UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS © Ana Feliú Martínez, 2018 TESIS DOCTORAL Modulación del sistema endocannabinoide como herramienta terapéutica en esclerosis múltiple: efecto sobre los condroitín sulfato proteoglicanos MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Ana Feliú Martínez DIRECTORA Carmen Guaza Rodríguez Madrid, 2018 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS MODULACIÓN DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE COMO HERRAMIENTA TERAPÉUTICA EN ESCLEROSIS MÚLTIPLE: EFECTO SOBRE LOS CONDROITÍN SULFATO PROTEOGLICANOS Ana Feliú Martínez Tesis Doctoral Madrid, 2018 Directora: Carmen Guaza Rodríguez UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular MODULACIÓN DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE COMO HERRAMIENTA TERAPÉUTICA EN ESCLEROSIS MÚLTIPLE: EFECTO SOBRE LOS CONDROITÍN SULFATO PROTEOGLICANOS Memoria presentada por Ana Feliú Martínez Para optar al grado de Doctora Vº Bº de la Directora: Dra. Carmen Guaza Rodríguez Instituto Cajal (CSIC) 5 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez “Si hay algo en nosotros verdaderamente divino, es la voluntad. Por ella afirmamos la personalidad, templamos el carácter, desafiamos la adversidad y nos superamos diariamente. Todo hombre puede ser, si se lo propone, escultor de su propio cerebro” Santiago Ramón y Cajal A mi familia y amigos Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 6 7 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez ÍNDICE AGRADECIMIENTOS.............................................................................................................5 ABREVIATURAS..................................................................................................................13 RESUMEN/SUMMARY........................................................................................................19 I. INTRODUCCIÓN......................................................................................................27 1. ESCLEROSIS MÚLTIPLE............................................................................................29 1.1. Definición, sintomatología y diagnóstico.......................................................................29 1.2. Epidemiología y clasificación.........................................................................................30 1.3. Etiología.........................................................................................................................31 1.3.1 Factores genéticos.............................................................................................31 1.3.2 Factores ambientales........................................................................................32 2. PATOGENIA DE LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE................................................................33 2.1. Fisiopatología................................................................................................................33 2.2. Inflamación...................................................................................................................35 2.3. Neurodegeneración......................................................................................................36 2.4. Desmielinización/remielinización..................................................................................37 3. CONDROITÍN SULFATO PROTEOGLICANOS (CSPGs)..................................................38 3.1. Estructura y función......................................................................................................38 3.2. CSPGs y cicatriz glial......................................................................................................41 3.3. Estrategias de inhibición de los CSPGs..........................................................................42 3.4. Mecanismos de acción de los CSPGs.............................................................................43 4. MODELOS EXPERIMENTALES DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE...........................................45 4.1. Modelo de la encefalomielitis autoimmune experimental...........................................45 4.2. Modelo viral de la encefalomielitis murina por infección con el virus de Theiler..............................................................................................................46 5. TRATAMIENTO Y NUEVAS ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS EN ESCLEROSIS MÚLTIPLE................................................................................................................48 6. SISTEMA CANNABINOIDE........................................................................................51 6.1. Sistema cannabinoide y funcionalidad..........................................................................51 6.2. Receptores cannabinoides............................................................................................52 6.3. Endocannabinoides, enzimas de síntesis y degradación...............................................54 Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 8 6.4. Propiedades terapéuticas de los cannabinoides..........................................................56 6.5. Cannabinoides y EM.....................................................................................................57 II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS..........................................................................................61 III. MATERIAL Y MÉTODOS EXPERIMENTALES...............................................................65 1. MATERIAL...............................................................................................................67 1.1. REACTIVOS....................................................................................................................67 1.1.1. Cultivos celulares..............................................................................................67 1.1.2. Procesamiento de tejido...............................................................................................67 1.1.3. Inmunocitoquímica, inmunohistoquímica y otras tinciones.............................67 1.1.4. Inmunodetección por separación electroforética de proteínas (Western-blot)..............................................................................................................68 1.1.5. Extracción de ARN, transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa...............................................................................................70 1.2. COMPUESTOS UTILIZADOS PARA EL DESARROLLO DE MODELO ANIMALES DE EM......................................................................................................................71 1.3. DROGAS Y TRATAMIENTOS....................................................................................71 1.3.1. Para los estudios in vitro...............................................................................................71 1.3.1.1. Citoquinas...........................................................................................71 1.3.1.2. Cannabinoides, inhibidores de la MAGL y antagonistas de receptores cannabinoides.................................................................................71 1.3.1.3. Inhibidores de rutas de señalización..........................................72 1.3.2. Para los estudios in vivo................................................................................................72 1.3.2.1. Cannabinoides, inhibidores de la MAGL y antagonistas de receptores cannabinoides.................................................................................72 1.3.2.2. Inhibidores de la ruta de síntesis CSPGs.............................................72 1.3.2.3. Otros...................................................................................................72 1.4. KIT DE INFUSIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR Y BOMBAS MINIOSMÓTICAS... .........73 1.5. TRAZADOR ANTERÓGRADO DE ALTA RESOLUCIÓN BDA...............................................73 1.6. OLIGONUCLEÓTOS........................................................................................................74 1.7. MARCADORES (ANTICUERPOS Y OTROS)......................................................................75 1.8. ENZIMOINMUNOENSAYO EN FASE SOLIDA (ELISA).......................................................76 9 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez 1.9. EQUIPOS............................................................................................................. .........77 2. MÉTODOS EXPERIMENTALES...................................................................................78 2.1. ANIMALES.......................................................................................................... ..........78 2.2. MODELOS ANIMALES DE EM.........................................................................................78 2.2.1. Modelo de encefalomielitis murina desmielinizante inducida por el virus de Theiler (TMEV-IDD)......................................................................................78 2.2.1.1. Diseño experimental...........................................................................79 2.2.1.2. Evaluación de la función motora (caja de actividad)...........................80 2.2.2. Modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)...........................81 2.2.2.1. Diseño experimental...........................................................................81 2.2.2.2. Evaluación de la función motora (puntuación clínica).........................82 2.3. CIRUGÍA E IMPLANTACIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR DE CATÉTERES Y MINIBOMBAS OSMÓTICAS PARA LA LIBERACIÓN DE 2-AG......................83 2.4. TRAZADOR ANTERÓGRADO BDA..................................................................................84 2.5. ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICO.........................................................................................84 2.5.1. Procesamiento del tejido..................................................................................84 2.5.2. Inmunohistoquímica.........................................................................................85 2.5.2.1. Marcaje con inmunofluorescencia.................................................................85 2.5.2.2. Marcaje con diaminobenzidina (DAB)................................................85 2.5.2.3. Hematoxilina/eosina......................................................................... 86 2.5.2.4. Evaluación de la infiltración celular....................................................86 2.5.2.5. Marcaje Luxol Fast Blue (LFB).............................................................87 2.6. MICROSCOPÍA.......................................................................................................88 2.6.1. Microscopía óptica y análisis de imagen.......................................................................88 2.6.2. Microscopía confocal y análisis de imagen........................................................88 2.6.3. Microscopía electrónica....................................................................................88 2.6.3.1. Procesamiento del tejido...................................................................88 2.6.3.2. Análisis semicuantitativo de axones mediante TEM.......................................89 2.7. TÉCNICA DE INMUNODETECCION POR SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍNAS (WESTERN-BLOT)..................................................................................89 2.8. ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA POR PCR CUANTITATIVA (qPCR)..............................91 2.8.1. Extracción de ARN.............................................................................................91 Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 10 2.8.2. Retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR).................91 2.9. CULTIVOS CELULARES.....................................................................................................91 2.9.1. Cultivo primario mixto.......................................................................................92 2.9.2. Cultivo primario de astrocitos a partir del cultivo mixto...................................92 2.10. ENZIMOINMUNOENSAYO EN FASE SOLIDA (ELISA).......................................................93 2.11. CUANTIFICACIÓN DE 2-AG EN TEJIDO (HPLC UNIDO A ESPECTROSCOPÍA DE MASAS LC-MS).........................................................................................................93 2.12. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.................................................................................................. 94 IV. RESULTADOS...........................................................................................................97 1. FISIOPATOLOGÍA Y ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE CSPGs EN LA FASE CRÓNICA DEL MODELO DE TMEV-IDD.....................................................................99 1.1. Fisiopatología de la encefalomielitis murina por infección con el virus de Theiler..............................................................................................................99 1.2. Análisis de la expresión de CSPGs en médula espinal en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD...............................................................................100 2. ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE CSPGs EN LA FASE CRÓNICA DEL MODELO DE TMEV-IDD...................................................................107 2.1. Inhibición farmacológica de la expresión de CSPGs por xilósido en el modelo de TMEV-IDD..................................................................................................107 2.2. Inhibición farmacológica de la expresión de CSPGs por fluorosamina en el modelo de TMEV-IDD.........................................................................................110 3. POTENCIAL TERAPÉUTICO DEL ENDOCANNABINOIDE 2-AG Y SU EFECTO SOBRE LOS CSPGs EN MODELOS MURINOS DE EM....................................115 3.1. Potencial terapéutico del UCM03025, inhibidor de la enzima MAGL, en el modelo de EAE...................................................................................................115 3.2. Potencial terapéutico del UCM03025 y del endocannabinoide 2-AG en el modelo del virus de Theiler. Efecto sobre los CSPGs..........................................121 4. MODULACIÓN DE LA SÍNTESIS DE LOS CSPGs POR 2-AG E INHIBIDORES FARMACOLÓGICOS DE LA MAGL EN ASTROCITOS EN CULTIVO...............................139 4.1. Efecto del 2-AG en la expresión de CSPGs en astrocitos en cultivo. Implicación del receptor CB2......................................................................................139 11 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez 4.2. Efecto de los inhibidores de la MAGL en la expresión de CSPGs en astrocitos en cultivo...............................................................................................143 4.3. Efecto del 2-AG e inhibidores de su hidrólisis en la liberación del proteoglicano Neurocán al sobrenadante en astrocitos en cultivo.............................144 4.4. Efecto del 2-AG sobre las vías de señalización implicadas en la síntesis de CSPGs......................................................................................................................145 V. DISCUSIÓN............................................................................................................151 1. EXPRESIÓN DE LOS CSPGs Y SU INHIBICIÓN EN EL MODELO DE TMEV-IDD................155 2. EFICACIA TERAPÉUTICA DEL INHIBIDOR DE LA MAGL EN DOS MODELOS DE EM.......159 3. EFECTO DEL 2-AG EN LA SÍNTESIS DE CSPGs POR ASTROCITOS EN CULTIVO...............165 VI. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS.............................................................................173 VII. REFERENCIAS........................................................................................................179 VIII. ANEXOS ...............................................................................................................215 1. Curriculum vitae del doctorando 2. Artículo original UCM03025 y EAE 3. Artículo original UCM03025 y TMEV-IDD Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 12 13 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez ABREVIATURAS 2-AG 2-araquidonoilglicerol ABHD α/β hidrolasa AC Adenilato ciclasa ACEA Araquidonil-2-cloroetilamida ADAMTs Desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trom bospondina ADN Ácido desoxirribonucleico AEA Anandamida; Araquidonoiletanolamida AG Acetato de glatirámero Akt Proteína quinasa B AMPc Adenosín monofosfato cíclico ANOVA Análisis de la varianza AP Coordenada anteroposterior AraC Citosina-D-arabinofuranósido Arg-1 Arginasa-1 ARN Ácido ribonucleico BDA Del inglés Biotinilated Dextran Amine BDNF Factor neurotrófico derivado del cerebro bFGF Factor básico de crecimiento de fibroblastos BHE Barrera hematoencefálica BSA Albúmina de suero bovino CBD Cannabidiol CFA Adyuvante completo de Freund ChABC Condroitinasa ABC de Proteus vulgaris COX Ciclooxigenasa CS Condroitín sulfato CSPGs Condroitín sulfato proteoglicanos CV Coeficiente de variabilidad DA Cepa Daniel del virus TMEV Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 14 DAB Diaminobenzidina DAG Diacilglicerol DAGL Diacilglicerol lipasa DEM Desviación estándar de la media DMEM Del inglés Dulbecco´s modified Eagle Medium DMSO Dimetil-sulfóxido DNasa Desoxirribonucleasa dpI Días postinmunización dpi Días postinfección DTT Ditiotreitol DV Coordenada dorso-ventral EAE Encefalitis autoinmune experimental ECM Matriz extracelular EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EGF-R Receptor del factor de crecimiento epidérmico ELA Esclerosis lateral amiotrófica ELISA Enzimoinmunoensayo en fase sólida EM Esclerosis múltiple EM-PP Esclerosis múltiple primaria progresiva EM-RR Esclerosis múltiple remitente recidivante EM-SP Esclerosis múltiple secundaria progresiva ERK Kinasa regulada por señales extracelulares FAAH Hidrolasa de amidas y ácidos grasos FBS Suero fetal bovino FCS Suero fetal de ternera FGF-2 Factor de crecimiento de fibroblastos 2 GAGs Cadenas de glicosaminoglicanos GalNAc N-acetil-D-galactosamina GFAP Proteína ácida fibrilar glial GlcUA Ácido D glucurónico GPR55 Receptor 55 acoplado a proteína G 15 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez GWAS Estudios de asociación de genoma completo H/E Hematoxilina/Eosina HACTV Actividad horizontal HERVs Retrovirus endógenos humanos HHV-6 Virus del herpes humano-6 HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia HS Suero de caballo HSPGs Heparán sulfato proteoglicanos IFN Interferón IGF-1 Factor de crecimiento insulínico tipo 1 IL Interleuquina I.P. Intraperitoneal NOS-II Sintasa de óxido nítrico inducible LAR Del inglés leukocyte common antigen-related phosphatase LC-MS Cromatografía líquida con espectroscopía de masas LCR Líquido cefalorraquídeo LFB Del inglés Luxol Fast Blue LINGO-1 Del inglés Leucine rich repeat and Immunoglobin-like domain-containing protein 1 LPS Lipopolisacárido MAGL Monoacilglicerol lipasa MAPK Proteína kinasa activada por mitógenos MBP Proteína básica de mielina MHC Complejo principal de histocompatibilidad ML Coordenada medio-lateral MMPs Metaloproteinasas de matriz MOG Glicoproteína de los oligodendrocitos de mielina MRI Imagen de resonancia magnética mTOR Del inglés mammalian target of rapamycin NAPE N-araquidonoilfosfatidiletanolamida Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 16 NArPE N-araquidonoilfosfatidiletanolamina NAT N-aciltransferasa NFκB Factor nuclear de transcripción kappa B NG2 Antígeno glial/neural tipo 2 NGF Factor de crecimiento nervioso Nogo-A Proteína asociada a la mielina con efecto inhibitorio Nrf2 Factor de transcripción nuclear eritroide-2 O2A Oligodendrocito-astrocito tipo 2 Olig-2 Factor de transcripción de oligodendrocitos tipo 2 OPCs Células progenitoras de oligodendrocitos P/S Penicilina/estreptomicina PBS Tampón fosfato salino PBT Tampón fosfato con tritón X-100 0,1% PCR Reacción en cadena de la polimerasa PEA Palmitoiletanolamida PFA Paraformaldehído PI3K Fosfatidilinositol-3-kinasa PKA Proteína kinasa A PLC Fosfolipasa C PLD Fosfolipasa D PMSF Fenil-metil-sulfonil-fluoruro PNNs Redes perineuronales PPAR Receptor nuclear activado por proliferadores de peroxi somas PSA-NCAM Del inglés Polysialic Acid Neural Cell Adhesion Molecule Rho GTPasa ROCK Proteína quinasa asociada a Rho RPTP Receptor de proteínas tirosina fosfatasas RT Retrotranscripción RXR Receptor X retinoico SDS Dodecil sulfato sódico 17 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez SEM Error estándar de la media Sema Semaforina SNC Sistema nervioso central SVZ Zona subventricular TBS Tampón Tris Salino TBST Tampón Tris Salino con Tween-20 0,1% TGF Factor de crecimiento transformante THC Tetrahidrocannabinol TMEV-IDD Del inglés Theiler´s murine encephalomyelitis virus-indu ced demyelinating disease TNFα Factor de necrosis tumoral α Transportadores AMT Transportador de anandamida TRP Receptores activados por potenciales transitorios ufp Unidades formadoras de placa VACTV Actividad vertical VEB Virus Epstein-Barr VLA-4 Integrina α4β1 Xt Xilosiltransferasa   Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 18 19 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez RESUMEN La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria desmielinizante y neurode- generativa que afecta al sistema nervioso central (SNC) y que evoluciona de manera crónica hacia un declive neurológico progresivo desembocando en incapacidad permanente. A nivel histopatológico, la EM se caracteriza por presentar áreas multifocales de inflamación, desmie- linización y daño axonal en la sustancia blanca del SNC que da lugar a la formación de lesiones donde se observan cicatrices glióticas crónicas con proliferación astrocítica. En la EM junto con los procesos de desmielinización, tienen lugar procesos de reparación y remielinización, sin embargo, conforme la enfermedad progresa la remielinización resulta menos eficiente, cronificándose los déficits neurológicos con el desarrollo de la patología. Este fallo en la remielinización no parece ser debido a una ausencia de precursores de oligoden- drocitos (OPCs) en la zona de lesión, sino más bien a problemas en su diferenciación. Se ha apuntado a la presencia de factores inhibitorios en las zonas desmielinizadas como los res- ponsables de impedir la diferenciación de los OPCs entre los que se encuentran las proteínas denominadas condroitín sulfato proteoglicanos (CSPGs). Los CSPGs son unas macromoléculas que forman parte de la matriz extracelular (ECM) y la cicatriz glial y son consideradas factores determinantes del fallo en la remielinización y la regeneración axonal generando un ambiente no permisivo que limita la diferenciación de los OPCs y la supervivencia neuronal. El modelo del virus de Theiler resulta especialmente adecuado para analizar aspectos de la formación de la cicatriz glial en lesiones inflamatorias y desmielinizantes y en la remie- linización. El proceso de desmielinización durante la fase crónica del modelo de TMEV se ve acompañado por alteraciones en la ECM, como la acumulación de CSPGs y astrogliosis reac- tiva. Además, la limitada remielinización observada en el modelo se ha asociado a una insu- ficiente diferenciación de OPCs. Los cannabinoides han demostrado aliviar algunos aspectos de la sintomatología de la EM. Mientras que en modelos de EM los cannabinoides presentan propiedades antioxidantes, antiexcitotóxicas y neuroprotectoras y mejoran la remielinización, promoviendo la diferenciación de los OPCs, poco se sabe sobre sus efectos sobre las proteínas de matriz extracelular y en particular sobre los CSPGs. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 20 El objetivo global de esta Tesis Doctoral es investigar la implicación de los CSPGs en el fallo de remielinización que tiene lugar en las fases crónicas del modelo de TMEV-IDD, así como el papel del endocannabinoide 2-AG en su regulación y modulación para promover los meca- nismos de reparación y consecuente remielinización. Los objetivos específicos incluyen: i) Análisis de la expresión de los CSPGs en la fase crónica del modelo de TMEV. ii) Estudio de la influencia de los CSPGs en los déficits neurológicos en el modelo de TMEV-IDD, haciendo uso de herramientas farmacológicas que impiden la acumulación de dichas macromoléculas. iii) Análisis del potencial terapéutico del inhibidor reversible de la enzima MAGL, UCM03025 y del propio 2-AG en los modelos de EAE y TMEV-IDD, estudiando su capacidad para modular la respuesta inflamatoria y la acumulación de CSPGs. iv) Puesto que los astrocitos son los principales productores de los CSPGs, se inves- tigará la síntesis y liberación de los CSPGs, en cultivos de astrocitos, así como la modulación por 2-AG y por inhibidores de la MAGL estableciendo los receptores y las vías de señalización implicadas. La metodología utilizada para el estudio de la implicación de los CSPGs en el modelo viral de EM, incluye: ratones infectados con TMEV tratados con compuestos que inhiben la síntesis de los CSPGs, así como con 2-AG y/o un inhibidor de la MAGL para analizar la progresión de la patología. Se utilizaron tests de función motora; el uso de diversos marcadores de células gliales, daño axonal, mielina y CSPGs mediante técnicas histológicas analizadas por microsco- pía óptica, confocal y electrónica; se realizaron estudios bioquímicos y de biología molecular utilizando técnicas de PCRs y western-blot, así como el uso de minibombas osmóticas para la liberación continua de 2-AG y trazadores axonales. La eficacia terapéutica del inhibidor de la MAGL también se evaluó en el modelo de EAE. Por último, para el estudio de la síntesis de CS- PGs por 2-AG e inhibidores de la MAGL, se utilizaron cultivos de astrocitos identificándose las vías de señalización y receptores implicados. 21 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Los resultados obtenidos indican que: i) En la fase crónica del modelo de TMEV-IDD existe astrogliosis reactiva y acumu- lación de CSPGs asociada a lesiones desmielinizadas en la médula espinal. ii) El tratamiento con dos inhibidores de la síntesis de CSPGs reduce la expresión de CSPGs y mejoran los déficits motores asociados a la patología. iii) El inhibidor reversible de la MAGL, UCM03025 mejora la sintomatología asociada a los modelos de EAE y TMEV-IDD. En el modelo de TMEV, el UCM03025 reduce la acumulación de CSPGs y la inflamación aumentando el número de oligodendrocitos prolife- rativos, así como el número de oligodendrocitos maduros, detectándose una menor pérdida axonal y una mejora en la remielinización. iv) Los astrocitos estimulados con TGF-β1 incrementan los niveles de CSPGs, los cuales disminuyen en aquellos astrocitos tratados con 2-AG y con inhibidores de la MAGL. La disminución del Neurocán por 2-AG está mediado a través del receptor CB2 y las vías implica- das incluyen la ruta de TGF-β/SMAD, así como la vía de PI3K-Akt-mTOR. Los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral nos permiten concluir que: i) La mejora en la sintomatología en los animales infectados con TMEV tras la ad- ministración de inhibidores de la síntesis de CSPGs, evidencia la relevancia de esas moléculas inhibitorias en el desarrollo de la patología. ii) Los efectos terapéuticos ejercidos por el UCM03025 tanto en el modelo de EAE como en el modelo de TMEV-IDD muestran la importancia de aumentar el tono endocanna- binoide del 2-AG como mecanismo para disminuir la inflamación y promover los mecanismos endógenos de reparación, reduciendo la astrogliosis y los niveles de CSPGs conduciendo todo ello a un menor daño axonal y a una mayor remielinización. iii) El mecanismo mediante el cual el 2-AG podría estar mediando sus efectos bene- ficiosos in vivo incluiría su acción sobre la producción de los CSPGs por parte de los astrocitos ya que se ha observado que la producción de estas macromoléculas por astrocitos in vitro se ve disminuida con 2-AG. Las vías de TGF-β/SMAD y PI3K-Akt-mTOR, así como el receptor CB2 parecen estar implicadas en estos efectos. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 22 Conjuntamente estos resultados resaltan el interés de incrementar el tono endocanna- binoide de 2-AG con el fin de modular las respuestas inflamatorias, así como para promover los mecanismos endógenos de reparación. Postulamos que el 2-AG podría favorecer dichos procesos reduciendo la acumulación de los CSPGs en las zonas desmielinizadas permitiendo a su vez una mayor diferenciación oligodendroglial y promoviendo así la remielinización y la regeneración axonal. 23 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez SUMMARY Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disease that affects the central nervous system (CNS) and leads to a neurological decline and permanent disability. The pathologic hallmarks in MS include multifocal areas of inflammation, demyelination and axonal damage in the brain and spinal cord white matter that are also pre- sent in the gray matter at cortical levels and leads to the formation of lesions where gliotic scars with astrocytic proliferation are observed. In MS, repair and remyelination processes occur spontaneously following demyelinating phases, but, as the disease progresses, remyelination becomes less efficient leading to increa- sed disability in patients. The failure in remyelination does not seem to be due to an insuffi- cient number of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in the lesion site but a failure in their differentiation. There are different inhibitory molecules present in demyelinated areas that im- pede OPCs differentiation, among these, we can find the chondroitin sulphate proteoglycans (CSPGs). CSPGs are extracellular matrix proteins (ECM) that have been reported to accumulate in MS lesions and are considered important factors for the failure of remyelination and regene- ration through the creation of a non-permissive environment that limits attachment, survival and differentiation of OPCs as well as neuron survival. Theiler’s murine encephalomyelitis virus induced demyelinating disease (TMEV-IDD) is an experimental viral model of MS suitable to elucidate the role of glial scar formation in chro- nic inflammatory and demyelinating CNS lesions. The limited remyelination observed in TMEV- IDD has been associated to insufficient oligodendroglial differentiation. Moreover, the chronic demyelination is accompanied by astrogliosis and alterations in spinal cord ECM and accumu- lation of CSPGs which in turn may contribute to the failure of axon remyelination and regene- ration. Cannabinoids are currently being studied for their potential benefits in the treatment of MS and other neuroinflammatory/neurodegenerative diseases. Although preclinical studies have demonstrated that cannabinoids can alleviate MS-associated symptoms like spasticity and exhibit anti-inflammatory, antioxidant, anti-excitotoxic properties and promote remyelina- tion and differentiation of OPCs there is no evidence about their role over extracellular matrix proteins and CSPGs. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 24 The main objective of this Doctoral Thesis is to evaluate the role of CSPGs in the remyeli- nating failure at the chronic phases of TMEV-IDD and the role of cannabinoids in its modulation to promote remyelination and repair mechanisms. The specific objectives include: i) Analysis of CSPGs expression at the chronic phase of TMEV-IDD. ii) To study the role of CSPGs in the severity of TMEV-IDD motor dysfunction by inhibiting CSPGs synthesis and accumulation through pharmacological tools. iii) To study the therapeutic effect of a reversible inhibitor of MAGL, called UCM03025 and 2-AG itself in the EAE and TMEV-IDD models studying its ability to modulate the inflammatory response and CSPGs accumulation. iv) As the main source of CSPGs are astrocytes, we will analyze CSPGs synthesis and release by astrocyte cultures treated with 2-AG and inhibitors of MAGL, elucidating the receptors and signaling pathways involved. The methods required to study the role of CSPGs in TMEV-IDD disease progression inclu- de TMEV infected mice treated with compounds that inhibit CSPGs synthesis, 2-AG and inhibi- tors of MAGL. Behavioral tests were carried out as well as immunohistochemistry techniques to analyze glial cells, axonal damage, myelin and CSPGs using optic, confocal and electron mi- croscopy. Molecular biology and biochemistry techniques such as PCRs and western-blot were used as well as the implantation of osmotic pumps and axonal tracers. The therapeutic efficacy of MAGL inhibitor was also evaluated in the EAE model. Finally, astrocyte cultures were used to analyze CSPGs synthesis and its modulation by 2-AG and different MAGL inhibitors. The results obtained in this study indicate that: i) There is prominent astrogliosis and CSPGs accumulation associated to demyeli- nated areas at the chronic phase of TMEV-IDD. ii) Treatment with two different CSPGs synthesis inhibitors reduce the expression of CSPGs and ameliorate motor deficits in TMEV model. iii) The reversible MAGL inhibitor, UCM03025, improves symptomatology in the EAE and TMEV models. UCM03025 reduces the expression of CSPGs, the inflammatory respon- 25 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez se and increases the number of proliferating oligodendrocytes as well as mature oligodendro- cytes, leading to less axonal damage and remyelination in the TMEV-IDD model. iv) TGF-β1 treated astrocytes increase the expression of CSPGs which are reduced following 2-AG and MAGL inhibitors treatments. The diminished Neurocan by 2-AG depends on CB2 receptor. The TGF-β/SMAD and PI3K-Akt-mTOR signalling pathways may be involved in the effects described above. The results obtained in this Thesis allow us to conclude that: i) The symptomatology amelioration in the TMEV-IDD model by the treatment with inhibitors of CSPGs synthesis indicates the relevance of these molecules in this disease progression. ii) The therapeutic effect exerted by UCM03025 in the EAE and TMEV-IDD models of MS, highlight the relevance of increasing the endocannabinoid tone of 2-AG as a tool to reduce inflammation and to promote repair mechanisms through the inhibition of astrogliosis and CSPGs accumulation, leading to less axonal damage and remyelination. iii) The mechanisms by which 2-AG could mediate its beneficial effects in vivo would include their ability to reduce the synthesis of CSPGs by astrocytes as we have confir- med in vitro. TGF-β/SMAD and PI3K-Akt-mTOR signalling pathways as well as CB2 receptor may be involved in this effect. Collectively, these findings highlight the importance of increasing the endocannabinoid tone of 2-AG, in order to modulate the inflammatory response and to promote the endoge- nous repair mechanisms. 2-AG could be involved in the above process by reducing CSPGs accu- mulation in demyelinating areas allowing oligodendrocytes to differentiate leading to greater remyelination and axonal regeneration. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 26 27 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción I. INTRODUCCIÓN Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 28 In tr od uc ci ón 29 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción 1. ESCLEROSIS MÚLTIPLE 1.1 DEFINICIÓN, SÍNTOMATOLOGÍA Y DIAGNÓSTICO La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica, inflamatoria, desmielinizante y neurodegenerativa del sistema nervioso central (SNC) que afecta a casi 2,5 millones de perso- nas en todo el mundo, siendo la mayor causa de discapacidad no traumática en adultos jóvenes. Los patólogos a los que se les atribuye las primeras menciones a la EM fueron Robert Carswell en 1838 (Carswell, R. 1838) y a Jean Cruveilhier en el año 1841 (Cruveilhier, J. 1841). Sería el neurólogo Jean-Martín Charcot quien en la segunda mitad del siglo XIX describió y definió la llamada “tríada de síntomas de Charcot” constituida por nistagmo, disartria y ataxia, correla- cionando además los síntomas de la enfermedad con hallazgos histopatológicos, definiéndola como la enfermedad de esclerosis en placas diseminadas (Charcot, JM 1868). Los primeros síntomas de la EM aparecen como consecuencia de brotes desmielinizantes aislados que provocan déficits neurológicos del sistema afectado, entre los que se incluyen trastornos sensitivos, pérdida de visión, alteraciones motoras con afectación cortical, del tronco cerebral, cerebelo y vías cerebelosas. Además, en los estadios más avanzados puede encon- trarse afectación medular que provoca debilidad motora, pérdida del equilibrio y coordinación, temblor, ataxia y parálisis. Aparte de los síntomas físicos discapacitantes, también se ha descrito una afectación tanto de la función cognitiva como de la labilidad emocional (Compston y Coles 2008). En el diagnóstico de la EM se utilizan diferentes técnicas de imagen, analíticas y electrofi- siológicas que incluyen la resonancia magnética para detectar las lesiones y determinar su dis- tribución en espacio y tiempo (Charil, Yousry et al. 2006) y el examen en líquido cefalorraquídeo para detectar procesos inflamatorios y realizar un análisis de bandas oligoclonales (Freedman, Thompson et al. 2005, Villar, Sadaba et al. 2005). Así mismo, se utilizan los potenciales evoca- dos para valorar la función de algunas vías nerviosas y la tomografía de coherencia óptica para medir el grosor y posible pérdida axonal de la capa de las fibras nerviosas de la retina (Sergott, Frohman et al. 2007). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 30 In tr od uc ci ón 1.2 EPIDEMIOLOGÍA Y CLASIFICACIÓN Los estudios de prevalencia de la EM han permitido observar, como muestra la Figura 1, una distribución irregular de esta enfermedad en todo el mundo detectándose mayores frecuencias entre los 40o y 60o de latitud Norte, fenómeno similar en el hemisferio sur coinci- diendo con zonas de baja radiación solar y déficit de vitamina D. En España la prevalencia oscila entre los 100-125 casos por cada 100.000 habitantes (Kingwell, Marriott et al. 2013, Kurtzke 1980, Otero-Romero, Ramio-Torrenta et al. 2015). Figura 1. Prevalencia de la EM en el mundo (2013). Modificado de la página web de la Federación Internacional de Esclerosis Múltiple: http://www.msif.org/about-us/advocacy/atlas/. El curso clínico de la enfermedad es variable y debuta normalmente entre los 20 y los 40 años de edad, con episodios de brotes reversibles de déficits neurológicos que acaban evo- lucionando con el tiempo hacia un declive neurológico progresivo e irreversible. También se han observado casos de EM en niños (EM pediátrica), así como primeros brotes en personas mayores de 60 años. Además, afecta a las mujeres en triple proporción que a los hombres. Teniendo en cuenta el modo de inicio de los síntomas clínicos y curso de la enfermedad, la EM se puede clasificar de diferentes formas; en primer lugar, el llamado síndrome neurológico aislado, el cual se identifica como la primera manifestación clínica de la enfermedad que mues- tra características de desmielinización inflamatoria que podría ser o no EM, pero que todavía no cumple los requisitos de dispersión en el tiempo para diagnosticarla como tal. Como mues- 31 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción tra la Figura 2, cuando estos pacientes tienen otro brote de disfunción neurológica pasarían a la siguiente clasificación de EM en forma de brotes y remisiones, remitente recidivante (EM-RR), que cursa con episodios de déficit neurológico seguidos de una recuperación completa o parcial (85 % de los casos), esta fase puede durar años o décadas. Por último, encontraríamos las EM progresivas, la primaria progresiva (EM-PP) que afecta al 10-15% de los pacientes y que incluye a aquellos que cursan desde el inicio con un empeoramiento progresivo de función neurológica, y aquellos que comienzan con brotes y derivan en la secundaria progresiva (EM-SP). Todas las formas se subdividen a su vez en activas o no activas, dependiendo de la existencia de brotes de disfunción neurológica o lesiones identificadas por resonancia (Lublin, Reingold et al. 2014). Figura 2. Evolución del deterioro neurológico en EM en función del tiempo y clasificación de los diferentes subtipos de la enfermedad. RR: Remitente-recurrente; SP: Secundaria-progresiva; PP: Primaria-progresiva. Fuente: Lublin et al. 2014. 1.3 ETIOLOGÍA La EM es una enfermedad heterogénea y compleja de etiología aún desconocida que se desencadena como consecuencia de la confluencia de factores de predisposición genética y desencadenantes ambientales que aumentan la susceptibilidad a padecerla. 1.3.1 Factores genéticos La existencia de factores genéticos de susceptibilidad se ve apoyada por datos que indican que, aunque el riesgo a padecer la EM en la población en general es del 0,1-0,2%, este porcen- taje aumenta hasta un 3-5% en caso de tener familiares de primer grado afectados y hasta un 30% en aquellos hijos de ambos progenitores afectados. Además la concordancia entre geme- los monocigotos es del 30% frente al 3-5% en gemelos dicigotos (Dyment, Ebers et al. 2004 Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 32 In tr od uc ci ón Sadovnick, Armstrong et al. 1993). El gen que posee una mayor asociación hasta ahora con la EM es el alelo HLA-DRB1 del complejo principal de histocompatibilidad tipo II (MHC-II), localizado en el cromosoma 6p21. Este es el locus que explica entre el 16-60% de la susceptibilidad genética a padecer EM (Hafler, Compston et al. 2007, Sawcer, Hellenthal et al. 2011). Esa región del genoma ha sido ampliamente estudiada debido a su asociación con diferentes enfermedades autoinmunes, infecciosas e inflamatorias y aunque la asociación con este gen refuerza la etiología inmune, afectando a la presentación de antígeno, el mecanismo por el cual el HLA-DRB1 contribuye a la susceptibilidad genética es aún desconocido. Estudios de asociación de genoma completo (GWAS) también han mostrado polimorfismos genéticos relacionados con el sistema inmune (Hollenbach and Oksenberg 2015, Sawcer, Franklin et al. 2014) entre los que destacan la cade- na alfa del receptor de la IL-7 (Lundstrom, Highfill et al. 2013), la cadena alfa del receptor de la IL-2 (Dendrou, Plagnol et al. 2009, Hartmann, Khademi et al. 2014), la señalización por NFКB o el receptor de TNF1 (Gregory, Dendrou et al. 2012). 1.3.2 Factores ambientales Muchos estudios apoyan también el papel del medio ambiente en la susceptibilidad a padecer EM. Se ha observado que esta susceptibilidad presenta una asociación geográfica y que la migración en la niñez o adolescencia hacia áreas de alta prevalencia influye en la pro- babilidad de desarrollo de la EM (Fernández y Rodríguez-Antigüedad, 2010). Según evidencias epidemiológicas, algunos factores que se han relacionado con un aumento en la susceptibi- lidad a padecerla serían el consumo de tabaco (Hernan, Jick et al. 2005, Poorolajal, Bahrami et al. 2017, Wingerchuk 2012, ), los niveles de vitamina D (Thouvenot, Orsini et al. 2015), así como diversos agentes infecciosos. Aunque hasta el momento no existen evidencias definitivas que relacionen de forma inequívoca la infección por virus con la patogenia de la EM, los resul- tados acumulados parecen apoyar la implicación de uno o más de estos agentes infecciosos en la EM. Entre estos se encuentran infecciones virales por virus de la familia Herpesviridae, el virus de Epstein-Barr (EBV) y el herpesvirus humano 6 (HHV-6), así como por los retrovirus endógenos humanos (HERVs). Así, el riesgo de padecer EM es unas 10 veces mayor entre los individuos que experimentan una infección no diagnosticada por el virus de Epstein-Barr en la 33 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción infancia temprana y de 20 veces entre las personas que desarrollan mononucleosis infecciosa más tardíamente (Belbasis, Bellou et al. 2015, Libbey and Fujinami 2010). Por último, en los úl- timos años se ha asociado también el papel de la microbiota comensal en la contribución de la patogénesis de la EM mediante su interacción directa con el sistema inmune (Banati, Csecsei et al. 2013, Calvo-Barreiro, Eixarch et al. 2017, Ochoa-Reparaz, Mielcarz et al. 2011). Debido a que en la actualidad se considera que la EM es una enfermedad de naturaleza autoinmune, probablemente debida a una respuesta normal a un antígeno inadecuado o bien a una exposición antigénica inapropiada, se han propuesto tres teorías mediante las cuales un patógeno podría desencadenar una patología autoinmune: i) la teoría de los superantígenos virales, en la que se produciría la activación no específica de células T autorreactivas por mo- léculas inmunoestimuladoras producidas por el virus; ii) la teoría de la expansión de epítopos provocada por la activación de las células T autorreactivas frente a antígenos propios de mielina como consecuencia de una destrucción tisular mediada la respuesta inmune frente al agente infeccioso; y iii) la teoría del mimetismo molecular que implicaría la activación de las células T autorreactivas por epítopos del agente infeccioso que presentan cierta homología en su se- cuencia o en su estructura con epítopos de mielina (Chastain and Miller, 2012, Vanderlugt and Miller 2002, Von Herrath and Harrison 2003). 2. PATOGENIA 2.1 FISIOPATOLOGÍA La EM se caracteriza a nivel histopatológico por presentar áreas multifocales de inflama- ción y desmielinización en la sustancia blanca, tanto a nivel de cerebro como de médula espinal (Frohman, Racke et al. 2006), donde se observan cicatrices glióticas crónicas con proliferación astrocítica (Compston y Coles 2008). Dichas lesiones se componen principalmente de infiltrados inflamatorios perivasculares del tipo macrófagos y linfocitos T, así como de células inmunes re- sidentes del SNC como es la microglía. Además, junto con la desmielinización y el daño axonal se observa alteración y permeabilización de la barrera hematoencefálica (BHE) (Compston y Coles 2008). Tal y como muestra la Figura 3, las placas desmielinizantes se clasifican en 4 tipos: i) placas Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 34 In tr od uc ci ón agudas, ii) placas crónicas activas, iii) placas crónicas inactivas y iv) placas fantasma. En la placa aguda se detectan infiltrados inflamatorios perivasculares, moderada desmielinización y daño axonal; estas placas son difíciles de observar ya que aparecen en las etapas iniciales de la en- fermedad. Las placas crónicas activas muestran desmielinización activa en el borde de la placa junto a microglía reactiva; la mielina aparece alterada o siendo fagocitada por macrófagos, y se observa también una importante pérdida axonal. En este tipo de placa no se observan infil- trados inflamatorios perivasculares. La placa crónica inactiva es más extensa, con desmielini- zación completa, densidad de axones escasa y reducción en el número de oligodendrocitos. El borde de la placa está muy bien delimitado y no se observa desmielinización activa en él. Este tipo de placa está ocupada, en su mayor parte, por astrocitos, por lo que se denomina también placa gliótica. Por último, existe un porcentaje de las placas en fase crónica llamadas placa fan- tasma o “en sombra” que han conseguido remielinizar detectándose en ellas axones con finas vainas de mielina, ausencia de infiltrados inflamatorios perivasculares, desmielinización activa en el borde o gliosis (Frischer, Weigand et al. 2015, Lucchinetti, Bruck et al. 2000). Figura 3. Clasificación de los tipos de placas en EM. Modificado de Clemente et al., 2013. Se ha observado que las placas de desmielinización no solo tienen lugar en la sustancia blanca del SNC, sino que también pueden aparecen en la sustancia gris tanto en la corteza cerebral como en los ganglios basales, tronco encefálico y médula espinal (Kutzelnigg, Luc- chinetti et al. 2005). Las lesiones neocorticales se clasifican en función de su localización y extensión, definiéndose como lesiones leucocorticales o tipo I que abarcan tanto la sustancia blanca como la gris, lesiones intracorticales o tipo II perivasculares que se encuentran dentro de la sustancia gris, las lesiones subpiales o de tipo III que se extienden desde la pía hasta zo- nas de las láminas 3 o 4 corticales, y las lesiones de tipo IV transcorticales que son extensiones de las de tipo III que no sobrepasan la unión entre la sustancia gris y blanca, siendo estas dos 35 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción últimas las más abundantes en los pacientes de EM con formas progresivas (Bo, Vedeler et al. 2003, Zurawski, Lassmann et al. 2017). Se ha observado además que, en las placas corticales, es más infrecuente la presencia de infiltrados inflamatorios con una mayor participación de la microglía (Peterson, Bo et al. 2001). Por último, cabe destacar que al analizar la sustancia blanca y gris aparentemente normal se han observado cambios celulares y moleculares que podrían indicar déficits en el transporte axonal (Kutzelnigg, Lucchinetti et al. 2005, Lassmann 2014, Zeis, Graumann et al. 2008). 2.2 INFLAMACIÓN Durante muchos años se ha considerado al SNC un órgano con privilegio inmune, donde la BHE forma una barrera altamente selectiva y limitada para moléculas y células controlando su tráfico desde la circulación periférica al parénquima nervioso. Hoy en día, este concepto ha cambiado y hay evidencia suficiente que indica que dentro del SNC no solo existe un sistema linfático (Louveau, Smirnov et al. 2015), sino que además existen linfocitos T en situación basal responsables de desencadenar respuestas inmunes e inflamatorias frente a estímulos del tipo infeccioso, accidentes traumáticos e isquemia entre otros. En situaciones en las que la tolerancia antigénica se ha perdido, se genera una respuesta autoinmune, que implica a linfocitos T CD4 y CD8 citotóxicos, así como a los linfocitos B, mo- nocitos/macrófagos y microglía. De esta manera se postula que, en EM, los linfocitos T auto- rreactivos específicos para componentes de la mielina interactuarían, mediante el MHC-II, con células presentadoras de antígeno en órganos linfoides periféricos, se activarían y migrarían al SNC a través de una BHE cuya permeabilidad estaría comprometida. Los linfocitos T una vez dentro del parénquima nervioso serían reactivados y proliferarían promoviendo la expresión de más moléculas MHC en microglía y astrocitos bajo la influencia del IFN-γ, amplificando así el reconocimiento antigénico. Se iniciaría además una cascada inflamatoria donde las citoquinas proinflamatorias del tipo IFN-γ, TNF-α, IL-12 e IL-17 estimularían a su vez a macrófagos, micro- glía y astrocitos, así como a células endoteliales. Estas últimas sobreexpresarían moléculas de adhesión favoreciendo el reclutamiento de más linfocitos T CD4, monocitos y linfocitos B desde el sistema circulatorio. Los linfocitos B secretarían anticuerpos específicos anti-mielina y los linfocitos T CD8 citotóxicos producirían un daño directo sobre la mielina, los oligodendrocitos y Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 36 In tr od uc ci ón los axones mediante mecanismos que incluirían contacto celular, activación del complemento o mediante la liberación de mediadores solubles citotóxicos (Zamvil and Steinman 2003). 2.3 NEURODEGENERACIÓN El daño axonal que conduce a la transección de los axones con la formación de esferoi- des en su parte más proximal del axón, es también característico de las placas escleróticas en la EM, junto con el daño a los oligodendrocitos y la mielina (Trapp, Peterson et al. 1998, Trapp, Ransohoff et al. 1999). La neurodegeneración y daño axonal en la EM fueron descritos por Charcot en 1868, sin embargo, el daño axonal siempre se ha considerado secundario a la inflamación y a la desmielinización. Actualmente, se ha demostrado que el daño y pérdida axonal es un proceso que se produce de manera temprana en la patología de la EM (Ferguson, Matyszak et al. 1997, Matthews, De Stefano et al. 1998, Trapp, Peterson et al. 1998) pudiendo alcanzar hasta un 65% de pérdida axonal en lesiones de EM en individuos sin síntomas neu- rológicos durante la fase inicial de episodios de RR de la enfermedad (Mews, Bergmann et al. 1998). Parece probable que, aunque el daño axonal pueda aparecer al inicio de la enfermedad, éste permanezca en forma subclínica durante la fase RR debido a mecanismos compensatorios del SNC, como la redistribución de los canales de sodio del axón o procesos de remielinización (Reddy, Narayanan et al. 2000, Waxman 1998). La transición desde la EM-RR hasta la EM-SP y el consecuente desarrollo progresivo de la discapacidad permanente podría ocurrir cuando se supera un umbral de pérdida neuronal o axonal, o cuando la respuesta adaptativa del SNC no es suficiente. En lesiones inflamatorias, los responsables del daño axonal son las células inmunitarias como los linfocitos T citotóxicos y las células gliales (microglía y astrocitos), que liberan me- diadores solubles tóxicos entre los que se encuentran el óxido nítrico, el glutamato, la perfori- na, citoquinas, enzimas proteolíticas, productos oxidativos, radicales libres o anticuerpos anti epítopos axonales. El daño axonal también puede generarse de manera secundaria a la des- mielinización debido a la pérdida de factores tróficos o a una mayor exposición de los axones desnudos a los mediadores inflamatorios (Owens 2003). A pesar de que en general, existe una correlación entre la inflamación y la neurodege- neración, la relación entre estos procesos en los diferentes estadios de la EM resulta cuanto 37 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción menos controvertida (Lassmann 2010, Tsunoda and Fujinami 2002, Trapp and Nave 2008). En este aspecto, sigue sin quedar claro si la inflamación es la causa o consecuencia de la neurode- generación, o si ambas participan en un ciclo que se retroalimenta. Se baraja la posibilidad de que la inflamación pueda llegar a ser protectora frente a la neurodegeneración. 2.4 DESMIELINIZACIÓN / REMIELINIZACIÓN La desmielinización es el proceso patológico por el cual, en el SNC, el oligodendrocito es dañado y la mielina que rodea a los axones es eliminada, y está generalmente asociado a la presencia de mediadores inflamatorios en la zona de lesión. Tanto en las placas agudas como en las crónicas activas, la mielina aparece desestructurada y en forma de vesículas que son fagocitadas por macrófagos. Además, la desmielinización no solo ocurre en la sustancia blanca (Lucchinetti, Bruck et al. 2000, Noseworthy, Lucchinetti et al. 2000), sino también en zonas cor- ticales y subcorticales de la sustancia gris del SNC (Peterson, Bo et al. 2001). La remielinización es un proceso para el cual es necesario que los progenitores de oligo- dendrocitos (OPCs), que constituyen un 5 % del total de células en el SNC adulto, migren hacia la zona de lesión y se diferencien a oligodendrocitos maduros para sintetizar nuevas vainas de mielina que recubran aquellos axones previamente desmielinizados (Chang, Tourtellotte et al. 2002, Wolswijk 1998). La remielinización recupera la función axonal facilitando la conducción saltatoria y proporciona un soporte trófico a los axones protegiéndoles del daño y la pérdida axonal. Tras un episodio agudo de inflamación en EM, la resolución del proceso inflamatorio ayuda a que se produzca una remielinización espontánea parcial y una consecuente recupe- ración neurológica que se observa en los episodios de remisión. Se piensa que cerca de un 40 % de las placas escleróticas muestran signos de remielinización, en las denominadas placas fantasma (Barkhof, Bruck et al. 2003, Kotter, Stadelmann et al. 2011). Sin embargo, conforme la enfermedad progresa esa remielinización resulta ser menos eficiente y pasa a ser escasa e incompleta presentando vainas delgadas de mielina e internodos más cortos que la mielina normal. Por esta razón, las propiedades de conducción idóneas de los axones no son del todo recuperadas y los déficits neurológicos se acumulan y se cronifican con el desarrollo de la pato- logía (Chang, Tourtellotte et al. 2002, Franklin 2002, Goldschmidt, Antel et al. 2009). Los datos clínicos y experimentales apuntan a que la incompleta remielinización no parece ser debida a Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 38 In tr od uc ci ón un fallo del reclutamiento de OPCs en la zona de lesión (Chang, Tourtellotte et al. 2002, Chang, Staugaitis et al. 2012), sino más bien a problemas en su diferenciación (Franklin 2002). En este contexto, se ha apuntado a diversos factores inhibitorios presentes en la zona desmielinizada, como responsables de impedir la diferenciación de los OPCs, provocando que la remielinización y regeneración endógena en las zonas lesionadas sea incompleta. Entre esos factores se ha descrito un aumento de la señalización vía Notch, wnt/ß-catenina, LINGO-1, RXR, Nogo-A, un balance alterado de Semaforina3F/Semaforina3A, Anosmina-1, PSA-NCAM (Hanafy and Sloane 2011) o cambios en la composición de la ECM circundante con un aumento en la expresión de proteínas denominadas condroitín sulfato proteoglicanos (CSPGs) y hialuro- nán entre otros (Figura 4) (Haylock-Jacobs, Keough et al. 2011). Figura 4. Moléculas inhibitorias de la remielinización y el daño axonal presentes en la zona de lesión. 3. CONDROITÍN SULFATO PROTEOGLICANOS (CSPGs) Los CSPGs son unas proteínas de la ECM que se acumulan en las zonas de lesión en EM y se consideran factores determinantes en el fallo de la regeneración axonal y la remielinización (Chang, Staugaitis et al. 2012, Sobel and Ahmed 2001), ya que generan un ambiente no permi- sivo que limita la diferenciación de los OPCs. 3.1 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN La ECM del SNC sirve como soporte estructural celular, pero también puede afectar a la proliferación, supervivencia, migración y diferenciación celular. La ECM está compuesta por: i) glicoproteínas del tipo fibronectina, laminina o tenascina, ii) proteínas fibróticas del tipo colá- genos o elastina, y iii) glicosaminoglicanos (GAGs), entre los que se encuentran el hialuronan 39 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción y los proteoglicanos, como los CSPGs localizados en el espacio pericelular y los heparán sulfato proteoglicanos (HSPGs), asociados a la membrana celular (Bandtlow and Zimmermann 2000 ,Galtrey and Fawcett 2007). Los CSPGs están constituidos por un esqueleto proteico al que se unen de forma covalen- te repeticiones de disacáridos llamados GAGs (Sherman and Back 2008). Estos disacáridos están formados por unidades de ácido D-glucurónico (GlcUA) y N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) (Galtrey and Fawcett 2007), y pueden variar en número entre 1 a 100 disacáridos en cada cade- na de GAG anclada a la estructura proteica. Como muestra la Figura 5, la biosíntesis intracelular de estas cadenas de GAGs ocurre en el retículo endoplásmico, donde la enzima xilosiltrans- ferasa une un grupo xiloso a la serina de la estructura proteica de los CSPGs. A continuación, dos residuos de galactosa se unen al grupo xiloso en la región cis/medial del aparato de Golgi mediante dos glicosiltransferasas, momento en el que se unen los disacáridos gracias a la acción de la condroitín sintasa (Galtrey and Fawcett 2007, Silbert and Sugumaran 2002). Se pueden producir modificaciones a posteriori mediante sulfataciones de las cadenas GAGs gracias a la acción de la enzima condroitín sulfotransferasa (Akita, von Holst et al. 2008, Gama, Tully et al. 2006), generando los diferentes condroitín sulfatos (CS) entre los que se encuentran el CS-A (sulfatado en posición 4), CS-C (en posición 6), CS-D (en posición 2 y 6), CS-E (en posición 4 y 6). La mayor actividad biológica de los CPSGs radica en sus cadenas GAGs y la funcionalidad global de los CSPGs varía en función de la estructura proteica, del número y localización de las cadenas GAGs y del patrón de sulfatación de las mismas (Galtrey and Fawcett 2007, Sherman and Back 2008). Figura 5. Ruta de la biosíntesis de CSPGs. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 40 In tr od uc ci ón Dentro de los CSPGs existe la familia de los llamados lecticanos (Figura 6) que constitu- yen la mayor parte de los CSPGs, entre los que se encuentran el Neurocán y Brevicán, siendo éstos los CSPGs más abundantes del SNC. A esta familia también pertenece el proteoglicano Agrecán, expresado principalmente por neuronas y localizado en los espacios perineuronales (PNNs), y el proteoglicano Versicán, expresado por fibroblastos, pericitos y células inflamato- rias (Wight, Kang et al. 2014, Yamaguchi 2000). Tanto NG2 como el Fosfacán son proteoglicanos independientes a esta familia, siendo NG2 un CSPG transmembrana expresado principalmente por los OPCs que no tiene homología ninguna con el resto de los CSPGs. El Fosfacán es el domi- nio extracelular del receptor tirosina fosfatasa β (RPTPβ), que se genera como resultado de un procesamiento alternativo del gen que codifica para ese receptor (Maurel, Rauch et al. 1994). Figura 6. (A) Tipos de CSPGs, (B) Detalle de las cadenas de GAGs y patrones sulfatación. Modificado de Haylock-Jacobs S et al. 2011. Los CSPGs son moléculas de gran importancia para la organización de la ECM, teniendo un papel determinante, no sólo en procesos patológicos, sino también en etapas del desarro- llo y en el mantenimiento estructural normal del SNC. Los CSPGs sirven como guía para los conos axonales en desarrollo y en la migración celular, contribuyendo así a la formación de la arquitectura neural. Además, en el adulto, la producción basal de los CSPGs y hialuronán, en el PNNs, es necesaria para mantener las conexiones neurales estabilizando así las sinapsis (Ca- rulli, Rhodes et al. 2006, Deepa, Carulli et al. 2006, Galtrey and Fawcett 2007, Matthews, Kelly et al. 2002, Rhodes and Fawcett 2004). Así mismo, la distribución y el patrón de sulfatación de estas moléculas resulta crítico para la regulación de la plasticidad sináptica (Miyata, Komatsu et al. 2012). Otra función de los CSPGs está relacionada con la modulación de la actividad de 41 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción los progenitores neurales en el SNC, pudiendo influir en su proliferación (Sirko, von Holst et al. 2007), así como en el mantenimiento, proliferación y diferenciación de los OPCs (Karus, Ulc et al. 2016, Lau, Keough et al. 2012, Pendleton, Shamblott et al. 2013, Siebert and Osterhout 2011). 3.2 CSPGs Y CICATRIZ GLIAL El conocimiento del papel de los CSPGs y su función en la cicatriz glial proviene de los es- tudios realizados en el marco de lesión medular. De esta manera, se ha observado que ante un daño en el SNC se produce un aumento inmediato de los CSPGs, siendo los astrocitos reactivos la principal fuente de síntesis de los mismos (Herrmann, Imura et al. 2008, Li, Tang et al. 2011, McKeon, Schreiber et al. 1991). La principal ruta de activación de los astrocitos para la síntesis y liberación de CSPGs implica la señalización a través de TGF-β/SMAD (Schachtrup, Ryu et al. 2010, Susarla, Laing et al. 2011), aunque algunos estudios también han implicado a la vía de PI3K y mTOR en este proceso (Jahan and Hannila 2015). Este aumento en la expresión de CSPGs en la zona lesionada forma la cicatriz glial, cuya función es en principio beneficiosa ya que limita el daño y evita que éste se extienda a otras zonas del parénquima (Silver and Miller 2004). Sin embargo, si esta cicatriz glial se mantiene en el tiempo puede resultar perjudicial, ya que im- pediría la regeneración axonal y la remielinización (Back, Tuohy et al. 2005, Chang, Staugaitis et al. 2012, Siebert and Osterhout 2011, Sobel and Ahmed 2001), de tal manera que se considera a los CSPGs como el mayor componente inhibitorio de la cicatriz glial (Karimi-Abdolrezaee and Billakanti 2012, Lau, Keough et al. 2012, Sobel and Ahmed 2001, Sofroniew 2009, Siebert and Osterhout 2011). En la EM, las lesiones desmielinizadas también contienen cicatrices gliales con acumu- lación de CSPGs del tipo Agrecán, Neurocán y Versicán, así como de hialuronán (, Back, Tuohy et al. 2005, Chang, Staugaitis et al. 2012, Sobel and Ahmed 2001). Además, la acumulación de CSPGs también se ha evidenciado en la fase desmielinizante de los modelos de lisolecitina y cuprizona, y su eliminación se ha relacionado con los periodos de remielinización (Larsen, Wells et al. 2003, Lau, Keough et al. 2012). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 42 In tr od uc ci ón 3.3 ESTRATEGIAS DE INHIBICIÓN DE LOS CSPGs Se han desarrollado diversas estrategias para poder evitar la acumulación de los CSPGs tanto en el caso de la lesión medular, como en modelos experimentales de desmielinización y de EM. En primer lugar y como muestra la Figura 7, el tratamiento local con la enzima ChABC, la cual elimina las cadenas GAGs de los CSPG ya liberados al espacio extracelular (Bradbury, Moon et al. 2002), ha mostrado tener efectos beneficiosos, aumentando la regeneración axo- nal y promoviendo un aumento del número de OPCs y de la remielinización en el modelo de lesión medular (Barritt, Davies et al. 2006, Bartus, James et al. 2014, Bradbury, Moon et al. 2002, Cafferty, Bradbury et al. 2008, Houle, Tom et al. 2006, Karimi-Abdolrezaee, Schut et al. 2012, Moon, Asher et al. 2001, Siebert, Stelzner et al. 2011). Otra estrategia consiste en la ad- ministración del compuesto xilósido, el cual incide en la ruta de síntesis de los CSPGs, ya que se ha observado que mediante su administración se consigue una disminución en la acumu- lación de CSPGs, así como una mayor remielinización y regeneración en el modelo de lesión medular, en modelos desmielinizantes y de EM (Lau, Keough et al. 2012, Rolls, Shechter et al. 2008). Incidiendo en la misma ruta de síntesis de los CSPGs, mediante el uso del compuesto fluorosamina, un análogo de la UDP-N-acetil-glucosamina que impide su conversión a UDP- N-acetil-galactosamina y por tanto la formación de los disacáridos, se han obtenido efectos beneficiosos y una disminución en la producción de CSPGs en el modelo de EAE, así como en el modelo de desmielinización por lisolecitina (Barthel, Antonopoulos et al. 2011, Keough, Rogers et al. 2016 ,Nigro, Wang et al. 2009). Otra aproximación se basa en incidir en las vías de seña- lización para la síntesis de CSPGs a través de TGF-β y del EGF-R mediante la administración de decorina (Davies, Tang et al. 2004). Además, las enzimas metaloproteinasas MMPs y ADAMTs también han mostrado tener efectos positivos degradando la estructura proteica de los CSPGs (Cua, Lau et al. 2013, Lemarchant, Pruvost et al. 2014, Tauchi, Imagama et al. 2012). Por últi- mo, varios estudios han evidenciado procesos de regeneración y recuperación funcional tras inhibir los receptores a través de los cuales los CSPGs ejercen sus efectos inhibitorios sobre la remielinización y regeneración axonal (Dyck, Alizadeh et al. 2015, Fisher, Xing et al. 2011, Fry, Chagnon et al. 2010, Lang, Cregg et al. 2015). 43 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción Figura 7. Rutas intracelulares de la síntesis de CSPGs y estrategias para su eliminación. Modificado de Dyck et al., 2015. 3.4 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS CSPGs El mecanismo mediante el cual los CSPGs y el hialuronan impiden la regeneración axonal y la remielinización se conoce gracias a diversos estudios in vitro, donde se evidencia que estas macromoléculas impiden la adhesión y diferenciación de los oligodendrocitos, bloqueando así la remielinización (Karus, Ulc et al. 2016, Larsen, Wells et al. 2003, Lau, Keough et al. 2012, Pen- dleton, Shamblott et al. 2013, Siebert and Osterhout 2011). Otros estudios también han mos- trado que los CSPGs y el hialuronan bloquean directamente el crecimiento del cono axonal y por tanto la regeneración (Dyck, Alizadeh et al. 2015, Lang, Cregg et al. 2015, Zhou, Li et al. 2014). Entre los mecanismos propuestos (Figura 8) se incluyen la interacción con la laminina, fi- bronectina y NCAM, bloqueando así sus propiedades tróficas (Galtrey y Fawcett 2007). Además, se han identificado dos tipos de receptores a través de los cuales los CSPGs podrían estar ejer- ciendo principalmente esos efectos: el receptor tirosina fosfatasa sigma (RPTPσ) y el receptor LAR. Los receptores PTPs son una familia de receptores de superficie implicados en el desarro- llo del SNC que controlan la migración, la formación sináptica y la plasticidad neural. Concreta- mente, se ha implicado directamente al PTPσ en la inhibición del crecimiento axonal mediada por los CSPGs (Lang, Cregg et al. 2015, Sapieha, Duplan et al. 2005, Shen, Tenney et al. 2009, Fry, Chagnon et al. 2010). La implicación de los receptores LAR en los efectos inhibitorios de los CSPGs proviene de estudios en los que mediante su inhibición o silenciamiento, se promueve la recuperación funcional en ratones con lesión medular, así como un aumento del crecimiento axonal in vitro (Fisher, Xing et al. 2011, Lang, Cregg et al. 2015, Xu, Park et al. 2015). También Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 44 In tr od uc ci ón se ha descrito que mediante la inhibición de los receptores LAR se promueve la supervivencia y crecimiento neuronal (Dyck, Alizadeh et al. 2015). Sin embargo, hay estudios que contrastan con los anteriores ya que implican a los receptores LAR en la promoción del crecimiento axo- nal. Por tanto, los efectos derivados de la activación de estos receptores parecen depender del contexto (Fisher, Xing et al. 2011, Yang, Yin et al. 2005). Se sabe además que los CSPGs activan la vía de señalización Rho/ROCK a través de su interacción con los receptores LAR y RPTPσ (Dyck, Alizadeh et al. 2015, Fisher, Xing et al. 2011). Mediante la activación de esta vía, la proteína RhoA bloquea la distribución de microtúbulos, proceso necesario para la regeneración axonal generando, en último término, un colapso del cono axonal. Asimismo, mediante inhibición directa de la vía Rho/ROCK o de los RPTPσ y LAR, se bloquean las propiedades inhibitorias de los CSPGs sobre la supervivencia neural (Dyck, Ali- zadeh et al. 2015), el crecimiento axonal y la recuperación funcional en lesión medular (Lang, Cregg et al. 2015) y se promueve la maduración de los OPCs y la mielinización in vitro (Pendle- ton, Shamblott et al. 2013). Figura 8. Vías de señalización inhibitorias propuestas de los CSPGs. 45 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción 4. MODELOS EXPERIMENTALES DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE Para estudiar los mecanismos fisiopatológicos y las posibles estrategias terapéuticas de la EM, se utilizan diferentes modelos experimentales que se dividen en «inmunes» o «virales» en función del posible origen de la enfermedad. Los modelos «inmunes» se basan en la reacción autoinmune frente a la mielina que se desarrolla tras la inmunización activa con fragmentos de proteínas de la mielina, o bien mediante transferencia pasiva con linfocitos T autorreactivas frente a epítopos de mielina. El modelo de este tipo más utilizado para el estudio de la EM es el de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Los modelos «virales» tienen en cuenta la teoría de un posible origen viral de esta enfermedad que desencadenaría un proceso autoin- mune, siendo el más extendido el de la enfermedad desmielinizante inducida por la infección con el virus de Theiler (TMEV-IDD, del inglés Theiler’s murine encephalomyelitis virus-induced demyelinated disease)(Lassmann and Bradl 2017,Procaccini, De Rosa et al. 2015). 4.1 MODELO INMUNE DE ENCEFALOMIELITIS AUTOINMUNE EXPERIMENTAL Para el desarrollo del modelo inflamatorio de EAE es necesaria una inmunización activa con un emulsionado de antígenos del SNC, siendo el más utilizado el péptido MOG35–55. Este péptido de mielina se administra junto con adyuvante incompleto de Freund (CFA) que permi- te una liberación lenta y continua del antígeno (Billiau and Matthys 2001) junto con micobac- terium tuberculosis como estimulador masivo de la respuesta inmune (Kabat, Wolf et al. 1951). Es necesaria así mismo la administración de toxina procedente de bordetella pertussis que ayuda a permeabilizar la BHE (Lu, Pelech et al. 2008) y a inhibir la respuesta de los linfocitos T reguladores (Chen, Winkler-Pickett et al. 2006). La inmunización activa con péptidos de mielina desencadena una respuesta inflamatoria mediada principalmente por linfocitos T CD4 autorreactivos que se extravasan a través de la BHE hacia el SNC, liberando una vez dentro, quimioquinas y citoquinas que atraen a su vez a monocitos/macrófagos periféricos, provocando así una inflamación desmielinizante y daño axonal. Aproximadamente a los 14 días de la inmunización, se alcanza el pico máximo de afec- tación clínica, cuya progresión depende de la especie y/o de la cepa de animal empleado, así como del antígeno, el sexo o el régimen de inducción, pudiendo presentar un curso monofási- co, crónico o RR (Steinman and Zamvil 2006). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 46 In tr od uc ci ón 4.2 MODELO VIRAL DE LA ENCEFALOMIELITIS MURINA POR INFECCIÓN CON EL VIRUS DE THEILER En relación a la hipótesis viral de la EM, existen modelos animales de EM entre los que se encuentra el modelo de Theiler, en el que mediante la inoculación intracerebral del virus TMEV en cepas de ratones susceptibles, se desarrolla una sintomatología desmielinizante crónica lla- mada TMEV-IDD, que modeliza la variante primaria progresiva de la EM (Dal Canto, Kim et al. 1996, Lipton 1975, Lipton and Jelachich 1997). El virus de Theiler es un picornavirus entérico patógeno de los ratones del género car- diovirus formado por una única cadena de RNA de polaridad positiva (Lipton 1975, Theiler 1937). Existen varias cepas que se distinguen en función de su neurovirulencia entre las que se encuentran la TO, que es menos virulenta, y dentro de la cual se incluyen las cepas BeAn y DA utilizadas para inducir el modelo de EM (Oleszak, Chang et al. 2004). La inoculación del virus debe realizarse en una ventana de tiempo concreta que varía entre las seis y ocho semanas de edad, hecho que está en consonancia con la hipótesis de que el origen de la EM podría deberse a una infección viral durante la infancia y adolescencia temprana. Ambas cepas de virus inducen, en ratones genéticamente susceptibles SJL/J, un trastor- no bifásico que consta de una primera etapa aguda (polioencefalomielitis) que tiene lugar a la semana post-infección, seguida por una segunda fase crónica desmielinizante que afecta prin- cipalmente a la médula espinal y que comienza alrededor del segundo mes post-infección en el caso de la infección con la cepa Daniel (Figura 9) (Lipton 1975, Tsunoda and Fujinami 1996, Tsunoda and Fujinami 2010). Las deficiencias motoras generadas en la fase crónica desmielini- zante incluyen con espasticidad, fallos de coordinación motora, debilidad en las extremidades, incontinencia urinaria y, finalmente, parálisis de las patas traseras (McGavern, Zoecklein et al. 1999). 47 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción Figura 9. Curso temporal del TMEV-IDD. En la fase aguda del TMEV-IDD, el virus de Theiler infecta principalmente a neuronas de la sustancia gris a nivel de corteza e hipocampo (Liu, Collins et al. 1967). En esta fase se observa in- flamación en la sustancia gris no solo a nivel cerebral, sino también en la médula espinal (Lipton y Dal Canto 1976). Además, en esta fase, se produce infiltración de linfocitos T CD4, CD8, células B que producen citoquinas proinflamatorias que reclutan a su vez a monocitos, macrófagos y microglía, produciéndose finalmente una encefalitis como respuesta inmune frente al virus (, Oleszak, Chang et al. 2004, Schlitt, Felrice et al. 2003, Tsunoda and Fujinami 2010). Tras la fase aguda, el sistema inmune no es capaz de eliminar el virus en ratones suscep- tibles, desarrollándose así la fase crónica en la cual se dan procesos de autoinmunidad debido a la expansión de epítopos (Miller, Katz-Levy et al. 2001, Olson, Eagar et al. 2002). Asimismo, se observa inflamación perivascular y subaracnoidal en la sustancia blanca particularmente en la zona ventral de la medula espinal, que generan desmielinización y daño axonal (Tsunoda and Fujinami 2002). El virus de Theiler persiste en reservorios como en oligodendrocitos, astrocitos, microglía y macrófagos, (Clatch, Miller et al. 1990, Jelachich, Bandyopadhyay et al. 1995, Oles- zak, Chang et al. 2004, Rodriguez, Leibowitz et al. 1983) siendo estos últimos la principal reserva de virus y quienes determinan su persistencia en el SNC durante toda la vida del animal (Lipton, Kratochvil et al. 1984). Las características patológicas del modelo de TMEV-IDD como son la inflamación, desmie- linización y el daño axonal, no solo se restringen a la médula espinal, sino que también apare- cen en corteza y tronco cerebral (Mecha, Carrillo-Salinas et al. 2013). Además, también tienen lugar procesos de remielinización espontánea incompleta (Bieber, Ure et al. 2005, Dal Canto and Lipton 1975) a pesar de que hay una mayor presencia de OPCs en las zonas de lesión, por Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 48 In tr od uc ci ón lo que se postula que la capacidad de estas células para diferenciarse se encuentra afectada en las zonas lesionadas (Ulrich, Seeliger et al. 2008). 5. TRATAMIENTO Y NUEVAS ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS EN EM A pesar de que hoy en día se ha avanzado de manera considerable en las terapias de la EM existiendo diferentes terapias que alivian o retrasan los brotes de la EM, hoy en día no existe un tratamiento lo suficientemente efectivo para la fase progresiva de la enfermedad. Los diferentes tratamientos que se administran en EM y que reducen la frecuencia de los brotes y por tanto la discapacidad de los pacientes, actúan generalmente como antiinfla- matorios, inmunosupresores e inmunomoduladores. Desde la introducción de los interferones en el tratamiento de la EM ha habido un considerable desarrollo terapéutico que ha logrado controlar en buena medida la primera fase de la enfermedad. Sin embargo, es necesario el de- sarrollo de nuevas terapias para controlar la fase progresiva de la EM donde una combinación de estrategias antiinflamatorias, oligoprotectoras y neuroprotectoras deberían ser abordadas (Ziemssen 2005). En los primeros síntomas de la enfermedad, los pacientes son tratados con altas dosis de corticoesteroides intravenosos entre los que se encuentran la metilprednisolona durante un periodo de 3 a 5 días. En casos particulares en los que la anterior medida no funcionase, se procede a la administración subcutánea o intramuscular de la hormona adrenocorticotrópica. Estos tratamientos antiinflamatorios actúan reduciendo rápidamente la sintomatología neuro- lógica relacionada con el brote. Por otro lado, como muestra la Figura 10, encontramos fármacos de primera línea en- tre los que se incluyen el IFNβ-1b subcutáneo (Betaferón® y Extavia®), IFNβ-1a intramuscu- lar (Avonex®), IFNβ-1a subcutáneo (Rebif®), interferones que suprimen la proliferación de los linfocitos autoreactivos, reducen la producción de citoquinas proinflamatorias (IFN-γ) y pro- mueven las antiiinflamatorias (IL-10). También se incluye como fármaco de primera línea al acetato de glatirámero (AG, Copaxone®), mezcla de péptidos sintéticos que ejercen un papel inmunomodulador ya que compiten con la proteína MBP por ser reconocidos por el sistema inmunitario y favorecen la producción de citoquinas antiinflamatorias (Arnon and Sela 2003). 49 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción En el caso de progresión sintomática, donde los fármacos de primera línea no resulta- sen eficaces, se pasaría a fármacos de segunda línea entre los que se encuentran anticuerpos monoclonales dirigidos contra componentes del sistema inmunológico del tipo natalizumab (Tysabri®), que bloquea la integrina VLA-4 de los linfocitos evitando así su transmigración al pa- rénquima nervioso; anticuerpo anti-CD25 o daclizumab (Zinbryta®); anti-CD52 de los linfocitos o alentuzumab (Lemtrada®); anticuerpo anti-CD20 inmunosupresor o Ocrelizumab (Ocrevus®). También se utilizaría el antineoplásico mitoxantrona (Novantrone®); el Fingolimod (Gilenia®), el cual retiene a los linfocitos en los ganglios linfáticos; la Teriflunomida (Aubagio®) cuya función es inhibir la proliferación de los linfocitos; el Dimetilfumarato (Tecfidera®) compuesto antiinfla- matorio y antioxidante y el recientemente aprobado, pero no comercializado aún, la Cladribina (Mavenclad®), análogo de los nucleótidos purínicos que interviene en la proliferación de los linfocitos. En general los fármacos mencionados previnienen la aparición de nuevos brotes pu- diendo retrasar la aparición de la discapacidad. El tratamiento de la EM en su forma progresiva supone todo un reto ya que el compo- nente inflamatorio en esta fase es más residual, no teniendo los compuestos anteriormente mencionados un efecto significativo ya que en general actúan como agentes inmunosupresores y antiinflamatorios. Los únicos compuestos aprobados y dirigidos a tratar las formas progresivas de la enfermedad incluyen al antineoplásico Mitoxantrone y al anticuerpo monoclonal huma- nizado Ocrelizumab que reconoce el antígeno CD20 de los linfocitos B (Garg and Smith 2015). Figura 10. Tratamientos para la EM y vías de administración. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 50 In tr od uc ci ón Cierto es que en una enfermedad tan heterogénea como la EM, donde la inflamación juega un papel determinante, aquellos fármacos dirigidos frente al componente inmunológi- co actuando como inmunomoduladores, ya sea impidiendo la proliferación linfocitaria, blo- queando su entrada al parénquima nervioso, impidiendo su transmigración a través de la BHE o mediante su retención en órganos linfoides, van a tener un efecto beneficioso reduciendo la aparición de brotes. Sin embargo, conforme la enfermedad progresa, estas terapias pierden eficacia y deberían ser complementadas por otras que no solo consigan cambiar el perfil proin- flamatorio de las lesiones hacia un perfil antiinflamatorio, sino que también vayan dirigidas específicamente a reducir la neurotoxicidad mediante compuestos neuroprotectores que inci- dan directamente en aquellos procesos que producen directamente daño axonal. Entre ellos se incluirían agentes inhibidores del receptor de glutamato, inhibidores de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS-II) y del óxido nítrico, antioxidantes, inhibidores de canales de Ca2+, antia- poptóticos, así como la administración de factores de crecimiento y factores tróficos (Karussis, Grigoriadis et al. 2006). Del mismo modo, resulta de gran importancia encontrar terapias capaces de incremen- tar los mecanismos endógenos de reparación que disminuyan o inhiban el daño al oligoden- drocito y a la mielina, así como mecanismos que promuevan la remielinización espontánea. En los últimos años se ha estudiado la posibilidad de utilizar la terapia celular para promover los mecanismos endógenos de reparación, mediante el uso de células madre mesenquimales y sus mediadores pro-regenerativos que incluyen citoquinas, quimioquinas y factores tróficos (Uccelli, Laroni et al. 2011). Además, con el fin de promover la remielinización, se ha barajado también el trasplante de oligodendrocitos, aunque como se ha mencionado anteriormente, el número de oligodendrocitos no se encuentra disminuido en áreas desmielinizadas. En los últi- mos años el control y la identificación de las moléculas inhibitorias de la regeneración axonal y la diferenciación de los oligodendrocitos presentes en las zonas desmielinizadas como son Nogo-A, Semaforina 3A o los CSPGs, han generado gran interés barajándose como posibles dianas para aumentar los mecanismos de reparación y remielinización en EM. Teniendo en cuenta las posibles dianas terapéuticas mencionadas, los cannabinoides son buenos candidatos a tener en cuenta para el tratamiento en EM ya que han demostrado ali- viar la sintomatología relacionada con la EM (Baker, Pryce et al. 2012), presentar propiedades 51 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción antiinflamatorias (Arevalo-Martin, Vela et al. 2003, Croxford and Miller 2003), antioxidantes, antiexcitotóxicas y neuroprotectoras (Fernandez-Ruiz, Garcia et al. 2010, Loria, Petrosino et al. 2010, Pryce, Ahmed et al. 2003). Asimismo, su administración mejora los procesos de remieli- nización (Arevalo-Martin, Vela et al. 2003), protege a los OPCs del daño inflamatorio in vivo e in vitro (Bernal-Chico, Canedo et al. 2015, Gomez, Arevalo-Martin et al. 2010, Mecha, Torrao et al. 2012, Molina-Holgado, Vela et al. 2002) y promueve su proliferación y diferenciación en cultivo (Gomez, Arevalo-Martin et al. 2010, Gomez, Sanchez-Rodriguez et al. 2011, Gomez, Sanchez-Rodriguez et al. 2015). 6. SISTEMA CANNABINOIDE La planta Cannabis sativa L., contiene alrededor de 421 compuestos químicos entre los que se encuentran más de 90 terpeno-fenoles llamados fitocannabinoides encontrados ex- clusivamente en dicha planta (ElSohly y Waseem 2014). Gracias al descubrimiento, en el año 1964, por el grupo de Mechoulam del fitocannabinoide THC (Gaoni y Mechoulam 1964), prin- cipal responsable de las propiedades psicoactivas de la planta, así como del receptor mediante el cual ejerce sus efectos (Matsuda, Lolait et al. 1990), conocido como el receptor CB1, pudo abrirse paso al conocimiento del sistema cannabinoide endógeno constituido por ligandos en- dógenos, las enzimas de síntesis y degradación de los mismos, así como los receptores median- te los cuales ejercen sus efectos. 6.1 SISTEMA CANNABINOIDE Y FUNCIONALIDAD Los cannabinoides son moléculas altamente hidrofóbicas, debido a su naturaleza lipídica, capaces de penetrar con facilidad en el SNC y atravesar las membranas celulares, (Pertwee 1999, Pertwee 2008, Pertwee 2010). Engloban a agonistas exógenos procedentes de la planta, cannabinoides sintéticos, así como a los endocannabinoides, todos ellos capaces de actuar so- bre elementos del sistema endocannabinoide (Di Marzo y Piscitelli 2015). Debido a su amplia distribución tisular y celular, se ha involucrado a los cannabinoides en numerosos procesos fisiológicos tanto centrales como periféricos (Ligresti, De Petrocellis et al. 2016, Maccarrone, Bab et al. 2015), teniendo un papel modulador en el sistema inmunitario, en el sistema cardio- vascular, reproductivo, y en el metabolismo energético y endocrino. Dentro del SNC, su acción no solo se restringe al nivel neuronal, sino que se extiende a las células gliales, provistas de la Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 52 In tr od uc ci ón maquinaria necesaria no sólo para responder, sino también para producir e inactivar endocan- nabinoides (Ligresti, De Petrocellis et al. 2016, Maccarrone, Bab et al. 2015). En este sistema, participan en la regulación de la actividad motora, en procesos de aprendizaje y memoria, en procesos cognitivos, control de la ingesta y el apetito así como en la regulación de la temperatu- ra corporal, en la emesis, control de la nocicepción, regulación neuroendocrina y supervivencia neuronal (Ligresti, De Petrocellis et al. 2016). 6.2 RECEPTORES CANNABINOIDES Los receptores mediante los cuales los cannabinoides ejercen principalmente sus efectos, son los denominados receptores CB1, y CB2. El receptor CB1 fue clonado por primera vez en el año 1990 por el grupo de Matsuda (Matsuda, Lolait et al. 1990) y pertenece a la familia de los receptores con siete dominios transmembrana, acoplados a proteínas G del tipo Gi/Go (Herken- ham, Lynn et al. 1990, Howlett, Barth et al. 2002). Este receptor se encuentra a nivel periférico y está ampliamente distribuido en el SNC, expresándose en la corteza cerebral, ganglios basales y cerebelo, así como en el hipocampo, en estructuras límbicas e hipotalámicas. Además, resulta interesante destacar que existe una buena correlación entre la presencia de este receptor en estas áreas cerebrales y las acciones psicotrópicas asociadas al consumo de cannabis y en par- ticular al efecto del THC (Mechoulam 2016). Los endocannabinoides modulan la neurotransmisión sináptica actuando como mensaje- ros retrógrados mediante la activación del receptor CB1 en membranas presinápticas. Se impi- de de esta manera la liberación de neurotransmisores ejerciendo un papel esencial en el control de un exceso de transmisión excitatoria o inhibitoria regulando de esta manera la homeostasis neuronal (Katona and Freund 2012). Respecto al receptor CB2, descrito en el año 1993 por Munro y colaboradores (Munro, Thomas et al. 1993), se expresa mayoritariamente en tejidos periféricos relacionados con el sistema inmune, así como en linfocitos B, monocitos y linfocitos T (Galiegue, Mary et al. 1995). También se ha identificado en la glía, en situaciones inflamatorias, incluyendo a astrocitos, mi- croglía, y progenitores de oligodendrocitos (Benito, Tolon et al. 2008, Di Marzo, Stella et al. 2015, Lu and Mackie 2016, Sagredo, Gonzalez et al. 2009), así como en determinadas subpobla- ciones neuronales (Garcia, Cinquina et al. 2015, Lanciego, Barroso-Chinea et al. 2011, Zhang, 53 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción Gao et al. 2017) y progenitores neurales (Palazuelos, Aguado et al. 2006). El receptor CB2 es también un receptor con siete dominios transmembrana, acoplado a proteína G, que tiene una homología global del 44% con el receptor CB1. Ambos receptores median su acción a través de la adenilato ciclasa y AMPc (Figura 11) y en el caso del CB1 inhibiendo también canales iónicos de Ca2+ y modulando los canales rectificadores de K+ (Guo and Ikeda 2004, Howlett, Barth et al. 2002). Además, la señalización mediada por cannabinoides ha mostrado estimular la ruta de las proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK) así como modular la cascada de señalización de la PI3K y Akt, vías que están íntimamente relacionadas con los procesos de proliferación, diferenciación y supervi- vencia celular (Iannotti, Di Marzo et al. 2016). Se ha identificado al receptor CB1 en mitocon- drias señalizando a través de la inhibición de la AC y PKA regulando los procesos de memoria a través de la modulación del metabolismo energético (Hebert-Chatelain, Desprez et al. 2016, Mendizabal-Zubiaga, Melser et al. 2016). Figura 11. Principales vías de señalización de receptores cannabinoides. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 54 In tr od uc ci ón Los cannabinoides también pueden actuar activando receptores de potencial transitorio V1 (TRPV1), canal iónico no selectivo, permeable tanto a Ca2+ como a Na+ y H+ (Zygmunt, Pe- tersson et al. 1999) implicados en la modulación de la vasodilatación, nocicepción e inflama- ción. Los cannabinoides son también capaces de activar a otros receptores acoplados a proteína G como el receptor GPR55 o el GPR18, importantes en la función vascular, dolor y en la coordi- nación motora (Morales and Reggio 2017, Sharir and Abood 2010), a receptores nucleares acti- vados por proliferadores de peroxisomas (PPARs), implicados en regular la respuesta inmune e inflamatoria, así como en analgesia (O’Sullivan 2007, Sun and Bennett 2007), a la subunidad α1 del receptor de glicina y a la subunidad β2 del receptor GABA-A entre otros (Katona and Freund 2012). Además, se ha descrito que los receptores de cannabinoides pueden formar homodí- meros o heterodímeros entre sí y con otros receptores formando complejos con los receptores GPR55, de serotonina 5-HT1a, 5HT2a, adenosina A2A, dopaminérgicos D2, entre otros (Ferre, Lluis et al. 2010, Morales and Reggio 2017, Vinals, Moreno et al. 2015). 6.3 ENDOCANNABINOIDES, ENZIMAS DE SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN En el año 1992 el grupo de Raphael Mechoulam identificó y caracterizó la N-araquidonil etanolamida o anandamida (AEA) (Devane, Hanus et al. 1992), endocannabinoide con mayor afinidad por el receptor CB1 que por el CB2. Tres años más tarde se identificó el segundo endo- cannabinoide, el 2-araquidonoilglicerol (2-AG), endocannabinoide más abundante del SNC que actúa con afinidad similar tanto por el receptor CB1 como por el CB2 (Mechoulam, Ben-Shabat et al. 1995, Stella, Schweitzer et al. 1997, Sugiura, Kondo et al. 1995, Sugiura, Kishimoto et al. 2006). Estos ligandos endógenos son sintetizados y liberados a demanda a partir de fosfolípidos de membrana como consecuencia de incrementos en los niveles de calcio intracelular mediante activación de receptores unidos a proteínas G o despolarización celular (Basavarajappa 2007, Katona and Freund 2012). Sin embargo, algunos estudios también han indicado que, por ejem- plo, la AEA podría almacenarse en adiposomas y unirse a transportadores intracelulares (Ian- notti, Di Marzo et al. 2016). La enzima responsable de sintetizar la AEA es la enzima fosfolipasa D a partir de la N-araquidonoilfosfatidiletanolamina (NAPE) (Basavarajappa 2007, Simon and Cravatt 2006, Simon and Cravatt 2008). En el caso del endocannabinoide 2-AG, la fosfolipasa C 55 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción (PLC) genera su precursor, el diacilglicerol (DAG), desde fosfoinositidos de membrana que a su vez lo hidrolizan dos diacilglicerol lipasas (DAGLα y DAGLβ) para generar 2-AG (Gao, Vasilyev et al. 2010, Tanimura, Yamazaki et al. 2010). Aparte de estos dos endocannabinoides, también existen lípidos derivados de ácidos grasos que pueden interactuar con receptores cannabi- noides entre los que se encuentra el N-oleiletanolamina, la N-palmitoiletanolamina (PEA), la N-linoleiletanolamina y la N-estearoiletanolamina, cuya estructura está muy relacionada con la de la AEA. Existen diferentes mecanismos mediante los cuales se regula la señalización mediada por cannabinoides. Entre estos se incluyen la sensibilización e internalización de los receptores de cannabinoides o la eliminación del propio endocannabinoide del espacio extracelular me- diante difusión pasiva o a través de sistemas de recaptación mediante transportadores AMT que lo dirige de nuevo al interior celular, aunque este último no ha sido caracterizado mole- cularmente hasta la fecha (Di Marzo, Stella et al. 2015). Dentro de la célula son hidrolizados mediante enzimas concretas, principalmente la FAAH en el caso de la AEA que la cataboliza a ácido araquidónico y etanolamina (Fezza, Bari et al. 2014). En el caso del 2-AG, es hidrolizado fundamentalmente a través de la serin hidrolasa monoacilglicerol lipasa (MAGL) (Blankman, Simon et al. 2007, Dinh, Carpenter et al. 2002), responsable del 85 % de su degradación (Blank- man, Simon et al. 2007) generando ácido araquidónico y glicerol. Existen así mismo otras serín- hidrolasas minoritarias que degradan el 2-AG entre las que se encuentran la alfabetahidrolasa 12 (ABHD12), capaz de degradar hasta un 9 % del 2-AG, y la alfabetahidrolasa 6 (ABHD6) capaz de degradar hasta un 3% del 2-AG (Blankman, Simon et al. 2007, Fezza, Bari et al. 2014, Ma- rrs, Blankman et al. 2010). Las enzimas ABHD6 y ABHD12 tienen una distribución subcelular diferente a la MAGL, lo que sugiere que podrían controlar distintas fuentes de 2-AG dentro del SNC (Blankman, Simon et al. 2007, Marrs, Blankman et al. 2010, Savinainen, Saario et al. 2012). La MAGL se expresa en altos niveles en neuronas del hipocampo, corteza, tálamo y cerebelo (Dinh, Carpenter et al. 2002) y colocaliza normalmente con el receptor CB1 en terminales pre- sinápticos (Savinainen, Saario et al. 2012). Se ha descrito además que la MAGL de los astrocitos es la responsable de la fuente celular del ácido araquidónico, producto de degradación del 2-AG, y precursor de las prostaglandinas dentro del SNC (Viader, Blankman et al. 2015). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 56 In tr od uc ci ón Figura 12. Sistema endocannabinoide. Enzimas de síntesis, enzimas de degradación, endocannabinoides y receptores. Modificado de Mecha et al 2017. 6.4 PROPIEDADES TERAPÉUTICAS DE LOS CANNABINOIDES Hoy en día se pueden encontrar diferentes compuestos de uso terapéutico en clínica con base cannabinoidea, entre los que se encuentran el Cesamet® (nabilona), el Marinol® (drona- binol) ambos análogos sintéticos del THC, el Sativex® (nabiximols) que es un extracto completo de cannabis con una proporción 1:1 de THC y CBD y el Epidiolex®, constituido por CBD puro de la planta el cual se encuentra cerca de ser aprobado para su uso en síndromes epilépticos. El Cesamet® y el Marinol® se usan como antieméticos para la quimioterapia y como orexigénicos (Soderpalm, Schuster et al. 2001), mientras que el Sativex® es el único aprobado en numerosos países incluyendo España en el año 2010, para el tratamiento de la espasticidad en pacien- tes con EM (Wade, Makela et al. 2004), además también está aprobado su uso contra dolor neuropático asociado a la EM y cáncer (Collin, Ehler et al. 2010, Langford, Mares et al. 2013, Novotna, Mares et al. 2011). El efecto terapéutico de los cannabinoides y de los moduladores del sistema endocanna- binoide podría ser también aplicable a enfermedades agudas de tipo isquémicas, traumatismo cerebral, lesión medular o en enfermedades neurodegenerativas crónicas como la EM, Escle- rosis Lateral Amiotrófica (ELA), Parkinson, Huntington o Alzheimer (Fernandez-Ruiz, Romero et al. 2015). Este efecto terapéutico se basaría en su perfil de amplio espectro que radica en su capacidad de afectar a múltiples procesos moleculares, entre los que se incluye su capaci- dad para modular la transmisión sináptica actuando a través del receptor CB1, regulando la homeostasis del glutamato y por tanto la excitotoxicidad, así como regulando la disfunción mi- 57 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción tocondrial. A lo anterior, se sumaría su capacidad para regular la actividad glial disminuyendo la toxicidad de la microglía a través del receptor CB2 (Fernandez-Ruiz, Romero et al. 2007) y modulando procesos neuroinflamatorios e induciendo neuroprotección. Por último, también se incluiría su efecto antioxidante y su capacidad para activar a las vías de Nrf-2, NFꓗB y recep- tores PPARγ (Muñoz, Pollastro et al. 2017, O’Sullivan 2007). 6.5 CANNABINOIDES Y EM Dado que los datos experimentales señalan que los componentes del sistema endocan- nabinoide se encuentran alterados tanto en modelos animales de EM (Centonze, Bari et al. 2007) como en lesiones desmielinizadas (Benito, Romero et al. 2007), plasma y LCR de pacien- tes (Centonze, Bari et al. 2007, Jean-Gilles, Feng et al. 2009), la administración de cannabinoi- des o de moduladores del sistema endocannabinoide se plantea como una buena estrategia para el tratamiento de esta enfermedad. Así, en el modelo de EAE y de TMEV-IDD se ha visto que mediante dichas estrategias se mejora la sintomatología motora en ambos modelos, y se disminuyen sus características histopatológicas ejerciendo efectos antiinflamatorios (Arevalo- Martin, Vela et al. 2003, Croxford and Miller 2003) y neuroprotectores (Fernandez-Ruiz, Garcia et al. 2010, Loria, Petrosino et al. 2010, Mecha, Feliu et al. 2015, Pryce, Riddall et al. 2015, Pry- ce, Ahmed et al. 2003). Los cannabinoides regulan así algunos de los eventos involucrados en la EM, como son la limitación del tráfico leucocitario al parénquima nervioso actuando a nivel de BHE (Mestre, Inigo et al. 2011), regulando la respuesta inflamatoria modulándola hacia un perfil más antiinflamatorio y reparador (Mecha, Feliu et al. 2015), o promoviendo la prolife- ración y la diferenciación de los OPCs favoreciendo los procesos de remielinización (Gomez, Arevalo-Martin et al. 2010, Gomez, Sanchez-Rodriguez et al. 2015). Concretamente, el 2-AG ha mostrado ejercer efectos inmunomoduladores y supresores de células inflamatorias regulando la actividad y proliferación de linfocitos (Kaplan, Ouyang et al. 2005, Lourbopoulos, Grigoriadis et al. 2011, Rockwell, Snider et al. 2006), de células microgliales (Carrier, Kearn et al. 2004) y de macrófagos (Gallily, Breuer et al. 2000), además de ejercer efectos neuroprotectores (Arevalo-Martin, Garcia-Ovejero et al. 2010, Panikashvili, Shein et al. 2006, Shohami and Mechoulam 2006). La administración de 2-AG también reduce el volumen de lesión en un modelo de lesión medular (Arevalo-Martin, Garcia-Ovejero et al. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 58 In tr od uc ci ón 2010). Inhibidores farmacológicos de la MAGL como el compuesto JZL184, han mostrado tener efectos terapéuticos mejorando la sintomatología motora en el modelo de EAE a través de la modulación de la respuesta inflamatoria de macrófagos y microglía hacia un perfil antiinflama- torio. También disminuye la infiltración de linfocitos T y la excitoxicidad de los oligodendrocitos previniendo así la desmielinización (Bernal-Chico, Canedo et al. 2015, Lourbopoulos, Grigoria- dis et al. 2011). Así mismo, el 2-AG y el inhibidor JZL184 también han mostrado inducir la proli- feración y diferenciación de OPCs in vitro pudiendo promover la remielinización y los procesos de reparación (Bernal-Chico, Canedo et al. 2015, Gomez, Arevalo-Martin et al. 2010, Gomez, Sanchez-Rodriguez et al. 2011, Gomez, Sanchez-Rodriguez et al. 2015). Durante la última década, se han desarrollado numerosos inhibidores selectivos de la MAGL, enzima de degradación del 2-AG (Tuo, Leleu-Chavain et al. 2017), como aproximación farmacológica para la obtención de efectos analgésicos, antiinflamatorios y neuroprotectores. Su uso resulta de gran interés terapéutico ya que, mediante su administración, se activan los receptores cannabinoides, pero se evita la aparición de efectos adversos psicotrópicos ejercidos por la acción de los agonistas sobre el receptor CB1 (Fernandez-Suarez, Celorrio et al. 2014, Chicca, Arena et al. 2016, Gaetani, Cuomo et al. 2003). El problema radica en que, los inhibi- dores descritos hasta la fecha actúan de manera irreversible pudiendo generar efectos antagó- nicos, así como tolerancia farmacológica y desensibilización de receptores tras su empleo cró- nico, perdiendo así la eficacia del inhibidor (Schlosburg, Blankman et al. 2010). Es por ello que supone de gran importancia desarrollar nuevos inhibidores selectivos, potentes y reversibles de la MAGL que carezcan de efectos adversos mediados por la activación central del receptor CB1. Este es el caso del compuesto UCM03025, inhibidor selectivo reversible de la MAGL, cuyo efecto terapéutico ha sido evaluado en la presente tesis doctoral. El UCM03025 es 50 veces más selectivo frente a la MAGL respecto a la FAAH con una IC50 (MAGL) de 0,18 µM, frente una IC50 (FAAH) de 59 µM. Actúa además como un inhibidor no competitivo con una Ki de 0,4 µM y no es capaz de unirse a los receptores CB1 y CB2 teniendo en este caso una Ki mayor de 10 µM. Por último, es capaz de detectarse en plasma tras 4 horas desde su administración (Hernandez- Torres, Cipriano et al. 2014) lo que posiciona a este inhibidor de la MAGL como un compuesto interesante para su uso terapéutico. Tanto los cannabinoides como los inhibidores de la MAGL, en particular aquellos que 59 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Introducción actúan de manera reversible, podrían ejercer efectos terapéuticos actuando no solo como in- munomoduladores, sino que podrían actuar también como neuroprotectores disminuyendo el daño axonal y promoviendo los mecanismos de reparación endógena y la remielinización. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 60 In tr od uc ci ón 61 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez O bjetivos II. HIPÓTESIS Y OBTETIVOS Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 62 O bj et iv os 63 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez O bjetivos La hipótesis de la presente Tesis doctoral postula que el fallo en la remielinización que acontece en las fases crónicas del modelo del virus de Theiler podría ser, en parte, consecuen- cia de una alteración de la ECM presente en las zonas de lesión, donde la acumulación de CS- PGs y la formación de la cicatriz glial inducen una desregulación de la diferenciación de OPCs, dificultando los mecanismos endógenos de reparación y una remielinización efectiva. El potencial de los cannabinoides como reguladores de la progresión de la enfermedad actuando como inmunomoduladores y antiinflamatorios podría incluir también un posible efecto terapéutico promoviendo los procesos de reparación a través de la modulación de los CSPGs y la cicatriz glial. El objetivo general de la Tesis doctoral es evaluar la implicación de los CSPGs en el fallo de remielinización que acontece en las fases crónicas del modelo de EM del virus de Theiler, así como el papel del endocannabinoide 2-AG en su regulación y modulación para promover los mecanismos de reparación y consecuente remielinización. Los objetivos concretos incluirán: i) El análisis de la expresión de los CSPGs en la fase crónica del modelo de TMEV. ii) Estudio de cómo la acumulación de los CSPGs influye en la funcionalidad moto- ra en las fases crónicas del modelo de TMEV-IDD, haciendo uso de herramientas farmacológi- cas que impiden la acumulación de dichas macromoléculas. iii) Análisis del potencial terapéutico del UCM03025, inhibidor reversible de la en- zima MAGL, y la administración del endocannabinoide 2-AG en el modelo de EAE, así como en el modelo del virus de Theiler, estudiando su capacidad para modular la respuesta inflamato- ria, así como de regular la acumulación de CSPGs. v) Puesto que los astrocitos son los principales productores de los CSPGs, se ana- lizará la síntesis y liberación de los CSPGs, en cultivo de astrocitos, así como su modulación por 2-AG y por inhibidores de la MAGL estableciendo los receptores y las vías de señalización implicadas. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 64 65 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez III. MATERIAL Y MÉTODOS EXPERIMENTALES Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 66 M at er ia l y M ét od os 67 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos 1. MATERIAL 1.1 REACTIVOS 1.1.1 Cultivos celulares - Dulbecco´s modified Eagle´s Media (DMEM, Lonza Ibérica S.A. Barcelona, España) - Tampón fosfato salino (PBS, Gibco-Invitrogen S.A. Barcelona, España) - Suero fetal bovino (FBS Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) - Suero de caballo (HS, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) - Penicilina/estreptomicina (Gibco-Invitrogen S.A. Barcelona, España) - Poly-D-Lisina (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - Tripsina-EDTA (Gibco-Invitrogen S.A.; Barcelona, España) - Citosina arabinósida AraC (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España) - Azul de Tripán (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) 1.1.2 Procesamiento del tejido -Paraformaldehído (Merck, Darmstadt, Alemania) -Sacarosa (Merck, Darmstadt, Alemania) -Tissue-Teck ® (Sakura, Zoeterwoude, Holanda) -Solución crioprotectora (polivinilpirrolidona 40 (PVP-40), sacarosa, polietilenglicol 400 y PB). -Agar (Conda, Madrid, España) 1.1.3 Inmunocitoquímica inmunohistoquímica y otras tinciones - Tampón fosfato salino (PBS, Gibco-Invitrogen S.A. Barcelona, España) Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 68 M at er ia l y M ét od os -Tritón X-100 (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - Metanol (Merck, Darmstadt, Alemania) - Paraformaldehído (Merck, Darmstadt, Alemania) - Peróxido de hidrógeno (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - Suero normal de cabra (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) - Suero normal de caballo (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) - Suero normal de conejo (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) - Complejo avidina-biotina peroxidasa (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) -3,3-Diaminobenzidina tetrahidrocloruro (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - Xileno (Merck, Darmstadt, Alemania) - Etanol (Merck; Darmstadt, Alemania). - DePeX® (AMS Biotechnology, Oxon, Reino Unido) - Mowiol (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Carbonato de litio (Merck; Darmstadt, Alemania). -Alumbre de cromo (Panreac Química S.A.U.; Barcelona, España) 1.1.4 Inmunodetección por separación electroforética de proteínas (western- blot) - Tampón RIPA pH 7.6 (10% glicerol, 1% NonideT P-40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) - Inhibidores de proteasas “Complete Mini” (Roche Diagnostics, S.L., Manheim, Alema nia) 69 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos - Ácido okadaico (Calbiochem; Darmstadt, Alemania). - Aprotinina (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Benzamidina HCl (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Ditiotreitol (DTT; Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Fenil-metil-sulfonil-fluoruro (PMSF; Boehringer Mannheim; Mannheim, Alemania). - Leupeptina (Boehringer Mannheim; Mannheim, Alemania). - Pirofosfato sódico (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España) - Hidróxido sódico (Merck; Darmstadt, Alemania). - Ortovanadato sódico (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Patrón de peso molecular de proteínas (BioRad; Hercules, CA, EEUU). - Membrana de nitrocelulosa (Amersham Biosciences Europe; Barcelona, España). - Persulfato amónico (APS) (BioRad; Hercules, CA, EEUU) - TEMED (BioRad; Hercules, CA, EEUU). - Tris base (Roche Diagnostics, S.L.; Mannheim, Alemania). - Glicina (PanReac, Alemania) - Glicerol (PanReac, Alemania) - Tween-20 (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Dodecil sulfato sódico (SDS) (USB, Cleveland, Ohio, EE.UU.) - Azul de Bromofenol (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - β-Mercaptoetanol (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - Acrilamida al 30% (BioRad, CA, EE.UU.) Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 70 M at er ia l y M ét od os - Ácido clorhídrico (Merck, Darmstadt, Alemania) - Leche desnatada en polvo (PanReac AppliChem, Barcelona, España) - Metanol (Merck, Darmstadt, Alemania) - Solución de bloqueo (LI-COR Biotechnology, Germany) - Solución de stripping NewBlot IR Stripping (LI-COR Biotechnology, Germany) - Ácido p-cumárico (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Luminol (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Peróxido de hidrógeno (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Reactivo de Bradford (BioRad POWER-PAC300, CA, EE.UU.) - Enzima Condroitinasa ABC de Proteus vulgaris (Sigma-Aldrich; Saint Louis, Missouri, USA) -Tampón condroitinasa (50 Mm Tris Ph8, 60Mm acetato sódico, 0,02% BSA) 1.1.5 Extracción de ARN, transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polime rasa - β-Mercaptoetanol (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - Kit de extracción RNeasy® (Qiagen, Manchester, Reino Unido) - QIAzol ® (Qiagen, Reino Unido) - Etanol (Merck; Darmstadt, Alemania). - Cloroformo (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - Desoxirribonucleasa I (DNasa I; (Sigma-Aldrich Química, S.A., Madrid, España) - EDTA (Gibco-Invitrogen S.A. Barcelona, España) - Sistema de transcripción inversa (Promega Biotech Ibérica, S.L., Madrid, España) 71 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos - Kit de alta capacidad R&D biosystems - Power SYBR® Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) 1.2 COMPUESTOS UTILIZADOS PARA EL DESARROLLO DE MODELOS ANIMALES DE EM - Cepa Daniel (DA) del virus de Theiler, cedido por el Dr. Moses Rodríguez (Departamen to de Inmunología y Neurología de la Clínica Mayo; Rochester, NY, EEUU). - Dulbecco´s modified Eagle´s Media (DMEM, Lonza Ibérica S.A. Barcelona, España) - Adyuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories; Detroit, MI, EEUU). - MOG35-55 (Unidad de Desarrollo de Herramientas Proteicas, CNB, CSIC; Madrid, Espa ña/ ImmunoStep SL; Salamanca, España). - Mycobacterium tuberculosis H37 RA (Difco Laboratories; Detroit, MI, EEUU). - Toxina pertussis (Bordetella pertussis) (Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, Espa¬ña). 1.3 DROGAS Y TRATAMIENTOS 1.3.1 Para los estudios in vitro 1.3.1.1 Citoquinas - TGF-β1 humana (Peprotech, Londres, Reino Unido) 1.3.1.2 Cannabinoides, inhibidores de la MAGL y antagonistas de los receptores canna binoides - 2-Araquidonoilglicerol (2-AG, Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) - UCM03025 (Cedido por la Profesora Mª Luz López Rodríguez, de la Universidad Com plutense de Madrid, Facultad de Químicas, Departamento de Química Orgánica) - WWL-70 (Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 72 M at er ia l y M ét od os - JZL 184 (Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) - SR14176 (cedido por Sanofi Recherche, Montpellier, Francia) - AM630 (Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) 1.3.1.3 Inhibidores de rutas de señalización - SB431542 (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) - LY294002 (Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) 1.3.2 Para los estudios in vivo 1.3.2.1 Cannabinoides, inhibidores de la MAGL y antagonistas de los receptores canna binoides - 2-Araquidonoilglicerol (2-AG, Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) - UCM03025 (Cedido por la Profesora Mª Luz López Rodríguez, de la Universidad Com plutense de Madrid, Facultad de Químicas, Departamento de Química Orgánica) - AM251(Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) - AM630 (Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) 1.3.2.2 Inhibidores de la ruta de síntesis de CSPGs - 4-metilumbeliferil-β-D-16 xilopiranósido, xilósido (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) - Fluorosamina (Cedido por el Profesor VW Yong, Hotchkiss Brain Institute, Departamen to de Neurociencia Clínica y Oncología de la Universidad de Cálgary, Canadá) 1.3.2.3 Otros - Dimetil-sulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich Química, S.A.; Madrid, España). - Salino (NaCl) 0,9% (Millipore, Alemania) - Isoflurano (Esteve; Madrid, España). 73 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos - Pentobarbital (Dolethal; Cedex, Francia). - BrdU (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) 1.4 KIT DE INFUSIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR Y BOMBAS MINIOSMÓTICAS - Bombas osmóticas tipo 1002 (Alzet, Cupertino, CA, USA) - Kit de infusión cerebral tipo 1 (Alzet, Cupertino, CA, USA) 1.5 TRAZADOR ANTERÓGRADO DE ALTA RESOLUCIÓN BDA - 10.000 MW Amino dextrano biotinilado (Molecular Probes, Eugene, OR, EEUU) Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 74 M at er ia l y M ét od os 1.6 OLIGONUCLEÓTIDOS Las sondas para SYBR® en tiempo real se diseñaron utilizando el software Primer Ex- press (Applied Biosystems, Reino Unido), a partir de las secuencias publicadas en la base de datos del Centro Nacional de Biotecnología (NCBI, EE.UU.) y fueron suministradas por Inte- grated DNA technologies, Iowa, USA. Los nombres y secuencias de las sondas en dirección 5´- 3´de los genes analizados se describen en la siguiente tabla: Tabla1. Cebadores o primers utilizados para la RT-PCR. 75 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos 1.7 MARCADORES (ANTICUERPOS Y OTROS) Tabla 2. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados para western-blot. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 76 M at er ia l y M ét od os Tabla 3. Anticuerpos y otros marcadores utilizados para inmunohistoquímica e inmunocitoquí- mica. 1.8 ENZIMOINMUNOENSAYO EN FASE SOLIDA (ELISA) - Kit anti Neurocán de rata MBS 450382 (MyBiosource) 77 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos 1.9 EQUIPOS - Actímetro (Activity Monitor System Omnithech Electronics, Inc., Columbus, OH, EE.UU.) - Criostato (Leica Microsystems CM1900, Barcelona, España) - Microscopio óptico (Carl Zeiss Microscopy, LLC, EE.UU.) - Miroscopio confocal Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Alemania) - Microscopio de fluorescencia invertido (Leica Microsystems, GMBH; Wetzlar, Alema nia). - Equipo electroforético (BioRad POWER-PAC300, CA, EE.UU.) - Sonicador (Sonics & Materials Inc, Vibra Cell, Danbury, CT, EE. UU) - Centrífuga (Hettich Zentrifugen EBA 12, Tubingen, Alemania) - Campana de flujo laminar (Steril, Mazzo di Rho, MI, Italia) - Incubador (RS Biotech Galaxy S, Scotland, Reino Unido) - Termociclador (MJ Research PTC-100, Watertown, MA, EE.UU.) - Sistema de PCR a tiempo real 7500 (Applied Biosystems, Reino Unido). - Escáner GS-800 (BioRad; Hercules, CA, EEUU). - Espectrofotómetro Nanodrop® (Nanodrop Technologies, EEUU). - Odyssey® CLx Imaging System (LI-COR Biotechnology, Germany) - Philips EM208S electron microscope - Espectofotómetro Multisckan FC (Thermofisher, Massachusetts, USA) - Vibratomo VT1000S (Leica Microsystems, Alemania) Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 78 M at er ia l y M ét od os - HPLC unido a espectroscopia de masas (LC-MS). Instrumento Agilent 1200 LC-MSD VL (Santa Clara, USA) 2. MÉTODOS EXPERIMENTALES 2.1 ANIMALES Para la experimentación in vivo, fueron utilizados ratones hembra Mus musculus de la cepa SJL/J de 6-8 semanas de edad (Harlan Laboratories; Barcelona, España) para desarrollar el modelo de TMEV-IDD. Para los experimentos realizados en el modelo de EAE, se utilizaron ratones hembra de la cepa C57BL/6 de 6-8 semanas (Harlan Laboratories; Barcelona, España). Los animales tuvieron acceso a agua y comida ad libitum, y fueron mantenidos en el animalario del Instituto Cajal (CSIC) en condiciones controladas de temperatura (22 oC), en un ciclo diario de luz/oscuridad de 12 horas, en jaulas con enriquecimiento ambiental. Para la experimentación in vitro fueron utilizadas ratas postnatales entre P0-P2 de la cepa Wistar para el desarrollo de cultivos primarios mixto y de astrocitos. Todos los experimentos se han realizado según la regulación del gobierno y la Unión Europea (Decreto 53/2013 BOE nº34 y Comunidad de Madrid: ES280790000184). El comité de ética sobre experimentación animal del Instituto Cajal (CSIC) aprobó todos los experimentos realizados en esta Tesis doctoral. El servicio de Animalario del Instituto Cajal cumple todas las recomendaciones so- bre alo¬jamiento del convenio del Consejo de Europa ETS 123 y la normativa vigente sobre Experimenta¬ción y Protección de los Animales utilizados en Experimentación y otros Fines Científicos reflejada en el RD 53/2013 y la Ley 6/2013. 2.2 MODELOS ANIMALES DE EM 2.2.1 Modelo de encefalomielitis murina desmielinizante inducida por el virus de Thei- ler (TMEV-IDD) El virus de Theiler (cepa DA), cedido por el Dr. Moses Rodríguez (Clínica Mayo; Roches¬ter, NY, EEUU), fue inoculado intracranealmente en el hemisferio cerebral derecho en ratones de la cepa susceptible SJL/J, a una dosis de 2 x 106 unidades formadoras de placa (ufp) en 30 μl de 79 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos medio DMEM enriquecido con 5% de suero fetal de ternero (FCS, del inglés Fetal calf serum) (Lledo, Borrell et al. 1999). Los ratones Sham fueron inoculados sólo con vehículo (DMEM + 5% FCS). La evolución de estos animales se controló periódicamente hasta su sacrificio. 2.2.1.1 Diseño experimental Una vez iniciada la sintomatología, evaluada mediante el test de la caja de actividad, y que tuvo lugar entre los 70-75 días post-infección (dpi), se procedió a tratar a los ratones con inhibidores de la síntesis de los CSPGs; xilósido (120 mg/kg) o fluorosamina (50 mg/kg) durante 10 días consecutivos por vía intraperitoneal (i.p.) o con sus respectivos vehículos (DMSO/PBS) y salino al 0,9%. Con el fin de evaluar el potencial terapéutico del endocannabinoide 2-AG en el modelo de TMEV-IDD una vez comenzados los síntomas motores, se procedió a administrar por vía i.p. un inhibidor reversible de su enzima de hidrólisis MAGL, el compuesto UCM03025 (5 mg/ kg) o bien el vehículo (DMSO/salino) durante 10 días consecutivos. En los experimentos en los que se utilizaron antagonistas del receptor CB1 (AM251, 2 mg/kg en PBS) o del receptor CB2 (AM630, 2 mg/kg en PBS), los animales fueron tratados i.p. con los antagonistas 30 minutos antes de la administración de UCM03025. Con el fin de determinar si el tratamiento con el in- hibidor de la MAGL podría afectar el proceso de remielinización un grupo de animales fueron tratados de la misma manera, durante 10 días con el compuesto UCM03025 (5 mg/kg) y se mantuvieron sin tratamiento durante los 20 días consecutivos posteriores sacrificándose a los 105 dpi tal y como muestra la Figura 13. Para determinar las células proliferativas mediante histología se procedió a administrar a los ratones BrdU, 50 mg/kg i.p. diariamente durante los 10 días de tratamiento junto con el UCM03025 o con el correspondiente vehículo. Para evaluar el efecto del 2-AG administrado de manera directa y continua en el ventrí- culo lateral de los ratones se usó un kit de infusión intracerebroventricular mediante catéter e implantación de minibombas osmóticas una vez comenzada la sintomatología clínica siguien- do el tratamiento durante 10 días. La eficacia terapéutica de los compuestos se analizó evaluando las deficiencias motoras de los animales mediante el test de la caja de actividad una vez finalizados los tratamientos, a Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 80 M at er ia l y M ét od os los 80-85 dpi y 20 días después, a los 105 dpi. Una vez evaluada la actividad motora se proce- dió al sacrificio de los animales con una sobredosis de anestésico (Pentobarbital 50 mg/kg), se realizó la perfusión y obtención del tejido para su posterior análisis. En cada experimento se utilizaron 5-6 animales por grupo en cada tiempo y tratamiento. Se llevaron a cabo dos experimentos independientes para el estudio del efecto terapéutico del compuesto UCM03025. Figura 13 Diseño experimental en el modelo de TMEV-IDD. 2.2.1.2 Evaluación de la función motora (caja de actividad) Para evaluar las deficiencias motoras generadas en los ratones infec¬tados con el virus de Theiler, se utilizó la prueba de la caja de actividad motora o actímetro (Figura 14; Activity monitor System Omnitech electronics, Inc.; Columbus, OH, EEUU), introduciendo a los anima- les en una caja de metacrilato con sensores, que detectan la actividad hori¬zontal del animal (HACTV, exploración espontánea) y la actividad vertical (VACTV, compromiso de las extremi- dades inferiores) como el número de interrupciones del haz del láser del sensor, durante dos ciclos conse¬cutivos de 5 minutos cada uno. Los resultados se analizaron con el software Di- giscan. El porcentaje de deficiencias motoras se calculó comparando la actividad motora regis- trada antes y después del tratamiento de cada animal y se analizó en relación al grado de afec- tación motora del animal infectado con el virus de Theiler y tratado con vehículo. 81 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos Figura 14 Esquema del actímetro y localización de los sensores en la caja. 2.2.2 Modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) Para el desarrollo del modelo de EAE se utilizó MOG35-55, 300 μg/ratón en PBS (100 μl/ ratón), y 800 μg/ratón de Mycobacterium tuberculosis H37 RA en adyuvante incompleto de Freund (100 μl/ratón). El eppendorf que contenía la mezcla de Mycobacterium y adyuvante incompleto de Freund se sonicó con ultrasoni¬do para disolverlo mejor, y se traspasó a un tubo de cristal. A continuación, se añadió gota a gota la MOG35-55, agitando con vortex en todo momento para conseguir una mezcla bien emulsionada. De esta suspensión se inyectó subcu- táneamente 200 μl a cada ratón, en el flanco de la pata, previamente anestesiados mediante inhalación de Isoflurano. Finalizada la inmunización, se inyectó i.p. la toxina pertúsica para am- plificar la respuesta inmune (200 ng/100 μl de PBS por ratón). A las 48 horas post-inmunización se volvió a inyectar la toxina. Los animales CFA fueron inoculados con la misma emulsión que los demás grupos inmunizados, pero sin MOG, y no recibieron la toxina pertúsica. 2.2.2.1 Diseño experimental Una vez comenzada la sintomatología característica del modelo de EAE, evaluada me- diante una puntuación clínica y correspondiente a los 6 días post-immunización (dpI), se dio comienzo al tratamiento. Los ratones fueron tratados diariamente i.p. con el compuesto UCM03025 (5 mg/kg) o el vehículo (DMSO/PBS), según el grupo correspondiente y durante 21 días hasta el día 27 dpI en el que se procedió a su sacrifico (Figura 15). Se utilizaron 5-6 anima- les por grupo. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 82 M at er ia l y M ét od os Figura 15. Diseño experimental en el modelo de EAE. 2.2.2.2 Evaluación de la función motora (puntuación clínica) Los déficits neurológicos de los ratones se examinaron diariamente mediante una es- cala clínica que permitía la valoración de una parálisis creciente (Figura 16). Se otorgaron las siguientes puntuaciones: 0 - No evidencias clínicas neurológicas. 1 - Parálisis total de la cola. 2 - Paraparesia trasera leve. 3 - Parálisis total de una de las extremidades posteriores. 4 - Parálisis total de ambas extremidades posteriores. 5 - Muerte o criterio de punto final. Figura 16. Imágenes representativas de lo s signos clínicos y su correspondiente puntuación de los ratones EAE. 83 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos 2.3 CIRUGÍA E IMPLANTACIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR DE CATÉTERES Y MINI- BOMBAS OSMÓTICAS PARA LA LIBERACIÓN DE 2-AG Con el fin de determinar el efecto directo de la administración de 2-AG en cerebro, se utilizó, en animales infectados con el virus de Theiler, un kit de infusión cerebral (tubo de po- licloruro de vinilo unido a una cánula de infusión de 4 cm de tubo, calibre 28, y jeringa larga de 5mm) junto con minibombas osmóticas del modelo 1002 de la casa comercial Alzet (Cuper- tino, CA, USA), de liberación continua 0.25 µl/h y capacidad de volumen total de 101 µl por bomba (Figura 17). Una vez comenzados los síntomas motores asociados al modelo de TMEV, se anestesió a los ratones mediante inhalación de Isofluorano, se colocaron en un soporte es- tereotáxico y se procedió a la implantación de la cánula y las bombas osmóticas. El catéter fue introducido en el ventrículo lateral derecho según las siguientes coordenadas (AP: -0,6; ML:1; DV:1,8) y se aseguró con pegamento. Las bombas osmóticas que contenían 2-AG (5 mg/kg) o el vehículo de las bombas (DMSO/Etanol/PBS) fueron implantadas de manera subcutánea en el lomo de los ratones Sham o infectados con el virus de Theiler y conectadas al catéter directo al ventrículo. Las bombas liberaron 2-AG o vehículo de manera continua durante 10 días, desde los 75 dpi hasta los 85 dpi momento en el que se procedió al sacrificio de los ratones. En el caso de los animales que se mantuvieron hasta los 105 dpi se retiró la bomba osmótica una vez finalizado el tratamiento a los 85 dpi. Figura 17 Esquema del sistema de infusión y bombas osmóticas Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 84 M at er ia l y M ét od os 2.4 TRAZADOR ANTERÓGRADO BDA Aquellos ratones tratados desde los 75 dpi hasta los 85 dpi y que fueron mantenidos hasta los 105 dpi, se anestesiaron con isofluorano 15 días antes de su sacrificio y se colocaron en un soporte estereotáxico para inyectarles de manera bilateral el trazador de alta resolución anterógrado BDA (10.000 MW dextrano amino biotililado: Molecular Probes, Eugene, OR) ad- ministrando 1,2 µl de un 10% de solución de BDA diluida en PBS. Como muestra la Figura 18, el trazador se inyectó en ambas cortezas motoras con una aguja Hamilton de 5 µl profundizando 1mm en la corteza (4 inyecciones, 0,3 µl por inyección) en un perímetro definido coronalmente por Bregma (1,7mm a -0,7mm y 0,5mm a 1,5mm) desde la sutura Sagital. Tras la inoculación del trazador, se mantuvo la aguja durante 3-5 min antes de su retirada lentamente (Rolls, She- chter et al. 2008). Figura 18. Esquema de la inyección del trazador anterógrado BDA y zona de análisis en médula espinal. 2.5 ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICO 2.5.1 Procesado del tejido Los ratones fueron anestesiados por inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/ kg). Se perfundieron transcardíacamente con salino 0,9%, y a continuación, se extrajeron las médulas espinales por extrusión con salino. Parte de la sección cervical de la médula espinal fue congelada inmediatamente y guardada a -80 oC para su posterior utilización para el aná- 85 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos lisis de western-blot y RT-PCR. La sección cervical restante se fijó con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS 0,1 M a 4oC en agitación durante toda la noche. Posteriormente, se crioprotegió con soluciones crecientes de sacarosa (15% y 30%) diluida en PBS 0,1 M y se congeló a -80 oC hasta su posterior utilización. Secciones de 30 μm de grosor fueron obtenidas mediante criostato tras embeber el tejido en resina O.C.T. y fueron almacenadas a -20 oC en una solución crioprotectora, hasta su utilización. En el caso del análisis del trazador anterógrado BDA, la médula espinal cervical fue embe- bida en Agar (Conda, Madrid, España) tras ser fijada en PFA 4% a 4oC en agitación durante toda la noche y se obtuvieron secciones de 50 μm de grosor mediante el vibratomo Leica VT1000S. 2.5.2 Inmunohistoquímica 2.5.2.1. Marcaje con inmunofluorescencia Las secciones cervicales de las médulas espinales (30 μm de grosor) en flotación se la- varon 3 veces durante 10 minutos, con PB 0,1 M. Se permeabilizó el tejido con 3 lavados de 10 minutos con PBT (PB 0,1 M + 0,1% Tritón X-100). Para evitar uniones inespecíficas, se blo- quearon con PBT + 5% de suero animal, y se incubaron con el anticuerpo primario en tampón de bloqueo durante toda la noche a 4 oC en agitación. Tras dicha incubación, las secciones se lavaron 3 veces durante 10 minutos con PBT, y se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario correspondiente. Una vez finalizado este paso, se procedió a lavar 3 veces durante 10 minutos con PB 0,1 M y se in¬cubaron con DAPI durante 10 minutos. Para finalizar, los cor- tes se volvieron a lavar con PB y fueron montados sobre portaobjetos con una solución 1:1 de glicerol y PB 0,1 M, o Mowiol. 2.5.2.2. Marcaje con diaminobenzidina (DAB) Las secciones cervicales en flotación de las médulas espinales (30 μm) se lavaron 3 ve- ces durante 10 minutos, con PB 0,1 M. A continuación, se procedió a inhibir la peroxi¬dasa endógena durante 1 hora con una solución de 50 % metanol y 1,66 % H2O2 en PB 0,1 M, a temperatura ambiente y en oscuridad. Se permeabilizó el tejido con 3 lavados de 10 minutos con PBT, y posteriormente, se bloquearon las uniones inespecíficas con el tampón de bloqueo (PBT + 5 % de suero animal). Una vez finalizado este paso, se incubaron con el anticuerpo pri- Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 86 M at er ia l y M ét od os mario en tampón de bloqueo durante toda la noche a 4 oC en agitación. Tras dicha incubación, las secciones se lavaron 3 veces durante 10 minutos con PBT para eliminar el exceso de anti- cuerpo primario y se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado a biotina y diluido en tampón de bloqueo. A continuación, se procedió a lavar 3 veces durante 10 minutos con PBT, y a incubar el tejido con avidina-peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente y oscuridad. Se repitieron los 3 lavados de 10 minutos cada uno con PB 0,1 M y se procedió con el revelado con DAB (diaminobenzidina al 0,025 % y H2O2 al 0,003 % en PB 0,1 M). Se lavaron las secciones 3 veces durante 10 minutos con PB 0,1 M y se montó el tejido sobre portaobjetos gelatinizados al 2 %. Una vez secados a temperatura ambiente, se procedió a deshidratar el tejido, sometiéndolo a pases de alcohol crecientes (70 %, 96 %, 100 % por duplicado) y por xileno (por duplicado), durante 10 minutos por solución. Finalmente, se cubrieron los cortes de los por¬taobjetos con DePeX® y se colocó el cubreobjetos. Para el análisis histológico del trazador anterógrado BDA se utilizó un anticuerpo conju- gado a la avidina-peroxidasa junto con el cromógeno DAB. En todos los casos la especificidad de los anticuerpos fue confirmada omitiendo el anti- cuerpo primario. 2.5.2.3 Hematoxilina/Eosina Para las tinciones de H/E, se montaron las secciones de 30 μm de grosor en portaobje- tos (previamente gelatinizados al 2 %), y se dejaron secar toda la noche. A continuación, se sumergie¬ron los portaobjetos en hematoxilina durante 3 minutos. Una vez pasado este tiem- po, se realizó un lavado con agua para eliminar el exceso de hematoxilina, y se sumergieron los portaobjetos en eosina al 1 % durante 1,5 minutos. Al igual que antes, se procedió a lavar con agua destilada duran¬te 30 segundos. Una vez teñidos los cortes, se sometió a los portaobje- tos a pases en un gradiente creciente de alcoholes: 70 %, 96 %, 100 % (2 veces) y xileno (2 ve- ces), durante 10 minutos cada uno para deshidratarlos. Finalmente, se cubrieron con DePeX® y los cubreobjetos y se dejaron secar. 2.5.2.4 Evaluación de la infiltración celular Se cuantificó la cantidad de infiltrados celulares en médula espinal mediante la tinción 87 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos con H/E. El criterio de cuantificación de la infiltración seguido fue el siguiente (Figura 19): 0 - Sin evidencias de infiltrados celulares. 1 – Infiltrados sólo en meninges. 2 - Número reducido de infiltrados celulares en pa¬rénquima. 3 - Infiltración moderada en sustancia blanca. 4 - Infiltración severa en sustancia blanca. Figura 19. Esquema del criterio de evaluación utilizado para determinar el grado de infiltración celular. 2.5.2.5 Marcaje de Luxol Fast Blue (LFB) Las secciones torácico-lumbares en flotación de las médulas espinales (15 μm de grosor) se lavaron tres veces durante 10 minutos con PB 0,1 M. Las muestras fueron deshidratadas con concentraciones crecientes de etanol, de 70 % a 95 %, y se incubaron en la solución de LFB durante una noche a 56 oC. Al día siguiente, el exceso de tinción se eliminó utilizando etanol Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 88 M at er ia l y M ét od os al 95 %, y las secciones se diferenciaron en una solución de carbonato de litio durante 30 se- gundos. Las secciones se deshidrataron, se aclararon con xileno, se montaron con DePeX® y se colocaron los cubreobjetos. 2.6. MICROSCOPÍA 2.6.1 Microscopía óptica y análisis de imagen Para la adquisición de las imágenes de tinciones con DAB, así como para aquellas teñidas con Hematoxilina/Eosina, se utilizó un microscopio Zeiss acoplado a un sistema de captura de imágenes Nikon de alta resolución. Para el análisis, se utilizaron entre cinco y seis secciones de médula espinal cervical de 5-6 animales por grupo. Para la cuantificación del marcaje se usó el software de análisis de imagen ImageJ (NIH; Bethesda, MD, EEUU), manteniendo el mismo umbral de intensidad para todas las imágenes del mismo ex¬perimento. El resultado se expre- sa como porcentaje del área total marcada. 2.6.2 Microscopía confocal y análisis de imagen En el caso de las imágenes obtenidas de tinciones con fluorescencia, se analizaron entre cinco y seis sec¬ciones de médula espinal cervical por animal, de 5-6 ratones por grupo experi- mental. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal Leica TCS SP5. El área marca- da fue cuantificada con el software de análisis de imagen ImageJ (NIH; Bethesda, MD, EEUU), manteniendo el mismo umbral de intensidad para todas las imágenes del mismo experimento. El resultado se expresa como porcentaje del área total marcada. La cuantificación del número de células marcadas por fluorescencia se evaluó por mm2 del asta ventral de la sustancia blan- ca de la médula espinal cervical. 2.6.3 Microscopía electrónica 2.6.3.1 Procesamiento del tejido para análisis mediante microscopía electrónica de transmisión Los ratones infectados con el virus de Theiler y sacrificados a los 105 dpi fueron aneste- siados mediante inyección intraperitoneal con ketamina/xilacina (80/10 mg/kg) y perfundidos transcardíacamente a temperatura ambiente (20-25 oC) con PBS durante 20 segundos seguido 89 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos de una solución de fijación con un 4% de PFA, 0,2% acido pícrico y 0,1 % de glutaraldehído en tampón fosfato durante 10-15 minutos. A continuación, se sacó la médula espinal de los rato- nes y se postfijó en la misma solución de fijado durante una semana a 4 oC siendo guardadas a 4 oC hasta su posterior utilización. Las secciones de médula espinal cervical se cortaron en vibrátomo con un grosor de 50 µm y se guardaron en PBS a temperatura ambiente. Las secciones se osmificaron en una solu- ción del 1 % de tetróxido de osmio en PBS durante 20 minutos y se deshidrataron en concen- traciones graduales de alcoholes hasta óxido de propileno y fueron embebidas en resina Epon 812. Secciones ultrafinas de 50 nm se colocaron en mallas de níquel y se marcaron con 2,5% de citrato de plomo durante 20 minutos. Las secciones se examinaron mediante un microscopio electrónico Philips EM208S. 2.6.3.2. Análisis semicuantitativo de axones mediante TEM La sustancia blanca de la médula espinal cervical fue evaluada mediante una cámara digital Olympus SIS Morada acoplada al microscopio electrónico Philips EM208S. Se analizaron 1000 axones del asta ventral de la sustancia blanca de la médula espinal de animales Sham o infectados con el virus de Theiler tratados o no con el compuesto UCM03025 (dos animales por grupo). El número de axones desmielinizados y mielinizados fue cuantificado y se calculó el g-ratio de los axones mielinizados. El g-ratio se define como el radio entre el diámetro del axón y el diámetro del axón más la unidad de mielina. Los axones con mielina bien preservada y compacta fueron analizados mediante Image-J (1.43u versión; NIH, USA) dibujando dos diá- metros perpendiculares de cada axón y del axón junto con la mielina. 2.7. TÉCNICA DE INMUNODETECCIÓN POR SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍ- NAS (WESTERN-BLOT) Para la extracción de la proteína de los astrocitos en cultivo, las células se despegaron de las placas de cultivos con 30 μl de tampón de lisis RIPA e inhibidores de proteasas y se pasaron a un tubo Eppendorf. En el caso de la extracción de la proteína de la médula espinal cervical de los animales infectados con el virus de Theiler, el tejido fue sonicado en 500 μl de tampón de lisis RIPA con inhibidores de proteasas. Tras sonicar las muestras, se centrifugaron durante 15 Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 90 M at er ia l y M ét od os minutos a 13.500 rpm a 4 oC para obtener el extracto de proteínas totales. La concentración de proteínas se determinó mediante la reacción de Bradford. Posteriormente, a cada muestra se le añadió tampón de carga Laemli 5X y fueron hervidas durante 5 minutos para desnaturalizar las proteínas. Posteriormente, 30 μg de proteína se separaron electroforéticamente en un gel de acrilamida al 10 ó 12 % y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (90 V durante 70 minutos). En el caso de la detección de los CSPGs, las muestras una vez sonicadas y centrifugadas se resuspendieron en tampón de Condroitinasa y se trataron con la enzima proteasa Condroi- tinasa ABC de la bacteria Proteus vulgaris a una concentración de 0,1U/ml durante 3h a 37 oC. La reacción se paró con 5X del tampón de carga Laemli y fueron hervidas durante 5 minutos. 15 μg de proteína fueron separadas electroforéticamente en geles de acrilamida al 6% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se lavaron 3 veces durante 10 minutos con TBS (solución de Tris Base 25 mM y NaCl 137 mM), y se permeabilizaron con 3 lavados de 10 minutos con TBST (TBS + Tween-20 al 10 %). Posteriormente, se bloquearon las uniones inespecíficas con tampón de bloqueo (5 % de leche desnatada) durante 1-2 horas. A continuación, se incubaron las mem- branas durante la noche a 4 oC con el anticuerpo primario en solución de bloqueo. Tras realizar 3 lavados durante 10 minutos con TBST, se procedió a la incubación de las membranas con el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano y diluido en tampón de bloqueo, du- rante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las membranas y la inmunodetección de las proteínas de estudio se realizó mediante reve¬lado por quimioluminiscencia (con una solución de luminol y ácido p-cumárico). Las membranas que iban a ser reutilizadas con otros anticuer- pos fueron sometidas a un proceso de stripping leve con un tampón de pH 6,8 que contenía glicina, SDS, Tween-20 y agua destilada. Por último, la señal se cuantificó por densitometría mediante un escáner GS-800 de BioRad. En el caso del uso de anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos se utilizó la solu- ción de bloqueo de LI-COR durante 1 hora para la detección de señal mediante Odyssey. Para el proceso de stripping se utilizó el reactivo NewBlot IR Stripping (LI-COR), durante 30 minutos a temperatura ambiente y para visualizar y cuantificar la señal se utilizó el escáner Odyssey® 91 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos CLx Imaging System. 2.8 ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA POR PCR CUANTITATIVA (qPCR) 2.8.1 Extracción del ARN La extracción de ARN de la médula cervical espinal de los animales infectados con el virus de Theiler se llevó a cabo homogeneizando el tejido con QIAzol (QIAgen, Reino Unido) y usan- do el protocolo de extracción de ARN utilizando cloroformo y etanol. El ARN tanto del tejido homogeneizado como de astrocitos primarios en cultivo se extra- jo uti¬lizando el kit de columnas RNeasy (QIAgen, Reino Unido), eliminando la posible conta- minación de ADN degradado con el tratamiento con DNasa I (QIAgen, Reino Unido). La concen- tración de ARN y su pureza fueron valorados por las medidas de A260/A280 realizadas con un espectrofotómetro Nanodrop® (Nanodrop Technologies, EEUU). 2.8.2 Retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) Se usó 1 μg de ARN total, que fue retrotranscrito a ADNc mediante el kit de Transcripción Reversa de Promega (Promega, España) y utilizando secuencias poly-dT. Las secuencias de los cebadores (primers) se detallan en la Tabla 1. La expresión de los genes de estudio por PCR en tiempo real fue detectada usando SYBR Green (Applied Biosystems, Reino Unido), utilizando 1 μl de ADNc y con los primers en una concentración final de 200 nM. Las condiciones de los ciclos de la PCR consistieron en un paso inicial de activación a 50 oC durante 2 minutos, 95 oC durante 10 minutos y 40 ciclos de desnaturalización a 95 oC durante 15 segundos seguidos de periodos de alineamiento y extensión a 60 oC durante 1 minuto. Estos ensayos de PCR se lle- varon a cabo en placas de 96 pocillos utilizando el equipo 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Reino Unido). Cada muestra se analizó en triplicado y la expresión génica se calcu- ló usando el método de 2-ΔΔCt y la expresión relativa se obtuvo calculando el ratio entre los valores obtenidos de cada gen y aquellos del gen control interno. Los resultados están expre- sados como el porcentaje de expresión respecto a los animales Sham. 2.9 CULTIVOS CELULARES Para el desarrollo de los cultivos primarios se utilizaron ratas Wistar postnatales de 0 a 2 Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 92 M at er ia l y M ét od os días de edad criadas en el animalario del Instituto Cajal (CSIC). 2.9.1 Cultivo primario mixto Los cultivos primarios mixtos fueron preparados a partir de encéfalos de ratas P0-P2, des- echando los bulbos olfativos y el cerebelo, siguiendo las modificaciones que Molina-Holgado y cols. (Molina-Holgado, Vela et al. 2002) y (Mecha, Iñigo et al. 2011) realizaron del proto¬colo de (McCarthy and de Vellis 1980). Una vez extraído, el encéfalo se colocó en DMEM frío, y se retiraron las meninges y vasos sanguíneos asociados a ellas. Los encéfalos fueron disgregados mecánicamente con una pipeta Pasteur previamente recubierta con medio, filtrado con una malla de 150 μm de tamaño de poro y las células resultantes fueron resuspendidas en DMEM con 10 % de suero de caballo (HS, del inglés horse serum), 10 % de suero fetal bovino (FBS, del inglés fetal bovine serum) y 1% de penicilina/estreptomicina (DMEM 10:10:1), y sembradas en frascos de 75 cm2 (previa- mente cubiertos con poli-D-lisina, 5 μg/ml). Los frascos se incubaron a 37 oC en condiciones controladas de humedad y 5% de CO2. Tras 7-10 días, se observó una estratificación de células. En el fondo, una monocapa con- fluente de astrocitos, sobre la que se situaban las células O2A (del inglés Oligodendrocyte-type 2 astrocyte), adheridas a ellos. Estas células O2A pueden dife-renciarse a oligodendrocitos o a astrocitos tipo 2, dependiendo del medio de cultivo. Las células microgliales poseen una ad- herencia débil a la monocapa de astrocitos y también pueden estar en suspensión en el medio de cultivo. 2.9.2 Cultivo primario de astrocitos a partir del cultivo mixto Pasados 7-10 días, el cultivo fue agitado a 230 rpm durante 3 horas a 37 oC para levantar las células microgliales y fueron descartadas mediante aspiración. Tras reponer el medio de cultivo (DMEM 10 % FBS,10 % HS,1 % P/S), se mantuvieron las células en agitación durante toda la noche a 280 rpm a 37 oC con el fin de separar los oligodendrocitos de los astrocitos. Una vez descartados los oligodendrocitos por aspiración, se obtuvieron los astrocitos al ser tratados con tripsina (0,05 %) /EDTA (0,02 %) durante 3 minutos a 37 oC. Pasado ese tiempo se agitó enérgicamente el frasco con el fin de levantar los astrocitos y se añadió medio con 93 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos suero para inactivar la enzima tripsina. Los astrocitos se sembraron a una densidad de 1 x 105 células/cm2 en el caso de los ensayos para extracción proteica y 5 x 104 células/cm2 para inmu- nocitoquímica, en medio DMEM 5 % FBS, 5 % HS, 1% P/S sobre placas tratadas con 0,1% Poli- D-lisina y lavadas con agua Mili-Q. Transcurridas 3 horas se cambió el medio de cultivo a un medio enriquecido en AraC (10 µM) y pasadas 72h se realizaron los ensayos correspondientes. En todos los casos, una hora antes de la administración de cualquier tratamiento, las células fueron sometidas a un medio libre de suero. 2.10. ENZIMOINMUNOENSAYO EN FASE SÓLIDA (ELISA) Para la determinación del proteoglicano Neurocán, se guardaron a -80 oC los sobrena- dantes de los cultivos de astrocitos tras 24 horas del tratamiento correspondiente. Se utilizó el kit comercial de detección de Neurocán (MBS 450382 My Biosource), siguiendo las indicacio- nes del fabricante. En primer lugar, se añadió a la placa de ELISA 100 μl de las diluciones están- dar y de las muestras y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se retiró el líquido de los pocillos y sin lavar se añadió 100 μl del buffer de detección A incubándo- se durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras aspirar el volumen se procedió a lavar 3 veces con 300 μl de solución de lavado y se añadió 100 μl del buffer de detección B incubándose durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras ese tiempo se aspiró y lavó cada pocillo hasta 5 veces y se añadió 50 μl de la solución de sustrato incubando durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras añadir 50 μl de la solución stop para detener la reacción, se procedió a obtener las medicio¬nes de densidad óptica de cada pocillo en el Multiscan a una absorbancia de 450 nm. La sensibilidad del kit de Neurocán fue de 0,055 ng/ml, el rango de detección 0,156-10 ng/ml y los coeficientes de variabilidad (CV) intra-ensayo e inter-ensayo fueron 10 % y 12 %, respectivamente. 2.11. CUANTIFICACIÓN DE 2-AG EN TEJIDO (HPLC UNIDO A ESPECTROSCOPÍA DE MA- SAS LC-MS) El tejido se pesó y se disgregó en hielo con un homogeneizador en un volumen de 2:2:1 de cloroformo/metanol/Tris HCl 50 Mm (pH 7,5), 2ml por cada 80-120 mg de tejido. Se utilizó un estándar de d8-2AG (200 pmol o 400 pmol) para realizar el ensayo. Se separó la fracción orgánica de la acuosa mediante centrifugación (6000g, 2 minutos) y la fracción orgánica se Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 94 M at er ia l y M ét od os pasó a un tubo nuevo y se dejó secar y evaporar. A continuación, se reconstituyó en 50 µl de acetonitrilo y se analizó mediante HPLC acoplada a espectroscopía de masas (LC-MS). La es- pectroscopía de masas se llevó a cabo usando el sistema Agilent 1200LC-MSD VL. La separación LC se realizó usando una columna Zorbax Eclipse Plus C18 (5 µm, 4,6 mm x 50 mm). El gradiente de elución de la fase móvil consistía en A (95:5 agua: acetonitrilo) y B (95:5 acetonitrilo: agua), con un 0,1% de ácido fórmico como modificador del solvente. El gradiente (tasa de flujo de 0,5 mL/min) comenzó a 0% B (durante 5 minutos) y aumentó de manera lineal hasta 100% B durante 45 minutos y descendió a 0%B durante 10 minutos antes de equilibrarse durante 5 minutos con un gradiente isocrativo de 0%B. El análisis de MS se realizó usando una fuente de ionización de electrospray. El voltaje del capilar se estableció en 3.0 kV, y el voltaje de fragmentación en 70 V. La temperatura del gas de secado fue de 350 oC con una velocidad de flujo de 10 L/min, y la presión del nebulizador fue de 20 psi. El análisis de LC-MS se realizó mediante la monitorización de iones selectivos en modo positivo. Las fracciones se cuantificaron midiendo el área bajo el pico y normalizándolo al estandar. Los niveles absolutos de 2-AG se estimaron en comparación con el estándar deu- terizado. 2.12 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos se representan como la media aritmética ± error estándar de la media (SEM, del inglés Standard error of the mean) salvo los referidos a la puntuación clínica en el modelo de EAE que se representan como la media aritmética ± desviación estándar de la media (DEM). Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa IBM SPSS Statistics 24 (SPSS Inc- IBM; Chicago, IL, EEUU). Para hacer comparaciones entre dos grupos se utilizó la prueba para- métrica t de Student, y si la comparación era de más de dos grupos, se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) de una vía con las pruebas a posteriori de Bonferroni o Tuckey. En aquellos casos en los que la prueba de homogeneidad de varianzas (estadístico de Levene) fue signi- ficativa (menor de 0,05), se empleó el test no paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido de una comparación por parejas con el test de U de Mann-Whitney. Para el análisis de las diferencias entre los g-ratios evaluados mediante microscopía electrónica se utilizó un Kruskal-Wallis ANO- VA de una vía y las comparaciones múltiples fueron analizadas siguiendo el método de Dunn. 95 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez M aterial y M étodos Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 96 Re su lta do s 97 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados IV. RESULTADOS Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 98 Re su lta do s 99 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados PARTE 1. FISIOPATOLOGÍA Y ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE CSPGs EN LA FASE CRÓNICA DEL MODELO DE TMEV-IDD. 1.1 Fisiopatología de la encefalomielitis murina desmielinizante por infección con el virus de Theiler. El modelo murino de EM por infección con el virus de Theiler modeliza la variante prima- ria progresiva de la enfermedad y presenta una patogenia similar a la que subyace en la EM. En dicho modelo, los ratones infectados desarrollan una patología crónica desmielinizante cuyos síntomas clínicos de disfunción motora comienzan entre los días 60-80 post-infección. Con el objetivo de valorar esos déficits motores, ratones hembra SJL/J fueron infectados intracranealmente con la cepa DA del virus de Theiler y se procedió a su valoración motora en la fase crónica de la enfermedad mediante la caja de actividad. Como se observa en la Figura 20, los animales infectados con el virus de Theiler presentaron déficits motores significativos, en comparación con los animales control o Sham, en la fase crónica del modelo, a los 85 dpi, evidenciados mediante la actividad horizontal (A) y la actividad vertical (B). Figura 20. Evaluación de la función motora mediante el test de la caja de actividad en la fase crónica de ratones TMEV-IDD. La inoculación intracerebral con el virus de Theiler genera, en ratones de la cepa susceptible SJL/J déficits motores a los 85 dpi, mostrados mediante (A) disminución de la actividad horizontal y (B) disminución de la actividad vertical. ***p≤0,001 vs SHAM. El componente inflamatorio es determinante en la EM, así como en sus modelos ex- perimentales. En la fase crónica del modelo de TMEV-IDD se detectan infiltrados de células mononucleares, entre las que se incluyen monocitos, linfocitos T y linfocitos B en la sustancia blanca de la médula espinal coincidiendo con una activación de la microglía, como respuesta Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 100 Re su lta do s de la inmunidad innata (Oleszak, Chang et al. 2004). Nos propusimos por tanto evaluar y confir- mar la presencia de infiltrados inflamatorios, así como el perfil de activación de la microglía en nuestro modelo. Por último, se llevaron a cabo marcajes para mielina y axones para confirmar la presencia de desmielinización y daño axonal. Todos los análisis que se muestran a continua- ción fueron realizados en la médula espinal de los animales de estudio ya que es el área del SNC más afectada en las fases crónicas del modelo de TMEV. Como se observa en la Figura 21, el estudio histopatológico mostró infiltrados leucocitarios en la sustancia blanca de la médula espinal de los animales infectados (A), así como una fuerte reactividad microglial evaluada mediante el anticuerpo de Iba-1 (B). Del mismo modo se observaron focos de desmielinización y pérdida axonal analizados mediante marcadores de Neurofilamento-H (C) y marcadores para mielina (MBP) (D). Figura 21. Estudio histopatológico de inflamación, pérdida axonal y desmielinización en la médula espinal en la fase crónica de los ratones TMEV-IDD. Microfotografías representativas de secciones transversales de médulas espinal cer- vical de animales infectados con el virus de Theiler donde se observa infiltración leucocitaria (A; Hematoxilina/eosina), reactividad microglial (B; inmunohistoquímica para Iba-1), pérdida axonal (C; Neurofilamento-H) y zonas desmieliniza- das (D; evaluadas mediante el anticuerpo de MBP). Barra de calibración 100 y 20 µm. 1.2 Análisis de la expresión de CSPGs en médula espinal en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD. Junto con la inflamación que acontece en el modelo de TMEV-IDD y en la EM, se produ- cen procesos de desmielinización y daño axonal en las llamadas placas escleróticas. En estas zonas, se generan cicatrices gliales donde los CSPGs se acumulan generando un ambiente no permisivo que impide la regeneración axonal y la remielinización (Lau, Keough et al. 2012, 101 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Siebert and Osterhout 2011). La astroglía forma parte de la mencionada cicatriz glial y son las principales células responsables de la síntesis de los CSPGs en situación de daño (Susarla, Laing et al. 2011). Debido a la gran importancia generada en torno a estas moléculas que impiden los mecanismos de reparación, se llevaron a cabo marcajes, tanto a 85 como a 105 dpi, para evaluar astrogliosis (GFAP y Vimentina) (Karimi-Abdolrezaee and Billakanti 2012), así como un estudio de la expresión de los CSPGs mediante uso del anticuerpo CS-56, el cual detecta las cadenas GAGs de los CSPGs. Como se observa en la Figura 22 A y B, el análisis inmunohistoquímico y su cuantificación en la médula espinal de los ratones infectados con el virus de Theiler, mostró una prominente astrogliosis que resultó significativa al analizar el área marcada para GFAP a los 85 dpi. De igual manera, el área marcada para Vimentina, marcaje característico de astrocitos reactivos, se en- contró significativamente aumentada tanto a los 85 como a los 105 dpi. La astrogliosis descrita se acompañó de una acumulación de CSPGs analizados mediante el anticuerpo de CS-56, cuyo aumento fue significativo en ambos tiempos. Además, se observó que en aquellas zonas don- de se producía una mayor expresión y acumulación de proteoglicanos, coincidían con focos de desmielinización, en donde la ausencia de marcaje de la proteína de mielina MBP era evidente (Figura 22A). Así mismo, los astrocitos reactivos marcados con el anticuerpo de Vimentina fue- ron positivos para el CS-56 confirmando que aquellos astrocitos reactivos expresaban CSPGs (Figura 22C). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 102 Re su lta do s Figura 22. La astrogliosis que se observa en la médula espinal y en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD está asociada a una acumulación de CSPGs y a procesos de desmielinización. (A) Fotomicrografías representativas de secciones transversales de médulas espinal cervical de 30µm de grosor donde se observan astrocitos marcados para GFAP, Vimentina y CS-56 y que muestran que la astrogliosis detectada coincide con depósitos de CSPGs en zonas des- mielinizadas. (B) Cuantificación del área total marcada para GFAP, Vimentina y CS-56 donde se observa que hay un incremento de la reactividad astroglial, así como de la expresión de CSPGs marcados con el anticuerpo CS-56 en dos tiempos (85 y 105 dpi) de la fase crónica del modelo de TMEV-IDD en comparación con los ratones Sham. (C) Fotomi- crografía representativa de la sustancia blanca de médula espinal cervical marcada para CS56 y Vimentina donde se observa que aquellos astrocitos reactivos Vimentina positivos expresan CSPGs. Los datos se representan como la media ± SEM: **p<0,01; *p<0,05 vs sham. Barra de calibración= 100 μm, 50μm. La línea punteada delimita la sustancia gris de la blanca de la médula espinal, así como las zonas desmielinizadas. 103 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Se ha descrito que los CSPGs más abundantes dentro del SNC son el Neurocán y el Bre- vicán, de la familia de los lecitanos (Yamada, Watanabe et al. 1994). Además, existen otros CSPGs, entre los que se incluye el Fosfacán, proteoglicano no perteneciente a la mencionada familia. Para profundizar en el estudio de expresión de los CSPGs en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD, quisimos evaluar la expresión a nivel de ARN mensajero, así como el nivel pro- teico de los distintos proteoglicanos, Brevicán, Neurocán y Fosfacán, a los 85 y 105 dpi. Como se observa en la Figura 23A, la expresión relativa del ARN mensajero de los proteoglicanos Brevicán y Fosfacán estaba significativamente aumentada tanto a los 85 como a los 105 dpi, observándose un incremento en el caso del Neurocán únicamente a los 105 dpi. El análisis a ni- vel proteico de los diferentes CSPGs evaluados mediante la técnica de western-blot indicó que, si bien el análisis de manera individual de cada proteoglicano no resultó ser significativo, su análisis sumatorio alcanzó significancia estadística a los 85 dpi y no a los 105 dpi (Figura 23B). Figura 23. Análisis de la expresión de diferentes CSPGs en la médula espinal cervical y en la fase crónica del mode- lo de TMEV-IDD. Análisis de (A) la expresión de ARN mensajero y (B) proteína de los CSPGs Neurocán, Brevicán y Fosfacán mediante RT-PCR y western-blot respectivamente a 85 y 105 dpi. Se observa un aumento de la expresión génica de Brevicán y Fosfacán tanto a 85dpi como a 105 dpi, incrementándose Neurocán únicamente a 105 dpi. Observamos aumento significativo de los CSPGs a nivel proteico cuando los evaluamos de manera conjunta. Los datos se representan como la media ± SEM: ***p<0,001 **p<0,01; *p<0,05 vs sham. La significancia en color rojo señala en análisis de los CSPGs en conjunto. ns: no significativo. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 104 Re su lta do s Los astrocitos reactivos son los principales responsables de sintetizar Brevicán, Neurocán y Fosfacán en situación de daño, mientras que los macrófagos vasculares, así como la microglía reactiva y los OPCs aumentan la expresión de Versicán y NG2. Con el fin de identificar las célu- las responsables de la síntesis de los CSPGs en nuestro modelo se llevaron a cabo dobles mar- cajes de CS-56 junto con GFAP e Iba-1. El resultado obtenido indicó que, a nivel de la sustancia blanca de la médula espinal cervical, las células positivas para el marcador de CSPGs (CS-56) fueron astrocitos GFAP+ resultando negativos para microglía (Iba1+) (Figura 24). Figura 24. Las células que expresan CSPGs en la médula espinal de los ratones TMEV-IDD corresponden a astro- citos y no a microglía. Fotomicrografías representativas de secciones transversales de médulas espinal cervical de 30µm de grosor donde se muestran astrocitos marcados para GFAP, positivos para el anticuerpo de CS-56 y microglía marcada con el anticuerpo de Iba-1 negativa para CS-56. Barra de calibración= 25μm. 105 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados RESUMEN PARTE 1: Los animales susceptibles SJL/J infectados con el virus de Theiler presentaron déficits motores significativos en la fase crónica del modelo. Además, se observó infiltración leuco- citaria a nivel de médula espinal, así como reactivación microglial y astroglial asociada a un aumento de expresión de CSPGs, en zonas desmielinizadas. Las células que colocalizaron con la expresión de CSPGs fueron astrocitos y no microglía. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 106 Re su lta do s 107 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados PARTE 2. ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE CSPGs EN LA FASE CRÓNICA DEL MODELO DE TMEV-IDD. Debido a que la alteración de la matriz extracelular y la acumulación de CSPGs en zonas de lesión impiden los procesos de regeneración (Dyck, Alizadeh et al. 2015), se han generado nuevos estudios para el desarrollo de terapias que disminuyan la síntesis y degraden los CSPGs para promover así los procesos de reparación y remielinización. Han sido varios los métodos utilizados para reducir la expresión de CSPGs y/o degradar los ya liberados a la ECM en situaciones de daño. Los tratamientos locales con la enzima chon- droitinasa ABC (Bradbury, Moon et al. 2002, Karimi-Abdolrezaee, Schut et al. 2012, Siebert and Osterhout 2011) o sistémicos con xilósido y fluorosamina han mostrado resultados significati- vos al reducir la acumulación de CSPGs en lesiones desmielinizadas, promoviendo la remielini- zación y la regeneración axonal en modelos de desmielinización por lisolecitina y cuprizona, así como en modelos de daño agudo en médula espinal y en el modelo de EAE (Keough, Rogers et al. 2016, Lau, Keough et al. 2012, Rolls, Shechter et al. 2008). Con el fin de evaluar la relevancia de la producción de CSPGs en la sintomatología clí- nica asociada al modelo de TMEV-IDD, quisimos incidir en la ruta de síntesis de los mismos mediante la administración sistémica, en los animales infectados, de los compuestos xilósido y fluorosamina. 2.1 Inhibición farmacológica de la expresión de CSPGs por xilósido en el modelo de TMEV-IDD. El glicósido 4-metilumbeliferil-beta-D-xilopiranosido o xilósido supone una herramienta de gran utilidad para comprobar el efecto inhibitorio de los CSPGs en los procesos de repara- ción y regeneración en situación de daño del SNC. Este compuesto impide la unión del grupo xiloso por parte de las enzimas xilosiltransferasas a la serina de la estructura proteica de los proteoglicanos, impidiendo así el primer paso de la síntesis y unión de las cadenas de condroi- tín sulfato al esqueleto proteico de los proteoglicanos y evitando como consecuencia su secre- ción a la ECM. Su administración se ha utilizado además para estudiar el papel de los CSPGs en el crecimiento axonal, tanto in vivo como in vitro (Zuo, Hernandez et al. 1998, Mendes, Onofre Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 108 Re su lta do s et al. 2003). Nos propusimos utilizar el xilósido como herramienta farmacológica para inhibir la sín- tesis de CSPGs en la fase crónica del modelo de TMEV y determinar así el papel de estas molé- culas en la progresión de la enfermedad. Con este fin, tratamos a los animales infectados con el virus de Theiler con el compuesto xilósido (120 mg/kg) por vía i.p., en la fase crónica del modelo (75 dpi) durante 10 días. Finalizado el tratamiento, se procedió a la valoración motora de los ratones de experimentación mediante el test de la caja de actividad. Tal y como muestra la Figura 25, los déficits motores que se observaron en los animales infectados tratados con vehículo fueron significativamente revertidos en aquellos tratados con el inhibidor de la sínte- sis de CSPGs a los 85 dpi. Figura 25. El tratamiento con xilósido en la fase crónica del TMEV-IDD mejora los déficits motores asociados al modelo. El análisis mediante el test de la caja de actividad muestra los déficits motores (A; actividad horizontal) (B; actividad vertical) que presentan aquellos animales infectados con el virus de Theiler en comparación con los animales Sham, así como la mejora significativa en aquellos tratados con xilósido a 85 dpi. Los datos se represen- tan como la media ± SEM: **p<0,01; *p<0,05 vs sham; ### p<0,001; ## p<0,01 vs TMEV. A continuación, quisimos valorar si el tratamiento con xilósido disminuía los niveles de CSPGs y la astrogliosis observada en el modelo a los 85 dpi. De esta manera y como muestra la Figura 26, tanto la astrogliosis, analizada por inmunohistoquímica mediante el marcaje con GFAP y Vimentina, como los CSPGs evaluados mediante el anticuerpo de CS-56, disminuyeron significativamente, a excepción del GFAP, en la médula espinal cervical de los animales infecta- dos (Figura 26 A, B). Del mismo modo los niveles de los CSPGs Brevicán y Neurocán, analizados mediante la técnica de western-blot, estaban disminuidos en los animales que habían sido tratados con xilósido respecto a los que habían sido tratados con vehículo, no observándose ningún efecto significativo a nivel de Fosfacán. Además, el nivel de los tres proteoglicanos 109 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados analizados de manera sumatoria por western-blot, indicó una disminución significativa de los mismos en aquellos ratones que recibieron este compuesto (Figura 26C). Figura 26. (A) El tratamiento con xilósido en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD disminuye la expresión de CSPGs. (A) Fotomicrografías representativas de secciones transversales de médula espinal donde se marcan astrocitos (GFAP, Vimentina) así como CSPGs (CS-56) y que muestran que tras la administración de xilósido se pro- duce una reducción de la astrogliosis, así como de la expresión de CSPGs a 85 dpi. (B) La cuantificación del área total marcada para GFAP, Vimentina y CS-56 revela que hay una disminución de la reactividad astroglial, así como de la expresión de CSPGs marcados con el anticuerpo CS-56 en comparación con los ratones tratados con vehícu- lo. (C) El análisis de los niveles proteicos de Neurocán, Brevicán y Fosfacán mediante western-blot evidencia una Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 110 Re su lta do s disminución de los mismos a 85 dpi Los datos se representan como la media ± SEM: # p<0,05. La significancia en color rojo indica en análisis de los CSPGs en conjunto. ns: no significativo. Teniendo en cuenta estos resultados, se sugiere que el efecto del compuesto xilósido mejorando los déficits motores en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD está asociado a una disminución de la astrogliosis y de la producción de los CSPGs en la médula espinal de los animales infectados. 2.2 Inhibición farmacológica de la expresión de CSPGs por fluorosamina en el modelo de TMEV-IDD. Recientemente se ha sintetizado un análogo del precursor de la N-acetil-galactosamina, componente del disacárido que forma parte de las cadenas de condroitín sulfato de los proteo- glicanos, llamado fluorosamina (Barthel, Antonopoulos et al. 2011, Nigro, Wang et al. 2009). Este compuesto impide que las enzimas glicosiltransferasas elonguen las cadenas de polisacá- ridos inhibitorias de condroitín sulfato, impidiendo así la síntesis y liberación de los CSPGs. Se ha descrito previamente la efectividad de la fluorosamina disminuyendo la síntesis de CSPGs por astrocitos murinos y astrocitos humanos in vitro, así como in vivo en modelos de desmie- linización por lisolecitina y de EM, como la EAE (Keough, Rogers et al. 2016) promoviendo los procesos de remielinización y recuperación funcional. Quisimos por tanto utilizar el compuesto fluorosamina para disminuir la producción de CSPGs en la fase crónica de nuestro modelo de TMEV y evaluar así la relevancia de la produc- ción de CSPGs en la sintomatología clínica asociada al modelo. Para ello tratamos a animales infectados con el virus de Theiler con el compuesto fluorosamina, (50 mg/kg) por vía i.p., en la fase crónica del modelo (70 dpi) durante 10 días y una vez comenzada la sintomatología clínica. Finalizado dicho tratamiento se procedió a su valoración sintomatológica mediante la caja de actividad. Tal y como muestra la Figura 27, los déficits motores evaluados mediante la actividad vertical fueron reducidos significativamente con la fluorosamina (B) sin tener efecto significativo en el caso de la actividad horizontal (A). 111 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Figura 27. El tratamiento con fluorosamina en la fase crónica del TMEV-IDD mejora los déficits motores asocia- dos al modelo. El análisis mediante el test de la caja de actividad muestra los déficits motores (A; actividad hori- zontal) (B; actividad vertical) que presentan aquellos animales infectados con el virus de Theiler en comparación con los animales Sham, así como la mejora significativa en aquellos tratados con fluorosamina a 80 dpi. Los datos se representan como la media ± SEM: ***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05 vs sham; # p<0,05 vs TMEV. Además, cuando evaluamos mediante RT-PCR los niveles de ARNm de la enzima xilosil- trasferasa 1, enzima encargada de unir un grupo xiloso a la serina del esqueleto proteico de los proteoglicanos (Gris, Tighe et al. 2007), primer paso imprescindible para la elongación de las cadenas de condroitín sulfato, observamos que ésta se encontró aumentada en los animales infectados con el TMEV, pero disminuida en aquellos tratados con la fluorosamina. Así mismo, se observó un aumento del ARNm de los proteoglicanos Fosfacán y Versicán en los animales infectados que fue disminuido en aquellos tratados con fluorosamina. Sin embargo, no se ob- servaron diferencias significativas en cuanto al estudio de Neurocán y Brevicán (Figura 28). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 112 Re su lta do s Figura 28. El tratamiento con fluorosamina en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD disminuye la expresión de CSPGs y de su enzima de síntesis Xt-1. El análisis a nivel del ARNm de la enzima de síntesis de CSPGs Xt-1 así como de Neurocán, Brevicán, Vesicán y Fosfacán mediante RT-PCR evidencia un aumento tanto de la enzima Xt-1 así como de los CSPGs Fosfacán y Versicán que se ven disminuidos tras tratamiento con fluorosamina sin verse efecto en cuanto a Neurocán y Brevicán a 80 dpi. Los datos se representan como la media ± SEM: **p<0,01; *p<0,05 vs sham; # p<0,05 vs TMEV. ns: no significativo. 113 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados RESUMEN PARTE 2: Como resumen de esta parte de la Tesis Doctoral se indica que el tratamiento con dos compuestos diferentes que inciden en la ruta de síntesis de los CSPGs, el xilósido y la fluoro- samina, administrados en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD y una vez comenzada la sintomatología clínica, mejoran los déficits motores asociados al modelo siendo más efectivo el tratamiento con xilósido. Además, ambos reducen la expresión de CSPGs evidenciando la relevancia de estas moléculas inhibitorias en el desarrollo de la patología del modelo de TMEV- IDD. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 114 Re su lta do s 115 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados PARTE 3. POTENCIAL TERAPÉUTICO DEL ENDOCANNABINOIDE 2-AG Y SU EFECTO SO- BRE LOS CSPGs EN MODELOS MURINOS DE EM Los cannabinoides han sido objeto de estudio durante años para el tratamiento en EM y en otras enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas por sus efectos no solo sobre la espasticidad sino también por su acción como potentes antioxidantes, anti-inflamatorios (Are- valo-Martin, Vela et al. 2003, Croxford and Miller 2003), anti-excitotóxicos y neuroprotectores (Fernandez-Ruiz, Garcia et al. 2010, Loria, Petrosino et al. 2010, Pryce, Ahmed et al. 2003). El potencial terapéutico de los cannabinoides en base a resultados en modelos animales como reguladores de la progresión de la EM podría incluir también un efecto en los procesos de re- paración modulando los CSPGs y la cicatriz glial. El 2-AG es el endocannabinoide endógeno mayoritario del SNC y ha mostrado tener efec- tos terapéuticos in vivo en modelos experimentales de daño agudo en médula espinal (Are- valo-Martin, Garcia-Ovejero et al. 2010) así como en el modelo de EM de EAE (Lourbopoulos, Grigoriadis et al. 2011). La MAGL es la enzima responsable de la degradación del 2-AG e inhibi- dores farmacológicos de esta enzima como el JZL184 han mostrado tener efectos beneficiosos en el modelo de EAE, así como el modelo de desmielinización por cuprizona (Bernal-Chico, Ca- nedo et al. 2015). Ya que los inhibidores farmacológicos de la MAGL sintetizados hasta la fecha son irreversibles y pueden inducir tolerancia al inducir una perdida funcional de los receptores cannabinoides (Schlosburg, Blankman et al. 2010) perdiendo por lo tanto su potencial efecto terapéutico, en este estudio se ha analizado el posible efecto terapéutico del aumento del tono endógeno del 2-AG mediante el uso de un inhibidor selectivo de la MAGL reversible, de síntesis reciente denominado UCM03025, tanto en el modelo de EAE como en el modelo TMEV-IDD. Asimismo, se ha llevado a cabo un estudio del efecto de dicho inhibidor en la acumulación de los CSPGs para determinar su potencial para generar un ambiente permisivo y promover así mecanismos de reparación y remielinización en el modelo de TMEV. 3.1 Potencial terapéutico del UCM03025, inhibidor de la MAGL, en el modelo de EAE Para evaluar el efecto terapéutico del compuesto UCM03025 en la fase crónica del mo- delo de EAE, inmunizamos ratones hembra de la cepa C57BL/6J de manera subcutánea con Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 116 Re su lta do s la glicoproteína oligodendroglial de mielina (MOG35-55). El tratamiento con el compuesto UCM03025 (5 mg/kg i.p.) comenzó a los 6 días postinmunización, una vez comenzados los síntomas motores y se mantuvo durante los 21 días posteriores. Los ratones fueron evaluados diariamente mediante la escala clínica descrita en la sección de materiales y métodos. En primer lugar y para comprobar que la administración del UCM03025 aumentaba los niveles endógenos del 2-AG, las médulas espinales de ratones tratados y sin tratar con el inhi- bidor de la MAGL fueron analizadas mediante la técnica de HPLC acoplada a espectroscopía de masas y se observó, como muestra la Figura 29A, que el tratamiento con el inhibidor reversible de la MAGL aumentaba significativamente los niveles los niveles endógenos de 2-AG. Como evidencia del potencial terapéutico del UCM03025, se observó además que aque- llos animales inmunizados y tratados con vehículo desarrollaron una sintomatología clínica con una puntuación clínica máxima cercana a 3, déficits motores que se vieron reducidos en aquellos animales tratados con el compuesto UCM03025. La mejoría motora comenzó a ser significativa a los 6 días del comienzo del tratamiento y se mantuvo hasta la finalización del experimento (Figura 29B). Figura 29. El tratamiento con el compuesto UCM03025 aumenta los niveles endógenos de 2-AG y mejora significativa- mente los síntomas motores asociados al modelo de EAE. (A) Análisis de los niveles de 2-AG a nivel de médula espinal de los ratones tratados con vehículo o con el compuesto UCM03025. (B) El inhibidor de la MAGL redujo los deficits motores asociados al modelo. Los datos se representan como la media ± DEM en el caso del análisis clínico y media ± SEM en el caso de los valores de 2-AG: ***p<0,001; **p<0,01; vs Intacto. ns no significativo. 117 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Para determinar si el aumento endógeno del 2-AG era capaz de modular la respuesta inflamatoria que tiene lugar en el modelo de EAE, se evaluó histológicamente, a los 27 dpi, la médula espinal cervical de los animales de estudio con el fin de analizar el grado de infiltración de leucocitos al parénquima así como la reactividad microglíal. Como muestra la Figura 30 A y B, el análisis de infiltrados evaluado en secciones teñidas con Hematoxilina/Eosina indicó que aquellos animales inmunizados con MOG y tratados con el compuesto UCM03025 mostraron niveles parcialmente inferiores de infiltración celular que los animales tratados con vehículo aunque no se detectó significancia estadística entre los grupos de estudio. Figura 30. El inhibidor de la MAGL reduce a modo de tendencia el número de infiltrados en la médula espinal de los animales inmunizados. Fotomicrografías representativas de secciones transversales de médula espinal cervical teñidas con Hematoxilina/eosina. (B) El análisis del grado de infiltración celular indica una tendencia al aumento de leucocitos en aquellos ratones inmunizados y tratados con vehículo y una reducción parcial, aunque no significativa en aquellos tratados con el UCM03025. Barra de calibración 50µm. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 118 Re su lta do s El análisis histopatológico para evaluar la reactividad microglial mediante el anticuerpo Iba-1 (Figura 31 A, B) mostró que el área ocupada por la microglía era significativamente ma- yor en los animales tratados con vehículo, indicando un mayor grado de reactividad microglial y que esta se encontraba significativamente disminuída en aquellos animales tratados con el inhibidor de la MAGL. Figura 31. UCM03025 reduce la reactividad microglial en el modelo de EAE. (A) Fotomicrografías representativas de secciones transversales de médula espinal cervical marcadas con el anticuerpo de Iba-1. (B) El análisis para Iba-1 revela que en aquellos ratones inmunizados hay un aumento significativo de la reactividad microglial que se encuentra reducida en aquellos que recibieron el compuesto. Los datos se representan como la media ± SEM: **p<0,01 vs CFA; ### p<0,001 vs EAE. Barra de calibración 100µm. Dado el efecto del compuesto UCM03025 en la mejoría de los déficits motores y la mo- dulación de la respuesta inflamatoria, se analizó su posible efecto a nivel de neuroprotección mediante tinciones para Neurofilamento-H así como para marcadores para mielina en la mé- dula espinal de los animales de estudio. Como muestra la Figura 32 A y B , en los animales inmunizados con MOG35-55 y tratados con vehículo se observó una pérdida de marcaje para Neurofilamento-H indicativo de altera- ción axonal. En aquellos animales inmunizados y tratados con el inhibidor de la MAGL, dicho 119 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados marcador se restauró a niveles control indicando una prevención de la pérdida axonal. Figura 32. El compuesto UCM03025 previene la pérdida axonal en el modelo de EAE. (A) Fotomicrografías repre- sentativas de secciones transversales de médula espinal cervical marcadas con el anticuerpo de Neurofilamento- H. (B) El análisis evidencia una pérdida axonal en aquellos ratones inmunizados que se revierte en aquellos que recibieron el compuesto. Los datos se representan como la media ± SEM: *p<0,05 vs CFA; #p<0,05 vs EAE. Barra de calibración 100µm. Con respecto a la integridad de las vainas de mielina, se realizó una inmunohistoquímica para el marcador de mielina MBP y una tinción de Luxol Fast Blue en secciones de la médula espinal (Figura 33). En dichas tinciones se pudo observar una pérdida de marcaje para MBP y de mielina en general en aquellos animales inmunizados y tratados con vehículo, siendo me- nos evidente en aquellos animales tratados con el inhibidor de la MAGL. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 120 Re su lta do s Figura 33. El inhibidor reversible de la MAGL restaura la morfología de la mielina en el modelo de EAE. Fotomi- crografías representativas de secciones transversales de médula espinal cervical marcadas para ver mielina con (A) el anticuerpo de MBP y (B) tinción con Luxol Fast Blue. Las imágenes muestran una importante pérdida del marcaje para mielina que se recupera en aquellos ratones que recibieron tratamiento con UCM03025. Barra de calibración 100 y 50µm. Como resumen del estudio del potencial terapéutico del inhibidor reversible de la MAGL, el UCM03025, en el modelo de EAE se resalta que: tras la administración de dicho compuesto se consiguió un aumento de los niveles endógenos del endocannabinoide 2-AG en la médula espinal de los animales de estudio, indicando una inhibición efectiva de la enzima MAGL in vivo. Además, el UCM03025 redujo los déficits motores asociados al modelo de EAE, efecto que se vio acompañado por una reducción parcial, aunque no significativa de infiltrados en la médula espinal, así como de una disminución de la reactivación microglial, pérdida axonal y de los marcadores para mielina. 121 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados 3.2 Potencial terapéutico del UCM03025 y del endocannabinoide 2-AG en el mo- delo del virus de Theiler. Efecto sobre los CSPGs. Para evaluar el potencial terapéutico del compuesto UCM03025 en el modelo de TMEV- IDD, se procedió a determinar su capacidad para mejorar la sintomatología motora asociada al modelo, así como su potencial antiinflamatorio. Así mismo, se analizó su capacidad para regu- lar la producción de los CSPGs, con el fin de determinar la capacidad del compuesto UCM03025 de participar en los mecanismos de reparación. Para ello, tratamos animales infectados con el virus de Theiler con el compuesto UCM03025, a una dosis de 5 mg/kg i.p., en la fase crónica del modelo (75 dpi) durante 10 días y una vez comenzada la sintomatología clínica. Finalizado el tratamiento, se procedió a su valo- ración clínica mediante la caja de actividad. Tal y como muestra la Figura 34 el tratamiento con UCM03025, mejoró significativamente los déficits motores asociados al modelo de TMEV-IDD, evaluados mediante la actividad horizontal (A) como la vertical (B). Además, para determinar la posible implicación de los receptores CB1 y CB2 en el efecto del UCM03025, otro grupo de ani- males fueron tratados con antagonistas selectivos de los receptores cannabinoides CB1 (2 mg/ kg) y/o CB2 (2 mg/kg) 30 minutos antes del tratamiento con el inhibidor de la MAGL durante 10 días. Se observó que el efecto beneficioso del UCM03025, mejorando los déficits motores en el modelo de TMEV-IDD, fue revertido al ser administrado junto con antagonistas tanto del receptor CB1 como del receptor CB2, así como cuando estos fueron administrados de manera conjunta no observándose una potenciación del grado de inhibición obtenida cuando se admi- nistraba cada antagonista independientemente. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 122 Re su lta do s Figura 34. El tratamiento con el compuesto UCM03025 mejora los déficits motores asociados al modelo de TMEV-IDD actuando a través de los receptores CB1 y CB2. El análisis de la actividad motora evaluada mediante el test de la caja de actividad a los 85 dpi mostró que los animales infectados con el virus de Theiler presentan las alteraciones motoras características del modelo detectadas en la (A) actividad horizontal y (B) actividad vertical. Dichas alteraciones motoras se encuentran reducidas en aquellos ratones tratados con el compuesto UCM03025 durante 10 días y se revierten en coadministración con antagonistas de los receptores de CB1 (AM251) y CB2 (AM630). Los datos se representan como la media ± SEM: ***p<0,001 vs Sham; ### p<0,001 vs TMEV;  p<0,05;  p<0,01 vs TMEV-UCM. Dado que el responsable de los efectos terapéuticos ejercidos por el UCM03025 es el incremento del tono endógeno de 2-AG, quisimos determinar si el tratamiento directo con el propio endocannabinoide sería capaz también de revertir los déficits motores asociados al modelo de TMEV. Además, para evitar el posible efecto del 2-AG a nivel periférico, administra- mos el 2-AG (5mg/kg) a nivel intracerebroventricular para determinar su acción directa en el SNC. Con este fin el 2-AG fue administrado en ratones infectados con el virus de Theiler y una vez comenzada la sintomatología (75 dpi), mediante la implantación de minibombas osmóti- cas. Tras 10 días de tratamiento y como muestra la Figura 35, se observó que los animales que 123 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados habían recibido administración continua del endocannabinoide mostraron menor porcentaje de discapacidad motora, analizada en base a la actividad horizontal (A) y vertical (B), que la observada en los animales tratados con el vehículo. Figura 35. La administración intracerebroventricular de 2-AG mejora la sintomatología moto- ra en los animales infectados con el virus de Theiler. La administración continua en ventrículo lateral de 2-AG mediante bombas osmóticas durante 10 días mejora los déficits motores eva- luados con el test de la caja de actividad. Los datos están representados como la media ± SEM en relación al porcentaje de déficits de los animales infectados tratados con vehículo de (A) la actividad horizontal y (B), de la actividad vertical. # p<0,05; ## p<0,01 vs TMEV. A continuación, se evaluó el efecto del tratamiento con el UCM03025 sobre la respuesta inflamatoria mediante histología de la médula espinal cervical, con el fin de analizar el grado de infiltración de leucocitos al parénquima. Además, debido a que la respuesta inmune innata en el SNC es esencial para la progresión del TMEV-IDD y la microglía proporciona la primera línea de defensa contra el virus, se analizó también el efecto del UCM03025 en la respuesta microglial en la fase crónica del modelo, a la finalización del tratamiento (85dpi). Como se observa en la Figura 36, el grado de infiltrados en médula espinal disminuyó significativamente en los animales tratados con UCM03025 en comparación con aquellos tra- tados con vehículo (A), además dicha disminución se vio acompañada de un descenso del area ocupada por microglía evaluada mediante el anticuerpo Iba-1 (B). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 124 Re su lta do s Figura 36. UCM03025 reduce la infiltración celular y la reactividad microglial en la médula espinal de los animales in- fectados con el virus de Theiler. Microfotografías representativas y análisis de secciones transversales de médula espinal cervical marcadas para ver infiltración leucocitaria mediante (A) tinción de Hematoxilina/Eosina y (B) mediante el anti- cuerpo de Iba-1 para analizar el estado de la microglía. Los datos indican que tras la administración durante 10 días con el compuesto UCM03025 se observa una disminución significativa del número de infiltrados en el parénquima, así como una reducción de la reactividad de la microglía a los 85 dpi. Los datos se representan como la media ± SEM: ***p<0,001; *p<0,05 vs Sham; # p<0,05; ### p<0,001 vs TMEV. Barra de calibración 100 µm. Se ha descrito previamente que en el modelo de TMEV, las células gliales, así como las células inmunes producen mediadores inflamatorios y citotóxicos que son responsables de generar daño axonal y desmielinización (Pope, Karpus et al. 1996). Una vez visto el efecto be- neficioso del UCM03025 a nivel motor, así como su efecto limitando la infiltración de células inmunes y disminuyendo la reactividad microglial, se procedió a determinar la expresión relati- va de ARNm, a nivel de médula espinal cervical, de diferentes mediadores inflamatorios como TNF-α, IL-1β y NOS-II mediante la técnica de RT-PCR. Como puede observarse en la Figura 37, el tratamiento con UCM03025, redujo de manera significativa la citoquina IL-1β y a modo de tendencia TNF-α y NOS-II. El 2-AG a través del compuesto UCM03025 podría no solo actuar disminuyendo la res- puesta proinflamatoria, sino también potenciando la respuesta antiinflamatoria. Para ello ana- lizamos la expresión relativa a nivel de ARNm de la enzima Arginasa-1 mediante la técnica de RT-PCR (Figura 37) y se observó que dicha enzima estaba aumentada de manera significativa en aquellos ratones tratados con UCM03025, respecto al grupo SHAM. 125 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Figura 37. El inhibidor de la hidrólisis del 2-AG modula los niveles de mediadores inflamatorios en el modelo de TMEV-IDD. Análisis de la expresión de ARN men- sajero mediante RT-PCR en la médula espinal cervical de (A) mediadores proin- flamatorios IL-1β, TNF-α y NOS-II y el mediador antiinflamatorio Arginasa-1. Los datos se representan como la media ± SEM: **p<0,01 vs Sham; # p<0,05 vs TMEV. En conjunto, los resultados muestran un efecto del UCM03025 disminuyendo la presen- cia de infiltrados en el parénquima, de citoquinas inflamatorias y de la respuesta microglial, así como como un posible aumento de la respuesta anti-inflamatoria, que apuntaría hacia un efecto inmunomodulador del UCM03025 en el modelo de TMEV-IDD. Una vez descrito que el potencial terapéutico ejercido por el compuesto UCM03025 po- dría ser resultado de su capacidad para actuar como inmunomodulador, nos preguntamos si junto a esa función se podría incluir la capacidad para reducir la producción y acumulación de los CSPGs, moléculas que habíamos visto aumentadas previamente en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD. Para ello, en primer lugar, evaluamos mediante inmunohistoquímica, la astrogliosis usan- do el anticuerpo para GFAP y Vimentina, así como la expresión de CSPGs mediante el anti- cuerpo CS-56. Según los resultados obtenidos, se observó una prominente astrogliosis (GFAP, Vimentina), así como una mayor expresión del marcador CS56, en los animales infectados y tratados con vehículo (Figura 38A), observaciones que, al hacer las cuantificaciones, mostra- Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 126 Re su lta do s ban una reducción significativa en aquellos animales tratados con el inhibidor de la MAGL (Figura 38B). Figura 38. El tratamiento con UCM03025 reduce la astrogliosis y la expresión del total de CSPGs en el modelo de TMEV-IDD. (A) Fotomicrografías representativas de secciones transversales de médula espinal donde se marcan as- trocitos (GFAP, Vimentina) así como CSPGs (CS-56). (B) La cuantificación del área total marcada para GFAP, Vimenti- na y CS-56 revela que hay una disminución de la reactividad astroglial, así como de la expresión de CSPGs marcados con el anticuerpo CS-56 a 85 dpi en comparación con los ratones tratados con vehículo. Los datos se representan como la media ± SEM: # p<0,05 vs TMEV. Barra de calibración 100 µm. Así mismo, cuando se evaluaron los diferentes CSPGs, Brevicán, Fosfacán y Neurocán, a nivel de ARNm mediante la técnica de RT-PCR (Figura 39A), así como a nivel proteico mediante western-blot (Figura 39B), se observó que el único proteoglicano que disminuyó significativa- mente tanto a nivel de ARNm como a nivel proteico fue el Fosfacán, no viéndose efecto alguno 127 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados a nivel de Brevicán y Neurocán. Sí que se detectó significancia estadística al analizar la expre- sión proteica sumatoria de los tres CSPGs. Figura 39. El inhibidor de la MAGL disminuye la expresión del proteoglicano Fos- facán tanto a nivel de mensajero como a nivel proteico. El análisis de los CSPGs Neurocán, Brevicán y Fosfacán mediante RT-PCR (A) y mediante western-blot (B) evi- dencia una disminución de únicamente significativa del Fosfacán tanto a nivel de mensajero como a nivel proteico a 85 dpi. Los datos se representan como la media ± SEM: ### p<0,001 # p<0,05 vs TMEV. La significancia en color rojo indica en análisis de los CSPGs en conjunto. ns: no significativo. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 128 Re su lta do s Los CSPGs han sido descritos como agentes inhibidores de los mecanismos de reparación y remielinización al generar un ambiente poco permisivo para la diferenciación de los progeni- tores de oligodendrocitos, así como la regeneración axonal. Teniendo en cuenta la disminución observada de los CSPGs como resultado de la administración del UCM03025, quisimos evaluar a continuación en nuestro estudio si también sería capaz de inducir cambios en el número de oligodendrocitos en la zona dañada. Para ello, se realizó un estudio a nivel histológico y de expresión de ARNm en médula espinal una vez finalizado el tratamiento con UCM03025 (85dpi) para marcadores de oligoden- drocitos. Así mismo, para determinar la proliferación celular, se administró a los animales de estudio BrdU (50 mg/kg, i.p.) diariamente junto con el tratamiento con UCM03025. Se observó que tanto el número de OPCs (Olig-2+ CC1-) como aquellos oligodendrocitos proliferativos, Olig2+BrdU+, se encontraban significativamente aumentados en los animales infectados con el virus de TMEV y tratados con UCM03025 (Figura 40 A, B). Se ha involucrado a Olig-2 en la diferenciación de los progenitores neurales a linaje oligodendroglial (Ligon, Kesari et al. 2006) mientras que el Nkx2.2 regula la maduración y diferenciación de los progenitores (Qi, Cai et al. 2001). Además, tanto el Olig-2 como el Nkx2.2 se expresan en altos niveles en OPCs, mientras que los oligodendrocitos maduros presentan bajos niveles de los mismos; astrocitos y micro- glía no expresan estos factores de transcripción (Kitada and Rowitch 2006, Kuhlmann, Miron et al. 2008). En relación a estos marcadores, el análisis por RT-PCR de los niveles de ARNm para Olig-2 y Nkx2.2 en nuestro estudio mostraron un incremento de los mismos en aquellos ani- males tratados con el UCM03025 (Figura 40C). 129 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Figura 40. El tratamiento con UCM03025 en ratones infectados con el virus de Theiler aumenta la proliferación de oligodendrocitos, así como la expresión de marcadores de OPCs a 85 dpi. (A) Fotomicrografías representa- tivas de secciones transversales de médula espinal marcadas tanto para Olig-2 como para células proliferantes (BrdU). (B) La cuantificación del número de OPCs (Olig-2+CC1-) así como de aquellos proliferantes (Olig-2+BrdU+) indica que estos se encuentran aumentados en aquellos ratones que recibieron tratamiento con el inhibidor de la hidrólisis de 2-AG. (C) El análisis de ARN mensajero de los marcadores de OPCs, Nkx2.2 y Olig-2, resalta el aumen- to de la expresión de los mismos en los ratones TMEV-IDD tratados con el compuesto. Los datos se representan como la media ± SEM: * p<0,05 **p<0,01 vs Sham; # p<0,05 ## p<0.01 vs TMEV. Barra de calibración 100, 50 µm. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 130 Re su lta do s La remielinización es un proceso por el cual se generan nuevas vainas de mielina por par- te de los OPCs diferenciados a oligodendrocitos maduros que ocurre tras un daño en el SNC. Para que este proceso tenga lugar es necesaria la diferenciación de OPCs en situaciones donde el ambiente debe ser permisivo. Dado que en nuestro estudio observamos una disminución CSPGs, así como un incre- mento en el número de OPCs en la médula espinal de los animales infectados y tratados con el UCM03025, quisimos determinar si este aumento se correlacionaría con una mayor presencia de oligodendrocitos maduros capaces de sintetizar nuevas vainas de mielina para dar lugar a procesos de remielinización. Con este objetivo, se llevó a cabo un análisis del número de células CC1 positivas, me- diante histología en la médula espinal de los animales de estudio. Como resultado de este análisis, se observó que el número de oligodendrocitos maduros CC1+ estaban aumentados en los animales infectados y tratados con el compuesto UCM03025 respecto a los tratados con vehículo (Figura 41 A, B). El aumento del número de progenitores, así como del incremento de oligodendrocitos maduros observado en los animales tratados con UCM03025, se podría traducir en nueva síntesis de proteínas de mielina. Con el fin de evaluar dicho efecto analiza- mos mediante western-blot la proteína de mielina MBP observándose que la disminución de su expresión en los animales TMEV tratados con vehículo se vio revertida de manera significa- tiva en aquellos animales a los que se les administró el inhibidor de la MAGL (Figura 41C). El UCM03025 por lo tanto no solo induce un aumento de la proliferación de oligodendrocitos, así como del número de oligodendrocitos maduros, sino que también incrementa la expresión de la proteína de mielina MBP a los 85 dpi. 131 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Figura 41. UCM03025 aumenta los marcadores de oligodendrocitos maduros en el modelo de TMEV-IDD. Las fotomicrografías representativas de secciones transversales de médula espinal marcadas para el marcador de oli- godendrocitos maduros CC1 (A) y su cuantificación, (B) muestran un aumento de los mismos tras tratamiento con UCM03025 a 85 dpi. Se observa una disminución de los niveles de la proteína básica de mielina MBP en las sec- ciones de los ratones infectados y tratados con vehículo, que sin embargo aumentan en aquellos que recibieron UCM03025 (C). Los datos se representan como la media ± SEM: * p<0,05 vs Sham; # p<0,05 ## p<0,01 vs TMEV. Barra de calibración 100 µm. Con el fin de evaluar si el efecto observado a nivel del número de oligodendrocitos se traduce en un aumento de los procesos de remielinización, se dejó otro grupo de animales TMEV trata- dos con UCM03025, sin tratar durante 21 días más, hasta los 105 dpi, escogiendo dicho tiempo basándonos en estudios previos (Arevalo-Martin, Vela et al. 2003). Llegado ese tiempo, se procedió de nuevo a su valoración clínica mediante la caja de actividad y se realizaron análisis histológicos y de western-blot a nivel de médula espinal para determinar la expresión de CS- PGs. Así mismo se procedió a analizar el grado de la preservación axonal, así como procesos de remielinización mediante microscopía electrónica TEM a 105 dpi. Tal y como muestra la Figura 42 A y B la mejoría clínica detectada previamente mediante análi- sis de la actividad horizontal y vertical, en los animales tratados con el inhibidor reversible de la MAGL a 85 dpi, se mantuvo a los 105 dpi a pesar de haber cesado el tratamiento 21 días antes. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 132 Re su lta do s Figura 42. El UCM03025 presenta efectos a largo plazo mejorando la actividad motora de los animales infecta- dos con el virus de Theiler. La evaluación de la actividad motora (A) actividad horizontal (B) actividad vertical, analizada mediante el test de actividad revela que los ratones tratados con el inhibidor de la hidrólisis del 2-AG durante 10 días y mantenidos sin tratamiento 21 días más hasta los 105 dpi siguen mostrando mejoría motora que aquellos tratados con vehículo. Los datos se representan como la media ± SEM: *** p<0,001 vs Sham; # p<0,05, ## p<0,01 vs TMEV. Al analizar la expresión de los proteoglicanos mediante inmunohistoquímica para CS-56, se observó una reducción de los mismos en la médula espinal de aquellos ratones infectados que recibieron el UCM03025 (Figura 43A). Además, a nivel de ARNm, el Fosfacán se encon- traba también disminuido a los 105 dpi, viéndose en este caso además una reducción a nivel de Neurocán, sin cambios significativos en cuanto al Brevicán (Figura 43B). Al analizar los pro- teoglicanos a nivel proteico mediante western-blot se observó en este caso que el Fosfacán y Brevicán estaban disminuidos sin detectarse cambios significativos en cuanto al Neurocán. Se detectó así mismo, significancia estadística en cuanto al análisis proteico sumatorio de los tres proteoglicanos mediante el western-blot (Figura 43C), observándose una disminución de los mismos en los ratones tratados con UCM03025 similar a la detectada mediante el anticuerpo de CS-56. 133 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Figura 43. El inhibidor de la MAGL disminuye los niveles de CSPGs 20 días después del cese del tratamiento en el modelo de TMEV-IDD. Las fotomicrografías representativas de secciones transversales de médula espinal mar- cadas para el total de CSPGs (CS-56) y su cuantificación (A) indican una disminución de los mismos en aquellos ratones infectados tratados con UCM03025. Además, el análisis de los CSPGs Neurocán, Brevicán y Fosfacán me- diante RT-PCR (B) y mediante western-blot (C) evidencia que los niveles de algunos CSPGs y del análisis total se mantienen disminuidos a este tiempo. Los datos se representan como la media ± SEM: # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 vs TMEV. La significancia en color rojo indica en análisis de los CSPGs en conjunto. ns: no significativo. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 134 Re su lta do s Con el objetivo de analizar la integridad axonal a los 105 dpi, se sometió a las secciones de médula espinal a una inmunohistoquímica para el anticuerpo de Neurofilamento-H (Figura 44A), así como a un análisis del tracto corticoespinal mediante el uso del trazador anterógra- do BDA inyectado en corteza motora (Figura 44B). Mediante el análisis de ambas técnicas se observó que la pérdida axonal era significativamente menor en los animales tratados con el compuesto UCM03025 en comparación con aquellos tratados con vehículo. Figura 44. Los ratones infectados y tratados con el UCM03025 presentan una menor perdida axonal a los 105 dpi. Las fotomicrografías representativas de secciones transversales de médula espinal marcadas para axones (Neurofilamento- H) y su cuantificación (A) así como el marcaje para el trazador anterógrado BDA (B), indican que en los ratones infectados y tratados con vehículo existe una mayor pérdida axonal que en aquellos tratados con UCM03025. Los datos se represen- tan como la media ± SEM: *** p<0,001 vs Sham; # p<0,05 vs TMEV. Finalmente, cuando las secciones de médula espinal cervical de los animales de estu- dio fueron analizadas mediante microscopía electrónica a los 105 dpi con el fin de detectar procesos de remielinización, se observó que esta resulta ser mucho más evidente en aquellos ratones infectados y tratados con el compuesto UCM03025, detectándose en estos ratones abundantes vainas finas de mielina de nueva formación (Figura 45A). Además, se observó un aumento significativo del número de axones mielinizados en aquellos ratones TMEV trata- dos con UCM03025 (899 de 1,000 axones) (Figura 45B) así como un g-ratio de axones mie- linizados mayor (0.82±0.0018) en comparación con el grupo SHAM (0.77±0.0024) y el TMEV (0.79±0.0019) (Figura 45C). Un valor de g-ratio mayor a 0.8 refleja un mayor número de axones en proceso de remielinización con vainas de mielina más finas y por lo tanto de nueva forma- ción. Estos datos evidencian el potencial del compuesto UCM03025 y por tanto del aumento 135 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados del tono endógeno del 2-AG, para promover la remielinización y los procesos de reparación en el modelo de TMEV-IDD. Figura 45. El tratamiento con UCM03025 incrementa los procesos de remielinización en aquellos animales infec- tados con el virus de Theiler a 105 dpi. El análisis ultrastructural de mielina y axones mediante microscopía elec- trónica a 105 dpi indica que el UCM03025 reduce el número de axones desmielinizados y promueve la remielini- zación (asteriscos) en la asta ventral de la médula espinal de los ratones infectados (A). El análisis del número de axones desmielinizados y mielinizados (B) así como el cálculo del g-ratio (C) muestra un aumento de los procesos de remielinización, así como del número de axones mielinizados en los ratones que recibieron tratamiento con el UCM03025. Los datos se representan como la media ± SEM: *** p<0,001 vs Sham; ### p<0,001 vs TMEV. Los resultados obtenidos en el modelo de TMEV-IDD, indican que: el tratamiento con el compuesto UCM03025 de forma terapéutica y una vez comenzada la sintomatología, mejora significativamente los déficits motores asociados al modelo. Una menor disfunción motora se observa así mismo en aquellos ratones TMEV que reciben directamente 2-AG en el ventrículo. La mejora sintomatológica producida por el UCM03025 se ve revertida en coadministración con antagonistas de los receptores CB1 y CB2. El análisis histológico en médula espinal de los Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 136 Re su lta do s animales TMEV revela que el UCM03025 disminuye la infiltración de leucocitos en la médula espinal, así como la reactivación microglial. Además, se observa un aumento en la prolifera- ción de los oligodendrocitos, así como un aumento del número de oligodendrocitos maduros, efecto que se ve acompañado por una disminución de la acumulación de CSPGs. Todo ello da lugar a una menor pérdida axonal, así como a un aumento del proceso de remielinización en aquellos ratones infectados y tratados con el inhibidor reversible de la MAGL. 137 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados RESUMEN PARTE 3: Se concluye de esta tercera parte de la presente Tesis doctoral que, tras la administración de forma terapéutica del inhibidor reversible de la MAGL, el UCM03025, en dos modelos expe- rimentales diferentes de esclerosis múltiple como son el modelo de EAE, y el modelo de TMEV, se produce una mejoría significativa de los déficits neurológicos presentes en ambos modelos. Además, el tratamiento con UCM03025 en el modelo de TMEV-IDD disminuye la expresión de CSPGs y la inflamación en la médula espinal, produciéndose un aumento del número de oligo- dendrocitos proliferativos, así como del número de oligodendrocitos maduros llevando todo ello a una menor pérdida axonal, así como a un aumento de los procesos de remielinización. Los datos recopilados en ambos modelos experimentales revelan la importancia de au- mentar el tono endocannabinoide del 2-AG como mecanismo para disminuir la inflamación y promover los procesos endógenos de reparación en modelos murinos de EM. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 138 Re su lta do s 139 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados PARTE 4. MODULACIÓN DE LA SÍNTESIS DE CSPGs POR 2-AG E INHIBIDORES FARMACO- LÓGICOS DE LA MAGL EN ASTROCITOS EN CULTIVO Los astrocitos son las principales células responsables del aumento de los CSPGs en si- tuaciones patológicas por exposición a citoquinas como TGF-β, siendo esta una de las cito- quinas mayormente implicadas en la formación de la cicatriz glial (Silver and Miller 2004). Se ha descrito previamente que el TGF-β produce un aumento en la activación y proliferación de astrocitos in vitro (Dyck, Alizadeh et al. 2015, Johns, Babcock et al. 1992) así como un aumento de la expresión de CSPGs, principalmente del Neurocán y Brevicán (Asher, Morgenstern et al. 2000, Hamel, Mayer et al. 2005, Schachtrup, Ryu et al. 2010). Debido al potente papel inhibi- torio de los CSPGs sobre los procesos de regeneración, supone de gran interés modular la ruta de síntesis de CSPGs liberados por los astrocitos en situaciones de daño del SNC. En base a los resultados previamente mostrados en relación a los efectos del aumento del tono endógeno del 2-AG sobre la disminución de la expresión de CSPGs, así como de una menor reactividad astroglial, quisimos evaluar el efecto del 2-AG, UCM03025 y otros inhibido- res de la hidrólisis del 2-AG, en la síntesis de proteoglicanos por astrocitos de rata en cultivo. 4.1. Efecto del 2-AG en la expresión de CSPGs en astrocitos en cultivo. Implicación del receptor CB2. Para investigar el efecto del 2-AG sobre astrocitos purificados in vitro y las posibles rutas de señalización implicadas, se realizaron cultivos de astrocitos primarios procedentes de cere- bros de ratas postnatales y se estimularon en primer lugar con las citoquinas TGF-β1 (20ng/ml) y bFGF (10ng/ml), citoquinas que según la literatura inducen previamente un aumento de sín- tesis de proteínas de matriz extracelular (Flanders, Ludecke et al. 1993, Smith and Hale 1997, Smith and Strunz 2005). En primer lugar, se analizó la expresión de ARNm del proteoglicano Brevicán a las 24h de la administración del estímulo TGF-β1+ bFGF en presencia o ausencia de 2-AG a 100 nM, 500 nM y 1 µM para determinar la dosis efectiva. Como muestra la Figura 46A, la dosis que redujo significativamente la expresión del Brevicán fue la de 100 nM, no viéndose efecto significativo a 500 nM ni a 1 µM. A continuación, se evaluó la expresión de Neurocán mediante inmunocitoquímica y se observó que el marcaje era evidente en aquellos astrocitos estimulados, siendo apenas detectable en aquellos que habían sido cotratados con 2-AG a la Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 140 Re su lta do s dosis de 100 nM (Figura 46B). Figura 46. Las citoquinas TGF-β1+ bFGF inducen la expresión de Neurocán y Brevicán en astrocitos en cultivo. El endocannabinoide 2-AG reduce su expresión a una dosis efectiva de 100 nM (A) Inmunocitoquímica para Neurocán (rojo) y GFAP (verde) en cultivo de as- trocitos de rata estimulados con TGF-β1 20 ng/ml y bFGF 10 ng/ml y tratados con 2-AG a una dosis de 100 nM durante 24 horas. (B) Análisis de la expresión del ARN mensajero de Brevicán evaluado mediante RT-PCR en astrocitos tratados con TGF-β1 20 ng/ml bFGF 10 ng/ml y 2-AG a las dosis de 100 nM, 500 nM, 1 µM durante 24 horas. Los datos se repre- sentan como la media ± SEM: *** p<0,001 vs CTL; ## p<0,01 vs TGF-β1 bFGF. 141 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Ya que, en la literatura científica, la administración de la citoquina TGF-β induce una expresión de CSPGs similar a la provocada en coadministración junto con la citoquina bFGF, se decidió estimular a los astrocitos únicamente con TGF-β con el fin de identificar los receptores y las rutas implicadas en el efecto del 2-AG sobre la inducción de los proteoglicanos. Para ello, en primer lugar, se observó que mediante estimulación con TGF-β1, 20 ng/ml, se producía un aumento del marcaje para Neurocán similar a la observada con TGF-β+bFGF mediante inmunocitoquímica. La administración de 2-AG a una dosis de 100 nM 30 min antes o en coadministración con TGF-β1 durante 24 horas produjo una disminución en el marcaje para el proteoglicano respecto a aquellos astrocitos únicamente estimulados con la citoquina (Figura 47). Figura 47. El tratamiento únicamente con TGF-β1 es suficiente para aumentar la expresión de Neurocán en astrocitos en cultivo. El endocannabinoide 2-AG reduce su expresión a una dosis de 100nM en coadministración o 30 minutos antes que el estímulo (A) La inmunocitoquímica para Neurocán (rojo) y GFAP (verde) en astrocitos de rata estimulados únicamente con TGF-β1 20 ng/ml y tratados 30 minutos antes o en coadministración con 2-AG a una dosis de 100 nM durante 24 horas muestra que la citoquina TGF-β1, sola, es capaz de inducir la expresión de Neurocán, niveles de expresión que se encuen- tran reducidos en aquellos astrocitos tratados con 2-AG. Para continuar con el estudio del efecto del 2-AG sobre la expresión de diferentes CSPGs, se llevó a cabo el análisis de tres proteoglicanos, Neurocán, Brevicán y Fosfacán en lisado de as- trocitos mediante la técnica de western-blot a las 24h de tratamiento. Además, para determi- nar los receptores implicados en la acción del 2-AG, se trató a los astrocitos 30 minutos antes de la administración de 2-AG con antagonistas para el receptor cannabinoide CB1 (SR14176, 1 µM) y para el receptor CB2 (AM630, 1 µM). Como muestra la Figura 48, los niveles de los Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 142 Re su lta do s proteoglicanos Neurocán (A), Brevicán (B) y Fosfacán (C) se encontraban aumentados en astro- citos estimulados por TGF-β1, inducción que se vio disminuida en los tres proteoglicanos tras el tratamiento con 2-AG, tanto si había sido administrado en pre-tratamiento 30 min antes como co-administrado junto al TGF-β1. La administración única del 2-AG no produjo aumento de la expresión de los proteoglicanos, incluso redujo sus niveles de manera significativa respecto al nivel control en el caso de Neurocán y Fosfacán. Al utilizar antagonistas de los receptores CB1 y CB2, se observó que el efecto del 2-AG disminuyendo los niveles de Neurocán era revertido tras la administración de un antagonista para el receptor CB2, aunque no se vio cambio signi- ficativo en caso del Brevicán. No se observaron cambios significativos en cuanto al efecto del 2-AG en coadministración con el antagonista para el receptor CB1 para ninguno de los proteo- glicanos. Por último, los antagonistas administrados en solitario tampoco mostraron ningún efecto en la expresión de los diferentes proteoglicanos. Figura 48. El 2-AG disminuye la expresión de Brevicán, Fosfacán y Neurocán en astrocitos in vitro actuando a través del receptor CB2 en el caso del Neurocán. Análisis de la expresión mediante western-blot de (A) Neurocán (B) Brevicán y (C) Fosfacán en astrocitos de rata estimulados con TGF-β1 20 ng/ml y en coadministración o 30 mi- nutos antes con 2-AG (100 nM) durante 24 horas. Los antagonistas de los receptores CB1 (SR14176, 1 µM) y CB2 (AM630, 1 µM) fueron administrados 30 minutos antes del tratamiento con 2-AG. Los datos se representan como 143 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados la media ± SEM: * p<0,05 ** p<0,01 *** p<0,001 vs CTL; # p<0,05 ## p<0,01 ### p<0,001 vs TGF-β1.  p<0,01 vs TGF-β1+2-AG. 4.2. Efecto de los inhibidores de la MAGL en la expresión de CSPGs en astrocitos en cultivo. Dado el efecto de la administración directa del 2-AG sobre los astrocitos in vitro dismi- nuyendo la expresión de los CSPGs, a continuación, se evaluó este mismo efecto, pero aumen- tando el tono endógeno de 2-AG mediante la administración de diferentes inhibidores de las enzimas MAGL y ABDH6, enzimas responsables del 80% y 6% de la hidrólisis del 2-AG respec- tivamente. Para ello se determinó la expresión de los diferentes proteoglicanos en astrocitos estimulados con TGF-β1, en coadministración con dos inhibidores de la MAGL, uno reversible (UCM03025) y uno irreversible (JZL 184) y un inhibidor de la enzima ABDH6 (WWL70). Para ello, los astrocitos fueron estimulados con TGF-β1 20 ng/ml con o sin los siguientes inhibidores de las enzimas de hidrolisis del 2-AG (UCM03025 1 µM, JZL 184 1 µM, WWL70 10 µM) durante 24 horas. Pasado ese tiempo se analizó la expresión de los proteoglicanos Neu- rocán y Brevicán en el lisado celular mediante western-blot. Como muestra la Figura 49, el incremento en los niveles de Neurocán (A) y Brevicán (B) en aquellos astrocitos estimulados con TGF-β1 se vieron reducidos en aquellos tratados con los inhibidores de las enzimas de hidrólisis del 2-AG. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 144 Re su lta do s Figura 49. El tratamiento con distintos inhibidores de enzimas de hidrólisis del 2-AG disminuyen la expresión de Neurocán y Brevicán en astrocitos en cultivo. Análisis de la expresión mediante western-blot de (A) Neurocán y (B) Brevicán en astrocitos de rata estimulados con TGF-β1 20ng/ml y tratados con dos inhibidores de la enzima MAGL (reversible, UCM03025 1 µM; irreversible, JZL 184 1 µM) y de la enzima ABDH6 (WWL70 10 µM) durante 24 horas. Los datos se representan como la media ± SEM: * p<0,05 ** p<0,01 vs CTL; # p<0,05 ## p<0,01 ### p<0,001 vs TGF-β1. 4.3. Efecto del 2-AG e inhibidores de su hidrólisis en la liberación del proteoglicano Neurocán al sobrenadante en astrocitos en cultivo. La estructura proteica de los CSPGs es sintetizada en el retículo endoplasmático, estructura a la que se le unen a posteriori cadenas de glicosaminoglicanos, así como los grupos sulfato en el Golgi, momento en el que son embebidos en vesículas y liberados al medio extracelular (Sil- bert and Sugumaran 2002). Ya que la mayoría de los proteoglicanos tienen que ser liberados al medio extracelular para realizar sus funciones, a excepción del proteoglicano NG2 que aparte de ser liberado al medio, también puede mantenerse anclado a la membrana celular, quisimos determinar si la reducción observada de la expresión de Neurocán en astrocitos estimulados con TGF-β1 y tratados con 2-AG e inhibidores de su hidrólisis, también se ve reflejada en una disminución del mismo al medio extracelular, es decir, al sobrenadante celular. Para ello se siguió el mismo protocolo descrito anteriormente y a las 24 horas de tratamiento se cogió el sobrenadante celular con el que se realizó un ensayo de ELISA para el proteoglicano Neurocán. Tal y como muestra la Figura 50 se pudo detectar una mayor cantidad del proteoglicano Neuro- cán en el sobrenadante de los astrocitos estimulados con TGF-β1, valores que se encontraron reducidos en aquellos astrocitos tratados con 2-AG. Se observó así mismo una disminución de los valores de Neurocán en aquellos astrocitos tratados con los dos inhibidores de la enzi- ma MAGL, el reversible (UCM03025) y el canónico irreversible (JZL 184) no encontrándose en este caso efecto alguno a este nivel en el caso del inhibidor de la enzima de hidrólisis ABDH6 (WWL70). 145 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Figura 50. El tratamiento con 2-AG, así como con inhibidores de la MAGL disminuyen la liberación del proteo- glicano Neurocán al medio extracelular en astrocitos en cultivo. El análisis mediante ELISA de los niveles de Neurocán en los sobrenadantes de astrocitos de rata estimulados con TGF-β1 20 ng/ml y tratados con 2-AG (100 nM), UCM03025 (1 µM), JZL184 (1 µm) y WWL70 (10 µM) durante 24 horas muestra una reducción de los niveles de Neurocán en aquellos astrocitos tratados con 2-AG y con los inhibidores de la MAGL. Los datos se representan como la media ± SEM: *** p<0,001 vs CTL; # p<0,05, ## p<0,01 ### p<0,001 vs TGF-β1. 4.4. Efecto del 2-AG sobre las vías de señalización implicadas en la síntesis de los CSPGs. Trabajos previos muestran que una de las rutas de señalización de la síntesis de los CSPGs depende de la ruta canónica de SMAD (Schachtrup, Ryu et al. 2010, Susarla, Laing et al. 2011). Así, en esta ruta, la activación del receptor de TGF-β induce una fosforilación de las proteínas SMAD2 y SMAD3 que da lugar a la generación de un complejo de señalización SMAD formado tras la unión de la proteína SMAD4 (Massague, Seoane et al. 2005). Sin embargo, estudios publicados en el año 2015 por Jahan y Hannila (Jahan and Hannila 2015) evidenciaron que la síntesis de los CSPGs inducida por TGF-β1, no se realizaba a través de la señalización por las proteínas SMAD, sino que era mediada a través de la ruta de PI3K/Akt/mTOR. Con el propósito de evaluar si el 2-AG es capaz de regular alguna de las dos vías descritas hasta la fecha implicadas en la síntesis de CSPGs, la ruta de SMAD y la ruta de PI3K- mTOR-Akt, se realizó un análisis de los niveles de fosforilación de las proteínas implicadas en ambas rutas, mediante western-blot, en lisado de astrocitos de rata estimulados y tratados con 2-AG (100 nM) a 1h de tratamiento. Además, con el fin de determinar los receptores implicados en la acción del 2-AG a este nivel, los astrocitos fueron tratados 30 minutos antes de la administra- ción de 2-AG, con antagonistas para el receptor cannabinoide CB1 (SR14176, 1 µM) y para el receptor CB2 (AM630, 1 µM). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 146 Re su lta do s En primer lugar, en relación a la ruta canónica de síntesis de CSPGs, la ruta de SMAD, se observó como muestra la Figura 51 que la fosforilación tanto de SMAD2 como de SMAD3 se encontraron significativamente aumentadas en los astrocitos estimulados con TGF-β1 (20 ng/ ml), fosforilación que se vio reducida en el caso de la proteína SMAD2 tras la administración del 2-AG (100 nM). Además, este efecto se vio revertido en coadministración con el antagonis- ta de CB2, indicando que el 2-AG podría estar ejerciendo este efecto a través de dicho receptor. Figura 51. Los astrocitos estimulados con TGF-β1 aumentan la señalización vía SMAD2/SMAD3 viéndose esta disminui- da con el tratamiento con 2-AG. Este efecto es revertido con un antagonista del receptor CB2. Análisis de la expresión mediante western-blot de (A) fosforilación de SMAD2 y (B) fosforilación de SMAD3 en astrocitos de rata estimulados con TGF-β1 20 ng/ml y tratados con 2-AG (100 nM) durante 24 horas. Los antagonistas de los receptores CB1 (SR14176, 1 µM) y CB2 (AM630, 1 µM) fueron administrados 30 minutos antes del tratamiento con 2-AG. Se utilizó un inhibidor de la ruta de señalización, el compuesto SB431542 (20 µM). Los datos se representan como la media ± SEM: *** p<0,001 vs CTL; # p<0,05 ### p<0,001 vs TGF-β1;  p<0,01 vs TGF-β1+2-AG. En segundo lugar, se evaluó el efecto del 2-AG en la otra vía que se había descrito invo- lucrada en la síntesis de CSPGs mediada por TGF-β, la ruta de PI3K- mTOR -Akt. Para ello se llevó a cabo el análisis de la fosforilación de Akt y mTOR mediante western-blot. Como puede observarse en la Figura 52, la fosforilación tanto de Akt (A) como de mTOR (B) se encontraban también disminuidas en los astrocitos tratados con 2-AG, efecto revertido en el caso de mTOR, en aquellos astrocitos a los que se les coadministró el endocannabinoide junto con el antago- nista de CB2. 147 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados Figura 52. Los astrocitos estimulados con TGF-β1 aumentan la señalización vía Akt-mTOR viéndose esta disminuida con el tratamiento con 2-AG. Este efecto es mediado a través del receptor CB2. Análisis de la expresión mediante western-blot de (A) fosforilación de Akt y (B) fosforilación de mTOR en astrocitos de rata estimulados con TGF-β1 20 ng/ml y tratados con 2-AG (100 nM) durante 24 horas. Los antagonistas de los receptores CB1 (SR14176, 1 µM) y CB2 (AM630, 1 µM) fueron adminis- trados 30 minutos antes del tratamiento con 2-AG. Se utilizó un inhibidor de la ruta de señalización, el compuesto LY 294002 (10 µM). Los datos se representan como la media ± SEM: ** p<0,01 vs CTL; ## p<0,01 ### p<0,001 vs TGF-β1;  p<0,05 vs TGF-β1+2-AG. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 148 Re su lta do s 149 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Resultados RESUMEN 4: Se resume de la cuarta y última parte de la presente Tesis doctoral que los astrocitos pu- rificados in vitro y tratados con la citoquina TGF-β1 durante 24 horas, aumentan la expresión de los proteoglicanos Neurocán, Brevicán y Fosfacán. Que al tratar esos astrocitos con el endo- cannabinoide 2-AG, así como con inhibidores de dos de sus enzimas de hidrólisis, la MAGL y la ABDH6, se produce una disminución de la expresión de dichos proteoglicanos a nivel celular, además el efecto del 2-AG regulando los niveles de Neurocán se ven revertidos al administrar un antagonista del receptor CB2. Tanto el 2-AG como los dos inhibidores de la MAGL redujeron significativamente los niveles de Neurocán liberado al medio extracelular. El endocannabinoi- de 2-AG podría estar disminuyendo la síntesis de proteoglicanos actuando a través de la vía de señalización canónica de síntesis de proteoglicanos TGF-β/SMAD, así como a través de la vía de PI3K-Akt-mTOR pudiendo estar implicada la activación del receptor CB2 en este mecanismo. Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 150 D is cu si ón 151 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusiónV. DISCUSIÓN Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 152 D is cu si ón 153 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión La EM es una enfermedad desmielinizante, neurodegenerativa, de curso crónico y com- ponente autoinmune, que produce un déficit funcional afectando a múltiples áreas del SNC. A lo largo de su evolución clínica aparecen fases inflamatorias, predominantes en las primeras etapas de la enfermedad seguidas de un estadio más tardío donde predomina la desmieliniza- ción y el daño axonal que generan como consecuencia una discapacidad permanente. En la actualidad, las terapias dirigidas frente al componente inflamatorio de la EM me- diante el uso de inmunomoduladores o inmunosupresores, han sido de gran utilidad reducien- do la aparición de los brotes, sin bien, resultan poco eficaces conforme la enfermedad progre- sa. Datos clínicos y experimentales apuntan a que, durante la fase progresiva, los mecanismos endógenos de remielinización y regeneración no son lo suficientemente efectivos por lo que es importante desarrollar tratamientos dirigidos a fomentar dichos procesos reparativos, así como reducir la neurotoxicidad y promover un perfil antiinflamatorio. Entre los responsables de interferir en dichos mecanismos endógenos de reparación se encuentran los CSPGs, macromoléculas que forman parte de la matriz extracelular y que se acumulan en la llamada cicatriz glial. La cicatriz glial se genera en respuesta a una situación de daño dentro del SNC cuya función, a corto plazo, es la de limitar la expansión del daño y la inflamación (Voskuhl, Peterson et al. 2009, Hamby and Sofroniew 2010). Sin embargo, a largo plazo supone una barrera física y química para que tengan lugar los procesos de remieliniza- ción y regeneración axonal (Cregg, DePaul et al. 2014). Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 154 D is cu si ón 155 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión 1. Expresión de los CSPGs y su inhibición en el modelo de TMEV-IDD Durante los procesos de desmielinización crónica se produce un aumento en la expresión de los niveles de CSPGs formando parte de la cicatriz astroglial (Lau, Keough et al. 2012, Siebert and Osterhout 2011). Los CSPGs impiden la remielinización y regeneración axonal debido a su capacidad para inhibir la diferenciación de los progenitores de oligodendrocitos, así como el crecimiento axonal y la supervivencia neuronal (Dyck, Alizadeh et al. 2015, Lang, Cregg et al. 2015, Zhou, Li et al. 2014). De hecho, mediante terapias que digieren de manera enzimática las cadenas GAGs de los CSPGs (Bartus, James et al. 2014, Keough, Rogers et al. 2016, Lau, Keough et al. 2012, Pendleton, Shamblott et al. 2013, Siebert and Osterhout 2011) o que inciden en su ruta de síntesis o bloquean los receptores a través de los cuales los CSPGs ejercen sus efectos (Lang, Cregg et al. 2015), se revierten estos efectos inhibitorios in vitro e in vivo promoviendo la remielinización y la regeneración axonal. El modelo de TMEV-IDD es un modelo viral de EM que modeliza su variante primaria progresiva. En él se dan procesos de desmielinización, así como de disfunción axonal y neuro- lógica en los que se pueden estudiar la influencia de los CSPGs. En este contexto, se ha descrito previamente que en el modelo de TMEV-IDD se produce remielinización espontánea en las zonas de lesión (Denic, Wootla et al. 2014, Mecha, Carrillo-Salinas et al. 2013) sin embargo, se postula que esa remielinización no es efectiva en las fases más avanzadas de la patología debido, en parte, al incremento en los niveles de CSPGs que se ha observado en este modelo de EM (Feliu, Moreno-Martet et al. 2015, Haist, Ulrich et al. 2012). El primer objetivo del presente estudio fue analizar en detalle la expresión de diferentes CSPGs en dos periodos de tiempo durante la fase crónica del modelo de TMEV-IDD. El aná- lisis mediante el uso del anticuerpo CS-56 indicó que estas macromoléculas se encuentran altamente expresadas en la sustancia blanca de la médula espinal de los animales infectados con el virus de Theiler, aumento que ha sido previamente observado en otros modelos experi- mentales de EM como el modelo de EAE (Keough et al. 2016), en modelos de desmielinización por lisolecitina y por cuprizona (Hibbits, Yoshino et al. 2012, Keough, Rogers et al. 2016, Lau, Keough et al. 2012), y en modelos de lesión medular (Gris, Tighe et al. 2007). Resulta de interés que la acumulación de los CSPGs que observamos en nuestro estudio está asociada a zonas Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 156 D is cu si ón desmielinizadas con elevada astrogliosis. Se ha descrito que los astrocitos presentes en la ci- catriz glial tienen un mayor número de procesos filamentosos con aumento en la expresión de GFAP, Vimentina y Nestina (Norton, Aquino et al. 1992). Estos datos concuerdan con lo descri- to en nuestro estudio donde observamos un incremento en la expresión de GFAP y Vimentina en la médula espinal de los animales TMEV. Además, aquellos astrocitos reactivos Vimentina positivos lo eran también para el marcador de CSPGs CS-56, indicando además que esta célula glial es la principal fuente de síntesis de los CSPGs de acuerdo con otros estudios (Hamby and Sofroniew 2010). En concordancia con el incremento en el marcaje por inmunohistoquímica para CS-56, los proteoglicanos Fosfacán, Brevicán y Neurocán estaban aumentados tanto a nivel de ARNm como a nivel total proteico, confirmando el incremento en la síntesis de CSPGs en la fase crónica del modelo de Theiler. La mayoría de las terapias dirigidas a solucionar distintos tipos de daño en el SNC su- gieren la eliminación de la cicatriz glial a través de la inhibición de la astrogliosis, aunque esta aproximación puede impedir también los procesos de regeneración (Anderson, Burda et al. 2016), lo que sugiere que algunos astrocitos presentan propiedades neuroprotectoras (Faulk- ner, Herrmann et al. 2004). Por lo tanto, más que inhibir la funcionalidad de los astrocitos por completo habría que incidir directamente en la síntesis de aquellas moléculas inhibitorias producidas por estas células gliales. Se considera así que la administración de compuestos que impidan la síntesis y acumulación de los CSPGs constituye una estrategia interesante para facilitar los procesos de remielinización y regeneración axonal en patologías desmielinizantes (Soleman, Filippov et al. 2013). De hecho, la administración de la enzima bacteriana condroi- tinasa ABC se ha utilizado ampliamente en modelos de lesión medular donde ha mostrado tener efectos positivos promoviendo la regeneración axonal. Sin embargo, esta enzima requie- re su administración de manera focal en la zona de lesión (Bartus, James et al. 2014, Siebert, Stelzner et al. 2011, Zhao and Fawcett 2013), hecho que la descarta para su uso en modelos de EM, donde las lesiones no son tan fácilmente localizables ni accesibles. Es por ello por lo que en nuestro estudio se han utilizado dos compuestos que inciden en diferentes puntos de la ruta de síntesis y anclaje de las cadenas GAGs a la estructura proteica del proteoglicano, el xilósido y un análogo de la glucosamina, la fluorosamina, administrados por vía sistémica du- rante la fase crónica de TMEV-IDD. De esta manera evitan la secreción de los CSPGs al medio 157 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión extracelular. En nuestro modelo de estudio, tanto el xilósido como la fluorosamina redujeron la ex- presión de los proteoglicanos recuperándose la función motora de los animales infectados con TMEV, si bien pareció ser más efectivo el tratamiento con xilósido. Estos hallazgos concuerdan con otros estudios realizados en modelos desmielinizantes como el modelo de lisolecitina y de EAE donde el tratamiento con dichos compuestos redujeron así mismo la expresión de los CSPGs y la puntuación clínica en el caso del modelo de EM (Keough, Rogers et al. 2016, Lau, Keough et al. 2012). En modelos de lesión medular la administración de inhibidores de la sínte- sis de CSPGs también disminuyeron la acumulación de CSPGs ejerciendo un efecto terapéutico (Rolls, Shechter et al. 2008). De especial relevancia es la reciente descripción de que la matriz generada in vitro por astrocitos tratados con fluorosamina resulta menos inhibitoria en la dife- renciación de los oligodendrocitos (Keough, Rogers et al. 2016). La mejora en la sintomatología observada tras la inhibición de la síntesis y acumulación de los CSPGs señala por tanto la importancia de las mismas en la evolución progresiva y en la fisiopatología del modelo de TMEV-IDD, subrayando el potencial terapéutico que supondría su inhibición en patologías desmielinizantes. Sin embargo, existe una limitación para el uso terapéutico del xilósido ya que no solo incide en la ruta de síntesis de CSPGs, sino que afecta también a la síntesis de otros proteoglicanos del tipo heparan sulfatos y dermatán sulfatos, pudiendo limitar la producción de proteínas necesarias también para la estabilidad de la matriz extracelular. En este aspecto, un compuesto que incida en el paso de síntesis de las cadenas GAGs o en su polimerización o sulfatación y no antes, resultaría más interesante desde el pun- to de vista terapéutico. La fluorosamina actuaría a este nivel impidiendo la formación de los disacáridos de las cadenas GAGs, sin embargo, podría actuar como un sustrato alternativo de la GlcNAc y no como un inhibidor competitivo como sugiere el estudio de Keough et al 2016, lo que indicaría que la inhibición de la síntesis de CSPGs no es completa. Este podría ser el mo- tivo por el cual con la fluorosamina no llegamos a observar el mismo efecto terapéutico que alcanzamos con el xilósido. Junto con estas limitaciones, habría que tener también en cuenta que tanto la fluoro- samina como el xilósido reducen la secreción de los CSPGs, pero no la producción de otros Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 158 D is cu si ón factores inhibitorios presentes en la zona de lesión como son Notch, Wnt, Lingo-1 o las semafo- rinas (Huang, Fancy et al. 2011) que podrían seguir limitando la remielinización y regeneración axonal. 159 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión 2. Eficacia terapéutica del inhibidor de la enzima MAGL en dos modelos experi- mentales de EM Con el fin de promover los mecanismos de regeneración sería necesaria la combinación de terapias que permitan la neutralización del ambiente inhibitorio generado en las zonas de lesión, y que promuevan la diferenciación de los oligodendrocitos permitiendo de esta manera la creación de ambientes más favorables para facilitar el proceso de remielinización y regene- ración. Con objeto de investigar si el aumento del tono endógeno de 2-AG podría ser beneficioso en modelos experimentales de EM, usamos un inhibidor selectivo y reversible de la MAGL de- nominado UCM03025. Tras comprobar su capacidad para aumentar los niveles de 2-AG en la médula espinal de los animales de estudio, se observó que su administración mejoraba la sin- tomatología asociada tanto al modelo de EAE como al de TMEV-IDD. En el caso de TMEV-IDD, dicho efecto era dependiente de los receptores cannabinoides CB1 y CB2, ya que el bloqueo de ambos revertía la mejoría en la actividad motora espontánea a niveles de los ratones que habían sido tratados con vehículo. Ambos receptores se han visto implicados en las acciones beneficiosas, ejercidas por 2-AG en un modelo de lesión medular, reduciendo la expansión de la lesión, así como el daño en la sustancia blanca (Arevalo-Martin, Garcia-Ovejero et al. 2010). . Además la implicación de los receptores CB1 y CB2 en la actividad del 2-AG se ha mostrado en investigaciones previas según las cuales ambos receptores son necesarios para inducir la pro- liferación y diferenciación de los oligodendrocitos in vitro (Gomez, Arevalo-Martin et al. 2010, Gomez, Sanchez-Rodriguez et al. 2015). El efecto beneficioso del aumento del tono endógeno de 2-AG sobre los déficits motores en el modelo de TMEV, se confirmó en nuestro estudio ad- ministrando el propio 2-AG de manera directa en el ventrículo cerebral lateral mediante el uso de minibombas osmóticas. El efecto terapéutico observado tras el tratamiento con el inhibidor de la MAGL podría deberse a acciones del 2-AG en múltiples dianas, entre ellas sobre procesos inflamatorios que tienen lugar en ambos modelos de estudio, pero también podría estar actuando a nivel de la acumulación de CSPGs no existiendo datos en la literatura científica en cuanto a este tema. En relación al proceso inflamatorio, observamos que el tratamiento con UCM0325 disminuyó la Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 160 D is cu si ón cantidad de infiltrados en la médula espinal, así como la reactividad de la microglía en ambos modelos de EM. Además, la disminución en la expresión génica de la citoquina proinflamatoria IL-1β junto con el aumento de los niveles de la enzima arginasa-1 sugieren que el 2-AG está ejerciendo un efecto anti-inflamatorio de acuerdo con las acciones de los cannabinoides am- pliamente descritas en la literatura (Arevalo-Martin, Vela et al. 2003, Croxford and Miller 2003, Klein 2005). Además de sus acciones en el modelo de lesión medular ya comentadas, el 2-AG limita el daño cerebral en un modelo de hipoxia-isquemia (Lara-Celador, Castro-Ortega et al. 2012) y en un modelo de EAE mejorando la sintomatología clínica tanto en la fase aguda como en la fase crónica (Lourbopoulos, Grigoriadis et al. 2011). Así mismo, el uso de un inhibidor irreversible de la MAGL, el JZL184, disminuyó la respuesta inflamatoria en un modelo de Al- zheimer, y en cultivos de microglía y astrocitos expuestos a agentes inflamatorios (Pihlaja, Tak- kinen et al. 2015). De especial interés es que tanto el 2-AG como el JZL184 reducen la muerte de los oligodendrocitos en cultivo inducida por AMPA, así como la inflamación en el modelo de EAE. Además, el compuesto JZL184 es capaz de conservar la integridad de la mielina en un mo- delo de desmielinización por cuprizona (Bernal-Chico, Canedo et al. 2015). Son consistentes los hallazgos positivos derivados de la inhibición de la MAGL con el inhibidor JZL184, sin embargo, al ser un inhibidor que actúa de manera irreversible, puede inducir tolerancia farmacológica por desensibilización de los receptores cuando se administra de manera crónica, lo que sitúa a los inhibidores reversibles de la MAGL, como el UCM03025, como compuestos con perfiles más interesantes desde el punto de vista terapéutico. Una vez que observamos que en el modelo de TMEV existe astrogliosis asociada a una acumulación de CSPGs en zonas desmielinizantes quisimos conocer si la atenuación de la se- veridad sintomatológica inducida por el inhibidor de la MAGL en la fase crónica del modelo de Theiler, podría ser también resultado de acciones del 2-AG sobre los niveles de CSPGs. En relación a este hecho, el tratamiento con UCM03025 redujo la astrogliosis y la acumulación de los CSPGs en la médula espinal de los ratones infectados con TMEV, disminuyendo específica- mente los niveles de Fosfacán y de Neurocán a los 85 y 105 dpi. Conviene subrayar que este efecto se vio acompañado de un aumento en el número de oligodendrocitos proliferantes, así como de oligodendrocitos maduros y más importante, de un aumento en la expresión de mar- cadores para mielina del tipo MBP. Se sabe que en las patologías desmielinizantes se estimula 161 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión la oligodendrogénesis, los OPCs proliferan y migran hacia la zona desmielinizada con el objeti- vo de madurar y producir nuevas vainas de mielina. Las investigaciones realizadas a día de hoy apuntan a que la mayoría de los oligodendrocitos que acuden a la zona lesionada provienen del parénquima (Polito and Reynolds 2005) aunque se ha señalado también la posible contri- bución de los nichos neurogénicos como la zona subventricular (SVZ) a los procesos de remie- linización (Mecha, Feliu et al. 2013, Menn, Garcia-Verdugo et al. 2006, Nait-Oumesmar, Decker et al. 1999, Picard-Riera, Decker et al. 2002). En esta línea, hay estudios que indican que los cannabinoides modulan la oligodendrogénesis, ya que el tratamiento con agonistas del recep- tor CB1 aumenta la oligodendrogénesis en la SVZ (Arevalo-Martin, Garcia-Ovejero et al. 2007, Solbrig, Fan et al. 2010, Xapelli, Agasse et al. 2014). En EM, aunque los axones desmielinizados remielinizan espontáneamente en las fases de remisión, es el fallo en el proceso de remieli- nización que tiene lugar en las fases progresivas de la enfermedad el que desemboca en una neurodegeneración progresiva dando lugar a disfunción y discapacidad irreversible (Franklin 2002). En general, este fallo se ha atribuido no a una falta de OPCs en la zona lesionada, sino a una escasa diferenciación, como se ha observado tanto en la EM (Chang, Tourtellotte et al. 2002) como en el modelo de TMEV-IDD (Ulrich, Seeliger et al. 2008). Es importante resaltar que en nuestro estudio, la capacidad de los oligodendrocitos de proliferar y madurar tras el aumento del tono endógeno de 2-AG, estaría de acuerdo con las acciones de diferentes tipos de cannabinoides actuando en los oligodendrocitos, bien protegiéndoles de estímulos tóxicos (Mecha, Torrao et al. 2012, Ribeiro, Yu et al. 2013) o promoviendo su proliferación y diferencia- ción (Arevalo-Martin, Garcia-Ovejero et al. 2007, Gomez, Arevalo-Martin et al. 2010, Gomez, Sanchez-Rodriguez et al. 2011, Gomez, Sanchez-Rodriguez et al. 2015, Molina-Holgado, Vela et al. 2002). Finalmente, quisimos analizar si los cambios observados en la población oligodendro- glial se traducían en remielinización y los análisis realizados en nuestro estudio a los 105 días, 20 días después de haber cesado el tratamiento con UCM03025, en un tiempo considerado óptimo para evaluar si se ha producido remielinización (Warrington, Asakura et al. 2000) así lo indican. El tratamiento con UCM03025 tuvo efectos a largo plazo tanto a nivel de mejoría de la función motora, como de una disminución en los niveles de CSPGs. Además, ambos efectos se correlacionaron con un mayor número de axones remielinizados que muestran vainas de Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 162 D is cu si ón mielina más finas reflejado en el incremento del valor del g-ratio en los axones de las médulas espinales de los ratones tratados con UCM03025. Investigaciones anteriores de nuestro grupo ya habían detectado que la activación de los receptores CB1 y CB2 promueven remielinización coincidente con una mejoría en la sintomatología en el modelo de TMEV-IDD mediante el tra- tamiento con cannabinoides sintéticos como WIN55,212-2, ACEA y JWH-015 (Arevalo-Martin, Vela et al. 2003). En la presente Tesis comprobamos además que existe una disminución del daño axonal observado mediante tinción con Neurofilamento-H, así como con una mejoría del transporte axonal en el tracto cortico-espinal detectada mediante el trazador BDA. En la misma línea el tratamiento con UCM03025 resultó efectivo manteniendo la integridad de la mielina y disminuyendo el daño axonal en el modelo de EAE. Es importante destacar el potencial te- rapéutico del inhibidor de la MAGL disminuyendo la pérdida axonal en dos modelos de EM, ya que esta es la principal causa de deterioro progresivo en los pacientes con EM donde las terapias actuales no resultan del todo efectivas. Teniendo en cuenta lo descrito previamente en la literatura científica sobre el efecto deletéreo de la acumulación de los CSPGs y el fallo en los procesos de remielinización que ocurre en la EM (Siebert and Osterhout 2011, Lau, Keough et al. 2012), resulta de gran interés identificar una terapia capaz no solo de promover la proliferación y maduración de los oligo- dendrocitos sino que sea también capaz de reducir la expresión de CSPGs en la zona lesionada, lo que ayudaría a generar ambientes más favorables para que tengan éxito los mecanismos endógenos de reparación no solo en modelos de EM, sino también en lesión medular. Los re- sultados obtenidos apoyan la hipótesis de que el aumento de los niveles de 2-AG generado por inhibición de la MAGL mejora la sintomatología en dos modelos de EM, actuando a través de los receptores cannabinoides CB1 y CB2. En el caso del modelo de TMEV-IDD, este efecto po- dría deberse a una disminución en la producción de CSPGs por parte de los astrocitos, neutrali- zando el ambiente inhibitorio predominante en las zonas desmielinizadas. Esta observación va acompañada por una mayor diferenciación de OPCs que podría estar contribuyendo al proceso de remielinización y a la protección axonal. No se puede descartar, sin embargo, que el efecto positivo ejercido por el inhibidor de la MAGL, sea también debido a sus propiedades inmuno- moduladoras, tanto en el modelo de TMEV-IDD como en el modelo de EAE. De manera alter- nativa o más bien complementaria el UCM03025 podría actuar como agente antiexcitotóxico 163 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión y neuroprotector mediante la activación de receptores CB1 y CB2 en neuronas, células gliales y células inmunes. Esta hipótesis estaría apoyada por estudios que han descrito que el 2-AG reduce los efectos excitotóxicos inducidos por AMPA en neuronas en cultivo (Loria, Petrosino et al. 2010), además otros cannabinoides del tipo WIN55-212-2, THC o el uso de inhibidores de la recaptación de los endocannabinoides han mostrado ejercer esas acciones antiexcitotóxicas y neuroprotectoras en los modelos de EAE y TMEV (Arevalo-Martin, Vela et al. 2003, Croxford and Miller 2003, Fernandez-Ruiz, Garcia et al. 2010, Loria, Petrosino et al. 2010, Pryce, Ahmed et al. 2003). Es necesario mencionar que quedan aún algunas cuestiones por resolver, por ejemplo, cual es la influencia de los CSPGs sobre las células oligodendrogliales o si el 2-AG podría mi- tigar el efecto inhibitorio de los CSPGs sobre los oligodendrocitos in vitro. Además, también hay que tener en cuenta que en el fallo en una remielinización efectiva contribuyen, además de los CSPGs, otros factores inhibitorios, presentes en la zona de lesión como son Notch, Wnt, Lingo-1 o las semaforinas (Huang, Fancy et al. 2011). Así mismo, es importante resaltar que los astrocitos no solo tienen la capacidad de incrementar las respuestas inflamatorias o in- hibir la remielinización y regeneración mediante la liberación de factores inhibitorios (Lidde- low, Guttenplan et al. 2017), sino que también pueden ser protectores y limitar la inflamación ayudando a la regeneración axonal (Farina, Aloisi et al. 2007, Liddelow and Barres 2017). De hecho, hay astrogliosis asociada a procesos de regeneración en los que los astrocitos producen factores de crecimiento del tipo FGF-2, que favorecen la diferenciación de los oligodendrocitos u otros como el NGF, BDNF o IGF-1 que ayudarían a los procesos de regeneración y remielini- zación (Moore, Abdullah et al. 2011). En este sentido, hay estudios que apoyan esta hipótesis sugiriendo que la inhibición de la astrogliosis en situaciones de daño al SNC no parece una aproximación terapéutica abordable ya que su inhibición in vivo podría ser perjudicial ya que se impide la reparación de la BHE, aumenta la respuesta inflamatoria y se bloquean los proce- sos de regeneración axonal en modelos de lesión medular (Faulkner, Herrmann et al. 2004) y empeora la sintomatología en el modelo de EAE (Toft-Hansen, Fuchtbauer et al. 2011, Voskuhl, Peterson et al. 2009). Por todo ello, desde el punto de vista terapéutico resultaría más factible identificar compuestos con múltiples dianas capaces de modular el fenotipo de los astrocitos hacia aquellos en los que no solo se disminuya la secreción de factores inhibitorios como los Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 164 D is cu si ón CSPGs, sino que se favorezca la secreción de aquellos factores pro-regenerativos. En relación a lo mencionado, habría que tener en cuenta también el patrón de sulfata- ción de las cadenas GAGs de los CSPGs, ya que se ha demostrado que este puede determinar su carácter inhibitorio o permisivo. De hecho, ante una situación de daño en el SNC la sulfatación general de los proteoglicanos aumenta siendo los sulfatados en posición 4 más inhibitorios para el crecimiento neuronal y los sulfatados en posición 6 más permisivos (Wang, Katagiri et al. 2008). Los animales que carecen de la enzima que sulfata en posición 6 tienen menor plas- ticidad y capacidad regenerativa en un modelo de lesión cortical y del tracto nigroestriatal (Lin, Rosahl et al. 2011) y desarrollan una EAE más severa (Miyamoto, Tanaka et al. 2014) por lo que parece que la cicatriz glial resulta ser permisiva o inhibitoria dependiendo de las características de sus componentes. Cambiar por tanto selectivamente el ratio de sulfatación de posición 4 a 6 de las cadenas GAGs de los CSPGs supone una estrategia a tener en cuenta (Foscarin, Raha- Chowdhury et al. 2017) y sería de gran interés estudiar si el patrón de sulfatación de los CSPGs cambia al inhibir la hidrólisis del 2-AG en los ratones TMEV. Los resultados descritos en esta Tesis, resaltan tal y como muestra la Figura 53, el efecto protector del UCM03025 frente a la desmielinización crónica y su capacidad para promover la remielinización en dos modelos de EM y abre nuevas posibilidades terapéuticas con inhibido- res de la MAGL para el tratamiento de las fases crónicas de la EM y patologías desmielinizantes. Figura 53. Resumen efecto terapéutico del UCM03025 en el modelo de EAE y en el modelo de TMEV-IDD. 165 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión 3. Efecto del 2-AG en la síntesis de CSPGs por astrocitos en cultivo Los astrocitos pueden potenciar las respuestas inflamatorias en situaciones de infección, trauma, isquemia o patologías neurodegenerativas, secretando citoquinas y quimioquinas que promuevan los procesos inflamatorios, formando parte de esta manera en las respuestas in- munes innatas, pero también son los principales mediadores de la gliosis reactiva, siendo la cicatriz glial formada por los astrocitos hipertróficos y reactivos, una característica patológica de la EM y que tiene una función importante en la progresión de la enfermedad (Sofroniew and Vinters 2010, Wu and Raine 1992). Debido a que los astrocitos son la principal fuente de CSPGs que contribuye a la for- mación de la cicatriz glial (Alonso and Privat 1993, Fawcett and Asher 1999, Reier and Houle 1988, Silver and Miller 2004), en el presente estudio se procedió a su cultivo y estimulación con TGF-β1, citoquina que aumenta considerablemente en situaciones de daño en el SNC y una de las responsables de aumentar la expresión de CSPGs in vivo e in vitro (Hamel, Mayer et al. 2005, Silver and Miller 2004, Susarla, Laing et al. 2011). De hecho, se ha mostrado que tratamientos que impiden la señalización mediada por TGF-β, por administración de decorina (Davies, Tang et al. 2004, Logan, Baird et al. 1999, Minor, Tang et al. 2008) o mediante anticuer- pos anti-TGF-β reducen el depósito de laminina, fibronectina y CSPGs así como la formación de la cicatriz glial promoviendo la regeneración axonal en modelos de lesión cerebral in vivo y promueven el crecimiento neuronal in vitro (Logan, Berry et al. 1994, Logan, Green et al. 1999, Moon and Fawcett 2001). Los resultados obtenidos en nuestro estudio en cuanto al aumento en la expresión de Neurocán, Fosfacán y Brevicán en astrocitos estimulados con TGF-β1 concuerdan con lo publi- cado en la literatura donde se indica que, tras el tratamiento con dicha citoquina, se produce un aumento en la síntesis de los proteoglicanos señalados anteriormente (Asher, Morgenstern et al. 2000, Gris, Tighe et al. 2007, Hamel, Mayer et al. 2005, Jones, Margolis et al. 2003, McKeon, Jurynec et al. 1999, Ryu et al. 2010, Sobel 2001, Schachtrup, Tang, Davies et al. 2003, Wang, Katagiri et al. 2008). Así mismo, la estimulación con TGF-β1 aumenta la expresión de toda la batería de enzimas necesarias para la síntesis de CSPGs en astrocitos (Asher, Morgenstern et al. 2000, Gris, Tighe et al. 2007, Hamel, Mayer et al. 2005, Smith and Strunz 2005, Wang, Katagiri Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 166 D is cu si ón et al. 2008). Además, el aumento de expresión de Neurocán observado en nuestro estudio mediante inmunocitoquímica, así como mediante ELISA también fue detectado por Asher en el año 2000 y por Smith en el año 2005 de manera que nuestros resultados coinciden con los estudios publicados previamente y nos permiten utilizar cultivos de astrocitos para investigar el efecto del 2-AG sobre las vías de señalización activadas por TGF-β1 y su impacto en la pro- ducción de los CSPGs. En la vía de señalización activada por TGF-β que conduce a la síntesis de CSPGs están in- volucradas las proteínas SMAD2/3, las cuales se fosforilan cuando TGF-β se une a su receptor, y forman el complejo SMAD con la unión de la proteína SMAD4 (Massague, Seoane et al. 2005). Además, existen evidencias que indican que la inducción de la síntesis de CSPGs, también pue- de realizarse a través de vías intracelulares independientes a la vía SMAD2/3 habiéndose su- gerido la implicación de la vía de PI3K-Akt-mTOR (Jahan and Hannila 2015, Susarla, Laing et al. 2011, Zhang 2017) o de la vía de las MAPK (Moustakas and Heldin 2005). La síntesis de CSPGs por estimulación con TGF-β e implicación de las vías de SMAD y PI3K, se ve reflejada en nuestro estudio ya que tras la estimulación con TGF-β se aumenta la fosforilación de SMAD2,3 así como de mTOR que junto con la inducción de Fosfacán, Neurocán y Brevicán sugiere la implicación de estas vías, en la síntesis de dichos proteoglicanos. El cuanto al efecto del 2-AG en los cultivos de astrocitos ya sea por exposición directa o mediante el tratamiento con inhibidores de las enzimas que lo catabolizan, la MAGL o la ABDH6, observamos una disminución en la fosforilación de la proteína SMAD2, así como de Akt y mTOR en astrocitos estimulados con TGF-β1 y tratados con 2-AG. Así mismo el 2-AG es capaz de disminuir los niveles de Brevicán, Fosfacán y Neurocán a nivel intracelular a la dosis de 100nM disminuyendo el Neurocán también a nivel extracelular. Esta dosis utilizada, fue se- leccionada en base al estudio dosis-respuesta para la expresión de ARNm de Brevicán en astro- citos estimulados con TGF-β1 y bFGF. Por otro lado, los inhibidores de las enzimas de hidrólisis del 2-AG disminuyeron la expresión de Brevicán y Neurocán a nivel intracelular, así como el Neurocán liberado al medio, con excepción en este caso del inhibidor de la enzima ABDH6. El hecho de que con el inhibidor de la enzima ABDH6, la cual hidroliza únicamente el 6% del 2-AG, se consiga la misma disminución de los niveles intracelulares de Neurocán y Brevicán que con los inhibidores de la MAGL, nos hace pensar que un aumento mínimo de los niveles de 2-AG 167 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión serían suficientes para reducir los niveles de esos proteoglicanos. De hecho, hay estudios in vivo que muestran que la inhibición de la ABDH6 es suficiente para conseguir efectos terapéu- ticos atenuando la neurodegeneración y mejorando la sintomatología en un modelo de lesión cerebral (Tchantchou and Zhang 2013) y aliviando los déficits motores asociados al modelo de EAE (Wen, Ribeiro et al. 2015). En cuanto a los receptores cannabinoides sobre los que el 2-AG podría estar ejerciendo sus efectos, observamos que al administrar antagonistas de los receptores CB1 y CB2, tanto la disminución de la fosforilación de SMAD2 y mTOR, ejercida por el 2-AG, como la expresión de Neurocán, dependen del receptor CB2. A pesar de que la expresión del receptor CB2 en astrocitos ha sido objeto de debate durante años, se sabe que es un receptor “inducible” que aumenta en condiciones inflamatorias en este tipo celular. Se ha observado la expresión de este receptor en astrocitos localizados en lesiones de la sustancia blanca en EM (Benito, Rome- ro et al. 2007) y puede modular la producción de diferentes mediadores inmunes en cultivos de astrocitos in vitro sometidos a inflamación tras la exposición con el compuesto UCM707 y HU210 (Ortega-Gutierrez, Molina-Holgado et al. 2005) así como en astrocitos humanos con el compuesto WIN55,212-2 (Sheng, Hu et al. 2005). Además, se ha observado su expresión en astrocitos en modelos in vivo, en un modelo de Huntington (Sagredo, Gonzalez et al. 2009) y en un modelo de lesión medular (Garcia-Ovejero, Arevalo-Martin et al. 2009). Así mismo, me- diante la activación del receptor CB2 en astrocitos junto con la activación del receptor CB1 en neuronas con el compuesto HU210, se han descrito efectos neuroprotectores, en el modelo de TMEV (Docagne, Muneton et al. 2007). En cuanto a la cuestión de si los astrocitos pueden res- ponder a los inhibidores de las enzimas de hidrólisis del 2-AG, estudios previos han evidencia- do que los astrocitos contienen tanto la enzima MAGL como la enzima ABHD6. En un estudio in vivo donde se inhibió de manera condicional la MAGL específicamente en microglía, astrocitos y neuronas, se mostró que el contenido de 2-AG a nivel cerebral estaba regulado fundamen- talmente por la MAGL de origen neuronal y de astrocitos (Viader, Blankman et al. 2015). Otro estudio más reciente indicó que la MAGL de los astrocitos controla la señalización del 2-AG en el cerebelo (Chen, Liu et al. 2016). Además, en un modelo organotípico de lesión neuronal, la neuroprotección inducida por el 2-AG estaba mediada por la inhibición de la MAGL en astroci- tos observándose que la expresión de la MAGL aumentaba en astrocitos estimulados con LPS Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 168 D is cu si ón (Kallendrusch, Hobusch et al. 2012). Por otro lado, en cuanto a la enzima ABHD6, esta se expre- sa en neuronas glutamatérgicas, así como en astrocitos, pero no en microglía a excepción de la línea BV2 (Marrs, Blankman et al. 2010). Los estudios descritos apoyarían por tanto el hecho de que los astrocitos son capaces de responder al tratamiento con los diferentes inhibidores de las enzimas de hidrólisis del 2-AG. En relación a los resultados obtenidos en cuanto a la modulación de la expresión de CSPGs por el 2-AG, hay estudios previos que indican que la modulación del sistema endocan- nabinoide puede regular la respuesta fibrótica en modelos experimentales de fibrosis, mo- delos donde se produce una activación de fibroblastos con excesivo depósito de colágeno y proteínas de la matriz extracelular. Se ha descrito un papel del receptor CB1 como receptor profibrótico (Marquart, Zerr et al. 2010, Yoshinaga, Uwabe et al. 2016), efecto corroborado por experimentación realizada con ratones deficientes para FAAH en los que se induce fibrosis dependiente de CB1 (Palumbo-Zerr, Horn et al. 2012). En contraposición a estos resultados, en nuestro estudio no observamos sin embargo ninguna disminución significativa en la expresión de proteoglicanos al tratar a los astrocitos con el antagonista del receptor CB1, SR14176 en situación basal. Sin embargo, observamos que el efecto del 2-AG reduciendo los niveles de Neurocán en astrocitos estimulados, es revertido al ser administrado junto con el antagonista de CB2. La reducción de los procesos fibróticos mediante activación del receptor CB2 se ha descrito en la literatura científica en el marco de la fibrosis cutánea y del daño tisular (Akhmet- shina, Dees et al. 2009). Así, se ha demostrado que mediante la activación del receptor CB2 se disminuyen los niveles de colágeno, de TGF-β y la fosforilación de sus proteínas de señalización sugiriendo que la señalización a través de TGF-β podría ser la vía mediante la cual el receptor CB2 estaría modulando los procesos fibróticos (Balistreri, Garcia-Gonzalez et al. 2011). En apo- yo de las anteriores observaciones, la administración de antagonistas del receptor CB2 como el AM630 aumenta la síntesis de colágeno y la señalización de TGF-β a través de la fosforilación de proteínas SMAD (Li, Wang et al. 2016). Toda esta evidencia previa, apoya los resultados ob- tenidos en relación al efecto del 2-AG sobre la fosforilación de las proteínas SMAD en astroci- tos in vitro, así como sobre la expresión de los proteoglicanos, efectos posiblemente mediados a través del receptor CB2. Hay además resultados en la literatura que sugieren un posible mecanismo mediante el 169 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión cual los cannabinoides podrían estar regulando la señalización mediada por TGF-β, este sería a través de la activación de los receptores PPARγ. Así, se ha observado que la activación de la vía PPARγ disminuye las respuestas fibróticas por inhibición de la señalización mediada por TGF-β (Dantas, Pereira et al. 2015). En este contexto se ha demostrado que mediante la administra- ción de agonistas de PPARγ y de CB2 como el ácido julémico o el VCE-004.8 (derivado quinona de CBD) se obtienen respuestas antifibróticas en modelos experimentales de esclerosis sisté- mica (Del Rio, Navarrete et al. 2016, Gonzalez, Selvi et al. 2012). Se ha observado así mismo que mediante la activación del receptor CB2 se consiguen respuestas antifibróticas inhibiendo la vía de TGF-β/SMAD de manera dependiente de Nrf2 (Li, Han et al. 2016). En relación a la disminución de la fosforilación de Akt y mTOR observada tras el trata- miento con 2-AG en los astrocitos estimulados, este efecto resulta llamativo ya que esta es una vía de señalización que se activa generalmente tras la activación de receptores cannabinoides, aunque nuestros datos indican una disminución de la señalización mediada a través de esta vía. Cabe destacar que en estudios realizados con células tumorales, la activación de los re- ceptores CB1 y CB2 conlleva a la activación de una compleja ruta de señalización que converge en la inhibición de la proteína Akt y conduce a procesos de autofagia (Carracedo, Lorente et al. 2006, Salazar, Carracedo et al. 2009, Velasco, Hernandez-Tiedra et al. 2016), lo que indicaría que la modulación de la cascada de señalización de PI3K por medio de la Gi/o es de naturaleza positiva o negativa dependiendo del tipo celular. Figura 54. Esquema del efecto del 2-AG sobre la produccion de CSPGs en astrocitos en cultivo Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 170 D is cu si ón Todo lo discutido en este apartado de la Tesis Doctoral sugiere que para el tratamiento de enfermedades como la EM son necesarias terapias que no solo sean capaces de modular la respuesta inmunológica, sino que además se combinen con otras que reduzcan la excitotoxi- cidad y promuevan los mecanismos endógenos de reparación y remielinización para poder así superar la fase progresiva de la enfermedad de la que hoy en día no existe una terapia efectiva. En relación con los mecanismos endógenos de reparación es de gran importancia identificar compuestos que favorezcan la diferenciación de los oligodendrocitos, que sean capaces de modular los factores inhibitorios presentes en las lesiones desmielinizadas, creando ambientes más permisivos para que tenga éxito la remielinización. A este respecto, se perfilan los astro- citos como una diana celular a tener en cuenta con el fin de modificar su activación hacia un perfil en el que no solo se reduzcan la síntesis y depósito de CSPGs, sino que se incremente la liberación de señales pro-regenerativas, lo que resultaría una estrategia de gran valor como terapia en situaciones de daño dentro del SNC. Finalmente, los cannabinoides podrían actuar en algunos de los fenómenos señalados anteriormente ya que actuarían de manera multi- diana disminuyendo la acumulación de CSPGs en la zona de lesión, modulando la respuesta inflamatoria hacia una respuesta más reparadora y promoviendo la diferenciación de los oligo- dendrocitos. Además, habría que añadir la capacidad de los cannabinoides para actuar como antioxidantes, antiexcitotóxicos y neuroprotectores, resultando ser compuestos con un gran potencial terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y en patologías desmielinizantes. 171 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez D iscusión Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 172 Co nc lu si on es 173 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Conclusiones VI. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 174 Co nc lu si on es 175 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Conclusiones 1. Los animales infectados con el virus de Theiler desarrollan alteraciones moto- ras en la fase crónica del modelo de TMEV-IDD y presentan infiltrados inflamatorios, así como reactivación microglial y astroglial a nivel de médula espinal. Esta respuesta inflamatoria está asociada a un aumento en la expresión de CSPGs en zonas desmielinizadas siendo los astro- citos las células que sintetizan los CSPGs. El tratamiento con dos inhibidores de la síntesis de los CSPGs, el xilósido y la fluorosamina, disminuyen los niveles de CSPGs en la fase crónica del modelo y mejoran los déficits motores asociados. Todo ello evidencia la relevancia de esas moléculas inhibitorias en el desarrollo de la patología. 2. La inhibición de la MAGL, aumenta los niveles de 2-AG in vivo, mejorando la sin- tomatología asociada al modelo de EAE y al modelo de TMEV. Los efectos terapéuticos ejerci- dos por el UCM03025 en el modelo de TMEV son dependientes de los receptores CB1 y CB2. El 2-AG podría estar actuando como agente antiinflamatorio y promoviendo los procesos endó- genos de regeneración ya que reduce la astrogliosis y los niveles de CSPGs en la médula espinal de los ratones TMEV. Además, induce un aumento del número de OPCs, de oligodendrocitos proliferativos y maduros, frenando la pérdida axonal y potenciando la remielinización. 3. El mecanismo mediante el cual el 2-AG podría estar mediando sus efectos be- neficiosos in vivo incluiría su acción sobre la producción de los CSPGs por parte de los astroci- tos ya que, como observamos in vitro, el tratamiento con 2-AG en astrocitos estimulados con TGF-β1 reduce la síntesis de los proteoglicanos Brevicán, Fosfacán y Neurocán. Concretamen- te, el efecto del 2-AG en la disminución de la síntesis de Neurocán es dependiente del receptor CB2. El uso de inhibidores selectivos de las enzimas MAGL y ABHD6 redujeron la expresión de Brevicán y Neurocán a nivel intracelular, disminuyendo también los niveles de Neurocán secre- tado al medio extracelular a excepción, en este caso, del inhibidor de la ABHD6. El 2-AG podría estar ejerciendo sus efectos disminuyendo la señalización de dos de las vías directamente im- plicadas en la síntesis de CSPGs como son la vía de TGF-β1/SMAD y Akt/mTOR. El receptor CB2 podría estar implicado en estos efectos. En conjunto, estos resultados destacan la importancia de incrementar el tono endógeno de 2-AG con el fin de modular las respuestas inflamatorias y promover los mecanismos endó- genos de reparación a través de la reducción de la acumulación de los CSPGs, en las zonas des- Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 176 Co nc lu si on es mielinizadas, permitiendo a su vez una mayor diferenciación olidodendroglial promoviendo así la remielinización. 177 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Conclusiones 1. Animals infected with Theiler´s virus develop motor symptoms, present infil- trates as well as microglial and astroglial reactivity in the spinal cord at the chronic phase of TMEV-IDD model. This inflammatory response is associated with an increment in CSPGs ex- pression within demyelinated lesions being the astrocytes the main cell responsible for CSPGs synthesis. The treatment with two different CSPGs synthesis inhibitors, xyloside and fluorosa- mine, decreased CSPGs levels and ameliorated motor deficits at the chronic phase of TMEV- IDD. All these data demonstrate the relevance of these inhibitory molecules in the progression of the pathology. 2. UCM03025 treatment increased 2-AG levels in vivo and ameliorated sympto- matology in EAE and TMEV-IDD model. The therapeutic effects exerted by UCM03025 in TMEV model are dependent on CB1 and CB2 cannabinoid receptors. 2-AG could be acting as an an- ti-inflammatory agent promoting endogenous mechanisms since it reduced astrogliosis and CSPGs levels in the spinal cord of TMEV infected mice. In addition, UCM03025 increased the number of OPCs and proliferating oligodendrocytes leading to a diminution in axonal damage enhancing remyelination. 3. The mechanism by which 2-AG could mediate its beneficial effects in vivo may include its ability to modulate CSPGs production in astrocytes since we observed in vitro that 2-AG diminished brevican, neurocan and phosphacan synthesis in TGF-β1 stimulated astro- cytes. The effect of 2-AG decreasing neurocan is dependent on CB2 cannabinoid receptor. The treatment with MAGL and ABHD6 inhibitors also reduced brevican and neurocan intracellular expression diminishing extracellular neurocan levels with the exception, in this case, of ABDH6 inhibitor. 2-AG could mediate its effects by acting over two signalling pathways involved in CS- PGs upregulation, TGF-β1/SMAD and Akt/mTOR pathways. CB2 receptor may be implicated in these effects. Collectively, these findings highlight the importance to increase endocannabinoid tone of 2-AG in order to modulate the inflammatory response and to promote the endogenous repair mechanisms, processes that are impeded and altered in demyelinating pathologies. 2-AG could be involved in this aspect by reducing CSPGs accumulation in demyelinating areas allowing oligodendrocytes to differentiate leading to greater remyelination and axonal regene- Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 178 Co nc lu si on es ration. 179 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Referencias VII. REFERENCIAS Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 180 Re fe re nc ia s 181 Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs | Ana Feliú Martínez Referencias Akhmetshina, A., C. Dees, N. Busch, J. Beer, K. Sarter, J. Zwerina, A. Zimmer, O. Distler, G. Schett and J. H. Distler (2009). “The cannabinoid receptor CB2 exerts antifibrotic effects in experimen- tal dermal fibrosis.” Arthritis Rheum 60(4): 1129-1136. Akita, K., A. von Holst, Y. Furukawa, T. Mikami, K. Sugahara and A. Faissner (2008). “Expression of multiple chondroitin/dermatan sulfotransferases in the neurogenic regions of the embryo- nic and adult central nervous system implies that complex chondroitin sulfates have a role in neural stem cell maintenance.” Stem Cells 26(3): 798-809. Alonso, G. and A. 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ANEXOS Ana Feliú Martínez | Modulación del Sistema Endocannabinoide como herramienta terapéutica en EM: efecto sobre los CSPGs 216 PORTADA Agradecimientos ÍNDICE ABREVIATURAS RESUMEN SUMMARY I. INTRODUCCIÓN II. HIPÓTESIS Y OBTETIVOS III. MATERIAL Y MÉTODOS EXPERIMENTALES IV. RESULTADOS V. DISCUSIÓN VI. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS VII. REFERENCIAS VII. ANEXOS