s f a t o 4 g l u c o s a - 6 - f o s f a t o d e s h i - d r o g o n a s a ) a l s e d i m e n t o de 100 000 g , r e c o n s t i t u y e un 7 0 - - 0 0 % de l a a c t i v i d a d h i d r o x i l a n t e h a l l a d a en e l s o b r e n a d a n t o do y 000 g , l o c u a l i n d i c e que l a c o n t r i b u c i d n do l a f r a c c i d n s o l u b l e a t a l a c t i v i d a d r a d i e r . , a l menos f u n d a m e n t a l - m o n t e , on l a r o d u c c i d n d o l NAOP* . No es e s t a , s i n e m b a r g o , l o s i t u a c i d n cn l o r a f z do j u d f a , d o n d e t n d n s l a s f r a c c i o - n o s se e n s a y a n s up l e r n e n t a d a s con un s i s t e m a g e n e r a d o r de - - NAOPH4 H+. C abo , p u e s , p e n s e r en l a i n t e r v e n c i d n de o t r o s c o f a c t £ r es e s e n c i a l e s p a r a e l l o g r o de un mâx imo de a c t i v i d a d , P o r e s t a s r a z o n e s , y en l a t o t a l aus en c i a de b i b l i o g r a f i a mas o menos i n d i c a t i v a , que t r a t e e s t a p r o b l e m a t i c s en m a t e r i a l e s b i o l d g i c o s de n a t u r a l e z a f u n g i c a , en e l p r é s e n t a t r a b a j o se o p t d p o r l a u t i l i z a c i o n de l a f r a c c i d n mas i n t e ­ g r a p o s i b l e . A s f , e l homogeneizado o b t e n i d o p o r e l p r o c e d i m i e n 8 5 t o a n t e s d e s c r i t o , se c e n t r i f u g e a 9 Ü00 g / 2Ü m i n u t o s / / 0 - 4 2 C • D o s e c h a d o e l s e d i m e n t o , e l s o b r e n a d a n t e se c o n ­ c e n t r a p o r l i o f’ i l i z a c i d n h a s t a un v o l u m e n t a l que 1 ml de - s o l u c i d n r e p r é s e n t e a p r o x i m a d a m e n t e l a f r a c c i d n c o r r e s p o n - d i e n t e a 500 mg de m i c e l i o f r e s c o . L a c o n c e n t r a c i d n de p r o - t e f n a en e l p r e p a r a d o e n z i m a t i c o a s f o b t e n i d o es de G - 10 mg / m l . E n t r e e l memento de l a c o s e c h a y e l d e l e n s a y o e n z i m a ­ t i c o no se d e j a t r a n s c u r r i r n u n c a un p e r i o d o de t i e r n p o sup_e r i o r a 10 d f a s . 4 . 2 - C O N D I C I O N E S DE LOS E N 5 A Y 0 S E N Z I M A T I C O S . Ademas de una a l i c u o t a d e l p r e p a r a d o e n z i m a t i c o y una c a n t i d a d c o n v e n i e n t e d e l s u s t r a t o a d e c u a d o , l a m e z c l a de ija c u b a c i o n se s u p l e r n e n l a con una s e r i e de c o f a c t o r e s e s e n c i a - 1 es — o s i m p l e m e n t s p o t e n c i a d o r e s — de l a a c t i v i d a d de l a s o x i d a s a s de f u n c i d n m i x t a . En l a b i b l i o g r a f i a a l r e s p e c t a se d e s c r i b e n d i v e r s o s - s u p l e m e n t c s de e s t e t i p o , q u e , en e l caso mas c o m p l e j o , co£ s i s t e n en u n a s o l u c i d n t a m p on ad a ( u s u a l m e n t s con f o s f a t o ^ ' - ' 0 , 1 n o T r i s 0 , 0 5 M, a pH 7 , 4 ) que c o n t i e n s F eC lg , n £ c o t i n a m i d a , NADP* y un s i s t e m a c a p a z de p a s a r a l p i r i d i n n u - c l e o t i d o a su f o r m a r s d u c i d a (NAOPH 4 H * ) . E l mas c o n v e n c i £ n a l de e s t o e s i s t e m a s as a l f o r m a d o p o r l a g l u c c s a - 6 - f n s - f a t o y l a g l u c o s a - 6 - f o s f a t o d e s h i d r o g e n a s a , aunque t a m b i e n es r e l a t i v a m e n t e f r e c u e n t e e l ernpleo de DL - i s o c i t r a t o con DL - i s o c i t r a t o d e s h i d r o g e n a s a . Los c o m p o n e n t e s de t a i e s s u p l e r n e n t o s pueden v a r i a r de£ t r o de m a r g en e s b a s t a n t e a m p l i o s , e i n c l u s o se puede p r è s - c i n d i r de a l g u n o de e l l o s . P a r t i c u l a r m e n t e cuando se t r a b a - j a con e l s o b r e n a d a n t e de 9 000 g , l a a d i c i d n de n i c o t i n a m i - da no p a r e c e n e c e s a r i a , h a b i e n d o a u t o r e s que a s i m i s m o e s t i - man q ue , en t a i e s c i r c u n s t a n c i a s , e l p r e p a r a d o e n z i m a t i c o c o n t i e n s ya d e s h i d r o g e n a s a s y s u s t r a t o s d e s h i d r o g e n a b l e s en c a n t i d a d s u f i c i e n t e p a r a que su f u n c i o n a m i e n t o a c o p l a d o con l a r e d u c c i o n d e l NAOP+ que se a n a d e , p r o v e s de l o s n i v e l e s 8 7 p.e c e s a r i n s de NAOPH 4 H En e s t e t r a b a j o , s i n e m b ar g o , se hace usa de un a s u p l £ m e n t a c i d n c o m p l é t a , y a s i , a 2 ml d s l p r e p a r a d o e n z i m a t i c o , se anaden 3 ml de u n a s o l u c i d n a c u o s a c o n t e n i a n do : Tampon f o s f a t o p H = 7 , 4 . . . . . . 250 yumol N i c o t i n a m i d e . . . . . . . . . . . . . 50 ” M g C l 2 • oHgT ................................ 50 " NADP+ . . . 1* ....................................... .............. 0 , 6 " G l u c o s a - 6 - P ................. .. 20 " G l u c o s a - 6 “ P d e s h i d r o g an asa • • • 0 , 5 U . E . SUSTRATO .................................................. .. 0 , 1 - 0 , 5 y j m o l ( s e g u n c a s o s ) E l c o n j u n t o sa m a n t i e n e en a g i t a c i d n a 3 7 2 C d u r a n t e - 30 m i n u t o s en un i n c u b a d o r D u b n o f f , t r a s l o c u a l se é v a l u a e l n i v e l de a c t i v i d a d en z i ni a t i c a a t r a v e s de l a e s t i m a c i d n de l a t r e n s f o r m a c i d n d e l s u s t r a t o p o r m e t o d o s que v a r i a n s£ c un e s t e . Como s u s t r a t o s sa u t i l i z a n , ademas d e l i n s e c t i c i d a o r - g a n o c l o r a d ü a l d r f n — c u y a e p o x i d a c i d n " i n v i v o " quedd demo£ t r a d ü se e x a l t a b a con l a p r e s e n c i a de PCQs — , a n i l i n a ( 3 yumol en l a s o l u c i d n a n t e s d e s c r i t a ) , p e n t o b a r b i t a l ( l yumo l ) y m e t i l a n i l i n a (5 y j m o l ) . E s t o s t r è s u l t i m o s c o m p u e s t o s ------ c o n s t i t u y e n s u s t r a t o s a b u n d a n t e m e n t e e m p l e a d o s en l a i n v e s - t i g a c i d n de l a s h i d r o x i l a c i o n e s a r o m a t i c a s , h i d r o x i l a c i o n e s a l i f a t i c a s y d e s m e t i l a c i o n e s , r e s p e c t i v a m e n t e , l l e v a d a s a - cabo p o r l a s O . F . M . p r è s e n t e s en e l r e t f c u l o e n d o p l â s r n i c o - l i s o de l a s c e l u l a s h e p â t i c a s de m a m i f e & o s . 4 . 3 - V A L OR A C I ON DE L AS A C T I V I D A D E S E N Z I M A T I C A S . Como a c s b a de m e n c i c n a r s e , l a s a c t i v i d a d e s i n v e s t i g a das son l a s e s q u e m a t i ^ a d a s an l a f i g , 1 1 , La e p o x i d a c i d n d e l a l d r f n se d é t e r m i n a c u a n t i f i c a n d o - l a s c a n t i d a d e s de a l d r f n y d i e l d r f n p r é s e n t e s on l a m e z c l a de i n c u b a c i d n d e s p u e s d e l e n s a y o . P a r a e l l o se e x t r a s d i c h a m e z c l a t r e s v e c e s c o n s e c u t i v a s con un v o l ume n i g u a l de hexa, no cada v e z y e l e x t r a c t o se e s t u d i a con i b i na nd o l a s t e c n i - c as de c r o m a t o g r a f f a de a d s o r c i d n s o b r e F l o r i s i l a c t i v a d o y c r o m a t o g r a f f a g a s - l f q u i d o con d e t e c c i o n p o r c a p t u r a e l e c - t r d n i c a , segun l a m e t o d o l o g f a d e s c r i t a en a l a p a r t a d o c o — r r e s p o n d i e n t e . La h i d r o x i 1 a c i d n ( a r o m a t i c a ) de l a a n i l i n a se e s t i m a - m e d i a n t e l a v a l o r a c i d n d e l p - a m i n o f e n o l f o r m a d o , p o r e l mje t o d o d e l f e n o l — i n d o f e n d de B r o d i e y A x e l r o d ( 1 9 4 8 ) , segun l a m o d i f i c a c i d n de Sasame y G i l l e t t e r e c o g i d a p o r Ka to y G i l l e t t e ( 1 9 6 5 ) . S a t u r a d a l a m e z c l a de i n c u b a c i d n con C l N a , se e x t r a e con un v o l u m e n c o n v e n i e n t e — - ^ 4 ml — ds é t e r et_f l i c G l i b r e de p e r d x i d o s . D e c a n t a d a l a f a s e a c u o s a , se a g i t a una a l f c u o t a d e l e x t r a c t o s t e r e o con 3 ml de un r e a c t i v o — C l O.F. M. ! ( 0] L _ _ EPOXIDACION C l - C1 Cl C l ALDRIN DIELDRIN NH2 ANIL INA ,CH3 1 PENTOBARBITAL n C H CH3 METI LA NI L I NA O.F. M. (Ol HIDRÛXILACION AROMATICA 0.F M. (ol _ k _ _ HIDROXILACION A LIEATICA O.F.M. (Ô) V DES m e t i l Ia c i ü n HC H OH p - AMINOFENOL X. / H 3 ÇH •CH/CH^CH -CHg OH A c . ETIL(3-HIDR0XI^1-ME T I L - B U T I L BARBITURICO NH2 A N I L I N A F i g * 11 - A c t i v i d a d e s e n z i m a t i c a s e n s a y a d a s con e l s o - b r e n a d a n t e de 9 000 g . L o s c o m p u e s t o s s u b r a y a d o s son aque — l l o s a t r a v e s de c u y a v a l o r a c i d n se e s t i m a l a a c t i v i d a d * 9 0 c o n s i s t e n t e en una s o l u c i d n de f e n o l a l 1% en NaÜH 0 , 1 N * S e p a r a d a s l a s f a s e s y e l i m i n a d a l a e t ê r e a , se d e j a r e p o s a r l a a c u o s a d u r a n t e 30 m i n u t o s , t r a n s c u r r i d o s l o s c u a l e s se - m i d e l a a b s o r b a n c i a d e l c o l o r d e s a r r o l l a d o a 620 nm. L as -— c o n c e n t r a c i o n e s de p - a m i n o f e n o l se d e t e r m i n a n p o r i n t e r p o - 1 a c i d n de l o s v a l o r e s e n c o n t r a d o s en u na r e c t a de c a l i b r a d o o b t e n i d a a p a r t i r de u na s e r i e de d i l u c i o n e s de una s o l u — c i d n e t e r e a de p - a m i n o f e n o l , t r a t a d a s con e l a n t e r i o r r e a £ t i V O . La h i d r o x i l a c i d n ( a l i f a t i c a ) d e l p e n t o b a r b i t a l ( a c i d o e t i l ( 1 - m o t i l - b u t i l ) b a r b i t u r i c o ) se v a l o r a p o r d e t e r i n i - n a c i d n de l a s c a n t i d a d e s de s u s t r a t o i n t r a n s f o r m a d o d e sp u é s do l a r e a c c i d n , segdn e l m é to do de B r o d i e e t a l . ( 1 9 5 3 ) . Pa r a e l l o a 2 ml do l a m e z c l a de i n c u b a c i d n se ar fade : Tampdn f o s f a t o p H = 5 , 5 . . . . . . . . . 1 ml NaC l 1 g S o l u c i d n a l 1 , 5 % de a l c o h o l i s o a m f l i c o en é t e r de p e t r o l e o . . . 30 ml Se a g i t a l a m e z c l a d u r a n t e 45 m i n u t o s s e p a r a n d o s e a -« c o n t i n u a c i d n l a s f a s e s , p o r c e n t r i f u g a c i d n s i f u e s e necesa- r i o . A 20 ml de l a f a s e e t o r e a se l e a d i c i c n a n a h o r a 4 ml de un a s o l u c i d n t a m p o n a d a a p H = 1 1 , p r e p a r a d a m e z c l a n d o : NaOH 10 N .............................. 8 , 5 ml NagPO^H 0 , 8 M .............. 200 ” De n u e v o se a g i t a l a m e z c l a d u r a n t e 3 m i n u t o s y , una v e z s e p a r a d a s l a s f a s e s , se m i de en l a e t e r e a l a a b s o r b a n ­ c i a a 240 nm. P a r a e l t r a z a d o de l a r e c t a de c a l i b r a d o se p r o p a r a - - u na s o l u c i d n s t o c k da p e n t o b a r b i t a l , d i s o l v i e n d c 10 mg de - e s t e c o m p u e s t o en 3 ml de NaOH 0 , 1 N y l l e v a n d o a v o lu m e n - de 100 ml con agua d e s t i l a d a * O b t s n i r i a s a p a r t i r de e s t a s£ l u c i d n una s e r i e da d i l u c i o n e s , 1 ml de c a d a u na de o i l a s - se t r a t a con 4 ml d e l tampdn f o r m a d o con NaOH 10 N y P0 aHNa2 0 , 8 n y a j u s t a d o a pH== 1 1 , m i d i e n d o s e a c o n t i n u a c i d n l a ab­ s o r b a n c i a a 240 nm. La d e s m e t i l a c i d n de l a m e t i l a n i l i n a se c u a n t i f i c a a - - t r a v d s do l a v a l o r a c i d n d e l f o r n i a l d a h i d o e l i m i n a d o en e l — p r o c e s o , p o r e l md todo de Nash ( 1 9 5 3 ) segun l a m o d i f i c a c i d n da C o c h i n y A x e l r o d ( 1 9 5 9 ) . P a r a e l l o , a 3 ml de l a s o l u — c i d n a v a l o r a r se aPîade 2 ZnSG^ ( s o l u c i d n a c u o s a a l 20%) . . . . . . . 1 ml B a ( 0 H)2 ( s o l u c i d n a c u o s a s a t u r a d a ) . . . 1 ” C e n t r i f u g a d a l a m e z c l a p a r a l a o b t e n c i d n de un sobren_a d a n t e l i b r e de p r o t e i n a s , a una a l f c u o t a de 2 , 5 ml de d i c h o s o b r e n a d a n t e se a d i c i o n a a h o r a 1 ml d e l r e a c t i v o de Nash " d o b l e f u e r z a ” : A c e t a t o a md n i c o . . . . . . . 75 g A c e t i l a c e t o n a ........... 1 ml Agua d e s t i l a d a . . . . . c . s . p . 250 ml 92 La m e z c l a sa same ce a c a l e f a c c i d n d u r a n t e 30 m i n u t o s - en Lin bano de a g u a a 60 Q C, m i d i e n d o s e i n m e d i a t a m e n t e d e s ­ p u é s l a a b s o r b a n c i a de l a s o l u c i d n a 4 15 nm, e i n t e r p o l a n d o l o s v a l o r e s h a l l a d o s en u n a r e c t a de c a l i b r a d o o b t e n i d a a - p a r t i r de u n a s e r i e de d i l u c i o n e s de u n a s o l u c i d n a c u o s a - - e s t a n d a r de f o r m a l d e h i d o , t r a t a d a s de modo a n a l o g o a como - se h i z ü con l a s o l u c i d n a v a l o r a r . 4 . 4 - I N U E S T I G A C I O N DE LA P R E S E N C I A DE C I T O l Rü HO P - 4 5 0 , E l c i t o c r o r n ü P - 4 5 0 — segun se c ome nt o en un a p a r t a d o - p r e c e d e n t s — ha s i d o d e t e c t a d o en muy d i v e r s e s e n t i d a d e s - b i o l d g i c a s como l a o x i d a s a f i n a l de l a s c a d e n a s de t r a n s p o £ t e a l e c t r d n i c o v i n c u l a d a s a l m e t a b o l i s m o de x e n o b i d t i c o s . - Aunque su p r e s e n c i a ha s i d o t a m b i ê n p u e s t a de m a n i f i e s t o en l a f r a c c i d n m i t o c o n d r i a l de c i e r t o s t e j i d o s a n i m a l e s , como e l c o r t e x a d r e n a l , su l o c a l i z a c i d n p r e f e r e n t e l a c o n s t i t u y e l a f r a c c i d n m i c r o s d m i c a , en l a que ha s i d o v a l o r a d a en a l g i j n o s t e j i d o s v e g e t a l e s , en c i e r t o s o r g a n o s de i n s e c t o s y , s£ b r e t o d o , en c é l u l a s h e p â t i c a s de m a m i f e r o s . En e l p r e s e n t s t r a b a j o , l a i n v e s t i g a c i d n de su p r e s e n ­ c i a se l l e v d a cabo en s o b r e n a d a n t e s de 9 000 g o b t e n i d o s - - p o r e l mismo p r o c e d i m i e n t o que e l u t i l i z a d o p a r a e l e ns ayo 'Lin v i t r o " de l a s a c t i v i d a d e s e n z i m â t i c a s mâs a t r â s m e n c i o - n a d a s . S i g u i e n d o , como es l o u s u a l , e l me todo de Omura y S a t o ( 1 9 5 7 ) , a una a l i c u o t a de 5 ml de l a s o l u c i d n a v a l o r a r se a d i c i o n a 1 mg de Na2 S2Û4 — que r e d u c i r â a l c i t o c r o m o — s a t j j r a n d o a c o n t i n u a c i d n l a r n u e s t r a con m o n d x i d o de c a r h o n o , — p o r b u r b u j e o de e s t e gas d u r a n t e u n os 30 s e g u n d o s . I n m e d i a - t a m e n t e d e s p u é s se r e g i s t r a en c o n t i n u e e l e s o e c t r o de d i ­ cha r n u e s t r a e n t r e 380 y 500 nm en un a p a r a t o de d o b l e h az y c o l o c a n d o como r e f e r e n d a o t r a a l i c u o t a de l a s o l u c i d n a v£ l o r a r , r e d u c i d a con d i t i o n i t o p e r o s i n t r a t a r con CO. 94 L a s an t e r i c r e s o p s r a c i o n e s , c o n d u c e n t e s a l a f o r m s c i o n de un c c m p l e j o c i t e c r u m o r e d i i c i d o - C H s e g u n e l e squ ema a d - j u n t o , deb e n r e a i i z a r s o con c i e r t a r a p i d e z , en c o n d i c i . c n e s de a n a e r o b i o s i s ( y a que a l c i t o c r o r n o as a u t o o x i d a b l e en p r ^ s e n c i a d e l 0 ^ , e n t r a n d o e s t e c o m p u e s t o a c o m p e t i r con e l CO p o r e l c i t o c r o r n o r e d u c i d o ) y en a u s e n c i a de l u z , qua p r o v o - - c a r f a l a d e s c o m p o s i c i o n d e l c o m p l e j o f i n a l * N&2^ 2^4 C 0 p - 4 5 0 _ ::: ^ P-45C _ . ^ p - 4 5 0 „ , - c o 02 450 nm) R ^d . CO La i d e n t i f i c a c i ( 5 n d e l c i t o c r o r n o se e f e c t u a en b a s e a l c o m p l e j o f o r m a d o en su e s t a d o r e d u c i d o con e l m o n o x i d o de - c a r b o n o , c o m p l e j o quo p r é s e n t a an su e s p e c t r o un a b a n d a a 450 nm, f enor neno a l que d e b e su d e n o r r i i n a c i o n . 5 - ÛETERniNACION MICROMANOMETRICA DEL CDNSUMO DE O X I - GENO POR LOS MICROORGANISMOS ENSAYADG5. Se l l e v a a cabo segun l a t é c n i c a de I J a r b u r g - B a r c r o f t en m i c r o r e s p i r o m e t r o s B, B ra u n ( M e l s u n g e n , A l e m a n i a ) , a d a p ­ t a b l e s a un t e r m o s t a t o con s o p o r t e s p a r a un a s e r i e de man6- m e t r o s que pueden s e r a g i t a d o s a l a v e l o c i d a d y a m p l i t u d de s e a d a s . Cada r e s p i r d m e t r o c o n s t i t u y e un s i s t e m a h e r m e t i c o - f o r m a d ü p o r un mandrnat ro y un r e c i p i e n t e de r e ac c i c5 n prov ins t o de una rama l a t e r a l y un p o c i l l o c e n t r a l . P a r a l a s d e t e r m i n a c i o n e s de i n t e r c a m b i o s g a s e o s o s r e a - l i z a d a s en e s t e t r a b a j o , en cada r e c i p i e n t e de r e a c c i d n se d e p o s i t a n 2 , 5 ml de un a s u s p e n s i o n , en l o s m e d i o s de c u l t i - vo a d s c u a d o s ; de e s p o r a s ( f \ , f l a v u s ) □ c é l u l a s v e g e t a t i v a s s e p a r a d a s p o r c e n t r i f u g a c i o n de un c u l t i v e a l c o m i e n z o de - su f a s 8 de c r e c i m i e n t o e x p o n e n c i a l ( S . c e r e v i s s i a a ) . La c o n c e n t r a c i c n de d i c h a s s u s p e n s i o n e s se a j u s t a p r e - v i a m e n t e ( p o r d i l u c i o n e s y r e c u e n t o en c â ma ra h e m a t o c i t o m é - t r i c a ) de f o r m a que sea s u f i c i e n t e p a r a que e l o x i g e n o c o n - s u m i d o , i n c l u s o en l a s p r i m e r a s e t a p a s , r é s u l t a f a c i l m e n t a m e s u r a b l e . Es p r e c i s e , no o b s t a n t e , t e n e r en c u e n t s que p o - b l a c i o n e s e x c e s i vamen t e d e n s e s c o n d u c e n con f r e c u e n c i a a r_e s u l t a d o s a n o m a l o s , p r o b a b l e m e n t e a c a u s a de a l t e r a c i o n e s en l a i n t e n s i d a d n o r m a l d e l i n t e r c a m b i o de g a s e s a n i v e l de SjJ p e r f i d e s de c o n t a c t e i n t e r c e l u l a r e s . 96 En eu a l q u i e r c a s o , l e s -mnd i üs l i e v a n i n c o r p o r s d ü T u a e n - - 2 0 a l 0 , 0 1 /o , a f i n ds a s a g u r a r u n a d i s p e r s i o n c e l u i a r h o ­ mo g en oa, i m p i d i e n d o l a f o r m a c i o n de a g l o m e r a d o s . î d é n t i c a - c o n c e n t r a c i u n d e l a g e n t e d e t e n s o r l l e v a , p o r s u p u e s t o , e l - r e c i p i e n t e de r e a c c i d n con n e d i c e s t é r i l — t e r m o b a r o m e t r o u t i l i z a d o p a r a l a n ô r m a l i z a c i d n b a r o m ê t r i c a de l a e x p e r i e n - c i a . L o s PCBs se a d i c i o n a n a l a s s u s p e n s i o n e s a e n s a y a r en c a n t i d a d e s que p r o p o r c i o n e n u na c o n c a n t r a c i d n de 25 ppm, — p o r t a d o s en 10 y j l de a c e t o n a . I d e n t i c a s p r o p o r c i o n e s de d i - s o l v e n t e p u r o se a d i c i o n a n a l a s u s p e n s i o n c o n t r o l , a s f c o - no a l t e r m o b a r c 5 m e t r o f P a r a c a p t a r e l CO^ d o s p r e n d i d o y c o n s e g u i r que su p r e - s i d n p a r c i a l en e l i n t e r i o r d e l s i s t e m a s ea n u l a , o a i m e - n o s i r r e l e v a n t e , en l a r ama l a t e r a l de c a d a r e c i p i e n t e de - r e a c c i é n se d e p o s i t a n 0 , 1 ml de KOH 4 N , a b s o r b i d o s s o b r e - - 1 cm^ de p a p e l de f i l t r a , a f i n de a l e v a r l a s u p e r f i c i e c a £ t a d o r a * Do e s t e modo , l a s c a r n b i o s de p r e s i o n p r o d u c i d o s en e l r e c i p i e n t s s e r a n u n i c a m e n t e a t r i b u i b l e s a l a s v a r i a c i o - n é s en l a p r a s i d n p a r c i a l de o x f g e n o . E l d e s c u e n t o de l a s - v a r i a c i o n e s e x p e r i m e n t a d a s en e l r e c i p i e n t e t e r m o b a r é m e t r i c o p e r m i t s , f i n a l m e n t e , a s i g n a r u n o s v a l o r e s a l a c o n t r i b u c i o n r e s p i r a t o r i a . Una v e z q u e , c o l o c a d o s l o s r a s p i r d m e t r o s en a g i t a c i o n c o n t i n u a y con e l v a s o s u m e r g i d o en un baho t e r m o s t a t i z a d o a 30 2 C, e l c o n j u n t o h a y a a l c a n z a d o u n a t e m p e r a t u r e h om og è­ n e s ( c o n v i e n s a g u a r d a r un i n t e r v a l o de a l r e d e d o r de 30 m i ~ n u t o s ) , se a j u s t a e l l i q u i d a m a n o m é t r i c o a un a d i v i s i o n d e - O ' ? te i r n ln a d a de l a e s c a l a , que c o r r e s p o n d e a l v e l u m en d esaado en e l r o c i n t o de r e a c c i o n , e i n m e d i a t a m e n t e d e s p u é s se c i a - r r a e l s i s t e m a . L as m e d i d a s se a f e c t u a n s i e m p r e a v o l u m e n c o n s t a n t e , - e n r a s a n d o l a a l t u r a d e l l i q u i d e b a r o m é t r i c o en l a rama c e - r r a d a con l a d i v i s i o n p r e f i j a d a a n t e r i o r m e n t e y l e y e n d o l a a l t u r a a l c a n z a d a en l a r ama a b i e r t a . La r e l a c i d n e x i s t a n t e e n t r e l a d i f e r e n c i a de p r e s i d n - r e f l e j a d a en l a e s c a l a m a n o m é t r i c a y e l gas c o n s u m i d o en e l mismo p é r i o d e de t i a m p o , es d i f e r e n t e p a r a c ad a r e s p i r d m e ~ t r o , h a l l a n d o s e d e f i n i d a p o r un p a r a m è t r e Kq o » q u e , segun U m b r e i t e t a l , ( 1 9 5 7 ) , e s t a d e t e r m i n a d o p o r : 9 7 T 02 Ç u l ) Vg “ ♦ V f o i = Kqo = AP (mm) ^ Po R e l a c i d n en l a que i n t e r v i e n e n l a s s i g u i e n t e s m a g n i t u ­ des : Vg = Vo lumen en l a f a s e g a s e o s a . V a r i a p a r a c ada r e c i ­ p i e n t e , V f = Vo lumen de l a f a s e l i q u i d a . 2 500 y u l de m e d i o 4 1 0 0 y u l de KOH 4N, cC = C o e f i c i e n t e de s o l u b i l i d a d d e l O2 en s o l u c i o n e s sa- l i n a s a c u o s a s * 0 , 0 2 6 a 30 2 C, t = T e m p e r a t u r a de t r a b a j o (30 2 C) . T = 273 2 4 30 2 = 303 2 K, Po = P r e s i d n n o r m a l , e x p r e s a d a en mm de l i q u i d e manomé 98 t r i c e , I D . O c Ü cm G r c d i i ; 7GC nm ds Ho . E l C i l i b r a d o d e l s i s t a r n e , que c o n s i s t e en l a d é t e r m i n a c i d n d e l v o l u m e n t o t a l Vt = Vg 4 V f p a r a c a d a c o n j u n t o v a s o - m andrno t r o , se e f e c t u a r e l l o n a n d o — l o s r e c i p i e n t e s con Hg p a r a , un a v e z d e t e r m i n a d a l a masa — d e l m e t a l — r e s u I t a d o de l a m e d i a ds v a r i a s p e s a d a s dedu c i r e l v o l u m e n r e q u e r i d o . 6 - VALORACION DE LA A C Ï I V Î DA D DE TRANSPORTE ELECTRO NICO. En e l t r a n s p o r t e e l e c t r d n i c o m i t o c o n d r i a l ( v i n c u l a d o , como es s a b i d o , a l a r e s p i r a c i d n , a d i f e r e n c i a d e l m i c r o s d - m i c o , v i n c u l a d o a l a s o x l d a s a s de f u n c i d n m i x t a y e n z i m a s - de a n â l o g a s i g n i f i c a c i d n ) , e l paso que a c t u a como l i m i t a n t s de l a v e l o c i d a d d e l p r o c e s o es e l que t r a n s c u r r e e n t r e l a - c o e n z i m a G y e l c i t o c r o r n o b ( C h a n c e , 1 9 5 4 ; Chance e t a l , , 1 955 ; G r e e n , 1 9 6 4 ) , P u e s t o que l a r e d u c c i d n d e l c l o r u r o de t r i f e n i l t e t r a z o l i o ( T T C ) es s u s c e p t i b l e de a c o p l a r s a a l ------ t r a n s p o r t e e l ^ c t r d n i c o a e s t e n i v e l , segun e l esquema a d j u n t o , es u s u a l l a u t i l i z a c i d n de d i c h a r e d u c c i d n — c u a n t i f i c a . b l e p o r m e d i d a de l a a b s o r b a n c i a a 490 nm p r o p i a d e l ” f o r m a z â n ” f o r m a d o — en l a e v a l u a c i d n de l a a c t i v i d a d t r a n s p o r t a - d o r a de l a t o t a l i d a d d e l s i s t e m a . Cl Cit. b(Fé^q Cl f .b(Fe**q TTC •TORMAZAN' xrjc S i g u i a n d o , can c i s r t a s m o d i f i c a c i o n e s , e l m e t ad o de —« Ogur e t a l * ( 1 9 5 7 ) , en e l p r e s e n t © t r a b a j o so l l e v d a cabo un e s t u d i o c o m p a r a t i v o de l a a c t i v i d a d t r a n s p o r t a d o r a de e l e c t r o n e s en c u l t i v o s de S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s s i a e d e s a r r o l l a d o s s o b r e med i o s d l i d o — f u e n t e de c a r b o n o : c t a n o l a l 3% — en p r e s e n c i a de 8 / j g / de d i s t i n t o s A r o c l o r * P a r a e l l o se p r e p a r a n y e s t e r i l i z a n en a u t o c l a v e , , p o r s e p a r a d o , en tampdn f o s f a t o 0 , 0 6 7 M a p H = 7 , 5 , u na s o l u - c i d n de a g a r no n u t r i t i v o a l 1 , 5 ^ y o t r a de TTC a l 2% ( l a e s t e r i l i z a c i d n puede o b v i a r s e en e n s a y o s de c o r t a d u r a c i d n , como l o s que a q u f se d e s c r i b e n * S i e m p r e que se l l e v a a c a ­ bo es p r e c i s o e v i t a r l a p r e s e n c i a c o n j u n t a , en l a s o l u c i d n , d e l a g a r y e l TTC, ya que e s t e e x p é r i m e n t a l a r e d u c c i d n a - f o r m a z â n s i se s omete a l a u t o c l a v e en t a i e s c o n d i c i o n e s ) ♦ Una v e z e n f r i a d a s a 5 5 Q C, se m e z c l a n ambas s o l u c i o n e s en - l a s p r o p o r c i o n e s n e c e s a r i a s p a r a que l a c o n c e n t r a c l d n d é f i ­ n i t i v e d e l TTC sea d e l 0 , 2 ^ y se c o n s o r v a n a 50 c C, en e s - t u f a , h a s t a e l momento de su a d i c i d n a l o s c u l t i v o s , A c ad a uno de ê s t o s , d e s p u é s de un p e r i o d o de i n c u b a - c i d n de 70 - 80 h o r a s a 26 Q C, se a f iaden 20 ml de l a s o l u - c i d n a g a r i z a d a de TTC y se d a j a en r e p o s o , a t e m p e r a t u r a am b i e n t e , d u r a n t e 3 - 4 h o r a s , t i e m p o d u r a n t e e l c u a l se d e s a - r r o l l a l a c o l o r a c i d n r o j a d e l f o r m a z a n . E n s a y a d o s d i f e r e n t e s s i s t e m a s de d i s o l v e n t e s p a r a l a - e x t r a c c i d n de e s t a d l t i m o , l a m e z c l a a c e t o n a : t e t r a c l o r o e t i ^ l e n o ( 3 : 2 , v : v ) , u t i l i z a d a p o r P a c k a r d ( 1 9 7 1 ) p a r a f i n e s m i l a r e s , en r e l a c i d n con l a a c t i v i d a d t r a n s p o r t a d o r a d e ------ 101 n l G c t r o n o s en e l f i t o p l a n c t o n n i a r i n o , r é s u l t é s e r l a que — p r o p o r c i o n d urras r e c u p e r a b i l i dades mas c o n s i s t e n t e s , A s i p u e s , una ve z d e s a r r o l l a d a l a c o l o r a c i d n , e l s i s ­ tema f o r m a d ü p o r ambos d i s c o s de a g a r , e n t r e l o s c u a l e s qu_e dan i n c l u i d a s l a s c o l o n i a s d e l m i c r c o r g a n i s m o , se homogene£ za d u r a n t e t r è s m i n u t o s en un a p a r a t o O m n i - M i x e r con 10 ml do tampdn f o s f a t o 0 , 0 6 7 M ( pH = 7 , 5 ) y 40 ml de l a m e z c l a de e x t r a c c i d n , E l h o m o g e n o i z a d o se c e n t r i f u g a a c o n t i n u a c i d n a b a j a v e l o c i d a d (lOOO g / 20 m i n u t o s ) y , con una j e r i n g a , se toma una a l i c u o t a de l a f a s e o r g â n i c a — i n f e r i o r — c l a r i f i - c a d a , s o b r e l a que sa m i d e l a a b s o r b a n c i a a 490 nm f r e n t e a un b l a n c o c o n s i s t a n t e en l a m e z c l a de e x t r a c c i d n . Es p r e c i s o s u b r a y a r que con l a m e t o d o l o g f a de e x t r a c - c i d n que se acaba de d e s c r i b i r , no os p o s i b l e l o g r a r r e c u l e r a b i l i d a d e s s u p e r i o r e s a ^ 6 0 ^ con un g r a d e de d i l u c i d n - a d o c u a d o , L o s v a l o r e s o b t e n i d o s , s i n e mb a r g o , son a l t a m e n t e r e p r o d u c i b l e s a c o n d i c i d n de h o m o l o g a r l o s v o l d m e n e s de l a m e z c l a e x t r a c t o r s y l o s t i e m p o s de h o m o g e n o i z a d o , p o r l o — q ue , y s i e n d o e l o b j e t i v o f u n d a m e n t a l de e s t e e s t u d i o l a — c o m p a r a c i d n e n t r e a c t i v i d a d e s de t r a n s p o r t e e l e c t r d n i c o en c u l t i v o s c o n t r ô l e s y d o s i f i c a d o s con l o s d i s t i n t o s A r o c l o r , e l me todo p r o p o r c i o n a r e s u l t a d o s p e r f e c t a m e n t e c o n s i s t a n t e s , A s i m is m o se r e a l i z d un a c u r v a de c a l i b r a d o a p a r t i r de una s o l u c i d n e s t a n d a r de TTC en e l tampdn f o s f a t o a n t e s es - p e c i f i c a d o , e x t r a y é n d o s e a l i c u o t a s de d i c h a s o l u c i d n , c o n v a - n i e n t e m e n t e d i l u i d a s , d e s p u é s de l a r e d u c c i d n d e l TTC a f o r ­ mazan p o r a d i c i d n de un e s c e s o de d i t i o n i t o s d d i c o , con l a - 102 m e z c l a a c e t o n a : t o t r a c l o r o e t i l e n o . L a r e l a c i d n o b t e n i d a e n t r a a b s o r b a n c i a y c o n c e n t r a c i d n : 3 1 . 8 A X 2 , 0 9 / i t n o l / m l r é s u l t a c o n s i s t e n t e con l a que dan P a c k a r d y H e a l y ( 1 9 6 8 ) , so^ b r e l a b a s e de r e s u l t a d o s de v a l o r a c i c n e s r e a l i z a d a s p o r r e ­ d u c c i d n c u l o m b i m é t r i c a : 3 1 . 8 A ^ 2 , 0 0 j u m o l / ml 6 , 1 - ENSAYOS PARA LA DETECCÎÜN DE MUTANTES CON DEFI - CïENCI A3 RESPIRATORI AS (EN S a c c h a r o m y ces c e r e v i s s i a e ) , L l e v a d o s a cabo con o b j e t o de i n v e s t i g a r l a p o s i b l e aĉ t i v i d a d m u t a g é n i c a de l o s PCBs en e s t e s e n t i d o , e l p r i n c i ­ p l e m e t o d o l d g i c o u t i l i z a d o en t a i e s e n s a y o s es e l mismo que e l co me n t ad o en e l a p a r t a d o a n t e r i o r : p u e s t o que l a s c é l u - 1 as d e f i c i t a r i a s on a l g u n c o m p o n e n t s ( s ) e s a n c i a l ( e s ) de - l a c a d e n a de t r a n s p o r t e e l e c t r d n i c o s e r a n i n c a p a c e s de r e - d u c i r e l c l o r u r o de t r i f e n i l t e t r a z o l i o , a l s e m b r a r — con un g r a d o de d i l u c i d n a decu ad o — un a p o b l a c i d n c e l u l a r s o b r e un m ed i o s d l i d o que p e r m i t a e l d e s a r r o l l o de l o s m u t a n t e s (un m ed io f e r m e n t a b l e ) y t r a t a r e l c u l t i v o , en o l momento en »— que l a s c o l o n i a s sean p e r c e p t i b l e s a s i m p l e v i s t a , con una s o l u c i d n a g a r i z a d a y t a m p o n a d a de t r i f e n i l t e t r a z o l i o segdn l a t é c n i c a ya d e s c r i t a ( O g u r e t a l . , 1 9 5 7 ) , l a s c o l o n i a s - - d e s a r r o l l a d a s a p a r t i r de c é l u l a s m u t a n t e s ( " a e r " ) p e r m a n e - c e r é n i n c o l o r a s , m i e n t r a s que l a s o r i g i n a d a s p o r c é l u l a s — r e s p i r a t o r i o - s u f i c i e n t e s ( " AER" ) a d q u i r i r a n l a c o l o r a c i d n r o j a p r o p i a d e l f o r m a z a n . En e l p r e s e n t s t r a b a j o , d i c h o t e s t se a p l i c d a p o b l a - c i o n e s c e l u l a r e s p r o c é d a n t e s de c u l t i v o s de S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s s i a e en med io I f q u i d o , d e s p u é s de un p é r i o d e de i n c j j b a c i d n de 20 h o r a s , en p r e s e n c i a de 25 ppm de l o s A r o c l o r de 32 , 4 2 , 48 , 54 y 60 % de g r a d o m e d io de c l o r a c i d n . 1 0 4 S e p a r a d a s l a s c é l u l a s d e l m ed io p o r c e n t r i f u g a c i o n , se lavGP. dos vecGS con m e d i c f r o s c u y e s t é r i l , y se r e s u s p e n - den en un v o lu m on a d ec u ad o d e l m i smo, de t a l modo que e l - - i n o c u l o que se a d i c i o n a a c ada p l a ç a do med i o s é l i d o s ea — p o r t a d o r de 80 - 150 c é l u l a s . T r a n s c u r r i d o un p e r i o d o de i n c u b a c i d n de 70 - 80 h o r a s a 26 Q C, se a d i c i o n a l a capa de a g a r - TTC y , d e s p u é s d e 3 - 4 h o r a s , se l l e v a a cabo e l r e c u e n t o de c o l o n i a s " a e r " y " AER" T r e n t e a c u l t i v o s c o n t r o l d e s a r r o l l a d o s y t r a t a d o s en i d é n t i c a f o r m a ( e x i s t e una f r e c u e n c i a n o r m a l de p r c d u c i d n de m u t a n t e s " a e r ” que caa d e n t r o de l o s l i m i t e s de d a t é e - c i d n de e s t e p r o c e d i m i e n t o ) . 8 . I I - R E S U L T A D O S I N T E R P R E T A C I O N 1 - LOS PCBs COMO [STRUCTURAS ALTAMENTE RESISTENTES A LA ACCIÜN METABOLICA DE LOS MICROORGANISMOS. A l s e r e l A r o c l o r - 1 254 l a m e z c l a c o r n e r c i a l de b i f e n i l o s p o l i c l o r a d o s mas a b u n d a n t e m e n t e u t i l i z a d a en l o s e s t u - d i o s s o b r e l a d i n a m i c a a m b i e n t a l de t a i e s c o m p u e s t o s , f u é l a p r i m e r a m e n t e e n s a y a d a T r e n t e a P é n i c i l l i u m f u n i c u l o s u m * P é n i c i l l i u m c h r y s o g enum, A s p e r g i l l u s n i q e r y A s p e r q i l l u s f 1 a v ü 3 d e s a r r o l l a d a s s o b r e m e d i o de Czapek s d l i d o . En n i n g u n c a s o , y a n i n g u n a de l a s c o n c s n t r a c i o n e s de - A - 1 254 p r o b a d a s — 2 , 5 , 10 y 20 y u g / cm^, d e p o s i t a d o s t a l - como 68 d e s c r i b i d en e l a p a r t a d o c o r r e s p o n d i e n t e — se d e t e c t a r o n a l t e r a c i o n e s en l a c o m p o s i c i d n d e l x e n o b i d t i c o , q ue , a l f i n a l de l o s p e r i o d o s de i n c u b a c i d n , se r é c u p é r a i n t r a n ^ f o r m a d o de l o s c u l t i v o s en p r o p o r c i o n e s q u e , t e n i e n d o en —' c u e n t a l o s f a c t o r e s do r e c u p e r a b i l i d a d — s u p e r i o r e s a l 90 % • r e s u l t a n i d e n t i c a s a l a s c a n t i d a d e s a f t a d i d a s . Segun p u e d e a p r e c i a r s e en l a f i g . 1 2 , que m u e s t r a un - c as o r e p r e s e n t a t i v o de t o d o s l o s demâs, l o s p e r f i l e s c r o m a - t o g r a f i c o s p r o d u c i d o s p o r una s o l u c i d n e s t a n d a r de A r o c l o r - - 1 2 5 4 y p o r un e x t r a c t o de un c u l t i v o a d i c i o n a d o con l a m i ^ ma m e z c l a , r e s u l t a n i g u a l e s . L a s e r i a l a d i c i o n a l que a p a r e c e en e l se gun do c r o m a t o g r a m a y que s o l a p a en p a r t e a l a d e b i - da a uno de l o s c o m p o n e n t e s d e l A r o c l o r , c o n s t i t u y e u n i c a ­ m e n t e una i m p u r e z a d e l e x t r a c t o , que d e s a p a r e c e p o r t r a t a - m i e n t o de un a a l l c u o t a de 2 ml de e s t e con una g o t a de I c i - A B I -0 CTI Vr. F i g * 1 2 - C r o m a t c g r a m a s d e A r o c l o r - 1 2 5 4 * A : s o l u c i o n e s t a j i d a r o p a t r o n « B ; e x t r ac t o r e c u p o r a d o d a un c u l t i v o d e Pen i c i - 1 1 i u fi ! f u n i c u 1 o s u n i s o b r e m e d i o r ie C z a p e k s o l i d o , a d i c i o n a d o c o n 1 0 y j g / cm^ ̂ d e s p u é s d o un p e r i o d o da i n c u b a c r i o n de 2 0 0 h o r a s * i ü 8 do s u l f u r i c o 6 0 % , r e s t a b l e c i é n d o s e e l p e r f i l e s t a n d a r * L a c o n t r i b u c i o n a l g o mener de l a s p r i m e r a s s e R a l e s a l a s u p e r ­ f i c i e t o t a l , que t a m b i é n se c o n s t a t a en e s t e c r o m a t o g r a m a , SB da a s i m i s m o en l o s e x t r a c t o s de p l a ç a s a d i c i o n a d a s con - l a s mi smas p r o p o r c i o n e s de A r o c l o r - 1254 y m a n t e n i d a s en — c o n d i c i o n e s e s t e r i l e s d u r a n t e un p e r i o d o de t i e m p o e q u i v a ­ l e n t s a l de i n c u b a c i d n . E l f endmeno d e b e , p u e s , a t r i b u i r s e a p s r d i d a s p o r v o l a t i l i z a c i d n — l o mas p r o b a b l e — o a l g d n o t r o mécan i sme de t i p o f i s i c o - ^ q u f m i c o ; p e r o no a l a a c c i d n de l o s m i c r o o r g a n i s m o s . A n â l o g o s r e s u l t a d o s se o b t u v i e r o n con l a s mismas e s p e - c i e s c u l t i v a d a s en m e d i o l i q u i d e f r e n t e a l o s A r o c l o r 1 2 3 2 , 1 2 4 2 , 1 2 4 8 , 1 254 y 1260 a l a s c o n c e n t r a c i o n e s de 5 , 1 0 , 25 y 50 ppm ( l a s f i g u r a s 13 de l a ^ a l a e r e c o g o n e j e m p l o s r ^ p r e s e n t a t i v o s de c a d a uno de l o s A r o c l o r ) , a s i como l a l evé ! d u r a S a c c h a r o m y ce s c e r e v i s s i a e , c u l t i v a d a t a n t o en m e d i o s f e r m e n t s b l e s cornu no f e r m a n t a b l e s . Aun c o n t r a s t a n d o con l o c r e s u l t a d o s o b t e n i d o s p o r -------- o t r o s a u t o r e s que t r a b a j a r o n con d i f o r e n t e s e n t i d a d e s b i o l j o g i c a s , l a a n t e r i o r c o n s t a t a c i d n no p a r o c e dernas i ado s c r p r e j i d e n t e . En e f e c t o , o l i n c r e m e n t s en l o s n i v e l e s r o s i d u a l e s - de PCBs en t e j i d o s de d i v e r s a s e s p e c i e s s i l v e s t r e s que en - l o s u l t i m o s aMos v i e n e s i e n d o d e t e c t a d o p o r n u m er o s o s a u t o ­ r e s ( v e a s e H e r n a n d e z , 1 9 7 6 , p a r a d a t o s en t o r n o a e s t e t e ma , r e f e r i d o s a E s p a r l a ) , a c u s a , s i n l u g a r a d u d a s , l a e s c a s a ca p a c i d a d d e g r a d a t i v a que l o s m e c a n i s m o s b i o l o g i c o s p os ee n — f r e n t e a e s t e t i p o de m o l é c u l a s . Es de n o t a r , a s i m i s m o , que en t a i e s e s t u d i o s c o n t i t u y e l a n o r m a e l que l o s p e r f i l e s - - A. f lavus- 5 0 ppm j-— r 80i 1 , - A-1232 : patrdn I : i i I ; ■ : I I ! I I i I %© • d o o - P •rt q O © d Br4 w O > l/i *H -P O O 'd © P4m V) © o d ^I'- 0 o k >TfP4*H M V I m rH OJ (H O 1 *H U O © r -4 B Ü c d k © 1 > tTij s I 3 «-s| 3 v il AkO O <^I ■Pd © S ^0 h O O "P o 1 (d _ k m o pH Ü0 k • H cd prw ^ § P© © ' I i ï=l:5rr̂-5p.- A. f lavus - 25 ppm T tT 'S'i ' A-12A2 : patron \ \ O ! •rf a o k P *H r4 - f o o w © pH© w np © M w © *. -P 1 0© o nd 'P C-5 »r4 O 0 O O'̂ U V I P: r-} «N O 05 *H nd 05 © rH P. >Ho © rH o Î o k ©I < P !>| © cSj nji p-:j Vi w 1 d »! g '" i © k © to 'd c -{-J o 5 Üo d k N O 4- X 1 © rP M d fd * nto o •r! -P 4̂ W • © © d© © 0 s A. flavus-10ppm A-12AB : patron u 1 -pCO 0) lA O do • r l O o 09 O n i to 0) k odI I . A flavus - 5 ppm _ I I t I I >> ud"d d •P%© w©ao'HÜPr*iO03 C n i 0) Go -p-P n 0. Q> O amo >o •rîo ■P h O 0i oPi03tf GITv kNrH1 Iko o rH 'dO•rlc Pk CTÎVl rH© O•rl03 nj(Ô O8 sdk pCiOoo-p 1da wok 6O d rH1 «H • < • r O % d 1 O •H k ^ < t % 1 t 1 1 ^ !/ // / i C ( 5 ) o D e s o s a d / ( 6 r / ) y s ^ i - v (/> 2 o x: o m o ir> coo LO co %•H m ©•iH >o uo o © 01 s o d co © o rH d •H O •H rt♦H © O rto •H d k - p S o rto o © » d © •P © r t d © M k r t © H 44 « ri Ü d î d A"fir\ CJ ï i M d II •H © d © dn© o r4 d © O ^ «H m © O iH d *H •p• O d bO bO*H •H k ^ À © o o M rt © d d .119 c i o n ccn l a r e s i s t e n c i a de l o s PCBs a l a a c c i . 6n m e t a b d l i c a , pone a s i m i s m o de m s n i f i e s t o e s t a u l t i m a p a r t i c u l a r i d a d d e l p r o c e s o de b i o c o n c e n t r a c i o n ( f i g s . 13 a - e . No se r e p r o d u ­ ce:! l o s c r o m a t o g r a m a s c o r r e s p o n d i e n t e s a l Sa c c h a r o m y ce s c e - r e v i s s i a e p o r s a r , como y a se d i j o , e n t e r a m e n t e a n a l o g o s ) , P o r o t r a p a r t e , s i se e x a m i n a l a e v o l u c i d n de l o s n i ­ v e l a s de A - 1 254 en m i c e l i o de A . f l a v u s — o c e l u l a s de S . c e r e v i s s i a e — a l o l a r g o d e l p e r i o d o de i n c u b a c i d n ( f i g s . 14 y 1 5 ) , se c o n s t a t a q u e , de un modo muy s i m i l a r en amboS c a s o s , l o s v a l o r e s mâx i mo s se r e g i s t r a n en l a s p r i m e r a s a t ^ pas d e l c u l t i v o , t e n d i e n d o g r a d u a l m e n t e a a l c a n z a r s e un n i ­ v a l de e s t a b i l i z a c i d n a m e d i d a que l a b i o m a s a a u m e n t a . D u ­ r a n t e t o d o e l p r o c e s o , l o s v a l o r e s a l c a n z a d o s se e n c u s n t r a n e s t r e c h a m e n t e r e l a c i o n a d o s con l a c o n c e n t r a c i d n i n i c i a l de x e n o b i d t i c o a d i c i o n a d a a l o s c u l t i v o s . Todo p a r e c a i n d i c a r , p u e s , que l a ma yo r p a r t e d e l x eo£ b i d t i c o aPiad ido es c o n c e n t r a d o a n o t a b l e v e l o c i d a d p o r l a - b i o m a s a en c r e c i m i e n t o , ” d i l u y e n d o s e ’* u l t e r i o r m e n t e en a l l a a m e d i d a que e s t a a u m e n t a . En e f e c t o , d e f i n i e n d o de a c u e r d o con J o h n s o n y Kennedy ( 1 9 7 3 ) , e l f a c t o r de b i o c o n c e n t r a c i d n ( ) como l a r e l a - c i d n e n t r e e l n i v e l de x e n o b i d t i c o en l a b i o m a s a y l a d o s i s i n i c i a l a M a d i d a a l m e d i o , l o s v a l o r e s de d i c h o p a r â m e t r o , t a n t o en c u l t i v o s de A. f l a v u s como de 5 . c e r e v i s s i a e en mje d i o f e r m e n t a b l e ( t a b l a M) d i s m i n u y e n g r a d u a l m e n t e a l o l a r ­ go d e l p e r i o d o de i n c u b a c i o n h a s t a a l c a n z a r , h a c i a e l f i n a l de d i c h o p e r i o d o , un n i v e l s u s t a n c i a l m e n t e i n d e p e n d i e n t e de T a b l a V - V a l o r e s d e l f a c t o r de b i o c o n c e n t r a c i d n ( Bb ) , a l o l a r g o d e l p e r i o d o de i n c u b a c i d n , en c u l t i vos de A s p e r g i l l u s f l a v u s y Sa c c h a r o m y ce s c e r e v i s s i a e ( G l u c o o a - 1 ^ , a d i c i o n a d ü s con d i f e r e n t a s c o n c e n t r a - c i o n e s de A r o c l o r - 1 2 5 4 . A s p e r g i l l u s f l a v u s Edad ( h o r a s ) b D o s i s (ppm) S a c c h . c e r e v i s s i a e P Edad b ( h o r a s ) 78 M t f tf 1 1 9 , 4 9 1 2 7 , 6 6 2 1 8 , 2 5 2 2 5 , 8 9 5 10 25 50 1 7 9 . 2 2 1 8 9 , 9 9 1 9 2 . 2 3 2 1 8 , 3 7 20 If it n 130 n H II 100,88 1 0 5 , 9 3 1 4 2 , 4 6 1 3 2 , 4 0 5 10 25 50 8 2 , 8 0 9 8 , 1 4 1 0 4 , 8 8 1 6 0 , 0 0 40 n i l n 178 tti it II 7 0 , 0 3 8 2 , 0 6 8 3 , 6 7 7 2 , 6 5 5 10 25 50 8 0 , 5 0 7 6 , 1 4 9 6 , 3 8 1 0 0 , 1 5 64 If tf If 213 If If II 5 9 , 9 9 6 5 , 1 5 6 8 , 1 9 7 1 , 0 6 5 10 25 50 7 2 , 8 0 7 4 , 3 8 8 3 , 9 5 8 5 , 7 9 130 If H II 1 2 1 1 a c o n c e n t r s c i a n i n i c i a l . P o r l o que r e s p e c t a a l a n a t u r a l e z a d e l p r o c e s o acurnu- l a t i v o , cabe p e n s a r q u e , en l o e s e n c i a l , v i e n e r i e t a r m i n a d o p o r me ca n i s i no s p a s i v o s de i n g r e s o — a d s o r c i d n , r e p a r t o a g u a / / i f p i d o s c e l u l a r e s — m i s quo p o r p r o c e s o s de t r a n s p o r t e a c - t i v o . E f o c t i v a m e n t e , i n c u b a n d o A. f l a v u s en p r e s e n c i a ds 5 , 1 0 , 25 y 50 ppm de l o s A r o c l o r de 3 2 , 4 2 , 4 8 , 54 y 60 /fa de c l o r a c i d n m e d i a , y e x t r a y e n d o e l m i c e l i o a l a s 200 h o r a s — ( c u a n d o t o d o s l o s c u l t i v o s se e n c u e n t r a n en l a s p r o x i m i d a - des d e l p u n t o de c o s e c h a m i x i m a y l o s n i v e l e s de x e n o b i d t i - co se han e s t a b i l i z a d o ) , l a s c o n c e n t r a c i o n e s d e t e c t a d a s se h a l l a n l i n e a l n i e n t e c o r r e l a c i o n a d a s ( f i g . 1 6 ; g r a d o de s i g - n i f i c a c i d n s u p e r i o r a l 99% ) con un I n d i c e ” 1 ” , o b t e n i d o — p o r m u l t i p l i c a c i d n de l o s p o r c e n t a j e s m e d i o s de c l o r a c i d n - de l o s A r o c l o r e m p l e a d o s , p o r l a s c o r r e s p o n d i e n t e s c o n c e n - t e c i o n e s i n i c i a l e s ( a s £ on un c u l t i v o a d i c i o n a d o con 5 ppm de A r o c l o r - 1 2 3 2 , ” 1” = 5 x 32 = 1 6 0 , e t c . ) . S i n que t a l e s r e s u l t a d o s e x c l u y a n f o r z o s a r a e n t e l a i n - t e r v e n c i d n da m e c a n i s m o s de t r a n s p o r t e a c t i v o o f a c i l i t a d o , 03 c l a r o , s i n e m b a r g o , que son a l t a m e n t e c o h e r e n t e s con l a h i p d t e s i s de que en e l p r o c e s o de b i o c o n c e n t r a c i d n da l o s - PCBs, e l c o e f i c i e n t e de r e p a r t o a g u a / I f p i d o s c o n s t i t u y e un f a c t o r de i m p o r t a n t e s i g n i f i c a t i o n . Y es p r o b a b l e m e n t e p o r e l l o q ue , d ada l a e l e v a d a l i p o f i l i a de l o s PCBs en g e n e r a l , no e x i s t a n d i f e r e n c i a s d é t e c t a b l e s en l a a c u r n u l a c i d n do l o s d i s t i n t o s c o m p o n e n t e s de un A r o c l o r d e t e r m i n a d o . P o r o t r a p a r t e , l a s d i f e r e n c i a s en e l p o t e n c i a l do b i £ ou % O (A(Ua o» \ ffl o Û. 5 4 3 2 321 (ppm iniciales de PCB«VoCl)10 -3 F i g . 16 - C o r r e l a c i o n e n t r e a c u r n u l a c i d n de d i f e - r e n t e s A r o c l o r , a d i f e r e n t e s c o n c e n t r a c i o n e s i n i c i a l e s , s i n d i c e " I " , en c u l t i v o s de A, f l a v u s . C o e f i c i e n t e de c o r r e l a c i o n : 0 , 9 8 5 . ( P a r a e x p l i c a c i d n , v e a s e e l t e x t o ) • 8 % 8&a o» CO uÛ_ ? 5 GLUCOSA- VU (50 h) 4 y = 1,72 X +152,0 3 2 ETANOL-3% (110 h)1 y = 0,59x -43,4 3 (ppm iniciales de PCB ■ •/oCl )10”^ F i g * 17 - C o r r e l a c i d n e n t r e a c u r n u l a c i d n de d i f e ­ r e n t e s A r o c l o r , a d i f e r e n t e s c o n c e n t r a c i o n e s i n i c i a l e s , 0 i n d i c e " I ” , en c u l t i v a s de S* c e r e v i s s i a e * C o e f i c i e n t e s de c o r r e l a c i d n , r s s p e c t i v a m e n t e ? ü , 9 8 0 y 0 , 9 8 4 * ( P a r a e x p l i c a c i d n , v e a s e e l t e x t o ) » 124 c o n c e n t r e c i d n que so ponen de m s n i f i e s t o en c u l t i v o s de S , c e r e v i s e l a n — a d i c i o n a d o s cun PCBs en modo a n a l o g o a i que - se acaba de d e s c r i b i r p a r a A, f l a v u s — d e s a r r o l l a d o s a e x ­ p e n se s de f u s n t e s de c a r b o n o f e r r n e n t a b l a s y no f e r m e n t a b l a s ( f i g * 1 7 ) , deben e x p l i c a r s e en f u n c i d n de l a s u p e r i o r b i o ma sa de l a c o s e c h a max ima que e l m i c r o o r g a n i s m o p r o d u c e en — e t a n o l - 3 ^ T r e n t e a g l u c o s a - 1 % , l a s u p e r i o r v e l o c i d a d - - con que se d e s a r r o l l a en e s t e u l t i m o m e d i o , y l a d i f e r o n c i a en e l c o e f i c i e n t e de r e p a r t o m ed io / c ê l u l a s de l o s PCBs, — que f a v o r e c e su a c u r n u l a c i d n en ma y or m e d i d a en e l caso d e l m ed io f e r m e n t a b l e * Debe s u b r a y a r s e , no o b t a n t e , que p esa a l i m p o r t a n t e p£ p e l que p a r e c e n desempePlar l o s p r o c e s o s de r e p a r t o en l a •— a c u r n u l a c i d n de l o s PCBs, no cabe d e s c a r t a r l a i n t o r v e n c i d n de mecan i smos de a d s o r c i d n * As£ , en c u l t i v o s en m ed io I f q u ^ do de l o s do s m i c r o o r g a n i s m o s t r a t a d o s en e s t e c a p f t u l o , d£ s i f i c a d o s con d i s t i n t a s c o n c e n t r a c i o n e s de l o s A r o c l o r o n - s a y a d o s , l a s c o n c e n t r a c i o n e s de x e n o b i d t i c o h a l l a d a s en ma­ t e r i a l b i ü l d g i c o y med io d e s p u e s de l a e s t a b i l i z a c i d n , sa - t i s f a c e n con un s i g n i f i c a t i v e g r a d o de a j u s t e ( > 9 5 ^ ) l a — e c u a c i d n de F r e u n d l i c h : K c ( l o g C = i l o g c 4 l o g K ) en l a que £ y £ son l a s c o n c e n t r a c i o n e s m e n c i o n a d a s en mate r i a l b i o l d g i c o y m e d i o , r e s p e c t i v a m e n t e , un a v e z a l c a n z a d o e l e q u i l i b r i o , Mas d i f i c i l y c u e s t i o n a b i o r e s u l t a r i a l a i n t e r p r é t a - i LA SA LA lA lA dl rd iH I 1 1 1 : O o * Sq O O O O o }> o O rH rH rH r-i rH •H d rH •P o iH « » ,* • • ' # iH o » 'â rH 00 O Tf Tf 0 k «K •k #k O d o © CM rH CM vO CMo r4 d m X rH © o O •H 1'd w O k m w U o << •H O LA Tf 00 CA CA •H > IT\ O rH Tf CM -P d % © < in CA N ON tH U ü © k Eh rH «\ #k d •H P © H rH rH rH O O A P •H d © ü d W O k © tn © 00 d nd «k •H K rH^ 1 tiO 1 î t t t rp © S O O O o rH O •H d o O rH rH rH rH d •H W k ino W O 3 • • » e • • p W iH • rd rH Tf VO 00 SA rO •H o O CvJ O CA SA O {> © ü rH *» •% #k O nd d X (A fA CM VO vO •s U w 1 o ---- -do o s co A o CM O O cr\ VO r4 p4 o d rH CM Tf i - O © t - ON t'- t - d ü o td rH •k ev B h ir* O O O o Oo B M o ■ P4 ë ITS O Cvi V w lA SA L*N ir^ SA ü •i d rH 1 I 1 1 I 0) c3 O k O O O o Oo CO «H d Ï Ï rH r-S rH rH iH p r-i Ui *s d î>i P d • « « « o • (3 lA k 'â O' O O O O to » O >» •> #k «k W. d d rd rH CA lA O CO d F ÎO rH X CM rHo d © r4 O ü rH P H P •H Ciû vO rH ! d k t'­ CA (A rH M •H © d en ON 00 cA < rH rH o O «H •H ?H 00 ,Q d © d © d EH Ph o CM CM co Tf O w •H (A Tf Tf lA VO C O CM CM CM CM CM d rH rH rH rH rH © k l 1 1 1 1 nd P < <4 <1 Oen oco O o o wû) ■so uG> q., •H Q> •xi cd'ri ü do wo K g o tD O 'd rd w o O rH r"l rH cO O •rH d O U •r-1 ci dw •Ho A W O $ doco •H rH ü c3 • d ÜO-P •H doo do ü 1 3 3 f i n e n cada c u r v a p r c c e d & n de d i s t i n t o s r e p l i c a d o s ds c u l t i ­ vo s i n i c i a d o s en i d â n t i c a s c o n d i c i o n e s ) • D i c h a f i g . 18 pone de m a n i f i e s t o q u e , s i b i e n l a depr_s s i o n p r o d u c i d a p n r l a p r e s e n c i a d e l x e n o b i d t i c o as d e j a n o ­ t a r 8 l o l a r g o do t o das l a s f a s e s d e l c u l t i v o , os a p r o x i m a - damento d e n t r o de l a s p r i m e r a s 100 h o r a s , es d e c i r , a ].c — l a r g o de l a f a s e de c r e c i m i e n t o e x p o n e n c i a l , que t a l d e p r e - s i 6n se m a n i f i e s t a con una r e g u l a r i d a d que p e r m i t s un t r a t a m i e n t o c a h o r e n t e en t ô r m i n o s c u a n t i t a t i v o s . Una v e z a l c a n z a da l a f asG on que l o s n u t i e n t e s e j e r c e n ya un e f e c t o l i m i ­ t a n t e d e l d e s a r r o l l o , y peso a que l o s c u l t i v o s t r a t a d o s — con e l A r o c l o r - 1 2 5 4 no l l o g a n a a l c a n z a r l a s c o t a s de l o s c o n t r ô l e s , l a i n f l u e n c i a d o ! x e n o b i d t i c o r é s u l t a ya mâs con^ f Lisa. A l a v i s t a da l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s en t o r n o a l a - d i n a m i c a ric- l a a c u r n u l a c i d n do l o s PCBs, y d o m o s t r a d a l a i n - c a p a c i d a d d e l m i c r o o r g a n i s m o p a r a u na a c c i d n m e t a b d l i c a o o - b r e l o s mi sums, a t r i b u i r s a t e d e c a i r n i e n t o p r o g r o s i v o en l a i n t e n s i d a d d e l e f e c t o t d x i c o s i m p l e m e n t a a l a d i l u c i d n qus se o p e r a en l a b i o m a s a en c r e c i m i e n t o , p a r e c e mas r a z o n a b l o que a c u d i r a r a z o n e s de i n d o l e a d a p t a t i v e . A n a l o g o c o m p o r t a m i e n t o , aunque con una d i n a m i c a t o d a - v i a mas a c u s a d a , p r e s e n t s l a v a r i a c i d n en l o s n i v e l e s r e l a ­ t i v o s do RNA d u r a n t e e l t r a n s c u r s n d e l p e r i o d o de i n c u b a - c i d n ( f i g . 1 9 ) . La n o t a b l e e s t i m u l a c i d n en l a b i o s i n t e s i s do e s t e c o m po no n te q ue , a l o l a r g o de l a f a s e de c r e c i m i e n ­ t o e x p o n e n c i a l , e j e r c s l a p r e s e n c i a do A r o c l o r - 1 2 5 4 , d e ca s o CSJ JC O ur> Û- : ; « Cl Q lO O lO ïd Cs lO O O') o mTT 0)© r4 U rO 0 w m 03 rH 1 a> 'd wd d o •H 0 cS 1Oo d o o rH «HK d • d •H C.p tn H o ncJ *H f-i O 0) nj o •H Sw o 4 ̂ d o dd . « d o nj rH w e O bû (> ♦rl ‘ r i Ph O CNJ (d rH O hl ooes osad 6iu / vNbi 6 r / 1 3 5 h a s t a una « i t u a c i o n rnuchc mas m n d e r a d a ya h a c i a l a s 60 - 90 horaSÿ aunque tampoco a q u i l l o g a n a i g u a l a r s e e s t r i c t s m a n t a l o s c u l t i v a s c o n t r ô l e s y l o s t r a t a d o s » Po r l o quo r e s p e c t a a l o s n i v e l e s r e l a t i v o s de DNA y p r o t o l n a s , no f u ê p o s i b l e a p r o c i a r d i f e r e n c i a s s i g n i f i c a t i ­ ves e n t r e u nos y o t r c s c u l t i v o s * f s t i m a n d n s e , a l a v i s t a do l o s a n t o r i o r e s r e s u l t a d o s , que despUGs de un p e r i o d o de i n c u b a c i d n p r d x i m o a l a s 60 - - h o r a s , l a t o t a l i d a d de l o s c u l t i v o s d e s a r r o l l a d o s en l a s — c o n d i c i o n e s e x p u e s t a s deben e n c o n t r a r s e en una f a s e c omp ar a b l o de c r e c i m i e n t o , y p o r t a n t o t a m b i ê n en e s t a d o s f i s i o l b - g i c o s c o m p a r a b l e s , se p r o c e d i d a r o p r e s e n t a r , f r e n t e a l l o - g a r i t m o de l a s d o s i s a p l i c a d a s y p a r a un p e r i o d o de 60 h o ­ r a s de G x p o s i c i d n , l a s v a r i a c i o n e s e l p eso sec o y 3 os n i v é l o s r e l a t i v e s de RNA como p o r c e n t a j e s de i n h i b i c i é n ( 1 ) y ü s t i f . i ü l a c j .ün ( [ ) r osp go t i vamen t e a p a r t i r de l o s v a l o r e s o b t e n i d o s p a r a l o s c o n t r ô l e s * No t r a t é n d o s e de c u a n t i f i c a r , CQinü iiiâs ü t r a s se c o m e n t d , una m o i t a l i d a d , no p a r e c i o o p o r - t u n o t r a n s f o r m e r l o s p o r c e n t a j e s de r e s p u e s t a en p r o h i b a s , D i c h o t r a t a m i e n t o , r e f l e j a d o e s q u o m o t i c a m e n t e en l a f i g . 2 0 , pono de m a n i f i e s t o , p o r l o que se r e f i e r e a l peso s e e n , una c o r r e l a c i d n l i n e a l l o g d o s i s - r e s p u e s t a t r a d u c i - b l a , con una s i g n i f i c a c i d n s u p e r i o r a l 99 % , a l a e c u a c i d n : I 6 8 , 1 l o g D - 1 8 , 9 ( 1 ) P o r l o quo so r e f i e r e a l a r e s p u e s t a d e l RNA, aunque B ou LO O o CL 5 O Ootr» _ G. O. ccT O K > Q <3 o O m .1___ (X Cl trs O O f{o 8 UJ O C/o) VNd u p p p ]n u in s 3 (o/o) ODOs osod uçpiqmuî E Cl Ql O LO O O en O CM O üi o o d '!> o H-' O q\4 03 % O O rH «H C rO O o o to c4 c3 k rH •P 0) m rd g vri f!j rH •rH q-i Ü cd • iH < •rs P d) •ri -P % 03 O O \> •H •P rH <3 O » q O o ü (!) n *i5 03 cî N in O o (D W O Pm A O 03 VD O rH O •* r j d1 03 d •H 'H Ü 10 *.-! ■ri C m r j 9 9 , 9 % ) cuaf ido e l p r u c e s o so d e f i n e a t r a v e s de l a e c u a - c i o n e x p o n e n c i a l î Mas c l a r a t o d a v i a ( f i g * 2 1 ) q ueda l a c o r r e l a c i d n , a s i ­ mismo e x p o n e n c i a l y d e f i n i da ( c o e f i c i e n t e de c o r r e l a c i d n = = 0 , 9 9 3 ; s i g n i f i c a c i ü f î , p a r a 4 g r a d e s de l i b e r t a d > - 9 9 , 9 %) p o r l a e c u a c i d n : 0 , 0 0 6 P N rna - 1 4 , 3 o ’ ( 3 ) e n t r e p e s o s secos de m i c e l i o ( P ) y n i v e l e s r e l a t i v o s de RNA ( r y a d a s . RNA ( N ) p a r a l a s d i s t i n t a s d o s i s de A r o c l o r - 1254 ensa* Cabe d e s t a c a r f i n a l m e n t e q ue , como puede a p r e c i a r s e en l a f i g » 2 0 , l a DI ( d o s i s que d é p r i m a a l a m i t a d d e l c o n ­ t r o l l o s v a l o r e s de peso s e c o ) y l a D C ^ qq ( d o s i s que e s t i - m u l e a l d o b l o d e l c o n t r o l l a b i o s f n t e s i s de RNA), son p r a c - t i c a m e n t e c o ï n c i d e n t e s , C a l c u l a d a s a p a r t i r de l a s e c u a c i o - nes ( 1 ) y ( 2 ) r e s u l t a n s e r 1 0 , 3 0 y 1 0 , 0 5 ppm r e s p e c t i v e - men t e , X COoo o ’ t CMCO i tt ti t o o ■T' ir> o o a s c s a d 6 u j / ( v n h ) e s o q i y 6 r f — I— lO t3i E oL> 0>w oy><î» Q. OO CM OO 1 *.H J2î <0 d ' f—! m (U CM rH 10 : O f i rH o O r-i h O •H O d o •H M w d) •H O 10 •H O iH CO CD o O co CH •H O fd co Q> (3 A Q) Oï -p d d *P Q d A o A4 Hi co a o •ri nd O Ci d rH Q) d o • o A Oi P' A (v X Ci A o co O o d 'd V5 O •ri w 'O O Pc3 h H cj d Q> r-H SD fH «H 'H f i O G •H O < CO 1 d O P) Q X H G> Cvî O • dî 'd bû •ri G> o Ph rd P4 03 G G O •iH t> IH 3 , 2 - INFLUENCIA DEL GRAÜO MEDIO DE CLORACIDN SOBRE LA TOXICIDAD DE LOS PCBs FRENTE A A s p e r g i l l u s f l a v u s . Como, segun p u s i e r o n de m a n i f i e s t o l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s en c l caso d e l A r o c l o r -• 1 2 5 4 , es d u r a n t e l a s f a s e s — p r é c o c e s d e l d e s a r r o l l o de l o s c u l t i v o s c uando l o s e f e c t o s t ü x i c o s d e l x e n o b i d b i c o a p a r a c e n mas p a t e n t e s , en l o s e n s a - yos c o m p a r a t i v e s d n t o x i c i d a d d e s c r i t o s a c o n t i n u a c i d n , y - a f i n de d i s p o n e r rie c a n t i d o d e s s u f i c i e n t e s de m a t e r i a l bio_ l 6 g i c o en d i c h a s f a s e s t e m p r a n a s , se u t i l i z a r o n i n d c u l o s en l e s quü n i numéro de o s p o r a s p o r ml se e n c o n t r a b a a p r o x i m a - damonte d u p l i c a d o con r e s p e c t o a l de l a s p r u e b a s a n t e r i o - r e s , A s i m i s m o , y c o n o b j e t o d e a g u d i z a r l a s p o s i b l e s d i f e - r o n c i as en l o s e f e c t u s t o x i c o s , t o d o s l o s c u l t i v o s se d o s i - f i c a r o n con 25 ppm tie l o s d i s t i n t a s A r o c l o r , c o n c e n t r a c i o n q ue, como acaba de m o s t r a r s e , r e p r e s e n t s 2 , 5 v o c e s l a — D I 5Q d e l A r o c l o r - 1254# S e g u n ce a p r e c i a en l a f i g , 2 2 , qua r e c o g e l a e v o l u - c i o n d e l p e s o seco de l a c c o s e c h a s ( v a l o r e s mo r i i o s de t r è s s e r i e s d o c u l t i v o s e n l a s a n t o r i o r e s c o n d i c i o n e s ) , t o d o s l o s A r o c l o r o n s a y a d o s e j e r c o n e f o c t o s t o x i c o s c l a r a r n e n t e - - p e r c e p t i b l e s , d G s t a c a n d o se que l a i n t e n s i d a d de t a i e s e f e c - t o G y ua r ri a u n a c o r r e l a c i d n i n v e r s a con o 1 p o r c e n t a j e med io de c l o r a c i d n d o l a m o z c l a d e P C B s a d i c i o n a d a a 3. m e d i o . 5 0 0 ot/lû> a . 200 A -1 2 G 0 A-1254 A - 1248 A - 1242 A - 1232 20 60 horas r i g , 22 - D e s a r r o l l o do A s p e r g i 1 1 u s f 1 a v t.i s on p r è s en c i a de 25 ppm do d i f e r e n t e s A r o c l o r 1 4 1 Cabo a s i m i s m o d e s t a c a r quo, f r e n t s a l p e r f i l c o n v e n c i u i n a l de l a c u r v a c o r r e s p o n d i e n L o a l o s c o n t r ô l e s , e l d e s a r r o 1 l o do l u s c u l t i v e s t r a t a d o s cun PCBs r é s u l t a rnas i r r e g u l a r , con f a s e s do l a t e n c i a que se p r o l o n g a n d u r a n t e p e r i o d o s a n u r m a l m e n t G d i l a t a d o s . La t a b l a V I I , en d o n d e , j u n t o con l o s p e s o s s e c o s , se r e c o g o n d o t u s c o m p a r a t i v e s s o b r e l o s n i v e l o s r e l a t i v o s do - RNA « d o 3 d i f o r e n t e s p e r i o d o s de a x p o s i c i o n , es c o h e r e n t e — a l a l u z do l o s r e s u l t a d o s e x p u e s t o s en e l c a p i t u l o p r e c e r i on t o — con l a a n t e r i o r a p r e c i a c i d n . E f e c t i v a m e n t o , l a i n h i b i c i o n d e l c r e c i m i e n t o y l a e s t i m u l a c i 6n c o r r e l a t i v a de l a b i o s i n t e s i s do RNA a l c a n z a n sua v a l o r e s mâxi rnos en e l caso d e l A r o c l o r - 1232 y d o s c i e t i d o n a m e d i d a que se e l c v a e l po_r c e n t a j e da c l o r a c i d n , con una d i c c o n t i n u i d a d en o l caso d e l A r o c l o r - 1 2 5 4 , e l c u a i , p o r c u a l q u i o r a de l o s dos c r i t e r i o n , e x h i b e una t o x i c i d a d s u p e r i o r a l a qua p a r e c e r X a c o r r e s p o n d - d o r l u p o r su con t o n i d o on c l c r o , (Cabü s u h r a y a r que , d u r an t e e l t r u n s c u r s o d e l p r e s e n t o t r a b a j o , v a r i a s n o t a s t ô c n i c a a de l a e n t i d a d m a n u f a c t u r a d o - r 8 , s e n a l a r o n l a p r e s e n c i a ds t r a z a s do p o l i c l o r c d i b e n z o d i - D x i n a s — i m p u r e z a s de e l o v a d a i n c i d e n c i a t d x i c a — e s p e c i f i - carnente en e l A r o c l o r - 1 2 5 4 , l o c u a l e x p l i c a s a t i s f a c t o r i a - mento l a d e s v i a c i o n o b s e r v a d a , a l a p a r que s u g i e r e l a e l e ­ vada s e n s i b i l i d a d de l a m e t o d o l o g i a de b i o o n s a y o ) * Por u l t i m o , es do m e n c i o n a r e l hecho de q ue , aun c u a n ­ do l o s e f e c t o s t o x i c o s de t o d o s l o s A r o c l o r t o d a v f a p e r s i s - t o n d es pu es de 150 h o r a s de i n c u b a c i 6n , r e s u l t a n muy s u a v i - o K l l 0 o • H 0 03 r q Q) , p W w M d 0 O u s t o t o i Pi r H 0 ) pPi h CÔ o r4 m u 0 -— •' .0 , p " 4 0 Vi w 7} p : M r H U S t o t - K A tPi N I Nj* m oj r*i o VÛ m xj" m xh Tjh C s v D U S C 'î 0 CM *» l i S C O r H C O i H r , r H C O 1— 1 v O <1 » •P Tt d* CO CM 0 P 0 #% 0 nd \ 'V - v 0 0 r s 0 d" ON r - 4 us 0 us CO t^ d- O N Ü to H r H 0 0 0 H > 0 • H P •P to • d' Tf- G» rs M) to r H rP 0 P • 0 r H c s O S rs si» 0 p-i U S C3 us d r H 0 PN 0 0 c h ?»H <]< n d 0 P i w 0 y.> rC4 r H C S r s CM Nt r ~ l 'xi P * H t) 0 0 C Î I - CM CO r H d * to a ir». f ” »i CM c s i r \ 0 C » 0 0 r 4 ( S ' i f - s f O S i r >■ ;S 0 . Ü 0 0 0 p <■> f H a • r i 0 • 0 0 c s rs h - v D r q r H to r P «>• *« •H Pi Pci 0 Oj r H 4 ^ •H r P P d 0 E -t 0 10 CM CM CO d * 0 0 • m H* U S CD H 4̂ EH CM CM CM CM CM 0 0. r~ { r H r H r H r H < H 0 1 1 I 1 1 >) 4̂ 0 < 4 < < < 1 4 3 z a d o s en r e l a c i o n con l a s quo sn n a n i f e s t a b a n a l a s 75 h o - r a s c Lina v e z s o b r o p a s a d a l a f a s e da c r e c i m i e n t o e x p o n e n c i a l . e i p . i c i a d o en l o s c u l t i v o s o l p e r i o d o de a u t o l i s i s , d u r a n ­ t e o l c u a l l o s p r o c e s o s a u t o m a t a b o i i c o s l l o g a n a r s d u c i r , d es p uo f i de u n a s 800 h o r a s , e l p es o s ec o do l a c o s e c h a a un v a l o r que o s c i l a a l r e d e d o r d e l 50 ^ de l a c o s o c h a m a x i m a , l a p r e s e n c i a do PCBs c o n t i n u a a f e c t a n d o l a d i n a m i c a d e l m i - c r o o r g a n i s m o * Si, b i e r , l o s e f e c t o s no son aqu£ t a n c l a r o s como en l a s f a s e s a n t e r i o r e s y l a s d i f e r e n c i a s e n t r e l o s c u l t i v o s d é s a ­ r r o i l o dus en p r e s e n c i a de l o s d i s t i n t o s A r o c l o r t i e n don a d e s a p a r e c o r — o l menos p a r l o que se r e f i e r e a l p e s o s o c o — con e l t r a n a c u r so d e l t i o m p o , de un modo g e n e r a l es p o s i b l e a f i r r n a r que son 1 n s PCÜa can un mon o r p o r c o n t a j e de c l o r a - c i o n l o s q u e , d o s p u o s de ' na i l e r e j o r c i d o un m a y o r e r e c t o i n - h i h i t o r i ü duran te . ' l a f a s e e x p o n e n c i a l , d o t e r r n i n a n a h n r a un r o t a r d ü mâs s i g n i f i c a t i v o en l o s p r o c e s o s o n d o m e t a b o i i c n s ( f i g . 2 3 ) . 04 04 O '6ro ''5‘ i 04 1 1 1 c o < < < u ^ a(N I I< < in go x: o o LO O O ro O O k o .-H Ü o N < w Q> -P d o u Q> ch •fi nd Q> nd 0 A Pi LO. W Os? O -!̂ O d nd •rl a f-l •H P o P p d a> w c, o nd A Pi (3 •r\ d P o> a "p •H w o p •H CH rO O r'i •n' «H >>o << C3 •rl O k nd a d o o r-i •H r-4 O O r3 U -p h 02 CO P w a W A 0) 10 1 a 44 PI m a » 1-1 to •H o Pi d-' O O LO (5lu) OD0 S osad o o 04 ( rd 3e 3 - L A H [■ SPLIESTA D?.. S a c c h 3 r o m y cGs c e r e v i s s i a a A LOS PCBs, T o d o s l o s r e s L i l t a d o s o b t o n i d o o a e s t e r e s p e c t o p a r e c e n i n d i n a r qua d i c h a r e s p u e s t a c o n s t i t u é e un caso de mayor com p l e j i d a d que e l r e p r e s a n t a r J o p o r Asp e r g i l l u s f l a v u s . C o n s i d o r a n d u p r i m e r a m e n t e e l d e o a r r o l l c — en t a r m i n o s do peso S0CÜ ~ d e l m i c r o o i q o n i s m o en p r e s e n c i a do 25 ppm de l o s d i s t i n t c j s A r o c l o r ( f i g , 24 y 2 5 ) , r i e s t a c a e l hecho de ~ que l a r e s p u e s t a a l x e n o b i d t i c o v i e n o en g r a n m e d i d a c o n d i - c i o n a d a p o r l a n a t u r a l o z a de l a f u e n t e o r g a n i c a de c a r b o n o d i s p o n i b l e en e l mod io de c u l t i v a , E f on t j varneu t é p en me d i n s c: 0 n f u en t e s de c a r b o n o f o r m on t a b l e s ( g l u c o s B ~ l % ) , que p romuoven un r a p i d e d e s a r r o l J o - d e l 3 a ec hr n my ce s y l a s i t u a n i o n , a l menos en l a c f a c e s p r o ~ c o c o s de l o s c u l t i v o s , a p a r e c e c u n l i t a t i v a m e n t e s a m e j a n t e a l a y a d e s c r i t o . p a r a A» f l a v u s t aunquo desda un p u n t o de v i s t a ü u a n t i t a t i v ' o l a i n h i b i c i o n r i a l c r e c i m i e n t o r é s u l t a cho menos acusada que en s q u e l c a s o , t o d o s l o s A r o c l o r o j e r can e f e c t o s i n h i b i t o r i o s , h a c i e n d o l o en t a n t o mayor g r a d o cuaot.G manor es su p o r c e n t a j e modio de c l o r a c i d n . P o r c l c o n t r a r i o , e n m o d i o n con f u e n t e s de c o r b o n o no f cr-inen t a b l e s ( e t a n o l - 3 %) , que s i b i e n no p e r m i t e n un c r e - c i m i e n t o t a n r a p i d e ) a c a b a n p a r p r o p o r c i o n a r c o s o c h a s ma x i - m a s m a s e l o v a d a s , u n i c a m e n t o l o s A r o c l o r 1232 y 1242 p r o v o - o uc.'v> o(AQ> CL 2 0 0 - 100 Y GLUCOSA *■ 1 "/o 15 30 horas Fic'c 24 - D p n a r r o l l o do S a c n h a i o m y co s o o r o v i s s i a o en p r G s G n c: i a d o 2 5 p p m de d .1 V e r e n t u o A r o c l o r * ( F u on t o de c a r ­ b on o : g l i ! n D r . o ) « 300 1Î50 60 O(o V .0- GcT- 120 ETANOL- 3% horas F i g . 2b - ü o s a r r o l l o r O ? S , C B r e i / i s s i a o en p r e s e n c i a Je 2 b p p : iJ e d i (' e r e n t e s A i o c 1 o r , ( F u o n t o de C t o t a n o l ) . 1 4 8 oun 1 2 a p a r i c i î J n do t a s o s do l a t e n c i a d i l a t a d a s j a j e r c i o n d o ÜM o f e e t o d o p r o s D X — en f a s e s rniiy p r é c o c e s tamhi . e'n e l 1 2 4 3 - qur j , en e l c a s o d e l p i i m e r o , r é s u l t a i n d u so o u a n t i t a t i v a - m o n t e c o m p a r a b l e a l quo p r o d u c i a s o b r e e l A. f l ^ a v u s . L o s A r o c l o r 1 2 5 4 , 1260 y , d e s p u e s do un b r e \ / e p e r i o d o do e x p a n s i o n , e l 1 2 4 0 , c a u s a n un e f e c t o e s t i . m u l a t c r i o no - D x c c b i v s m e n r , 0 a c u s a d o , p e r c s i g n i f i c a t i v e , y q u o , como p r u e ba l a r e c u p e r a c i d n d e l p r o d u c t o i n t r a n s f o r m a d o a l f i n a l i z a r o l p o i i o d o de i n c u b a c i o n , en e b s o l u t o p u n d e a t r i b u i r s e o - - su u t i l i z a c i 6 n d i r e c t a , p o r p a r t e d e l r n i c r o o r g a n i s m o , como f u 0 n bo de c a r b o n o o e n e r g i a • B P o r 1 o q u e s e r o f i n r e a 1 n s n i v e l o s r e l a t i v e s d e R N A ( t a b l a V I I I ) , l o s r e s u l t a d o s a p a r e c e n m u c h o m a s o s c u r o s q u e I d s D e m o n t a d o s o n I n s c i p a r t a d o s p r o c g d o n t e s . D e I n o c h o , u n i ­ c o r n o n t o d o s p u e s d o u n b r a v e p e r i o d o r i e o x p o s i c i d n ( a l r e d e - r i n r de 2ü h n v a s p a r a . l o s c u l t i v e s d é s a r r o i ! a d o s e n m e d i o s - f B r rn o n t a b l e s y 6 0 h o r a s g n n; g d i o s n o f o r t n a n 1 3 h l e s ) p a r e c g - d a r s e i ! n a s a t i m u l a c i ô n u n 1 a b i s s i i ' t t e s i a d o d i c h a c o m p o n e n ­ t e t r e n t e a l o s P C B s de b a j a c l o r a c i d n , en m e d i o q l u c o s a d o » Do m e n e r s i g n i f i c : a c i 6 n son 1 as e l e v a c i o n e s q u e , en mo­ d i o no f e r m e n t a b l e , p a r e c e n p r o v o c a r l o s PCSs de m a y o r con - t e n i d o m o d i o en c l o r e , con t r a r i arnen t e a i o que c a b r f a o s p e - r a r , e s p u c i a l m c n t e o l A r o c l o r - 1254 ( c a s o que q u i z â p u d i e - r a a t r i b u i r s e a l a s p o l i c l a r o b o n z o d i o x i n a s , a n t e s c i t a o n s , que i m p u r i f i e an e s t a m e z c l a en p a r t i c u l a r ) , C o m o o n o l c a s o d e l A. f l a v u s . n o se d e t e c t a r o n d i f e - V c;| ?{ p i C/ !>> r ( U i C) O! O û l N .S; -■ît u ID pi O d! P c o l d "H G) . p '■'d n w o !• 0 •H 'tJ r- î H d A i o A i d m o C\’ < 0 s ' d d o •.H r j O d (0 0 O w p 0 -p d P i r- i n C: H (D d O O r ; j r - i r.l 1—î •H O r : U f i ( cJ CD H M I I en I t-ao Si pq Oj oo to C; O (\) 1 CD m o o Oô\ f-i \D Cv] CO o\ rd r-, N t5- r-iN CM c\: CM CM O O \o O o O C’O O en pH r-! O VO ro î> CM O ••H rS c\ CM CM t i CO VD ro in CM C\ CM d ' d- (H m f~l 1- d ' '.P 00 CM C'O CM CM CM (M CM CM f - Gn a-. P) en CM CO O' CD C'\ CD cT un vO CM C\] en CM CM CM q CM CM CO CD Pi en d* un VD [:-! CM CM CM CM CM ‘rn r'-î r-H rd r-î r-M CD l î t 1 { c[ •d < < 4 O o o w P4 t i U1 o rû •H K (v dQ) O P(w o N d o o «t r-4 ■s •p d CD y; o o•m uV!; d m Q u o r—I d 150 r e n c i a s s i g n i f i c a t i v e s an l o s n i v a l e s r e l a t i v e s de ON A y - p r o t e i n a s en c u l t i v o s c o n t r ô l e s y t r a t a d o s . E f e c t u a d a l a a p r o x i m a c i d n d o s i s - r e s p u e s t a — y b a san do 80 en e s t e caso l a c u a n t i f i c a c i d n d e l c r e c i m i e n t o en l a me­ d i d a de l a a b s o r b a n c i a a 660 nm de une m u e s t r a de c a d a c u l - t i v o f r e n t e a un b l a n c o de med io f r e s c o — se e n c o n t r d que - s i l a s c o m p a r a c i o n e s se l l e v a n a c a b o , como es l o u s u a l , en f a s e e x p o n e n c i a l p r e c o z ( a l r e d e d o r de l a s 20 y 40 h o r a s r e ^ p e c t i v a m e n t e p a r a m e d î o s f e r m e n t a b l e s y no f e r m e n t a b l e s ) , - d n i c a m e n t e p a r e c e n p o s e e r v e r d a d e r a c o n s i s t e n c i a l o s r e s u l - t a d o s r e f e r e n t e s a l a a c t i v i d a d d e l A r o c l o r - 1 2 3 2 , c u y a s r ^ l a c i o n e s d o s i s - r e s p u e s t a ( f i g * 26) r e s p o n d e n , con un a s i g - n i f i c a c i d n s u p e r i o r a l 9 9 % , a l a s e c u a c i o n e s : I = 4 3 , 0 2 l o g D - 2 1 , 9 8 ( g l u c o s a - 1 % ) I « 8 0 , 8 5 l o g D - 3 8 , 0 6 ( e t a n o l - 3%) que p r o p o r c i o n a n , p a r a l a D I cq , v a l o r e s de 4 6 , 7 y 1 2 , 3 ppm r e s p e c t i v a m e n t e * En e l r e s t o de l o s A r o c l o r en s i t u a c i o n e s i n h i b i t o r i a s , l o s v a l o r e s de l a O I ^ q quedan muy p o r e n c i m a d e l l i m i t e s u ­ p e r i o r d e l i n t e r v a l o de c o n c e n t r a c i o n e s u t i l i z a d o , p o r l o - q u e , pese a l a c e p t a b l e a j u s t e de l a s c o r r e s p o n d i e n t e s r e g r e s i o n e s l i n e a l e s , cabe d u d a r de l a s i g n i f i c a c i d n de u nas e x - t r a p o l a c i o n e s que, en e l caso mas m o d e r a d o , s i t u a r i a n a l a D I 5Q en dos d r d e n e s de m a g n i t u d p o r e n c i m a de l a s a n t e r i o - r e s (8 700 y 4 980 ppm en med io f e r m e n t a b l e y no f e r m e n t a b l e . - t CD O CD o> CO c CO en CO U) CM 0v_ 1 CL *den o cd u. 1 "o o K CO o X c cd s : o lO IO c f 11 o u 3 x : o CM O UJ < r o 00 O CM CO i II LO i II < >% Q O >» E CL CL CD* II O LO uJU099yj uppjqiqui O o E CLCL çn eno o o LO o o CO o CM cd •H 0) % 1 Ao V CQ 01 5 o . d CO 0ixi 3Q 1-P rso ao d-P n 0 KdQ) 1 to •HdO T* » d CM Q) m cl CM o r4 •H I O Ud oiH r4Q> O « p vo d CM O O • bo d •H O ■5 lo 152 r e s p e c t i v a m e n t a , f r e n t e a l A r o c l o r - 1 2 4 2 ) . E f e c t i v a m e n t o , edemas d a l d udoso s e n t i d o de u n a c o m pa - r a c i d n t o x i c o l o g i c a a t r a v e s do u n a t a l d e s p r o p o r c i o n de — e f e c t o — y que hace s o s p e c h a r que l a s a c t i v i d a d e s b i o l o g i - cas que s ubyac en a ambos c a so s tampoco sean e s t r i c t a m e n t o - c o m p a r a b l e s —, c a b r f a a Pl ad i r que i n c l u s o l a a d i c i o n a m e - d l o s acu oso s de c o n c e n t r a c i o n e s l i g e r a m e n t e s u p e r i o r e s a — l a s 50 ppm, p a r t i c u l a r m e n t e en l o s PCBs de a l t o c o n t e n i d o - en c l o r o , r é s u l t a muy d i f i c u l t o s a e i m p e r f e c t a , aun u t i l i - zando un d i s o l v e n t e o r g a n i c o m i s c i b l e con agua como p o r t a - d o r , p o r r a z o n e s de s o l u b i l i d a d . Una r e c a p i t u l a c i 6 n de l o s r e s u l t a d o s r e c o g i d o s en l o s u l t i m o s a p a r t a d o s p e r m i t e f o r m u l e r c i e r t a s c o n c l u s i o n e s p r £ v i s i o n a l e s con v a l o r de h i p d t e s i s de t r a b a j o : .1) En l a t o x i c i d a d de l o s PCBs f r e n t e a A s p e r g i l l u s f 1 avus p o d r f a n desempef l ar un p a p e l r e l e v a n t e — a j u z g a r p o r l a c o r r e l a c i d n e x i s t a n t e e n t r e i n t e n s i d a d d e l e f e c t o t d x i c o y e s t i m u l a c i d n de l a b i o s f n t e s i s de RNA — m é c a n i s m e s de i n - d u c c i o n e n z i m a t i c a s u s c e p t i b l e s de s e r d e s e n c a d e n a d o s p o r - l a p r e s e n c i a d e l x e n o b i d t i c o , 2) L a r e s p u e s t a de S a c c ha ro m y c e s c e r e v i s s i a e a l a p r e - s e n c i a da PCBs p a r e c e d e s c a n s a r en b a s e s f i s i o l d g i c a s de — d i s t i n t a n a t u r a l e z a , con r e s p e c t o a l a s c u a l e s cabe s u b r a - y a r % 153 a) L a s r e l a c i o n a s s s t r u c t u r a q u f m i c a - a c t i v i d a d b i o l d g i c a r e s u l t a n a p a r e n t e m e n t a mucho mas e s t r i c t a s que - - l a s que g o b i e r n a n l a r e s p u e s t a de A. f l a v u s , ya que l a s d i ~ f e r e n c i a s e n t r e l o s e f e c t o s p r o d u c i d o s p o r PCBs ds d i s t i n t o g r a d o de c l o r a c i d n son mucho mas n o t a b l e s que en a q u e l c a ­ s o . b) L a ma yo r i n t e n s i d a d de e f e c t o — c l a r a m e n t e — - c o n s t a t a b l e a l menos en e l caso de l a m e z c l a de m a y or i n c i - d e n c i a ( A r o c l o r - 1 2 32 ) — que se r e g i s t r e cu an do e l m i c r o o r - g a n i s m o se d e s a r r o l l a an rned ios no f e r m e n t a b l e s , es d e c i r , cu and o se ve o b l i g a d o a c u b r i r t o d a s sus n e c e s i d a d e s energ ja t i c a s p o r v i a o x i d a t i v a ( r e s p i r a t o r i a ) , s u g i e r e e l c i c l o de K r e b s como b i a n c o de l a a c c i d n t d x i c a . Cuando e l m i c r o o r g a - n i s m o , p o r e l c o n t r a r i o , puede o b t e n e r un a p o r t e e n e r g é t i c o s i g n i f i c a t i v e — l a c ep a u t i l i z a d a p o s ee un p o d e r f e r m e n t â t ^ VO m ed io — p o r v f a f e r r a e n t a t i v a , e s c a p a an c i e r t o g r a d o a - l a a c c i o n d e l x e n o b i d t i c o . c ) De l a c o n j u n c i d n de l o s pun t o s a) y b) p o d r f a d e s p r e n d e r s e que e n t r e l o s A r o c l o r e s de b a j o g r a d o de c l o r £ c i o n e x i s t e n e s t r u c t u r a s s u s c e p t i b l e s de i n h i b i r una o v a ­ r i a s e n z i m a s i m p l i c a d a s en e l c i c l o de K r e b s . 4 - LOS PCBs COMO POSIBLCS INDUCT0RE3 ENZIMATÎCOS I N - OUSTi r iCADOS. L o s r e s u l t a d o s que f i g u r a n en e l a p a r t a d o a n t e r i o r en t o r n o a l o s n i v a l e s r e l a t i v e s de RNA e n c o n t r a d o s en c u l t i ­ ves s o m e t i d o s a d i s t i n t a s c o n c e n t r a c i o n e s de A r o c l o r - 1 2 5 4 y c o n c e n t r a c i o n e s é q u i v a l e n t e s de d i s t i n t o s A r o c l o r , s u g i e - r e n con f u e r z a , a l a l u z de l a s o b s e r v a c i o n e s r e g i s t r a d a s - p o r o t r o s a u t o r e s en s i t u a c i o n e s c o m p a r a b l e s , en o t r a s e n t i dades b i o l d g i c a s , l a p o s i b i l i d a d de que l o s PCBs e s t i m u l e n , en Aspe r g i l l u s f l a v u s , l a s f n t e s i s de a l g u n s i s t e m a e n z i m a - t i c o c a t a b o l i z a n t e . E f e c t i v a m e n t e , l a e l e v a c i d n d e l c o n t e n i d o r e l a t i v o de RNA p a r e c e c o n s t i t u i r una c a r a c t e r f s t i c a de l a r e s p u e s t a de d i v e r s e s s i s t e m a s b i o l d g i c o s a n u m e r o s o s c o m p u e s t o s e x d g e - no s — una l a r g a s e r i e de f â r m a c o s , p o r e j e m p l o — y au nq ue - en r a l a c i d n con m i c r o o r g a n i s m o s e x i s t e t o d a v f a muy e s c a s a - d o c u m e n t a c i d n a e s t e r e s p e c t e , e l hecho ha s i d o r e p e t i d a m e n t e c o n s t a t a d o en e s t u d i o s l l e v a d o s a cabo con o r g a n i s m e s s]U p e r i o r e s — muy e s p e c i a l m e n t e en h f g a d o de m a m i f e r o s , d r g a n o s o b r e e l que c l â s i c a m e n t e se c e n t r a n t a i e s e s t u d i o s —• Es i m p o r t a n t e , p o r o t r a p a r t e , d e s t a c a r e l h ec ho de — que l a a u s e n c i a de t r a n s f o r m a c i o n e s que i n c i d a n s o b r e l o s - x e n o b i d t i c o s e n s a y a d o s — t a l como quedo de m a n i f i e s t o en ain t e r i o r e s c a p i t u l o s — p a r e c e o p o n e r s e a l a h i p d t e s i s de l a - c a p a c i d a d de i n d u c c i d n e n z i m a t i c a de l o s PCBs en e s t e caso 155 p a r t i c u l a r . E x i s t a , s i n emb arg o , una e x p l i c a c i d n p l a u s i b l e , y p o d r i a c o n s i s t i r en q ue , aun a c t u a n d o t a l e s c o m p u e s t o s c £ mo i n d u c t o r e s de a l g u n s i s t e m a e n z i m a t i c o c a t a b o l i z a n t e , no c o n s t i t u y e s e n u l t e r i o r m e n t e un s u s t r a t o s u s c e p t i b l e a l a t a - que de a q u e l . Cabe s u b r a y a r q ue , aun no h a b i e n d o s i d o d e s c r i t o an rje l a c i d n con l a p r o b l e m a t i c a l de l o s c o m p u e s t o s x e n o b i d t i c o s - un t a l p r o c B s o de " i n d u c c i d n i n j u s t i f i c a d a " de e n z i m a s , d i - cho mecanismo se e n c u e n t r a l e j o s de c o n s t i t u i r un fen dmen o d e s c o n o c i d o , e i n d u c t o r e s i n J u s t i f i c a d o s o g r a t u i t o s de l a - g a l a c t o s i d a s a en E s c h e r i c h i a c o l i — como e l t i o m e t i l g a - l a c t d s i d o y e l i s o p r o p i l t i o g a l a c t d s i d o — desempeMaron un - - i m p o r t a n t e p a p e l m e t o d o l d g i c o p r e c i s a m e n t e en l o s e s t u d i o s , hoy ya c l a s i c o s , l l e v a d o s a cabo p o r e l g r u p o de Monod en t o r n o a l a r e g u l a c i d n de l a f u n c i d n g e n i c a ( v e r , p o r e j e m - p l o , Monod e t a l . , 1 9 5 2 ) . Es é v i d e n t s q ue , de e n c o n t r a r s e l o s PCBs en e s t e c a s o , p o d r f a n p r o v o c a r un c o n s i d e r a b l e t r a s t o r n o en l a e c o n o m f a - e n e r g e t i c a d e l m i c r o o r g a n i s m o e s t u d i a d o . I n c l u s o s u p o n i e n d o que e l s i s t e m a e n z i m a t i c o i n d u c i d o no a c t u a s e s o b r e a l g u n - c o m p o n e n t s f u n g i c o e n d o g e n o , d e s e q u i l i b r a n d o a l g d n b a l a n c e m e t a b d l i c o mas o menos e s e n c i a l , es p r é c i s e t e n e r en c u e n t a que l a sePîal i n d u c t o r a , es d e c i r , l a p r e s e n c i a de l o s PCBs, a l r e s i s t i r e l a t a q u e d e l s i s t e m a i n d u c i d o , o b l i g a r f a a l a c é l u l a a d e s v i a r de un modo s o s t e n i d o una f r a c c i d n de su - d i s p o n i b i l i d a d e n e r g é t i c a h a c i a l a s f n t e s i s de uno o mas - c o m p o n e n t e s c o m p l e j o s de u t i l i d ad n u l a . Aun en l a a u s e n c i a de c u a l q u i a r o t r o mecan i smo t o x i c o , 156 e l a n t e r i o r e f e c t o p o d r f a a l c a n z a r una n o t a b l e r e l e v a n c i a y j u s t i f i c a r p o r s i s o l o l a s v a r i a c i o n e s e n c o n t r a d a s en l a — b i o m a s a de l o s c u l t i v o s d e s a r r o l l a d o s en l a s c o n d i c i o n e s — mas a t r â s e s p e c i f i c a d a s . Debe o b s e r v a r s e , p o r o t r a p a r t s ( v e a n s e l o s d a t o s c o r r e s p o n d i e n t e s en e l c a p f t u l o a n t e r i o r ) q u e , t a n t o p a r a l a s d i s t i n t a s c o n c e n t r a c i o n e s de A r o c l o r - - 1 2 5 4 e n s a y a d a s , como p a r a l o s e f e c t o s p r o v o c a d o s p o r c o n ­ c e n t r a c i o n e s i g u a l e s de A r o c l o r de d i f e r a n t e t o x i c i d a d , ------ e x i s t e una c l a r a c o r r e s p o n d e n c i a e n t r e e l e v a c i d n de l o s n i - v e l e s de RNA y d e p r e s i d n de l o s v a l o r e s de p eso s e c o , r e l a - c i o n e s que r e s u l t a n c o h e r e n t e s con e l a n t e r i o r s u p u e s t o . 4 . 1 - METABOLISMO " ALOINDUCIDO" DE OTROS XENOBIOTICOS " I N V I V O " . En l a h i p d t e s i s do que l o s PCBs d e s a r r o l l a n u na a c t i v £ dad i n d u c t o r a de un s i s t e m a e n z i m a t i c o q u e , s i b i e n p a r e c e r é s u l t e r i n e f e c t i v o f r e n t e a a q u e l l a s m o l e c u l a s , debe r e s ­ p o n d e r , desde e l p u n t o de v i s t a de su s i g n i f i c a d o b i o l d g i c o f o r m a l , a una f u n c i d n d e t o x i f i c a n t e , cabe a s i m i s m o s u p o n e r — y su i n e f e c t i v i d a d " d o f a c t o " a n t e l o s PCBs a s i l o s u g i e ­ r e — que t a l p r o c e s o i n d u c t i v o c o n s t i t u y e una r e s p u e s t a ------ i n e s p e c i f i c a , B s t e r e o t i p a d a , de l a e n t i d a d b i o l d g i c a que l a d e s a r r o l l a a l a p r e s e n c i a de un t i p o no e x c e s i v a m e n t e p a r t i c u l a r i z a d o do m o l d c u l a i n d u c t o r a . L a i n v e s t i g a c i d n de e s t a n u e v a h i p d t e s i s do t r a b a j o se l l e v d a cabo c u a n t i f i c a n d o l a s t r a n s f o r m a c i o n e s e x p é r i m e n t a das p o r o t r o s x e n o b i d t i c o s — a l d r f n , DDT, p e n t o b a r b i t a l y a n i l i n a , segun l o s p r o c e s o s e s q u e m a t i z a d o s en un c a p f t u l o - p r e c e d e n t s — en c u l t i v o s de A s p e r g i l l u s f l a v u s d e s a r r o l l a ­ dos en c o n d i c i o n e s " c o n t r o l " , f r e n t e a o t r o s a l o s que se a d i c i o n a una c o n c e n t r a c i d n i n i c i a l de 25 ppm de d i f e r e n t e s A r o c l o r . L o s c o r r e s p o n d i e n t e s r e s u l t a d o s se r e c o g e n en l a s t a ­ b l a s IX y X, do nd e , e f e c t i v a m e n t e , so pone de m a n i f i e s t o - q uo , a l menos on l o s c a s o s d e l a l d r f n , DDT y p e n t o b a r b i t a l , l a p r e s e n c i a do l o s PCBs i n t e n s i f i e s su r i t m o de t r a n s f o r m a i c i d n p o r p a r t e d e l m i c r o o r g a n i s m o . o I n M Q) g-S d S o 0> y*rl O nrf A a o Pi 0) Pi k in o (M Pi o OJ T* O ̂ rd d d ri § S •H 0) u 10 •H © nd d d Pi ̂ d Eh © P P w;l k o fd M "3 S M © © *d ^ o M B w•H d rH rH O «M d w •P d© i-i S* © Pi 10 <î I © «y (0 1^3 hO«H O O y g" # © o 1 P % d I P \o r\ 00 0\ r4 o\o CM CM o o b-m CM c\ m o\ Th ■ 9» #» *% *. »> o r-l o o o o m m in in m CM CM CM CM CM m irv iTN in m m CM CM p m T$" 00 ^ o m vo EH CM CM CM CM CM Î2; O O r4 < 1 pH rH 4 ^ y i 1d pà o«50 H O B O44W rÛl« dO d î>>y H CM kt*- ■P dlO lf\#k M 1o O o EH o%) P *HP rHv-** ©O O•p •HEH 1 aPP d MM © rH Od O©•*. »P Ol o©a ##» ©p o pp 1 y1 CM •H ••y y|p do fdp Q ##4dp y *o «iH Qp ü bd *rl•• P -PPl d rHO dd d ©«rlO ©a y © yp «rl yp*ŵ y od o «Hh- b- îd y yEH d o ©«rl SP 1 U© rHP EH P ©O _ p rH d© ©O y ©1 rH ©_ d dd d oVH «H «Hd O •H H -PiH d ta o © -P d d © ©u rH © d 44 •P •H •H y rûu © d yP o G -P p d p© pm CM © y © y o 0 d w •H •H ü rH d O © rO w d © •P h © P S d 1 © X © o y 3 d iH P rH O Eh §© © © y 'x . y—s * © d d o vO C7\ CM O rH © © © y CM en 00 CO en © - #» 9» - 9̂ #» y > —V xa 5P -p m CO tn vo vo d| © O % G CM O'»—' d y o d fO «H G o s y o k •H k d d o M o d Et 44 © 44 d -P © O © o d d •H d © d G d •« o A El G d •P o o •p © o y o iH © rH «H d © d -P •P *•. •H o y y iP l P © o b- m CM tn 00 b- p H o "M" o C7N H ^© p o #» #» #* #» #» d •** P 44 tn m 00 b- b- vO N eJ| O tn o © -p •p d d d Et ^ © © o d P rO N a P P S3 •r4 •• CM O o |P d • r -^ 'd O o U y p» d•rt © «r4 *P d xB 1 tn tn tn tn tn P G rH d oI CM CM CM CM CM P K o d P _ y ü d d P y -H •H O •• O «H P i d d p »f4 d d • * o © o d y y «rHG Pi •H © y © VD d y d •• in tn tn tn in tn y P O p M- -M* d o n b o y © «H •P rH o y -p d d *H p © "p El © d P •H © d O p p Et A g © d d p y rO P# o P O "p © ^ «r4 e CM CM CO Tb O d y y P en rt tn vo © © © E4 CM CM CM CM CM p © rrt g Î2Î iH rH fH rH rH VJ> d O 1 1 1 1 1 •• d « iH Ü < < . o ir> ^ 0 )ouj rVu> I ^ •r! nd O a O O ® a m #» CM Oi I rH «H a 0 m •p a 1 ë ©vo WO rH § • N CM O #. A m 03 CM© v_̂ d • © *4 O CJrH O O O © H < O m g o P -p w d d •H o •P o CO •H iH nd © nd 03 O d H Vd •H © O 'd d rH a O A A • 1 CM O CO d CM O -P o © • a to tt *0 •H A *d •H A o (0 •H ©«K e.penmenUVo^ • l e ô n c o s•o. inCM00 CM CMCM en CM % 9 / X * / / x : , c r .x ....̂ ! iU B i! x Æ l_ f^juste a l a e c u a c io n d R / d t « / l a f ig # 2 8 , (R=consumo de 1 6 8 l o s i n d i c e s de con sumo de o x f g e n o ( a ) d e s c i a n d e n p r o g r e s i y a men te ~ aunquo s i n l l e g a r n u nc a a l o s qua se dan en l o s cori t r o l e s — a m e d i d a que se e l e v a e l p o r c e n t a j e m e d i o de c l o r a c i d n d e l x e n o b i d t i c o , con l a s o l a e x c e p c i d n d e l A r o c l o r - - 1 2 5 4 ( d e s v i a c i o n que c o n c u e r d a con l a s o b s e r v a c i o n e s c o n ^ t a t a d a s en c a p f t u l o s a n t e r i o r e s y c u y a c a u s a ya se e x p l i c d . S i , a l a l u z de e s t o s r e s u l t a d o s , se c o n s i d é r a e l he - cho de que l a p r e s e n c i a de l o s PCBs d e p r i m e — como quedd — d e m o s t r a d o — e l d e s a r r o l l o d e l m i c r o o r g a n i s m o , p a r e c e i n m e - d i a t o c o n c l u i r que e l x e n o b i d t i c o d é t e r m i n a , en A . f l a v u s . u na c a f d a do l o s r e n d i m i e n t o s e n e r g e t i c o s d e l m e t a b o l i s m o o x i d a t i v o , c a i d a q u e , segdn t o d o s l o s i n d i c i o s , se debe a una c a n a l i z a c i d n i n a d e c u a d a de l a e n e r g i a l i b e r a d a , mas que a un b l o q u e o en l o s m e ca n i s mo s que l a p r o d u c e n , Una s i t u a c i d n en c i e r t o modo i n v e r s a es l a que ponen de m a n i f i e s t o l o s d a t o s r e l a t i v o s a l S a c c h a r o m y ces c e r e v i s ­ s i a e en med io no f e r m e n t a b l e ( f i g . 30 y 3 1 ) , ya que m i e n - t r a s l a m a g n i t u d d e l e f e c t o de l o s PCBs es maxima en e l A r £ c l o r - 1232 y d e c r e e s a m e d i d a que au men ta e l p o r c e n t a j e me­ d i o de c l o r a c i d n , l a n a t u r a l e z a de d i c h o e f e c t o c o n s i s t e en u n a d e p r e s i o n d e l consume de o x f g e n o . P o r o t r a p a r t e , l a r e l a c i o n e n t r e l o s c o e f i c i e n t e s o b ­ t e n i d o s p o r a j u s t e de l o s v a l o r e s e x p é r i m e n t a l e s a l a e c u a ­ c i o n l o g f s t i c a : dR 2 — = aR - bR^ d t Conlrol A - 1260 . A-1248 A* 1242 C'J A - 1232 ETANOL-37< horas105 F i g , 30 - E v o l u c i o n r i e l consumo de Go en S. c e r e v i s - s i a e ( m e d i o no F e r m e n t a b l e ) , No= 4 , 1 7 . l O " c e l u l a s / n l . C\f o CO InrvL_ O o < o o O'- teôricos X - expérimentales ETANOL - 3'/, tiempo F i g , 31 - A j u s t e a l a a c u a c i o n d R / d t = aR - bR^ de l e s va* l o r e s e x p é r i m e n t a l e s de l a f i g , 3 0 , ( R « consuma de O2) * 1 7 1 CONTROL 0 , 4 5 3 2 , 9 9 1 0 -3 A- 12 32 0 , 4 5 7 3 , 7 7 # 1 0 -3 A - 1 24 2 0 , 4 5 4 3 , 3 6 & 1 0 "3 A-1248 0 , 4 7 7 3 , 4 1 1 0 -3 A - 1 25 4 0 , 4 7 4 3 , 3 2 • I Q - 3 A-1260 0 , 4 7 2 2 , 2 2 1 0 - 3 m u e s t r a como l a ’’ c a p a c i d a d a de p o r t e ” — dada p o r e l p a r a m é ­ t r é a / b — f toma v a l o r e s que c r e c e n con l a I n t e n s i d a d de - l o s e f e c t o s t d x i c o s , p 0 n u G V O , p u e s , se p a t e n t l z a l a d i f e r e n c i a e n t r e l a s r e s p u e s t a de A s p e r q i l l u s y S a c c h a r o m y c e s a l o s x e n o b i o t i c o s e s t u d i a d o s , a l mismo t i e m p o que se r e f u e r z a l a h i p d t e s i s de q u e , en e s t a u l t i m a e s p e c i e , l o s PCBs a l t e r a n de a l g u n modo no l o s r e n d i r n i e n t e s — como en e l caso a n t e r i o r — d e l me tabo l i s m o o x i d a t i v o , s i n o l a m e c â n i c a misma d e l p r o c e s o * 6 - EFECTOS DE LOS PCBs SOBRE EL TRANSPORTE ELECTRONI- CO EN S a c c h a r o m y cGS c e r e v i s s i a e . L a s c a r a c t e r i s t i c a s de l a i n h i b i c i ( 5 n en e l consumo de o x f g e n o que , sogun p u s i e r o n de i n a n i f i e s t o l e s e x p e r i e n c i a s m i c r o m a n o m é t r i c a s , p r o v o c a l a p r e s e n c i a de l o s PCBs en c u l ­ t i v e s de S a c c h a r o m y ces c e r e v i s s i a e , c uando e l m i c r o o r g a n i s - mo se d e s a r r o l l a en m e d i o s no f e r m e n t a b l e s , l l e v a r o n a p l a n t e a r l a h i p d t e s i s de que d i c h o s x e n o b i 6 t i c o s p u d i e r a n desem p e f l a r un p a p e l m u t a g e n i c o , e l e v a n r i o l a t a s a n o r m a l de p r o - d u c c i d n de m u t a n t e s d é f i c i e n t e s en a l g u n c o m p o n e n t s e s e n - c i a l de l a cadona r e s p i r a t o r i a . L a a p l i c a c i d n , s i n e mb ar go , d e l e ns ay o d e l c l o r u r o de t r i f e n i l t e t r a z o l i o ( TTC ) segdn l a t o c n i c a de Ogur e t a l . ( 1 9 5 7 ) , d e m o s t r d que n i n g u n o de l o s A r o c l o r e x h i b e una capa c i d a d m u t a g é n i c a s i g n i f i c a t i v a en t a l s e n t i d o . Con t o d o , es p r e c i s e s e M a l a r que e x i s t e n m u t a n t e s con d e f i c i e n c i e s en l o s m é c a n i s m es de t r a n s p o r t e e l e c t r d n i c o o f u n c i o n e s c o n e x a s , no s u s c e p t i b l e s de d e t e c c i d n m e d i a n t s e l e n s a y o d e l TTC, y a s f p o r e j e m p l o P a r k e r y M a t t o n ( 1 9 6 9 ) v i e r t e n l a e x i a t e n c i a de m u t a n t e s i n c a p a c e s de l l e v a r a c a - bo l a f o s f o r i l a c i o n o x i d a t i v a , p e r o c a p a c e s de r e d u c i r e l TTC. La s B v i d e n c i a s m i c r o m a n o m é t r i c a s , no o b t a n t e , s u g e r i a n 173 con f u e r z a a l g u n a d i s f u n c i o n en e s t e t i p o de m e c a n i s m o s . De o t r o l a d o , en l a b i b l i o g r a f f a es p o s i b l e h a l l a r c i e r t o s a n - t e c e d e n t e s , aunque no muy p r e c i s o s , r e l a t i v e s a l a a c t u a - c i d n da d e t e r m i n a d o s c o m p u e s t o s o r g a n o c l o r a d o s , f u n d a m e n t a l m e n t e i n s e c t i c i d a s , como d e s a c o p l a d o r e s d e l t r a n s p o r t e e l e c t r d n i c o o l a f o s f o r i l a c i d n o x i d a t i v a en s i s t e m a s m i t o c o n - d r i a l e s a i s l a d o s de d i v e r s o s d r g a n o s de m a m f f e r o s ( P a r d i n i e t a l . , 1970 y 1 9 7 1 ; N e l s o n y W i l l i a m s , 1 9 7 1 ; S i v a l i n g a n , 1 9 7 3 ) , l o c u a l apoya e l a n t e r i o r p u n t o de v i s t a * En c o n s e c u e n c i a , se p r o c e d i d a l a i n v o s t i g a c i d n de l a i n f l u e n c i a de l o s PCSs s o b r e l a v e l o c i d a d de r e d u c c i d n d e l TTC, u t i l i z a n d o a h o r a l a t d c n i c a e x t r a c t i v a d e l f o r m a z é n — d e s c r i t a on un c a p i t u l o a n t e r i o r , y o p e r a n d o s o b r e c u l t i v o s de S a c c h a r o m y c e s en me d i o s d l i d o con f u e n t e de c a r b o n o no - f e r m e n t a b l e ( e t a n o l - 3% ) , a f i n de e l e v a r l a c o n t r i b u c i d n de l o s me can i smos o x i d a t i v o s a l b a l a n c e e n e r g é t i c o d e l mi - c r o c r g a n i s m o . L o s r e s u l t a d o s , e x p u e s t o s en l a t a b l a X I , ponen de ma n i f i e s t o un a e x a l t a c i d n en l a p r o d u c c i d n de f o r m a z a n en l e s c u l t i v o s d o s i f i c a d o s con l o s x e n o b i d t i c o s , con v a l o r e s que d e s c i e n d e n a m e d id a que se e l e v a e l p o r c e n t a j e de c l o r a c i d n d e l A r o c l o r a d i c i o n a d o a l m e d i o . S i b i e n en una p r i m e r a a p r e c l a c i d n e l l o p a r e c e r i a in d i^ c a r que l o s PCBs d e t e r m i n a n una i n t e n s i f i c a c i é n d e l f l u j o - de e l e c t r o n e s a t r a v é s de l o s p o r t a d o r e s , una i n t e r p r é t a - c i o n que i n t e g r a e s t o s r e s u l t a d o s con l o s de l o s e n s ay o s c r o m a n o m é t r i c o s l l e v a f o r z o s a m e n t e a o t r a e x p l i c a t i o n . 1 1 rH •H d O G S d-p o* o w 1• E4 ü w• d-aj o • d 'd d oo ^ o o rH O -P O d O d a> H ® *0 d <4 nd u «H-po 0) m oi d Q) V» o -p d iH o d P< o o to d o o o 0) »d -P tj 4-# d ' H ' H il o rH P4 O & o g Th rH K VÛ Tt* 00 h - - #* • k #» lA 00 CA (A CM rH O CM 00 t - vO O (A O b- fA rH CM CM rH rH rH (A 00 t - CM rH rH o \ (A 00 rH o \ CM M- CA CA CM «» •k •k O o O O O O U-N CO CVJ m vû CO CN r - in CM rH o rH rH rH rH rH^ c\ ^ O O O O O O O CM CM OO •M* O d î CA lA MO Eh CM CM CM CM CM iz ; rH rH rH rH O 1 t 1 1 ! o en en o (•/•) ^0 oujnsuoD |ep uoisdJdeQ w H < o % 3 Ê o w oo CM O in î O •H m C O e kl bo o •H (H Oa d •H r4 03 02 O •H 'Ü O 03 kl Q> 02 h ü oiH d M > 0> •d o ü w o o bû î>M •HX -PO d o ü'd d 03 a os 03p o 03 dd o o kl o -p o 03 02 O rH r-i 0) O 0> U ya d a o A O d V5 a •H -p O u d o r4 Pr O 03 kl fj kl a O kl ü •p 1 'S•dm •Hl>• •H bû-P •H ü P4 a a fH O co 0 r4 "d 1 gO «H O fl O •H O e P:o 03 ̂ O o î t u O î u 1 ro’ O O Z> Q.»-< a. 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S i e l o x f g e n o m o l e c u l a r se r e d u c e a menos v e l o c i d a d en l o s m i c r o o r g a n i s m o s d o s i f i c a d o s con l o s x e n o b i t S t i c o s , — l o s t r a n s p o r t a d o r e s de e l e c t r o n e s en e s t a d o r e d u c i d o se e n - c o n t r a r â n , on r e l a c i d n con l o s m i c r o o r g a n i s m o s " c o n t r o l " , en c o n c e n t r a c i o n es rnas a l t a s , l o que a h o r a e x p l i c a l a mayor v e l o c i d a d de r e d u c c i d n d e l TTC, P er o s i l o s e l e c t r o n e s son t r a n s p o r t a d o s n o r m a l m e n t e h a s t a e l n i v e l U b i q u i n o n e - c i t o - c romo b ( q u o es e l e s l a b d n a l que so a c o p l a l a r e d u c c i d n do l a s s a l e s do t e t r a z o l i o , f i g . 3 3 ) , p ese a l o c u a l e x i s t e un r e t a r d o en l a r e d u c c i d n d e l o x f g e n o m o l e c u l a r , l o s e f e c t o s de l o s PCQs deben c o n s i s t i r p r e c i s a m o n t e en e l b l o q u e o , a l menos p a r c i a l , d e l t r a n s p o r t e e l e c t r d n i c o an a l g u n o de l o s e s l a b o n e s s u b s i g u i e n t e s , es d e c i r a n i v e l rie c i t o c r o m o s . HO ( I ) 7 - INFLUENCIA DE LOS PCBs SOBRE LA PRODUCCION DE ACI- DO KOJICO. Numer osos m i c r o h o n g o s — en p a r t i c u l a r d i v e r s o s A s p e r ­ g i l l u s — p r o d u c e n en a e r o b i o s i s a c i d o k d j i c o ( 2 - h i d r o x i r a e - t i l - 5 - h i d r o x i - ^ - p i r o n a : l ) on p r o p o r c i o n e s s i g n i f i c a t i *" v a s , a p a r t i r de una g r a n va 0 ' r i e d a d de f u e n t e s h i d r o c a r b £ n ada s ( aun s i e n d o p o s i b l e su p r e p a r a c i o n p o r v f a s i n t e t i - c a , l a o b t e n c i d n i n d u s t r i a l de e s t e c o m p u e s t o se l l e v a a cabo p r e c i s a m e n t e p o r p r o c e - d i m i e n t o s f ô r i n en t a t i v o s ) * S i b i e n su e s t r u c t u r a q u f m i c a se c o n o c a d esde 1924 y en l a a c t u a l i d a d se l a ban e n c o n t r a d o a p l i c a c i o n e s p r a c t i ­ c e s como s i n e r g i s t a de c i e r t o s i n s e c t i c i d a s ( M a y e r e t a l * 1 9 4 6 ) y como i n t e r m e d i a r i o en l a s f n t e s i s de i n s e c t i c i d a s ( M e t i v i e r , 1 9 5 7 ) , f u n g i c i d a s ( O ' K a n e y M o r e y , 1 9 4 9 ) , a n t i - b i o t i c o s y d r o g a s c a r d i o v a s c u l a r e s ( K r i m e l , 1 9 5 5 ) , e l p a ­ p e l f i s i o l o g i c o e x a c t o d e l a c i d o k d j i c o en l o s m i c r o o r g a ­ n i s m o s que l o p r o d u c e n , d i s t a aun de e n c o n t r a r s e s u f i c i e n - t e m e n t e a c l a r a d o . Desde l u e g o , su i n t e n s a a c t i v i d a d a n t i b a c t e r i a n a , e s - p e c i a l m e n t e t r e n t e a l a s b a c t e r i a s G r a m - n e g a t i v a s , y que - ha s i d o e s t u d i a d a p o r n u m e r o s o s i n v e s t i g a d o r e s ( V a b u t a , 179 1 9 1 2 ; F o s t e r y K a r r o u , 1 9 4 5 ; M o r t o n e t a l * 1 9 4 5 ) , o b l i g a a a t r i b u i r l e un p a p e l r e l e v a n t e en l o s fe no me no s de a n t i b i o ­ s i s n a t u r a l * Fs p o s i b l e , s i n e m b ar g o , que sus f u n c i o n e s - no se a g o t e n a q u f * L a s p r o p o r c i o n e s en que se f o r m a e l a c i d o k d j i c o de - penden d i r e c t a m e n t e de l a f u e n t e de c a r b o n o d i s p o n i b l e , — s i e n d o l a g l u c o s a e l s u s t r a t o p r e f e r e n t a , a t r a v é s , segun A r n s t e i n y B e n t l e y ( 1 9 5 3 a ) , de l a s r u t a s a l t e r n a t i v e s I - I I - I l i a o I - I I - m b - I V ( f i g * 3 4 ) * No ha quedado d e s c a £ t a d a , s i n e mb ar g o , l a v f a mas d i r e c t a g l u c o s a - I l i a - a c i d o k o j i c o , p r o p u e s t a p o r Y a b u t a ( 1 9 2 4 ) y a s u m i d a p o r K i n o s h i t a ( 1 9 2 7 ) y H a w o r t h ( 1 9 2 9 ) , s i e n d o p r o b a b l e l a c o e x i s t o n c i a - do t o d a s e l l a s * P o r o t r a p a r t e , l o s mismos A r n s t e i n y B e n t 1 oy ( 1 9 5 3 a y b) s u g i e r e n l a p o s i b i l i d a d do que o t r a s m o l e - c u l a s mas p o q u e h a s , como e l a c e t a t o , g l i c e r a t o , p i r u v a t o , e t c * , p a r t i c i p e r ! a s i m i s m o on l a b i o s f n t e s i s d e l a c i d o en - c u e s t i o n , p r e v i a f o r m a c i é n de t r i o s a f o s f a t o s * De c u a l q u i e r modo que f u n c i o n e n t a l e s m u l t i p l e s p o s i - b i l i d a d e s b i o s i n t e t i c a s , e l hecho es que en un c u l t i v o co ji v e n c i o n a l de A s p e r g i l l u s f l a v u s s o b r e med io de C z a p e k , e l c o n t e n i d o en a c i d o k o j i c o a l c a n z a l o s v a l o r e s max imes a l - c o m i e n z o de l a f a s e e s t a c i o n a r i a , p a r a d i s m i n u i r g r a d u a i - m e n t e , h a s t a d e s a p a r e c e r , a l o l a r g o de l a f a s e de a u t o l i - s i s (Lahoz e t a ie ) , l o c u a l p a r e c e i n d i c a r que e l m i c r o o r g a ­ n i s m o l o p r o d u c e c uando se d e s a r r o l l a en med i o r i c o s en nsj t r i a n t e s , p u d i e n d o r e u t i l i z a r l o u l t e r i o r m o n t e , en l a s f a - se s d e f i c i t a r i a s en f u e n t e s e x d g e n a s de c a r b o n o * S i , p o r - a h a d i d u r a , se t i e n s en c u e n t e que en un am bien t e n a t u r a l l o s b i o t o p o s r i c o s en f u e n t e s o r g a n i c a s de c a r b o n o son f a v o - X o o o XX o O O X: O Q < X o = o X uo X o Oxi daciôn X O Z) o : C3 M «2 OO t 4 •OVD O •H O YÙ rH 0 'd coo o •H sS h •fH A (0 o ho co H 3o 0) kPi o f-t -p do & 10 o co d k co o10 •H 3> d rH d rO > •rH CO Q> O "TjP4 I •H -P U Pw• bo d •H Ph to •rH to ©-P 191 r a b i e s a l d e s a r r o l l o de n u m er o s os m i c r o o r g a n i s m o s en c ompe- t e n c i a t r o f i c a ^ es c l & r a l a c o h o r e n c i a e n t r o l a d i n a m i c a — que s i g u e l a p r o d u c c i o n de a c i d o k o j i c o y su c a r a c t e r a n t i - b i o t i c o * E l e s t u d i o de d i c h a d i n a m i c a on c u l t i v o s de A. f l a v u s d o s i f i c a d o s con 25 ppm de l o s d i f e r e n t e s A r o c l o r puso de ma n i f i e s t o qua t a n t o s i se c o n s i d é r a e l a c i d o k d j i c o t o t a l — p r o d u c i d o p o r cada u n i d a d de c u l t i v o — 50 ml de med io — ( f i g . 3 5 ) , como e l p r o d u c i d o p o r u n i d a d de b i o m a s a ( f i g . 36) r e s u l t a n s e r l o s A r o c l o r de q r a do de c l o r a c i d n med io — A- 1248 y A - 1 2 5 4 — l o s que e x a l t a n con mayor i n t e n s i d a d l a - s f n t e s i s d e l a n t i b i d t i c o , quedando l a c o t a a l c a n z a d a en e l caso d e l A - 1 2 42 l i g e r a m e n t e p o r e n c i m a de l a d e l c o n t r o l y s i e n d o e l c u l t i v e con A - 1 2 60 e l q u e , una vez mas, p r é s e n t a e l c o m p o r t ami en t o mas s e m e j a n t e a l d e l c o n t r o l . L o s e f e c t o s mas n o t a b l e s se p r o d u c e n en e l caso d e l A - 1 2 3 2 , que d a t e r r n ^ na una t o t a l a b o l i c i d n d e l r i t r n o de b i o s f n t e s i s d e l compue^ t o en c u e s t i o n . T a n t o s i e l p a p e l f i s i o l o g i c o d e l a c i d o k d j i c o en As - p e r q i l l u s f l a v u s c o n s i s t s en p r o v e e r a l m i c r o o r g a n i s m o de un mécan i sme de a n t i b i o s i s , como s i se t r a t a de una s u s t a n - c i a en c i e r t o modo de r é s e r v a , como s i c o n t r i b u y e a ambos f i n e s , d esde un p u n t o de v i s t a e c o l d g i c o l a p r o d u c c i d n de e s t e c o m p u e s t o es p e r f e c t a m e n t e i n t e r p r é t a b l e como l o q ue , en t e r m i n o l o g i e de M a c A r t h u r ( 1 9 6 8 ) , hoy g e n e r a l i z a d a ( - ^ ) , ( ^ ) Segun d i c h a t e r m i n o l o g i e , l o s o r g a n i s m e s ” e s t r a t e q a s de l a r " son l o s que basan su c a p a c i d a d de c o m p e t e n c i a en 2 0 0 ' in c o n t r o l o o A-12 32 A-1254 A-1260 100 -o F i g . 35 - E v o l u c i o n de l o s c o n t e n i d o s de a c i d o k o j i c o en c u l t i v o s de A. f l a v u s d o s i f i c a d o s con 25 ppm da l o s d i ^ t i n t o 8 A r o c l o r . 0,50- en conlrolCL o— o A -1232 o -1242 A-1248 A-1254 A-1260 -o- — -o-o 200 horas400 F i g * 36 - E v o l u c i d n de l o s c o n t e n i d o s r e l a t i v e s de a c i d o k o j i c o en c u l t i v o s de A. f l a v u s d o s i f i c a d o s con 25 ppm de l o s d i s t i n t o s A r o c l o r * 1 8 4 se c o n o c e conic un n iecanismo " K ^ L a i n t e r f e r e n c i a de l o s PCDs en t a l mecanisrno a p a r e c e un t a n t o c o n f u s a , p o r c u a n t o l o s d i s t i n t o s A r o c l o r p a r e c e n e j e r c s r e f e c t o s en a l g u n o s c a s o s o p u e s t o s * Queda c l a r o „ s i n e mb a r g o , que l a m o z c l a de b i f e n i l o s p o l i c l o r a d o s q ue , a j u ^ g a r p o r su i n f l u e n c i a en t o d o s l o s r e s t a n t e s p a r a m e t r o s b i £ I cSg ic os e s t u d i a d o s en e s t a m e m o r i a r é s u l t a mas t o x i c a ( A r o ­ c l o r - 1 2 3 2 ) , i n h i b e f u e r t e m e n t e l a b i o s f n t e s i s d e l a c i d o k £ j i c o , l o c u a l se p r e s t a a i n t e r p r e t e r como una r o p r o d u c c i o n a n i v e l de e s p e c i e — l e s i d n o p e r d i d a de m e ca n i s mo s " K " — de l o s e f e c t o s que l o s x e n o b i d t i c o s c au san a n i v a l de e c o - s i s t e m a — r e g r e s i d n p o r c r e a c i d n de c o n d i c i o n e s que f a v o r e - cen a l o s o r g a n i s r n o s " o s t r a t e g a s de l a r " —• l a p r o d u c c i d n de un e l e v a d o numoro de d e s c e n d i e n t e s ; l o s que i n v i e r t e n en l a r e p r o d u c c i o n l a f r a c c i d n m a y o r i t a r i a de sus p o s i b i l i d a d e s o n e r g o t i c a s . L o s " e s t r a t e o a s de l a k " , - p o r e l c o n t r a r i o , son a q u e l l o s q u e , p r o d u c i e n d o un mas es ca so numéro de d e s c e n d i e n t e s , d i s i p a n p r o p o r c i o n e s i m p o r t a n ­ t e s de e n e r g i a an e l m a n t e n i m i e n t o de me ca n i s mo s a d a p t a t i ­ ve s mas o menos s o f i s t i c a d o s , que a s e gu r a n . u n as més a l t a s - t a s a s do s u p e r v i v e n c i a * N a t u r a l m e n t e que e n t r e l a s c a t e g o r f a s t e o r i c a s e x t r e - mas se e n c u e n t r a t o d a una a m p l i s i m a v a r i e d a d de c a t e g o r f a s r e a l o s y p r a c t i c a s que r e p r e s e n t a n s o l u c i o n e s de ma y or o m£ n o r c o r n pr o m i so ; que c o m b i n a n m e ca n i s mo s que s i r v e n a d i s t i £ t a s G s t r a t e g i a s , P e r o — y a rnuy d i s t i n t o s n i v e l e s de f i n u r a — es p o s i b l e i n t e r p r e t e r h a c i a donde un d e t e r r n i n a d o m e c a n i s m o , su r e f u e r z o o su r e l a j a c i d n , t i e n d e n a d e s p l a z a r l a e s t r a t e g i a a d a p t a t i v a da un s e r v i v o * " C " - C O N C L U S I O N E CONCLUSIONES L a r e c a p i t u l a c i d n f i n a l de l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s a l o l a r g o d e l d e s a r r o l l o e x p e r i m e n t a l de l a p r e s e n t e m e m o r i a , p e r m i t s f u n d a m e n t a r l a s c o n c l u s i o n e s quo a c o n t i n u a c i d n se r es umen en l o s s i g u i e n t e s a p a r t a d o s : 1 - N i n g u n o de l o s m i c r o o r g a n i s m o s s e l e c c i o n a d o s , on - n i n g u n a de l a s m o r i a l i d a d e s de c u l t i v o quo so e n s a y a r o n , mo_s t r d c a p a c i d a d p a r a l a t r a n s f o r m a t i o n m e t a b d l i c a de l o s PCBs* 2 - En c u l t i v o s do A s p e r g i l l u s f l a v u s y Sancharorny ces c e r e v i s s l a o d o s a r r o l l a d o s an m e d i o s I f q u i d o s , e l p r o c s s o de b i o c o n c r e n t r a c i o n de l o s PCBs p a r e c e v e n i r d e t e r r n i n a d o e x c l u s i v a r n e n t e p a r m e c a n i s m os p a s i v o s de t r a n s p o r t e , S i e n d o l o s n i v e l e s a l c a n z a d o s en e l e s t a d o do e q u i l i b r i o l i n e a l y d i ~ r e c t a m e n t e c o r r o l a t i v o s con e l p o r c e n t a j e med io de c l o r a - c i o n — l i p o f i l i a — de l o s x e n o b i d t i c o s a d i c i o n a d o s a l m e d i o , y s a t i s f a c i e n d o a s i m i s m o con un buon g r a d e de a j u s t e l a ----- e c u o c i d n de F r e u n d l i c h , e l p o t e n c i a l do b i o c o n c o n t r a c i d n —- p u e d e i n t e r p r e t a r s e como una r é s u l t a n t e de l a s c o n t r i b u c i o - n es d e b i d a s t a n t o a f e n o m en o s de r e p a r t e como de a d s o r c i o n , s i b i e n no s ea s e n c i l l a l a d i f o r e n c i a c i d n e n t r e l a s r e s p e c ­ t i v e s c o n t r i b u c i o n e s , 3 - L o s e f e c t o s do l o s PCBs s o b r e A s p e r g i l l u s f l a v u s d e f i n e n un c u a d r o t o x i c o l d g i c o muy c o m p l e j o , en e l que l a - 1 8 7 a c c i d n • * d i r e c t a ” de l o s x e n o b i d t i c o s p a r e c e desempenar un - p a p e l s e c u n d a r i o T r e n t e a l a s d i s f u n c i o n e s r é s u l t a n t e s de - l a p r o p i a r e s p u e s t a a d a p t a t i v a d e l m i c r o o r g a n i s m o , y en r e - l a c i d n con e l c u a l es p r e c i s o d e s t a c a r l o s a s p e c t o s que a - c o n t i n u a c i d n so d e s c r i b e n * 4 - L a i n t e n s i d a d de l o s e f e c t o s t d x i c o s en sus d i s t i n t a s m a n i f e s t a c i o n e s v a r i a en r e l a c i d n i n v e r s a con e l p o r c e n t a j e med io de c l o r a c i d n de l o s PCQs, 5 - L a s m a n i f e s t a c i o n e s més r e l e v a n t e s d e l c u a d r o t o x £ c o l d g i c G c o n s i s t é e e n : a) d e p r o s i d n d e l c r e c i m i e n t o , con una que, en e l caso d e l A r o c l o r de p e r f i l c r o r n a t o g r é f i c o mas s i m i l a r a l que p r o d u c e n l o s e x t r a d o s de m u e s t r a s ambion t a i e s ( A r o c l o r - - 1 2 5 4 ) , se s i t u a en l a s 10 ppm ( v a l o r e x p e r i m e n t a l : 1 0 , 3 0 ) . b) e s t i m u l a c i d n de l a b i o s f n t e s i s de RNA c u y os n i ­ v e l e s r e l a t i v e s en o l m i c e l i o a l c a n z a n v a l o r e s que d u p l i c a n a l o s n o r m a l e s a s i m i s m o p a r a d o s i s de 10 ppm de A r o c l o r - 1 2 5 4 ( v a l o r e x p e r i m e n t a l : 1 0 , 0 5 ) . c ) e x a l t a c i d n d e l consumo de o x i g e n o p o r p a r t e d e l m i c r o o r g a n i s m o , q u e , a l no t r a d u c i r s e en una s u p e r i o r v e l o ­ c i d a d en l a s f n t e s i s de b i o m a s a , su pon e una c a f d a en l o s — r e n d i m i a n t o s d e l m é t a b o l i s m e e n e r g é t i c o . d) a l t e r a c i d n en l o s n i v e l e s y r i . t m o s de p r o d u c ­ c i d n de a c i d o K o j i c o . 1 8 8 6 - Como r e s p u e s t a a l a p r e s e n c i a de l o s PCBs, y en - - c ü n s o n a n c i a con l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s en t o r n o a l o s n i ­ v e l a s de RNA, en A s p e r g i l l u s p a r e c e d e s a r r o l l a r s e , con i n t e n s i d a d d i r e c t a m e n t e r e l a c i o n a d a con l a t o x i c i d a d , un p r o c e s o de i n d u c c i d n de e n z i m a s q u e , s i b i e n r e s u l t a n i n e f e c t i v a s - f r o n t s a l s u s t r a t o i n d u c t o r , que q ueda i n a l t e r a d o ( s a t r a t a , p u e s , de u n a i n d u c c i d n i n j u s t i f i c a d a o g r a t u i t a ) , se m u e s - t r a n c a p a c e s de a c e l e r a r s i g n i f i c a t i v a m e n t e e l m e t a b o l i s m o de o t r o s x e n o b i d t i c o s , fendmeno p a r a e l que se p r o p o n e e l - t e r m i n o de m e t a b o l i s m o a l o i n d u c i d o . 7 - L o s e f e c t o s do l o s PCBs s o b r e 5 a c c h a r o m y ces c e r e ­ v i s s i a e p a r e c e n r e s p o n d e r a un mecan i smo de a c t u a c i o n de n£ t u r a l e z a d i f e r e n t e a l d e s c r i t o p a r a A s p e r g i l l u s f l a v u s , r e - s u l t a n d o , p o r o t r a p a r t e , c l a r a m e n t e d o p e n d i e n t e s d o l t i p o p r é d o m i n a n t e de m e t a b o l i s m o e n e r g é t i c o f e r m e n t a t i v o o r e £ p i r a t o r i o — i r n p u e s t o p o r l a f u e n t e o r g a n i s a de c a r b o n o d i s ­ p o n i b l e en e l m e d i o . A s f , en m e d i o s f e r m e n t a b l es l a i n t e n s i dad do l a s m a n i f e s t a c i o n e s t d x i c a s , p a r t i c u l a r m e n t e en e l - c as o d e l A r o c l o r - 1 2 3 2 , a l c a n z a v a l o r e s s i g n i f i c a t i v a m e n t e mas b a j o s que l o s e n c o n t r a d o s cuando e l m i c r o o r g a n i s m o se - ve o b l i g a d o a s a t i s f a c e r sue n e c e s i d a d e s e n e r g e t i c a s v f a ci^ d o de K r e b s ( en g l u c o s a : D l g g 4 6 , 7 ; en e t a n o l : D I gg ~ = 1 2 , 3 , p a r a e l A - 1 2 3 2 ) . 8 - E l g r a d o de t o x i c i d a d de l o s A r o c l o r e n s a y a d o s v a ­ r i a en r e l a c i o n i n v e r s a con su c o n t e n i d o med io en c l o r o , - - s i e n d o e s t a v a r i a c i é n , en l o que se r e f i e r e a l o s e f e c t o s s o b r e e l p e s o se co de l a s c o s e c h a s , n o t a b l e m e n t e mas a c u s a - da que l a que se p o ne de m a r i i f i e s t o en l a e s p e c i e a n t e r i o r . 1 8 9 9 " L o s e f e c t o s de l e s PCBs s o b r e l o s i n t a r c a m b i o s de g a se s en m e d i o s no f e r m e n t a b l e s , g u a r d a n d o un a c o r r e l a c i o n d i r e c t s con e l g r a d o de t o x i c i d a d , c o n s i s t s n , a l c o n t r a r i o que en A s p e r g i l l u s f l a v u s , en una d e p r e s i d n de l o s consumos do o x f g e n o , 10 - Segun pone de i n a n i f i e s t o l a e v a l u a c i d n con j u n t a - de l o s r e s u l t a d o s m i c r o m a n o m é t r i c o s y l o s c o r r e s p o n d i e n t e s a l e s t u d i o de l a a c t i v i d a d t r a n s p o r t a d o r a de e l e c t r o n e s , — l o s PCBs b l o q u e a n d i c h a a c t i v i d a d , a l menos p a r c i a l m e n t e , a n i v e l de a l g u n e s l a b o n de l o s c o m p r e n d i d o s e n t r e o l c i t o c r o mo b y e l o x f g e n o m o l e c u l a r , 11 - T a n t o l o s r e s u l t a d o s c o r r e s p o n d i e n t e s a l o s n i v e ­ l e s r e l a t i v o s de RNA — quo en e s t a u l t i m a e s p e c i e se mu es - t r a n s u s t a n c i a l m e n t o i n a l t é r a b l e s p o r l a p r e s e n c i a de l o s PCBs — , como l o s r e f e r e n t e s s l a s i n c u b o c i o n e s l l e v a d a s a cabo on p r e s e n c i a de v a r i o s x e n o b i d t i c o s , i n d i c a n que, en Sa cc har or ny ce s c e r e v i s s i a e , l o s m e ca n i s mo s de i n d u c c i d n enzj^ m a t i c a no debon d e se mp e i l a r un p a p a l r e l e v a n t e en l a r e s p u e s t a d e l m i c r o o r g a n i s m o a l o s t d x i c o s e n s a y a d o s , 12 — L a v a l o r a c i d n , d es de un p u n t o do v i s t a e c o l o g i e s , d e l a n t e r i o r c o n j u n t o de r e s u l t a d o s , p e r m i t s d e s c u b r i r l a - p r o f u n d a c o h e r e n c i a con q u e , a t o d o s l o s n i v e l e s , se ponen de m a n i f i e s t o l a s d i f e r e n c i a s e n t r e l a s e s t r a t e g i a s a d a p t a - t i v a s de l o s s e r e s v i v o s , A s i como e l hecho de que e l d e s - p l a z a m i e n t o h a c i a e s t r a t e g i a s de l a " r " — r e p e t i d a m e n t e s e - M a l ad o como r e s p u e s t a de l a s c o m u n i d a d e s b i o l d g i c a s a l o s - t r a s t o r n o s a m b i e n t a l e s — c o n s t i t u y e t a m b i d n , a n i v e l de i n - 1 5 0 d i v i d u o , una. c o n s e c u e n c i a de i s a c c i d n de l o s x e n o b i d t i c o s , E f e c t i v a m e n t e , t e n i e n d o en c u e n t a qua e l 5 a c c h a r o m y c es c e r e v i s s i a e ( P r o t o a s c o r n i c e t o ) y A s p e r g i l l u s f l a v u s ( E u a s c o - m i c e t o ) , c o n s t i t u y a n dos e n t i d a d e s b i o l d g i c a s q u a , c o m p a r a ­ b l e s p o r su r e l a c i d n f i l o g e n a t i c a , r e p r e s e n t a n dos n i v e l e s e v o l u t i v o s en l o s que e l s e g u n d o , mas a v a n z a d o , as mas e s - t r a t e g a de l a " k ” que e l p r i m e r o , r é s u l t a de i n t e r e s d e s t a - c a r ; a) E l A, f l a v u s ( e s t r a t e g a de l a *’ k ” ) es mas s e n s i b l e a l a a c c i d n de l o s PCBs quo e l S, c e r e v i s s i a e ( e s t r a t e g a de l a " r " ) . b) E n t r e l a s m a n i f o s t a c i o n e s de l a a c t i v i d a d de l o s PCQs s o b r e A. f l a v u s se c u e n t a l a a l t e r a c i d n de l o s r l t m o s de b i o s f n t e s i s d e l a c i d o k o j i c o ( i n c i d e n c i a , p u e s , s o b r e un i m p o r t a n t e m e c a n i s m o ’' k ' * ) , c ) Ü adas l a s d i f e r e n c i a s e x i s t a n t e s e n t r e l o s e f e c t o s de l o s PCBs s o b r e S, c e r e v i s s i a e en m e d i o s f e r m e n t a b l e s y no f e r m e n t a b l e s , es i n m e r i i a t o s u p o n e r que s i , en c o n d i c i o ­ n e s n a t u r a l e s , l a l e v a d u r a t u v i e s e i g u a l m e n t e d i s p o n i b l e s ambos t i p o s de s u s t r a t o s , l a p r e s e n c i a de l o s x e n o b i d t i c o s a c e n t u a r i a e l d e s p l a z a m i e n t o d e l m e t a b o l i s m o e n e r g é t i c o d e l m i c r o o r g a n i s m o h a c i a l a s v i a s f e r m r a n t a t i v a s , t e n d i e n d o a a n u l a r e l p a p e l de l a s r e s p i r a t o r i a s * L a m e r a t o n d e n d i a a l a p é r d i d a de u n a p o s i b i l i d a d me- t a b d l i c a s i g n i f i e s , s i n du d a , u n a p é r d i d a de m e c a n i s m o s ” k ’*. 19,1 P e r o p o r a n a d i d u r a , e l p r o c e s o f a v o r o c i d o an e s t e caso as - l a f e r m e n t a c i d n q u e , aunque segun se ha y l s t o , s o p o r t a un - r i t m o de c r e c i m i e n t o mas r a p i d o ( o t r a m a n i f e s t a c i o n ’h : ” ) — r o G u l t a — p u e s t o que e l s u s t r a t o s o l o se o x i d e p a r c i a l m e n - t e — de n ienor e f i c i e n c i a que l a o x i d a c i d n v i a c i c l o d e -------- K r e b s . P e r d i d a de e f i c i e n c i a que d e f i n e a su vez un d e s p l a - z ami en t o ” k ” —-»• " r " . d) Aunque n i n g u n a de l a s dos e s p e c i e s es c a paz de e j e r c a r u n a a c c i d n m e t a b d l i c a s o b r e l o s PCBs, e l A s p e r g i l l u s , - mas e v o l u c i o n a d o , p a r e c e p o n e r en j u e g o una r e s p u e s t a i n d u e t i v a que no se m a n i f i e s t a en S a c c h a r o m y c e s , R e s p u e s t a , no - o b t a n t o , que r é s u l t a e s t e r e o t i p a d a e i n u t i l ^ s i n o p o r j u d i ­ c i a l — , l o c u a l se p r e s t a a i n t r o d u c i r c i e r t a s r iudas en l a s e g u r i d a d quo muchos a u t o r o s e x p r e s a n s o b r e e l v a l o r de l a s p o s i b l e s a d a p t a c i o n e s a l o s c o m p u e s t o s x e n o b i d t i c o s . " D " - B I B L I 0 G R A F I A BIBLI OGRAFI A CITADA 1 - A n d e r s , M. U, - B i c c h e m * P h a r m a c o l , 1 ^ , 2551 ( 1 9 6 9 ) , 2 - A r n s t e i n , H . R . U * ; B e n t l e y , R, - B i o c h e m , B, 54 , 493 ( 1 9 5 3 a ) , 3 - A r n s t e i n , H . R . V . ; B e n t l e y , R, - B i o c h e m , 3 , 5 4 , 508 ( 1 9 5 3 b ) . 4 - A r n s t e i n , H . R . l / , ; B e n t l e y , R. - B i o c h e m . 3 , 5 4 , 517 ( 1 9 5 3 c ) . 5 - B a l u j a , G; F r a n c o , 3 . M . ; m u r a d o , M .A . - I n v e s , P e s q . 37 ( 3 ) , 593 ( 1 9 7 3 ) . 6 - B e n t l e y , R. - M e t h . F n z y m o l . 3, 23G ( 1 9 5 7 ) . 7 - B i t m a n , 3 . ; C e c i l , H.C* - 3 . A g r , Food Chem, 1_8, 1108 ( 1 9 7 0 ) . 8 - B o l l a g , 3 . M . - Ad v . A p p l . M i c r o b i o l . 1 ^ , 75 ( 1 9 7 4 ) . 9 - B r o d i e , B . ; A x e l r o d , 3 . - 3 . P h a r m a c o l . 2É» 22 ( 1 9 4 8 ) . 10 - B r o d i e , B . ; B u r u s , 3 . ; M a r k , L . ; L i e f , P . ; B e r n s t e i n , C. ; P a p p e r , E. - 3 . P h a r m a c o l . 1 0 9 , 26 ( 1 9 5 3 ) . 11 - B r o c k , T . D , ~ " B i o l o g f a de l o s m i c r o o r g a n i s m o s " , p a g . 1 8 7 . E d i t o r i a l Omega. B a r c e l o n a ( 1 9 7 3 ) . 12 - B r o o k s , G . T . ; H a r r i s o n , A. - B i o c h e m . P h a r m a c o l . 1 8 , 557 ( 1 9 6 9 ) . 13 - B u r t o n , K. - B i o c h e m . 3 . 315 ( 1 9 5 6 ) . 14 - C o c h i n , 3 . ; A x e l r o d , 3 . - 3 . P h a r m a c o l . 1 2 5 , 105 ( 1 9 5 9 ) . 1 9 4 15 - ChancQj B, - " A sympos ium o f t h e mechan i sm o f enzyme a c t i o n " , pag« 339* E d i t o r s : U«D* M c E l r o y and B, G l a s s , B a l t i m o r e : J o h n s H o p k i n s P r e s s ( 1 9 5 4 ) , 16 - C h a n c e , 8 , ; W i l l i a m s , G , R . ; H o l m e s , U . F . ; H i g g i n s , J . - 3 . B i o l . Chem. 2T7, 439 ( 1 9 5 5 ) . 17 - De F a u b e r t , M. ; Egan , H . ; C o d l y , E , U . ; Hammond, E . U . ; R o b u r n , 3 . ; Thompson, 3 . - A n a l y s t , 8 ^ , 168 ( 1 9 6 4 ) . 18 - D i s c h e , Z. - F i i k r o c h e m i e , 8̂ , 4 ( 1 9 3 0 ) , 19 - D u k e , T . W . ; L o u e , 3 , 1 . ; W i l s o n , A , 3 . - B u l l , Env . C e n t . T o x , 5 , 171 ( 1 9 7 0 ) . 20 - F o s t e r , 3 . W . ; K a r o u , E .O. ~ 3 . B e e t . 19 ( 1 9 4 5 ) . 21 - F o s t e r , 3 .W, - " C h e m i c l a A c t i v i t i e s o f F u n g i " , A ca d e m i c P r e s s , New Y o r k ( 1 9 4 9 ) . 22 - F o s t e r , 3 ,W. ~ " T h e O x y g e n a s e s " , p a g . 2 41 . A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k ( 1 9 6 2 ) . 23 - G i l e s , K . W . ; M y e r s , A. - N a t u r e , 4 9 7 9 , 93 ( 1 9 6 5 ) . 24 « Goa, 3 . ~ S c a n d . C l i n . L a b . I n v e s t . £ , 210 ( 1 9 5 3 ) . 25 - G r a n t , D . L . ; P h i l l i p , U . E . 3 . , V i l l e n e u v e , D.C. - B u l l . E n v . C o n t . T o x . jS, 102 ( 1 9 7 1 ) . 26 - G r e b , W. ; K l e i n , W . ; C o u l s t o n , F . ; G o l b e r g , L . ; K o r t e , F . - B u l l , E n v . C o n t . T o x . 1 ^ ( 4 ) , 424 ( 1 9 7 5 a ) . 27 - G r e b , U . ; K l e i n , W. ; C o u l t o n , F . ; G o l b e r g , L . ; K o r t e , F . - B u l l . E n v . C o n t . T o x . ( 4 ) , 471 ( 1 9 7 5 b ) . 28 - G r e e n , D . E . - S c i . Amer . 210 ( l ) , 63 ( 1 9 6 4 ) . 29 - H a n s e n , D . 3 . ; P a r r i s h , P . R . ; L o u e , 3 . 1 . W i l s o n , A . 3 . - B u l l . E n v . C o n t . T o x . 6, 113 ( 1 9 7 1 ) . 30 - H a r r i s , A . B . - 3 . Gen. M i c r o b i o l . 111 ( 1 9 6 7 ) . 31 - H a u e s , M . L . ; K r i c h a r , 3 . C . ; U r e y , 3 . C . - B u l l . 1 9 5 Env* C o n t . T o x . 3̂ 5 ( l ) , 14 ( 1 9 7 6 ) . 32 - H a u o r t h j , U . N . ~ Thn C o n s t i t u t i o n o f S u g a r s . L o nd on : E d u a r d A r n o l d and Co. ( 1 9 2 9 ) . 33 ~ H e r n a n d e z S a i n t - A u b i n , L . M . ~ T e s i s d o c t o r a l . F a c u l t a d de C i e n c i as B i o l o g i c a s . U n i v e r s i d a d C o m p l u t e n se de M a d r i d ( 1 9 7 6 ) . 34 - H o d g s o n , E. ; T a t e , L . G . ; K u l k a r n i , A . P . ; P l a p p , F*U* - 3 . A g r . Fond Chem. 2 2 ( 3 ) , 350 ( 1 9 7 4 ) . 35 - 3 en s e n , H . L . - A c t a A g r . S c a n d . 1_3, 40 4 ( 1 9 5 3 ) . 36 - 3 en s e n , S, - New S c i e n t i s t , 3 2 , 612 ( 1 9 6 6 ) . 37 - 3 e n s e n , S. - C o m u n i c a c i o n p r i v a d a , 1 9 6 8 . 38 - 3 e n s e n , 5 . ; S u n d s t r b m , G. - A m b i o , 2? 70 ( 1 9 7 4 ) . 39 - 3 o n h s o n , B . T . ; K e n n e d y , 3 . 0 . - A p p l i e d M i c r o b i o l . 26 ( 1 ) , 66 ( 1 9 7 3 ) . 40 - K a i s e r , K . L . E . ; Uong, P . T . S . - B u l l . Env , C on t * T o x . 11 ( 3 ) , 291 ( 1 9 7 4 ) . 41 - K a t a g i r i , M . ; G a n g u l i , B . N . ; G u n s a l u s , l . C , - 3 . B i o l . Chem. 2 j ^ , 3543 ( i 9 6 0 ) . 42 - K a t c , R . ; G i l l e t t e , 3 . M . - 3 . P h a r m a c o l . Exp. T h o r . 1510 ( 2 ) , 279 ( 1 9 6 5 ) . 43 - K e a r n e y , P . C . ; N a s h , R . G . ; I s e n s e s , A . R . - C h e m i c a l F a l l o u t , 5 4 . C h a r l e s C. Thomas P u b l i s h e r . S p r i n g f i e l d . I l l i n o i s ( 1 9 6 9 ) . 44 - K e i l , 3 . E . ; P r i e s t e r , L . E . ; S a n d i f e r , S . H . - B u l l . E n v . C o n t . T o x . 6 , 156 ( 1 9 7 1 ) . 45 - K i n o s h i t a , K. - A c t a P h y t o c h i m . Tok yo 2» 31 ( 1 9 2 7 ) . 46 - Koeman, 3 . H . ; Ten N o e u e r de B r a u u , M . C . ; de Vos, R . H . - N a t u r e , 221., 1126 ( 1 9 6 9 ) . 47 - K r i m m e l , C . P . - U. 3 . P a t . 2 , 7 1 5 , 1 3 0 ( A u g . 1 9 5 5 ) , 1 9 6 48 *• L a h ü z , R « ; R e y e s , T . ; f i e l t r a , R, - 3 . G en , M i c r o b i o l . £ 5 , 41 ( 1 9 6 6 ) . 49 - L a h o z , R . ; G o n z a l e z Xb eas , 3 , - 3 , Gon, M i c r o b i o l , 5_3, 101 ( 1 9 6 8 ) . 50 - L i c h t e n s t e i n , E . P , ; L a n g , T . T . ; A n d e r e g g , B . N . - S c i e n c e , lO j , , 847 ( 1 9 7 3 ) . 51 ~ L i n c e r , 3 . L . ; P e a k a l l , D . B . - N a t u r e , 2 2 8 , 7 38 ( 1 9 7 0 ) . 52 - L i t t e r s t , C . L . ; F a r b e r , T , M . ; B a k e r , A . M . ; van L o o n , E . 3 . - T o x i c o l . A p p l i e d . P h a r m a c o l , 2_3, 112 ( 1 9 7 2 ) . 53 ~ L i t t e r s t , C , L , ; van L o o n , E , 3 . - Oui , Env , C o n t . T o x . 11 ( 3 ) , 206 ( 1 9 7 4 ) . 54 - . M a c A r t h u r , R. - " P o p u l a t i o n , B i o l o g y and E v o l u ­ t i o n " . Ed . by L e u o n t i n , S y r a c u s e U n i v . P r e s s ( 1 9 6 8 ) . 55 - M a y e r , E . L . ; T a l i o y , F . B . ; U o o d u a r d , C . F . - U . S . D c p t . A g r , B u r , E n t o m o l , P l a n t Q u a r a n t i n e , ET - 709 ( 1 9 4 6 ) . 56 - M e j b a u m , U. - Z. P h i s i o l . 2ââ# ( 1 9 3 9 ) . 57 - M e t i v i e r , 3 . - U . S . P a t . 2 , 7 7 8 , 7 6 7 ( 3 a n . 1 9 5 7 ) . 50 - M i t o m a , C h . ; P o s n e r , H . S , ; R e i t z , H , C , ; U d a n f i e n d , S. - A r c h . B i oche m and B i o p h y s , 61^ 431 ( 1 9 5 6 ) . 59 - M o i l a n e n , K . U . ; C r o s b y , D.G, - 1 6 5 t h Amer , Chem, S o c . M e e t i n g . D a l l a s . T e x a s , ( 1 9 7 3 ) . 60 - Mo nod , 3 . ; P a p p e n h e i m e r , A , M . 3 r . ; C o h e n - B e z i r e , G. - B i o c h e m , B i o p h y s . A c t a , £ , 643 ( 1 9 5 2 ) , 61 - M o r t o n , H . E . ; K o c h o l a t y , U . ; B u n o u i e z - K o c h o l a t y , R . ; K e l n e r , A. - 3 . B a c t . 5_0, 579 ( 1 9 4 5 ) . 62 - M c z a , P . ; U e i s g e r b e r , 3 . ; K l e i n , U ; K o r t e , F. - B u l l . E n v . C o n t . T o x , 12 ( 5 ) , 541 ( 1 9 7 4 ) . 1 9 7 5 3 - N a s h , I , - B i o c h e m , 3 , £ 5 , 416 ( 1 9 5 3 ) . 64 - N e b e k e r , A . V . ; P u g l i s i , F . A . - T r a n s a c t i o n s Am. F i s h . S o c . 10_3 ( 4 ) , 722 ( 1 9 7 4 ) . 65 - N e l s o n , 8 . D . ; W i l l i a m s , C. - 3 . A g r . Food Chem. 19 ( 2 ) , 339 ( 1 9 7 1 ) . 66 - O ' K a n e , W . C . ; M o r e y , G.H. - U . S . P a t . 2 , 4 6 0 , 1 8 8 ( J a n . 1 9 4 9 ) . 67 - Omura , 68 - O n l a y , 3 . H . ; M i l l s , P . A . - 3 . A ss , O f f , A, Che­ m i s t , 983 ( 1 9 6 2 ) . 69 - O g u r , M . ; R os e n , G. - A r c h . B i o c h e m , 25 , 262 ( 1 9 5 0 ) . 70 - O g u r , M. ; S t * 3 o h n , R. ; N a g a i , S. - S c i e n c e , 1 2 5 , 928 ( 1 9 5 7 ) . 71 - P a c k a r d , T . T . ; h l e a l y , M . L * - 3 , M a r , Res. _26, 66 ( 1 9 6 8 ) , 72 ~ P a c k a r d , T . T . - 3 . M a r . Res. 2 £ , 234 ( 1 9 7 1 ) . 73 - P a r d i n i , R . S . ; H o i d k e r , 3 . C . ; F l e t c h e r , D .C . - B i o c h e m , P h a r m a c o l , 2695 ( 1 9 7 0 ) . 74 - P a r d i n i , R . S . - B u l l . E n v , C o n t , Tox* 6 ( 6 ) , 539 ( 1 9 7 1 ) . 75 - P a r k e r , 3 . M . ; M a t t o o n , 3 . R . - 3 , B a c t u r i o l . 100 ( 2 ) , 647 ( 1 9 6 9 ) . 76 - P e a k a l l , D . B . - N a t u r e , 2 1 6 , 505 ( 1 9 6 7 ) , 77 - P e a k a l l , D . B , - S c i e n t i f i c A m e r i c a n ( A p r . 1 9 7 0 ) . 78 - P e a k a l l , D . B . ; L i n c e r , 3 . L . - B i o s c i e n c e , 2 0 , 958 ( 1 9 7 0 ) . 79 - P e a k a l l , , D . B . - " E n v i r o m e n t a l D y na m i c s o f P e s ­ t i c i d e s " , p a g . 3 4 3 . Ed, Hague and V . H . F r e e d , P l enum P r e s s . New Y o r k - L o n d o n ( 1 9 7 5 ) . 198 80 - P o t t e r , V . R . ; R e c k n a g e l , , R• 0* ; H u r l b e r t , R , 8 . - Fe d . P r o c . 645 ( 1 9 5 1 ) . 81 - R e n d e r s , 3 . ; Meadows, D , L , - " L o s l i m i t e s d e l c r e c i m i en t o " . E d i t o r i a l f *ondo de c u l t u r e e c c n d m i c a . M e x i c o ( 1 9 7 2 ) . 82 - R a y , 3 . U . - B i o c h e m . P h a r m a c o l , 1_6, 99 ( 1 9 6 7 ) . 83 - R i s e b r o ' j g h , R . U . ; P e a k a l l , D . U . ; Herman, S . G . ; K i r v s n , M .N . - N a t u r e , 220 , 1098 ( 1 9 6 8 ) . 84 - R u i z - H e r r e r a , 3 . ; S t a r k e y , R . L , - 3 . B a c t e r i o l . 9 9 , 544 ( 1 9 6 9 ) . 85 - S c h n e i d e r , U . C . - 3 . B i o l . Chem, 1 6 1 , 293 ( 1 9 4 5 ) . 86 - S c h n e i d e r , U. C. - M e t h o d s i n E n z i m o l o g y , V o l I I I , 680 ( 1 9 5 7 ) . 87 - S c h u l t e , E . ; A c k e r , L , - N a t u r w i s s e n s c h a f t e n , 61 , 79 ( 1 9 7 4 ) . 88 - S h i b k o , S; K o i v i s t o i n e n , P . ; I r a t n y e k , C . A . ; N o w h a l l , A . R . ; F r i e d m a n , L . - An s l y t i c a l B i o c h e m . 19^, 528 ( 1 9 6 7 ) . 89 - S i v a l i n g a n , P . M . ; Y o s h i d a , T . ; I n a d a , Y , - B u l l , E n v . C o n t . T o x . 1 0 , 242 ( 1 9 7 3 ) . 90 - S m i t h ; E . 3 . ; van L o o n , E . 3 , - A n a l , B i o c h e m , 3 1 . 315 ( 1 9 6 9 ) , 91 - So s a L u c e r o , 3 . C . ; de l a I g l e s i a , F . A , - B u l l , E n v . C o n t . T o x . 1 £ ( 4 ) , 248 ( 1 9 7 3 ) . 92 - S t r e e t , 3 . G . ; U r r y , F . M . ; U a g s t a f f , 0 , 3 . ; B l a u , A . D . - Ame r . Chern. S o c , M e e t i n g . New Y o r k ( S e p , 1 9 6 9 ) . 93 - T u r n e r , 3 . C . ; G r e e n , R . S . - B u l l . E nv . C o n t , T o x . 1 2 ( 6 ) , 669 ( 1 9 7 4 ) . 94 - U m b r e i t , U . U . ; B u r r i s , R . H . ; S t a u f f e r , 3 . F . - " M a n o m e t r i c T e c h n i q u e s " . B u r g e s s P u b l i s h i n g Co. M i n n e a ­ p o l i s ( 1 9 5 7 ) . 1 9 9 96 - V o s , 3 , G . ; Koeman, Ü*H, ~ T o x i c o l , A p p l i e d P h a r m a c o l , 1/7, 656 ( l 9 7 ü ) , 96 - V o s , 3 . G»; van d e r Maas, H . L , ; Ten Udewer de B r a u u , M . C . ; de V o s , R . H , - Food C o s m e t . T o x i c o l . £ , 525 ( 1 9 7 0 ) . 97 - y i l d i s h , D . 3 . - B u l l . Env . C o n t . T o x . S, 202 ( 1 9 7 0 ) . 98 - Y a b ü t a , T - 8 t h I n t e r n . C o n g r . P u r a A p p l i e d Chem, ( A p p e n d i x ) 2 5 , 455 ( 1 9 1 2 ) . 99 - Y a b ü t a , T . - 3 . Chem. S o c . _125, 575 ( 1 9 2 4 ) . 100 - Yu. S . 3 . ; K i i g e m a g i , U . ; T e r r i e r o , L . C . - 3 . A g r . Food Chem. 1 £ ( l ) , 6 ( l 9 7 l ) « 101 - Z e p p , R . L . ; S a n d e r s , O . T . ; K i r k p a t r i c k , R . L . - B u l l . E n v . C o n t . T o x . 12 ( 5 ) , 518 ( 1 9 7 4 ) .