UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV TESIS DOCTORAL Estudios del ciclo vesicular en neuronas granulares de cerebelo de rata MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR José Jorge Ramírez Franco Directores Magdalena Torres Molina David Bartolomé Martín Madrid, 2014 © José Jorge Ramírez Franco, 2014 Estudios del ciclo vesicular en neuronas granulares de cerebelo de rata Universidad Complutense de Madrid Facultad de veterinaria Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV Estudios del ciclo vesicular en neuronas granulares de cerebelo de rata. Universidad Complutense de Madrid Facultad de veterinaria Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV Estudios del ciclo vesicular en neuronas granulares de cerebelo de rata. Memoria presentada por: D. José Jorge Ramírez Franco para optar al grado de Doctor. Directora de Tesis: Dra. Magdalena Torres Co-director de Tesis: Dr. David Bartolomé Vº Bº Directora: Vº Bº Co-director: Magdalena Torres David Bartolomé Agradecimientos Alguien se preguntó una vez "¿Qué es la vida?". Si a mí me preguntasen, diría que es "Azar y necesidad". Por ello, quiero empezar agradeciéndole plenamente al azar este trabajo. Como biólogo, me debo a él. En segundo lugar me gustaría agradecerle a Magdalena la oportunidad brindada al permitirme trabajar en su laboratorio y la confianza depositada en mí durante estos años al instarme a desarrollar la mayoría de ideas que se plantearon. Obviamente, haberme permitido desarrollar todas habría sido un error. Esta ha sido, sin duda, una de las "Oportunidades de mi vida" y espero haber correspondido en este tiempo. A Pepe, por mostrarme qué es la perseverancia por medio del ejemplo; por el siempre sabio y atento consejo que deriva de su cuasi clarividencia científica y, en definitiva, por ayudarnos a hacernos con el timón de un barco que de otro modo habría trastabillado indefectiblemente. A Deibi, por ser la definición viva de la palabra "amable". Por tu ayuda incondicional desde ambos lados del charco, por orientar, aconsejar, incitar y animar, de forma casi omnipresente, en la nebulosa de mi pensamiento. Por hacer el 80% del camino, que es el comienzo. Por tu concepto del Saber como un bien universal a compartir y por saber que es esto último, junto con la música, lo único que nos hace plenamente humanos. Por ser un amigo, un maestro, un confidente y tantas otras cosas que a las palabras sólo les está permitido quedarse a las puertas de definir. A Javi Díaz, por las charlas, las discusiones, las ideas, el apoyo incondicional y los atardeceres con Miguel Servet, pero sobre todo por ser esa persona en mi vida que prácticamente me obliga a seguir creyendo en los sueños; por ende gracias también a Candy, por haceros ustedes, el uno al otro, gran parte de lo que sois. Gracias a José, porque, cómo alguien dijo, de la crítica surge el progreso, gracias de verdad, por compartir tu pensamiento con todo aquel que quisiere acercarse a él, te debo muchas; también a Patri, por tu ayuda desinteresada con nuestros gráficos de columnas. A Salvatore, por enseñarme una vez más que la voluntad es, casi, más poderosa que el tiempo; por tantas vivencias y por el apoyo mutuo de aquellos primeros años. Eres ejemplar. A Mayka, por sorprenderme. Se echa de menos gente como tú en este mundo, gracias por enseñarme de orden y rigor científico a la vez que me has dado una lección en la vida acerca de como tener una mente abierta y plural. A Andrea C., por tantos momentos y pensamientos compartidos, por enseñarme a aprender con tu actitud desde el primer día que entraste en el laboratorio, por escucharme, por confiar y, por supuesto, por fumar. A Ana A., de la que aprendí a poner la mejor cara al peor tiempo. A Ricardo, por demostrarme que el tesón siempre acaba traduciéndose en la derrota de la imposibilidad; en la ciencia, y en todo lo demás; y a Marta, por decir siempre las cosas tal y como son. A Felipe, ejemplo de que la integridad, la entereza y la excelencia científica no están reñidas con la mayor de las simpatías imaginables. A Bea, por aguantarme todo este tiempo. No debe de ser fácil, muchos días ni yo lo hago. Sigue adelante. A Alberto, por su madurez, por su mente crítica y por creer en las ideas. Gracias a vosotros dos por enseñarme a enseñar. A Roberto, por lo elegante de la simplicidad con que te haces un hueco en el corazón de las personas y por corroborarme aquella sospecha de que el que quiere, puede. Gracias también a Ángel por alguna que otra lección de autogestión del conocimiento y por hacer las cosas bien. No me olvido del bolígrafo. A toda la gente del ala sur del departamento: A Paula y Vero, compañeras de cursos de doctorado y de alguna que otra rutina burocrática o de intendencia, como se les llama ahora. A Laura, Aida y Mario, por aportarle un aire nuevo al laboratorio, por conferirle un poco de vuestra simpatía y naturalidad y por contagiarme una parte de esa jovialidad que os caracteriza; también por los cafés de media tarde y por algún que otro atuendo. A Álvaro, porque, como creía el que más la amó, la ironía es la mejor forma de amar la existencia. A Nacho, por un buen puñado de valiosos consejos y por innumerables favores, y a Jesús, por tener siempre a mano alguna palabra agradable. No puedo olvidarme de Elena, por enseñarme las destrezas de jardinero de neuronas, ni de Carol, por los ánimos de los primeros meses en el lab. Querría agradecer también este trabajo a Agustín y a Marisa, del CNME, sin vosotros, la microscopía electrónica habría sido poco más que una intención. Especial mención merecen todos los profesores de BBMIV, por ser la vuestra ardua empresa, en estos tiempos de agnosia, desprecio del mérito e indiferencia del saber; que nunca tengáis mayor pretensión de grandeza que la de enseñar a disfrutar por medio del conocimiento; que vuestro único fin, sea ponerle alas a las mentes, porque todo lo demás -incluso las estatuas- se dispersa en el olvido. Agradezco este trabajo a todas las personas de las que aprendí algo de la vida o del estudio de esta en la facultad de Biológicas, en particular a Andrea R. y a Adán, amigos, e infatigables compañeros en el camino que elegimos hace tiempo ya. Por supuesto a Edu, por ser mi guía en alguna que otra circunstancia difícil y a Ene, por la calma y la alegría que transmites. También a Rubén, por las tardes de poesía ígnea, por ser el Nunatak anfractuoso en la gélida masa uniforme. No puedo olvidarme de Carmen Rúa e Iñigo Azcoitia, por creer en la enseñanza y por enseñar a creer en algo. A los arquitectos de mi vida: a Eli, por ser amiga y cómplice inseparable; por regalarme toda la magia del fondo de tus ojos y la constancia imperecedera de tu sonrisa alentadora; porque una vez más, sin ti, Ariadna, este laberinto habría sido muy difícil de salvar. Y, porque a día de hoy, todavía busco, "busco el término huidizo, la expresión inestable, que signifique, exacta, lo que eres". A mis mejores maestros, los de la calle; los que cuentan con la ventaja de la imprevisibilidad de sus lecciones; los que despiertan interés, porque dicen cosas interesantes. A J. Morgado, por lo vivido, lo contado, lo viajado y sobre todo, por ser un oasis de sensatez y cordura en medio de áridas vorágines; por ser un estandarte de razón y por hacerme comprender que nada, ni siquiera la vida, va del todo en serio. A Jabo, por enseñarme pragmatismo y filosofía existencial y por transmitirme esa particular visión de la libertad como una guerra diaria y constante contra uno mismo. Ana C. y Diego, escultores de un futuro que es presente, de ese ahora que se sublima en el mañana, gracias por seguir ahí. A la gente de Villafamés, especialmente a David R. y Robert, por ser el refugio donde la mente puede cobijarse de las largas avenidas y desafiar sin miedo al tiempo. A Claudia, Inés y Eu, por demostrarme, con su actitud, que la felicidad es cuestión de voluntad. Al marinero de su destino, Adrián, por el respeto, el cariño y por su sabiduría musical. A Juanda y Repe, por estar cerca cuando todo empezó. A toda la gente del Celta de Vino, por arroparme y por enseñarme que la edad es un estado de la mente. A B. Rugal, por estar ahí en momentos difíciles y por compartir los momentos alegres. A la poesía y la música, en general. Y, como dicen los ingleses, "last but not least", a mis Padres. En primer lugar por la vida, sin ella creo que todo lo demás es imposible. También por hacer de mi casi todo lo que soy y por enseñarme a hacer el resto. Por transmitirme esa ávida pasión por el conocimiento y los libros, a la vez que me dejasteis saborear la libertad en cada momento, por vuestro calor, vuestros cuidados, vuestro cariño y por mostrarme la fuerza que reside en el deber y la rectitud, Por la mente crítica y la ironía, también por saber soñar. Gracias por enseñarme los placeres de la lectura y de la ciencia y por ayudarme a entender que el tener es secundario en este mundo. Después de al azar, es de justicia agradeceros esto a vosotros. En definitiva, a todos los que me ayudasteis a construir mi vida estando cerca, a los protagonistas de mis memorias y mis vivencias y también a los actores secundarios, pues todo; absolutamente todo, cuenta. Ni la más angustiosa de las soledades, ni siquiera el caprichoso Jano, podría con vuestro recuerdo. Porque somos lo que percibimos, lo que recordamos, lo que nos proponemos y, accidentalmente, lo que conseguimos, ¡Gracias! Summary Synaptic transmission in the mammalian nervous system is mainly based on chemical synapses. These synapses contain a cluster of small vesicles that are filled up with neurotransmitter molecules, referred to as synaptic vesicles (SVs) (Sudhof, 2012). Upon the arrival of an action potential to the presynaptic compartment, calcium influx through voltage gated calcium channels (VGCC) promotes the fussion of these SVs with the plasma membrane, leading to the release of the neurotransmitter into the synaptic cleft (Sudhof, 2004). Once in the extracellular space neurotransmitter molecules bind to postsynaptic receptors (Attwell y Gibb, 2005), propagating, in this way, the nerve impulse through neuronal networks. The released neurotransmitter can also activate presynaptic receptors which, in turn, modulates neurotransmitter release. Axonal sites of neurotransmitter release, also known as Active Zones (AZs), contain a high density of VGCC sorrounded by a complex network of proteins that interact among them, positioning SV's in the vicinity of calcium channels; these proteins make up the so called cytomatrix at the active zone (CAZ) (Gundelfinger y Fejtova, 2012; Sudhof, 2012). All together, these features justify the high sensitivity and the exceptionally tight regulation of SV fussion. However, during trains of repetitive stimulation neurons have to reuse their vesicular content to sustain the fidelity of synaptic transmission. The concept of the synaptic vesicle cycle emerges from this scenario, in which local vesicular recycling through endocytosis and re-acidification can be understood as the limiting step of the synaptic efficiency (Betz y Angleson, 1998; Sudhof, 2004). SV cycle comprises four sequential steps. At a first stage, SV's stablish a physical contact and dock to the presynaptic plasma membrane; here, the vesicles will be primed, acquiring full exocytic competence. Later on, calcium-triggered exocytosis gives rise to the fussion of the vesicles with the presynaptic plasma membrane. The lipidic moiety correponding to the SV`s will be retrieved through compensatory endocytosis, and then, after refilling, the vesicles will be able to participate in a subsequent round of exocytosis. By making use of a dual strategy in live cell imaging, electron microscopy techniques, and pharmacological experiments, we have characterized two different steps of the synaptic vesicular cycle in cultured cerebellar granule neurons. VgluT-pHluorin and FM1-43 experiments combined with correlative post-hoc immunocytochemistry, allowed us to study large populated samples of individual nerve terminals. Regarding endocytic mechanisms we have encountered that synaptic efficiency, in terms of SV reuse, is limited during strong neuronal stimulation due to the co-existence of effective and innefective endocytic pathways. The innefective endocytic pathways, which resemble some of the features of bulk endcoytosis (Clayton y Cousin, 2009), are started up as a consequence of the massive exocytosis of Svs that takes place during high neuronal activity, and involve the accummulation of non-releseable endosomes at the presynaptic level. Moreover, we found that these forms of non-vesicular endocytosis showed a developmentally regulated switch towards efficient forms of SV retrieval at later maturational stages. Interestingly, while dynamin GTPase activity was not necessary for the scission of these endosomes, its interaction with the plasma membrane appeared to be crucial for this process. As expected, efficient forms of recycling were virtually abolished by dynamin inhibition. Calcineurin activity seemed to be participating in vesicular recycling to a higher extent than in endosomal recycling. As recycling efficiency scales up with the immunoreactivity of key synaptic proteins at the individual synaptic level, we propose that synaptic efficiency, in terms of SV reuse, is a hallmark of synaptic maturation (Bartolome-Martin et al., 2012). On the other hand, we have partially dissected the exocytic deffects underlying the well established paradigm of cannabinoid-mediated presynaptic depression (Kreitzer y Regehr, 2001). We found that a prolonged activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R), strongly inhibited synaptic exocytosis by means of a drop in cAMP levels. When analyzing at the single synaptic level some of the puncta analyzed were completely reluctant to synaptic exocytosis after CB1R activation, which led us to classify them as silent synapses. This effect was not associated to a reduction in calcium entry through VGCC, and could be prevented by incubation with forskolin. This cAMP drop seemed to operate by EPAC-dependent rather than by PKA-dependent mechanisms. At the ultrastructural level, CB1R activation elicitated a withdrawal of the SV closer to the plasma membrane at presynaptic active zones. We also demonstrate that the susceptibility to CB1R-mediated synaptic silencing was largely determined by the RIM1α content at individual nerve terminals. All together, we propose that CB1R activation exerts an heterogeneous inhibitory effect over different synapses, giving rise to a lack of exocytosis in a subset of presynaptic terminals. This fact could be related to cannabinoid mediated LTD. Bibliography Attwell, D. y Gibb, A. (2005) Neuroenergetics and the kinetic design of excitatory synapses. Nat Rev Neurosci, 6, 841-849. Bartolome-Martin, D., Ramirez-Franco, J., Castro, E., Sanchez-Prieto, J. y Torres, M. (2012) Efficient synaptic vesicle recycling after intense exocytosis concomitant with the accumulation of non- releasable endosomes at early developmental stages. J Cell Sci, 125, 422-434. Betz, W.J. y Angleson, J.K. (1998) The synaptic vesicle cycle. Annu Rev Physiol, 60, 347-363. Clayton, E.L. y Cousin, M.A. (2009) The molecular physiology of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J Neurochem, 111, 901-914. Gundelfinger, E.D. y Fejtova, A. (2012) Molecular organization and plasticity of the cytomatrix at the active zone. Curr Opin Neurobiol, 22, 423-430. Kreitzer, A.C. y Regehr, W.G. (2001) Retrograde inhibition of presynaptic calcium influx by endogenous cannabinoids at excitatory synapses onto Purkinje cells. Neuron, 29, 717-727. Sudhof, T.C. (2004) The synaptic vesicle cycle. Annu Rev Neurosci, 27, 509-547. Sudhof, T.C. (2012) The presynaptic active zone. Neuron, 75, 11-25. Abreviaturas 2-AG: 2 Araquidonil Glicerol. AC: Adenilato ciclasa. AEA: Anandamida. AMPA: Ácido α-Amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propiónico (se refiere al receptor ionotrópico activado por este compuesto). AP-1/AP-2/AP-3/AP-180: Adaptor Protein 1/2/3/180 o proteína adaptadora (de clatrina) 1/2/3/180. AZ: Zona Activa. BAR (dominio): Bin-Amfifisina-Rv. BDNF: Brain Derived Neurotrophic Factor o Factor neurotrófico derivado del cerebro. BPB: Bromophenol Blue o Azul de bromofenol. CaMKII: Calcio-Calmodulina Quinasa II. CaMKIV: Calcio-Calmodulina Quinasa IV. CaMKK: Calcio-Calmodulina Quinasa Quinasa. cAMP: Adenosin monofosfato cíclico. CAPS: Calcium dependent Activator Protein for Secretion o Proteína Calcio dependiente activadora de la secreción. CAST: Cytomatrix at the Active zone STructural protein o proteína estructural de la citomatriz de la zona activa. CB1R: Receptor de Cannabinoides de tipo 1. CB2R: Receptor de Cannabinoides de tipo 2. Cdk5: Quinasa dependiente de ciclina 5. CGC: Células Granulares de Cerebelo. CREB: Cyclic AMP Response Element Binding factor o Factor de unión a los elementos de respuesta a cAMP. DAG: Diacil Glicerol DEP (dominio): Dishevelled-Egl10-Plecstrina. DGLα: DiacilGlicerol Lipasa α. DIV: Días In vitro. DSE: Supresión de la excitación inducida por despolarización. DSI: Supresión de la inhibición inducida por despolarización. EBSS: Earle's Balanced Salt Solution Solución de sales estabilizada de Earle. Abreviaturas EGL: External granule layer o capa granular externa. En: día Embrionario n. EPAC: Exchange Protein directly Activated by cAMP o proteína intercambiadora activada por cAMP. FAAH: Fatty Acid Amido Hidrolase o Amido hidrolasa de ácidos grasos. FITC: Fluoresceina Isotiocianato. FM1-43: Fei Mao 1-43. GABA B: Receptor GABA B. GABA: Ácido Gamma Amino Butírico. GAPdh: Gliceraldehído Fosfato Deshidrogenasa. GDP: Guanosin difosfato GEF (dominio): Guanine Nucleotide Exchange Factor o factor intercambiador de nucleótidos de guanina. GFP: Green Fluorescent Protein o proteína fluorescente verde. GluA3: Subunidad A3 del receptor AMPA. GPCR: G-Protein Coupled Receptors o receptores acoplados a proteínas G. GSK3: Glucógeno sintasa quinasa 3. GTP: Guanosin Trifosfato. HBM: HEPES buffer medium o medio tamponado con HEPES. HU-210: Hebrew University 210, agonista cannabinoide. IGL: Inner granule layer o capa granular interna. LTD: Long Term Depression o Depresión a largo plazo. LTP: Long Term Potentiation o Potenciación a largo plazo. MAC: Mitochondria Anchoring Complex o complejo de anclaje mitocondrial. MGL: MonoacilGlicerol Lipasa. Munc: Mammalian homologue of UNCoordinated phenotype u homólogo mamífero de fenotipo descordinado. NMDA: N-Metil-D-Aspartato (se refiere al receptor ionotrópico activado por este compuesto). NO: Óxido nítrico. NT: Neurotransmisor. Nurr1: Nuclear Receptor Related Protein 1 o Proteina similar a Receptor Nuclear. Abreviaturas PA: Potencial de acción. PBS: Phosphate Buffer Saline o tampón fosfato salino. PC: Purkinje Cell o célula de Purkinje. PDBu: 4-β-forbol-12, 13-dibutirato. PF: Parallel Fiber o fibra paralela. PH (dominio): Pleckstrin Homology o dominio homologo a plecstrina. PIP(4,5)2: Fosfatidil Inositol 4,5 , Bisfosfato. PKA: Proteína Quinasa A. PKB: Proteína quinasa B. PLC: Fosfolipasa C. PLD: Fosfolipasa D. Pn: día Postnatal n. PPARγ: Peroxisome Proliferator Activated Receptors o receptores activados por proliferadores de peroxisomas. PSD: Post-synaptic Density o Densidad Postsináptica. PTx: Toxina pertúsica. Rab: Ras in the Brain o Ras en el cerebro. REM (dominio): Ras Exchange Motif o motivo de intercambio de Ras. RIM: Rab Interacting Molecule o molécula de interación con Rab. RIM-BP: RIM Binding Protein o Proteína de unión a RIM. ROI: Region of Interest o Region de interés. RRP: Readily Releasable Pool o conjunto de vesículas preparadas para su liberación . SDS: Dodecil Sulfato sódico. SM: Sec1/Munc18 like proteins o proteínas similares a Sec1/Munc18. SNAP: Soluble NSF Attachment Protein o proteína unida a NSF soluble. SNARE: SNAP REceptors o receptores de SNAP. SNC: Sistema Nervioso Central. STD: Short Term Depression o Depresión a corto plazo. SV2: Synaptic Vesicle protein 2 o proteína de vesícula sináptica 2. TRPV1: Transient Receptor Potential Vanilloid 1 o Receptor de vaniloides de potenciales transitorios de tipo 1. Abreviaturas TTx: Tetrodotoxina. UBC: Unipolar Brush Cells o células unipolares en cepillo. VAMP: Vesicle associated Membrane Protein o Proteína asociada a las membranas vesiculares. V-ATPasa: Vacuolar-ATPase o ATPasa vacuolar. VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor o Factor de crecimiento del endotelio vascular. VGluT1: Vesicular Glutamate Transporter 1 o transportador vesicular de glutamato de tipo 1.   I Índice Índice I-Introducción..........................................................................................3 1-Regionalización, estructura y función del cerebelo...............................3 1.1-Citoarquitectura del cerebelo....................................................6 1.2-Circuitería y neuroquímica......................................................10 1.3-Histogénesis cerebelar..............................................................13 2-La sinapsis glutamatérgica....................................................................17 2.1-La zona activa............................................................................22 2.1.1-La arquitectura de la zona activa...............................25 2.2-El ciclo vesicular sináptico.......................................................29 2.2.1-Exocitosis......................................................................29 2.2.2-Preparación de las vesículas........................................31 2.2.3-Fusión calcio dependiente de las vesículas.................34 2.2.4-Endocitosis....................................................................36 2.2.4.1-Endocitosis mediada por clatrina..................38 2.2.4.2-Endocitosis en masa........................................44 II Índice 2.3-Los "pools" de vesículas sinápticas.........................................47 3-El sistema endocannabinoide................................................................49 3.1-Síntesis de endocannabinoides.................................................50 3.2-Receptores cannabinoides........................................................51 3.3-Degradación...............................................................................53 3.4-Plasticidad mediada por cannabinoides..................................54 3.4.1-Plasticidad a corto plazo: DSI y DSE.........................54 3.4.2-Plasticidad a largo plazo: LTD...................................56 4-Sinapsis silentes......................................................................................62 II-Objetivos.............................................................................................67 II.1-Endocitosis................................................................................69 II.2-Exocitosis..................................................................................70 III Índice III-Materiales y métodos....................................................................73 III.1-Resumen gráfico I.............................................................................75 III.2-Resumen gráfico II...........................................................................76 1-Materiales...............................................................................................77 1.1 Material biológico.....................................................................77 1.2 Equipos.......................................................................................78 1.2.1-Electroporación y cultivos...........................................78 1.2.2- Adquisición de imagen, microscopios y cámaras.....78 1.2.3- Detección de proteinas................................................79 1.2.4- Acumulación de cAMP...............................................79 1.3 Reactivos, anticuerpos y fármacos...........................................79 1.3.1-Material de cultivos.....................................................79 1.3.2- Acumulación de cAMP...............................................80 1.3.3- Microscopía electrónica..............................................80 1.3.4- Inmunodetección.........................................................81 IV Índice 1.3.4.1- Anticuerpos primarios...................................81 1.3.4.2- Anticuerpos secundarios, líquido de montaje, sueros, cubreobjetos y portaobjetos..........82 1.3.5- Extracción de proteínas, electroforesis y transferencia.......................................................................82 1.3.6- Experimentos de imagen en célula viva..............................83 1.3.6.1- Sales...........................................................................83 1.3.6.2- Fármacos...................................................................83 1.3.6.3- Sondas.......................................................................85 2-Métodos...................................................................................................85 2.1-Cultivo de neuronas granulares de cerebelo de rata y electroporación.....................................................................85 2.1.1-Protocolo.......................................................................86 2.1.1.1- Preparación de cubreobjetos........................86 2.1.1.2- Realización del cultivo...................................87 2.1.1.3- Electroporación..............................................89 2.2-Obtención de sinaptosomas......................................................93 2.3-Extracción de proteínas e inmunodetección...........................94 V Índice 2.3.1-Extracción de proteínas totales...................................94 2.3.2-Electroforesis y transferencia a membrana...............95 2.4-Inmunocitoquímica...................................................................98 2.5-Imagen en célula viva..............................................................100 2.5.1-FM1-43........................................................................100 2.5.1.1-Tampones.......................................................103 2.5.1.2-Protocolo........................................................103 2.5.1.3- Protocolos gráficos.......................................105 2.5.2-VGluT1-pHluorina....................................................110 2.5.2.1-Tampones.......................................................113 2.5.2.2-Protocolos......................................................113 2.5.2.3-Protocolos gráficos........................................115 2.5.3-FURA2-AM................................................................117 2.5.3.1-Tampones.......................................................118 2.5.3.2-Protocolos......................................................118 2.6-Microscopía electrónica..........................................................120 VI Índice 2.6.1-Tampones....................................................................120 2.6.2-Protocolos...................................................................120 2.6.2.1-Microscopía en sinaptosomas......................120 2.6.2.2-Microscopía en células..................................122 2.7- Niveles de cAMP...................................................................127 2.8- Inmunocitoquímica post-hoc...............................................128 2.8.1-Protocolo.....................................................................128 3-Procesamientos informáticos 3.1-Inmunodetección en membranas...........................................131 3.2-FM1-43.....................................................................................131 3.3-VGluT1-pHluorina.................................................................136 3.4-Fura2-AM................................................................................138 3.5-Inmunocitoquímica post-hoc..................................................138 3.6-Inmunocitoquímica.................................................................139 3.7-Microscopía electrónica..........................................................139 3.7-Estadística y ajustes................................................................140 VII Índice IV-Resultados.......................................................................................143 1-Diferencias en la eficacia e reciclamiento subyacen a la heterogeneidad de respuestas en neuronas granulares de cerebelo en cultivo.......................................................................................................145 2- La magnitud del evento exocitótico determina la eficacia de reciclamiento............................................................................................150 3-Bajas concentraciones de FM1-43 marcan las vías de reciclamiento ineficaz......................................................................................................152 4-El reciclamiento ineficaz está asociado a formas lentas de endocitosis................................................................................................154 5-Papel de la dinamina en las distintas formas de reciclamiento vesicular....................................................................................................155 6-Contribución diferencial de la calcineurina a las distintas formas de reciclamiento............................................................................................160 7-El fenómeno de Kiss & Run no está implicado en las formas ineficaces de reciclamiento.....................................................................162 VIII Índice 8-Análisis ultraestructural del ciclo vesicular sináptico: las formas ineficaces de reciclamiento están asociadas a endocitosis en masa.....165 9-La eficacia de reciclamiento como marcador de la maduración neuronal....................................................................................................170 10-Marcadores presinápticos asociados con la eficacia de reciclamiento............................................................................................177 11- Receptores presinápticos y eficacia de reciclamiento....................180 12-Regulación de la eficacia de liberación vesicular por el receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1R) e inducción de silenciamiento sináptico....................................................................................................184 13-Independencia de calcio del fenómeno de silenciamiento sináptico....................................................................................................191 14-Efectos ultraestructurales asociados a la activación del receptor CB1...........................................................................................................200 15-La activación del receptor CB1 induce una reducción del pool de reciclamiento............................................................................................202 IX Índice 16-La inducción de silenciamiento es atribuible a una reducción en los niveles de cAMP.......................................................................................206 17-La activación de la vía del cAMP previene, de forma PKA- independiente y EPAC-dependiente, la inducción de silenciamiento mediada por CB1R..................................................................................207 18-La activación de la proteína EPAC es capaz de revertir el fenómeno de silenciamiento sináptico....................................................................213 19-Marcadores presinápticos de la susceptibilidad al silenciamiento mediado por CB1R..................................................................................217 V-Discusión..........................................................................................225 1-Diferencias en la eficacia e reciclamiento y heterogeneidad en respuestas sinápticas...............................................................................227 2-La magnitud de la exocitosis determina la eficacia de reciclamiento............................................................................................230 3-Concentraciones de FM1-43 y eficacia de reciclamiento..................231 X Índice 4-Las formas de endocitosis poco eficaces persisten tras la estimulación. Coexistencia de rutas de reciclamiento.........................234 5-Papel de la dinamina en las distintas formas de reciclamiento........236 6-Papel de la calcineurina en ambas formas de endocitosis................239 7-Posible implicación de los fenómenos de "Kiss&Run" en el reciclamiento ineficaz..............................................................................242 8-Análisis ultraestructural de terminales sinápticos............................243 9- La eficacia de reciclamiento como marcador de maduración........246 10- Marcadores presinápticos y eficacia de reciclamiento..................249 11- Receptores presinápticos y maduración neuronal.........................250 XI Índice 12- Regulación de la liberación vesicular por el receptor CB1. Silenciamiento sináptico..........................................................................252 13-Calcio independencia del fenómeno de silenciamiento...................254 14-Análisis ultraestructural del fenómeno de silenciamiento sináptico....................................................................................................257 15-Redistribución de los pools de vesículas sinápticas mediada por la activación de CB1....................................................................................258 16- Farmacología del fenómeno de silenciamiento...............................258 17-Reversibilidad del proceso de silenciamiento. Implicaciones en la plasticidad................................................................................................260 18- Determinantes presinápticos de la susceptibilidad al silenciamiento...........................................................................................265 XII Índice VI-Conclusiones...................................................................................269 1.1 Endocitosis y reciclamiento....................................................271 1.2 Exocitosis..................................................................................272 VII-Bibliografía...................................................................................275 VIII-Anexos................................................................................................i Anexo I..............................................................................................iii Anexo II.............................................................................................vi Anexo III.........................................................................................viii Anexo IV.............................................................................................x Anexo V............................................................................................xii Anexo VI.........................................................................................xiv 1 I- Introducción "Man at last knows he is alone in the unfeeling immensity of the universe, out of which he has emerged only by chance. His destiny is nowhere spelled out, nor is his duty. The kingdom above or the darkness below; it is for him to choose." J.L. Monod 2   3 Introducción I-Introducción La palabra encéfalo proviene del griego ἐγκέφαλον (ἐγ/en que significa dentro y κέφαλον/kefalos que significa cabeza) y hace referencia al principal órgano del sistema nervioso central (SNC), que orquesta tanto las funciones conscientes como la mayoría de funciones vegetativas. El encéfalo de mamífero se encuentra subdividido en tres regiones: el prosencéfalo o cerebro anterior, que comprende el telencéfalo (corteza cerebral) y el diencéfalo (tálamo, subtálamo hipotálamo y epitálamo); el mesencéfalo o cerebro medio, que constituye el nexo anatómico entre el cerebro anterior y el posterior y alberga la substancia nigra, el núcleo rojo y los tubérculos cuadrigéminos; y por último el rombencéfalo o cerebro posterior, que comprende el mielencéfalo (bulbo raquídeo y pares craneales VIII, IX, X, XI y XII) y el metencéfalo (puente, cerebelo y pares craneales V, VI, VII y VIII) (Kandel et al., 2000; Jacobson y Marcus, 2008). 1-Regionalización, estructura y función del cerebelo El cerebelo es una estructura que deriva de la porción antero-dorsal del rombencéfalo y se sitúa en el techo del cuarto ventrículo (Hashimoto y Hibi, 2012). Se encuentra físicamente conectado al tronco cerebral por tres pares de haces de fibras, que reciben el nombre de pedúnculos cerebelosos: El pedúnculo cerebeloso inferior, por el que cursan principalmente aferencias ascendentes homolaterales de información propioceptiva (tracto espino-cerebeloso e información desde el núcleo inferior de la oliva), el pedúnculo cerebeloso medio por el que ingresan principalmente las aferencias cortico- pontino-cerebelares (información motora proveniente de corteza) y el pedúnculo cerebeloso superior, principal vía de salida de las eferencias cerebelosas ascendentes hacia los núcleos Ventral Anterior y Ventral Lateral del tálamo (los que constituyen el 4 Introducción denominado tálamo motor) y hacia el núcleo rojo así como de las eferencias descendentes hacia el núcleo paramedial reticular, con importantes funciones en el control postural y de orientación espacial (Jacobson y Marcus, 2008). El cerebelo funciona a modo de centro comparador y refinador del movimiento, lo que queda evidenciado si atendemos a las conexiones que establece con las distintas áreas del sistema nervioso. Por un lado, recibe información descendente de la orden emitida por la corteza motora y por otro, recibe información ascendente propioceptiva. Estas informaciones permiten la comparación entre el movimiento intencional (orden motora emitida por corteza) y el movimiento actual (el movimiento que realmente se está llevando a cabo), del que informan las aferencias propioceptivas. Una vez integradas y comparadas estas informaciones, el cerebelo lleva a cabo la modulación fina del movimiento mediante la inervación del tálamo motor y del sistema reticular descendente (Ito, 2006; Hashimoto y Hibi, 2012). Por tanto, se puede considerar al cerebelo como un centro evaluador y regulador del movimiento fino, que actúa comparando la orden motora emitida con la que realmente se ha llevado a cabo (Kandel et al., 2000; Hashimoto y Hibi, 2012). Las principales aferencias y eferencias del cerebelo quedan recogidas en la tabla 1. En los últimos años se ha sugerido que el cerebelo, aparte de su papel canónico, pudiera estar modulando funciones cognitivas y emocionales por medio de los denominados modelos de control interno (Ito, 2008). Estas especulaciones se basan en el hecho de que la filogenia de las zonas laterales de los hemisferios cerebelares es más reciente que la del resto del cerebelo y paralela a la aparición filogenética de corteza cerebral asociativa. Además, estas zonas laterales adquieren una mayor prominencia en primates y humanos (Ramón y Cajal, 1899; Leiner et al., 1986; 1993; Kandel et al., 2000; Ito, 2008). 5 Introducción Aferencias del cerebelo: A. Pedúnculo cerebelar inferior 1. Ipsilaterales: Del tracto espinocerebelar dorsal y del tracto cuneocerebelar. Reticulocerebelar (de formación reticular lateral y núcleo paramediano) 2. Contralaterales: Olivocerebelar B. Pedúnculo cerebelar medio Aferencias cortico-pontino-cerebelares, decusan desde el hemisferio cerebral contralateral. C. Pedúnculo cerebelar superior Aferencias contralaterales espinocerebelares, principalmente hacia el paleocerebelo. La función principal de este pedúnculo es eferente. Eferencias del cerebelo: A. Pedúnculo cerebelar inferior 1. Vía núcleo fastigial, al núcleo vestibular lateral y áreas reticulares del tronco encefálico 2. Vías fastigio-reticulares y fastigio-vestibulares B. Pedúnculo cerebelar medio Eferencias a núcleos pontinos. C. Pedúnculo cerebelar superior 1. Desde núcleos dentado e interpuesto, contralateral hacia tálamo VA y tálamo VL. También hacia el núcleo rojo 2. Información descendente hacia el núcleo reticular paramediano Tabla 1. Principales aferencias y eferencias que cursan por los pedúnculos cerebelares. Macroscópicamente, en el cerebelo, pueden distinguirse tres regiones dispuestas latero- medialmente: la vermis o región media; la paravermis o región paramedial y los hemisferios cerebelares. El cerebelo está compuesto por una corteza de estructura trilaminar, que engloba a una capa interna de sustancia blanca (constituida por las aferencias y eferencias cerebelares) y tres núcleos cerebelares profundos: el núcleo 6 Introducción fastigial; el núcleo interpuesto (constituido a su vez por dos núcleos: el globoso y el emboliforme) y el núcleo dentado (Kandel et al., 2000; Jacobson y Marcus, 2008). La estructura trilaminar de la corteza cerebelosa tiene su origen en teleósteos superiores y está altamente conservada a lo largo de la escala evolutiva (Hashimoto y Hibi, 2012). El cerebelo posee una estructura altamente ordenada y modular que en mamíferos se dispone en 10 lóbulos (I-X), aunque los patrones de foliación de cada uno de ellos pueden variar en la escala filogenética (Sillitoe y Joyner, 2007). Cada uno de estos lóbulos o folias conserva la citoarquitectura trilaminar característica a lo largo de todo el eje latero-medial (Ramón y Cajal, 1899). Esta homogeneidad histológica lleva a pensar que distintas regiones del cerebelo llevan a cabo procesos computacionales de características similares, operados probablemente sobre distintas entradas de información topográficamente organizadas. 1.1-Citoarquitectura del cerebelo Desde una perspectiva citológica el cerebelo se compone de neuronas excitatorias, neuronas inhibitorias y células gliales. Entre las neuronas excitatorias glutamatérgicas encontramos principalmente las neuronas granulares, las células unipolares en cepillo o UBCs (del inglés Unipolar Brush Cells) y neuronas excitatorias de proyección de los núcleos cerebelares profundos. Entre las neuronas inhibitorias GABAérgicas encontramos numerosos tipos celulares entre las que cabe destacar las neuronas de Purkinje, por ser estas las principales neuronas eferentes de la corteza cerebelar, aunque han de citarse también los numerosos tipos de interneuronas que están presentes en la corteza cerebelar, cuya función es llevar a cabo procesos de modulación intrínsecos. Entre estas encontramos las células de Golgi, las células de Lugaro, células en 7 Introducción candelabro, células en cesta y células estrelladas (Altman y Bayer, 1997). Existen también interneuronas pequeñas en los núcleos cerebelares profundos (Sillitoe y Joyner, 2007). En cuanto a las células no neuronales, caben destacar las células de la glía de Bergmann, un tipo de astrocito de cerebelo cuya disposición recuerda la de la glía radial en corteza y posee importantes funciones de soporte y señalización durante la migración de las células granulares (Xu et al., 2013). Además, existen astrocitos, oligodendrocitos y células microgliales. Todas estas células se disponen en una estructura trilaminar que comprende, desde la zona más superficial a la más interna, las siguientes capas: 1) La capa plexiforme o molecular, 2) la capa de las células de Purkinje y 3) la capa de las células granulares. La capa plexiforme está constituida principalmente por los axones de las células granulares o fibras paralelas y las arborizaciones dendríticas de las células de Purkinje, formando un intrincado plexo de conexiones que da origen a su nombre. Es en este estrato donde se establece la sinapsis entre los terminales glutamatérgicos de la fibra paralela y las dendritas de la célula de Purkinje (sinapsis PF-PC), cuyo elemento presináptico es el objeto del estudio que se detallará a lo largo de este trabajo. El aspecto tenue y granulado de las antiguas tinciones con hematoxilina es el motivo por el que también se conoce como capa molecular (Ramón y Cajal, 1899). Entre el plexo de fibras se pueden distinguir además interneuronas en cesta y estrelladas, prolongaciones distales de la glía de Bergmann y aquellos terminales de las fibras trepadoras que establecen contactos axo-dendríticos con las neuronas de Purkinje. La capa de las células de Purkinje está formada por los somas de dichas células y por los terminales axónicos excitatorios de las fibras trepadoras, cuyo soma se encuentra en el núcleo olivar inferior, mientras que sus terminales se disponen rodeando los somas de las neuronas de Purkinje y estableciendo sinapsis de tipo axo-somático. La naturaleza 8 Introducción neuroquímica de estos terminales ha sido objeto de controversia durante años debido a una mala interpretación de resultados electrofisiológicos (Toggenburger et al., 1983), si bien es cierto que a día de hoy está ampliamente aceptada su naturaleza glutamatérgica (Ottersen y Storm-Mathisen, 2000). Interpuestas entre los somas de las células de Purkinje se encuentran los somas de las interneuronas en candelabro. La capa de células granulares contiene principalmente los somas de las neuronas granulares, aunque también se encuentran en este estrato los somas de las UBCs, las interneuronas de Golgi y las de Lugaro. Las interneuronas de Golgi son activadas por las fibras paralelas de la capa plexiforme y establecen sinapsis sobre las dendritas de las mismas neuronas granulares, constituyendo un elemento regulador endógeno de la actividad de las neuronas granulares modulado, a su vez, por la actividad de estas. Encontramos en este estrato los terminales glutamatérgicos de las fibras musgosas que establecen contactos con las dendritas de las neuronas granulares, constituyendo la principal entrada de información al cerebelo. A la unidad funcional constituida por los terminales presinápticos de las neuronas de Golgi y de las fibras musgosas, y por el elemento postsináptico aportado por las neuronas granulares se le denomina glomérulo cerebeloso (Ramón y Cajal, 1899; Palkovits et al., 1971; Ito, 1984). Por debajo de las tres capas de corteza cerebelosa se encuentra el cableado de fibras que conecta el cerebelo con distintas regiones del encéfalo. Encontramos fibras aferentes y eferentes, que cursarán por los pedúnculos cerebelosos, así como fibras intrínsecas, cuya función es la de conectar distintas áreas del cerebelo tanto homolateral como contralateralmente, lo que permite tareas de sincronización y comparación. También se encuentran aquí los núcleos cerebelares profundos, estación de relevo obligatoria para las eferencias cerebelosas, a excepción de aquellas que inervan el núcleo vestibular. 9 Introducción Figura 1- Estructura macroscópica e histológica del cerebelo. Se muestra la regionalización macroscópica del cerebelo, así como cortes transversales en los que se muestra la citoarquitectura de la corteza cerebelar y la organización esquemática de una laminilla. GCL: Capa de células granulares; PCL:Capa de células de Purkinje; ML: Capa plexiforme o molecular (Adaptado de (Sillitoe y Joyner, 2007; Apps y Hawkes, 2009)) 10 Introducción 1.2-Circuitería y neuroquímica El circuito neuroquímico del cerebelo fue descrito alrededor del año 1960 por John Eccles y Masao Ito, el primero de ellos recibió en 1963 el premio Nobel de fisiología y medicina por sus investigaciones. Este circuito es relativamente simple, si se atiende exclusivamente a su función moduladora del movimiento. Sólo hay dos tipos de axones que ingresan en el cerebelo, los de las fibras trepadoras y los de las fibras musgosas. Las fibras trepadoras se originan exclusivamente en el núcleo olivar inferior, mientras que las fibras musgosas recogen el resto de entradas de información al cerebelo. Ambas son de naturaleza glutamatérgica (excitatoria), excitando aquellas neuronas con las que sinaptan. Una vez que entran en el cerebelo, tanto las fibras musgosas como las trepadoras emiten colaterales que sinaptan sobre las neuronas de los núcleos cerebelares profundos. A medida que ascienden en la corteza cerebelosa, las fibras musgosas se ramifican exhaustivamente. Cada una de las fibras musgosas establece sinapsis sobre una población de dendritas de las neuronas granulares lo que causa su activación, a continuación el axón de la célula granular se dirige hacia la superficie externa de la corteza cerebelosa (capa plexiforme) donde se divide formando una "T", y es entonces cuando atraviesa, en paralelo con el eje de la folia cerebelosa, los árboles dendríticos formados por las neuronas de Purkinje, con los que establecen sinapsis "en passant" (así denominadas debido a que no son sinapsis terminales, sino que se establecen a lo largo de todo el recorrido del axón). Cada una de las neuronas de Purkinje establece sinapsis con varios cientos de miles de fibras paralelas, cada uno de estos fascículos de fibras que sinapta sobre una neurona de Purkinje se conoce con el nombre de haz (del inglés beam). Además, las fibras paralelas establecen contactos excitatorios con las 11 Introducción interneuronas de Golgi, las estrelladas y las interneuronas en cesta. La activación de las neuronas de Purkinje puede ser sumatoria, en términos sinápticos, si atendemos a la inervación que recibe desde las neuronas granulares. Los axones de las células de Purkinje son los únicos que abandonan la corteza del cerebelo, haciendo sinapsis sobre los núcleos cerebelares profundos y sobre algunas neuronas vestibulares. Las neuronas de Purkinje son neuronas GABAérgicas que ejercen una potente inhibición sobre las distintas neuronas con que sinaptan. Por tanto, la entrada de información excitatoria en el cerebelo activa las neuronas de los núcleos cerebelares profundos, así como a las neuronas granulares. Estas a su vez excitarán las neuronas de Purkinje, cuya función es entonces inhibir las neuronas de los núcleos cerebelares profundos. Este es un paso crítico del circuito cerebeloso, en el que se lleva a cabo un refinamiento de la información eferente sobre las neuronas de los núcleos cerebelosos (Hashimoto y Hibi, 2012). Podemos entender este proceso como un refinamiento de la actividad a la baja, similar al que lleva a cabo un escultor, en el que va eliminando porciones de la pieza inicial para dar forma, en este caso, a un patrón de actividad neuronal. Las fibras trepadoras establecen sinapsis excitatorias directas sobre las células de Purkinje. La relación entre las fibras trepadoras y las neuronas de Purkinje es 1:1, lo que significa que existe una íntima relación entre las neuronas del núcleo olivar inferior y las células de Purkinje. Se cree que el núcleo olivar inferior funciona como un detector de errores, cuando se lleva a cabo una acción errática, se activa el núcleo olivar inferior y posteriormente las neuronas de Purkinje correspondientes, a través de las fibras trepadoras. Esto conlleva la inhibición de los núcleos cerebelares profundos lo que acarrea el término del componente indeseado (error) de la acción. El refinamiento de los patrones motores tiene lugar mediante procesos de plasticidad sináptica, mayoritariamente en la sinapsis que se establece entre la fibra paralela y la 12 Introducción célula de Purkinje. En esta sinapsis se han descrito, tanto procesos de depresión como de potenciación que podrían guardar relación con una memoria relacionada con los patrones motores. Los fenómenos de LTD y STD (del inglés Long Term Depression y Short Term Depression respectivamente) presináptica que acontecen en las fibras paralelas han sido fruto de numerosas investigaciones y parecen guardar una estrecha relación con este tipo de aprendizaje (Ito, 1989; 2002; 2006; Porrill y Dean, 2008; Rothman et al., 2009) Figura 2- Circuito cerebelar básico. Esquema del circuito básico del cerebelo, se identifican con "+" las sinapsis excitatorias y con "-" las inhibitorias. Lg: Cel. de Lugaro; Go: Cel. de Golgi; UB: Cel. Unipolares en cepillo. Gr: Cel. Granulares; PF: Fibras paralelas; SC: Cel. Estrelladas; BC: Cel. en cesta; MF: Fibras musgosas; CF: Fibras trepadoras. PCN: Núcleos precerebelares; CN/VN Nucleos cerebelares/vestibulares; IO: Oliva inferior; pRN: Núcleo Rojo (parvocelular) N-C: Vias intrínsecas Núcleo-corticales; N-O: Núcleo-Olivares; R-O: Proyecciones Rubro-Olivares. Adaptado de (Ito, 2008) 13 Introducción 1.3-Histogénesis cerebelar Los precursores de las células de Purkinje se originan en el neuroepitelio del cuarto ventrículo, llevando a cabo una migración radial desde la pared del ventrículo hacia la corteza cerebelosa (Altman y Bayer, 1978); la mayoría de las interneuronas GABAérgicas del cerebelo también sigue esta ruta migratoria, lo que las conduce a su localización final (Zhang y Goldman, 1996). Las neuronas de Purkinje forman entonces la placa de células de Purkinje que es, en los primeros estadios, una estructura multilaminar, formándose la monocapa final en estadios postnatales tempranos (Altman y Bayer, 1978; Hibi y Shimizu, 2012; Xu et al., 2013). Los precursores de las células granulares se dispersan tangencialmente en dirección rostral sobre la superficie dorsal del cerebelo a partir del labio rómbico superior, este movimiento morfogenético origina la llamada capa granular externa (EGL del inglés External Granule Layer) que queda situada por encima de la capa de células de Purkinje (Altman y McCrady, 1972; Altman y Bayer, 1997; Chung et al., 2010). Esta capa granular externa se comporta como una zona germinal secundaria que prolifera a partir del día E17 (Xu et al., 2013) siguiendo un gradiente antero-dorsal y dilatando su ventana proliferativa hasta el estadio postnatal de P10. El pico de proliferación se produce alrededor de P7, momento escogido para realizar los cultivos de células granulares de cerebelo de rata, por conservar estas dos características esenciales para la realización de un cultivo celular: pluripotencia y cierta capacidad proliferativa. Parece ser que el mitógeno Shh (del inglés Sonic HedgeHog) secretado por las células de Purkinje es la señal que mantiene la actividad proliferativa de los precursores en la EGL (Spassky et al., 2008; Chedotal, 2010). En el cerebelo postnatal temprano (hasta P3), las células presentes en la EGL migran tangencialmente (Komuro et al., 2001). A partir de P5 y hasta P15 (con un pico comprendido entre P7 y P12) las células experimentan un proceso de migración radial, atravesando la capa de 14 Introducción células de Purkinje y usando para su guía las prolongaciones de la glía de Bergmann (Xu et al., 2013). El par de moléculas Sema6A (Semaforina 6A) y su receptor PlexinaA2 controlan el inicio de este periodo de migración radial (Komuro et al., 2001; Chedotal, 2010) ya que controlan los movimientos del núcleo (Chedotal y Renaud, 2008) y la dinámica de la polimerización/despolimerización de actina (Renaud et al., 2008). Numerosas moléculas difusibles como el BDNF (del inglés Brain Derived Neurotrophic Factor) (Zhou et al., 2007) o el VEGF (del inglés Vascular Endothelial Growth Factor) (Ruiz de Almodovar et al., 2010) han sido implicadas en la continuidad de este proceso de migración. Estas moléculas pueden ser secretadas por las células de la glía de Bergamnn y señalizar de forma paracrina en las células granulares, pues se adhieren a sus prolongaciones, como ocurre con el VEGF o bien pueden ser sintetizadas y secretadas por las propias células granulares, señalizando de forma autocrina (Zhou et al., 2007). También han sido implicadas en el proceso migratorio varias moléculas de adhesión celular expresadas por la glía de Bergmann como la astrotactina, la profilina o la β1-Integrina (Xu et al., 2013). Durante este periodo, la supervivencia de las células granulares es dependiente de actividad, lo que se traduce en una entrada de calcio presumiblemente mediada por el receptor NMDA (N-Metil-D-Aspartato) (Jurado et al., 2003), si bien es cierto que los receptores AMPA permeables a calcio parecen jugar también un papel importante en la supervivencia dependiente de calcio que este tipo celular exhibe en periodos tempranos del desarrollo (Condorelli et al., 1993; Incontro et al., 2011). La entrada de calcio conlleva finalmente la activación de una cascada pro- supervivencia en la que está crucialmente implicada el factor Nurr1 (Barneda-Zahonero et al., 2012). El BDNF y el calcio parecen actuar de forma sinérgica en la promoción de la supervivencia de la célula granular. El gradiente de BDNF generado por las células de la capa granular interna induce la síntesis y secreción de BDNF desde las propias 15 Introducción neuronas granulares, este bucle de retroalimentación positiva potencia el gradiente de BDNF, lo que ha sido puesto de manifiesto en animales carentes de la proteína CAPS2 (del inglés Calcium-dependent Activator Protein for Secretion). Esta proteína se encuentra asociada a las vesículas de secreción de BDNF y Neurotrofina3, en los ratones carentes de esta proteína, la migración de las células granulares sufre un severo retraso por los defectos de señalización autocrina y de amplificación del gradiente (Sadakata et al., 2007). Además el calcio juega un importante papel en la regulación de la transcripción del BDNF. Se ha descrito que la transcripción del BDNF es dependiente del factor CREB (del inglés cyclic AMP Response Element-Binding protein), este factor se activa por fosforilación dependiente de la Calcio Calmodulina QuinasaIV (CaMKIV) que a su vez es fosforilada por la Calcio Calmodulina Quinasa Quinasa (CaMKK), la pérdida de cualquiera de estas dos quinasas conlleva una disminución de los niveles de BDNF así como un retraso en la migración de las células granulares (Kokubo et al., 2009). Además, el calcio, actuando a través de la ya mencionada cascada de fosforilaciones sobre el factor CREB, parece regular también la transcripción de Nurr1; este factor de transcripción también se une al promotor del gen del BDNF induciendo su transcripción, lo que también contribuye a la amplificación del gradiente (Barneda- Zahonero et al., 2012). La expresión de distintos tipos de canales iónicos (tanto receptores como canales operados por voltaje) está finamente regulada a lo largo de la migración, lo que de nuevo pone de manifiesto la importancia de la señalización por calcio en la supervivencia temprana y en la migración de las células granulares inmaduras (Komuro y Rakic, 1992). De hecho se ha propuesto que el proceso migratorio podría estar orquestado por los cambios en el proteoma de membrana y las fluctuaciones de calcio intracelular que estos desencadenarían (Komuro y Rakic, 1998). El glutamato necesario para la activación de los receptores AMPA y NMDA durante el 16 Introducción proceso de migración parece provenir de la incipiente inervación aferente que estas células reciben durante este periodo, motivo por el cual el cultivo de células granulares de cerebelo ha de realizarse en condiciones despolarizantes con el objeto de emular el estado de excitación de las membranas durante este periodo (Gallo et al., 1987). De forma paralela a la oleada migratoria, la célula granular extiende su axón hacia la capa granular externa y este va adquiriendo su particular forma de "T", lo que le hace establecer un vínculo constante con su lugar de origen (Espinosa y Luo, 2008; Xu et al., 2013). En el estadio P15, prácticamente la totalidad de las células que formaban la EGL han ingresado en la capa granular interna o IGL (del inglés Inner Granule Layer) y a partir de P21 la capa granular externa ha desaparecido completamente, habiéndose originado ya la estructura trilaminar característica del cerebelo adulto. Figura 3- Migración de las células granulares desde la capa granular externa a la capa granular interna. Esquema que ejemplifica el patrón cronológico de migración de la capa granular externa a la interna y micrografía correspondiente a una laminilla cerebelosa en P14. Obsérvense las células migrando radialmente junto a las prolongaciones de la glía de Bergmann (puntas de flecha). Adaptado de (Incontro et al., 2011; Xu et al., 2013) 2-La sinapsis glutamatérgica 17 Introducción La transmisión de información entre dos células puede tener lugar de diversos modos y es imprescindible para el mantenimiento de la correcta homeostasis de organismos pluricelulares. Posiblemente, el mayor grado de especialización de este fenómeno lo encontremos en la comunicación entre células del sistema nervioso, en concreto en la transmisión de información neurona-neurona o sinapsis (Kotaleski y Blackwell, 2010). La transmisión de información entre dos neuronas siempre está codificada en términos químicos o eléctricos, dando lugar a cambios en los gradientes de los iones que mantienen el equilibrio químico y eléctrico de una célula, lo que a su vez generará, bien perturbaciones en el potencial de membrana de dicha célula, o bien en las concentraciones de diferentes mensajeros extra e intracelulares y por tanto dará lugar a oscilaciones en diferentes actividades enzimáticas y/o fluctuaciones en la expresión génica. Actualmente se conocen dos formas mayoritarias de transmisión sináptica, las sinapsis eléctricas y las sinapsis químicas. En las sinapsis eléctrica, la transmisión de información se da de forma directa, ya que las neuronas adyacentes se encuentran en contacto por medio de uniones intercelulares que comunican sus citoplasmas (concebidas como sinapsis “rudimentarias” evolutivamente, típicas de organismos inferiores). En las sinapsis químicas, la transmisión es indirecta, e implica la liberación de un mensajero químico (neurotransmisor) por el terminal axónico de la neurona presináptica y la recepción de dicho mensajero por complejos proteicos generalmente ubicados en la dendrita de la neurona postsináptica (este tipo de sinapsis es considerada más “avanzada” en términos evolutivos). Si bien es cierto que determinados núcleos y generadores de ritmos del encéfalo de mamíferos se rigen por sinapsis eléctricas (Connors y Long, 2004), la gran mayoría de la transmisión sináptica en el encéfalo de mamíferos es explicable por sinapsis de tipo químico. 18 Introducción En las sinapsis químicas existe una separación espacial entre la neurona presináptica y la postsináptica, espacio que recibe el nombre de brecha o hendidura sináptica donde se secreta el neurotransmisor por parte de la neurona presináptica. La distancia de esta brecha sináptica es de unos 30nm (Cowan et al., 2001), y es esta separación la que confiere a este tipo de sinapsis dos de sus más importantes propiedades, la discontinuidad espacio-temporal en la propagación del impulso nervioso y la posibilidad de amplificar (o silenciar) una determinada señal presináptica en función de características intrínsecas de la neurona postsináptica (número y tipo de receptores así como el estado de activación de los mismos), aunque las propiedades que caracterizan a una sinapsis en concreto dependen tanto de su elemento presináptico como del postsináptico (Koester y Johnston, 2005). Además, en función de las sinapsis aferentes que reciba una determinada neurona postsináptica, este tipo de sinapsis permite una elevada capacidad de integración al poder ser activados receptores de distintos tipos de neurotransmisores o bien distintos receptores que respondan al mismo neurotransmisor, sobre una misma membrana postsináptica. En términos generales, el inicio de la transmisión sináptica se podría definir cronológicamente de la siguiente manera: la llegada de un potencial de acción (PA) al terminal presináptico genera, debido a la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje, una elevación transitoria de la concentración de calcio en la zona activa que desencadena la fusión calcio-dependiente de las vesículas sinápticas que contienen el neurotransmisor y consecuentemente el vertido de neurotransmisor a la hendidura sináptica. La activación de los receptores presentes en la neurona postsináptica daría continuidad al impulso nervioso, que se propagaría de esta manera por la red neuronal (Sudhof, 2004; Sudhof y Rizo, 2011). Todos los eventos comprendidos entre la invasión del terminal presináptico por el potencial de acción y el desencadenamiento de la respuesta que concluye con la génesis 19 Introducción de un nuevo potencial de acción en la neurona postsináptica suceden en un tiempo inferior a 2ms (Sudhof, 2012a). El L-Glutamato es el neurotransmisor excitatorio más abundante en el sistema nervioso central de mamíferos, su acción como neurotransmisor es conocida desde 1960 (Curtis et al., 1960). Aproximadamente un 40% del glutamato sintetizado en el terminal presináptico se debe a la actividad de la enzima glutaminasa, localizada en las mitocondrias de los terminales presinápticos, que lleva a cabo la hidrólisis del grupo amino de la cadena lateral de la glutamina. La glutamina necesaria para esta reacción es transferida a las neuronas desde las prolongaciones astrocitarias que rodean la brecha sináptica (Siegel, 2006). El Glutamato restante parece provenir directamente del ciclo de los ácidos tricarboxílicos por medio de la transaminación del α-cetoglutarato. El glutamato es introducido en la vesícula sináptica por medio de sus transportadores específicos, VGluT1 (Takamori et al., 2000), VGluT2 (Aihara et al., 2000; Takamori et al., 2001) y VGluT3 (Fremeau et al., 2002; Schafer et al., 2002). Clásicamente se ha considerado que estos son antiportadores que incorporan glutamato en la vesícula sináptica en contra de gradiente gracias a la disipación de un gradiente electroquímico de protones previamente generado por las V-ATPasas (del inglés Vacuolar ATPases) (Tabb et al., 1992; Wolosker et al., 1996), sin embargo investigaciones recientes parecen poner de manifiesto que el potencial de membrana de la vesícula sináptica es responsable en gran medida del transporte de glutamato (Bellocchio et al., 2000; Juge et al., 2006; Juge et al., 2010; Omote et al., 2011). Una vez que las vesículas han incorporado el glutamato en su interior (a una concentración aproximada de 150mM (Burger et al., 1989; Takamori et al., 2006)), se disponen en la zona activa en la proximidad de los canales de calcio dispuestas a ser liberadas ante la llegada del potencial de acción. Las zonas activas son puntos del axón especializados en la 20 Introducción liberación de neurotransmisores, en los que gracias a una compleja red de proteínas se posibilita un acoplamiento muy rápido entre el calcio y la maquinaria exocitótica que permite la elevada fidelidad de la transmisión sináptica (Sudhof, 2004; Gundelfinger y Fejtova, 2012). Cuando el glutamato es liberado a la hendidura sináptica activa a distintos receptores específicos presentes en la membrana postsináptica, ademas de receptores presentes en la membrana presináptica o la astrocitaria, estos receptores pueden ser de tipo ionotrópico constituidos por los subtipos AMPA (Honore et al., 1982; Hollmann y Heinemann, 1994), NMDA (Jahr, 1992; Monyer et al., 1992; Hollmann y Heinemann, 1994) y Kainato (Hollmann y Heinemann, 1994; Lerma, 1997; Rodriguez-Moreno y Lerma, 1998) o metabotrópicos (Nicoletti et al., 1986; Masu et al., 1991; Nicoletti et al., 2007). El conjunto de acontecimientos moleculares que tiene lugar en el terminal presináptico desde que una vesícula cargada con neurotransmisor se fusiona con la membrana de la zona activa, hasta que vuelve a estar disponible para un nuevo evento exocitótico recibe el nombre de reciclamiento vesicular (Sudhof, 2004; Shupliakov y Brodin, 2010). Podemos dividir el reciclamiento vesicular en tres etapas, la primera es la fase de endocitosis consistente en la recuperación de la superficie de membrana correspondiente a las vesículas sinápticas que se han fusionado durante la estimulación (esta comprende a su vez una serie de pasos que se detallarán más adelante); la siguiente etapa consiste en la re-acidificación del lumen de la vesícula sináptica, hecho indispensable para poder llevar a cabo la última etapa del reciclamiento, la reincorporación de nuevas moléculas de neurotransmisor en la vesícula sináptica. La continuidad temporal entre los eventos exocitóticos y el reciclamiento vesicular a dado pie a la aparición del concepto del ciclo de las vesículas sinápticas (Heuser y Reese, 1973; Valtorta et al., 1989; Zimmermann et al., 1989; Betz y Bewick, 1992; Zimmermann et al., 1993; Betz y Angleson, 1998) 21 Introducción considerada como la más estrechamente regulada de todas la vías de tráfico intracelular (Sudhof, 1995). Este término engloba todos los eventos relacionados con la exocitosis y con el reciclamiento vesicular, siendo un importante objeto de estudio en la fisiología sináptica actual. El concepto de ciclo vesicular incorpora el reciclamiento como un factor limitante en la eficacia sináptica, hecho que se puso de manifiesto en los mutantes Shibire de Drosophila (Koenig y Ikeda, 1989; Chen et al., 1991). Cuando un terminal sináptico recibe un tren de potenciales de acción a una frecuencia elevada, el paso que limita de forma crucial la disponibilidad de vesículas, y por tanto la fidelidad de la transmisión sináptica, es el reciclamiento vesicular (von Gersdorff, 2001; Sudhof, 2004; Dittman y Ryan, 2009; Shupliakov y Brodin, 2010). A continuación se detallarán los distintos pasos del ciclo vesicular tratando de relacionarlos con el conocimiento actual de la ultraestructura de las zonas activas. Figura 4- Esquema general de una sinapsis glutamatérgica. Se ilustra tanto el elemento presináptico como el postsináptico. Obsérvese la íntima relación existente entre la maquinaria de secreción y la onda de calcio, así como la aposición del elemento pre y postsináptico. Micrografía electrónica de una sinapsis glutamatérgica en células granulares de cerebelo en cultivo. Adaptado de (Sudhof, 2012a), la micrografía electrónica es cortesía del Dr. Bartolomé-Martín. 22 Introducción 2.1-La zona activa El termino Zona Activa (AZ) fue introducido por primera vez en 1967 (Jabonero, 1967; Dreyer et al., 1973) y hace referencia a aquellos puntos del axón de la célula presináptica encargados de la fusión dependiente de calcio de las vesículas que contienen el neurotransmisor. En las sinapsis del SNC de mamíferos las zonas activas son estructuras discoidales en íntima aposición con la estructura postsináptica con un diámetro comprendido entre 0.2 y 0.5 μm (Schikorski y Stevens, 1997; Xu-Friedman et al., 2001; Sudhof, 2012b) y cuya función principal es orquestar el acoplamiento rápido entre la entrada de calcio y la liberación de neurotransmisor (Eggermann et al., 2012; Schmidt et al., 2013). Los elementos principales de las zonas activas son las vesículas sinápticas y la membrana presináptica con la que las vesículas experimentan el proceso de fusión. Una característica importante de estos sitios de liberación es la elevada densidad de canales de calcio operados por voltaje en la membrana presináptica (Robitaille et al., 1990) que posibilita la creación de microdominios de calcio y justifica la extraordinaria regulación de la fusión calcio-dependiente de las vesículas sinápticas (Chad y Eckert, 1984; Llinas et al., 1995; Augustine et al., 2003; Schneggenburger y Neher, 2005; Bucurenciu et al., 2008; Scimemi y Diamond, 2012; Schneggenburger et al., 2012). Las vesículas sinápticas se encuentran en la cercanía de estos microdominios de calcio, lo que permite una elevada sensibilidad al calcio de las vesículas más próximas a los canales (Neher, 1998; Schneggenburger et al., 2012) y esta disposición es posible gracias a una compleja red de interacciones proteína-proteína que tiene lugar entre los canales de calcio y la maquinaria exocitótica (Seagar et al., 1999; Spafford y Zamponi, 2003; Han et al., 2011; Kaeser et al., 2011). Las zonas adyacentes a las zonas activas, se denominan zonas perisinápticas. La endocitosis compensatoria de las vesículas tiene lugar en estas zonas (Wan et al., 2000; Wenk y De Camilli, 2004; 23 Introducción Newton et al., 2006; Evergren et al., 2007; Ferguson et al., 2007; Hayashi et al., 2008), además en las zonas perisinápticas se encuentran las moléculas de adhesión celular que mantienen la íntima aposición del aparato pre y post-sináptico, como el par neuroligina (postsinápticas)-neurexina (presinápticas), las SynCAM (del inglés SYNaptic Cell Adhesion Molecules) o las cadherinas (Yamagata et al., 1995; Uchida et al., 1996; Song et al., 1999; Biederer, 2006). Estas zonas perisinápticas también albergan algunos de los receptores presinápticos metabotrópicos y sus complejos de señalización intracelular, como es el caso de algunos subtipos de receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) (Kinoshita et al., 1996; Shigemoto et al., 1997; Fukaya et al., 2008) o del principal receptor presináptico de endocannabinoides (CB1R) (Nyiri et al., 2005; Kawamura et al., 2006; Yoshida et al., 2006; Puente et al., 2010) ambos con importantes funciones en el control de la liberación de neurotransmisor. Existe un elemento adicional presente en la mayoría de las sinapsis del SNC de mamíferos y al que únicamente se le ha atribuido una importancia parcial: la mitocondria (Palay, 1956; Xu-Friedman et al., 2001). Teniendo en cuenta que las zonas activas requieren un alto aporte de energía y que estas pueden distar, en el caso de las CGC, varias micras del soma neuronal, se hace necesaria la presencia de mitocondrias sinápticas que puedan satisfacer la demanda energética de los sitios de liberación de NT (Tang y Zucker, 1997; Ivannikov et al., 2010; Vos et al., 2010). Además, las mitocondrias parecen jugar un papel en el tamponamiento de los niveles de calcio presinápticos, pudiendo contribuir de este modo al control de la eficacia sináptica (Billups y Forsythe, 2002). Las mitocondrias aparecen ancladas a las zonas activas por un entramado filamentoso denominado complejo de anclaje a la mitocondria o MAC (del inglés Mitochondria Anchoring Complex). El tamaño de esta estructura es de aproximadamente 200 nm y su composición proteica es desconocida (Tolbert y Morest, 1982; Perkins et al., 2010). 24 Introducción Figura 5- Esquema de la zona activa y una zona perisináptica. Obsérvese la disposición de las vesículas alrededor de los sitios de liberación de la zona activa. Las vesículas se liberan en la zona activa y se trasladan, por difusión lateral, a las zonas adyacentes. El reciclamiento vesicular tiene lugar preferentemente en las zonas perisinápticas. Adaptado de (Shupliakov y Brodin, 2010) 25 Introducción 2.1.1-Arquitectura de la zona activa Se puede definir una zona activa como una compleja cascada de interacciones proteína- proteína (Sudhof, 1995). El intrincado plexo de interacciones moleculares que acontece en las zonas activas tiene lugar fundamentalmente entre siete proteínas: RIM (del inglés Rab3 Interacting Molecule) (Wang et al., 1997), Munc13-1 (del inglés Mammalian homologue of UNCoordinated phenotype 13) (Brose et al., 1995), RIM-BPs (del inglés RIM-BindingProteins) (Wang et al., 2000; Liu et al., 2011), ELKS/CAST (del inglés Cytomatrix at the Active zone STructural protein) (Ko et al., 2003; Deguchi-Tawarada et al., 2004) y α-liprinas (Serra-Pages et al., 1995; Zhen y Jin, 1999), que conformarían el núcleo de la zona activa (Wang et al., 2009; Sudhof, 2012b). Estas proteínas, junto con las proteínas Piccolo (Cases-Langhoff et al., 1996) y Bassoon (tom Dieck et al., 1998) parecen extenderse hacia el interior del terminal presináptico debido a su gran tamaño (Limbach et al., 2011; Gundelfinger y Fejtova, 2012) y constituyen la citomatriz de la zona activa. Excepto α-liprina y ELKS/CAST, algo más simples en su estructura, las demás proteínas mencionadas son proteínas modulares con diferentes dominios, lo que permite una elevada combinatoria de interacciones mediante las que se posibilitan las funciones de la zona activa (anclaje y preparación de las vesículas sinápticas, acoplamiento de la maquinaria exocitótica a la entrada de calcio gracias al reclutamiento de canales, interacción con moléculas de adhesión celular y propiedades plásticas del aparato exocitótico). Al microscopio electrónico, las zonas activas muestran una apariencia de rejillas hexagonales de agregados electrodensos entre las que se encuentran intercaladas las vesículas sinápticas, estos agregados reciben el nombre de "proyecciones densas" y se encuentran enfrentados a la densidad postsináptica en las sinapsis asimétricas (Pfenninger et al., 1972; Limbach et al., 2011). Estudios recientes de ultraestructura combinados con inmunodetección, han revelado que las proteínas 26 Introducción Munc13 y RIM se encuentran distribuidas entre las proyecciones electrodensas y muy cerca de la membrana plasmática, guardando una íntima relación espacial con las vesículas sinápticas. En cuanto a las proteínas Piccolo y Bassoon, estas parecen contener su extremo C-terminal en las zonas medias y distales de las proyecciones electrodensas, mientras que su extremo N-terminal se extiende hacia el interior del citoplasma (Siksou et al., 2009; Limbach et al., 2011). Esta organización topológica es acorde a la descrita con técnicas ultra-resolutivas de microscopía óptica (Dani et al., 2010). Los extremos N-terminal tanto de Munc13 como de RIM distan tan solo 20 nm de los extremos C-terminal de Piccolo y Bassoon lo que aporta una explicación a la interacción física descrita entre estas moléculas (Wang et al., 2009; Limbach et al., 2011). ELKS/CAST se sitúa en el centro de las proyecciones electrodensas (Siksou et al., 2007) y esta localización es coherente con las interacciones que esta molécula establece con Piccolo, Bassoon, Munc13 y RIM (Ohtsuka et al., 2002; Schoch et al., 2002; Jose et al., 2008; Wang et al., 2009; Hida y Ohtsuka, 2010). Como se comentó previamente, una elevada densidad de canales de calcio en el terminal presináptico es indispensable para una eficiente liberación de neurotransmisor una vez el PA invade el terminal presináptico. El confinamiento de canales de calcio voltaje-dependientes en las zonas activas (Limbach et al., 2011) es posible gracias a dos interacciones descritas: la de las RIM-BPs con canales de calcio dependientes de voltaje, y con su subunidad accesoria (β) (Hibino et al., 2002; Kiyonaka et al., 2007) que da lugar a un complejo que comprende a RIM, RIM-BPs y canales de calcio; y la interacción directa de RIM, por medio de su dominio PDZ, con el dominio C-terminal tanto de canales de tipo P/Q (Cav2.1) como de canales de tipo N (Cav2.2) (Wong y Stanley, 2010; Kaeser et al., 2011). El complejo heterotrimérico formado entre Munc13, RIM y la GTPasa pequeña de la membrana de las vesículas sinápticas, Rab3 (Fischer von Mollard et al., 1990), 27 Introducción actúa como nexo entre las vesículas y las partes distales de las proyecciones electrodensas de la zona activa (Dulubova et al., 2005), lo que parece guardar relación con el papel de RIM en un primer anclaje de las vesículas sinápticas a la zona activa (Gracheva et al., 2008; Kaeser et al., 2011). Existen controversias acerca de los estudios ultraestructurales de las zonas activas realizados en distintas condiciones, ya que los fijadores químicos como los aldehídos, parecen promover la agregación de los complejos proteicos generando artefactos. Este hecho se puso de manifiesto al usar técnicas de congelación a elevadas presiones, que permiten preservar la ultraestructura de la muestra sin el uso de fijadores químico (Landis et al., 1988), en este caso no se obsevan las proyecciones electrodensas y sólo hay evidencias de una maraña de conectores entre las distintas vesículas y entre estas y la membrana plasmática (Landis et al., 1988; Siksou et al., 2007; Fernandez-Busnadiego et al., 2010). Empero, cabe destacar que las posiciones relativas de los epítopos de las distintas proteínas constituyentes de la zona activa no parecen modificarse al usar diferentes técnicas de fijación (Siksou et al., 2007; Siksou et al., 2009; Limbach et al., 2011) y que los conectores siguen siendo visibles con técnicas de fijación convencionales, aunque en menor proporción (Perkins et al., 2010). Esto hace que a día de hoy las técnicas de microscopía electrónica con fijadores químicos sigan estando ampliamente aceptadas para los estudios ultraestructurales de la zona activa, ya que el hecho de que una estructura no sea visible no necesariamente implica que esa estructura no exista (Sudhof, 2012b). 28 Introducción Figura 5- Micrografías electrónicas de zonas activas obtenidas mediante técnicas de fijación química (A) o mediante congelación a altas presiones (B). En (C) se observan las proyecciones electrodensas en íntima aposición con la densidad post-sináptica (PSD). La disposición relativa de las proteínas que forman la zona activa se muestra en (D). Adaptado de (Siksou et al., 2007; Kaeser et al., 2011; Gundelfinger y Fejtova, 2012) N C C N 29 Introducción 2.2-El ciclo vesicular sináptico El conjunto de pasos de tráfico vesicular intracelular que comprenden la adquisición de competencia exocitótica plena por parte de una vesícula sináptica, su fusión con la membrana plasmática y su posterior fisión de esta por endocitosis, así como el proceso de reacidificación del lumen vesicular que precede a la reincorporación de nuevas moléculas de glutamato en su interior reciben el nombre de ciclo vesicular (Valtorta et al., 1989; Betz y Bewick, 1992; Zimmermann et al., 1993; Sudhof, 1995; 2004). Los pasos del ciclo vesicular se describirán a continuación, comenzando por la fase exocitótica y haciendo especial mención a la preparación de vesículas para su fusión y a la fase endocitótica. 2.2.1-Exocitosis El proceso que concluye con la fusión de las bicapas lipídicas de la vesícula y de la membrana de la zona activa tiene como protagonistas moleculares a las proteínas SNARE (del inglés SNAp REceptors) (Link et al., 1992; Schiavo et al., 1992; Fasshauer et al., 1998b; Sudhof y Rizo, 2011; Jahn y Fasshauer, 2012). Las proteínas de la superfamilia SNARE son proteínas altamente conservadas desde un punto de vista evolutivo y que participan en numerosas vías de tráfico intracelular (Lewis et al., 1997; Antonin et al., 2002; Bonifacino y Glick, 2004; Jahn y Scheller, 2006). Estas proteínas contienen un motivo característico llamado dominio SNARE (Fasshauer et al., 1998a) que es básicamente una estructura helicoidal. En la liberación de vesículas sinápticas son tres las proteínas SNARE con un papel esencial: la proteína de la vesícula sináptica sinaptobrevina o VAMP (del inglés Vesicle Associated Membane Protein) (Trimble et al., 1988; Baumert et al., 1989), y las proteínas de la membrana plasmática Sintaxina-1 (Bennett et al., 1992) y SNAP 25 (Oyler et al., 1989). Además de su dominio SNARE, 30 Introducción la proteína Sintaxina posee un dominio adicional denominado Habc (Fernandez et al., 1998) con importantes funciones en la regulación de la formación del complejo SNARE (Dulubova et al., 1999; Fasshauer y Margittai, 2004; Dulubova et al., 2007; Khvotchev et al., 2007). El complejo SNARE que se forma entre proteínas de membrana plasmática y proteínas vesiculares supone un nexo físico entre la membrana presináptica y la vesicular confiriendo proximidad y posibilitando el proceso de fusión. Este es un complejo super-helicoidal constituido por cuatro hélices, dos de ellas son aportadas por la proteína SNAP 25, una es aportada por la proteína sintaxina y la restante por la proteína vesicular sinaptobrevina (Poirier et al., 1998; Sutton et al., 1998). Figura 6- Proteínas SNARE implicadas en la fusión vesicular. Se ilustra el dominio modular de estas proteínas (A) y el modelo de estructura atómica (B) del complejo SNARE ensamblado. En C se recogen los principales eventos del proceso de fusión. Adaptado de (Sudhof y Rizo, 2011) y (Jahn y Scheller, 2006) 31 Introducción La formación del complejo SNARE se da principalmente mediante interacciones hidrofóbicas (Fasshauer et al., 1998a) y en dirección de N a C terminal. El ensamblaje de este complejo es un proceso altamente exergónico, lo que confiere la energía de activación necesaria para la posterior fusión de las bicapas, por tanto, se puede definir al complejo SNARE como el verdadero motor molecular de la exocitosis (Sudhof y Rizo, 2011). Esta energía de activación se traduce en fuerzas de torsión que aproximan las membranas e inducen la curvatura necesaria para que suceda el evento de fusión (Jahn y Grubmuller, 2002; Kozlovsky y Kozlov, 2002; Jahn y Scheller, 2006). 2.2.2-Preparación de las vesículas Previo al paso de fusión calcio dependiente de las vesículas sinápticas estas experimentan un proceso de preparación para su liberación. Este proceso puede ser explicado en dos pasos, un acercamiento espacial a las zonas donde se generan los microdominios de calcio en la zona activa, lo que se conoce con el nombre de amarre a la zona activa (del inglés docking) y un paso ulterior que permite el ensamblaje de complejos SNARE y recibe el nombre de preparación de las vesículas (del inglés priming) (Sudhof, 2012a). Existen cuatro proteínas crucialmente implicadas en el proceso de preparación de vesículas sinápticas, las ya mencionadas RIM1, Munc13 y Rab3 (o Rab27 (Yu et al., 2008)), y la proteína de la familia SM (del inglés Sec1/Munc18 like) Munc18 (Hata et al., 1993; Deak et al., 2009). Tanto el ratón deficiente para la proteína Munc13 como el ratón deficiente para la proteína Munc18, muestran serios defectos en la exocitosis de vesículas sinápticas (Verhage et al., 2000; Varoqueaux et al., 2002). También se han observado defectos ultraestructurtales en los ratones deficientes de Munc13 (Siksou et al., 2009) y RIM1 (Kaeser et al., 2011) y en 32 Introducción gusanos Caenhorabdites elegans carentes de la proteína Rab3 (Gracheva et al., 2008), si bien es cierto, que este último defecto no ha sido observado en ratones carentes de esta proteína (Leenders et al., 2001; Schluter et al., 2004) a excepción de un estudio en el que se muestra un defecto en el número de vesículas ancladas a la zona activa en las sinapsis que inervan el diafragma de estos ratones (Coleman et al., 2007). La ausencia de efecto en estos animales probablemente se deba a duplicaciones génicas compensatorias a lo largo de la escala evolutiva (Schluter et al., 2004). En cualquier caso, los animales deficitarios para la proteína Rab3 muestran un severo defecto de reclutamiento de vesículas durante la estimulación del terminal presináptico, lo que sí parece tener un correlato ultraestructural (Leenders et al., 2001). En cuanto a Munc18, se han encontrado defectos ultraestructurales en neuronas de ratones parcialmente carentes de esta proteína (heterocigotos) (Toonen et al., 2006) así como en células β- pancreáticas de ratones totalmente carentes de ella (Oh et al., 2012). Munc 13 parece tener un papel central en el priming por participar en un primer paso de acercamiento, y en el paso final de la preparación de la vesícula y la conferencia de competencia exocitótica plena (Jahn y Fasshauer, 2012). RIM también tiene importantes funciones en la preparación de las vesículas, pues es el determinante posicional que sitúa a las vesículas junto a los sitios de entrada de calcio gracias a su interacción con los canales de calcio (Wong y Stanley, 2010; Kaeser et al., 2011) y con la GTPasa pequeña de vesícula Rab3 (Wang et al., 1997; Dulubova et al., 2005), e interviene en la activación de Munc13 por la formación de un complejo heterodimérico (Lu et al., 2006; Kaeser et al., 2011). Munc13 está sometida a una regulación adicional por calcio gracias a sus dominios C2 y por diacilglicerol gracias a su dominio C1 (Brose et al., 1995; Betz et al., 1998; Rhee et al., 2002; Martin et al., 2011), lo que posibilita su reclutamiento a membrana. Finalmente, Munc18 parece guardar relación con los estadios finales del 33 Introducción proceso de preparación de las vesículas, por interaccionar con una forma semi-cerrada de la sintaxina1 (Dulubova et al., 1999; Deak et al., 2009) promoviendo el inicio de la formación del complejo SNARE (Shen et al., 2007; Rathore et al., 2010) y quizá evitando que el complejo SNARE ensamblado se interponga en la fusión de las bicapas lipídicas (Dulubova et al., 2007). Por tanto, se podría contemplar el proceso de preparación de las vesículas como un proceso bifásico, en un primer estadio la unión GTP dependiente de Rab3 a RIM da pie a la formación de un complejo heterotrimérico entre Rab3 y el heterodímero previamente formado de RIM/Munc13 que ancla físicamente la vesícula a la zona activa. En un paso posterior, la activación de Munc13 por calcio y diacilglicerol, que conlleva su translocación, aproxima la vesícula a su sitio final de fusión y a continuación Munc18 iniciará la formación del complejo SNARE, confiriendo a la vesícula su competencia exocitótica plena. Figura 7- Esquema ilustrativo de la arquitectura de una zona activa. Obsérvese la importancia del heterotrímero RIM/Rab3/Munc13 en el posicionamiento y preparación de las vesículas sinápticas. Según modelos recientes, la complexina no entraría a formar parte del complejo SNARE hasta la entrada de calcio en el terminal presináptico, adaptado de (Sudhof, 2012b) 34 Introducción 2.2.3-Fusión Calcio dependiente de las vesículas Existen dos proteínas crucialmente implicadas en la fusión calcio dependiente de las vesículas sinápticas, la proteína de vesícula sináptica sinaptotagmina que actúa a modo de sensor de calcio para la exocitosis (Perin et al., 1991a; Perin et al., 1991b; Surkova y Grishin, 1991) y las complexinas (McMahon et al., 1995; Ishizuka et al., 1997), pequeñas proteínas citosólicas que se unen al complejo SNARE. La proteína sinaptotagmina posee dos dominios C2 de unión a calcio: C2A y C2B. Ambos se unen, de forma calcio-dependiente, a fosfolípidos ácidos y el dominio C2B posee una región que une membranas enriquecidas en Fosfatidil Inositol 4,5, Bisfosfato (PIP(4,5)2) (Brose et al., 1992; Davletov y Sudhof, 1993; Chapman y Jahn, 1994; Fukuda et al., 1994; Fukuda et al., 1996; Schiavo et al., 1996). El papel del calcio en esta interacción parece ser disminuir las repulsiones electrostáticas entre los dominios C2 y las membranas aniónicas (Radhakrishnan et al., 2009; McMahon et al., 2010). Respecto a la función de las complexinas se ha postulado que pudiesen funcionar a modo de iniciador de la formación del complejo SNARE, promoviendo su ensamblaje y por tanto induciendo la fusión vesicular (Xue et al., 2010), o bien funcionando como un freno molecular que se uniría y estabilizaría al complejo SNARE parcialmente ensamblado, liberándose de él ante la llegada del calcio, lo que permitiría el ensamblaje completo de dicho complejo y la consecuente fusión vesicular (Yang et al., 2010; Kummel et al., 2011). Teniendo en cuenta los datos ultraestructurales que revelan que las vesículas no están en contacto íntimo con las membranas de las zonas activas, si no separadas por unos pocos nanómetro (Siksou et al., 2007; Fernandez-Busnadiego et al., 2010), es plausible que el complejo SNARE no se forme hasta que la onda de calcio invada el terminal presináptico. Este dato sería incompatible con el papel de la complexina a modo de freno molecular del ensamblaje del complejo SNARE (Stein et al., 2007; van 35 Introducción den Bogaart et al., 2011) y por tanto lleva a pensar que las complexinas serían las últimas proteínas en entrar a formar parte del complejo de fusión (Jahn y Fasshauer, 2012). El esquema al que dan pie estas observaciones experimentales sería el siguiente. Tanto Munc13 como RIM intervendrían en un primer paso de posicionamiento de las vesículas en aposición a complejos SNARE (Sintaxina/SNAP25) previamente activados, posiblemente gracias a su unión con Munc18. En este estadio, la sinaptotagmina de la vesícula sináptica ya estaría unida a la membrana presináptica, bien por interacciones con el complejo SNARE, o bien por interacciones con membranas enriquecidas en PIP(4,5)2 como es el caso de las membranas de las zonas activas (Micheva et al., 2001). Es entonces cuando la entrada de calcio desencadena una serie de procesos que concluyen, a modo de cascada termodinámica, en la fusión de las vesículas sinápticas. Figura 8- Dinámica del proceso de exocitosis y de preparación de las vesículas. Modelo ilustrativo de los pasos secuenciales de la fusión calcio dependiente. Munc18 sería responsable de la activación del SNARE aceptor, la sinaptotagmina posiciona la vesícula por unión al PIP(4,5)2 y una vez el calcio invade la presinapsis, Munc18 se disocia del complejo SNARE. Es entonces cuandola sinaptobrevina se une al complejo SNARE y la complexina promueve su ensamblaje total (Jahn y Fasshauer, 2012) 36 Introducción La coordinación de los iones calcio a los sitios C2A y C2B de la sinaptotagmina induce en esta un cambio conformacional que aproxima la vesícula aun más a la membrana lo que permitiría la entrada de sinaptobrevina en el complejo SNARE; concomitantemente Munc18 es desplazado de su unión con el complejo SNARE y las complexinas promueven el ensamblaje total del mencionado complejo, ya que orientan correctamente la interacción sintaxina-sinaptobrevina. En este sentido, es difícil disociar los últimos pasos de la preparación de una vesícula sináptica de los primeros pasos del proceso de fusión, por ser ambos calcio dependientes. Este modelo pone de manifiesto que la regulación de la exocitosis se da mayoritariamente en los pasos previos al proceso de formación del complejo SNARE y por tanto a la fusión vesicular, por ser estas últimas reacciones altamente exergónicas. Este modelo asume que una vez que la sinaptobrevina de la membrana vesicular esté lo suficientemente cerca de un complejo SNARE preensamblado, acontecerá un evento exocitótico (Jahn y Fasshauer, 2012). 2.2.4-Endocitosis La transmisión sináptica es un proceso biológico que requiere una elevada fidelidad en términos de frecuencia; en el caso de los terminales presinápticos, esto se traduce en mecanismos que permitan una correcta disponibilidad de vesículas ante estímulos que requieran una elevada frecuencia de liberación exocitótica de neurotransmisor. El principal mecanismo que limita la disponibilidad de nuevas vesículas en un terminal presináptico entre dos estímulos consecutivos es la endocitosis. El máximo exponente de este hecho es la primera sinapsis de las vías auditivas y visuales (las células ciliadas y los fotorreceptores, respectivamente) (von Gersdorff, 2001). El concepto de reciclamiento local de los fragmentos membranosos que experimentan fusión con la 37 Introducción membrana plasmática surge alrededor de 1970 mediante estudios con trazadores y técnicas de microscopía electrónica (Holtzman et al., 1971; Heuser y Reese, 1973). Desde entonces se han descrito tres formas de endocitosis de vesículas sinápticas, la endocitosis mediada por clatrina (Bloom et al., 1981; Heuser, 1989; Maycox et al., 1992; Granseth et al., 2007) la endocitosis masiva (del inglés bulk endocytosis) (Heuser y Reese, 1973; Wu y Wu, 2007; Clayton et al., 2008) y la endocitosis que prosigue a los fenómenos de "kiss&run", proceso conocido en células no neuronales (Alvarez de Toledo et al., 1993) y cuyo papel en neurotransmisión fue inicialmente propuesto por Fesce y colaboradores (Fesce et al., 1994) y demostrado unos años más tarde (Stevens y Williams, 2000; Gandhi y Stevens, 2003; Park et al., 2012), si bien es cierto que existe una gran controversia en torno a la mecánica de estos procesos (He et al., 2006; Granseth et al., 2007; He y Wu, 2007; Dittman y Ryan, 2009; Alabi y Tsien, 2013). En este último modo de exo/endocitosis la fusión vesicular no es completa y por tanto no se requiere una fisión vesicular estrictamente hablando, que siga al evento exocitótico. De los tres modos de endocitosis mencionados, el más relevante en lo que respecta al reciclamiento de vesículas sinápticas es la endocitosis mediada por clatrina (Granseth et al., 2007; Saheki y De Camilli, 2012) sin embargo, el modo exacto de endocitosis que se pone en marcha en un terminal presináptico depende de numerosos factores, tales como la intensidad del estímulo que desencadena el evento exocitótico (Heuser y Reese, 1973; Perez Bay et al., 2007; Wu y Wu, 2007; Clayton et al., 2009), el tipo de neurona en el que se estudie este mecanismo (Granseth et al., 2007), o el estadio de maduración o desarrollo en el que se encuentre la muestra biológica a estudiar (Bartolome-Martin et al., 2012). Se hará especial mención a los procesos de endocitosis masiva y endocitosis mediada por clatrina, por ser la coexistencia de estos dos mecanismos uno de los objetos principales de estudio de este trabajo. 38 Introducción Figura 9- Endocitosis en un terminal presináptico. Se ilustran los tres modos de endocitosis previamente mencionados: 1) Kiss & Run; 2) Endocitosis mediada por clatrina y 3) Endocitosis masiva. Obsérvese que tanto la endocitosis mediada por clatrina como la endocitosis masiva tienen lugar en las zonas perisinápticas, adyacentes a los sitios de fusión. Adaptado de (Saheki y De Camilli, 2012) 2.2.4.1-Endocitosis mediada por clatrina Tras experimentar el proceso de fusión con la membrana presináptica, la acción de distintas proteínas adaptadoras acaba rindiendo un intermediario membranoso recubierto de clatrina (Pearse, 1976; Maycox et al., 1992); finalmente y tras el desensamblaje de esta cubierta de clatrina, se genera una nueva vesícula sináptica que podrá rellenarse con nuevas moléculas de neurotransmisor para ser liberada (Takei et al., 1996; Cremona et al., 1999; Dittman y Ryan, 2009). En las zonas perisinápticas, el reciclamiento mediado por clatrina tiene dos características que lo distinguen de este 39 Introducción mismo proceso en otros tejidos: la especificidad de la carga de proteínas contenida en una determinada fracción de membrana, lo que asegura la presencia de proteínas que tienen un bajo número de copias en las vesículas sinápticas (Takamori et al., 2006; Rao et al., 2012), y la velocidad del proceso (Dittman y Ryan, 2009; Saheki y De Camilli, 2012). Por ello, aparecen isoformas neuronales asociadas a las sinapsis de distintas proteínas que participan en este proceso que no están presentes en otros tejidos (Ferguson et al., 2007; Saheki y De Camilli, 2012). La endocitosis mediada por clatrina comprende un paso inicial en el cual las proteínas adaptadoras se ensamblan en una determinada región de membrana enriquecida en PIP(4,5)2 (Cremona et al., 1999), lo que conlleva la invaginación de ese fragmento de membrana, etapa que se conoce con el nombre de nucleación de la malla de clatrina. Posteriormente y de forma cooperativa, se irán reclutando factores adicionales, junto con las distintas moléculas de clatrina que ayudarán a inducir la curvatura necesaria para la gemación de la vesícula sináptica. En un último paso, la GTPasa dinamina (Shpetner y Vallee, 1989; Obar et al., 1990; Scaife y Margolis, 1990; Chen et al., 1991; Baba et al., 1995; De Camilli et al., 1995; Hinshaw y Schmid, 1995; Takei et al., 1995; Ferguson et al., 2007) lleva a cabo la fisión de la vesícula y, por último, la malla de clatrina es desensamblada de forma dependiente de la fosfatasa sinaptojanina (McPherson et al., 1996; Ramjaun y McPherson, 1996), lo que rinde una nueva vesícula dispuesta para ser liberada una vez sea cargada con nuevas moléculas de neurotransmisor (Dittman y Ryan; Saheki y De Camilli, 2012). Los adaptadores de clatrina generalmente comprenden un módulo plegado de unión a membrana y una serie de brazos flexibles que terminan en dominios globulares (Edeling et al., 2006). El módulo de unión a membrana acopla dominios presentes en las proteínas vesiculares llamados motivos endocitóticos y generalmente basados en tirosinas, así como las cabezas polares del PIP(4,5)2 (Beck y Keen, 1991; Traub, 2003; 40 Introducción Owen, 2004), mientras que los brazos de estas moléculas unen las cadenas pesadas de la clatrina, así como otras moléculas adaptadoras y factores endocitóticos (Edeling et al., 2006) que son proteínas accesorias a la malla de clatrina. Cabe destacar como molécula adaptadoras para el ensamblaje de la malla de clatrina, la proteína AP-2 (del inglés adaptor protein 2) (Smythe et al., 1992; Chang et al., 1993) que interacciona con motivos ricos en tirosinas presentes en la proteína de vesícula SV2 (Schmied y Holtzman, 1987; Floor y Feist, 1989; Haucke y De Camilli, 1999) así como con motivos basados en dileucinas presentes en distintos transportadores de neurotransmisores (Fei et al., 2008). Otro factor adaptador es la proteína AP-180 (Morris et al., 1990), que interacciona con la proteína sinaptobrevina por medio del dominio SNARE de esta (Koo et al., 2011; Miller et al., 2011). La proteína Stonina-2 (Martina et al., 2001), homólogo de las proteínas Stoned-B de Drosophila melanogaster (Andrews et al., 1996), es otro adaptador que forma un complejo con la proteína AP-2 e interacciona con la proteína vesicular sinaptotagmina, el sensor de calcio para la exocitosis (Zhang et al., 1994; Walther et al., 2001; Walther et al., 2004; Willox y Royle, 2012; Kononenko et al., 2013). Atendiendo a sus interacciones, queda claro que las principales funciones de las proteínas adaptadoras son la selección de la carga que se contiene en el fragmento de membrana que se ha de internalizar. La fuerza mecánica requerida para el proceso de gemación parece ser conferida por la clatrina, ya que el ensamblaje característico a modo de trisquel (Ungewickell y Branton, 1981), funciona como motor molecular principal de esta reacción (Kirchhausen, 2000). Sin embargo, en los últimos años se ha puesto de manifiesto que numerosas proteínas, llamadas factores endocitóticos, podrían ayudar a la inducción de curvatura de las membranas (Ford et al., 2002), funcionando la clatrina como un elemento propagador de la curvatura generada en primera instancia por los dominios BAR y F-BAR de estas proteínas accesorias (Itoh y De Camilli, 2006; 41 Introducción Ungewickell y Hinrichsen, 2007). A su vez este proceso es cooperativo, pues las proteínas generadoras de curvatura en membrana también detectan dicha curvatura uniéndose más eficientemente a membranas previamente curvadas (Antonny, 2006). Puesto que proteínas con distintos dominios BAR pueden inducir curvaturas que originan precursores endocitóticos con distintos diámetros, son unas buenas candidatas para la regulación de la forma de endocitosis que se pone en marcha ante una determinada estimulación (Peter et al., 2004; Itoh et al., 2005; Clayton y Cousin, 2009). La proteína endofilina (Sparks et al., 1996; Micheva et al., 1997b) tiene un papel muy relevante en la inducción de curvatura, así como en la posterior sincronización de los eventos de fisión y desensamblado de la malla de clatrina (Ringstad et al., 2001) por medio de sus interacciones con dinamina y sinaptojanina (Micheva et al., 1997a; Ringstad et al., 2001; Dickman et al., 2005; Ferguson et al., 2009). Otra proteína con dominios BAR es la amfifisina (Lichte et al., 1992; David et al., 1996; Di Paolo et al., 2002) que también participa en el reciclamiento por inducir curvatura, si bien es cierto, que los ratones carentes de esta proteína, son capaces de reciclar vesículas sinápticas, aunque más lentamente (Di Paolo et al., 2002; Pant et al., 2009). La sindapina (Qualmann et al., 1999; Simpson et al., 1999) es una proteína accesoria con una peculiaridad, posee un dominio F-BAR, distinto al dominio canónico, N-BAR, que induce una curvatura más abierta de las membranas (Peter et al., 2004; Shimada et al., 2007). Por este motivo se ha relacionado esta proteína con la endocitosis masiva y será discutida en dicho apartado (Clayton y Cousin, 2009). De forma paralela a la compleción del proceso de recubrimiento de la vesícula, se recluta en el tallo de la vesícula naciente, la GTPasa dinamina, principalmente por su interacción con endofilina (Ringstad et al., 2001). La dinamina forma oligómeros en espiral en los cuellos de las vesículas y promueve la fisión final del intermediario endocitótico de la membrana 42 Introducción plasmática. Existen tres isoformas de dinamina, de las cuales la isoforma 1 y 3, son relevantes para el reciclamiento sináptico (Cao et al., 1998; Ferguson et al., 2007). La función de la dinamina queda puesta de manifiesto al analizar los defectos ultraestructurales de las sinapsis de animales carentes de esta enzima, cuyos intermediarios endocitóticos quedan bloqueados en el paso previo a la fisión de la vesículas (Koenig y Ikeda, 1989; Ferguson et al., 2007; Raimondi et al., 2011), o tras el uso de antagonistas farmacológicos tales como el Dynasore, inhibidor de la actividad GTPasa de la enzima (Macia et al., 2006; Newton et al., 2006). La actividad GTPasa de la dinamina es dependiente de dimerización del modulo donde reside dicha actividad, dado que la dinamina se ensambla formando anillos alrededor del cuello de las vesículas nacientes; está dimerización de los dominios GTPasa solo se produce entre anillos paralelos. Finalmente, la hidrólisis de GTP aporta la fuerza contráctil necesaria para la escisión de la vesícula de la membrana plasmática (Gasper et al., 2009; Chappie et al., 2010; Chappie et al., 2011; Ford et al., 2011). El reclutamiento de dinamina a membrana ocurre únicamente en los pasos finales del proceso de invaginación (Merrifield et al., 2002) y parece dependiente de la interacción de su dominio PH (del inglés Pleckstrin Homology) con membranas enriquecidas en PIP(4,5)2, así como de las interaciones de su dominio C-terminal, rico en prolinas, con otros factores endocitóticos (Okamoto et al., 1997; Shupliakov et al., 1997; Lee et al., 1999; Szaszak et al., 2002; Anggono y Robinson, 2007). Es importante destacar que las proteínas con dominios BAR encargadas de reclutar a la dinamina, como la endofilina, suelen interaccionar también con la fosfatasa sinaptojanina, lo que coordina el paso de fisión con el desensamblaje de la malla de clatrina (Micheva et al., 1997b; Schuske et al., 2003; Itoh y De Camilli, 2006). La sinaptojanina promueve la hidrólisis del PIP(4,5)2 presente en la membrana vesicular, lo que parece limitar los sitios de unión de los adaptadores de 43 Introducción clatrina (Cremona et al., 1999; Hayashi et al., 2008). Paralelamente, la acción de la ATPasa Hsc70 y su cofactor auxilina (Guan et al., 2010; Xing et al., 2010) promueve el desensamblaje completo de la malla de clatrina, funcionando de manera sinérgica y haciendo del desensamblaje una reacción termodinámicamente catastrófica, lo que a su vez impide un re-ensamblaje espontaneo (Saheki y De Camilli, 2012). La fina regulación que requiere el proceso de endocitosis se da gracias a un ciclo de fosfoinosítidos que es paralelo al proceso endocitótico, en el cual sólo las membranas vesiculares en contacto con la membrana plasmática van a tener una elevada concentración de PIP(4,5)2 (Di Paolo y De Camilli, 2006). La Fosfatidil Inositol Fosfato quinasade tipo 1γ (PIPK1 γ) es la enzima sináptica responsable de la síntesis de PIP2 (Wenk et al., 2001) e interacciona con la proteína AP-2 (Krauss et al., 2006). Esta interacción es responsable del reclutamiento de la quinasa a los centros de nucleación de la malla de clatrina. Finalizado el proceso de fisión, la fosfatasa sinaptojanina es reclutada a las membranas gracias a sus interacciones con endofilina (Ringstad et al., 2001) donde disminuye los niveles de PI(4,5)P2 promoviendo la desaparición de sitios de unión para los adaptadores de clatrina, y la aparición de sitios de unión para auxilina (Guan et al., 2010). Una vez desensamblada la cubierta de clatrina se discute si la vesícula va a experimentar un paso de fusión con un endosoma terminal (Wucherpfennig et al., 2003; Rizzoli et al., 2006), o bien si elude esta estación de relevo (Saheki y De Camilli, 2012). 44 Introducción 2.2.4.2-Endocitosis masiva La endocitosis masiva, término que proviene del inglés Bulk endocytosis, hace referencia a aquellos modos de recuperación de membrana que se ponen en marcha tras estimulaciones de alta frecuencia, donde un gran número de vesículas se fusionan con la membrana plasmática, generando intermediarios endocitóticos de gran diámetro (Heuser y Reese, 1973; Miller y Heuser, 1984; Shupliakov et al., 1997; Harata et al., 2001; Paillart et al., 2003; Clayton et al., 2007; Perez Bay et al., 2007; Wu y Wu, 2007; Clayton et al., 2008; Wu et al., 2009; Clayton et al., 2010; Bartolome-Martin et al., 2012; Wenzel et al., 2012). La función prioritaria de este tipo de endocitosis no es la redisponibilidad de vesículas inmediata, sino la de prevenir un incremento de superficie de membrana deletéreo para el terminal presináptico (Clayton y Cousin, 2009). Los modelos empleados para explicar este tipo de endocitosis asumen que la endocitosis mediada por clatrina tienen una tasa de saturación o capacidad de carga (Sankaranarayanan y Ryan, 2000); una vez rebasado ese umbral, se dispararían los mecanismos que ponen en marcha la endocitosis masiva (Clayton y Cousin, 2009). El destino final de los endosomas que se generan a partir de este tipo de endocitosis parece ser su futura gemación para rendir nuevas vesículas (Teng et al., 2007; Clayton et al., 2008; Clayton et al., 2009), si bien este es un tema controvertido, pues en algunos casos se ha descrito que los endosomas se acumulan sin rendir nuevas vesículas (Perez Bay et al., 2007; Bartolome-Martin et al., 2012) y existen discrepancias en la bibliografía acerca de los tiempos de regeneración de vesículas (Clayton et al., 2008; Bartolome- Martin et al., 2012; Cheung y Cousin, 2013). La gemación de nuevas vesículas desde estos endosomas parece guardar relación con los adaptadores de clatrina AP-1 y AP-3 (Cheung y Cousin, 2012) pero parece ser un mecanismo independiente de dinamina (Ferguson et al., 2007; Saheki y De Camilli, 2012). Se ha propuesto que la endocitosis 45 Introducción masiva pueda ser una reminiscencia de mecanismos endocitóticos que tienen lugar durante la guía axonal, pues aparece asociado a las vastas remodelaciones de membrana que tienen lugar en el cono axónico (Bonanomi et al., 2008). La terminación de este tipo de endocitosis es otro punto controvertido; mientras algunos autores sostienen que la endocitosis no continúa al finalizar la estimulación (Clayton et al., 2008), también existen evidencias que muestran que los endosomas formados durante este tipo de endocitosis, permanecen unidos con el espacio extracelular después de la estimulación (Ferguson et al., 2007; Bartolome-Martin et al., 2012; Cheung y Cousin, 2013). El mecanismo molecular por el que se pone en marcha este tipo de endocitosis es solo parcialmente conocido, pero la regulación por calcio y por la fosfatasa dependiente de calmodulina, calcineurina (Proteína Fosfatasa 2 B) parece ser de crucial importancia (Cousin y Robinson, 2001; Wu et al., 2009), si bien es cierto que los efectos del calcio en la puesta en marcha de este tipo de endocitosis son difíciles de evaluar por ser el calcio el inductor de todos los tipos de endocitosis en un terminal presináptico (Marks y McMahon, 1998; Wu et al., 2009). En cualquier caso se ha demostrado que un ciclo de desfosoforilaciones/refosforilaciones de la proteína dinamina acompaña a los fenómenos de endocitosis masiva (Tan et al., 2003; Clayton et al., 2009; Clayton et al., 2010) y en este caso, la defosforilación parece mediada por la fosfatasa calcineurina actuando esta en ese caso como sensor de la estimulación prolongada (Clayton y Cousin, 2009). Además, la calcineurina parece estar implicada también en el proceso de gemación de nuevas vesículas desde los endosomas (Cheung y Cousin, 2013). A pesar de que la mayoría de eventos moleculares que han sido caracterizados en torno a los fenómenos de endocitosis masiva integran a la dinamina, esta enzima parece prescindible para la formación de estructuras endosomales tras la estimulación, pues se ha observado su formación en ausencia de dinamina 1, la principal isoforma neuronal 46 Introducción (Ferguson et al., 2007; Hayashi et al., 2008) y durante la inhibición farmacológica de su actividad GTPasa (Bartolome-Martin et al., 2012). Sin embargo, la interacción dependiente de fosforilación con la proteína Sindapina, que contiene dominios F-BAR, parece determinante a la hora de iniciar estos procesos (Anggono y Robinson, 2007; Clayton y Cousin, 2009), lo que parece conferir a la dinamina una función más posicional que catalítica en la endocitosis masiva. La dinamina sufre un ciclo de fosforilación/desfosforilación en sus Serina 774 y 778, durante los fenómenos de endocitosis masiva (Tan et al., 2003; Clayton et al., 2009; Clayton et al.). En este ciclo, la fosfatasa calcineurina parece promover, de forma dependiente de la entrada de calcio en el terminal, la desfosforilación de las Serinas 774 y 778 de la dinamina 1 (Clayton y Cousin, 2009; Clayton et al., 2010), lo que, a su vez, llevaría a su interacción con sindapina 1 y desencadenaría la recuperación masiva de la membrana presináptica. Tras la estimulación, la dinamina se refosforila en dos pasos, el primero de ellos mediado por Cdk5 en la S778 (Anggono y Robinson, 2007; Clayton et al., 2010) y el siguiente, estrictamente dependiente del anterior, sería llevado a cabo por Gsk3 en la S774 (Clayton et al., 2010). La interacción con la proteína intersectina parece ser importante en el modo de endocitosis masiva. De hecho, cuando se impide la interacción de la intersectina con la dinamina se ponen en marcha preferentemente mecanismos de endocitosis masiva durante la estimulación neuronal (Winther et al., 2013). Es conocido que las membranas de los endosomas que participan en el reciclamiento masiva son algo más hidrofóbicas que las membranas de las vesículas que rinde la endocitosis mediada por clatrina (Clayton et al., 2008; Bartolome-Martin et al., 2012), lo que podría guardar relación con diferencias en la composición lipídica de las membranas de los distintos tipos de orgánulos o en la cantidad relativa de proteínas contenidas en dichas membranas. 47 Introducción 2.3-Los "pools" de vesículas sinápticas En un terminal presináptico existen distintos tipos de vesículas, en función de su susceptibilidad a experimentar un proceso de fusión ante la llegada de un estímulo al terminal. Las vesículas con distintas probabilidades de ser liberadas se agrupan en lo que se denomina "pools" de vesículas sinápticas (Rizzoli y Betz, 2005). La idea de la existencia de estos grupos de vesículas se sugirió al observar que en ganglios simpáticos de gato existían dos componentes de liberación de neurotransmisor: uno listo para ser liberado ante la llegada estimulación y otro algo más reticente a la liberación (Birks y Macintosh, 1957; Birks y Fitch, 1974). Se recomienda hacer una clasificación en tres grupos: las vesículas cuya liberación es inmediata o RRP (del inglés Readily Releasable Pool), las vesículas que se movilizan durante la estimulación, contribuyendo a la exocitosis y por tanto a la liberación de neurotransmisor, que constituyen el "pool" de reciclamiento y por último aquellas vesículas que no se movilizan y por tanto no contribuyen a la liberación de neurotransmisor, que conforman el "pool" de reserva (Alabi y Tsien, 2012). Las vesículas del RRP, parecen estar amarradas a la zona activa y molecularmente preparadas para su liberación (Rosenmund y Stevens, 1996; Schneggenburger et al., 1999; Richards et al., 2003). La liberación de estás vesículas se puede inducir con estimulaciones mínimas o mediante perfusión de una solución hipertónica de sacarosa (Rosenmund y Stevens, 1996), lo que es coherente con el modelo de fusión vesicular en el que el complejo SNARE no está pre-ensamblado (Jahn y Fasshauer, 2012). El pool de reciclamiento está constituido por las vesículas que mantienen la neurotransmisión durante un tren de potenciales de acción (Richards et al., 2003) o aquellas vesículas que experimentan procesos de exo/endocitosis en una ventana temporal relativamente corta, en sinapsis de animales vivos (Denker et al., 2011a). Por regla general este pool no supera el 15 % de las vesículas contenidas en un 48 Introducción determinado compartimento presináptico. Finalmente el pool de reserva está formado por vesículas que no participan en la neurotransmisión durante estimulaciones de baja frecuencia y cuya movilización sólo es conseguida al emplear altas frecuencias de estimulación (Kuromi y Kidokoro, 2000; Rizzoli y Betz, 2005), este parece estar constituido por un 80-90 % de las vesículas de un terminal sináptico, si bien es cierto que mediante experimentos en los que se puede determinar una medida acumulada de la exocitosis, se ha demostrado que posiblemente estas vesículas constituyan un 50-60% del total de vesículas (Kim y Ryan, 2010). Cabe destacar que el porcentaje aproximado de vesículas pertenecientes a uno u otro de los citados pools varía en función de la aproximación metodológica empleada para su determinación; mientras que por medio de técnicas de microscopía electrónica se ha determinado que el porcentaje de vesículas del "pool" de reciclamiento no supera el 20% en la mayoría de preparaciones (Kuromi y Kidokoro, 2000; Richards et al., 2003; Rizzoli y Betz, 2005; Alabi y Tsien, 2012), mediante técnicas de imagen con pHluorinas en rodajas de cerebro (Rose et al., 2013) y medidas de capacitancia (Xue et al., 2013), se ha descrito recientemente que la práctica totalidad de vesículas de un terminal presináptico experimentan procesos de fusión con la membrana plasmática en condiciones fisiológicas y participan, por tanto, en la neurotransmisión. Probablemente el porcentaje relativo de cada uno de estos "pools" sufra modificaciones durante el desarrollo (Rose et al., 2013). Se discute si son determinantes moleculares intrínsecos a las vesículas sinápticas (Hua et al., 2011; Ramirez y Kavalali, 2012) o por el contrario, características posicionales (Holderith et al., 2012; Park et al., 2012) las que definen que una vesícula pertenezca a uno u otro de los mencionados pools. Se ha descrito que las vesículas del pool de reserva pudiesen funcionar como un reservorio de proteínas sinápticas (Denker et al., 2011b). En cualquier caso la tasa de recambio entre estos grupos de vesículas, así como la 49 Introducción regulación de la incorporación en uno u otro de los pools constituye una línea de investigación importante en la fisiología sináptica. Se ha encontrado que las actividades de fosforilación/desfosforilación llevadas a cabo por Cdk5/Calcineurina, sobre un sustrato aún por identificar, podrían regular la dinámica de estos pools, siendo la actividad de Cdk5 favorable a la incorporación de vesículas en el pool de reserva y mediando la calcineurina las acciones opuestas (Kumashiro et al., 2005; Kim y Ryan, 2010; Mitra et al., 2012). En los últimos años se ha obsevado que algunas vesículas pueden compartirse entre terminales presinápticos, lo que ha dado pie a la aparición de un nuevo concepto, el "superpool" de vesículas. Los mecanismos que rigen la dinámica de estas vesículas son solo parcialmente conocidos (Darcy et al., 2006; Ratnayaka et al., 2011; Orenbuch et al., 2012) si bien son un atractivo correlato celular al concepto de redistribución de pesos sinápticos. Figura 10- a) Esquema ilustrativo de la distribución de los distintos pools de vesículas sinápticas en un terminal de SNC de rata. b) Proporciones de los distintos pools de vesículas sinápticas, las flechas rojas aluden a la tasa de intercambio entre los distintos pools. Adaptado de (Rizzoli y Betz, 2005) 50 Introducción 3- El sistema endocannabinoide Los endocannabinoides son mensajeros retrógrados dependientes de actividad (Kreitzer y Regehr, 2001; Ohno-Shosaku et al., 2001; Wilson y Nicoll, 2001) ampliamente implicados en el control de la neurotransmisión en el SNC de mamíferos (Chevaleyre et al., 2007; Kano et al., 2009). Los elementos del denominado sistema endocannabinoide comprenden: las moléculas mensajeras 2-Araquidonil Glicerol (2-AG) y Araquidonil Etanol Amida o anandamida (AEA); las enzimas de síntesis, la Fosfolipasa D (PLD) y la DiAcilGlicerol Lipasa α (DGLα); las enzimas de degradación MonoacilGlicerol Lipasa (MGL) y la Amido Hidrolasa de Ácidos Grasos (FAAH del inglés Fatty Acid Amido Hidrolase) y los receptores activados por dichos endocannabinoides, CB1R y CB2R (Kano et al., 2009). 3.1-Síntesis de endocannabinoides La anandamida fue aislada por primera vez del encéfalo porcino en 1992 (Devane et al., 1992) y su producción, dependiente de calcio extracelular y actividad en neuronas, se descubrió a los pocos años (Di Marzo et al., 1994). Las dos enzimas que participan secuencialmente en la síntesis de anandamida son la N-Acil transferasa y la PLD, ambas son sensibles a calcio (Kano et al., 2009), lo que promueve la síntesis de este mensajero tras la entrada de calcio en la neurona. El ratón carente de la enzima PLD no muestra alteraciones comportamentales evidentes, y se piensa que en estos animales la anandamida podría sintetizarse por una ruta alternativa (Leung et al., 2006; Okamoto et al., 2007). Este hecho, junto con las bajas concentraciones de este metabolito en el encéfalo, hace pensar que este endocannabinoide pueda ser menos relevante que el 2- AG en la modulación de la neurotransmisión mediada por endocannabinoides (Kano et 51 Introducción al., 2009). El 2-AG fue aislado por primera vez del aparato digestivo canino (Mechoulam et al., 1995) y posteriormente del encéfalo de rata (Sugiura et al., 1995). En su síntesis parecen intervenir secuencialmente dos enzimas, la fosfolipasa C de tipo β (PLCβ) (Maejima et al., 2005) y la DGLα (Yoshida et al., 2006; Gao et al., 2010; Tanimura et al., 2010). La síntesis de 2-AG puede inducirse en respuesta a estimulaciones que provoquen un aumento transitorio de calcio, presumiblemente por la activación calcio dependiente de las enzimas de síntesis (Bisogno et al., 1997; Stella et al., 1997; Stella y Piomelli, 2001; Straiker y Mackie, 2005), en respuesta a la estimulación de receptores metabotrópicos de glutamato de tipo I (Maejima et al., 2001; Varma et al., 2001; Ohno-Shosaku et al., 2002; Galante y Diana, 2004) o de forma sinérgica en respuesta a la coincidencia entre ambos tipos de estímulo (Ohno-Shosaku et al., 2002; Brenowitz y Regehr, 2003; Brown et al., 2003; Hashimotodani et al., 2005; Maejima et al., 2005). La síntesis de endocannabinoides, por tanto, podría tener la función de detector de coincidencias cuando se pone en marcha por el último mecanismo de los previamente mencionados; una de las señales induciría la entrada de calcio y la otra la activación de los receptores metabotrópicos de glutamato (y por tanto de la FosfolipasaC de tipo β). El verdadero detector de coincidencias sería la PLC-β por exhibir calcio dependencia y susceptibilidad a la activación por la vía de señalización de mGluR1 (Hashimotodani et al., 2005; Hashimotodani et al., 2007) 3.2-Receptores de cannabinoides Se han caracterizado dos receptores de cannabinoides, el receptor CB1 y el receptor CB2. Las principales acciones sinápticas de los endocannabinoides se atribuyen al receptor CB1 por ser este el más expresado en el sistema nervioso central (Herkenham 52 Introducción et al., 1990; Herkenham et al., 1991; Kawamura et al., 2006). No obstante, se ha demostrado la existencia del receptor CB2 (Munro et al., 1993), así como su relevancia fisiológica, en el sistema nervioso central de mamíferos (Skaper et al., 1996; Van Sickle et al., 2005; Ando et al., 2012; den Boon et al., 2012) y en cultivos neuronales (Trazzi et al., 2010). Sin embargo, y debido a que en este estudio se presta especial atención a procesos inhibitorios mediados por el receptor CB1, se obviará al receptor CB2 en esta introducción. El receptor CB1 se fue caracterizado en 1990 (Gerard et al., 1990; Matsuda et al., 1990) y ese mismo año se demostró su abundante expresión en sistema nervioso central (Herkenham et al., 1990). Su localización en terminales presinápticos (Nyiri et al., 2005; Katona et al., 2006; Kawamura et al., 2006; Puente et al., 2010) hace pensar que ejerce funciones importantes en el control de la liberación de neurotransmisor (Freund et al., 2003; Castillo et al., 2012). El receptor CB1 es un receptor acoplado a proteínas G heterotriméricas con una longitud de 473 aminoácidos (Herkenham et al., 1990) que, a diferencia de otros receptores de 7 hélices transmembrana y debido a la naturaleza hidrofóbica del ligando, alberga el sitio de unión de los cannabinoides en la región transmembrana (Song y Bonner, 1996). Los cannabinoides acceden al sitio de unión a ligando gracias a movimientos de difusión lateral en la membrana (Makriyannis et al., 2005; Tian et al., 2005). Se ha propuesto que en vivo, el receptor CB1 nativo podría presentarse formando homodímeros (Wager- Miller et al., 2002) como otros GPCRs (del inglés G-Protein Coupled Receptors) (Maggio et al., 1993), y en este caso la homodimerización del receptor parece dependiente de su interacción con el agonista (Mackie, 2005). Otra posibilidad es la heterodimerización del receptor CB1 con otros receptores metabotrópicos (Mackie, 2005), como la interacción descrita con el receptor D2 de dopamina. La heterodimerización en este caso modifica las características de señalización del receptor 53 Introducción monomérico (Kearn et al., 2005). La activación del receptor CB1 media efectos inhibitorios sobre la liberación de neurotransmisor (Shen et al., 1996; Levenes et al., 1998; Schlicker y Kathmann, 2001; Godino et al., 2005) dependientes de proteínas G (Pitler y Alger, 1994; Sim et al., 1996; Pertwee, 1997) gracias a dos mecanismos principalmente: I) la alteración de la conductancia iónica de las membranas bien por inhibición directa de canales de calcio voltaje dependientes por la acción del dímero βγ (Twitchell et al., 1997; Huang et al., 2001; Kreitzer y Regehr, 2001; Wilson y Nicoll, 2001; Brown et al., 2004), bien por activación de canales rectificadores de potasio (Mackie et al., 1995; Daniel y Crepel, 2001; Daniel et al., 2004; Guo y Ikeda, 2004), lo que disminuye la excitabilidad del compartimento presináptico (Chevaleyre et al., 2006) y II) la disminución de los niveles de cAMP dependiente de la acción de la subunidad αi de proteínas G sobre la Adenilato Ciclasa (AC) (Howlett et al., 1986; Vogel et al., 1993; Childers y Deadwyler, 1996; Chevaleyre et al., 2007) lo que conlleva una disminución de los niveles de actividad de las enzimas reguladas por cAMP. Clásicamente se ha considerado a la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (PKA) como la mediadora de los efectos de los endocannabinoides (Chevaleyre et al., 2007; Mato et al., 2008; Yasuda et al., 2008; Heifets y Castillo, 2009) si bien es cierto que otras proteínas reguladas por cAMP podrían ser las responsables de dichos efectos (Seino y Shibasaki, 2005; Bos, 2006; Gekel y Neher, 2008; Branham et al., 2009; Tsetsenis et al., 2011; Yang et al., 2012). Se ha postulado que la alteración de la conductancia iónica de la membrana presináptica está relacionada con la plasticidad a corto plazo, mientras que la disminución de los niveles de cAMP y los consecuentes cambios en la maquinaria de liberación se asocian a mecanismos de depresión sináptica a largo plazo (Schoch et al., 2002; Heifets y Castillo, 2009; Castillo et al., 2012). Por otra parte, recientemente se ha propuesto la presencia del receptor CB1 y su capacidad 54 Introducción de señalización en orgánulos intracelulares (Brailoiu et al., 2011). En concreto el receptor CB1 está presente en mitocondrias, donde parece regular el metabolismo energético neuronal, pudiendo esto contribuir a sus funciones en plasticidad sináptica (Benard et al., 2012). 3.3-Degradación Los cannabinoides son degradados en dos pasos secuenciales, un primer paso de hidrólisis y un segundo paso de oxidación (Vandevoorde y Lambert, 2007). Las enzimas que catalizan estas reacciones son distintas en función del cannabinoide a degradar. La enzima responsable de la hidrólisis de la anandamida es la FAAH (Cravatt et al., 1996; Cravatt et al., 2001) y la enzima responsable de la hidrólisis del 2-AG es la MGL (Tornqvist y Belfrage, 1976; Karlsson et al., 1997; Dinh et al., 2002; Dinh et al., 2004; Blankman et al., 2007). Posteriormente el ácido araquidónico que se genera en estas reacciones es oxidado por las enzimas Ciclo OXigenasa (COX) y Lipo OXigenasa (LOX) entrando en las rutas de síntesis de prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos. El 2-AG puede ser oxidado directamente por determinadas isoformas de COX y tanto el 2-AG como la anandamida son susceptibles a la oxidación por LOX's (Vandevoorde y Lambert, 2007; Kano et al., 2009). Mientras que la distribución de la enzima FAAH es casi exclusivamente postsináptica, la de la MGL es presináptica (Gulyas et al., 2004), este hecho podría guardar relación con la posible función de la anandamida a modo de señalizador postsináptico, vía la activación de receptores TRPV1 (Grueter et al., 2010; Puente et al., 2011). 55 Introducción 3.4-Plasticidad mediada por cannabinoides 3.4.1-Plasticidad a corto plazo: DSI y DSE La plasticidad a corto plazo mediada por endocannabinoides de forma retrograda se puso de manifiesto por primera vez en sinapsis inhibitorias, con la demostración de la Supresión de la Inhibición inducida por Despolarización (DSI) (Ohno-Shosaku et al., 2001; Wilson y Nicoll, 2001; Yoshida et al., 2002) y posteriormente en la Supresión de la Excitación inducida por Despolarización (DSE) (Kreitzer y Regehr, 2001), aunque probablemente el mecanismo de DSI se caracterizó unos diez años antes, si bien no se identificó al mensajero responsable de este fenómeno (Llano et al., 1991; Pitler y Alger, 1992; 1994). Ambas formas de plasticidad se manifiestan en una supresión transitoria de la liberación de neurotransmisor por parte de la neurona presináptica, de modo que si esta neurona es glutamatérgica el fenómeno desencadenado será la DSE, mientras que si es GABAérgica se le denominará DSI (Kano et al., 2009; Castillo et al., 2012). Tanto la DSI como la DSE requieren un pulso despolarizante de la membrana postsináptica (generalmente se despolariza la membrana postsináptica hasta 0 mV), que promueva la entrada de calcio, que pondrá en marcha la producción del mensajero retrógrado por activación de sus enzimas sintéticas, que son dependientes de calcio (Brenowitz y Regehr, 2003; Maejima et al., 2005; Brenowitz et al., 2006). La síntesis de endocannabinoides también puede ser inducida por activación de receptores metabotrópicos acoplados a proteínas Gq/11 y la subsiguiente estimulación de la PLCβ. Por norma general este mecanismo se asocia a la activación de receptores metabotrópicos de glutamato de tipo 1 (Maejima et al., 2001; Varma et al., 2001; Ohno- Shosaku et al., 2002; Kushmerick et al., 2004) aunque la estimulación de otros receptores metabotrópicos, como por ejemplo los receptores M1 y M3 muscarínicos, también parece desencadenar la producción de estos mensajeros por la activación de su 56 Introducción ruta de síntesis (Kim et al., 2002; Fukudome et al., 2004). Investigaciones recientes sugieren, que tanto la síntesis dependiente de la entrada de calcio como la síntesis dependiente de la activación de receptores metabotrópicos podrían funcionar de forma conjunta, ya que se ha observado un sinergismo entre ambas rutas, manifestado en una facilitación de liberación del mensajero retrogrado (Varma et al., 2001; Kim et al., 2002; Ohno-Shosaku et al., 2002). En este contexto la síntesis de endocannabinoides funcionaría detectando coincidencias, bien temporales (en el caso de recibir dos estímulos de la misma naturaleza neuroquímica en un periodo breve de tiempo) (Brenowitz y Regehr, 2003; Maejima et al., 2005), o bien neuroquímicas, en el caso de recibirse distintas aferencias sobre una misma neurona postsináptica (Kim et al., 2002). La proteína que funcionaría como el verdadero detector de coincidencias en este caso sería la PLCβ ya que exhibe calcio dependencia y es susceptible de activación por proteínas Gq/11 (Brenowitz y Regehr, 2003; Hashimotodani et al., 2005; Maejima et al., 2005). Además, el ratón carente de la enzima PLCβ no muestra sinergismo en la síntesis de endocannabinoides ante la combinación de ambos tipos de estimulación (Maejima et al., 2005). Una vez generado, el diacilglicerol se metaboliza a 2-AG por acción de la DGLα (Szabo et al., 2006; Gao et al., 2010). Se ha sugerido que este mecanismo sinérgico pueda subyacer también a la síntesis de endocannabinoides requerida para los procesos de LTD (Safo y Regehr, 2005). De hecho, la LTD en las neuronas de Purkinje se puede inducir por la activación concomitante de las fibras paralelas y las trepadoras (Ito, 2001), lo que parece indicar que la liberación de cannabinoides que da origen a estos fenómenos es atribuible a la sinergia entre ambas rutas de síntesis (Hashimotodani et al., 2007). Durante los procesos de DSI y DSE la activación de los receptores CB1 da lugar principalmente a una disminución de la entrada de calcio en el terminal presináptico por inhibición de los canales de calcio dependientes de voltaje (Lenz et al., 57 Introducción 1998; Kreitzer y Regehr, 2001; Ohno-Shosaku et al., 2001; Wilson y Nicoll, 2001; Varma et al., 2002; Brown et al., 2003; Brown et al., 2004; Godino et al., 2005; Safo et al., 2006) 3.4.2-Plasticidad a largo plazo, LTD La primera vez que se demostró la implicación del sistema endocannabinoide en la LTD presináptica fue en el año 2002 en el estriado dorsal (Gerdeman et al., 2002), desde entonces se ha demostrado su implicación en procesos de depresión a largo plazo en numerosas regiones encefálicas tales como la amígdala (Marsicano et al., 2002), el núcleo accumbens (Robbe et al., 2002), el hipocampo (Chevaleyre y Castillo, 2003; Yasuda et al., 2008), distintas regiones de corteza (Sjostrom et al., 2003; 2004; Huang et al., 2008), el cerebelo (Safo y Regehr, 2005; Soler-Llavina y Sabatini, 2006; Qiu y Knopfel, 2009; Carey et al., 2011), el área tegmental ventral (Pan et al., 2008) o los colículos superiores (Henneberger et al., 2007). A diferencia de en la DSI o en la DSE, el principal efecto de los endocannabinoides en la inducción de la LTD es una disminución de los niveles de cAMP del terminal presináptico (Howlett et al., 1986; Childers y Deadwyler, 1996; Chevaleyre y Castillo, 2003; Chevaleyre et al., 2006; Chevaleyre et al., 2007; Mato et al., 2008; Heifets y Castillo, 2009), aunque también se ha propuesto a la calcineurina como mediadora de la LTD inhibitoria inducida por endocannabinoides en ciertas interneuronas hipocampales (Heifets et al., 2008). Llegados a este punto es importante mencionar que mientras los procesos de plasticidad a corto plazo son totalmente dependientes del sistema endoannabinoide, durante los procesos de LTD, sólo la fase de inducción es dependiente del sistema endocannabinoide (Safo y Regehr, 2005; Singla et al., 2007; Heifets et al., 2008; 58 Introducción Heifets y Castillo, 2009; Castillo et al., 2012). La aplicación de un agonista cannabinoide por sí sola no es suficiente para provocar una depresión sostenida de la liberación de neurotransmisor (Sjostrom et al., 2003; Ronesi et al., 2004; Safo y Regehr, 2005; Bender et al., 2006) y parece ser que se requiere la activación de la neurona aferente, de forma concomitante a la exposición al endocannabinoide, para que este pueda inducir una LTD sostenida (Adermark y Lovinger, 2007; Singla et al., 2007; Heifets et al., 2008). El significado fisiológico de esta forma de LTD podría ser el de conferir especificidad a aquellas sinapsis que han de experimentar el proceso de depresión (Singla et al., 2007; Heifets et al., 2008) pero, a día de hoy, el mecanismo molecular subyacente a este fenómeno no ha sido esclarecido a día de hoy (Castillo et al., 2012). Los tiempos de activación del receptor CB1 requeridos para la inducción de la LTD son mucho mayores que los requeridos para la inducción de la DSI o la DSE (Chevaleyre y Castillo, 2003; Ronesi et al., 2004), lo que explica parcialmente el requerimiento de una actividad presináptica sostenida para el mantenimiento de la LTD (Singla et al., 2007). Se ha propuesto que la activación de receptores NMDA presinápticos podría ser la responsable del mantenimiento de la LTD (Sjostrom et al., 2003; Bender et al., 2006; Nevian y Sakmann, 2006; Corlew et al., 2007; Rodriguez- Moreno y Paulsen, 2008). Esta activación promovería una entrada de calcio en el terminal presináptico, hecho que contrasta con las formas de plasticidad a corto plazo en las que el principal efecto de los endocannabinoides es una inhibición transitoria de los canales dependientes de voltaje (Kreitzer y Regehr, 2001) y con formas de LTD que se manifiestan en una inhibición sostenida de los canales de calcio dependientes de voltaje (Pelkey et al., 2006; Mato et al., 2008; Qiu y Knopfel, 2009). El calcio entrante por los receptores NMDA podría ser responsable de la activación de la fosfatasa calcineurina, requerida para el mantenimiento de la LTD de ciertas interneuronas (Heifets et al., 59 Introducción 2008) o de la síntesis de óxido nítrico (NO) por activación de la oxido nítrico sintasa (NOS) presináptica, que viajaría de forma ortodrómica al compartimento postsináptico, promoviendo allí el mantenimiento de la LTD (Ito, 2001; Safo y Regehr, 2005). El requerimiento del óxido nítrico para el mantenimiento de la depresión a largo plazo es especialmente relevante en la LTD cerebelar de la sinapsis establecida entre la fibra paralela y la neurona de Purkinje (Safo y Regehr, 2005) que es dependiente de la activación del receptor CB1, al menos en un estadio inicial (Safo y Regehr, 2005; Qiu y Knopfel, 2009; Carey et al., 2011). Curiosamente se ha detectado la producción y liberación de óxido nítrico por parte de las fibras paralelas tras su estimulación, en la capa plexiforme de rodajas cerebelares (Shibuki y Kimura, 1997), si bien es cierto que en un estudio se constata la independencia del óxido nítrico en el mantenimiento de la LTD cerebelar inducida por endocannabinoides (Qiu y Knopfel, 2009). La aplicación de un antagonista del receptor CB1 una vez inducida la LTD no permite revertir esta inhibición (Chevaleyre y Castillo, 2003; Sjostrom et al., 2003; Ronesi et al., 2004), lo que hace pensar que una vez puesto en marcha el mecanismo efector no es necesaria la activación persistente del receptor (Heifets y Castillo, 2009). Debido a la dependencia de la inhibición de la adenilato ciclasa, los mecanismos moleculares que dan cuenta de la LTD han de estar relacionados con la disminución de los niveles de cAMP (Chevaleyre et al., 2007; Mato et al., 2008; Yasuda et al., 2008) y se postula que tengan efectos directos sobre proteínas de la maquinaria de liberación (Azad et al., 2004; Heifets y Castillo, 2009; Tsetsenis et al., 2011; Castillo et al., 2012). Tanto la proteína Rab3 como la proteína RIM son imprescindibles para los procesos de LTP presináptica dependientes de un incremento de los niveles de cAMP (Castillo et al., 1997; Schoch et al., 2002; Huang et al., 2005) y se ha observado que los procesos de LTD están facilitados en los ratones carentes de la proteína RIM (Schoch et al., 2002). También se 60 Introducción ha demostrado que los procesos de LTD mediados por endocannabinoides son dependientes de la proteína RIM1α y de la disminución de los niveles de cAMP (Chevaleyre et al., 2007). En este contexto se había identificado a la fosforilación PKA- dependiente de la proteína RIM en su Serina 413 como la responsable de la potenciación a largo plazo (Lonart et al., 2003; Kaeser y Sudhof, 2005). Sin embargo haciendo uso de un mutante de la proteína RIM1α cuya Serina 413 se sustituye por una alanina (S413A), se ha demostrado recientemente que esta fosforilación es prescindible para los procesos de potenciación a largo plazo (Kaeser et al., 2008), lo que descarta la idea de la fosforilación de la PKA sobre RIM1 como factor crítico en la mediación de procesos de LTP y LTD (Heifets y Castillo, 2009; Sudhof, 2012b). Cabe destacar que la interacción entre Rab3 y RIM parece ser de crucial importancia para los procesos de LTP y LTD (Castillo et al., 1997; Schoch et al., 2002; Tsetsenis et al., 2011) y esta interacción es dependiente de que la proteína Rab3 esté unida a GTP, lo que supone un punto de regulación de esta interacción, ya que el estado de Rab3 (Rab3-GDP o Rab3- GTP) impide o permite, respectivamente, la interacción de Rab3 con RIM1 (Wang et al., 1997; Wang et al., 2000). Aunque se considera la PKA como la mediadora canónica de los efectos del cAMP, existen múltiples dianas susceptibles de ser reguladas por las variaciones en los niveles de cAMP (Kawasaki et al., 1998; Bos, 2003; Rehmann et al., 2003; Seino y Shibasaki, 2005; Bos, 2006; Efetova et al., 2012). Una de estas dianas es la proteína EPAC (del inglés Exchange Protein directly Activated by CAMP) (de Rooij et al., 1998; Kawasaki et al., 1998; de Rooij et al., 2000), un factor intercambiador de nucleótidos de guanina cuya acción canónica es ejercida sobre la proteína Rap1 (Kawasaki et al., 1998). Existen dos isoformas de la proteína Epac codificadas por dos genes distintos rapgef1 y rapgef2, que dan lugar a las proteínas EPAC1 y EPAC2 respectivamente (Kawasaki et al., 1998; Ueno et al., 2001). Ambas contienen cuatro 61 Introducción dominios funcionales: un dominio de unión a cAMP, un dominio DEP (Dishevelled, Egl-10, y Plecstrina) responsable de su localización en membrana, un dominio REM (del inglés, Ras Exchange Motif) y el dominio GEF (del inglés, Guanine nucleotide Exchange Factor) (Kawasaki et al., 1998; Bos, 2003). La expresión de la isoforma EPAC1 es ubicua en el ratón adulto, pero los niveles de expresión son bajos en sistema nervioso central. En cambio los niveles de expresión de la isoforma EPAC2 son altos en distintas regiones del sistema nervioso adulto de ratón adulto (Kawasaki et al., 1998; Ozaki et al., 2000). No sucede lo mismo en el sistema nervioso de rata, donde la expresión de ambas isoformas es elevada en distintas regiones encefálicas (Gekel y Neher, 2008). Se ha demostrado que la activación de las proteínas EPAC potencia la liberación de neurotransmisor en sinapsis hipocampales (Gekel y Neher, 2008) y en sinapsis caliciformes de la vía auditiva (Sakaba y Neher, 2003; Kaneko y Takahashi, 2004), y se ha sugerido que estas acciones de potenciación son independientes de la modulación de canales iónicos y han de estar relacionadas con efectos sobre la maquinaria de liberación (Kaneko y Takahashi, 2004). En animales carentes de ambas isoformas de la proteína EPAC se ha demostrado una disminución de la liberación de neurotransmisor, tanto espontanea como inducida por estimulación, que conlleva una deficiencia de los procesos de LTP y de distintos tipos de aprendizaje, así como de las interacciones sociales de estos animales (Yang et al., 2012). Además se ha demostrado que la señalización inhibitoria mediada por el receptor GABA B, que consiste en una disminución de los niveles de cAMP opera por medio de una disminución de actividad de la proteína EPAC2 (Sakaba y Neher, 2003). Se ha demostrado la existencia de un complejo proteico en el que la proteína EPAC2 interacciona con Rim1 y con Picolo (Ozaki et al., 2000; Kashima et al., 2001; Fujimoto et al., 2002), lo que posibilitaría la interacción de EPAC2 con Rab3, pudiendo modularse de esta manera el estado de 62 Introducción activación de Rab3 (Ozaki et al., 2000; Seino y Shibasaki, 2005). Este hecho se ha demostrado en la reacción acrosómica del espermatozoide, donde la activación de EPAC promueve la exocitosis por inducir la unión de Rab3 a GTP (Branham et al., 2009). El otro vínculo directo existente entre la activación de EPAC y la maquinaria exocitótica es la activación dependiente de EPAC de la fosfolipasa C-ε (PLCε), que promueve la generación de DAG y podría dar lugar al reclutamiento de Munc13-1 a la membrana plasmática (Schmidt et al., 2001). A lo largo del trabajo que aquí se presenta se ha estudiado la posible implicación de la proteína EPAC en algunas formas de depresión sináptica mediada por cannabinoides. Figura 11- Síntesis y mecanismos de acción de los cannabinoides endógenos en DSI/DSE (A) y en LTD (B). Adaptado de (Castillo et al., 2012) 63 Introducción 4-Sinapsis silentes De entre todas las formas conocidas de depresión sináptica, probablemente el silenciamiento constituye la forma más abrupta de todas. Una sinapsis silente se caracteriza por exhibir una ausencia total de exocitosis ante la llegada de un estímulo, a pesar de experimentar una entrada de calcio normal y contener una composición de proteínas similar a la de una sinapsis funcional (Moulder et al., 2004; Moulder et al., 2006; Yao et al., 2006; Chang et al., 2010; Cousin y Evans, 2011; Crawford et al., 2011). Es importante mencionar, que, debido a esta clasificación, una sinapsis silente podría ser confundida con una sinapsis con baja probabilidad de liberación si el estímulo aplicado es demasiado débil (Cousin y Evans, 2011), lo que podría hacer atribuir efectos activadores a cascadas de señalización que únicamente produzcan un incremento en la probabilidad de liberación. Los mecanismos que subyacen al silenciamiento sináptico son solo parcialmente conocidos. Parece ser que un defecto en el proceso de preparación de las vesículas sinápticas es responsable de este efecto (Moulder et al., 2006), defecto que puede ser revertido mediante la aplicación de Forbol 12, 13 diButirato (PDBu) (Chang et al., 2010) y mediante activadores de la ruta del cAMP como la forskolina, activador de la adenilato ciclasa (Chavis et al., 1998; Kohara et al., 2001; Moulder et al., 2008; Cousin y Evans, 2011; Crawford et al., 2012). Un reclutamiento masivo de vesículas hacia el "pool" de reserva podría desencadenar un comportamiento equivalente al de una sinapsis silente, ambos efectos podrían suceder de forma paralela (Kim y Ryan, 2010; Mitra et al., 2012). También se ha descrito una activación rápida de sinapsis previamente silentes asociada a la polimerización de actina (Shen et al., 2006; Yao et al., 2006). El papel fisiológico de las sinapsis silentes podría ser una adaptación a periodos de hiperactividad, hecho que concuerda con la aparición de este tipo de sinapsis tras periodos prolongados de despolarización (Moulder et al., 64 Introducción 2006). Sin embargo, se ha demostrado que la activación de distintos tipos de receptores metabotrópicos puede dar lugar a la aparición de estas sinapsis (Crawford et al., 2011), lo que hace pensar que estas sinapsis puedan tener una relevancia fisiológica más allá de un mero papel neuroprotector (Mitra et al., 2012). Es de particular importancia en este contexto el caso del cerebelo y en concreto la sinapsis entre la fibra paralela y la célula de Purkinje (Porrill y Dean, 2008; Dean et al., 2010); de hecho, se ha demostrado en vivo que la mayoría de sinapsis (hasta un 85%) entre las fibras paralelas y las células de Purkinje son silentes (Isope y Barbour, 2002). En el caso del aprendizaje motor en el cerebelo, parece ser, debido al elevado número de contactos que se establecen entre un fibra paralela y una célula de Purkinje, que la mayoría de la información transmitida por las fibras paralelas es ruido (información fútil). Así, el aprendizaje motor parece consistir en un ajuste a la baja de esta sobrecarga de información, lo que conlleva un ajuste heterogéneo de los pesos sinápticos y en algunos casos lleva a silenciar algunas de estas conexiones (Porrill y Dean, 2008; Dean et al., 2010) de forma concomitante a la potenciación de otras conexiones (Dean et al., 2010). Esta redistribución heterogénea de pesos sinápticos parece tener lugar también en el área CA3 del hipocampo ante la adaptación de la red neuronal a la inactividad (Mitra et al., 2012). Por otro lado, si se atiende a las dianas postsinápticas de las fibras paralelas, estas establecen sinapsis directamente sobre las células de Purkinje, e indirectamente, por medio de interneuronas inhibitorias. Dado que esto tiene efectos opuestos sobre la célula de Purkinje, es concebible que en el momento de potenciarse una interacción directa sobre la célula de Purkinje, se deprima la interacción indirecta por medio de la interneurona inhibitoria, lo que acarrearía una redistribución heterogénea de los distintos pesos sinápticos de una misma fibra paralela (Dean et al., 2010). En el presente trabajo se han estudiado los 65 Introducción mecanismos moleculares que subyacen a la inducción de silenciamiento en una subpoblación de sinapsis tras una activación persistente del receptor CB1. 66 67 II- Objetivos "Cuando emprendas tu viaje a Ítaca, pide que el camino sea largo, lleno de aventuras y experiencias. No temas a los lestrigones, ni a los cíclopes, ni al colérico Poseidón..." C. Kavafis 68   69 Objetivos II-Objetivos A lo largo de este trabajo hemos estudiado, mediante dos paradigmas distintos, aspectos funcionales relacionados con el ciclo vesicular sináptico en neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo. En un primer lugar se analizaron aspectos de la endocitosis sináptica que parecían estar regulados durante la maduración de estas neuronas. Por otro lado hemos estudiado un modelo de plasticidad relacionado con aspectos exocitóticos del ciclo vesicular en el que se disecaron farmacológicamente los mecanismos moleculares subyacentes a la plasticidad mediada por cannabinoides. Los objetivos concretos son los que se plantean a continuación: 1-Endocitosis 1.1- Estudiar la eficacia de reciclamiento de vesículas sinápticas en neuronas granulares de cerebelo en cultivo de forma paralela a la maduración de dichas neuronas. 1.2- Corroborar, mediante diferentes técnicas, la coexistencia de distintas rutas de endocitosis en sinapsis individuales en determinados momentos del desarrollo de las neuronas granulares, así como indagar cuáles son los determinantes moleculares responsables de la puesta en marcha de uno u otro tipo de endocitosis. 1.3- Investigar la composición proteica de sinapsis individuales tratando de relacionar el contenido sináptico de determinadas proteínas con la eficacia de reciclamiento. 70 Objetivos 2-Exocitosis 2.1- Caracterización y estudio de los mecanismos subyacentes a la inhibición presináptica mediada por cannabinoides en fibras paralelas de neuronas granulares en cultivo. 2.2- Evidenciar la inducción de silenciamiento sináptico tras un tratamiento prolongado con el agonista del receptor CB1. 2.3- Estudiar posibles efectos ultraestructurales en el terminal presináptico asociados con la inhibición mediada por cannabinoides. 2.4- Analizar la independencia de PKA de algunas de las formas de depresión sináptica relacionadas con la disminución de los niveles de cAMP tras la estimulación del receptor CB1. 2.5- Estudiar la heterogeneidad, dentro de una población de sinapsis, en lo que a la susceptibilidad de la inhibición por cannabinoides se refiere, tratando de correlacionar estas diferencias con la composición de proteínas de sinapsis individuales. Las proteínas que aquí se analizaron fueron el receptor CB1 y distintas proteínas de zona activa. 71 72 73 III- Material y métodos "Aquel que tiene un porqué para vivir, se puede enfrentar a todos los cómos" F. Nietzsche 74   75 Material y métodos I) Resumen gráfico de la metodología empleada para los experimentos con neuronas granulares de cerebelo de rata, el número entre paréntesis indica el apartado en que se describe el protocolo llevado a cabo en cada caso. 76 Material y métodos II) Resumen gráfico de la metodología empleada para los experimentos con sinaptosomas de corteza cerebral de ratón, el número entre paréntesis indica el apartado en que se describe el protocolo llevado a cabo en cada caso.   77 Material y métodos II-Materiales y métodos 1-Materiales 1.1-Material biológico Para la realización de los cultivos celulares y de los experimentos que de estos se derivan, se emplearon ratas albinas (Rattus norvegicus) de la cepa Wistar de 7 días postnatales. La privación maternal se llevó a cabo 1 hora antes del sacrificio, por ser este el tiempo requerido para el transporte de los animales desde el animalario de la facultad de medicina de la Universidad Autónoma de Madrid. Para algunos de los estudios ultraestructurales se emplearon ratones (Mus musculus) CB57/BL6 bien de genotipo silvestre (Wt, del inglés wild type) o bien carentes del gen que codifica para el receptor de cannabinoides CB1 (cnr1-/-). Estos animales fueron cedidos conjuntamente por los doctores Beat Lutz (Universidad de Mainz) e Ismael Galve-Roperh (Universidad Complutense de Madrid) El manejo de todos los animales empleados en la realización de este trabajo de investigación se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones éticas para la experimentación con animales y las regulaciones establecidas por la directiva del consejo europeo (86/609/EEC) aprobadas por el comité ético de la UCM. 78 Material y métodos 1.2-Equipos 1.2.1-Electroporación y cultivos Para aquellos experimentos en los que se requirió transfectar las neuronas con material genético exógeno se utilizó el equipo Amaxa Nucleofector II de Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania). Para los cultivos celulares se hizo uso de un agitador orbital modelo WY-100 de la marca COMECTA (Barcelona, España), una cabina de flujo PV-30 de Telstar (Terrassa, España) y un incubador HERAcell® de Thermo Fisher Scientific (NC, EE.UU.). 1.2.2-Adquisición de imagen: Microscopios y cámaras El microscopio empleado tanto para la realización de los experimentos en célula viva como para la adquisición de imágenes de inmunofluorescencia fue un microscopio de la marca Nikon (Japón) modelo Eclipse TE-2000S equipado con un objetivo inmersión en aceite Nikon CFI plan Apo VC 60x con una apertura numérica de 1.4 y una cámara CCD modelo iXonEM+DU885 de Andor Technology (Belfast, Irlanda). Los fluoróforos fueron excitados con un monocromador de la marca Kinetic Imaging (Nottingham, Reino Unido) a las longitudes de onda requeridas. Para la adquisición de imágenes de microscopía electrónica se empleó el microscopio JEM1010 de la marca JEOL (Tokyo, Japón) del Centro Nacional de Microscopía Electrónica. Para los experimentos de microscopía en célula viva se utilizó una cámara de perfusión modelo PH5, la perfusión se llevó a cabo con un sistema VC6 y la temperatura se mantuvo a 37ºC haciendo uso de un termostato TC-344B, todos ellos de Warner Instruments (CT, EE. UU.) 79 Material y métodos 1.2.3-Detección de proteínas Para la electroforesis en geles de poliacrilamida y la posterior transferencia de proteínas a membranas se empleó el dispositivo Mini-Protean® Tetra Cell de Bio-Rad (CA, EE. UU.). En la detección de proteínas transferidas a membranas se empleó el sistema Odyssey de Li-Cor Biosciences (NE, EE.UU.). 1.2.4-Acumulación de cAMP Para la determinación de los niveles de AMP cíclico se empleó un lector de placas FLUOStar Omega de la marca BMG LabTech (Ortenberg, Alemania). 1.3-Reactivos, anticuerpos y fármacos Se indicarán las casas comerciales y posteriormente el material adquirido en cada una de ellas. 1.3.1-Material de cultivos Worthington (NJ, EE. UU.): Kit de digestión enzimática con papaína para la disociación del tejido nervioso (nº cat.: LK003160). InvitrogenTM, Life TechnologiesTM (CA, EE.UU.): Medio de cultivo Neurobasal A (nº cat.:10888-022); suplemento de medio de cultivo B-27 (nº cat.: 17504044); fuente de glutamina de degradación lenta Glutamax (nº cat.: 35050038). 80 Material y métodos Lonza (Basilea, Suiza): Rat Neuron Nucleofector ® Kit, kit para la electroporación de neuronas de rata, composición desconocida (nº cat.: VPG-1003) Sigma-Aldrich (MO, EE.UU.): Citosina β-D-arabinofuranosido, inhibidor de la replicación del DNA (nº cat.: C1768); solución antibiótica y antimicótica (nº cat.: A5955) y EBSS (del inglés Earle's Balanced Salt Solution; nº cat.: E6267). Biochrom AG (Berlín, Alemania): Poli-L-Lisina como sustrato adherente para las células (nº cat.: L 7240). 1.3.2-Acumulación de cAMP CisBio (Codolet, Francia): Kit dynamic 2 de medida de acumulación de cAMP (nº cat.: 62AM4PEB) Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.): IBMX (3-Isobutil-1-Metilxantina), inhibidor de las fosfodiesterasas de cAMP y cGMP (nº cat.: I5879) 1.3.3-Microscopía electrónica Electron Microscopy Sciences (PA, EE. UU.): Tetróxido de osmio (OsO4), fijador de microscopía electrónica (nº cat.: 19170). Merck (MA, EE.UU.): Óxido de propileno empleado para despegar la monocapa de células de la placa de cultivo (nº cat.: 818567); Ferricianuro potásico (nº cat.: 104971). Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.): Glutaraldehído grado I para microscopía electrónica (nº cat.: G5882) 81 Material y métodos TAAB (Berkshire, Reino Unido): Kit de resinas SPURR® para la inclusión de las muestras de microscopía electrónica (nº cat.: S024D) 1.3.4-Inmunodetección 1.3.4.1-Anticuerpos primarios Applied Biosystems (CA, EE.UU.): Anticuerpo monoclonal de ratón anti-GAPDH (Gliceraldehído Fosfato Deshidrogenasa) (nº cat.: AM4300) BD Transduction laboratories (NJ, EE.UU.): Anticuerpo monoclonal de ratón anti- Calcineurina (nº cat.: 610259) Frontier Institute Co. Ltd (Hokkaido, Japón): Anticuerpo policlonal de cobaya anti- CB1R (receptor de cannabinoides de tipo I) (nº cat.: CB1-GP-Af530) Millipore (MA, EE.UU.): Anticuerpo policlonal de ratón anti-fosfo-Sinapsina I (nº cat.: 07-567); Anticuerpo monoclonal de ratón anti-GluA3 (nº cat.: MAB5416) Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.): Anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-Tubulina (nº cat.: T0198). Synaptic Systems (Goettingen, Alemania): Anticuerpo policlonal de cobaya anti- Bassoon (cat. nº: 141004); Anticuerpo monoclonal de ratón anti-Munc13-1 (nº cat: 126111); Anticuerpo policlonal de conejo anti-Dinamina (nº cat: 115002); Anticuerpo monoclonal de ratón anti-Sinapsina I (nº cat: 106001); Anticuerpo policlonal de conejo anti-VGluT1 (nº cat.: 135302); Anticuerpo policlonal de conejo anti-Sinaptojanina I (nº cat.: 145003); Anticuerpo monoclonal de ratón anti-Sintaxina I (nº cat.: 110001); Anticuerpo policlonal de conejo anti-Sinaptofisina I (nº cat.: 101002) 82 Material y métodos 1.3.4.2-Anticuerpos secundarios, líquido de montaje, sueros, cubreobjetos y portaobjetos Jackson Immunoresearch (PA, EE. UU.): Sueros normales de cabra (nº cat.: 005-000- 121) y de burro (nº cat.: 017-000-121). Li-Cor Biosciences (NE, EE. UU.): Anticuerpos marcados con fluoróforos excitables en el infrarrojo para la detección de proteínas en western blot. Anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón IRDye 680 (nº cat.: 926-32220); Anticuerpo policlonal de cabra anti- ratón IRDye 800 CW (nº cat.: 926-322110); Anticuerpo policlonal de cabra anti-conejo IRDye 800 CW (nº cat.: 926-32211). Mentzel-Gläser (Braunschweig, Alemania): Cubreobjetos circulares de vidrio de 15 mm de diámetro (nº cat.: CB00150RA1) y portaobjetos de vidrio de 26 x 76 mm (nº cat.: AD00000112E). Molecular ProbesTM Life TechnologiesTM (CA, EE. UU.): Anticuerpos marcados con fluoróforos Alexa para su detección inmunocitoquímica. Anticuerpo de cabra anti- cobaya marcado con Alexa 546 (nº cat.: A11074); Anticuerpo de cabra anti-ratón marcado con Alexa 594 (nº cat.: A11005); Anticuerpo de cabra anti-ratón marcado con Alexa 488 (nº cat.: A11001); Anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con Alexa 488 (nº cat.: A11008). Líquido de montaje ProLong Antifade con DAPI, (4',6-DiAmidino-2- FenilIndol) para el marcaje de núcleos celulares (nº cat.: P36935). 1.3.5-Extracción de proteínas, electroforesis y transferencia de proteínas a membrana Bio-Rad (CA, EE. UU.): solución de acrilamida/bisacrilamida 37,5:1 al 40% (nº cat.: 161-0148), Dodecil Sulfato Sódico, SDS purificado (nº cat.: 161-0301), TEMED (nº 83 Material y métodos cat.: 161-0800), persulfato de amonio (APS) (nº cat.: 161-0700), Tris base purificado (161-0716), membranas de nitrocelulosa (nº cat.: 162-0115), β-mercaptoetanol (nº cat.: 161-0710), glicina (nº cat.: 161-0718), patrones de peso molecular (rango 10-250 kDa; nº cat.: 161-0373) y el reactivo de Bradford para la determinación de proteínas (nº cat.: 500-0205). Li-Cor Bioscience (NE, EE. UU.): Odyssey blocking buffer (nº cat.: 927-40000) Thermo-Fischer Scientific NC, EE. UU.): Tampón RIPA para extractos de proteínas totales (nº cat.: 11834141); Kit de inhibidores de proteasas y fosfatasas (nº cat.: 10085973). 1.3.6-Experimentos de imagen en célula viva, sales sondas y fármacos 1.3.6.1-Sales Todas las sales se adquirieron a Merck-Millipore. No se indican números de referencia. 1.3.6.2-Fármacos Alomone labs: Tetrodotoxina, TTX, bloqueante de canales de sodio dependientes de voltaje (nº cat.: T-550). 84 Material y métodos ASCENT scientific (Cambridge, Reino Unido): Bromuro de tetradeciltrimetilamonio, MiTMAB®; impide el reclutamiento de la dinamina a membranas (nº cat.: Asc-473); Bafilomicina A1, inhibidor de las V-ATPasas (nº cat.: Asc-497). Calbiochem (CA, EE. UU.): Forskolina (nº cat.: 344270); H-89, inhibidor de la PKA (nº cat.: 371962); T0070907, Antagonista del receptor PPARγ (nº cat.: 575305). Chaiman Chemical (MI, EE. UU.): Daidzeina, isoflavonoide vegetal con efecto estrogénico (nº cat.:10005166). BioLog (Bremen, Alemania): 8-p-Cpt-2'-Me-O-cAMP, activador de la proteína EPAC (nº cat.: C041); N6-Bnz-cAMP, activador de la PKA (nº cat.: B-009). Bio-Rad (CA, EE. UU.): Azul de Bromofenol (nº cat.:161-0404). Merck (MA, EE.UU.): Toxina pertúsica (PTX) (nº cat.:516560); SQ-22536, Inhibidor de la adenilato ciclasa (nº cat.: 568500). Sanofi (Paris, Francia): SR141716, agonista inverso/antagonista del receptor CB1 (cedido, no disponible). Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.): Dynasore; inhibidor de la actividad catalítica de la dinamina (nº cat.: D7693); 4-β-forbol-12, 13-dibutirato, PDBu (nº cat.: P1269). 85 Material y métodos Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido): HU-210, potente agonista cannabinoide (nº cat.: 0966). 1.3.6.3-Sondas Molecular ProbesTM Life TechnologiesTM (CA, EE. UU.): -FM1-43: sonda anfipática, con estructura similar a un fosfolípido, que se internaliza en el lumen de las vesículas sinápticas tras un ciclo de exo/endocitosis y rinde fluorescencia en entornos hidrofóbicos (tras su partición en membrana). Se usa como trazador del ciclo vesicular sináptico (nº cat.: T35356). Fura2-AM: Indicador ratiométrico de la concentración intracelular de calcio. Una vez hidrolizado por la esterasas intracelulares es capaz de unir calcio, lo que provoca variaciones en su espectro absorción. Mediante el cálculo del cociente de los valores de emisión tras su excitación dual a 340 y 380 nm (relación 340/380), se pueden inferir las variaciones en la concentración intracelular de calcio (nº cat.: F-1221). 2-Métodos 2.1-Cultivo de neuronas granulares de cerebelo de rata y electroporación Como se comentó en la introducción, los experimentos descritos en este trabajo han sido enfocados a la caracterización de fenómenos de plasticidad y maduración del 86 Material y métodos elemento presináptico de lo que, in vivo, constituye la sinapsis entre las fibras paralelas y las células de Purkinje. Como modelo de estudio de estos fenómenos se emplearon cultivos de neuronas granulares de cerebelo obtenidas de ratas Wistar (Rattus norvegicus) de siete días postnatales. Ha de destacarse que, a diferencia de otros tipos de neuronas, los cultivos de cerebelo se pueden obtener a partir de postnatales tardíos por estar dilatada la ventana proliferativa de estas células hasta dichos estadios en el animal. 2.1.1-Protocolo 2.1.1.1-Preparación de los cubreobjetos Para favorecer la formación de la matriz de poli-L-Lisina sobre la superficie del cristal se procedió como se describe a continuación: 1-Sumergir los cubreobjetos en HCl 1,5M durante 20 minutos en una placa Petri. 2-Lavar con abundante agua estéril (x3). 3-Dejar secar y extender 100μl de Poli-L-Lisina 0,1 mg/ml sobre cada cubreobjetos. Mantener un mínimo de 3 horas a 37ºC. 4-Lavar con agua estéril (x3). 5-Colocar en las placas de cultivo y dejar secar. 87 Material y métodos En las placas de cultivo de 6 pocillos se procedió de igual forma pero a partir del paso 3, cubriendo completamente el fondo del pocillo con la Poli-L-Lisina 0,1 mg/ml. 2.1.1.2-Realización del cultivo 1-Sacrificicio de los animales por decapitación, extracción del cerebelo y limpieza de las meninges y elementos vasculares en una placa Petri con EBSS frío, una vez limpios los cerebelos se transfieren a otra placa Petri con EBSS limpio y frío. 2-Disección mecánica el tejido con tijeras de cirugía de punta curva. 3-Transferencia de los cerebelos triturados a un tubo de 50 ml con EBSS conteniendo: 12,5 U/ml de papaína; 600U de DNAasa I; 2mM CaCl2 y 2mM MgCl2. Incubar en agitación (250 rpm.) a 37º C durante una hora. La incubación a 37ºC favorece la disgregación enzimática del tejido. 4-Disgregación de los restos no digeridos mediante aspiración y expulsión enérgica con una pipeta automática de 10 ml. Es importante evitar la formación de burbujas 5-Centrifugación a 110g (1.000 rpm en una centrífuga de 9,8 cm de radio), durante 5 minutos. 6-Descartar el sobrenadante; añadir al precipitado medio EBSS con ovomucoide (1 mg/ml) y resuspender. 88 Material y métodos 7-Añadir la suspensión de células a una disolución de ovomucoide de 10mg/ml contenida en un tubo de 15ml. Agitar antes de añadir las células. 8-Centrifugar la solución de ovomucoide a 110g durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante comenzando por la parte superior del tubo en la que se suele formar espuma. 9-Resuspender el precipitado de células en 3ml de Neurobasal A. 10-Preparar una dilución 1:10 de la solución de células obtenida en el paso 9. 11-Preparar una dilución 1:1 con azul tripán de la dilución obtenida en el paso 10 y contar en cámara Neubauer. La densidad celular, en cel. /ml viene dada por la siguiente igualdad: Cel. /ml = Nº cel. contadas x factor de dilución x 104 Donde: Factor de dilución=20 (1/10 en el paso 9; 1/2 en el paso 10) 104= Viene de dividir el número de contado células entre el volumen de cada recuadro que es de 10-4 ml. 89 Material y métodos 12-Siembra de las células a las siguientes densidades, en medio Neurobasal A suplementado con B-27 (1x) y solución antibiótica antimicótica (1x), conteniendo una concentración final de KCl de 25mM: -106 células por pocillo para las placas de 6 pocillos (inmunodetección en membranas y microscopía electrónica). - 1-3x105 células por cubreobjetos de 15mm de diámetro. - 105 células por pocillo en las placas de 96 pocillos. 13-Reemplazar el medio tras 24 horas con medio fresco (paso 12) y citosina arabinósido a una concentración final de 10μM, lo que inhibirá la proliferación glial. Los cultivos de Neuronas granulares son viables hasta más de 14 DIV, realizándose la mayoría de experimentos alrededor de 7DIV, por ser este el momento del pico sinaptogénico en nuestros cultivos. 2.1.1.3-Electroporación Cuando se requirió las células se electroporaron a 0 DIV. El plásmido electroporado codifica para una versión del transportador vesicular de glutamato que contiene una GFP modificada entre los segmentos transmembrana 1 y 2 de dicha proteína, esto permite monitorizar los eventos exo/endocitóticos al registrar los cambios en la fluorescencia de la GFP que acontecen de forma paralela al ciclo vesicular, por variaciones del pH del interior de la vesícula sináptica. Se le denominará plásmido VGluT1-pHluorina. 90 Material y métodos 1-Pipetear, en tubos eppendorf de 1,5 ml un volumen conteniendo 4-5x106 células por electroporación a realizar, a partir de la suspensión de células del paso 9 del apartado anterior. 2- Centrifugar 2 minutos a 245g (2.000 rpm en una microfuga de radio 5,5 cm) y descartar el sobrenadante. 3-Resuspender el precipitado en 100 μl de Rat Neuron Nucleofector ® Solution y añadir 1µg de plásmido VGluT1-pHluorina (se representa el plásmido en la figura 1). Esperar 10 minutos. 4- Pipetear el contenido en una cubeta de electroporación estéril y electroporar. Se utilizó el programa O-003, por lo descrito en (Lopez-Jimenez et al., 2009). 5-Pipetear sobre estos 100 µl, 500µl más de medio Neurobasal con B-27 previamente atemperado (37ºC) y transferir a un eppendorf estéril. Mantener 20 minutos en el incubador de células. 6- Sembrar a una densidad final de 1-2x106 células por cubreobjetos. Es conveniente sembrar la muestra obtenida en el paso 5 sobre 1 ml de medio Neurobasal A con B-27 previamente atemperado. 7-Añadir, tras 2 horas en el incubador, 1,5 ml más de medio Neurobasal A con B-27. No añadir citosina arabinósido. 91 Material y métodos Figura 1- Plásmido empleado para electroporar a 0DIV las neuronas granulares de cerebelo con la construcción VGluT1-pHluorina. 92 Material y métodos 2.2-Obtención de sinaptosomas Para el aislamiento de terminales presinápticos autónomos en términos energéticos y con funcionalidad exocitótica se procedió de forma acorde al método descrito por Dunkey y colaboradores (Dunkley et al., 1986). 1-Sacrificio por dislocación cervical y posterior decapitación. 2-Extracción del cerebro y disección de las cortezas cerebrales. 3-Homogeneizado de las cortezas en sacarosa 0,32 M (pH=7,4; 4ºC) con un homogeneizador con vástago de teflón (realizar hasta 7 pases a 700 rpm). 4-Centrifugar a 2.000 g durante 2 minutos a 4ºC y descartar el precipitado (P1). Aislar el sobrenadante (S1). 5- Volver a centrifugar el S1 a 9.500g durante 12 minutos a 4ºC. Descartar el sobrenadante (S2) y conservar el precipitado (P2). Resuspender este precipitado en sacarosa 0,32M. 6-Centrifugar el P2 resuspendido sobre un gradiente de Percoll constituido por tres bandas de Percoll al 3%, 10% y 23% a 25.000g durante 10' a 4ºC. 93 Material y métodos 7-Recoger, por aspiración suave la interfase depositada entre las bandas de 23% y 10%. Resuspender en HBM (Hepes Buffer Medium: NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). 8-Centrifugar a 22.000g durante 10 minutos y descartar el sobrenadante (S3). Resuspender el precipitado (P3) en HBM fresco y cuantificar proteínas mediante el método de Biuret. Hacer alícuotas de 0,75 mg de proteínas totales. 9-Centrifugar a 3.000g durante 10 minutos y descartar el sobrenadante. El precipitado se almacena a 4ºC (en hielo) y los terminales presinápticos son funcionales entre 4-6h después de su obtención. 94 Material y métodos 2.3-Extracción de proteínas e inmunodetección en membranas Para la cuantificación de proteínas sinápticas se empleó la técnica de western blot e inmunodetección en membrana como se describe a continuación. 2.3.1-Extracción de proteínas totales 1-Lavar dos veces cada pocillo de la placa (3,5x106 células por pocillo) con PBS 1x (137mM NaCl; 27mM KCl; 100mM Na2HPO4; 18mM KH2PO4, pH=7,4) atemperado a 37ºC. 2-Añadir un volumen de tampón RIPA (200-300 µl por pocillo) suplementado con inhibidores de fosfatasas y proteasas (1x), rascar el fondo del pocillo enérgicamente y mantener 15 minutos a 4ºC. 3- Recoger el contenido de los pocillos en tubos eppendorf y centrifugar a 10.400g (13.000 rpm en microfuga de r=5,5 cm) durante 15 minutos. Descartar el precipitado y guardar el sobrenadante. 4- Cuantificación de la concentración de proteínas mediante método colorimétrico de Bradford. 95 Material y métodos 2.3.2-Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y transferencia a membranas 1- Preparación de los geles. Gel concentrador: 4% Acrilamida; 125mM Tris; 0,1% SDS (p/v); 0,05% Persulfato amónico (p/v) en un volumen final de 10ml. Añadir 12 μl de TEMED como catalizador de la reacción de polimerización. Añadir justo antes de servir el gel. Gel separador: 8% Acrilamida; 375mM Tris; 0,1 % SDS (p/v); 0,05% Persulfato amónico (p/v) en un volumen final de 12ml. Añadir 6 μl de TEMED como propagador de la reacción de polimerización justo antes de servir el gel. 2- Añadir a las muestras obtenidas en el paso tres del apartado anterior tampón de carga 5x (10% SDS (p/v); 50% Glicerol (v/v); 312mM Tris; 0,01% Azul de Bromofenol (p/v); 25% β-Mercaptoetanol (v/v)) hasta generar una dilución 1x del tampón de carga con los microgramos deseados de proteína a cargar (5-20 μg de proteínas totales, en función de la abundancia de la proteína de interés). 3-Cuando fue requerido, las proteínas se sometieron a desnaturalización térmica por tratamiento con calor (90ºC, 10 minutos). 4-Cargar las muestras en los pocillos y correr la electroforesis a 4ºC a amperaje constante (20 mA/gel) en tampón de electroforesis (25mM Tris; 192mM Glicina; 0.1% SDS; pH=8,3, no ajustar, comprobar) durante 1 hora 30 minutos. Añadir patrón de peso molecular en algún/os pocillo/s. 96 Material y métodos 5-Unos minutos antes de detener la electroforesis, hidratar las membranas de nitrocelulosa con agua ultrapura y posteriormente equilibrar en tampón de transferencia (25mM Tris; 192mM Glicina; 20% Metanol (v/v); pH=8,3). 6-Una vez finalizado el proceso electroforético, equilibrar los geles en tampón de transferencia. La transferencia de proteínas se llevó a cabo a un amperaje constante de 250 mA durante 1 hora a 4ºC en tampón de transferencia (25mM Tris; 192mM Glicina; 20% Metanol (v/v); pH=8,3). 7-Enjuagar las membranas en PBS para retirar el exceso de metanol. Bloquear en Odyssey Blocking Buffer durante 1 hora a temperatura ambiente. Es importante cerciorarse de que la solución de bloqueo cubre toda la membrana. 8-Incubar con los anticuerpos primarios a la concentración deseada, los anticuerpos primarios se diluyen en una solución 1:1 de Odyssey Blocking Buffer y PBS 1x (137mM NaCl; 27mM KCl; 100mM Na2HPO4; 18mM KH2PO4, pH=7,4) durante 1 hora a temperatura ambiente u o/n a 4ºC. Añadir Tween-20 a una concentración de 0,1% (v/v) disminuye la unión inespecífica de los anticuerpos (a continuación se indican las concentraciones de los anticuerpos empleados en este estudio para inmunodetección en membrana: Dinamina 1:1000; Sintaxina 1:1000; Sinaptojanina 1:200; β-Tubulina 1:2000; GAPDH 1:1000; CB1R 1:300; RIM1α 1:400; Munc13-1 1:1000). 9-Lavar las membranas durante 5 minutos con PBS-Tween 20 al 0,1% (x4). 97 Material y métodos 10-Incubar con los anticuerpos secundarios marcados para la lectura en el infra-rojo. Incubar en PBS 0,1 % Tween-20 (v/v), 0,01% SDS (p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente. Todos los anticuerpos secundarios se usaron a la concentración 1:15000. 11-Lavar la membrana con PBS Tween-20 al 0,1 % (x4). 12-Lavar una vez la membrana en PBS. 13-Dejar secar y escanear en Odyssey. El programa genera archivos tipo *.TIFF y los datos se pueden procesar haciendo uso del programa provisto con el equipo. 98 Material y métodos 2.4 Inmunocitoquímica Se emplearon para la detección inmunocitoquímica, cubreobjetos de 15mm de diámetro sembrados a una densidad de 1-3x105 cel. /cubreobjetos. 1-Lavar 5 minutos con PBS 1x (137mM NaCl; 27mM KCl; 100mM Na2HPO4; 18mM KH2PO4, pH=7,4) a 37ºC (x2). 2-Fijar con Paraformaldehído al 4% en PBS (p/v) durante 15 minutos a temperatura ambiente. 3-Lavar con PBS frío (x2). 4- Permeabilizar con PBS-Triton X-100 al 0,2% (v/v) a temperatura ambiente durante 6 minutos. 5-Bloquear durante 1 hora a 37ºC en una solución de PBS 0,05% Tritón X-100 (v/v); 10% (v/v) suero de cabra. 6- Incubar o/n a 4ºC con los anticuerpos primarios a la concentración deseada. Las empleadas en este estudio se indican a continuación: anti-Bassoon 1:500; anti-fosfo- Sinapsina 1:400; anti-Munc13-1 1:1000; anti-Calcineurina 1:50; anti-GluA3 1:200; anti-Dinamina 1:400; anti-Sinapsina 1:250; anti-VGluT1 1:200; anti-RIM1α 1:400; anti CB1R 1:300. Los anticuerpos se incubaron en PBS 0,05% Triton X-100 (v/v), 5% Suero de cabra (v/v). 99 Material y métodos 7-Lavar en PBS, 5 minutos (x3). 8-Incubar con el anticuerpo secundario 1h a 37ºC en PBS (137mM NaCl; 27mM KCl; 100mM Na2HPO4; 18mM KH2PO4, pH=7,4). Todos los anticuerpos secundarios, marcados con fluoróforos Alexa, se emplearon a 1:200 en este estudio. 9- Lavar con PBS (x3). Tras el lavado, enjuagar los cubreobjetos en agua ultrapura para eliminar el exceso de sales. 10-Montar con líquido de montaje ProLong con DAPI sobre portaobjetos rectangulares. Cerciorarse de que no se forman burbujas durante el montaje. 100 Material y métodos 2.5 Imagen en célula viva Para la monitorización del ciclo vesicular se emplearon dos estrategias, la sonda FM1- 43 y la VGluT1-pHluorina. 2.5.1-FM1-43 Las sondas de tipo FM son derivados del estireno. Son moléculas anfipáticas, ya que cuentan con una cabeza polar con dos nitrógenos cuaternarios (que le impiden voltearse en la membrana) y una cola hidrofóbica hidrocarbonada, lo que le permite la partición en las membranas biológicas. La partición en membranas de estas moléculas es reversible, y la velocidad de partición viene determinada por la longitud de la cola hidrocarbonada. Una propiedad de las sondas FM es que no poseen fluorescencia en disolución acuosa, pero sí en entorno hidrofóbico, lo que las hace excelentes trazadores de la dinámica de las membranas biológicas (Cousin, 2008). → Figura 2- Estructura química (A) y molecular (B) de la sonda FM1-43. En C se muestra el protocolo experimental genérico de incorporación de la sonda en el interior de las vesículas sinápticas. D) Aspecto de un campo de neuronas posterior a la incorporación de sonda y previo a la estimulación durante el experimento; en E se muestra el aspecto del campo tras la realización del experimento. F) Regiones sinápticas a estudiar, la obtención de esta imagen se detalla en el apartado 3.2 de métodos. Las neuronas en reposo (G) son estimuladas en presencia de FM1-43 10μM (H), que se incorpora al lumen de las vesículas. Tras un periodo de lavado (I) se elimina el exceso de sonda unido a la membrana externa. La estimulación (J) genera una extinción de la fluorescencia por partición de la sonda en el medio extracelular. Los números corresponden a los números sobre el esquema en C. 101 Material y métodos 102 Material y métodos En el trabajo aquí descrito se ha empleado la sonda FM1-43 con longitudes de onda de excitación comprendidas entre 480 y 490 nm y emisión a más de 510 nm, se trabajó con un filtro de Fluoresceina IsoTioCianato (FITC) que recoge longitudes de onda entre 520 y 540 nm (fluorescencia verde). La puesta en contacto de una monocapa de células con la sonda FM1-43 genera la partición de la misma en la membrana celular, generando un marcaje fluorescente uniforme en toda la célula. Al estimular neuronas en presencia de la sonda FM1-43 (por ejemplo, con KCl 50mM), la endocitosis compensatoria de las vesículas sinápticas atrapará moléculas de FM1-43 en el lumen vesicular y en principio, en las membranas externas (siempre en la hemicapa correspondiente a la cara E). Tras un periodo de lavado, solo aquellas moléculas de FM1-43 intercaladas en la hemicapa luminal de la membrana de las vesículas sinápticas serán responsables de la fluorescencia observada, lo que genera un aspecto punteado de la fluorescencia. Si tras un periodo de reposo, volvemos a estimular estas neuronas, se observará una extinción de la fluorescencia relacionada con la fusión con la membrana presináptica de aquellas vesículas que habían retenido FM1-43, lo que provoca la partición de esta en el medio extracelular. Posteriormente, gracias al procesamiento informático de las imágenes, podemos analizar exclusivamente aquellas regiones en las que el apagamiento de fluorescencia durante la segunda estimulación sea compatible con el de una región sináptica (ver apartado 3.2). La ventaja de esta técnica reside en la capacidad de poder analizar el comportamiento de sinapsis individuales; puesto que en un único experimento se pueden registrar hasta varios miles de respuestas aisladas, el poder analítico, en términos estadísticos, de este tipo de experimentos, es bastante elevado. Los tratamientos se llevaron a cabo en función del fenómeno a analizar, si se pretendían estudiar aspectos endocitóticos del ciclo vesicular, se llevó a cabo una incubación previa 103 Material y métodos a la incorporación de la sonda en el lumen de las vesículas, en cambio, si el objetivo era estudiar fenómenos exocitóticos, el tratamiento fue posterior a la carga con la sonda. 2.5.1.1-Tampones HBM de reposo: (del inglés Hepes Buffer Medium NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). HBM de estimulación (NaCl 95mM, KCl 50mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 1,33mM CaCl2; pH=7,4). HBM de reposo-BPB: HBM de reposo conteniendo 2mM de azul de bromofenol. HBM de estimulación-BPB: HBM de estimulación conteniendo 2mM de azul de bromofenol. 2.5.1.2-Protocolo experimental (FM1-43) 1-Partiendo de células granulares de cerebelo en cultivo de 7 DIV (también empleadas a 3 y a 14 DIV) llevar a cabo el siguiente protocolo. 2-Atemperar las células durante 10 minutos a 37ºC en medio HBM de bajo potasio. 104 Material y métodos 3-Incubar el cubreobjetos con las células durante 5 minutos en HBM de estimulación conteniendo 10μM de FM1-43 y 1,33mM CaCl2. Estas fueron las concentraciones estándar de no indicarse lo contrario (las variaciones en concentración de sonda y de CaCl2 durante la carga se detallan en los protocolos gráficos). 4- Enjuagar el cubreobjetos en una placa Petri pequeña con medio HBM de reposo. 5-Montar el cubreobjetos en la cámara de perfusión (en este estudio se uso una cámara PH5 de Warner Instruments, no obstante, se pueden emplear cámaras fabricadas a mano en la tapa de una placa Petri pequeña de plástico). 6-Conectar la cámara al sistema de perfusión, montar en la pletina del microscopio y lavar, por perfusión de HBM de reposo (37ºC; v flujo= 1ml/min) durante 10 minutos. Montar en la pletina del microscopio. 7-Comenzar la adquisición de la imagen, los ajustes del equipo óptico y del programa de adquisición fueron los siguientes: Objetivo: 60x λ excitación: 479nm Ventana: 1004x1002 pixeles Tiempo de exposición 0.067 segundos Ganancia electrónica: 50 Pre-Amplificación de la ganancia: 3.80 Profundidad en bits: 14 Tasa de adquisición de imágenes: 1Hz 105 Material y métodos 8-Adquirir imágenes durante un periodo de línea base de 30" y posteriormente estimular por perfusión de medio de estimulación durante un tiempo variable. Los tiempos aquí escogidos fueron o 4'30" minutos en perfusión continua (estudios de endocitosis) o bien una primera estimulación de 10" espaciada por un minuto de reposo y seguida por una estimulación de 1'30" (estudios de exocitosis). 9- Una vez finalizado el experimento, tomar una imagen en contraste de fase que servirá para ubicar los puncta de fluorescencia monitorizados durante el experimento y excluir regiones no sinápticas. 2.5.1.3-Protocolos gráficos Figura 3- Protocolos gráficos del esquema experimental empleado en las variaciones de los tiempos y concentraciones de calcio durante el periodo de lavado (figuras 1, 2 y 3 de resultados) A) Tiempo de lavado=1 minuto en presencia (+) o ausencia (-) de CaCl2 durante el lavado. B) Tiempo de lavado=10 minutos en presencia (+) o ausencia (-) de CaCl2 durante el lavado. Protocolo estándar de FM1-43. C) Tiempo de lavado=20 minutos en presencia (+) o ausencia (-) de CaCl2 durante el lavado. Estimulación: 5 minutos. 106 Material y métodos Figura 4- Variaciones de la concentración de calcio durante el periodo de carga en A (1,33mM CaCl2) B (0,5mM CaCl2) y C (0,25mM CaCl2). Variaciones de la concentración de FM1-43 durante el periodo de carga en D (3μM FM1-43), E (5μM FM1-43) y F (10μM FM1-43). Figuras 4 y 5 respectivamente. De no indicarse lo contrario la concentración de CaCl2 durante la carga será de 1,33mM a partir de ahora. Estimulación 5 minutos en todos los casos. Figura 5- Esquema de carga en control (A) y en condiciones de carga asincrónica (B) en la que la sonda se pone en contacto con la preparación después de la estimulación con objeto de detectar formas de endocitosis lenta que persisten tras la estimulación. Lavado en ausencia de CaCl2. Estimulación 5 minutos. 107 Material y métodos Figura 6- Esquema de carga en control de las figuras 7 y 9 de resultados (A) y en la figura 8 (A'). Los tratamientos tanto con Dynasore como con FK-506 (figuras 7 y 9 de resultados, respectivamente) se llevaron a cabo durante los 25 minutos previos a la carga, y durante la fase de incorporación a las concentraciones indicadas en (B); * téngase en cuenta que, en el caso de la figura 7 de resultados, el protocolo de carga de la sonda se llevó a cabo a distintas concentraciones de calcio, tanto en control como en las células tratadas con Dynasore. En (C) se muestra el protocolo de carga empleado para los experimentos con MiTMAB (figura 8 de resultados). Estimulación 5 minutos. 108 Material y métodos Figura 7- Esquema del protocolo empleado en los experimentos de FM1-43 y azul de bromofenol en control (A) y perfundiendo azul de bromofenol durante el lavado y durante la estimulación (B). 5 minutos de estimulación en ambos. Los tratamientos prolongados se llevaron a cabo mediante incubación en el medio de cultivo (Neurobasal A con B-27) durante las 24 horas previas al experimento a las siguientes concentraciones: TTx, 1μM (figura 14 de resultados); Daidzeina, 500 nM; T0070907, 1μM (figura 15 de resultados); PTx, 2μg/ml (figura 18 de resultados); SR141716, 5μM (figura 19 de resultados). Para todos ellos se empleó el protocolo descrito en la figura 2B de métodos, como control se emplearon células no tratadas. 109 Material y métodos Para los estudios de exocitosis se llevaron a cabo pequeñas modificaciones de los tiempos de carga y de la segunda estimulación que se detallan en los esquemas que siguen. Figura 8- Esquema del protocolo empleado en los experimentos de FM1-43 y activación del receptor CB1; la estimulación consiste en 10" (D1) un tiempo de reposo y una perfusión de 2'30" con medio de estimulación (D2). A) Control; B) HU-210 C) HU-210 + SR141716; D) Tratamiento breve con HU-210 (40" antes de la estimulación). A, B, y C en la figura 20 de resultados; A y D figura 21. El periodo de carga fue de 2 minutos en todos los casos. 110 Material y métodos 2.5.2-VGluT1-pHluorina Las pHluorinas son indicadores de pH codificados genéticamente. Diseñadas por primera vez por Miesenbock (Miesenbock et al., 1998), consisten en una proteína endógena modificada con una versión de la proteína fluorescente verde que exhibe una extraordinaria sensibilidad al pH. Esta versión modificada de la GFP está apagada a pHs ácidos (pH=5,5; lumen vesicular), mientras que emite fluorescencia a pHs neutros (pH=7,4; espacio extracelular). Años después se introdujo una nueva modificación en estas herramientas codificadas genéticamente, ya que la copia de GFP se sustituyó por otra versión de la proteína cuya medida no es ratiométrica, ya que el espectro de emisión posee un solo máximo, a la que se denominó pHluorina eclíptica (Sankaranarayanan y Ryan, 2001). Posteriormente la sustitución de la GFP por la EGFP (del inglés Enhanced Green Fluorecent Protein) (Heim et al., 1995), llevó al desarrollo de la pHluorina super eclíptica (Ng et al., 2002). La pHluorina empleada en este estudio está constituida por una pHluorina supereclíptica situada entre los bucles 1 y 2 transmembrana (orientada hacia la cara E o luminal) del transportador vesicular de glutamato de tipo 1, conocida como VGluT-pHluorina (Voglmaier et al., 2006; Balaji y Ryan, 2007). → Figura 9- A) Espectro de emisión de la pHluorina supereclíptica a diferentes pH (distintos colores). Adaptado de (Schulte et al., 2006). B) Se muestra el efecto de la variación de pH sobre la fluorescencia de la Sy-pHluorina en este caso, en copias expresadas en neuronas vivas. Adaptado de (Sankaranarayanan y Ryan, 2001). C) Ilustración esquemática del cambio de fluorescencia en la VGluT1-pHluorina respuesta a las variaciones de pH del lumen vesicular; la pHluorina supereclíptica entre TM1 y TM2 se representa como un círculo. D) Esquema de las variaciones de fluorescencia paralelas a la sucesión de acontecimientos del ciclo vesicular, 1) Reposo; 2) Exocitosis vesicular; 3) Endocitosis; 4) Re- acidificación. Se indican los cambios de pH del lumen de la vesícula sináptica. El registro de fluorescencia que se obtendría tras poner en marcha la fusión vesicular en neuronas que expresan esta proteína se indica con números que corresponden a las fases del ciclo vesicular ilustrado previamente. 111 Material y métodos 112 Material y métodos La estimulación neuronal provoca la fusión de las vesículas con la membrana presináptica y por tanto la neutralización del lumen de las vesículas sinápticas, o lo que es lo mismo, un flujo neto de protones hacia el espacio extracelular. Este cambio en pH se traduce en un incremento rápido de la fluorescencia neta de la GFP durante la fase exocitótica del ciclo vesicular, seguido de un descenso lento y progresivo de la fluorescencia inducido por la endocitosis y la re-acidificación de las vesículas sinápticas. Posteriormente, por perfusión de una solución de NH4Cl, podemos promover la salida de protones del interior de las vesículas, lo que neutralizará el lumen vesicular de forma independiente de la exocitosis y por tanto dará lugar a una señal máxima a la que normalizar el aumento de fluorescencia monitorizado durante la estimulación. De este modo es posible estimar la fracción (porcentaje) de vesículas exocitadas durante un estímulo, respecto al total de vesículas sinápticas presentes en sinapsis individuales. Las principales ventajas de la monitorización del ciclo vesicular con VGluT1-pHluorina frente a la monitorización de este proceso con FM1-43 son I) la ausencia de un paso de estimulación previo al experimento para la incorporación de la sonda y II) la posibilidad de monitorizar la fase endocitótica del ciclo vesicular. Una ventaja de este sistema es la alta reproducibilidad de los experimentos entre rondas de estimulación sucesivas. Esto permite tener un control interno a la hora de efectuar comparaciones una vez realizados tratamientos farmacológicos. 113 Material y métodos 2.5.2.1-Tampones HBM de reposo: (del inglés Hepes Buffer Medium NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). HBM de estimulación (NaCl 95mM, KCl 50mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 1,33mM CaCl2; pH=7,4). HBM de alcalinización de vesículas sinápticas: (del inglés Hepes Buffer Medium NaCl 90mM, NH4Cl 50mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). 2.5.2.2- Protocolo 1-Partiendo de células electroporadas a 0 DIV (como se indica en el apartado 2.1.1.3) y mantenidas hasta 7 DIV. 2-Atemperar las células durante 10 minutos a 37ºC en medio HBM de bajo potasio. 3-Montar el cubreobjetos en la cámara de perfusión (en este estudio se uso una cámara PH5 de Warner Instruments, no obstante, se pueden emplear cámaras fabricadas a mano en la tapa de una placa Petri pequeña de plástico). 4-Conectar la cámara al sistema de perfusión y lavar, por perfusión de HBM de reposo (37ºC; v flujo= 1ml/min). Montar en la pletina del microscopio. 114 Material y métodos 5-Comenzar la adquisición de imagen, los ajustes del equipo óptico y del programa de adquisición fueron los siguientes: Objetivo: 60x λ excitación: 475nm Ventana: 1004x1002 pixeles Tiempo de exposición 0.250 segundos Ganancia electrónica: 100 Pre-Amplificación de la ganancia: 3.80 Profundidad en bits: 14 Tasa de adquisición de imágenes: 4Hz (las 4 imágenes se promediaron para mejorar la relación señal ruido) dando lugar a una tasa real de aproximadamente 1Hz. 6-Adquirir un periodo de línea base de 30" y posteriormente estimular por perfusión de medio de estimulación durante un tiempo variable. Los tiempos aquí escogidos fueron o 10" en perfusión continua o 20" en el caso de desearse llevar a cabo una sobre- estimulación neuronal. Posteriormente pasar a perfusión de HBM de reposo durante 50". Finalmente, perfundir 30" de la solución de alcalinización con objeto de obtener un máximo de señal para normalizar posteriormente. 7-Se puede repetir el paso 8 tantas veces como se desee, llevando a cabo tratamientos farmacológicos en los periodos entre experimentos. 115 Material y métodos 8- Una vez finalizado el experimento, tomar una imagen en contraste de fase que servirá para ubicar los puncta de fluorescencia monitorizados durante el experimento y excluir regiones no sinápticas. 2.5.2.3-Protocolos gráficos. Figura 10- Protocolos gráficos del esquema experimental empleado en los experimentos de doble pulso en VGluT1-pHluorina en control (A) y con un tratamiento de 10 minutos con HU-210 (5μM) entre las estimulaciones (B). En la figura 22 de resultados, el tampón de estimulación empleado contenía 1,33mM CaCl2 para ambos protocolos. En la figura 24 de resultados, el tampón de estimulación empleado contenía 5mM CaCl2. En la figura 23 se empleó el protocolo en A con una gradación de los niveles de CaCl2 durante la estimulación (0,25; 1,33 y 5mM). El segmento recuadrado en el protocolo A corresponde al paso 8 del protocolo detallado en 2.5.2.2; 30" reposo / 10" estimulación / 50" reposo /30" alcalinización. El protocolo empleado en la figura 25 corresponde al pulso posterior a la incubación del HU-210 y la estimulación se llevó a cabo durante 20" en un medio conteniendo 5mM CaCl2. 116 Material y métodos Figura 11- Protocolos gráficos del esquema experimental empleado en los experimentos de doble pulso en VGluT1-pHluorina en control (A) y con un tratamiento de 5 minutos con PDBu (1μM) entre las estimulaciones (B). Corresponde a la figura 26 de resultados. Nótese que se llevaron a cabo dos protocolos, en uno se estimuló a 0.25mM CaCl2 y en otro a 1,33mM CaCl2. Figura 12- Protocolos gráficos del esquema experimental empleado en los experimentos de Bafilomicina en control (A) y tras tratar con HU-210 (B) La bafilomicina se empleó a 500 nM a partir de los 20" previos al comienzo de la estimulación y hasta el final del experimento. Los tiempos de línea base y estimulación son los descritos en el punto 8 del protocolo experimental. 117 Material y métodos Los protocolos gráficos de las incubaciones farmacológicas de las figuras 32, 33 y 34 de resultados se indican en la misma figura, ha de tenerse en cuenta que tras la incubación con los distintos agonistas/antagonistas o activadores/inhibidores se llevó a cabo el protocolo descrito en el paso 6 de 2.5.2.2 (protocolo recuadrado en la figura 10A de métodos). 2.5.3-Fura2-AM Con objeto de determinar las variaciones intracelulares de calcio en neuronas individuales se utilizó la sonda fluorescente Fura-2 AM. Esta es una sonda hidrofóbica, lo que le permite atravesar la membrana plasmática y alcanzar el interior celular, donde las esterasas citoplásmicas hidrolizan su enlace éster. El Fura-2 liberado queda confinado en el citoplasma donde se une al Ca2+ libre para formar el complejo Ca2+- Fura, que da lugar a una emisión fluorescente cuyo máximo se registra a una longitud de onda de 510 nm, produciéndose además un desplazamiento en el máximo de su espectro de excitación de 380 nm a 340 nm. Posteriormente el valor obtenido de dividir entre el valor de fluorescencia emitida al excitar a 340nm y el valor obtenido al excitar a 380nm obtendremos una señal ratiométrica que incrementará de forma paralela a la concentración intracelular de calcio. Está técnica se empleó para medir la reducción en la entrada de calcio en respuesta a la aplicación del agonista CB1. 118 Material y métodos 2.5.3.1-Tampones HBM de reposo: (del inglés Hepes Buffer Medium NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 1,33mM CaCl2; pH 7,4). HBM de estimulación (NaCl 95mM, KCl 50mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 1,33mM CaCl2; pH=7,4). 2.5.3.2-Protocolo 1- Partiendo de neuronas granulares de cerebelo de 7DIV en cubreobjetos de 15mm de diámetro. 2- Incubar durante 50 minutos a 37ºC en HBM de reposo conteniendo 5μM de la sonda FURA2-AM. 3-Enjuagar brevemente las células en una placa Petri pequeña conteniendo medio de reposo. 4-Montar las células en la cámara, conectar al sistema de perfusión y lavar, durante 10 minutos, por perfusión de HBM de reposo (37ºC; v flujo= 1ml/min). 5-Comenzar la adquisición de imagen, los ajustes del equipo óptico y del programa de adquisición fueron los siguientes: 119 Material y métodos Objetivo: 40x λ excitación:340nm/380nm Ventana: 502x501 pixeles Tiempo de exposición 0.050 segundos Ganancia electrónica: 100 Pre-Amplificación de la ganancia: 3.80 Profundidad en bits: 14 Tasa de adquisición de imágenes: 2Hz (una medida en cada longitud de onda por segundo). 6-El protocolo consistió en estimulaciones secuenciales por perfusión, durante 10 segundos, de HBM de estimulación. En los periodos de reposo se incubó durante 1 o 10 minutos con HU-210 5μM. 7-Al finalizar el experimento, realizar una foto en contraste de fase y perfundir, durante 3 minutos, medio de estimulación conteniendo 10μM FM1-43. Lavar posteriormente durante 10 minutos con HBM de reposo. Esto delimitará las regiones sinápticas para el análisis posterior. 8- Adquirir una imagen del marcaje de FM1-43 (* los ajustes del equipo han de ser los descritos en 2.5.1.2). 120 Material y métodos 2.6-Microscopía electrónica 2.6.1-Tampones -Tampón Millonig: Tampón fosfato 0,1 M; 1,87% NaH2PO4 (p/v), 0,38 % NaOH (p/v); pH=7.4. -Tampón de fijación I: 4% Paraformaldehído; 2,5 % Glutaraldehído en Tampón Millonig. -Tampón de fijación II (Osmicación): 1% OsO4; 1,5% K3Fe (CN)6. -Soluciones de deshidratación: Soluciones de etanol/acetona de concentración creciente desde 30% hasta etanol/acetona absoluto/a. 2.6.2-Protocolos 2.6.2.1 Microscopía de sinaptosomas 1-Los sinaptosomas, obtenidos en el paso 9 del protocolo 2.2, se mantuvieron 1h a 37ºC en la que fueron tratados con el agonista del receptor CB1, HU-210 (5μM en HBM, 10 minutos) o bien con HBM un periodo equivalente. 121 Material y métodos 2-Lavado en tampón Millonig a 37ºC, pH=7,3 por resuspensión del precipitado conteniendo los sinaptosomas. Centrifugar 1 minuto a 10.000g. 3- Fijar en tampón de fijación I, 2 horas a 4ºC. 4-Lavar en tampón Millonig a 4ºC y centrifugar 2 minutos a 245g (x2). 5-Lavado o/n en tampón Millonig a 4ºC. Centrifugar 2 minutos a 245g. Descartar el sobrenadante. 6-Postfijación y osmicación: Añadir en el tubo eppendorf Tampón de fijación II y mantener 1h a 4ºC. 7-Retirar el tampón de fijación II e inactivar los residuos con leche en polvo, esto disminuye su toxicidad. Lavar con agua destilada (x3). 8-Deshidrataciones en concentraciones crecientes de acetona - Acetona 30%; 15 minutos - Acetona 50% ; 15 minutos - Acetona 70% ; 15 minutos - Acetona 80% ; 15 minutos - Acetona 90% ; 15 minutos - Acetona 95% ; 15 minutos - Acetona 100%; 15 minutos (x2) 122 Material y métodos 9-Inclusión en concentraciones crecientes de resina SPURR. - Resina / acetona 1/3; 1h - Resina / acetona 1:1; 1h; - Resina / acetona 3/1; 2h - Resina pura; o/n 10- Cambiar la resina pura del último paso por resina pura fresca y mantener 48 horas a 60ºC, lo que da lugar a la polimerización de la resina. Los bloques de resina se cortaron en el centro nacional de microscopía electrónica (C.N.M.E.). 2.6.2.2 Microscopía de células 1-Partiendo de neuronas granulares de cerebelo de 7DIV (paso 13 del protocolo 2.1.1.2) sembradas en placas de 6 pocillos, retirar el medio de cultivo NeurobasalA y añadir HBM atemperado a 37ºC, mantener 10 minutos en incubador de células. 2-Retirar el HBM y añadir HBM atemperado a 37ºC conteniendo el tratamiento farmacológico, o bien proceder al protocolo de estimulación. En el trabajo aquí descrito, los tratamientos empleados fueron los siguientes, descritos en función del proceso que perseguían caracterizar: a-Para los estudios en endocitosis y reciclamiento, figura 11 de resultados (6 Condiciones): 123 Material y métodos Control: Basal: Células mantenidas 10 minutos adicionales en HBM (Hepes Buffer Medium: NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). Estimulación en 1,33mM CaCl2: Células mantenidas 10 minutos en HBM de reposo (NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). Posteriormente fueron estimuladas en medio HBM de alto potasio (NaCl 95mM, KCl 50mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 1,33mM CaCl2; pH=7,4) durante 5minutos. Mantener en reposo los 10 minutos posteriores a la estimulación. Estimulación en 0,25mM CaCl2: Células mantenidas 10 minutos en HBM de reposo (137mM NaCl; 27mM KCl; 100mM Na2HPO4; 18mM KH2PO4, pH=7,4). Posteriormente fueron estimuladas en medio HBM de estimulación (NaCl 95mM, KCl 50mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 0,25mM CaCl2; pH=7,4) durante 5minutos. Mantener en reposo los 10 minutos posteriores a la estimulación. 124 Material y métodos Dynasore (inhibidor de la actividad catalítica de la dinamina): El tratamiento con Dynasore 20μM en HBM se mantuvó desde los 20 minutos comprendidos desde la retirada del medio de cultivo en el paso 1 de este protocolo hasta el periodo posterior a la estimulación (esta incluída). Basal: Células mantenidas 20 minutos en HBM (NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 20μM Dynasore; pH 7,4). Estimulación en 1,33mM CaCl2: Células mantenidas 10 minutos en HBM de reposo (NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). Posteriormente fueron estimuladas en medio HBM de estimulación (NaCl 95mM, KCl 50mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 1,33mM CaCl2; 20μM Dynasore; pH=7,4) durante 5minutos. Mantener en reposo los 10 minutos posteriores a la estimulación. Estimulación en 0,25mM CaCl2: Células mantenidas 10 minutos en HBM de reposo (137mM NaCl; 27mM KCl; 100mM Na2HPO4; 18mM KH2PO4; 20μM Dynasore pH=7,4). Posteriormente fueron estimuladas en medio HBM de alto potasio (NaCl 95mM, KCl 50mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 0,25mM CaCl2; 20μM Dynasore; pH=7,4) durante 5minutos. Mantener en reposo los 10 minutos posteriores a la estimulación. 125 Material y métodos b-Para los estudios del receptor CB1, relacionados con aspectos exocitóticos: Control: Células mantenidas 10 minutos adicionales en HBM (NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). HU-210: Células tratadas durante los 10 minutos con HU-210 5μM en HBM (NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; pH 7,4). 3-Lavado en tampón Millonig a 37ºC, pH=7,3 (en placa). 3- Fijar en tampón de fijación I, 2 horas a 4ºC (en placa). 4-Lavar en tampón Millonig a 4ºC. (x2; en placa). 5-Lavado o/n en tampón Millonig a 4ºC (en placa). 6-Postfijación y osmicación: Añadir sobre el pocillo de la placa de cultivo Tampón de fijación II y mantener 1h a 4ºC (en placa). 7-Retirar el tampón de fijación II e inactivar los residuos con leche en polvo, esto disminuye su toxicidad. Lavar con agua destilada (x3; en placa) 126 Material y métodos 8-Deshidrataciones en concentraciones crecientes de etanol - Etanol 30%; 15 minutos - Etanol 50% ; 15 minutos - Etanol 70% ; 15 minutos - Etanol 80% ; 15 minutos - Etanol 90% ; 15 minutos - Etanol 95% ; 15 minutos - Etanol 100%; 15 minutos (x2) 9-Despegar la monocapa de células con pipeteos enérgicos de óxido de propileno. Es importante ser diligente, pues el óxido de propileno ataca el plástico de la placa, lo que puede contaminar la muestra. Recoger la monocapa en un tubo eppendorff. Centrifugar a 750g durante 2 minutos, descartar el sobrenadante. 10-Inclusión en concentraciones crecientes de resina SPURR en tubos eppendorf - Resina / etanol 1/3; 1h - Resina / etanol 1:1; 1h; - Resina / etanol 3/1; 2h - Resina pura; o/n 11- Cambiar la resina pura del último paso por resina pura fresca y mantener 48 horas a 60ºC, lo que da lugar a la polimerización de la resina. Los bloques de resina se cortaron en el centro nacional de microscopía electrónica (C.N.M.E.). 127 Material y métodos 2.7-Niveles de cAMP 1-Partiendo de células granulares de cerebelo en cultivo de 9/10 DIV en placas de 96 pocillos. 2-Incubar en HBM de reposo (NaCl 140mM, KCl 5mM, NaHCO3 5mM, NaH2PO4 1,2mM, MgCl2 1mM, glucosa 10mM y HEPES 10mM; 1,33mM CaCl2; pH 7,4) con 1mM IBMX. Los tratamientos se llevaron a cabo a las siguientes concentraciones: HU- 210, 5μM; Forskolina 1μM; SQ-22536, 100μM. Incubar durante 30 minutos a 37ºC 3-Lisar las células y proceder como se indica en el kit cAMP dynamic 2 detection kit. 4-Realizar las medidas de fluorescencia en un lector de placas, en este caso el equipo empleado fue un Fluos-STAR OMEGA. 128 Material y métodos 2.8- Inmunocitoquímica Post-hoc La técnica de la inmunocitoquímica post-hoc surge de combinar los experimentos de funcionalidad de FM1-43 con técnicas clásicas de inmunocitoquímica (Ramirez-Franco et al., 2013). El protocolo se detalla a continuación y se incorpora en su formato de publicación en el anexo I Los tampones empleados no se detallarán por quedar recogidos en las secciones correspondientes 2.8.1-Protocolo 1-Partiendo de células granulares de cerebelo en cultivo de 7 DIV (también empleadas a 3 y a 14 DIV) llevar a cabo el siguiente protocolo. 2-Atemperar las células durante 10 minutos a 37ºC en medio HBM de bajo potasio. 3-Incubar el cubreobjetos con las células durante 5 minutos en HBM de estimulación conteniendo 10μM de FM1-43 y 1,33mM CaCl2. Estas fueron las concentraciones estándar de no indicarse lo contrario (las variaciones en concentración de sonda y de CaCl2 durante la carga se detallan en los protocolos gráficos). 4- Enjuagar el cubreobjetos en una placa Petri pequeña con medio HBM de reposo. 5-Montar el cubreobjetos en la cámara de perfusión (en este estudio se uso una cámara PH5 de Warner Instruments, no obstante, se pueden emplear cámaras fabricadas a mano en la tapa de una placa Petri pequeña de plástico) 129 Material y métodos 6-Conectar la cámara al sistema de perfusión y lavar, por perfusión de HBM de reposo (37ºC; v flujo= 1ml/min) durante 10 minutos. Montar en la pletina del microscopio. 7-Comenzar la adquisición de imagen, los ajustes del equipo óptico y del programa de adquisición fueron los siguientes: λ excitación: 479nm Ventana: 1004x1002 pixeles Tiempo de exposición 0.067 segundos Ganancia electrónica: 50 Pre-Amplificación de la ganancia: 3.80 Profundidad en bits: 14 Tasa de adquisición de imágenes: 1Hz 8-Proceder como se indica en los protocollos gráficos de estimulación de doble pulso (Figura 8A de métodos). 9- Una vez finalizado el experimento, tomar una imagen en contraste de fase que servirá para ubicar los puncta de fluorescencia monitorizados durante el experimento y excluir regiones no sinápticas. Tomar varias imágenes a menor magnificación (40x y 20x) con objeto de reconstruir el máximo área posible del cubreobjetos, siempre identificando el campo de partida. 10-Desmontar cautelosamente la cámara de perfusión y recuperar el cubreobjetos con las células. 130 Material y métodos 11- Enjuagar en PBS 1x a 37ºC y proceder al protocolo de inmunocitoquímica detallado en la sección 2.4 de métodos. 12- Buscar en 20x el campo sobre el que se realizó el experimento de imagen, emplear para ello la reconstrucción llevada a cabo a partir de las imágenes del apartado 9 de este protocolo. 13- Aumentar la magnificación sobre el campo del experimento (60x) y tomar las imágenes de fluorescencia correspondientes al marcaje contra las proteínas de interés. 131 Material y métodos 3-Procesamientos informáticos 3.1- Inmunodetección en membranas Las imágenes se procesaron de forma semi-automatizada con el software incorporado con dispositivo de escaneo de membranas (Odyssey). Se procedió a la medida de la densidad integrada de una proteína de interés y de una proteína a la que relativizar el valor de esta primera (control de carga). Los distintos valores se normalizaron al valor del cociente obtenido a 3DIV, usando para ello el programa microsoft excel. 3.2- FM1-43 Se hizo uso del método semi-automatizado descrito por Bergsman (Bergsman et al., 2006) con ligeras modificaciones (Bartolome-Martin et al., 2012; Ramirez-Franco et al., 2013). Este método permite la selección automática de regiones cuyo comportamiento tras la estimulación es compatible con el de una región sináptica, atendiendo a tres características: I) la tasa de descarga del periodo de línea base (estabilidad de la señal); II) la relación señal/ruido de la línea base (ruido de la señal) y III) el grado de descarga tras la estimulación. Se detalla el procesamiento a modo de protocolo informático 1-Almacenar las imágenes obtenidas tras el paso 8 del protocolo 2.5.1.2 en un archivo *.tiff multidimensional. Descomponer en secuencia de imágenes en una carpeta con nombre conocido, renombrando las imágenes individuales desde cover001.tiff hasta covernnn.tiff. Guardar en esta misma carpeta la imagen obtenida en contraste de fase y renombrar como cel.tiff. 132 Material y métodos 2- Ejecutar la macro BatchImageProcess en IgorPro 6.31 y proceder como se detalla en la figura a continuación, una vez finalizado ejecutar "go" en el panel lateral. Figura 13- Consola de IgorPro empleada para el procesamiento semiautomatizado de los experimentos de FM1-43. 3- Una vez finalizado el procesamiento aparece una consola en la que debemos pulsar "leave folder alone", esta operación guarda una copia del experimento con el fondo sustraído automáticamente mediante una estrategia iterativa basada en el algoritmo de bola rodante (Sternberg, 1983). Acceder a Data> Browse waves > QualitySegment+ (nombre de la carpeta) y guardar una copia. Este es un archivo *.ibw que alberga la máscara binaria empleada posteriormente para analizar el experimento. 133 Material y métodos 4-Mediante el programa ImageJ, importar las imágenes procesadas automáticamente contenidas en una subcarpeta contenida la carpeta original del paso 1. Acceder a File> Import>Raw y proceder como se indica en la figura 14A (genera un *.tiff multidimensional). Importar también la máscara binaria obtenida en el paso 3, siguiendo las opciones en la figura 14B. Posteriormente, sobre la imagen que aparece ejecutar Process>Binary>Make binary. A partir de esta imagen hemos de generar un conjunto de regiones de interés (ROI's), para ello acceder a Analyze>Analyze particles y proceder como en la figura 14C. Figura 14- Opciones a marcar durante los distintos pasos descritos en el paso 4. 134 Material y métodos 5-Guardar el ROIset.zip que se genera, contiene la información de la máscara del experimento (More>Save). Ejecutar, sobre la secuencia de imágenes importada en el paso 4 More>Multi Measure lo que generará un archivo con los datos crudos (u.a.f.) de cada una de las regiones de la máscara. Pegar en una hoja de datos de Origin 8.0 y guardar este archivo. Figura 15- Campo a t0 de un experimento de FM1-43 (A) y máscara obtenida tras el análisis en IgorPro (B). Obsérvese en el detalle de C como las regiones encajan perfectamente en los puntos de fluorescencia. 135 Material y métodos 6-Normalizar los datos al valor inicial de fluorescencia con Microsoft Excel y representar en Origin 8.0 para su posterior procesamiento. Los cálculos relativos a valores de fluorescencia inicial se llevaron a cabo con el dato previo a la normalización. 7-Las determinaciones llevadas a cabo sobre los datos se recogen en la figura a continuación. Figura 16- Ajuste a decaimiento exponencial de primer orden de la cinética de descarga y cálculo del porcentaje de liberación, ambos llevados a cabo en OriginPro 8.0. La ventaja principal de este procesamiento es la mínima intervención del usuario y la definición automática de las regiones de interés, lo que lleva a una ausencia de pixeles 136 Material y métodos "muertos" en las regiones a analizar lo que lleva a minimizar la interferencia en los valores numéricos obtenidos. 8-Cuando se requirió, se midió la longitud total de axones presentes en el campo haciendo uso del plug-in "Neurite J" del programa ImageJ (Meijering et al., 2004) sobre la imagen obtenida en el paso 9 del protocolo 2.5.1.2. 3.3- VGluT1-pHluorina 1-Basándonos en la imagen obtenida tras el paso 6 del protocolo en 2.5.2.2, definir a mano las regiones de interés con el programa ImageJ. Restaurar la selección en un documento en blanco de las mismas dimensiones y generar una máscara binaria (Edit>Selection>Restore Selection; Edit>Draw; Edit>Fill; Process>Binary>Make Binary). Definir también al menos dos regiones de fondo en zonas ausentes de células. Generar el ROIset (Analyze>Analyze particles y proceder como en la figura 14C), y guardar. 2-Aplicar el ROIset sobre la imagen de partida y medir: More>Multi measure. Pegar los datos crudos en un documento de Origin 8.0 (figura 17A) y proceder a la sustracción del fondo mediante la sustracción de la media de los valores de cada una de las regiones libres de células (figura 17B). Sustraer a cada región el valor de su línea base, de este modo se confiere a la línea base el valor "0" (figura 17C). Posteriormente normalizar al valor máximo de fluorescencia obtenido tras la perfusión de NH4Cl, lo que conferirá a este punto el valor "1" (figura 17D), todas las operaciones sobre los datos crudos se 137 Material y métodos llevaron a cabo en Microsoft Excel. De este modo podemos medir nuestra señal como fracción de vesículas puestas en juego ante un estímulo determinado. Figura 17- Procesamiento matemático de los datos crudos obtenidos en VGluT-pHluorina. A) Datos crudos y región de fondo; B) Datos con el fondo sustraído; C) Datos cuya línea base se ha ajustado a 0 y D) Datos normalizados al máximo de fluorescencia. 3- Para la caracterización del fenómeno de silenciamiento elegimos como umbral un 4% de la respuesta máxima de fluorescencia, por encontrarse los niveles de ruido en nuestro sistema cercanos a este valor. 138 Material y métodos 3.4- FURA2-AM 1- Partiendo de la imagen obtenida en el paso 7 del protocolo 2.5.3.2, generar una máscara como se ha descrito previamente para FM1-43. Aplicar esta máscara sobre cada longitud de onda del experimento de imagen de calcio. Definir manualmente regiones de fondo para cada canal y sustraerlas al valor numérico de los datos haciendo uso de Microsoft Excel. 2- Obtener la señal ratiométrica de cada región por división de sus valores a 340nm entre los valores a 380nm. Normalizar a la línea base lo que le confiere a esta el valor 1 (Microsoft Excel). Representar en Origin 8.0 y analizar. 3.5- Inmunocitoquímica post-hoc 1-El procesamiento de FM1-43 es análogo al explicado en la sección 3.2 de este apartado. Alinear las imágenes de inmunocitoquímica de cada canal con la imagen de FM1-43 haciendo uso del plug-in "align RGB planes". 2-Aplicar la máscara sobre cada imagen de inmunorreactividad y guardar los valores. Normalizar en Origin a la media de inmunorreactividad de la población total. Conferir a cada respuesta un valor de inmunorreactividad y ordenar, en grupos de inmunorreactividad, las diferentes respuestas en Origin 8.0. Este protocolo se detalla en el anexo I. 139 Material y métodos 3.6- Inmunocitoquímica 1-Proceder de igual modo que en la figura 13. La imagen que debemos cargar ha de ser la imagen de inmunorreactividad deseada con el fondo sustraído. Tomar la precaución de ajustar "Baseline Starts:1; Ends:1" 2-Importar la máscara generada en ImageJ como se ha descrito previamente (Figura 14B). Aplicar esta máscara sobre las imágenes de inmunorreactividad y obtener los valores. Pegar en Origin 8.0, representar gráficos y procesar. 3.7-Microscopía electrónica Todas las medidas se realizaron con Image J y se multiplicó por el factor correspondiente para transformar el número de píxeles en nanometros. A 80.000x, el aumento empleado en la mayoría de los casos esta relación fue de 0,71 pixels/nm. 140 Material y métodos 3.8-Estadística y ajustes Adquisición de Imagen: Microscopía óptica: Andor IQ 1.9.1; Microscopía electrónica: Programa AnalySIS 5.0 de Olympus-SIS. Tratamiento de imágenes; ImageJ; Adobe PhotoShop CS3. Procesamiento de experimentos de FM1-43: IgorPro 6.31, Macro: Batch Image Process. Medidas de longitud total de neuritas: Extensión Neurite-J del programa ImageJ. Ajuste lineal (y=a+bx); Ajuste de decaimiento exponencial (y=y0+Ae-x/τ): Origin Pro 8.0. Test t-Student; Comparaciones múltiples ANOVA (con Bonferroni); Origin Pro 8.0. Distribución de probabilidad acumulada: Sigma Plot (versión 11.0) Test de Kolmogorov-Smirnov y análisis de conglomerados: Statgraphics Centurion XVI.I. Ilustración y Maquetación: Adobe Illustrator CS3. 141 142 143 IV- Resultados "La imposibilidad es fruto de tirar por la borda el afán" Pardoxus luporum 144   145 Resultados IV-Resultados 1-Diferencias en la eficacia de reciclamiento subyacen a la heterogeneidad de respuestas sinápticas en neuronas granulares de cerebelo en cultivo Mediante el uso de la sonda FM1-43 se puso de manifiesto que la eficacia de reciclamiento vesicular entre dos estimulaciones sucesivas de 5 minutos, espaciadas por un periodo de lavado de 10 minutos, exhibía una gran variabilidad si se analizaba el comportamiento de sinapsis individuales en redes de neuronas granulares de cerebelo en cultivo. La estimulación de la red neuronal por la perfusión de una solución hipercalémica genera un amplio repertorio de respuestas exocitóticas tanto en términos cinéticos como en términos de porcentaje de liberación (porcentaje de vesículas liberadas durante la primera estimulación que son susceptibles de ser exocitadas durante una segunda ronda de estimulación). Puesto que las células en que se analizan estas respuestas han sido sometidas a una primera ronda de estimulación, estas diferencias exocitóticas han de estar relacionadas con las diferentes eficacias de reciclamiento de las sinapsis individuales. En la figura 1A se ilustra un ejemplo de la heterogeneidad de respuestas individuales en lo que respecta a liberación vesicular en un único experimento, cuyo histograma de frecuencias queda recogido en la figura 1B. Tras llevar a cabo un análisis de conglomerados (del inglés clúster) y un ajuste a dos Gausianas sobre una población con un elevado número de sinapsis individuales (Figura 1D, N=7, n=1788), constatamos la existencia de dos subpoblaciones sinápticas segregables en función de su tasa de descarga de FM1-43. Tanto por medio del análisis de conglomerados como por medio del ajuste a dos gausianas, se estimó un valor umbral en torno al 40% de descarga y fue empleado posteriormente para segregar las respuestas individuales. Estas respuestas se clasificaron en un grupo de descarga fuerte, 146 Resultados  cuya liberación era superior al 40% de su fluorescencia inicial y en un grupo de descarga débil, con una liberación inferior al 40% de la fluorescencia inicial (Figura 1C). A 7 Días In Vitro (DIV), el porcentaje relativo de la sub-población de descarga fuerte suponía un 62,6 ± 4,9 %, mientras que la población de descarga débil era un 37,4 ± 4,9 % sobre el total de respuestas analizadas (Figura 1C, diagrama circular). Figura 1- Se muestra la distribución bimodal de respuestas exocitóticas individuales tras la estimulación con KCl 50mM (A) y el ajuste de un experimento individual a dos gaussianas (n=791) (B). El mismo procedimiento se llevó a cabo para una metapoblación de sinapsis (N=7, n=1788) (C) y se observó una distribución de frecuencias equivalente tras ajustar a dos gaussianas (D), el punto de corte entre las gaussianas (40% de descarga) fue empleado a posteriori para segregar los dos tipos de respuestas observadas. 147 Resultados Una vez caracterizadas las dos sub-poblaciones de respuestas, decidimos estudiar otros parámetros distintos al empleado para la segregación de estas que pudiesen guardar relación con la eficacia de reciclamiento. Se analizaron las fluorescencias iniciales, parámetro directamente proporcional al número de vesículas que han experimentado un proceso de reciclamiento (exo/endocitosis) durante la fase de carga con la sonda FM1- 43, y las constantes temporales (τ) de exocitosis, tras llevar a cabo un ajuste a un decaimiento exponencial de primer orden (y=y0+Ae-X/) sobre los datos cinéticos. Se observó que las menores eficacias de reciclamiento estaban siempre relacionadas con valores mayores de fluorescencia inicial, lo que pone de manifiesto que el contenido vesicular marcado en estas sinapsis durante la estimulación es mayor (Figuras 2A y 2B; Fl. inicial grupo de descarga fuerte = 14,1 ± 0,2, N=3, n=896 // Fl. inicial grupo de descarga débil = 19,2 ± 0,4, N=3, n=463; ANOVA p<0.01; K-S Test p<0.01). También se encontraron diferencias significativas en lo que respecta a las constantes temporales de exocitosis, siendo estas menores en el grupo de mayor tasa de liberación, lo que refleja que estas sinapsis son capaces de movilizar y exocitar su contenido vesicular de forma más rápida que las sinapsis del grupo de descarga débil (Figura, 2C y 2D; τ grupo fuerte = 11,4 ± 0,4 "; χ2 = 5,63 x 10-4// τ grupo débil = 15,4 ± 0,7 "; χ2 = 5,64 x 10-4). Al llevar a cabo un ajuste exponencial de segundo orden sobre las cinéticas de exocitosis (y=y0+A1e -X/ A2e -X/), se corroboró que las cinéticas de descarga seguía un patrón bifásico, lo que es coherente con lo previamente descrito por otros grupos de investigación (Klingauf et al., 1998; Mozhayeva et al., 2002). Las constantes temporales de estas dos componentes de liberación fueron las siguientes: τ1 grupo de descarga fuerte = 9,6 ± 0,6 s; τ2 grupo de descarga fuerte = 91,2 ± 11,4 s; χ2 = 1,05 x 10-4 // τ1 grupo de descarga débil = 16,8 ± 3,0 s; τ2 grupo de descarga débil = 113 ± 148 Resultados  23,4 s; χ2 = 1,99 x 10-4, constatándose de nuevo la menor velocidad de exocitosis del grupo de descarga débil en ambos componentes de la descarga. En cualquier caso se observó que ambos grupos de sinapsis poseían un componente rápido de liberación de vesículas ante la llegada de la estimulación. Puesto que la incorporación inicial de sonda fue inducida mediante un protocolo que afecta de forma homogénea a todas las sinapsis presentes en un campo, las diferencias exocitóticas observadas son exclusivamente atribuibles a la heterogeneidad en la eficacia de reciclamiento. Figura 2- Distribución de probabilidad acumulada de las fluorescencias iniciales de cada tipo de sinapsis (A) y comparación de medias (B). El ajuste cinético de las respuestas medias de cada uno de los grupos se muestra en (C) y la comparación de las constantes de decaimiento promediadas promedio se muestra en (D). (**p<0,01 K-S Test en A; ANOVA con Bonferroni en B y D) 149 Resultados Para descartar un posible efecto de la exocitosis espontánea que tiene lugar durante el tiempo de lavado de la sonda (10 minutos en condiciones control) sobre la eficacia de reciclamiento, se diseñó una serie de experimentos consistentes en variar los tiempos de lavado, tras el periodo de carga con FM1-43. Además, se analizó el efecto del calcio extracelular en la solución de lavado (0 mM o 1,33 mM). Figura 3- Fluorescencias iniciales (A) y porcentajes de descarga (B) de cada uno de los grupos a distintos tiempos de lavado en distintas concentraciones de calcio (**p<0,01, Prueba t de Student; en B no se muestra significación por haber sido ambos grupos segregados manualmente imponiéndose un umbral arbitrario). No se encontraron diferencias entre los porcentajes de botones pertenecientes a cada grupo en las distintas condiciones, ni entre los porcentajes de descarga de cada uno de los grupos (Figura 3B) encontrándose únicamente diferencias significativas en las fluorescencias iniciales entre los grupos con distintos tiempos de lavado, pero manteniéndose las diferencias relativas entre grupos en una misma condición de lavado 150 Resultados  (Figura 3A), lo que indicaba que una mayor tasa de exocitosis espontanea en los botones de descarga fuerte no era la responsable de las diferencias cinéticas observadas. El efecto del calcio sólo fue apreciable en los botones de baja eficacia de reciclamiento en tiempos cortos de lavado, si bien es cierto que fue el contrario al esperado, pues se relacionó con una mayor fluorescencia inicial (Figura 3B). Debido a que no se encontraron diferencias significativas al emplear distintos tiempos de lavado ni distintas concentraciones de calcio, las condiciones de lavado escogidas para el resto de experimentos fueron de 10 minutos en ausencia de calcio extracelular. 2- La magnitud del evento exocitótico determina la eficacia de reciclamiento Nuestro siguiente objetivo fue analizar en qué medida, las diferencias en la eficacia de reciclamiento estaban relacionadas con la magnitud del estímulo exocitótico que desencadenó la incorporación de la sonda FM1-43 en el interior de las vesículas sinápticas. Para ello llevamos a cabo una serie de experimentos a distintas concentraciones de calcio extracelular (desde 0,25 hasta 1,33 mM) con objeto de disminuir el número de vesículas exocitadas durante la fase de carga. Se observó una reducción dramática del porcentaje de botones que exhibían un reciclamiento poco eficaz al emplear bajas concentraciones de calcio durante la fase de carga (Figuras 4A, 4B y 4C diagramas circulares; 40,1 ± 6,3% a 1,33mM CaCl2; 25,9 ± 10% a 0,5mM CaCl2 [ p>0,05]; 12,5 ± 3,9% a 0,25mM CaCl2 [p<0,01]; ANOVA), este aumento de la eficacia de reciclamiento no estaba acompañado por una disminución en la densidad de botones por unidad de longitud (Figura 4F 0,055 ± 0,01 a 1,33 mM CaCl2; 0,075 ± 0,002 a 0,5 mM CaCl2; 0,055 ± 0,010 a 0,25 mM CaCl2 expresado en sinapsis/μm; p>0,05, ANOVA) y por tanto indicaba un cambio en la eficacia de reciclamiento 151 Resultados vesicular inversamente proporcional a las intensidades de estimulación. Además del aumento en el porcentaje de sinapsis cuya eficacia de reciclamiento era mayor, se observó un aumento del porcentaje de liberación en ambos grupos de descarga, lo que guarda relación con un aumento global de la eficacia de reciclamiento al emplear menores intensidades de estimulación (Figuras 4A-C, 4E y 4F Grupo de descarga fuerte 1,33mM=54,98±0,35%, N=3, n=623; 0,50mM=56,67±0,32%, N=4, n=1045 [p<0,01]; 0,25mM= 64,17±0,31%, N=4, n=1040 [p<0,01] // Grupo de descarga débil 1,33mM=36,10±0,34%, N=3, n=586; 0,50mM = 35,38±0,41%, N=4, n=361 [p>0,05]; 0,25mM=41,08±0,72%, N=4, n=148 [p<0,01], comparado a la condición control, ANOVA). Por tanto el mecanismo que limitaba la eficacia de reciclamiento no se manifestaba al emplear bajas concentraciones de calcio durante la fase de carga. Figura 4- Patrones de descarga y porcentaje relativo de cada tipo de botones (diagramas circulares) a 1,33mM Calcio (A); 0,5mM Calcio (B) y 0,25mM Calcio (C) durante la fase de carga con FM1-43. Distribución de probabilidad acumulada de los porcentajes de descarga (D) y valor medio (E) para cada una de las subpoblaciones a distintas concentraciones de calcio extracelular durante el periodo de carga. (F) Densidad de botones sinápticos (nº de botones/ μm) **p<0,01; ANOVA con Bonferroni. 152 Resultados  3- Bajas concentraciones de FM1-43 marcan selectivamente las vías de reciclamiento ineficaz Se han descrito diferencias en lo referente a la hidrofobicidad relativa de las membranas recaptadas tras la estimulación en las distintas formas de endocitosis (Clayton y Cousin, 2008). Con el objetivo de averiguar si las formas de reciclamiento ineficaz estaban asociadas a estas vías de endocitosis, decidimos llevar a cabo una aproximación consistente en la disminución de los niveles de sonda FM1-43 durante el periodo de carga, asumiendo que la disminución de las concentraciones de sonda daría lugar a una incorporación selectiva de la sonda en membranas más hidrofóbicas. La disminución de los niveles de sonda produjo un cambio dramático en los porcentajes relativos de cada uno de los tipos de botones, aumentando el porcentaje de aquellos que mostraban una baja eficacia de reciclamiento vesicular (Figura 5A; 26,1 ± 7,6 % a 10μM de FM1-43; 72,1 ± 3,9 % a 5μM de FM1-43 [p>0,01] y 89,7 ± 6,1 a 3μM de FM1-43 [p<0,01]) así como una disminución de la fracción de fluorescencia liberada en ambos tipos de sinapsis (Figura 5B; 59,7 ± 0,2 % y 39,2 ± 0,1% a 10 μM FM1-43; 53,0 ± 0,7% y 36,9 ± 0,53 % a 5 μM FM1-43 [p<0.001] y 47,5 ± 1,8% y 29.6 ± 0.6 % a 3 μM FM1-43 [P<0.001] ANOVA frente al control). Esta reducción de la eficacia de reciclamiento se vio acompañada de una reducción de la densidad de botones (Figura 5C; 0,054 ± 0,01 a 10 μM FM1-43; 0,020 ± 0,002 a 5 μM FM1-43 [p<0,05] y 0,014 ± 0.0019 a 3 μM FM1- 43, [p<0,05], ANOVA), lo que indica que a diferencia de la modificación de las concentraciones de calcio, la modificación de las concentraciones de sonda no generaba un cambio en la eficacia de reciclamiento de los botones, sino que más bien marcaba preferentemente aquella subpoblación de botones con una baja eficacia de reciclamiento, lo que quedó reflejado en un cambio virtual del comportamiento cinético 153 Resultados de las sinapsis estudiadas y en una disminución del número de botones en la unidad de longitud. Figura 5- A) Se ilustran los patrones de descarga, así como los porcentajes relativos (diagramas circulares) de cada uno de los grupos de respuesta a 10 μM (Azul), 5 μM (Rojo) y 3 μM (Negro) de FM1- 43 durante la fase de incorporación de la sonda en las vesículas sinápticas. (B) Gráfico de probabilidad acumulada de descarga de los distintos grupos a diferentes concentraciones de sonda. (C) porcentaje de botones por μm de fibra axónica al emplear diferentes concentraciones de sonda durante la carga. El código de colores empleado en 5B y 5C es el mismo que en la figura 5A. 154 Resultados  4-El reciclamiento ineficaz de las vesículas sinápticas está asociado a formas lentas de endocitosis Las diferente susceptibilidad al marcaje de los distintos grupos de botones sinápticos al emplear concentraciones decrecientes de FM1-43 puede explicarse por tres motivos principalmente: i) una mayor hidrofobicidad de las membranas endocitadas en estos terminales; ii) una mayor superficie de membrana de los orgánulos endocitados en este tipo de terminales tras la estimulación y iii) una menor velocidad de cierre de poro y fisión de las vesículas u orgánulos endocitados en este tipo de terminales, lo que favorecería la unión de la sonda, a bajas concentraciones, a aquellas membranas que estén más tiempo expuestas a la solución extracelular. Para dilucidar cuál de estos factores contribuía mayoritariamente a las diferencias cinéticas observadas a bajas concentraciones de sonda, diseñamos un experimento en el que la sonda no estaba presente en la solución de estimulación, de manera que solo aquellas formas de endocitosis que persistieran después de la estimulación pudiesen incorporar sonda en el lumen de los orgánulos endocitados; a este protocolo se le denominó protocolo de carga asincrónica de FM1-43. Se encontraron diferencias en el porcentaje relativo de cada uno de los tipos de botones, produciéndose una inversión de los porcentajes típicos de las condiciones control, lo que se manifestó en un aumento drástico del porcentaje de botones con patrón de descarga débil (Figura 6A; Descarga débil: 38,5 ± 4,8% en control; 76,9 ± 6,0 en carga asincrónica; p<0,01, Prueba de t de Student). Además se vio reducido el número de botones marcados en la unidad de longitud (Figura 6C, Control: 0,047 ± 0,003 botones/μm; Asincrónica: 0,031 ± 0,005 botones/μm; p<0,01 Prueba t de Student), lo que, al igual que al emplear concentraciones decrecientes de sonda, está indicando una diferencia en el número de botones que exhibe mecanismos endocitóticos 155 Resultados asociados a un reciclamiento vesicular ineficaz, pero no un cambio en el comportamiento exo/endocitótico de los botones presentes en la preparación. Figura 6- Patrón de descarga y porcentajes relativos de cada uno de los grupos en las distintas condiciones de carga con FM1-43. En (A) se muestran las condiciones de carga control y en (B) el patrón de descarga tras la carga asincrónica con FM1-43. En (C) se indican la densidad de botones por unidad de longitud (**p<0,01, Prueba t de Student). 5-Papel de la dinamina en las distintas formas de reciclamiento vesicular La endocitosis compensatoria de las vesículas sinápticas que tiene lugar gracias al reciclamiento mediado por clatrina es completamente dependiente de la enzima dinamina. En nuestra preparación, la inhibición de la actividad de esta enzima por la incubación (previa a la carga con FM1-43) con el inhibidor selectivo de su actividad GTPasa, el dynasore (20µM, 30 min.) (Macia et al., 2006; Newton et al., 2006), no dio lugar a una ausencia de incorporación de sonda en los terminales analizados, al emplear concentraciones fisiológicas de calcio durante el periodo de carga (1,33mM), indicando que había formas de reciclamiento coexistentes con la endocitosis mediada por clatrina en una subpoblación de terminales sinápticos. Al llevar a cabo este mismo tipo de experimentos a bajas concentraciones de calcio durante la fase de carga con FM1-43 (0,25mM), encontramos una ausencia total de incorporación de FM1-43 en los 156 Resultados  terminales estudiados, lo que indicaba que la estimulación en presencia de distintas concentraciones de calcio activaba distintas formas de endocitosis sináptica, diferencialmente acopladas al reciclamiento eficiente de vesículas sinápticas, como se muestra en la figura 7, y con distinta dependencia de la actividad GTPasa de la dinamina (Figuras 7A y 7B). Estas diferencias endocitóticas se manifestaron al analizar las fluorescencias iniciales de aquellas zonas de los axones que habían incorporado FM1-43 en ambas condiciones, lo que quedó reflejado tanto en el valor medio, como en la distribución de probabilidad acumulada de estas fluorescencias (Figuras 7C y 7D; Dynasore 0,25 mM Calcio: 2,22 ± 0,11 u.a.f. de FM1-43, N=5, n=86; Dynasore 1,33 mM Calcio: 5,42 ± 0,55 u.a.f. de FM1-43, N=4, n=111; [p<0,01] ANOVA y K-S test). Además se observó un cambio en la distribución de probabilidad acumulada de las fluorescencias iniciales al emplear distintas concentraciones de calcio durante la carga en condiciones control (sin interferir con la actividad GTPasa de la enzima) (Figura 7C y 7D Control 0,25 mM Calcio: 14,76 ± 0,30 u.a.f. de FM1-43, N=3, n=488; Control 1,33mM Calcio: 19,42 ± 0,49 u.a.f. de FM1-43, N=3, n=615; [p<0,01] ANOVA y K-S test). También encontramos deficiencias en la eficacia de reciclamiento exhibida por aquellos terminales que habían incorporado sonda a concentraciones fisiológicas de calcio de forma dinamina-independiente, ya que estos terminales no mostraron ningún tipo de respuesta exocitótica en una segunda ronda de despolarización sostenida, como demuestra su paralelismo con una cinética obtenida al realizar un experimento en presencia del quelante de calcio EGTA (100µM) en presencia de 50µM CaCl2. Además, esta deficiencia de reciclamiento manifestada en una ausencia de exocitosis durante una segunda ronda de estimulación, quedó reflejada en un descenso dramático del porcentaje de liberación de FM1-43en aquellos terminales que habían incorporado sonda en presencia de Dynasore (Control 1,33 mM Calcio: 48,82 ± 1,00 %; Dynasore 157 Resultados 1,33mM Calcio: 11,31 ± 1,01 %; [p<0,01] ANOVA). Estos resultados ponen de manifiesto que las formas de endocitosis asociadas a un reciclamiento eficiente de las vesículas sinápticas son dependientes de la actividad GTPasa de la dinamina, mientras que aquellas vías de recuperación de membrana dinamina-independientes no generan vesículas susceptibles de ser liberadas en una segunda ronda de estimulación (Figura 7E y 7F). Para caracterizar en detalle la independencia de la dinamina de las rutas de endocitosis que acompañan al reciclamiento ineficaz, se hizo uso de un inhibidor de la enzima cuyo mecanismo de acción no es la inhibición del centro activo de esta (actividad GTPasa) si no la unión a su dominio PH, interfiriendo de este modo en el posicionamiento de la enzima en la membrana, por competir con la fosfatidil serina en la unión a dicho dominio. Este compuesto recibe el nombre de MiTMAB (del inglés Myristyl TriMethyl Ammonium Bromide) (Quan et al., 2007). La incubación con este compuesto fue previa al periodo de carga (5µM, 10 min.). De forma inesperada, se observó una ausencia total de endocitosis compensatoria tras el uso de MiTMAB (Figura 8A), lo que impidió por tanto el análisis de la posterior respuesta exocitótica (Figura 8B). Este hecho se vio reflejado en una disminución drástica de los valores de fluorescencia inicial de FM1-43 (Figura 8Cy 8D; Control: 44,45±0,79 u.a.f. de FM1-43, N=2, n=1702; MiTMAB: 13,14±0,52 u.a.f. de FM1-43, N=3, n=377; p<0,01, ANOVA) en posibles regiones sinápticas y en una disminución de la relación señal/ruido, que impidió el análisis posterior de respuestas exocitóticas. Las diferencias observadas al emplear dos tipos de inhibidores de la dinamina son atribuibles a los distintos mecanismos de acción de estos compuestos: mientras que la actividad GTPasa de la dinamina no parece crucial para mediar la internalización de FM1-43 asociada a reciclamiento ineficiente tras la estimulación a concentraciones fisiológicas de calcio, su localización en membrana parece indispensable para ambas formas de reciclamiento. 158 Resultados  Figura 7- Efecto de la inhibición de la actividad GTPasa de la dinamina sobre la eficacia de reciclamiento. En A y B se compara el aspecto de marcaje con FM1-43 a distintas concentraciones de calcio y en presencia o ausencia de Dynasore. En C se comparan las distribuciones fluorescencias iniciales de los botones en ausencia y presencia de Dynasore a distintas concentraciones de calcio, valores promedio en D. E) Ausencia de reciclamiento (por ausencia de exocitosis) de los botones que han internalizado FM1-43 durante una estimulación con calcio 1,33 mM en presencia de Dynasore; F) Distribución de los porcentajes de descarga histogramas) y valores promedio (columnas) de los botones que habían internalizado FM1-43 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de dynasore (**, p<0,01; K-S test en C; ANOVA con Bonferroni en E). 159 Resultados Figura 8- A) Efecto del MiTMAB sobre la incorporación de FM1-43. B) El aumento de la relación señal- ruido impidió la normalización y por tanto el análisis de las respuestas exocitóticas. C) Distribución de probabilidad acumulada y medias (D) de las fluorescencias iniciales de FM1-43(** p<0,01; K-S test en C y ANOVA con Bonferroni en D). 160 Resultados  6- Contribución diferencial de la calcineurina a las distintas formas de reciclamiento La calcineurina ha sido propuesta como la enzima responsable de acoplar la endocitosis compensatoria a la entrada de calcio en el terminal presináptico, actuando como sensor de calcio gracias a su activación calmodulina-dependiente y promoviendo la desfosforilación de determinadas proteínas que experimentan ciclos de fosforilación/desfosforilación paralelos a los cambios en las concentraciones de calcio que acontecen en el terminal presináptico. Estas desfosforilaciones parecen ser requeridas para las interacciones que han de establecerse entre los distintos factores endocitóticos (Cousin y Robinson, 2001; Wu et al., 2009; Saheki y De Camilli, 2012). Para evaluar en qué medida la actividad de la calcineurina estaba implicada en las distintas formas de endocitosis de las SVs observadas en este estudio, decidimos llevar a cabo un ensayo en presencia de FK-506 (Ochiai et al., 1987), un inmunosupresor que al unirse a su inmunofilina, FK-506-BP (del inglés, FK-506 Binding Protein), tiene un efecto inhibidor de la calcineurina (Liu et al., 1991). Al incubar con FK-506 1µM durante los 30 minutos previos a la carga y durante la carga con FM1-43, encontramos un marcado desplazamiento hacia las formas ineficaces de reciclamiento, lo que quedo reflejado tanto en el porcentaje relativo de grupos de botones (Figura 9A y 9B; Control, descarga fuerte: 71,56±7,81%; FK-506, descarga fuerte:24,43±2,77% // Control descarga débil: 28,44±7,81%; FK-506, descarga débil:75,57±2,77%; p<0,01 Prueba t de Student; Control, N=4, n=882; FK-506, N=6, n=993) como en la cinética media de descarga durante una segunda ronda de estimulación (Figura 9C). Además, se comprobó que la densidad de botones en estas condiciones era equiparable a la encontrada en las condiciones control (Figura 9D; Control: 0,045±0,003 botones/µm; FK-506: 0.039±0,002 botones/µm; p>0,05, Prueba t de Student) , lo que nos permitió concluir 161 Resultados que la inhibición de la calcineurina generaba un cambio en el comportamiento endocitótico de la totalidad de los botones, sin producir una disminución en el número de botones totales marcados por la sonda. Además, las formas de endocitosis asociadas con un reciclamiento eficaz de las vesículas sinápticas (presumiblemente endocitosis mediada por clatrina) parecen más sensibles a la inhibición farmacológica de la enzima calcineurina. Figura 9- Comparación de las cinéticas de descarga y de los porcentajes relativos de los grupos de botones en condiciones control (A) y tras la inhibición farmacológica de la calcineurina con FK-506 (B). En C se muestran las cinéticas promedio de descarga en las distintas condiciones, la menor eficacia de reciclamiento tras la inhibición de la calcineurina con FK-506 se manifestó en un porcentaje de liberación menor durante la segunda ronda de estimulación. En D se muestran las densidades de botones marcados con FM1-43 en ambas condiciones. (** p<0,01; n.s. no significativo; prueba t de Student) 162 Resultados  7- El fenómeno de "Kiss&Run" no está implicado en las formas ineficaces de reciclamiento Los experimentos realizados en presencia de MiTMAB y Dynasore pusieron de manifiesto que determinadas formas de endocitosis independientes de la acción GTPasa de la dinamina, desencadenadas ante estimulaciones persistentes a concentraciones fisiológicas de calcio, eran en parte responsables del reciclamiento ineficiente de vesículas sinápticas. Por otra parte, se ha descrito que la estimulación neuronal a elevadas frecuencias pone en marcha mecanismos de "kiss & run" (Ales et al., 1999; Stevens y Williams, 2000; Park et al., 2012). Estos mecanismos se descubrieron en el año 2000 (Stevens y Williams, 2000) y se caracterizan porque a pesar de registrarse una respuesta postsináptica normal, al emplear sondas estirílicas, era imposible detectar una caída de fluorescencia atribuible a la exocitosis presináptica (o internalización de la sonda por el mismo motivo). Se ha descrito que el azul de bromofenol 2mM (BPB, por sus siglas en inglés, BromoPhenol Blue), por sus características espectrales, actúa como una molécula capaz de absorber la fluorescencia emitida por la sonda FM1-43, lo que permite detectar la exocitosis atribuible al fenómeno de "kiss&run" mediante FM1-43 (Harata et al., 2006), ya que a pesar de que el poro de fusión que se origina durante el "kiss&run" no permite la salida de la sonda, dado que la molécula de BPB es del mismo tamaño que la de un neurotransmisor, este sí puede entrar en el lumen de las vesículas, originando allí un apagamiento de la fluorescencia remanente de FM1-43. Corroboramos un aumento de la tasa de descarga, tanto del valor medio como de la distribución de la población (Control = 44,73±0,34, N=4, n=1288; BPB = 57,63±0,28, N=5, n=1353; p<0,01; ANOVA, K-S test), así como una inversión marcada de los porcentajes relativos de cada uno de los grupos de descarga (Control Descarga débil: 41,66±3,25%; BPB Descarga débil: 11,08±5,73%, p<0,01 Prueba t de Student). Sin 163 Resultados embargo, no se encontraron diferencias cinéticas significativas entre los distintos grupos para sus constantes temporales de decaimiento, lo que indica que la velocidad de la exocitosis no se vio modificada al emplear BPB durante la estimulación (Descarga fuerte control = 17,4±1,3s//Descarga fuerte BPB = 17,97±1,46s; Descarga débil control = 21,56±1,29s// Descarga débil BPB = 24,19±1,73s, p>0,05, ANOVA). Al analizar las fluorescencias iniciales de cada uno de los grupos en las distintas condiciones (ha de tenerse en cuenta que el BPB comienza a ser perfundido antes del inicio del experimento) se constató una disminución de la fluorescencia inicial de los botones clasificados como de descarga débil y una ausencia de efecto sobre las fluorescencias iniciales de descarga fuerte (Control descarga fuerte: 9,70±0,14 u.a.f. de FM1-43; BPB descarga fuerte: 9,31±0,11 u.a.f. de FM1-43; p>0,05; Control de descarga débil: 13,78±0,25 u.a.f. de FM1-43; BPB descarga débil: 11,11±0,39 u.a.f. de FM1-43; p<0,01 ANOVA). El cambio en las fluorescencias iniciales, junto con la ausencia de efecto en las constantes temporales de exocitosis, nos llevó a concluir que el efecto observado en lo relativo al aumento de la tasa de liberación (y por tanto la inversión en el porcentaje relativo de botones) en la condición de BPB, era atribuible a una disminución de las fluorescencias iniciales relacionado con el mantenimiento del contacto físico de algunas cisternas endocitóticas con el espacio extracelular, lo que posibilitaría el acceso del BPB pero no permitiría que la sonda se lavase en condiciones normales. En cualquier caso, la contribución del fenómeno de "kiss&run" es cuanto menos discutible ya que el mismo argumento empleado para explicar la ausencia de lavado de la sonda del interior luminal de aquellas vesículas que experimentan este tipo de procesos, es aplicable al proceso inverso, lo que imposibilitaría su incorporación en la vesícula durante la carga. Más adelante se discutirán exhaustivamente estos resultados y la posible implicación del fenómeno de "kiss&run" en nuestra preparación. 164 Resultados  Figura 10- Cinéticas de descarga en la condición control (rojo) y en la condición BPB (azul) (A) y distribución de probabilidad acumulada de los porcentajes de liberación (B) en ambas condiciones. En (C) y (D) se muestran los porcentajes relativos de botones en cada condición. (E) Comparación de las medias de fluorescencia inicial en cada uno de los grupos, en F) se muestran las distribuciones de probabilidad acumulada de las fluorescencias iniciales de cada grupo (**p<0,01; K-S test en B y F; ANOVA con Bonferroni en D). 165 Resultados 8- Análisis ultraestructural del ciclo vesicular sináptico: las formas ineficaces de reciclamiento están asociadas a endocitosis en masa Con el objeto de dilucidar qué tipo de orgánulos estaban asociados a las formas ineficaces de reciclamiento, decidimos llevar a cabo experimentos de microscopía electrónica en aquellas condiciones que provocaron un efecto drástico en nuestra preparación (bien referido a parámetros cinéticos o referido a parámetros de fluorescencia inicial). Por ello se eligieron las siguientes seis condiciones: i) Control en reposo (sin estimular), empleado para las comparaciones estadísticas; ii) Control estimulado (ClCa2 1,33mM); iii) Control estimulado (CaCl2 0,25mM); iv) Dynasore en reposo; v) Dynasore estimulado (CaCl2 1,33mM); vi) Dynasore estimulado (CaCl2 0,25mM). Se analizó el número total de orgánulos, clasificándose estos en función de su diámetro como vesículas sinápticas (<40nm diámetro) o como endosomas (>40nm diámetro), y analizándose entre 15 y 20 terminales por condición. En condiciones control, en ausencia de estimulación, los terminales analizados se mostraban exclusivamente poblados por vesículas sinápticas pequeñas (n=20, 35±7 SVs/terminal) y carentes de endosomas terminales en la mayoría de los casos (n=20, 0,45±0,13 endosomas/terminal) lo que no difería de la pre-incubación con dynasore (n=19, 36,0±6,0 SVs/terminal [p>0,05]; 0,32±0,11 endosomas/terminal [p>0,05], ANOVA con Bonferroni). En condiciones control, la estimulación neuronal daba lugar a distintos efectos ultraestructurales en función de la concentración de calcio empleada. Encontramos que la estimulación a concentraciones fisiológicas de calcio (1,33mM CaCl2) desencadenaba la acumulación de endosomas, en detrimento del número de SVs, lo que indicaba una relación exo/endocitótica entre estos dos tipos de orgánulos (n=20, 22,0±5,0 SVs/terminal [p>0,05]; 5,0±1,0 endosomas/terminal [p<0,01], ANOVA con Bonferroni). De forma acorde a lo esperado teniendo en cuento los datos cinéticos, 166 Resultados  encontramos que la estimulación a bajas concentraciones de calcio (0,25mM CaCl2) no provocaba la aparición de los mencionados endosomas terminales (n=18, 33,0±4,0SVs/terminal [p>0,05]; 0,6±0,2 endosomas/terminal [p>0,05] ANOVA con Bonferroni). Estos resultados pusieron de manifiesto que en condiciones control, la estimulación persistente con altas concentraciones de calcio activaba mecanismos de endocitosis consistentes en la recuperación de grandes fracciones de membrana, y que estos mecanismo coexistían con la endocitosis mediada por clatrina. A bajas concentraciones de calcio estos mecanismos no se activaban, lo que indicaba que la magnitud del estímulo era un factor clave en el desencadenamiento de uno u otro tipo de endocitosis. En presencia del inhibidor de la actividad GTPasa de la dinamina, la estimulación con concentraciones fisiológicas de calcio (1,33mM CaCl2) dio lugar a un vaciamiento de vesículas sinápticas, concomitante con la aparición de estructuras endosomales (n=22, 7,0±2,0 SVs/terminal [p<0,01], 5,0±1,0 endosomas/terminal [p<0,01], ANOVA con Bonferroni) cambiando de forma drástica la apariencia ultraestructural de los terminales presinápticos analizados. Al disminuir el calcio en la solución de estimulación (0,25mM CaCl2) en presencia de Dynasore, encontramos una reducción en el número de vesículas sinápticas que no era paralela a la aparición de cisternas endocitóticas tipo endosoma (n=15, 10,0±2,0 SVs/terminal [p<0,01], 1,0±0,5 endosomas/terminal [p>0,05], ANOVA con Bonferroni). Estos resultados indican i) que las estructuras responsables de la internalización dinamina-independiente de FM1-43 a concentraciones fisiológicas de calcio son endosomas, este hecho da cuenta de su baja eficacia de recilamiento; ii) que la intensidad de estimulación es crucial a la hora de determinar qué mecanismos de recuperación de membrana se activan y iii) que ambas vías de endocitosis pueden coexistir en un mismo terminal presináptico. 167 Resultados El agotamiento de las vesículas de los terminales estimulados a bajas concentraciones de calcio en presencia de Dynasore es compatible con un defecto neto de la recuperación de membrana, por ser todas las formas de endocitosis activadas en estas condiciones dinamina-dependientes, y con la ausencia de marcaje con FM1-43 observado en los experimentos funcionales. Además en esta última condición, las vesículas remanentes del terminal presináptico se encontraban a una gran distancia de la zona activa, lo que es compatible con un agotamiento de las vesículas del "pool" de reciclamiento, asumiendo la hipótesis de que son factores posicionales los que determinan la pertenencia a uno u otro "pool" de vesículas sinápticas (Park et al., 2012). Los endosomas encontrados al estimular con alto calcio darían cuenta de la baja eficacia de reciclamiento exhibida por algunos botones (descarga débil) de la condición control y de la ausencia de descarga tras una segunda ronda de estimulación observada en aquellos terminales que habían internalizado FM1-43 en presencia de Dynasore. El análisis de los campos individuales mostró heterogeneidad en la presencia de endosomas en la condición de estimulación con 1,33mM CaCl2 en condiciones control lo que de nuevo es compatible con la variedad de respuestas encontradas al realizar experimentos funcionales; sin embargo, la presencia de endosomas era más homogénea en el caso de los terminales estimulados en presencia de Dynasore, lo que de nuevo es compatible con la ausencia de reciclamiento mostrada por los terminales presinápticos en esta condición. Además, en condiciones de alta eficacia de reciclamiento (Control estimulado en 0,25mM CaCl2) los terminales analizados se encontraban poblados homogéneamente por vesículas sinápticas, indicando que son estas últimas las que dan cuenta de una eficacia de reciclamiento elevada. 168 Resultados  169 Resultados ←Figura 11- Ultraestructura de los terminales en reposo en la condición control (Aa) y tratados con Dynasore (Ab). La estimulación con 1,33mM CaCl2 en control (Ac) dio lugar a la coexistencia de ambos tipos de orgánulos (SVs y endosomas) y a la acumulación de endosomas tras el tratamiento con Dynasore (Ad). La estimulación con 0,25mM CaCl2 no dio lugar a la generación de endosomas en condiciones control (Ae) y sólo provocó un agotamiento de vesículas tras tratar con Dynasore (Af), obsérvese que las SVs más alejadas de la zona activa no se consiguieron movilizar. Barra de escala: 200nm en todos los casos. B) Cuantificación de los datos ultraestructurales, se analizaron el número de SV´s, de endosomas y de orgánulos totales [n.s., no significativo;**p<0,01 vs Control Basal; #p<0,05 vs Dynasore 1,33mM CaCl2] ANOVA con Bonferroni; C) Cociente entre el número de endosomas y el de SV's en las distintas condiciones, [n.s., no significativo **p<0,01 vs Control Basal; #p<0,05 vs Dynasore 1,33mM CaCl2] ANOVA con Bonferroni.//↑ Figura 12- Número de vesículas sinápticas (A) y de endosomas (B) encontrado en cada uno de los botones analizados. Cada unidad en "x" corresponde a una sinapsis individual, equivalente en A y en B, obsérvese que en la condición control estimulado con alto calcio existe una heterogeneidad en lo que al contenido de orgánulos del terminal presináptico se refiere, coherente con las respuestas funcionales encontradas, mientras que en la condición de Dynasore estimulado con alto calcio, la distribución de endosomas es homogénea entre todos los botones estudiados. 170 Resultados  9-La eficacia de reciclamiento como marcador de la maduración neuronal Para estudiar la potencial existencia de una relación entre el grado de maduración de un cultivo neuronal y la eficacia de reciclamiento sináptico, decidimos caracterizar el patrón de maduración exhibido por las neuronas granulares de cerebelo, analizando para ello la expresión de distintas proteínas sinápticas a distintos días in vitro (3, 7 y 14 DIV), así como otros parámetros relacionados con la adquisición de competencias exo/endocitóticas plenas tales como las fluorescencias iniciales exhibidas por las distintas sinapsis de la preparación, lo que se relaciona con su contenido vesicular total (Mozhayeva et al., 2002). Las proteínas escogidas para el análisis de su expresión fueron: Dinamina, Sintaxina, Sinaptojanina y Sinapsina, empleándose como control de carga Gliceraldehído Fosfato Deshidrogenasa (GAPdh) o β-Tubulina. Encontramos que la maduración neuronal promovía un incremento de expresión de las proteínas sinápticas analizadas, al normalizar estos valores al encontrado a 3DIV (Figura 13A). El principal aumento de expresión tenía lugar entre 3 y 7DIV (Figura 13B), estabilizándose posteriormente los niveles de expresión de las proteínas estudiadas. Los niveles de expresión de las distintas proteínas a distintos días in vitro, así como los valores de significación estadística, se recogen en la tabla 1. De forma paralela encontramos un aumento global de los niveles de fluorescencia inicial en ambos grupos de descarga (Figura 13C, Descarga fuerte; 3DIV: 7,05±0,26 u.a.f. FM1-43; 7DIV: 13,27±0,21 u.a.f. de FM1-43 [p<0,01]; 14DIV: 23,69±0,25 u.a.f. de FM1-43 [p<0,01]; Descarga débil; 3DIV: 8,85±0,47 u.a.f. de FM1-43; 7DIV: 15,43±0,39 u.a.f. de FM1-43 [p<0,01]; 14DIV: 31,15±0,50 u.a.f. de FM1-43 [p<0,01]; ANOVA con Bonferroni, vs 3DIV en cada grupo), lo que es indicativo del aumento total del pool de vesículas sinápticas a lo largo de la maduración del cultivo, resultados acordes a los publicados previamente (Mozhayeva et al., 2002). 171 Resultados Figura 13- A) Estudio del patrón de expresión de distintas proteínas sinápticas mediante inmunodetección de extractos obtenidos a partir de células de 3, 7 o 14 Días In Vitro. B) Cuantificación de los datos obtenidos tras normalizar al valor de 3DIV, obsérvese que tras 7DIV seestabilizaron los niveles de expresión de las distintas proteínas analizadas. C) Distribución de probabilidad acumulada de las fluorescencias iniciales de cada uno de los grupos de descarga obtenidas a 3, 7 y 14 DIV (*p<0,05; **p<0,01 vs 3DIV, ANOVA con Bonferroni en B; K-S test en C). Una vez caracterizado el curso temporal de maduración en lo concerniente a los niveles de expresión de proteínas y a las fluorescencias iniciales, decidimos caracterizar la maduración del cultivo en función del porcentaje de cada uno de los grupos de descarga a los distintos días in vitro, así como del porcentaje de descarga exhibido por cada uno de los grupos. Encontramos que la maduración funcional del cultivo era paralela a un incremento de los botones de descarga fuerte presentes en la preparación. De forma 172 Resultados  similar a lo observado con el patrón de expresión de las distintas proteínas, se comprobó que el aumento principal del porcentaje de botones de descarga fuerte acontecía en la ventana temporal comprendida entre 3 y 7 DIV's (Figura 14A; Descarga fuerte, 3DIV: 50,0±4,1%; 7DIV: 63,9±7,4%, p<0,05; 14DIV:66,2±3,4%, p<0,05; Descarga débil, 3DIV: 50,0±4,1; 7DIV: 36,1±7,4, p<0,05; 14DIV: 33,8±3,4, p<0,05). La tasa de descarga normalizada a la fluorescencia inicial del grupo de descarga fuerte no se vio modificada a lo largo del desarrollo del cultivo (Figura 14B; Porcentaje de descarga, 3DIV: 63,9±1,1%; 7DIV: 60,3±1,8%, p>0,05; 14DIV: 63,0±1,1%, p>0,05; Prueba t de Student vs 3DIV), mientras que el grupo de descarga débil experimentó un ligero aumento de esta fracción a los 14DIV (Figura 14B; Porcentaje de descarga, 3DIV: 35,6±3,0%; 7DIV: 38,7±1,1%, p>0,05; 14DIV: 43.3±0.9%, p<0,05; Prueba t de Student vs 3DIV). A diferencia de las fracciones de descarga, las constantes temporales de exocitosis sufrieron una disminución a lo largo del desarrollo del cultivo, lo que es coherente con un aumento de la velocidad de exocitosis y por tanto, de la eficacia de reciclamiento vesicular (Figura 14C; τ Descarga fuerte, 3DIV: 12,08±0,69s; 7DIV: 8,94±0,61s, p<0,01; 14DIV: 9,79±0,69s, p<0,05// τ Descarga débil, 3DIV: 24,03±1,32s; 7DIV: 15,55±1,36s, p<0,01; 14DIV: 14,96±0,76s, p<0,01; Prueba t de Student vs 3DIV en todos los casos). La inhibición crónica de la actividad en cultivos neuronales (bien con bloqueantes de los canales de sodio voltaje dependientes, bien con antagonistas de receptores ionotrópicos de glutamato), parece producir un efecto homeostático (Buonomano, 2005; Turrigiano, 2008), promoviendo la expresión y acumulación de determinadas proteínas presinápticas tales como RIM, VGluT-1, Sinaptotagmina y Canales de calcio tipo P/Q. Este efecto sobre la expresión de proteínas sinápticas, descrito como una remodelación 173 Resultados de las zonas activas (Lazarevic et al., 2011) guarda relación con un efecto heterogéneo sobre la probabilidad de liberación, aumentando este parámetro, al menos en una población de sinapsis (Lazarevic et al., 2011; Mitra et al., 2012). En nuestro caso, adicionamos (TTx 1μM) al medio de cultivo las 24 horas previas a la realización del experimento, para evaluar posibles efectos de la inactivación crónica sobre la eficacia de reciclamiento. No encontramos efecto de TTx a los 7DIV sobre los porcentajes de respuesta exocitótica en ninguno de los grupos (Figura 14B, TTx; Grupo de descarga fuerte: 56,32±1,58%, p>0,05; Grupo de descarga débil: 37,47±1,93%, p>0,05; Prueba t de Student vs Control 7DIV en ambos casos), sin embargo encontramos una inversión de los porcentajes relativos de respuestas mostrados a 7DIV en condiciones normales (Figura 14A; TTx 7DIV; Botones de descarga fuerte: 30,42±6,59%, p<0,05; Botones de descarga débil: 69,58±6,59%, p<0,05, Prueba t de Student vs Control 7DIV en ambos casos) que fue acompañada por una reducción selectiva de las constantes temporales de exocitosis en el grupo de descarga débil (Figura 14C; TTx 7DIV, τ Descarga fuerte: 7,51±0,43s, p>0,05; τ Descarga débil: 8,35±0,60s, p<0,01, Prueba t de Student vs Control a 7DIV en ambos casos). Nuestra interpretación de estos resultados se basa en asumir que el aumento de la probabilidad de liberación inducido por la inactivación crónica del cultivo genera una oleada masiva de exocitosis ante la llegada de estimulación que promueve la puesta en marcha de formas de endocitosis no vesiculares asociadas a reciclamiento ineficiente. La disminución de las constantes temporales de exocitosis de los botones de baja eficacia de reciclamiento apoya esta hipótesis, ya que es un indicativo de una adaptación, en términos cinéticos, de la eficacia de reciclamiento, que aparece de forma concomitante al aumento en la probabilidad de liberación. Por tanto podemos concluir que el aumento en la eficacia de exocitosis durante el periodo de carga con FM1-43 (se puede establecer cierto paralelismo entre 174 Resultados  este parámetro y la probabilidad de liberación) es el responsable de la baja eficacia de reciclamiento que se pone de manifiesto durante una segunda ronda de estimulación. Figura 14- Maduración funcional del cultivo evaluada atendiendo al porcentaje de respuestas exocitóticas de cada tipo (A), el porcentaje de liberación de cada grupo de respuesta (B) y la constante de decaimiento exhibida por cada grupo de respuesta (C) a los distintos días in vitro. El efecto de TTx se muestra con símbolos vacíos en los distintos paneles. Leyenda en (D). (*p<0,01; **p<0,05 vs Control 3DIV; #p<0,05 vs Control 7DIV, Prueba t de Student) Como parte de una colaboración con la doctora Hurtado, decidimos llevar a cabo una serie de experimentos en un contexto en el que la maduración celular del cultivo estaba potenciada artificialmente mediante el uso de un fitoestrógeno. Los fitoestrógenos son 175 Resultados moléculas vegetales no esteroideas (en su mayoría isoflavonas), que tienen efectos estrogénicos por su similitud estructural con el 17-β-Estradiol. En neuronas los efectos de los fitostrógenos parecen derivar de una combinación de la activación de receptores de estrógenos canónicos (Turner et al., 2007) y de receptores nucleares PPARγ (del inglés Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) (Shen et al., 2006). Las acciones de los fitoestrógenos son una aceleración de la diferenciación neuronal y un aumento en la expresión de la proteína sináptica sinaptofisina (Chindewa et al., 2008), efecto que reproduce el agonista PPARγ rosiglitazona (Sayan-Ozacmak et al., 2011). Encontramos que la aplicación del fitoestrógeno Daidzeína (0,5 μM, 24h) produjo un aumento de la eficacia global de reciclamiento, manifestado como un aumento en la proporción de botones de descarga fuerte respecto a la de descarga débil, que fue revertido a niveles basales al coincubar con el antagonista PPARγ T0070907 a una concentración de 1μM (Figura 15A; Relación de botones descarga fuerte/ botones descarga débil; Control: 2,20 ± 0,18; N=3, n=3260; Daidzeína: 3,18 ± 0,33; N=5, n=5704 [p<0,05]; Daidzeína + T0070907: 1,94 ± 0,16; N=4, n= 3371 [p>0,05]; ANOVA con Fisher). A diferencia de en la proporción de botones de cada tipo, ninguno de los tratamientos produjo una modificación de las cinéticas de respuesta de las distintas subpoblaciones de botones (Figura 15 B). Sin embargo encontramos un aumento de las fluorescencias iniciales tras el tratamiento con Daidzeina que fue prevenido tras la coincubación con el antagonista PPARγ (Figura 15C, Fluorescencia inicial media; Control: 2337,53 ± 22,70 u.a.f. FM1- 43; Daidzeína: 2990,61 ± 20,25 u.a.f. FM1-43, [p<0,01]; Daidzeína + T0070907: 2426,87 ± 22,49 u.a.f. FM1-43, [p<0,05]; ANOVA con Bonferroni), lo que indica un aumento del número de vesículas presentes en los terminales presinápticos, de forma acorde a lo descrito por otros grupos (Mozhayeva et al., 2002). Además, dado que el aumento de las fluorescencias iniciales no se correspondía con una disminución de la 176 Resultados  tasa de descarga de FM1-43, este aumento indicaba un aumento de la eficacia de reciclamiento del contenido vesicular de los elementos presinápticos del cultivo Figura 15- A) Cociente botones de descarga fuerte/botones de descarga débil. B) Medias cinéticas de los distintos grupos de botones en las distintas condiciones experimentales. C) Fluorescencias iniciales de los botones ante las distintas condiciones. D, E y F) Histogramas de distribución de frecuencias de descarga de FM1-43 en Control, Daidzeína y Daidzeína+T0070907 respectivamente. *p<0,05; **p<0,01; ANOVA con Fisher en Fig. 15A y K-S Test en Fig 15C. 177 Resultados 10-Marcadores presinápticos asociados con la eficacia de reciclamiento Para esclarecer si existía algún tipo de relación entre la heterogeneidad en la eficacia de reciclamiento y las características intrínsecas de los distintos botones en términos de expresión de proteínas, llevamos a cabo series de experimentos en los que de forma posterior al análisis de la eficacia de reciclamiento mediante FM1-43, se llevó a cabo una inmunocitoquímica post-hoc según se ha detallado en la sección de métodos. Se analizó una batería de proteínas presinápticas implicadas en procesos de exocitosis (Sinapsina, Fosfosinapsina y Munc13-1) o endocitosis (Dinamina y Calcineurina), proteínas de citomatriz (Bassoon) y proteínas vesiculares (VGluT1) así como el marcador postsináptico GluA3, subunidad de los receptores ionotrópicos de glutamato tipo AMPA asociados a estados de inmadurez sináptica (Condorelli et al., 1993; Incontro et al., 2011). Encontramos que tras separar las inmunorreactividades de sinapsis individuales en función de la pertenencia a uno u otro grupo de descarga, algunos de los marcadores segregaban en paralelo con la tasa de descarga. En concreto encontramos que las proteínas Bassoon, Munc13-1, Calcineurina y la forma fosforilada de la Sinapsina se encontraban enriquecidas con respecto a la media de la población, en aquellas sinapsis con una mayor eficacia de reciclamiento. Por el contrario, la subunidad GluR3 de los receptores AMPA se expresaba mayoritariamente en aquellos puntos en aposición a las sinapsis con una menor eficacia de reciclamiento. A diferencia de estas proteínas mencionadas cuya inmunorreactividad era variable en función del grupo de sinapsis analizadas, las inmunorreactividades de las proteínas Sinapsina, Dinamina y VGluT1 no mostraron ningún tipo de segregación paralela a la segregación de respuestas cinéticas. 178 Resultados  179 Resultados ← Figura 16- A) Ejemplo de inmunocitoquímica post-hoc. Se muestra en azul (pseudocolor) la imagen correspondiente a la sonda FM1-43 (experimento en célula viva), en verde el marcaje de la forma fosforilada de la sinapsina y en rojo el marcaje de la subunidad GluA3 del receptor ionotrópico de glutamato de tipo AMPA, barra de escala 5μm. A continuación se muestran las comparaciones de las inmunoreactividades (IR) medias de cada uno de los grupos de descarga para Sinapsina (B), Fosfo- sinapsina (C), Munc13-1 (D) y VGluT1 (E) respectivamente (n.s., no significativo; ** p<0,01 Prueba t de Student) // ↑ Figura 17- Comparacion de las IRs medias de cada uno de los grupos para Bassoon (A), Dinamina (B), Calcineurina (C) y la subunidad del receptor AMPA GluA3 (D). Obsérvese que únicamente la subunidad GluA3 está enriquecida en las postsinapsis en aposición a elementos presinápticos con un reciclamiento poco eficiente, ya que esta subunidad es característica de estadios de inmadurez sináptica (n.s., no significativo; ** p<0,01 Prueba t de Student). En ambas figuras se ha normalizado a la inmunoreactividad media. Enlos anexos II y III se muestran las imágenes detalladas de las inmunocitoquímicas post-hoc de las distintas proteínas estudiadas 180 Resultados  11-Receptores presinápticos y eficacia de reciclamiento Nuestro siguiente objetivo fue estudiar la implicación de los receptores metabotrópicos en la maduración de la eficacia de reciclamiento, como parámetro asociado a la maduración neuronal. La primera aproximación llevada a cabo en este contexto fue el tratamiento a largo plazo (24h) con toxina pertúsica (PTx). Esta toxina cataliza la ADP- ribosilación de la subunidad αi de proteínas G heterotriméricas de la familia αi, interfiriendo con su mecanismo de acción (Burns, 1988). Se observó que el tratamiento prolongado de las células granulares con PTx, producía un aumento de la eficacia de reciclamiento de estas, manifestado en un aumento de las medias globales de descarga (Figura 18A y 18B Control: 55,28 ± 0,84 %, N=5, n=598; PTx: 65,16 ± 0,48 %, N=6, n=1320; **p<0,01 ANOVA con Bonferroni) así como en un aumento relativo del porcentaje de botones de descarga fuerte respecto al de los botones de descarga débil (Figura 18B; Porcentaje de botones de descarga fuerte; Control: 54,83 ± 1,37 %; PTx: 65,76 ± 1,72%; **p<0,01 Prueba t de Student). Al analizar los datos observamos que un número similar de experimentos había dado lugar a un número altamente diferente de botones en las distintas condiciones, por ello se analizó la densidad de botones por unidad de longitud en las distintas condiciones experimentales. Se constató un aumento del número de botones sinápticos que incorporaban FM1-43 (expresado en botones/µm de neurita) tras el tratamiento de 24 horas con PTx (Figura 18C; Control: 0,07 ± 0,016 botones/µm; PTx: 0,13 ± 0,01 botones/µm; * p<0,05); de estos experimentos se deduce que la inhibición de los GPCR inhibitorios (del inglés G-Protein Coupled Receptor) producía un incremento en el número de sitios activos así como un aumento de la eficacia de reciclamiento de dichos sitios. En línea con estos experimentos decidimos inhibir de forma selectiva uno de los receptores metabotrópicos más abundante en las 181 Resultados neuronas granulares de cerebelo (Tsou et al., 1998; Egertova y Elphick, 2000; Stephens, 2009) con importantes funciones tanto en el desarrollo y maduración de estas neuronas (Trazzi et al., 2010) como en la regulación de su eficacia sináptica (Safo y Regehr, 2005; Safo et al., 2006; Stephens, 2009), el receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1R). Figura 18- A) Medias cinéticas obtenidas en control y tras el tratamiento durante 24 horas con PTx. Los puntos de tiempo para calcular el porcentaje de descarga que se muestra en la figura insertada son t = +1 minuto a partir de la estimulación. B) Porcentaje de cada uno de los grupos de descarga tras el tratamiento con PTx de 24horas. C) Densidad de botones (expresada en botones por μm de neurita). D) Fluorescencias iniciales de la población total de botones* p < 0,05; **p < 0,01; Prueba t de Student y ANOVA con Bonferroni. 182 Resultados  Tratando de establecer un paralelismo entre la inhibición de la señalización por proteínas G inhibitorias y la inhibición del receptor de cannabinoides de tipo 1, se incubaron las células con SR141716 (5μM), antagonista selectivo del mencionado receptor, durante las 24 horas previas a la realización del experimento al igual que se había procedido en el caso de los experimentos con PTx.0020 Figura 19- A) Medias cinéticas obtenidas tras el tratamiento de 24 horas con SR141716 y porcentaje medio de descarga obtenido a partir de los registros de botones individuales tras 1 minuto de perfusión con alto potasio (figura insertada). B) Porcentaje de los dos grupos de descarga en control y tras el tratamiento de 24h con SR141716. C) Densidades medias de botones (en botones por µm) en control y tras el tratamiento prolongado con SR141716. D) Fluorescencias iniciales en control y tras el tratamiento con SR141716. n.s.: no significativo; * p<0,05; **p<0,01, Prueba t de Student. 183 Resultados El tratamiento durante 24 horas con SR141716 dio lugar a un aumento selectivo del porcentaje de botones con descarga fuerte (Figura 19B; Control descarga fuerte: 68,91 ± 4,11 % N=8, n= 3059; SR141716 descarga fuerte: 82,83 ± 2,54 %, N=8, n=3647; * p<0,05 Prueba t de Student), lo que quedó reflejado en las medias cinéticas globales y por tanto en los porcentajes de descarga (Figura 19A; Control: 60,29 ± 0,31 %; SR141716: 72,53 ± 0,34; ** p<0,01; ANOVA con Bonferroni). Puesto que la adaptación homeostática puede ser bidireccional (Turrigiano, 2008; Mitra et al., 2012), la aplicación de PTx durante las 24 horas previas a la realización del experimento podría conducir a un efecto en el cultivo opuesto al del tratamiento prolongado con TTx, en el cual se llevase una reducción homeostática de la actividad sináptica, lo que debería conllevar una disminución de las fluorescencias iniciales de los botones estudiados, debido a que, en este caso, el efecto homeostático consistiría en una disminución de la probabilidad de liberación al menos en una subpoblación de sinapsis durante la fase de carga. Motivados por esta especulación decidimos llevar a cabo las medidas de las fluorescencias iniciales de los botones en ambos tipos de experimentos. Encontramos una marcada disminución de las fluorescencias iniciales de los botones sinápticos en las células tratadas con PTx, que no se reproducía en los botones tratados con SR141716 (Figura 18D; Control: 10,65±0,18 u.a.f. de FM1-43; PTx: 6,49±0,13 u.a.f. de FM1-43; p<0,01 Prueba t de Student; Figura 19D; Control: 7,21±0,07 u.a.f. de FM1-43; SR141716: 7,13±0,07 u.a.f. de FM1-43; no significativo Prueba t de Student ). Este hecho nos llevó a pensar que el bloqueo crónico de la señalización inhibitoria mediada por CB1 no era suficiente para mediar un efecto homeostático, mientras que la inhibición global de la señalización mediada por aquellos receptores acoplados a proteínas Gαi si daba lugar a este efecto. Las diferencias en lo relativo a las fluorescencias iniciales sugieren que, a pesar de no producir un efecto homeostático en 184 Resultados  estas células, el tratamiento prolongado con el antagonista del receptor CB1 ha de mediar un efecto directo durante la realización del experimento que conduce a las diferencias cinéticas observadas. Una de las limitaciones técnicas de la sonda FM1-43 es que requiere una estimulación prolongada y de alta intensidad durante el proceso de incorporación de la sonda en el lumen de las vesículas sinápticas, hecho que podría promover una síntesis masiva de endocannabinoides durante el proceso de carga, que regulase la eficiencia sináptica durante la fase de descarga (Hashimotodani et al., 2005; Maejima et al., 2005; Hashimotodani et al., 2007). En este contexto, puesto que el SR141716 es un agonista inverso de los receptores de cannabinoides, podría estar regulando a la baja la señalización por endocannabinoides que tuviera lugar durante el periodo de carga y la fase de lavado. Por esta razón decidimos llevar a cabo experimentos en los que las células se expusieran a un agonista cannabinoide (HU-210) tras la fase de incorporación de la sonda, para comprobar si este tratamiento producía alguna modificación de la eficacia sináptica. 12- Regulación de la eficacia de liberación vesicular por el receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1R) e inducción de silenciamiento sináptico La acción inhibitoria de los cannabinoides sobre la eficacia presináptica radica en una disminución de la entrada de calcio por inhibición de canales de calcio operados por voltaje y en una reducción de los niveles de cAMP en el compartimento presináptico por la inhibición llevada a cabo sobre la adenilato ciclasa por parte de las subunidades αi de proteínas G (Kreitzer y Regehr, 2001; Brown et al., 2004; Chevaleyre et al., 2007). Tras corroborar tanto por medio de técnicas de inmunocitoquímica (Figuras 20A y Figura 20B; CB1R-Sinptofisina; Pendiente 0,672 ± 0,005; r2=0.681; N=10, n =6598) 185 Resultados como de western-blot a partir de extractos de células a distintos días in vitro (Figura 20C), la expresión del mencionado receptor en nuestros cultivos de neuronas granulares, y con objeto de disecar molecularmente ambos tipos de inhibición en nuestros experimentos de ciclo vesicular, se diseñaron experimentos en los que, en lugar de una estimulación sostenida, se llevaban a cabo dos estimulaciones secuenciales, la primera de ellas de 10 segundos y la siguiente, tras un periodo de 1 minuto entre ambas estimulaciones, de 2 minutos 30 segundos. El razonamiento para llevar a cabo este tipo de experimentos fue el siguiente, una estimulación de baja magnitud nos permitiría detectar cambios atribuibles a la inhibición de la entrada de calcio, mientras que la estimulación prolongada pondría de manifiesto exclusivamente aquellos cambios atribuibles a modificaciones de la maquinaria de liberación, dado que el control inhibitorio sobre los nanodominios de calcio estaría presumiblemente eludido en estas condiciones de estimulación. El protocolo empleado se muestra en la figura 20D. Encontramos que la aplicación del agonista cannabinoide HU-210 durante los 10 minutos posteriores al proceso de carga provocaba una reducción dramática de la liberación de FM1-43 durante la estimulación inducida por el primer pulso (10s), que se mantenía en el segundo pulso (2'30"), lo que parecía indicar la independencia de esta reducción exocitótica de la inhibición de la entrada de calcio. Este efecto era mediado específicamente por el receptor CB1, ya que la coincubación con su agonista selectivo, el SR141716, suprimía la reducción de la liberación vesicular (Figura 20E y 20F, Control D1: 48,67 ± 0,25 %; Control D2: 23,36 ± 0,16 %; Control total: 72,04 ± 0,23 %, N=7, n=2790; HU-210 D1: 31,61 ± 0,20 %, *p<0,001; HU-210 D2: 26,31 ± 0,16 %, *p<0,001; HU-210 total: 57,92 ± 0,24 %, *p<0,001, N=7, n=2639; HU-210+SR141716 D1: 46,92 ± 0,51 %, no significativo; HU-210+SR141716 D2: 23,53 ± 0,32 %, no significativo; HU-210+SR141716 total: 70,46 ± 0,48 %, no significativo, N=4, n=995). 186 Resultados  Figura 20- A) Inmunocitoquímica mostrando la colocalización del receptor CB1 con la proteína vesicular sinaptofisina, barra de escala: 5 μm. B) Se refiere a A; correlación de las inmunorreactividades (IR) de sinaptofisina con las del receptor CB1 en terminales sinápticos de neuronas granulares en cultivo. C) Expresión del receptor en nuestros cultivos a 3, 7 y 14 días in vitro. D) Protocolo empleado para los experimentos de FM1-43 e imágenes representativas de la línea base (a), después de la primera descarga (b/D1) y tras la estimulación sostenida con cloruro potásico (c/D2). E) Cinéticas de descarga de FM1-43 en control, HU-210 y HU-210/SR141716. F) Cuantificación de los datos de descarga en los distintos puntos del experimento (*p<0,001; n.s. no significativo, ANOVA con Bonferroni) 187 Resultados En una serie de experimentos paralelos, se observó que la reducción exocitótica observada era estrictamente dependiente de un largo periodo de incubación con el agonista cannabinoide, pues una exposición de 40 segundos al HU-210 no fue suficiente para mediar ningún efecto sobre la descarga de FM1-43 inducida por un periodo de 10 segundos de perfusión hipercalémica (Figura 21A y 21B; Control: 42,42 ± 0,25 %; N=5, n=3041; HU-210 [40"]: 41,58 ± 0,32; N=5, n=2648, no significativo, ANOVA con Bonferroni). Figura 21- A) Cinéticas de descarga de FM1-43 en control y tras la perfusión de HU-210 durante 40 segundos (rectángulo azul). B) Cuantificación de los porcentajes de descarga (medias de respuestas individuales) de las cinéticas promediadas en A, (*p<0,001; n.s. no significativo, ANOVA con Bonferroni) Dado que la principal limitación metodológica de los experimentos con FM1-43 es la estimulación necesaria para la incorporación de la sonda en el interior de las vesículas sinápticas y que durante este periodo podría producirse una liberación de endocannabinoides que afectase a los datos contenidos en las figuras 20 y 21, decidimos trasladar estos protocolos experimentales a técnicas de imagen del ciclo vesicular en las que no fuese requerida una estimulación previa para el marcaje de las vesículas sinápticas. Se empleó para ello la VGluT1-pHluorina (amablemente cedida por los 188 Resultados  doctores Robert Edwards y Susan Voglmaier, de la UCSF), un copia modificada del transportador vesicular de glutamato 1 (VGluT1) con una GFP (del inglés Green Fluorescent Protein) unida a su porción luminal. Las fluctuaciones de pH que tienen lugar en el interior de la vesícula sináptica de forma paralela a los fenómenos de exo/endocitosis nos permiten monitorizar dichos procesos por las variaciones en la fluorescencia de la GFP unida al transportador de glutamato, orientada hacia la cara luminal de las vesículas sinápticas (pHreposo=5,5 ↔pHexocitosis=7,4), pues la fluorescencia de la GFP se encuentra apagada a pHs ácidos. Para llevar a cabo una estimación de la fracción de vesículas movilizadas durante un determinado proceso exocitótico, al finalizar el experimento se realiza una perfusión de cloruro amónico (NH4Cl 50mM) con objeto de alcalinizar todas las vesículas, lo que rinde una señal máxima de fluorescencia que se empleará para normalizar y a la que se le conferirá el valor 1 (a la línea base del experimento se le confiere el valor 0). Las ventajas principales de esta técnica son I) la ausencia de estimulación previa a la realización del experimento, y por tanto de la activación de la síntesis de endocannabinoides que ello podría conllevar; II) la posibilidad de monitorizar registros endocitóticos y III) la presencia de un control interno para cada una de las respuestas sinápticas individuales si se llevan a cabo protocolos de varias estimulaciones. → Figura 22- A) Colocalización del receptor CB1 con VGluT1-pHluorina en células transfectadas a 0 DIV y mantenidas hasta 7 DIV para el análisis de las respuestas .B) Ejemplo ilustrativo de las medias mostradas en C y D, obsérvese la reducción de fluorescencia en el segundo pulso tras el tratamiento de 10 minutos con HU-210. Medias cinéticas en condiciones control (C) y con un tratamiento intermedio de HU-210 (D), la normalización (0,1), empleada para la comparación de respuestas cinéticas se muestra en la figuras insertadas. E) Experimentos de triple pulso en los que se muestra que solo las incubaciones prolongadas con el agonista cannabinoide producen una reducción exocitótica observable, los tiempos entre estimulaciones son 10 minutos en todos los casos. 189 Resultados F y G) son las correlaciones de las respuestas individuales, en control y tras la aplicación de 10 minutos de HU-210. Los recuadros azules indican una respuesta inferior al 4% en el segundo pulso (sinapsis silenciadas), la línea verde es x=y y las líneas rojas el ajuste de los datos experimentales. H) Cuantificación de las medias mostradas en E, obsérvese que sólo los tiempos largos de incubación generan una reducción exocitótica (pulso 3). I y J) son registros individuales de sinapsis en control (I) y tras el tratamiento con HU-210 (J). K) Superposición de imágenes obtenidas durante la perfusión de NH4Cl en cada uno de los pulsos de E, obsérvese que algunos botones sinápticos se desplazaban en su totalidad durante la realización del experimento (puntas de flecha) y por tanto no fueron cuantificados. L) Porcentaje de sinapsis silenciadas (cuadro azul en G) tras el tratamiento con HU-210 (n.s. so significativo; *p<0,05; ** o ## p<0,01). 190 Resultados  Tras comprobar la presencia del receptor en terminales de neuronas transfectadas por su colocalización con GFP (Figura 22A), se comprobó que, en condiciones control, dos estimulaciones sucesivas de 10s con HBM de estimulación, espaciadas por un intervalo de 10 minutos, daban lugar a respuestas exocitóticas de la misma magnitud, lo que descartaba la posibilidad de que se estuvieran produciendo mecanismos de depresión/potenciación presináptica durante este intervalo de tiempo (Figura 22C, Control, Pulso 1: 42,82 ± 1,77 %; Pulso 2: 39,15 ± 1,35 %, N=6, n= 209, no significativo). Al aplicar el agonista cannabinoide (HU-210, 5μM) en los 10 minutos del intervalo entre estímulos se producía una marcada reducción exocitótica de las respuestas globales (Figura22 D; HU-210, Pulso 1: 48,26 ± 2,06 %; Pulso 2: 23,11 ± 1,24 %, N=6, n=195, **p<0,01) sin efecto aparente en las cinéticas de exo/endocitosis (figuras insertadas en 22C y 22D). Con objeto de corroborar el requerimiento de una exposición prolongada al agonista cannabinoide para inducir la reducción exocitótica, se diseñaron experimentos de triple pulso, en los que el intervalo entre estimulaciones era de 10 minutos. Estos intervalos fueron empleados para analizar los efectos de las exposiciones a corto (40") y largo plazo (10') con el agonista HU-210, comprobándose que solo las incubaciones durante periodos prolongados de tiempo inducen una reducción de la exocitosis vesicular sináptica (Figura 22E y 22H: Control P1: 41,67 ±1,81 %; Control P2: 42,82 ± 1,83, no significativo; Control P3: 44,11 ± 1,78 %, no significativo; N=2, n=90// HU-210 P1 (Control): 46,44 ± 2,42, no significativo; HU-210 P2 (40"): 43,10 ± 1,93, no significativo; HU-210 P3 (10'): 18,12 ± 1,88, **p<0,01 y ##p<0,01, comparado a P1 control y P1 HU-210 respectivamente; N=2, N=49; ANOVA con Bonferroni en todos los casos). Encontramos que tras los 10 minutos de incubación con HU-210 se producía un fenómeno conocido como silenciamiento sináptico en una subpoblación de terminales (Cuadro azul en figura 22G, ejemplos individuales en 22B y 191 Resultados 22J) definiendo como ausencia de exocitosis una respuesta inferior al 4% sobre la señal máxima de fluorescencia (por ser estos los niveles habituales de ruido en los registros individuales), fenómeno que no se observó en condiciones control. Definimos como botones silenciados por el tratamiento con HU-210 aquellos que mostraban una respuesta exocitótica normal durante el primer pulso, pero inferior al 4% durante la segunda estimulación (Figura 22L; Control: 0,25 ± 0,25 % de botones silenciados; HU- 210: 32,31 ± 10,86 % de botones silenciados, *p<0,05 Prueba t de Student). 13- Indepencia de Calcio del fenómeno de silenciamiento sináptico Los resultados obtenidos en los experimentos de FM1-43, en los que una estimulación sostenida con solución hipercalémica no era capaz de compensar los mecanismos de inhibición iniciados por el HU-210, apuntaban hacia un tipo de inhibición calcio independiente, ya que a estas intensidades de estimulación, la regulación de la neurosecreción por nanodominios de calcio parece no ser efectiva. En primera instancia corroboramos la calcio dependencia de los procesos exocitóticos y endocitóticos en nuestro sistema experimental; para ello realizamos estimulaciones pareadas (protocolos de doble pulso) a concentraciones crecientes de calcio durante el periodo de estimulación (0,25mM, 1,33mM y 5mM CaCl2). Se comprobó que el incremento máximo de fluorescencia (número de vesículas exocitadas) era directamente proporcional a la concentración de calcio empleada durante el periodo de estimulación (Figura 23A y 23B, 0,25mM CaCl2: 31,20 ± 2,22%, N=3, n= 64, **p<0,01; 1,33mM CaCl2: 42,47 ± 4,77%, N=7, n=209; 5mM CaCl2: 56,94 % ± 4,17%, N=5, n=101, **p<0,01, ANOVA con Bonferroni, comparaciones con 1,33mM CaCl2). En cuanto a las constantes temporales de exocitosis, estas no sufrieron modificaciones a ninguna de 192 Resultados  las concentraciones de calcio de forma significativa (Figura 23C; 0,25mM CaCl2: 5,51 ± 0,50 segundos, no significativo; 1,33mM CaCl2: 4,61 ± 0,55 segundos; 5mM CaCl2: 6,33 ± 0,87 segundos, no significativo; Prueba t de Student comparado con 1,33mM CaCl2). Figura 23- A) Medias cinéticas obtenidas en experimentos de doble pulso a concentraciones crecientes de calcio, la figura insertada es la normalización (0,1) para el análisis de parámetros cinéticos. B) Cuantificación de los incrementos medios de fluorescencia del primer pulso para cada concentración de calcio, media a partir de datos individuales. C y D) Ajustes exponenciales de exocitosis y endocitosis, respectivamente, con las comparaciones de sus constantes temporales en las figura insertadas (n.s., no significativo, *p<0,05; **p<0,01; ANOVA con Bonferroni en B y Prueba t de Student en C y D. 193 Resultados Las constantes endocitóticas mostraron una clara tendencia a la reducción (aumento de la velocidad del proceso de endocitosis) a medida que se aumentaron las concentraciones de calcio, siendo únicamente significativa la comparación entre 0,25mM y 5mM CaCl2 (Figura 23D; 0,25mM CaCl2: 17,30 ± 1,30 s, no significativo; 1,33mM CaCl2: 14,43 ± 0,98; 5mM CaCl2: 12,81 ± 0,64 s, no significativo versus 1,33mM; *p<0,05 versus 5mM). Una vez caracterizada la calcio-dependencia del proceso exo/endocitótico en nuestro sistema, decidimos llevar a cabo la inducción del silenciamiento por exposición al agonista cannabinoide HU-210 en experimentos de doble pulso en los que se empleó una concentración de 5mM CaCl2 durante los pulsos de estimulación. Los efectos observados a concentraciones fisiológicas de calcio se reprodujeron a 5mM CaCl2, tanto en lo referente a la magnitud global de la respuesta exocitótica (Figuras 24A, 24B y 24C; Control P1: 53,51 ± 4,08 %; Control P2: 45,36 ± 3,14 %; N=3, n=49, no significativo; HU-210 P1: 39,49 ± 1,96 %; HU-210 P2: 13,35 ± 1,03 %; N=4, n=86, **p<0,01; Prueba t de Student contra su control interno [P1] en ambos casos) como en lo referente al porcentaje de botones silenciados tras el tratamiento con HU-210 (Figura 24D; Control 1,33mM: 0,25 ± 0,25 %; HU-210 1,33mM: 32,31 ± 10,86 %, *p<0,05; Control 5mM: 1,41 ± 0,81 no significativo; HU- 210 5mM: 25,61 ± 5,35 %, *p<0,05; ANOVA con Bonferroni, datos de 1,33mM tomados de figura 22L), lo que indica que un aumento de la concentración extracelular de calcio (y por tanto de la entrada de calcio durante la estimulación) no es suficiente para prevenir los efectos inhibitorios mediados por el HU-210. Puesto que a altas concentraciones de calcio los experimentos de dobles pulso podrían estar induciendo fenómenos de depresión a largo plazo (obsérvese en el control una ligera tendencia no significativa a la reducción exocitótica durante el segundo pulso de estimulación), decidimos llevar a cabo estos experimentos con un solo pulso de estimulación a una 194 Resultados  concentración de calcio de 5mM. Con objeto de eludir los mecanismos de inhibición de la entrada de calcio se llevaron a cabo estimulaciones de 20 segundos con cloruro potásico. Figura 24- Experimentos de doble pulso a 5mM CaCl2 en control (A) y tras la aplicación de HU-210 5μM entre ambos pulsos (B), la correlación de las respuestas individuales se muestra en C). D) Comparación del porcentaje de botones silenciados a concentración fisiológica de calcio (1,33mM, datos de figura 22L) y a concentración elevada de calcio (5mM), n.s. no significativo; *p<0,05; **p<0,01; Prueba t de Student en A y B, ANOVA con Bonferroni en D). Los experimentos de pulso simple a altas concentraciones de calcio corroboraron los resultados obtenidos en experimentos de pulso simple y demostraron que la estimulación previa con una concentración suprafisiológica de calcio no estaba 195 Resultados implicada en el fenómeno de silenciamiento. Se observó una marcada reducción exocitótica (Figuras 25A, 25B y 25C; Control 5mM CaCl2: 56,92 ± 1,93 %, N= 5, n=157; HU-210 5mM CaCl2: 28,98 ± 1,36 %, N=5, n=134), acompañada de una inducción de silenciamiento sináptico comparable a la obtenida en los experimentos de doble pulso (Figura 25 F; Control 5mM: 0,80 ± 0,52 % de sinapsis silentes; HU-210 5mM: 19,76 ± 4,19 % de sinapsis silentes, **p<0,01 Prueba t de Student). Se encontró un defecto endocitótico en el control que se rescataba en el tratamiento con HU-210, probablemente debido a una saturación de la maquinaria endocitótica a estas concentraciones de calcio en el control que tendría lugar como consecuencia de la exocitosis masiva que este tipo de estimulación acarrea (Dittman y Ryan, 2009), si bien es cierto que, aunque evidente, esta tendencia no mostró significación estadística (Figuras 25D y 25E, Control 5mM CaCl2, τ endocitosis: 44,52 ± 6,25 s; HU-210 5mM CaCl2, τ endocitosis: 25,26 ± 6,44 s, no significativo, Prueba t de Student). Puesto que este tipo de estimulación masiva no fue capaz de ocluir la inhibición exocitótica mediada por el HU-210, es posible que el efecto neto ejercido por el HU-210 sea disociable, en gran medida, de la inhibición de los canales de calcio voltaje dependientes mediado por la activación del receptor CB1. Existe descrita una oclusión del efecto potenciador del PDBu a concentraciones altas de calcio (Lou et al., 2005). La oclusión de esta potenciación en nuestro modelo sería un dato experimental del que se argüiría que la inhibición mediada por el HU-210 no sería explicable únicamente como una inhibición de la entrada de calcio. Motivados por esta hipótesis decidimos llevar a cabo experimentos de doble pulso en el que el análogo del DAG, el Forbol-12, 13- dibutirato (PDBu), era perfundido durante 5 minutos en el intervalo entre estimulaciones. Se observó una oclusión de la potenciación ejercida por el PDBu a concentraciones fisiológicas de calcio. 196 Resultados  Figura 25- A) Imágenes representativas de un experimento de un solo pulso a concentración 5mM CaCl2, en control (parte superior y trazos negros) y tras el tratamiento con HU-210 (parte inferior y trazos rojos). Se muestran las imágenes de contraste de fases en la columna de la derecha. B) Medias globales de las respuestas en control (negro) y tras el tratamiento con HU-210. En C) se muestra la distribución de probabilidad acumulada del porcentaje de descarga para cada uno de los grupos, el histograma y la gaussiana derivada de su ajuste se representan en la figura insertada. D) Normalización (0,1) para el cálculo de parámetros cinéticos, las constantes promedio de endocitosis se muestran en E). F) Porcentaje de botones silentes a 5mM CaCl2 en control y tras el tratamiento con HU-210. n.s., no significativo;**p<0,01. ANOVA con Bonferroni de las respuestas individuales en B); K-S test en C); Prueba t de Student en E y en F. 197 Resultados La potenciación selectiva del PDBu sobre las respuestas sinápticas a bajas concentraciones de calcio (0,25mM) se manifestó en un incremento del cociente obtenido al dividir la respuesta obtenida tras la perfusión del PDBu entre la respuesta control (Figura 26D y 26G; Cociente de respuestas R2/R1; Control 1,33mM CaCl2: 0,95 ± 0,92 N=5, n=142; PDBu 1,33mM CaCl2: 0,99 ± 0,01, n.s.; Control 0,25mM CaCl2:0,97 ± 0,05, n.s. (versus Control 1,33mM); PDBu 0,25mM CaCl2: 3,01 ± 0,31, **p<0,01; ##p<0,01, ANOVA con Bonferroni contra el control a ambas concentraciones de calcio respectivamente). Se observaron fenómenos opuestos a la inducción de silenciamiento, en los que tras la perfusión de PDBu se reclutaban sinapsis previamente inactivas (Figura 26A y 26E); sin embargo, las bajas concentraciones de calcio no son óptimas para evaluar el silenciamiento sináptico, pues a bajas intensidades de estimulación el silenciamiento sináptico se puede ver enmascarado por la disminución global de la probabilidad de liberación (Cousin y Evans, 2011) motivo por el cual no se analizó este efecto en esta serie de experimentos (Figura 26B, registros individuales y cuadrado azul en figura 26E). Al analizar el ajuste de las respuestas individuales enfrentadas (Control 1,33mM CaCl2: pendiente = 0,90 ± 0,01; r2 = 0,92; PDBu 1,33mM CaCl2: pendiente = 0,95 ± 0,01; r2 = 0,93, no significativo; Control 0,25mM CaCl2: pendiente = 0,96 ± 0,04; r2 = 0,91, no significativo vs. control 1,33mM CaCl2; PDBu 0,25mM CaCl2: pendiente = 1,38 ± 0,04; r2: 0,80, **p<0,01, ##p<0,01, vs. Control a 1,33mM y 0,25mM CaCl2, respectivamente), únicamente en el caso del PDBu a 0,25mM CaCl2 se encontró una pendiente significativamente superior a la recta x=y (línea verde). Estos datos confirman que la modulación de la eficacia sináptica por PDBu se ve ocluida a concentraciones fisiológicas de calcio en nuestro sistema, lo cual es un argumento a favor de la calcio independencia, al menos parcial, de la inhibición mediada por la activación del receptor CB1R. 198 Resultados  Figura 26- A) Imágenes representativas de un experimento de doble pulso a bajas concentraciones (0,25mM) de calcio, las flechas indican sinapsis reclutadas tras la perfusión de PDBu. B) Registros individuales en experimentos de doble pulso. C, D y E) Registros individuales enfrentados (R1 vs. R2), ajuste de las respuestas enfrentadas y orden de potenciación, respectivamente, a 1,33mM CaCl2 en control, negro y en PDBu, rojo. F, G y H) Registros individuales enfrentados (R1 vs. R2), ajuste de las respuestas enfrentadas y orden de potenciación, respectivamente, a 0,25mM CaCl2 en control, negro y en PDBu, rojo, n.s., no significativo; **p<0,01. Prueba t de Student en D y G; ANOVA con Bonferroni en E y H. 199 Resultados Finalmente, con objeto de corroborar la calcio independencia de la inhibición exocitótica mediada por el HU-210 se llevaron a cabo experimentos con un indicador ratiométrico de calcio, la sonda FURA-2 AM. Estos experimentos fueron diseñados para llevar a cabo estimulaciones sucesivas (50mM KCl, 10s) sobre las mismas neuronas, intercalando entre los estímulos, bien una perfusión con medio de lavado o bien una perfusión de distintos tiempos (1 minuto o 10 minutos) con HU-210. Encontramos una reducción similar de la entrada de calcio en ambos tiempos de incubación con HU-210, que no fue observada en condiciones control (Figura 27 Control R1: 1,07 ± 0,05; Control R2: 1,00 ± 0,05; no significativo, n=739; HU-210 1 min R1: 1,51 ± 0,02; HU-210 1 min R2: 1,18 ± 0,02, **p<0,01, n=771; HU-210 10 min R1: 1,34 ± 0,03; HU-210 10 min R2: 0,94 ± 0,02, **p<0,01, n=336, Prueba t de Student) puesto que solo aquellos tratamientos prolongados con el HU-210 dan lugar a una reducción exocitótica significativa, concluimos que los efectos sobre la exocitosis mediados por la activación del receptor CB1 son disociables de la inhibición de la entrada de calcio. Figura 27- Experimento de doble pulso con el indicador de calcio FURA-2 AM. La entrada de calcio se inhibió de forma similar en tratamientos cortos y prolongados con HU-210. n.s. no significativo; **p<0,01, Prueba t de Student. 200 Resultados  14- Efectos ultraestructurales asociados a la activación del receptor CB1 Puesto que la inhibición mediada por el HU-210 no parece ser exclusivamente atribuible a una inhibición de la entrada de calcio, decidimos analizar si la aplicación del agonista cannabinoide daba lugar a algún tipo de defecto posicional sobre las vesículas sinápticas, que pudiese estar influyendo en la disponibilidad de las mismas y el acoplamiento de la exocitosis a la entrada de calcio. Con el objeto de caracterizar ultra- estructuralmente, mediante microscopía electrónica de transmisión, el efecto mediado por el HU-210, se diseñaron una serie de experimentos en los que las células se trataron durante 10 minutos bien con medio de lavado, o con medio que contenía HU-210 5μM. Posteriormente las células se fijaron y procesaron para su análisis mediante microscopía electrónica. Encontramos que el tratamiento con HU-210 no producía ninguna modificación en el número de vesículas totales medias en los terminales de neuronas granulares en cultivo (Figuras 28E; Control: 30 ± 2 SVs/sinapsis; HU-210: 34 ± 3 SVs/sinapsis, no significativo, Prueba t de Student) lo que permitió el análisis porcentual de la posición de las vesículas sinápticas respecto a la zona activa. Se identificó una retracción de las vesículas en los botones de las neuronas tratadas con HU-210 (Figura 28A, parte superior y 28B; Porcentaje de vesículas a menos de 10 nm de la membrana presináptica, Control: 14,31 ± 0,78 %, n=38; HU-210: 5,78 ± 0,67 %, n=44, **p<0,01 Prueba t de Student. Número medio de vesículas a menos de 10 nm de la zona activa, Control: 4,0 ± 0 SVs/sinapsis, n =38; HU-210: 2,0 ± 0 SVs/ sinapsis, n=44, **p<0,01, Prueba t de Student). Tratando de corroborar este efecto en un sistema biológico distinto decidimos reproducir este experimento en sinaptoneurosomas de corteza cerebral de ratón; estos muestran la ventaja de ser extraídos del tejido nativo y de permitirnos la caracterización de los efectos del HU-210 en animales carentes del gen del receptor CB1. 201 Resultados Figura 28- A) Imágenes representativas de la disposición de las SVs en control y tras el tratamiento con HU-210 en células granulares de cerebelo, (escala 100nm, fila superior), en sinaptoneurosomas provenientes de ratones carentes del receptor CB1R (cnr1-/-, escala 150nm, fila media) o en sinaptoneurosomas de ratones silvestres (cnr1+/+, escala 150nm, fila inferior). Cuantificaciones del porcentaje de vesículas por zona activa en función de la distancia y (en figuras insertadas) número medio de vesículas a menos de 10 nm en células granulares de cerebelo (B), en sinaptoneurosomas de ratones cnr1-/- (C) o en sinaptoneurosomas de ratones cnr1+/+ (D), en control (negro) y tras el tratamiento con HU- 210 (rojo). E) y F) son cuantificaciones del número medio de vesículas por terminal en células granulares de cerebelo y en sinaptoneurosomas corticales, respectivamente. n.s. no significativo; **p<0,01; Prueba t de Student. 202 Resultados  El defecto en posicionamiento de las vesículas sinápticas encontrado en células granulares de cerebelo se reprodujo en sinaptoneurosomas provenientes de corteza cerebral de ratones genéticamente normales (Figura 28A filas media e inferior, 28C y 28D, Sinaptoneurosomas cnr1+/+; Porcentaje de vesículas a menos de 10 nm, Control: 9,24 ± 0,75 %, n=42; HU-210: 4,27 ± 0,46 %, n=31, **p<0,01 Prueba t de Student; Número medio de vesículas a menos de 10 nm; Control: 4,0 ± 0; HU-210: 2,0 ± 0,0, **p<0,01 Prueba t de Student; Sinaptoneurosomas cnr1-/-; Porcentaje de vesículas a menos de 10nm, Control: 11,70 ± 0,77, n=34; HU-210: 10,56 ± 1,01, n=34, p<0,05, Prueba t de Student; Número medio de vesículas a menos de 10 nm; Control: 4,0 ± 0,0; HU-210: 4,0 ± 0,0, p>0,05 Prueba t de Student). El número medio de vesículas sinápticas por sinapsis analizada no se vio modificado ni por los tratamientos, ni por las características genéticas de los ratones (Figura 28F, Número medio de vesículas/zona activa: cnr1+/+ Control: 50 ± 4; cnr1+/+ HU-210: 50 ± 6, no significativo; cnr1-/- Control: 43 ± 4, no significativo; cnr1-/- HU-210: 43 ± 5, no significativo, ANOVA con Bonferroni). Estos resultados junto con la calcio independencia parcial de la inhibición de la entrada de calcio que exhibe este tipo de depresión sináptica, indican que el efecto inhibitorio del HU-210 es atribuible a una redistribución del aparato vesicular sináptico. 15- La activación del receptor CB1 induce una reducción del pool de reciclamiento Tratando de evaluar si los datos ultraestructurales eran paralelos a una redistribución de las vesículas sinápticas en los distintos pools de vesículas, se llevaron a cabo experimentos en los que se analizaba de forma acumulativa la exocitosis sináptica desencadenada por una estimulación. Para ello se uso la bafilomicina, un inhibidor de la V-ATPasa que impide la re-acidificación de las vesículas que tiene lugar tras la 203 Resultados endocitosis. Esto permite que todas las vesículas que se hayan fusionado con la membrana presináptica durante un periodo de estimulación (pool de reciclamiento), emitan una señal fluorescente a pesar de haberse endocitado, pues al no ser posible su re-acidificación, tampoco se observa un apagamiento de la fluorescencia de la VGluT1- pHluorina (Ariel y Ryan, 2010). Se estudiaron dos parámetros en estos experimentos, la fracción correspondiente al pool de reciclamiento en control y tras el tratamiento con HU-210 a distintas concentraciones de calcio (0,25mM; 1,33mM y 5mM), y el porcentaje de respuestas silentes en cada una de estas concentraciones de calcio. Encontramos una reducción significativa del pool de reciclamiento tras el tratamiento con HU-210 a todas las concentraciones de calcio ensayadas, así como un aumento del número de botones silentes. La fracción de vesículas correspondiente al pool de reciclamiento a las distintas concentraciones de calcio fue la siguiente (Figura 29 y 30B; 0, 25mM CaCl2, Control: 16,03 ± 0,89 %, N=3, n=193; HU-210: 7,33 ± 0,38 %, N=3, n=379, **p<0,01 ANOVA con Bonferroni; 1,33mM CaCl2, Control: 31,19 ± 0,77 %, N=4, n=402; HU-210: 15,19 ± 0,63 %, N=4, n=267, **p<0,01 ANOVA con Bonferroni; 5mM CaCl2, Control: 36,60 ± 0,16 %, N=4, n=607; HU-210: 18,23 ± 0,90, N=4, n=238, **p<0,01, ANOVA con Bonferroni y K-S Test). El número de botones silentes (definidos en estos experimentos como aquellos cuya señal acumulativa no superaba el 4% sobre la línea base), aumentó de forma drástica tras el tratamiento con HU-210 a todas las concentraciones de calcio (Figura 30A; Porcentaje de botones silentes: 0,25mM CaCl2, Control: 8,42 ± 1,36 %; HU-210: 49,92 ± 1,20 %, *p<0,05, Prueba t de Student; 1,33 mM CaCl2, Control: 1,97 ± 0,67 %; HU-210: 19,14 ± 5,17 %, *p<0,05 Prueba t de Student; 5mM CaCl2: Control: 0,97 ± 0,30 %; HU-210: 12,32 ± 3,62 %, *p<0,05 Prueba t de Student) si bien es cierto que el aumento a 0,25mM fue mucho mayor, de nuevo cabe mencionar que las bajas concentraciones de calcio no son 204 Resultados  óptimas para evaluar el silenciamiento sináptico, debido a la disminución global de la probabilidad de liberación. Figura 29- Medias cinéticas obtenidas en experimentos realizados en presencia de bafilomicina a 0,25mM (A), 1,33mM (C) y 5mM CaCl2 (E) respectivamente; obsérvese que la reducción en el pool de reciclamiento inducida por el HU-210 fue significativa a todas las concentraciones de calcio ensayadas. En B, D y F) se muestran las distribuciones de probabilidad acumulada de la fracción correspondiente al pool de reciclamiento a las distintas concentraciones de calcio, **p<0,01 Kolmogorov-Smirnov Test 205 Resultados Se puede considerar que el incremento de fluorescencia registrado durante los primeros milisegundos de un experimento realizado en presencia de bafilomicina corresponde al RRP (Neves y Lagnado, 1999; Rizzoli y Betz, 2005). Limitados por la resolución temporal, llevamos a cabo un ajuste lineal (Figura 30; y=a + mx; a=0) de los primeros tramos de la fase exocitótica, encontrando una reducción de la pendiente tras el tratamiento con el HU-210, que es consistente con los datos de microscopía electrónica. Figura 30- A) Porcentaje de botones silentes a las distintas concentraciones de calcio en control (negro) y tras la activación persistente del receptor CB1 (rojo). B) Fracción de vesículas media correspondiente al pool de reciclamiento a distintas concentraciones de calcio. D, E y F son los ajustes lineales de las pendientes de exocitosis a las concentraciones de calcio indicadas; n.s., no significativo; *p<0,05; **p<0,01. Prueba t de Student en A, D E y F; ANOVA con Bonferroni en B; D) r2 control: 0,80; r2 HU- 210: 0,81; E) r2 control: 0,99 ; r2 HU-210: 0,95; F) ) r2 control: 0,97 ; r2 HU-210: 0,94. 206 Resultados  16- La inducción de silenciamiento es atribuible a una disminución en los niveles de cAMP Una vez confirmada la calcio independencia del silenciamiento sináptico inducido por el tratamiento prolongado con un agonista del receptor CB1, se estudió la dependencia de este fenómeno de la inhibición de la adenilato ciclasa mediada por la activación de dicho receptor. En nuestro sistema, el tratamiento prolongado con el agonista HU-210 (10min, 5µM) dio lugar a una reducción drástica de los niveles de cAMP (expresados en picomoles de cAMP por cada 100.000 células y normalizados al basal) similar a la observada tras tratar las células con el inhibidor de la adenilato ciclasa SQ-22536 (25', 100µM), sin embargo la incubación con ambos compuestos de forma simultánea produjo un efecto parcialmente aditivo, indicando que la inhibición producida por la activación del receptor CB1 sobre la adenilato ciclasa no es total, lo que puede ser debido a una deslocalización parcial de un subpoblación de receptores CB1 y determinadas adenilato ciclasas. Utilizamos el tratamiento con Forskolina a modo de activador positivo de nuestro sistema, encontrando una elevación de los niveles de cAMP de aproximadamente 70 veces la concentración observada en el basal (Figura 31A; Basal: 1,28 ± 0,02 pmoles/104 cels; 100 ± 0%; SQ-22536: 0,75 ± 0,06 pmoles/104 cels; 58,37 ± 4,13%, **p<0,01; HU-210: 0,84 ± 0,02 pmoles/104 cels; 65,18 ± 4,33%, **p<0,01; HU-210+SQ22536: 0,50 ± 0,08 pmoles/104 cels; 38,85 ± 6,21%, **p<0,01; Forskolina: 89,97 ± 12,64 pmoles/104 cels; 7007,36 ± 1083,76%, **p<0,01). Las concentraciones de cAMP sin normalizar en cada uno de los distintos tratamientos se recogen en la figura 31A y los valores normalizados de cada uno de los días en la tabla 31C. 207 Resultados Figura 31- Niveles de cAMP en respuesta a los distintos tratamientos en pmoles/100.000 células (A) y normalizados al control (B); **p<0,01 vs. control; ##p<0,01 vs Forskolina. Los datos normalizados de cada uno de los días de experimento se recogen en C (cada fila corresponde a un día distinto de experimento y a un cultivo diferente). 17-La activación de la vía del cAMP previene, de forma PKA-independiente y EPAC-dependiente, la inducción de silenciamiento sináptico mediada por CB1R. Los ensayos de acumulación de cAMP realizados en presencia del agonista HU-210 junto con los experimentos funcionales con el indicador ratiométrico de calcio FURA-2 AM parecían apuntar a una calcio independencia, al menos parcial, del fenómeno de silenciamiento, que a su vez era paralelo a un descenso en las concentraciones de cAMP. Por este motivo decidimos llevar a cabo experimentos funcionales en los que se trató de prevenir la inducción del silenciamiento sináptico mediado por la activación del 208 Resultados  receptor CB1 incrementando farmacológicamente los niveles de cAMP e intentando disecar molecularmente la cascada de señalización implicada en este fenómeno. Para ello llevamos a cabo experimentos funcionales en los que la inducción del silenciamiento sináptico por el tratamiento prolongado con el agonista HU-210 (10 min, 5µM) era precedida por una incubación con el activador directo del sitio activo de la adenilato ciclasa (Tesmer et al., 1997), la Forskolina (50µM, 10min). Encontramos que la forskolina, por sí sola era capaz de prevenir la totalidad de los efectos funcionales inducidos por una incubación prolongada con un agonista CB1, en lo referente a la magnitud de la respuesta exocitótica y al número de botones silentes. Tratando de establecer en qué medida la prevención del efecto del HU-210 era dependiente de la activación por parte del cAMP de su diana canónica, la PKA, decidimos pre-tratar las células con H-89, un inhibidor selectivo de la PKA que compite con el quelato magnesio-ATP por la unión al centro activo de la enzima (Lochner y Moolman, 2006), de forma previa a la incubación con Forskolina. Descubrimos que, si bien la recuperación de la respuesta exocitótica no era total tras la inhibición de la PKA, sí se pudo observar una dramática reducción del número de botones silentes, lo que pone de manifiesto la existencia de mecanismos PKA dependientes e independientes que subyacen a la inhibición mediada por cannabinoides (Figura 32 C; Control, respuesta: 35,61 ± 1,07%; N=3, n=169; HU-210, respuesta: 13,45 ± 1,23%; **p<0,01 vs control, N=5, n=159; HU-210+Fsk, respuesta: 32,94 ± 1,08%; no significativo vs. control, ##p<0,01 vs. HU-210; N=4, n=269; HU-210+Fsk+H-89, respuesta: 24,29 ± 0,75%; **p<0,01 vs. control, ##p<0,01 vs. HU-210, N=7, n=417; ANOVA con Bonferroni; los datos referidos al número de respuestas silentes en todas las condiciones farmacológicas se compilan en la figura 34). 209 Resultados Figura 32- A) Protocolo de incubación empleado en cada condición, el código de colores es válido a lo largo de la figura. B) Distribución de probabilidad acumulada de las respuestas exocitóticas individuales. C) Medias cinéticas de la población total de botones, obsérvese que la inhibición de la enzima PKA permite una recuperación parcial de la respuesta. D) Gráfica de columnas de las respuestas promediadas en C, **p<0,01 vs. control; ##p<0,01 vs. HU-210, ANOVA con Bonferroni. Con el objetivo de corroborar y estudiar en profundidad la independencia parcial de PKA que observamos en estos experimentos, llevamos a cabo una serie de experimentos funcionales en los que se trató de prevenir el efecto del HU-210 mediante la activación directa de la enzima a la que clásicamente se le han atribuido la mayoría de las acciones mediadas por el cAMP, la PKA. Mediante el uso del activador selectivo del dominio regulador de la PKA, el N6-Benzoil-cAMP (200µM, 5min) se intentó revertir el silenciamiento inducido por HU-210; el esquema del protocolo empleado para las 210 Resultados  incubaciones se detalla en la figura 33 A. La activación directa de la PKA tras una incubación de 10 minutos con el agonista HU-210 no fue suficiente para revertir el fenómeno de silenciamiento y solo dio lugar a una recuperación parcial de las respuestas exocitóticas medias, si bien esta tendencia no mostró significación estadística con respecto al HU-210 (Figura 33 C; Control, respuesta: 45,93 ± 1,48 %, N=2, n=138; HU-210, respuesta: 15,90 ± 1,52%, N=2, n=96, **p<0,01 vs. control; HU-210 + N6- Bnz-cAMP, respuesta: 18,98 ± 0,95%, N=6, n=251, **p<0,01 vs. control; no significativo vs. HU-210, ANOVA con Bonferroni) Figura 33- A) Protocolo de incubación empleado en cada condición, el código de colores es válido a lo largo de la figura. B) Distribución de probabilidad acumulada de las respuestas exocitóticas individuales. C) Medias cinéticas de la población total de botones, la activación de la enzima PKA no contrarrestó el efecto del HU-210. D) Gráfica de columnas de las respuestas promediadas en C, **p<0,01 vs. control; ANOVA con Bonferroni. 211 Resultados Una vez corroborada la independencia parcial de la PKA en el fenómeno de silenciamiento, tratamos de identificar a la diana molecular activada por cAMP responsable de la prevención del silenciamiento sináptico mediado por el HU-210. La proteína EPAC (del inglés Exchange Protein direcctly Activated by C AMP) es un factor intercambiador de nucleótidos de guanina activable por cAMP descubierto en 1998 (de Rooij et al., 1998). Su caracterización en células no neuronales demostró su implicación en la regulación de la exocitosis mediada por cAMP (Renstrom et al., 1997; Ozaki et al., 2000), mientras que en células neuronales la demostración de su implicación en este tipo de procesos es más reciente (Sakaba y Neher, 2003; Kaneko y Takahashi, 2004; Gekel y Neher, 2008). Para averiguar si parte de los efectos mediados por la activación del receptor CB1 podían ser prevenidos por la activación directa de la proteína EPAC, se diseñaron una serie de experimentos en los que las células se preincubaron con el activador selectivo de la proteína EPAC, el 8-Cpt-2'-O-Me-cAMP (50µM, 15 min.). El tratamiento con el activador de EPAC de forma previa a la inducción de silenciamiento con HU-210, redujo drásticamente el número de respuestas silentes y compensó las reducción exocitótica global mediada por la activación de CB1 (Figura 34 C; Control, respuesta: 36,87 ± 1,29%, N=4, n=183; HU-210, respuesta: 27,11 ± 1,76%, N=5, n=136; **p<0,01; HU-210 + 8-Cpt-cAMP, respuesta:40,96 ± 1,36%, N=5, n=144, no significativo). El porcentaje de botones silentes en las distintas condiciones se enumera a continuación y se ilustra en la figura 34 (Porcentaje de botones silentes; Control: 0,76 ± 0,35%, N=13; Forskolina: 0 ± 0%, N=2; H-89: 4,05 ± 2,69%, N=5; Forskolina+H-89: 1,61 ± 1,00, N=3; HU-210: 30,33 ± 4,77 %, N=12; HU- 210+Forskolina: 1,54 ± 0,73%, N=4; HU-210+Forskolina+H-89: 6,44 ± 1,30%, N=7; HU-210+8-Cpt: 4,33 ± 1,29 %, N=5; HU-210+N6-Bnz-cAMP: 23,40 ± 4,36, N=6) 212 Resultados  Figura 34- A) Protocolo de incubación empleado en cada condición experimental. B) Distribución de probabilidad acumulada de las respuestas exocitóticas individuales. C) Medias cinéticas de la población total de botones, obsérvese que la activación de EPAC contrarrestó el efecto del HU-210. D) Gráfica de columnas de las respuestas promediadas en C. E) Porcentaje de botones silentes en las condiciones indicadas, corresponden a las figuras 32 y 33, F) Se indican los valores correspondientes a cada tratamiento así como su N; **p<0,01 vs. control; ##p<0,01 vs. HU-210; n.s. no significativo; ANOVA con Bonferroni en todas las comparaciones. Fsk: Forskolina; HU: HU-210; 6Bnz: N6Bnz-cAMP. 213 Resultados 18- La activación de la proteína EPAC es capaz de revertir el fenómeno de silenciamiento sináptico Tratando de profundizar en la reversibilidad y en el curso temporal del proceso de silenciamiento, se llevaron a cabo experimentos en los que las incubaciones con el activador de la proteína EPAC se llevaban a cabo de forma ulterior a la inducción de silenciamiento por la activación de CB1R durante 10 minutos y tras un primer pulso de estimulación que permitía definir la población de botones silentes. En primer lugar caracterizamos temporalmente la reversibilidad del fenómeno, con objeto de definir una ventana temporal en la que llevar a cabo una aproximación farmacológica que adoleciese de una mínima influencia de la reversión espontanea del silenciamiento. Figura 35- A) Esquema de los protocolos experimentales empleados para evaluar la persistencia del silenciamiento sináptico, el código de colores se mantiene a lo largo de la figura (negro: 4 minutos periodo inter-estímulo; rojo: 10 minutos periodo inter-estímulo). B) Ejemplo de re-activación espontanea de botones previamente silenciados con HU-210 tras 10 minutos en reposo después de una primera estimulación (puntas de flecha), barra de escala=5 μm. C) Porcentaje de botones activos y silentes durante el segundo pulso (P2 en A y B), relativizados a los botones silentes del primer pulso (P1 en A y B), *p<0,05, Prueba t de Student. 214 Resultados  Encontramos que un amplio porcentaje de respuestas silentes se recuperaba de forma espontanea tras un periodo de 10 minutos en reposo precedido por un primer pulso de estimulación, mientras que no fuimos capaces de observar esta recuperación espontanea tras un periodo de 4 minutos (Figura 35B, Reversión espontanea tras 10 minutos: 68,95 ± 9,45 % de botones silentes, N=3; Reversión espontanea tras 4 minutos: 25,93 ± 6,40 % de botones silentes, N=7, *p<0,05, Prueba t de Student). Motivados por estas observaciones decidimos llevar a cabo las aproximaciones farmacológicas en un periodo de tiempo no superior a los 4 minutos de reposo entre estimulaciones sucesivas. En estos cuatro minutos las células se perfundieron bien con medio de lavado (condición control), bien con el activador selectivo de la proteína EPAC (8-p-Cpt-2-Me-O-cAMP, 50μM, 4 minutos). Encontramos que el agonista de la proteína EPAC no solo era capaz de prevenir el fenómeno de inducción de silenciamiento, como se muestra en la figura 34, sino que también era capaz de revertirlo una vez puesto este en marcha por la activación prolongada del receptor CB1 (el protocolo experimental se detalla en la figura 35A). Para disecar finamente el fenómeno de silenciamiento del fenómeno clásico de inhibición presináptica, llevamos a cabo una segregación en las distintas subpoblaciones de respuestas sinápticas (respuestas activas y respuestas silentes) para observar específicamente los efectos del tratamiento sobre cada una de estas. Encontramos que el tratamiento con el activador de EPAC dio lugar a una recuperación de las cinéticas globales debido principalmente a la reactivación de respuestas silentes y no por la potenciación de las previamente activas (Figuras 36, B, C y D) ya que este fenómeno se observó también en condiciones control y es atribuible a la transitoriedad del proceso inhibitorio (Figura 37 A y 37 B). 215 Resultados Figura 36- A) Esquema del protocolo experimental; B C y D) Cinéticas en neuronas control (negro) y en tratadas con 8-pCpt (rojo) tras la activación prolongada de CB1R en la población total, la subpoblación de sinapsis activas y la de sinapsis silentes, respectivamente. E) Porcentaje de sinapsis silentes, normalizado al total de sinapsis silentes durante el primer pulso. F) Ejemplo de activación de botones previamente silenciados con HU-210 tras 4 minutos de tratamiento con 8-pCpt, escala 20s, 10% Fluorescencia. **p<0,01 Prueba t de Student. 216 Resultados  De forma acorde a estas observaciones encontramos que el porcentaje de botones silentes que permanecía inactivo en el segundo pulso se redujo drásticamente al tratar con 8-p-Cpt (Figura 36 E; Porcentaje de botones silentes relativizado a los silentes en el primer pulso; Control: 74,06 ± 6,40, N=7; 8-p-Cpt, N=9). Los picos de fluorescencia de cada una de las subpoblaciones en los distintos tratamientos se recogen en la figura 38 (Figura 38A; Control [N=7, n Total=358; n Activos=292; n Silentes=66]; Total P1: 15,77 ± 0,66%; Activos P1: 19,16 ± 0,65%, **p<0,01; Total P2: 19,45 ± 0,66%; **p<0,01; Activos P2: 22,45 ± 0,66%; **p<0,01 vs. Total P1; ##p<0,01 vs Total P2; 8- Cpt [N=9, n total=552; n Activos=413; n Silentes=139]; Total P1: 16,27 ± 0,70%; Activos P1: 21,92 ± 0,73%, **p<0,01; Total P2: 26,85 ± 0,56%, **p<0,01; Activos P2: 28,50 ± 0,63, **p<0,01 vs. Total P1; no significativo vs. Total P2). En cuanto a las respuestas exocitóticas de la población silente se recogen sus medias en la figura 37 B. Figura 37- A) Respuestas exocitóticas medias de la subpoblación de sinapsis activas y de la población total (A) y de la subpoblación de sinapsis silentes (B), referida a la figura 36. Leyenda: Act P1: Botones Activos en el Pulso 1; Tot P1: Población total en el Pulso 1; Act P2: Botones Activos en el Pulso 2; Tot P2: Población total en el Pulso 2 (A); P1: Pulso 1; P2: Pulso 2 (B). **p<0,01; n.s. no significativo; ANOVA con Bonferroni en ambos casos. 217 Resultados La subpoblación de sinapsis silentes experimentó una re-activación estadísticamente significativa en condiciones control (Figura 37B; Control P1; 0,80 ± 0,50 %; Control P2: 6,15 ± 1,0 %, **p<0,01); en cualquier caso está reactivación fue significativamente mayor al tratar con 8-p-Cpt-2-Me-O-cAMP, lo que queda reflejado en la comparación de las respuestas exocitóticas de las sinapsis silentes de ambas condiciones durante el segundo pulso de experimento (Figura 37B; 8-p-Cpt P1: 0,65 ± 0,41%, no significativo vs. Control P1; 8-p-Cpt P2: 21,91 ± 1,07 %; **p<0,01 vs. 8-p-Cpt P1; ##p<0,01 vs. Control P2). Estos resultados indican que la vía Adenilato Ciclasa/cAMP/EPAC está implicada en el silenciamiento sináptico mediado por el receptor CB1 19- Marcadores presinápticos de la susceptibilidad al silenciamiento mediado por CB1R Una vez caracterizado farmacológicamente el fenómeno de silenciamiento, decidimos llevar a cabo aproximaciones, mediante inmunocitoquímica post-hoc, que nos permitiesen dilucidar si existían características intrínsecas a las distintas sinapsis, a las que atribuir una susceptibilidad diferencial al silenciamiento. Aparte de las limitaciones metodológicas ya comentadas en el apartado 12 para el uso de la sonda FM1-43, existe una adicional en lo referente al estudio del silenciamiento sináptico; a diferencia de la VGluT1-pHluorina, que es un indicador codificado en una proteína, la FM1-43 es una sonda que experimenta un apagamiento constante en tiempos largos de experimento, lo que impide establecer un umbral numérico en torno al que clasificar las respuestas como silentes o activas. Esta limitación metodológica se ilustra en la figura 38A, en la que se muestra el paralelismo cinético entre una población de botones renuentes a responder durante la estimulación y botones estimulados en ausencia de calcio extracelular y en 218 Resultados  presencia del quelante EGTA. Debido a que esta ausencia virtual de respuesta suele ir acompañada de una pérdida pequeña, aunque cuantificable, de los niveles de fluorescencia (aproximadamente un 15%), como se observa en la figura 38B, decidimos clasificar como botones silentes aquellos en los que, a pesar de poder apreciarse un apagamiento paulatino de la fluorescencia, no se observaron respuestas ante ninguno de los pulsos de estimulación. Figura 38- A) Se muestra un conjunto de botones silentes (Sil) en comparación con una media obtenida a partir de botones estimulados en presencia de EGTA y en ausencia de calcio extracelular (trazo negro grueso), se muestran dos botones activos (Act) para su comparación con la subpoblación de silentes. B) Cinética media de botones estimulados en presencia de EGTA y en ausencia de calcio extracelular junto a la cinética de los botones silentes; obsérvese que el apagamiento progresivo de fluorescencia es evidente en ambos casos. a) y b) hacen referencia a distintos tiempos experimentales, a) es previo y b) posterior a la estimulación. La micrografía insertada muestra una sinapsis silente antes y después de la estimulación. Una vez definidas qué respuestas podían ser clasificadas como silentes en los experimento de FM1-43, decidimos llevar a cabo un análisis en el que se trató de determinar si existía una correlación entre la expresión del efecto de silenciamiento y la cantidad de distintas proteínas relacionadas con procesos exocitóticos en terminales 219 Resultados presinápticos individuales, así como con la mayor localización del receptor CB1 en los distintos compartimentos presinápticos. Para ello se realizaron experimentos funcionales seguidos por una inmunocitoquímica post-hoc, con objeto de relacionar las respuestas cinéticas tras un tratamiento con HU-210 y los niveles de inmunorreactividad de forma semi-cuantitativa. Se analizaron dos proteínas de la maquinaria exocitótica (RIM1α y Munc13-1) y el receptor presináptico CB1. El análisis del receptor CB1 se llevo a cabo en todos los experimentos, quedando estos finalmente constituidos por las parejas RIM1α/CB1R y Munc13-1/CB1R. La estrategia que se siguió para llevar a cabo una segregación a ciegas de las distintas respuestas, atendiendo a sus niveles de inmunorreactividad, fue separar las distintas respuestas en grupos atendiendo a dicho valor, relativizado a la media de cada campo. Arbitrariamente se segregaron tres grupos: aquellos botones cuyo valor de inmunorreactividad era inferior a 0,5 veces el valor medio de inmunorreactividad; aquellos cuyo valor de inmunorreactividad era superior a dos veces la media y la población total. Posteriormente se seleccionaron los botones pertenecientes a cada grupo (sin tener en cuenta sus cinéticas individuales) y se representó la media de respuesta de cada uno de estos grupos; mediante este tipo de segregación se evita cualquier tipo de sesgo, pues ni la selección de las regiones de interés ni la posterior segregación de las respuestas se lleva a cabo de modo manual. Se muestra un ejemplo de cómo se procedió a la segregación en la figura 39, representándose un resultado positivo de segregación de inmunorreactividad. 220 Resultados  Figura 39- A) Representación gráfica de la segregación en grupos de inmunorreactividad sobre el histograma total de inmunorreactividades normalizadas al valor promedio. B) Gráficas de descarga de FM1-43 de cada uno de los grupos de inmunorreactividad mostrados en el apartado A. Se encontró una relación entre el grado de descarga de FM1-43 inducido por una estimulación de 10 segundos de perfusión hipercalémica y los niveles de inmunorreactividad de la proteína RIM1α, si bien sólo aquellos terminales con valores de inmunorreactividad superiores a dos veces la media exhibieron una respuesta diferente a la población total, no encontrándose diferencias significativas en la población con niveles de IR inferiores a 0,5 veces la media de la población (Figura 40B; Población total de botones: 18,71 ± 0,34 %, N=4, n=541; Sub-población<0,5 media de IR: 17,69 ± 0,59 %, N=4, n=219, no significativo, K-S Test; Sub-población>2 media de IR: 21,31 ± 0,69 %, N=4, n=91, **p<0,01 K-S Test). Al dividir los valores normalizados de inmunorreactividad de la proteína RIM1α entre los valores normalizados de inmunorreactividad del receptor CB1, se obtuvo un cociente para cada uno de los terminales analizados al que denominamos cociente RIM1α/CB1R. Se observó una segregación de ambos grupos, encontrándose que aquellos botones con 221 Resultados bajo contenido en la proteína RIM1α y alto contenido en el receptor CB1 (RIM1α/CB1R < 0,5) exhibían una menor descarga de FM1-43, además, las respuestas silentes se encontraron siempre confinadas a esta subpoblación de botones (Figura 40 D; Población total de botones: 18,71 ± 0,34 %, N=4, n=541; Subpoblación<0,5 RIM1α/CB1R: 13,04 ± 0,97 %, N=4, n=55, **p<0,01, K-S Test; Subpoblación>2 RIM1α/CB1R: 20,74 ± 1,20 %, N=4, n=48, **p<0,01 K-S Test). Inesperadamente, no se encontraron diferencias en el grado de de descarga al segregar las poblaciones atendiendo a los niveles de inmunorreactividad de la proteína Munc13-1 (Figura 41 B; Población total de botones: 21,85 ± 0,19 %, N=4, n=3842; Subpoblación<0,5 media de IR: 22,27 ± 0,27 %, N=4, n=1892, no significativo, K-S Test; Subpoblación>2 media de IR: 20,98 ± 0,45 %, N=4, n=583, no significativo, K-S Test). Tampoco se encontraron diferencias para los cocientes de inmunorreactividad entre la proteína Munc13-1 y el receptor CB1 (Ratio Munc13-1/CB1R) a diferencia de lo observado para el par de marcadores RIM1α/CB1R (Figura 41 D; Población total de botones: 21,85 ± 0,19 %, N=4, n=3755; Sub-población<0,5 Munc13-1/CB1R: 20,53 ± 0,40 %, N=4, n=816, no significativo, K-S Test; Sub-población>2 Munc13-1/CB1R: 22,25 ± 0,32 %, N=4, n=1272, no significativo, K-S Test). Las diferencias observadas en el análisis de los distintos marcadores pueden deberse a la diferente sensibilidad de los anticuerpos o a los distintos mecanismos que rigen la función de estas dos proteínas, e indican el papel crucial de la proteína RIM en la susceptibilidad a los fenómenos inhibitorios operados por la activación del receptor CB1. Estos resultados demuestran que la expresión de distintos mecanismos de plasticidad puede venir determinada por características intrínsecas a cada sinapsis, pudiendo ser estos heterogéneos en función de la composición proteica de los distintos terminales. 222 Resultados  Figura 40- A) Imagen representativa de una inmunocitoquímica post-hoc contra RIM1α (verde) y CB1R (rojo), FM1-43 se muestra en azul (pseudocolor). Barra de escala = 50 μm. B) Gráfica de probabilidad acumulada de descarga de los distintos grupos de inmunorreactividad de RIM1α. C) Se muestran dos botones, uno de ellos con un alto cociente RIM1α/CB1R (a) y otro con bajo cociente RIM1α/CB1R (b). D) Gráfica de probabilidad acumulada de descarga de los distintos grupos de cocientes RIM1α/CB1R. E) Registros cinéticos de los terminales mostrados en C. **p<0,01; n.s. no significativo; K-S Test. 223 Resultados Figura 41- A) Imagen representativa de una inmunocitoquímica post-hoc contra Munc13-1 (verde) y CB1R (rojo), FM1-43 se muestra en azul (pseudocolor). Barra de escala = 50 μm. B) Gráfica de probabilidad acumulada de descarga de los distintos grupos de inmunorreactividad de Munc13-1. C) Se muestran dos botones, uno de ellos con un alto cociente Munc13-1/CB1R (a) y otro con bajo cociente Munc13-1/CB1R (b). D) Gráfica de probabilidad acumulada de descarga de los distintos grupos de cocientes Munc13-1/CB1R. E) Registros cinéticos de los terminales mostrados en C. **p<0,01; n.s. no significativo; K-S Test. 224 225 V- Discusión "Razonar y convencer, ¡Qué difícil, largo y trabajoso! ¿Sugestionar? ¡Qué fácil, rápido y barato! S. Ramón y Cajal 226   227    Discusión IV-Discusión 1-Diferencias en la eficacia de recicl amiento y heterogeneidad de respuestas sinápticas En nuestro modelo experimental (células granulares de cerebelo de rata a 7DIV), mediante experimentos con la sonda FM1-43, observamos un amplio repertorio de respuestas cinéticas tras la estimulación por perfusión de una solución que contenía KCl 50mM. A pesar de que las respuestas individuales se distribuyeron de forma continua, mediante un análisis de conglomerados y un ajuste a dos gaussianas, fue posible segregar dos subpoblaciones de respuestas, en torno a un umbral de aproximadamente un 40 % de descarga respecto a la fluorescencia inicial de cada una de las sinapsis individuales. A estas dos poblaciones se las denominó: población de descarga débil (población cuya respuesta total no superó el 40% de su fluorescencia inicial) y población de descarga fuerte (aquella cuya respuesta fue superior al 40% de su fluorescencia inicial). La variabilidad observada en términos de eficacia de reciclamiento de los terminales individuales ha de guardar relación con alguna de las fases del ciclo vesicular, ya sea el periodo de exocitosis monitorizado durante el experimento (lo que conduciría a una estimación directa de la fuente de variabilidad) o el periodo de exo/endocitosis inducido con objeto de incorporar la sonda en el lumen de las vesículas sinápticas (lo que conduciría a un análisis indirecto de la fuente de variabilidad). Una vez segregadas las dos poblaciones de respuestas se analizaron en ellas otros parámetros relacionados con la eficacia de reciclamiento tales como las fluorescencias iniciales de cada uno de los botones sinápticos (parámetro relacionado con el total de vesículas exocitadas y posteriormente endocitadas durante la fase de incorporación de la sonda) y las constantes temporales de exocitosis (relacionadas con   228      Discusión  la velocidad de exocitosis durante el periodo de estimulación). Respecto a las constantes de exocitosis, las cinéticas observadas mostraron un patrón bifásico de descarga, lo que permitió su ajuste a un decaimiento exponencial de segundo orden, que arrojó dos constantes temporales: una rápida, relacionada con las primeras fases de exocitosis durante la estimulación (τ1) y una lenta, relacionada con las fases tardías de exocitosis durante la estimulación (τ2). El ajuste a un decaimiento exponencial de segundo orden es coherente con lo descrito previamente por otros grupos para distintos tipos neuronales (Klingauf et al., 1998; Mozhayeva et al., 2002) lo que nos permitió corroborar la validez de las respuestas sinápticas que se estaban analizando. Se encontró que la población de descarga débil adolecía de una menor velocidad en la liberación de su contenido vesicular, lo que guarda relación bien con una menor eficacia de exocitosis o bien con una menor eficacia de reciclamiento de las vesículas exocitadas durante la fase de incorporación de la sonda. Paralelamente se encontró que la fluorescencia inicial de los botones de descarga débil era superior a la de los botones de descarga fuerte; este dato es indicativo de que la superficie de membrana vesicular expuesta al medio extracelular conteniendo FM1-43 durante la fase de incorporación (parámetro directamente relacionado con el número de vesículas exocitadas durante dicha fase) fue mayor en esta subpoblación de botones. Este dato siembra una duda acerca de la estrategia de segregación de las respuestas sinápticas en dos subpoblaciones, pues si el porcentaje de descarga es normalizado a la fluorescencia inicial de los botones y esta fluorescencia es mayor en una de las subpoblaciones, aun a pesar de que la fracción exocitada, en términos absolutos (u.a.f. de FM1-43), por las dos subpoblaciones, fuese de la misma magnitud, los botones con mayor fluorescencia inicial descargarían una menor fracción de fluorescencia normalizada. Esta duda quedó disipada al realizar experimentos en cultivos pre-tratados durante 24 horas con el fitoestrógeno daidzeina,   229    Discusión compuesto que acelera la maduración funcional de los cultivos neuronales (Chindewa et al., 2008; Hurtado et al., 2012). En estas condiciones se observó un aumento del porcentaje de botones que exhibían un patrón de descarga fuerte, de forma paralela a un aumento de las fluorescencias iniciales. Este dato indica que la menor eficacia de reciclamiento, asociada en condiciones control a unas mayores fluorescencias iniciales, no es un artefacto matemático derivado de la normalización. Otro factor que podría estar afectando a las fluorescencias iniciales, y por tanto al dato obtenido tras la normalización a estas, es la exocitosis espontanea que pudiese tener lugar durante el tiempo de lavado de la sonda. Con objeto de distinguir si el tiempo de lavado estaba teniendo algún efecto en las fluorescencias iniciales, se llevaron a cabo experimentos en los que se modificó tanto el tiempo de lavado de la sonda como la presencia de calcio en el medio de lavado. El aumento de los tiempos de lavado disminuyó las fluorescencias iniciales de forma global, pero no las diferencias relativas entre ambos grupos de sinapsis, lo que descarta la posibilidad de que la menor fluorescencia inicial observada en los botones de descarga fuerte esté relacionada con un fenómeno de exocitosis espontanea. Por otro lado, en lo referente a la presencia o ausencia de calcio en el medio de lavado se observó que el calcio promovió, a todos los tiempos ensayados, una mayor fluorescencia inicial, fenómeno atribuible a que la compleción de la endocitosis sináptica es calcio dependiente (Dittman y Ryan, 2009; Wu et al., 2009; Cheung y Cousin, 2013), si bien es cierto que las diferencias relativas entre el grupo de descarga fuerte y el de descarga débil se mantuvieron independientemente de la presencia o ausencia de calcio en el medio. De forma paralela se encontró que ni los tiempos de lavado ni la presencia de calcio en el medio de lavado alteraban los porcentajes de descarga de las dos subpoblaciones de botones sinápticos.   230      Discusión  2- La magnitud de la exocitosis determina la eficacia de reciclamiento Motivados por estas observaciones decidimos diseñar una serie de experimentos para caracterizar el defecto en el ciclo vesicular subyacente a la pérdida en eficacia de reciclamiento en una subpoblación de terminales. Para dilucidar en qué medida la pérdida en eficacia de reciclamiento guardaba relación con la magnitud del fenómeno exocitótico que induce la incorporación de la sonda, se llevo a cabo un protocolo en el que se modificaron las concentraciones de calcio presentes en el medio extracelular durante dicha fase. De este modo, se trató de disminuir la magnitud de la estimulación neuronal durante la fase de carga, lo que presumiblemente conllevaría la fusión de un menor número de vesículas con la membrana plasmática o, al menos, una menor frecuencia de fusión vesicular. Se observó que la disminución de la concentración de calcio en el medio extracelular conllevó un aumento en las eficacias globales de reciclamiento. Este fenómeno no implicó una reducción en el número de botones marcados en la unidad de longitud, por tanto estos resultados se interpretan como una relación inversa entre el número de vesículas que se fusionan con la membrana y la eficacia de reciclamiento de las mismas, descartándose una reducción en el reclutamiento sináptico. La explicación más plausible a este hecho, sería pensar en que un exceso de membrana vesicular, fusionada con la membrana presináptica durante periodos de estimulación neuronal prolongada a concentraciones fisiológicas de calcio, estaría activando procesos no canónicos de endocitosis compensatoria, con menor eficacia de reciclamiento (Heuser y Reese, 1973; Clayton y Cousin, 2009; Hosoi et al., 2009; Saheki y De Camilli, 2012). La baja intensidad de estimulación (0,25 mM CaCl2 extracelular) no sería capaz de inducir una oleada masiva de exocitosis vesicular, previniendo al terminal presináptico de la puesta en marcha de los mencionados procesos (Clayton et al., 2008; Kim y von Gersdorff, 2009). De hecho, a 0,25 mM   231    Discusión CaCl2, solo pudimos detectar una representación marginal de los botones con baja eficacia de reciclamiento. Estos resultados serían acordes a lo descrito para formas de endocitosis masiva, en los que tras periodos sostenidos de exocitosis, se invaginan largas superficies de membrana que finalmente rinden, por gemación, intermediarios endocitóticos de tipo endosomal (Clayton et al., 2009; Saheki y De Camilli, 2012; Chandrasekar et al., 2013). 3- Concentraciones de FM1-43 y eficacia de reciclamiento La modificación de las concentraciones de sonda durante el periodo de carga se llevó a cabo con el objetivo de poner de manifiesto un marcaje diferencial de los botones, teniendo en cuenta las propiedades físico-químicas de la sonda FM1-43 (Cousin, 2008) así como las potenciales diferencias en composición lipídica de diferentes tipos de membranas endocitóticas, tal y como había descrito el grupo de Michael Cousin (Clayton y Cousin, 2008). Los experimentos realizados a las concentraciones elegidas (10μM, 5μM y 3μM) evidenciaron una disminución en el número de botones marcados, como reflejan las densidades de botones sinápticas en cada uno de los casos. Además, esta disminución en el número de botones funcionales fue acompañada selectivamente de una disminución del porcentaje de botones denominado de grupo de descarga fuerte, lo que quedó patente en la proporción de botones del grupo de descarga fuerte respecto a los del grupo de descarga débil. Este hecho tuvo impacto en las cinéticas medias de descarga, así como en las cinéticas parciales de descarga de cada uno de los grupos. Por tanto, la disminución de las concentraciones de sonda durante el periodo de carga dio lugar a una disminución virtual de la densidad de botones sinápticos en detrimento de aquellos botones de descarga fuerte o alta eficacia de reciclamiento. Las explicaciones   232      Discusión  al fenómeno observado pueden ser varias. En primer lugar, si las formas de endocitosis asociadas a reciclamiento de baja eficacia, son más lentas que las formas de endocitosis mediada por clatrina (Bartolome-Martin et al., 2012), lo observado en este experimento podría representar que el cierre del poro que comunica dichas formas de endocitosis con el medio extracelular es más lento que el paso de fisión vesicular en la endocitosis mediada por clatrina, lo que permitiría un mayor tiempo de exposición a la solución que contiene la sonda y por tanto una mayor partición de la sonda en la membrana. Otra posibilidad es la diferencia de hidrofobicidad de las membranas correspondientes a los distintos tipos de endocitosis. Es posible que distintos orgánulos membranosos intracelulares exhiban características diferenciales en lo que a hidrofobicidad se refiere (van Meer et al., 2008). Si el reciclamiento por medio de una u otra ruta de endocitosis implicase distintos tipos de orgánulos, sería plausible que variase la composición de las membranas recuperadas y su hidrofobicidad, reteniendo mejor la sonda FM1-43 y por tanto haciéndose patente esta inclusión diferencial de la misma en distintos tipos de membranas al disminuir las concentraciones. La selectividad de las distintas sondas por distintas fracciones de la membrana se ha puesto de manifiesto recientemente (Clayton y Cousin, 2008; Chung et al., 2010), demostrándose que la sonda FM1-43 marca preferentemente la endocitosis masiva por ser más hidrofóbica, mientras que la FM2-10, que difiere con FM1-43 en dos carbonos de la cola hidrocarbonada (Cousin, 2008), parece marcar preferentemente la endocitosis de vesículas simples (Clayton y Cousin, 2008). Sin embargo, en este trabajo los autores encuentran resultados opuestos a los obtenidos en nuestro laboratorio. En primer lugar cabe destacar que su aproximación metodológica se basa en lo siguiente: al aumentar las concentraciones de la sonda FM2- 10 (más hidrofílica) se consigue marcar las membranas que participan en la endocitosis masiva, que no se consiguen marcar a concentraciones estándar de FM2-10. Por otro   233    Discusión lado, la FM1-43 es un buen trazador tanto de la endocitosis masiva, como de la endocitosis mediada por clatrina a sus concentraciones estándar, pero al disminuir su concentración marca sólo la endocitosis de tipo vesicular simple. Atendiendo a las hidrofobicidades relativas tanto de las distintas fracciones membranosas como de las distintas sondas, es lógico que el aumento de concentraciones de FM2-10 (de carácter relativamente hidrofílico) marque la población de vesículas más hidrofóbica que no consigue marcar a concentraciones estándar. Pero lo opuesto en cuanto a la disminución de las concentraciones de FM1-43 no es totalmente intuitivo, pues al disminuir su concentración deberíamos aumentar su selectividad hidrofóbica, no empezar a marcar selectivamente la fracción membranosa algo más hidrofílica. Por otro lado, el protocolo de estimulación descrito en dicho trabajo para cargar/descargar la sonda es sustancialmente distinto al nuestro, pues ellos llevan a cabo un total de 4 rondas de estimulación (carga-descarga//carga2-descarga2) de las que comparan entre sí las dos descargas. Las dos primeras rondas de estimulación podrían haber inmovilizado una fracción del pool vesicular que no se tiene en cuenta en la segunda descarga, lo que haría observar una descarga más eficiente en el segundo periodo de descarga, correspondiente a la subpoblación de vesículas más fácilmente reutilizable, lo que posiblemente generaría una mayor tasa normalizada de descarga en el segundo estímulo, como realmente ocurre en dicho artículo (Clayton y Cousin, 2008). Nuestro siguiente objetivo fue, por tanto, comprobar si, efectivamente, las formas de endocitosis puestas en marcha tras la estimulación masiva de estas neuronas permanecían más tiempo en contacto con el medio extracelular o si, por el contrario, las diferencias de marcaje eran exclusivamente atribuibles a la hidrofobicidad relativa de cada tipo de membrana.   234      Discusión  4- Las formas de endocitosis poco efic aces persisten tras la estimulación. Coexistencia de rutas de reciclamiento Con la intención de caracterizar el curso temporal de las distintas formas de endocitosis y su contribución a cada uno de los patrones de descarga, se diseñaron una serie de experimentos en los que se trató de introducir el marcador FM1-43 en el lumen de las vesículas sinápticas exponiendo las neuronas granulares a la sonda de forma posterior a su estimulación. De este modo, se pueden trazar selectivamente aquellas formas de endocitosis lentas (y persistentes tras la estimulación), con objeto de disecar, tras una estimulación posterior, su contribución a los distintos patrones cinéticos. Al incorporar la sonda en estas condiciones se observaron varios efectos: una disminución de las cinéticas globales de descarga, una inversión de los porcentajes de respuestas cinéticas a favor de aquellas de descarga débil y una disminución del número de botones en la unidad de longitud. Estos resultados son compatibles con una contribución mayoritaria de un tipo de endocitosis lenta y persistente a los fenómenos de reciclamiento ineficaz, lo que es coherente con el marcaje selectivo de estas formas de endocitosis a bajas concentraciones de sonda. La presencia de una mayor superficie de membrana de aquellos orgánulos que participan en este tipo de endocitosis también podría dar cuenta de las diferencias observadas. Nuestra interpretación de estos resultados es que las formas de endocitosis asociadas al reciclamiento ineficaz son más lentas que las asociadas al reciclamiento eficaz y posiblemente impliquen la recuperación de mayores superficies de membrana (Richards et al., 2000). El razonamiento es el siguiente: en el caso de que la respuesta exocitótica observada en condiciones control durante el experimento de imagen venga determinada por la contribución relativa de dos mecanismos de endocitosis (uno eficaz y otro ineficaz) a la capacidad global de reciclamiento, suponemos que cuanto menor sea la respuesta de los botones, mayor será   235    Discusión la contribución de la vía considerada ineficaz. Independientemente de cuál fuese la endocitosis rápida, la eficaz o la ineficaz, su contribución a la fluorescencia inicial será mayor en las condiciones estándar de carga, ya que los intermediarios endocitóticos no estarían expuestos al medio de lavado durante los 10 minutos posteriores a la incorporación de la sonda. Lo opuesto es aplicable para la carga posterior a la estimulación. La contribución de las formas eficaces de endocitosis es mayor i) a bajas concentraciones de calcio; ii) a altas concentraciones de sonda y iii) al incorporar la sonda durante la estimulación; las formas ineficaces son más evidentes a i) altas concentraciones de calcio; ii) bajas concentraciones de sonda y iii) al incorporar la sonda de forma posterior a la estimulación. Mientras que el número de botones no se vio modificado al variar las concentraciones de calcio, lo que indica un cambio en los mecanismos de reciclamiento, sí se vio reducido al disminuir las concentraciones de sonda y al incorporarla de forma posterior a la estimulación, indicando que, sin modificar los mecanismos de reciclamiento (ya que la estimulación se llevó a cabo en las mismas condiciones), estas variaciones experimentales consiguen marcar selectivamente una sub-población de botones. Aunque estos tratamientos reducen significativamente el número de botones en la unidad de longitud, la magnitud de esta reducción nos lleva a pensar que ambos mecanismos coexisten temporalmente (en la mayoría de los casos) en un mismo terminal sináptico, durante la estimulación en condiciones control. Se concluye que la endocitosis asociada a formas ineficaces de reciclamiento es más lenta (la cara luminal de los orgánulos generados durante este proceso permanece más tiempo en contacto con el medio extracelular) y probablemente implique orgánulos que contengan una mayor superficie de membrana.   236      Discusión  5- Papel de la dinamina en las distintas formas de reciclamiento El estudio de la contribución de la dinamina a las distintas formas de reciclamiento, puso de manifiesto que en condiciones de intensa estimulación a concentraciones fisiológicas de calcio (1,33mM CaCl2 extracelular), se activaban mecanismos de endocitosis independientes de la actividad GTPasa de la dinamina. Sin embargo, en presencia de bajas concentraciones de calcio extracelular (0,25mM CaCl2 extracelular), todas las formas de endocitosis eran estrictamente dependientes de la actividad GTPasa de la dinamina (presumiblemente, endocitosis mediada por clatrina). Los orgánulos membranosos marcados con FM1-43 y endocitados en presencia de un inhibidor de la actividad GTPasa de la dinamina, mostraron una ausencia total de respuesta al llevar a cabo una estimulación posterior de estas células con cloruro potásico. Estos resultados indican que las rutas endocitóticas que contribuyen a la ineficacia en el reciclamiento son mayoritariamente dinamina independientes y únicamente se ponen en marcha en condiciones de estimulación intensa. La modificación de las condiciones de estimulación por disminución del calcio extracelular puso de manifiesto que estas vías no se activan a bajas intensidades de estímulo (condiciones en las que la mayoría de botones exhiben reciclamiento eficaz). Se han caracterizado inhibidores de la dinamina cuyo mecanismo de acción se basa en el impedimento de su reclutamiento a membrana, por competencia con determinados fosfolípidos de membrana en la unión a la mencionada enzima. Decidimos explorar si mediante este mecanismo de inhibición de la dinamina era posible reproducir los resultados obtenidos en presencia de dynasore. Sorprendentemente, observamos una ausencia total de marcaje con FM1-43 en todas las condiciones ensayadas. Los bajos valores de fluorescencia de las regiones identificadas como potenciales elementos presinápticos impidieron la normalización y, por tanto, el análisis de estas respuestas. Por tanto, la inhibición del reclutamiento a membrana de la   237    Discusión dinamina, conllevó un bloqueo total de todas las formas de endocitosis. Las diferencias en el mecanismo de acción de cada uno de estos compuestos podrían subyacer a las variaciones experimentales observadas. Mientras que la inhibición con Dynasore se basa en el bloqueo del mecanismo catalítico de la enzima, la inhibición con MiTMab impide el posicionamiento de la enzima en su localización efectiva, en términos funcionales. Existe cierta controversia en lo referente al papel de la dinamina en la endocitosis masiva. Algunos autores defienden que la dinamina es prescindible en la escisión de los orgánulos generados durante este tipo de endocitosis, basándose en las observaciones llevadas a cabo en animales carentes de la isoforma I de la dinamina (principal isoforma sináptica), en los que es posible inducir endocitosis masiva en respuesta a altas intensidades de estimulación (Ferguson et al., 2007; Hayashi et al., 2008; Saheki y De Camilli, 2012). Una proteína de tipo F-BAR denominada sindapina, así como remodelaciones del citoesqueleto de actina, se han propuesto como los principales candidatos a mediar la fuerza contráctil requerida para la gemación de este tipo de orgánulos (Itoh y De Camilli, 2006; Andersson et al., 2008; Clayton et al., 2009; Wu et al., 2010). Sin embargo, se ha demostrado que la dinamina sufre un ciclo de desfosforilaciones/refosforilaciones durante estos fenómenos, como se comenta en la introducción (Anggono y Robinson, 2007; Clayton et al.; Clayton y Cousin, 2009; Clayton et al.). La interacción dinamina-sindapina es dependiente de la desfosforilación de la dinamina (Clayton et al., 2007). Por tanto, el estado de fosforilación de la dinamina, así como el reclutamiento de la sindapina a membrana, parecen funcionar como el interruptor molecular que pone en marcha los procesos de endocitosis masiva (Clayton et al., 2009; Clayton y Cousin, 2009; Ferguson et al., 2009; Clayton et al., 2010; Saheki y De Camilli, 2012). Nuestros resultados son acordes con el siguiente escenario molecular: el reclutamiento de la dinamina a membrana y su posterior   238      Discusión  desfosforilación posibilitan el reclutamiento de la sindapina a membrana (Clayton et al., 2009; Taylor et al., 2011; Ferguson y De Camilli), donde media sus efectos contráctiles. Esta hipótesis es coherente con los datos experimentales observados, y concilia los distintos efectos de los inhibidores de la dinamina. La inhibición de la actividad GTPasa (prescindible para la gemación de orgánulos endosomales) permite la puesta en marcha de este tipo de endocitosis masiva ya que el reclutamiento de la sindapina a membrana no está impedido en estas condiciones. Por el contrario la inhibición del reclutamiento a membrana de la dinamina acarrearía un defecto en el posicionamiento de la sinadapina, que no podría mediar sus efectos contráctiles. La independencia de la actividad GTPasa de la dinamina en los procesos de endocitosis masiva ha sido constatada en numerosos estudios (Ferguson et al., 2007; Xu et al., 2008). Sin embargo, a la luz de los resultados obtenidos, nuestra propuesta es que si bien la actividad catalítica de la enzima es prescindible para el desarrollo de este tipo de procesos, su papel como reclutadora de proteínas es imprescindible para la endocitosis masiva. Estos resultados son parcialmente contradictorios con trabajos en los que se describe la existencia de endocitosis masiva en ausencia de la isoforma I de la dinamina (Ferguson et al., 2007), si bien es cierto que en este tipo de animales otras isoformas podrían llevar a cabo el papel de la dinamina I por sobre-expresión homeostática, probablemente, de la dinamina III. En el único artículo publicado en el que se describe un triple mutante de la dinamina (Park et al., 2013) el trabajo fue llevado a cabo sobre células no neuronales (fibroblastos en este caso), siendo difícil extrapolar estos resultados a la endocitosis compensatoria de las vesículas sinápticas.   239    Discusión 6- Papel de la calcineurina en ambas formas de endocitosis El uso del inhibidor de la calcineurina, FK-506, produjo un cambio dramático en la respuesta cinética de los botones sin modificar el número de los mismos en la unidad de longitud. La calcineurina parece jugar un papel crucial en la endocitosis masiva (Clayton et al., 2007) así como en la endocitosis mediada por clatrina (Anggono et al., 2006), regulando, por tanto, todas las formas de endocitosis conocida (Cousin y Robinson, 2001; Wu et al., 2009). Se ha comprobado que un gran número de proteínas que participan en procesos de endocitosis, entre ellas la sinaptojanina, la amfifisina y la dinamina, sufren ciclos de fosforilación/desfosforilación durante la entrada de calcio en el terminal presináptico, y la puesta en marcha del ciclo vesicular, motivo por el que se las denominó en su conjunto defosfinas (Cousin y Robinson, 2001). La cronología de estos eventos ha sido sólo parcialmente disecada molecularmente, y existen controversias en lo que se refiere a cuál es el estado de fosforilación en el que encontraremos estas proteínas durante distintos tipos de endocitosis. La desfosforilación de la dinamina mediada por calcineurina ha sido implicada tanto en la endocitosis mediada por clatrina (Cousin y Robinson, 2001) como en los fenómenos de endocitosis masiva (Clayton et al., 2007; Clayton et al., 2009). Paradójicamente, la fosforilación en las serinas 774 y 778 de la dinamina, que parece mediada por Cdk 5 y GSK3 de forma secuencial (Clayton et al., 2010) también se ha relacionado con la endocitosis mediada por clatrina (Anggono y Robinson, 2007; Evans y Cousin, 2007; Clayton et al., 2009) así como con la endocitosis masiva (Clayton et al., 2010). Aunque es difícil conciliar los datos presentes en la bibliografía del campo, ya que probablemente los ciclos de desfosforilación y refosforilación de la dinamina se den en intervalos temporales muy pequeños, nuestros resultados sugieren que el papel de la calcineurina es más relevante en la endocitosis mediada por clatrina que en la endocitosis masiva, como recientemente   240      Discusión  se ha demostrado (Armbruster et al., 2013). De este modo, la inhibición de la calcineurina disminuiría el umbral de la endocitosis masiva, por estar parcialmente inhibida la endocitosis mediada por clatrina. En otras palabras, la capacidad de carga de la endocitosis mediada por clatrina sería fácilmente saturable (Dittman y Ryan, 2009). La resultante sería una puesta en marcha de los fenómenos de endocitosis masiva (asociados a un reciclamiento ineficiente) en una mayor proporción de sinapsis que en condiciones control. Esto es coherente con trabajos anteriores en los que se demuestra, haciendo uso de un mutante puntual en el que las serinas susceptibles de ser fosforiladas en la dinamina se sustituyen por alaninas (S774A/S778A), que la fosforilación de la dinamina es necesaria para llevar a cabo la endocitosis masiva pero no la endocitosis mediada por clatrina (Clayton et al., 2010). Recientemente se ha demostrado que la calcineurina tiene un papel crucial en la gemación de nuevas vesículas desde aquellos endosomas que son capaces de rendir nuevas vesículas competentes para un nuevo evento exocitótico (Cheung y Cousin, 2012; 2013). Estos resultados explicarían parcialmente nuestras observaciones experimentales. La inhibición farmacológica de esta enzima resultaría en un defecto en la gemación de nuevas vesículas desde los endosomas, lo que finalmente daría lugar a un defecto aparente de la eficacia de reciclamiento mayor que en condiciones control, por retención de la fluorescencia contenida en dichos endosomas (Bartolome-Martin et al., 2012). La función del ciclo de desfosforilaciónes y refosforilaciónes sobre la dinamina sigue siendo enigmático, pues ambos pasos parecen imprescindibles para llevar a cabo los procesos mencionados anteriormente (Clayton et al., 2010; Smillie y Cousin, 2012). En cualquier caso la única manera de explicar este hecho es un proceso dinámico, en el que este ciclo esté implicado en la propia mecánica de endocitosis; una posibilidad atractiva es que estas fosforilaciones/desfosforilaciones tengan algún efecto en el ensamblaje de las proteínas   241    Discusión encargadas de este tipo de endocitosis, es decir, que en la formación de un complejo, la desfosforilación sea necesaria para reclutar una serie de proteínas, y el reclutamiento de otras proteínas, o bien el mantenimiento de dicho complejo sea dependiente de la mencionada refosforilación. Aunque en un primer momento se pensó que los efectos mediados por Cdk5 y calcineurina eran opuestos y su balance determinaba la puesta en marcha de uno u otro tipo de endocitosis (Clayton et al., 2007; Evans y Cousin, 2007) hoy en día se sabe que hay muchas otras quinasas implicadas en la regulación de los fenómenos de endocitosis masiva, tales como la GSK3 (Clayton et al., 2010) o la Akt/PKB (Smillie y Cousin, 2012). El motivo para que la calcineurina haya sido propuesta clásicamente como la principal candidata para poner en marcha la endocitosis masiva, ha sido el hecho de que las elevaciones transitorias de calcio la activarían por medio de la calmodulina. Sin embargo, la calmodulina activa también a la CaMKII, cuyos efectos se han considerado tradicionalmente opuestos (Silva et al., 1992; Groth et al., 2003; Stefan et al., 2008). En cualquier caso, la activación de la calcineurina siempre ha sido asociada a elevaciones menores de calcio que las necesarias para activar la CaMKII, por tanto la asunción de que la calcineurina es el candidato óptimo para desencadenar la endocitosis masiva (Clayton y Cousin, 2009) es parcialmente falaz. Por otro lado, los eventos de fosforilación y desfosforilación de una proteína determinada, pueden acompañar a un fenómeno sin que exista una causalidad vinculante; es decir, el hecho de que la dinamina se desfosforile durante los fenómenos de endocitosis masiva, no necesariamente implica que su desfosforilación sea la causante de la puesta en marcha del mencionado fenómeno. Por tanto, nuestra conclusión es que la endocitosis mediada por clatrina está crucialmente regulada por la proteína calcineurina, mientras que la endocitosis masiva es menos sensible a su inhibición.   242      Discusión  7-Posible implicación de los fenómenos de "Kiss&Run" en el reciclamient o ineficaz Motivados por las observaciones del grupo de Richard Tsien (Harata et al., 2006) decidimos llevar a cabo una serie de experimentos en los que se trató de dilucidar el impacto de la exocitosis de tipo kiss and run en los fenómenos de reciclamiento ineficaz. El azul de bromofenol (conocido como BPB por sus siglas en inglés) es una molécula pequeña (668 Da) capaz de penetrar a través del poro de fusión que se supone se establece durante este modo de exocitosis. La FM1-43, a pesar de ser de menor tamaño que el BPB queda retenida en el lumen de las vesículas por su relativo carácter hidrofóbico, no detectándose una pérdida neta de fluorescencia durante este tipo de exocitosis (Klingauf et al., 1998; Harata et al., 2006; Park et al., 2012). Debido a sus características espectrales y estructurales, el BPB es capaz de disminuir la fluorescencia de FM1-43 por transferencia de energía de resonancia (Harata et al., 2006) constituyendo una herramienta útil para el estudio de este tipo de fenómenos, pues es capaz de acceder al lumen de las vesículas sinápticas durante los fenómenos de kiss and run y apagar allí la fluorescencia de la sonda. En nuestro modelo experimental el BPB produjo un cambio drástico en la respuesta cinética media, así como una inversión en la proporción de botones de cada grupo, lo que en principio lleva a pensar en una contribución de los fenómenos de kiss and run en los botones caracterizados a priori como botones con reciclamiento ineficaz. Sin embargo, también observamos un cambio drástico en las fluorescencias iniciales de los botones en presencia de FM1-43, lo que da lugar a un artefacto matemático a la hora de la normalización. Teniendo en cuenta que ha de existir una cierta proximidad espacial entre las moléculas de BPB y las de FM1- 43 para que se produzca el fenómeno del apagamiento, es probable que esta reducción de las fluorescencias iniciales se deba a que determinadas cisternas inducidas por   243    Discusión mecanismos endocitóticos permanezcan en contacto con el espacio extracelular tras 10 minutos de lavado, ya que el BPB comienza a ser perfundido durante los 30 segundos de adquisición de la línea base del experimento. Puesto que no se pudo disecar la contribución de los fenómenos de kiss and run y de las formas de endocitosis tardía a la mejoría cinética observada en presencia de BPB, se decidió llevar a cabo un análisis ultraestructural de los terminales presinápticos en distintas condiciones, debido a que los fenómenos de kiss and run han de ser ultraestructuralmente indistinguibles. Por tanto, si el defecto subyacente a la ineficacia de reciclamiento tiene que ver con fenómenos de kiss & run no se observarían alteraciones ultraestructurales evidentes. 8-Análisis ultraestructural de terminales sinápticos Mediante microscopia electrónica de transmisión se identificó que las condiciones de estimulación asociadas a una menor eficacia de reciclamiento (1,33mM CaCl2 durante la fase de carga) estaban asociadas a la aparición de estructuras endosomales en el terminal presináptico. La presencia de estas estructuras fue marginal en condiciones de ausencia de estimulación, de forma acorde con lo previamente descrito (Xu-Friedman et al., 2001; Clayton et al., 2008). Se observó que la estimulación moderada (0,25mM CaCl2 durante la fase de carga) no generaba este tipo de estructuras, siendo en estas condiciones el reciclamiento vesicular la ruta predominante de endocitosis; estas observaciones son coherentes con trabajos recientes de otros grupos de investigación (Chandrasekar et al., 2013). De estos resultados se puede inferir que las altas intensidades de estimulación ponen en marcha fenómenos de endocitosis masiva asociadas con la recuperación de grandes superficies de membrana presináptica en forma de intermediarios endosomales. Decidimos analizar el efecto de la inhibición de   244      Discusión  la dinamina sobre el reciclamiento en el terminal presináptico desde un punto de vista ultraestructural. Para ello emulamos las condiciones de carga en alto y bajo calcio en presencia de dynasore. Se observó que las altas intensidades de estimulación fueron capaces de inducir la aparición de endosomas, pero no se observaron vesículas sinápticas en estas condiciones, sugiriendo que este es un mecanismo independiente de la actividad catalítica de la dinamina (Armbruster et al., 2013). A bajas concentraciones de calcio, la estimulación hipercalémica no produjo estructuras de tipo endosomal; sin embargo, se observó un vaciamiento de vesículas sinápticas en los terminales estimulados a bajas concentraciones de calcio en presencia de dynasore, observándose solo vesículas muy alejadas de la membrana presináptica, que probablemente no llegarán a experimentar el proceso de fusión (Park et al., 2012). Estos resultados son acordes con los obtenidos mediante incorporación de la sonda FM1-43. El dynasore por sí mismo no produjo ningún efecto observable en la ultraestructura de los terminales sinápticos. De lo previamente expuesto se puede concluir que las elevadas intensidades de estimulación ponen en marcha mecanismos de endocitosis masiva asociados con la recuperación de grandes superficies de membrana. Estos mecanismos no participan en el reciclamiento vesicular en condiciones de estimulación más moderadas. La actividad catalítica de la dinamina es prescindible para la recuperación de endosomas pero es necesaria para la recuperación de vesículas sinápticas. Las formas de endocitosis masiva han sido clásicamente asociadas a la posterior gemación de vesículas desde los endosomas, que aseguren la redisponibilidad de las mismas ante una nueva ronda de estimulación (Clayton et al., 2008; Cheung y Cousin, 2013) sin embargo también se han descrito formas de endocitosis endosomales no asociadas a la regeneración de vesículas (Perez Bay et al., 2007) tras altas intensidades de estimulación. Nuestros resultados son acordes con esta última hipótesis (Bartolome-Martin et al., 2012), ya que la aparición de   245    Discusión estas estructuras está asociada a bajas eficacias de reciclamiento. Nosotros consideramos que la prioridad de estos mecanismos de endocitosis no es la generación de vesículas competentes para su fusión, sino más bien preservar al terminal presináptico de un incremento deletéreo en la superficie de membrana. El correcto acoplamiento de la exocitosis a la entrada de calcio, así como la compensación de la exocitosis mediante mecanismos de endocitosis está asociada a la integridad de la plataforma de señalización celular que constituye la membrana presináptica y, en concreto, la zona activa (Jahn y Scheller, 2006; Hosoi et al., 2009; Yao et al., 2009; Jahn y Fasshauer, 2012; Sudhof, 2012). Un aumento desmesurado del área de membrana presináptica conllevaría el desacoplamiento de estos procesos por deslocalizar los sitios de fusión vesicular (Hosoi et al., 2009), así como los sitios de entrada de calcio. Además, las elevaciones transitorias de calcio serían más duraderas, pues el acoplamiento de los procesos de fusión a la entrada de calcio sería menos eficiente, y la extrusión de calcio del terminal presináptico también sería más costosa en términos energéticos (Kim y von Gersdorff, 2009). Otro efecto potencialmente dañino del incremento de superficie de la membrana presináptica, sería el "derrame" (traducción del inglés spillover) de glutamato. La difusión del glutamato a sitios alejados de las plataformas de señalización postsinápticas puede tener consecuencias negativas al activar receptores extrasinápticos (Kullmann et al., 1996; Hardingham et al., 2002). La activación de estos receptores ha sido relacionada con efectos excitotóxicos del glutamato mediados por calpaína (Wei et al., 2012; Vizi et al., 2013). Por tanto, el reciclamiento mediante estas estructuras endocitóticas conllevaría una depresión presináptica estrictamente hablando, relacionada con el agotamiento de vesículas sinápticas y el almacenamiento de su membrana en forma de endosomas. Adicionalmente, se ha propuesto que algunos endosomas puedan funcionar, una vez   246      Discusión  internalizados, a modo de plataformas de señalización intracelulares (Cosker et al., 2008; Dang et al., 2012; Smith et al., 2012), lo que podría tener relación con los fenómenos observados. No podemos descartar que algunos de los endosomas rindan, por gemación, nuevas vesículas sinápticas como ha sido demostrado por otros grupos de investigación (Cheung y Cousin, 2013). De hecho, en las preparaciones de microscopía electrónica pudimos observar vesículas siendo generadas a partir de estas estructuras; sin embargo, la mayoría de endosomas parecen renuentes a su liberación posterior, como se puede observar en las preparaciones estimuladas a concentraciones fisiológicas de calcio en presencia de dynasore (Bartolome-Martin et al., 2012) a juzgar por las respuestas cinéticas obtenidas en estas condiciones. En cualquier caso, las vesículas generadas por estos mecanismo tardarían más en pasar a formar parte de un pool de vesículas dispuesto a liberarse, pudiendo funcionar este mecanismo a modo de punto de control de mecanismos excitotóxicos en determinadas condiciones fisiopatológicas (Richards et al., 2000; Evans y Cousin, 2007; Clayton y Cousin, 2009; Wenzel et al., 2012). Se puede descartar una contribución mayoritaria de los fenómenos de kiss & run al reciclamiento ineficaz debido a la evidencia de alteraciones ultraestructurales. 9- La eficacia de reciclamiento como marcador de maduración Se ha descrito que la endocitosis masiva puede estar asociada a las vastas remodelaciones de membrana que sufre el cono axonal durante su guía, permaneciendo de forma reminiscente en sinapsis inmaduras (Bonanomi et al., 2008). Con objeto de analizar la eficacia de reciclamiento en función de la maduración neuronal en el cultivo, elegimos tres puntos temporales concretos, 3, 7 y 14 Días In Vitro (DIV). Corroboramos la maduración en términos de expresión de proteínas sinápticas, observándose un   247    Discusión aumento de expresión entre 3 y 7 DIV, coherente con el pico de sinaptogénesis en estos cultivos (Mundy et al., 2008; Juranek et al., 2013). Posteriormente la expresión de la mayoría de proteínas sinápticas se estabilizó, manteniéndose estos niveles constantes hasta 14DIV. Las fluorescencias iniciales de las sinapsis presentes en el cultivo, también incrementaron de forma lineal con el tiempo de cultivo, indicando un aumento del pool de vesículas sinápticas, que es coherente con la maduración neuronal (Mozhayeva et al., 2002). Se observó un aumento progresivo de las eficacias de reciclamiento a lo largo de la maduración del cultivo, que además estaba asociado a un aumento de las fluorescencias iniciales, lo que indica que en este caso, el exceso de membrana exocitada durante la estimulación es recuperado mayoritariamente en forma de vesículas sinápticas disponibles para ser liberadas ante una nuevo estímulo, lo que indica que la exocitosis vesicular masiva no induce una saturación de la maquinaria endocitótica. Por tanto, se puede considerar el umbral de saturación de los mecanismos de endocitosis vesicular un marcador de desarrollo de las neuronas granulares de cerebelo en cultivo. Existen mecanismos de plasticidad sináptica regulados durante el desarrollo (Al-Hayani y Davies, 2000; Doherty et al., 2004; Carey et al., 2011). Este tipo de endocitosis podría subyacer a formas de plasticidad sináptica relacionadas con la eliminación de contactos funcionales entre las fibras paralelas y las células de Purkinje en los primeros estadios de la sinaptogénesis de estas células; aquellas sinapsis más inmaduras exhibirían una mayor susceptibilidad a la saturación de los mecanismos endocitóticos vesiculares, poniendo en marcha mecanismos de endocitosis masiva antes que las sinapsis maduras. Ante estimulaciones sucesivas, las sinapsis más maduras serían capaces de mantener la fidelidad de la transmisión sináptica, por conservar la integridad de sus vesículas, lo que conllevaría una mayor probabilidad de éxito a la hora de establecer un contacto funcional. Este hecho podría tener implicaciones en la   248      Discusión  sinaptogenesis cerebelar in vivo. Se ha descrito que la inactivación crónica de los cultivos neuronales produce un efecto homeostático que se traduce, entre otros efectos, en un aumento de expresión de determinadas proteínas presinápticas y en un aumento de la probabilidad de liberación (Turrigiano, 2008; Lazarevic et al., 2011; Mitra et al., 2012). En nuestro caso, la inactivación crónica del cultivo mediante un tratamiento de 24h con TTx, dio lugar a una inversión de los porcentajes de sinapsis de cada uno de los grupos, indicando un defecto en las eficacias de reciclamiento. La interpretación de estos resultados parte de que un aumento en la probabilidad de liberación daría lugar a un incremento masivo de la exocitosis vesicular durante la fase de incorporación de la sonda, dando lugar a la formación de estructuras de tipo endosomal en un mayor número de botones. Tratando de establecer una relación mayor entre el estadio de maduración de estas neuronas y su eficacia de reciclamiento vesicular, se llevó a cabo un tratamiento con un fitoestrógeno, la daidzeina, cuyos efectos, asociados a la activación de receptores nucleares PPARγ, se han relacionado con la maduración neuronal (Chindewa et al., 2008; Sayan-Ozacmak et al., 2011). El efecto que este tratamiento produjo en las células fue un aumento de las eficacias de reciclamiento manifestado como un aumento en el porcentaje de los botones de descarga fuerte. Es interesante destacar que esta mejoría en la eficacia de reciclamiento fue, en este caso, paralela a un incremento de las fluorescencias iniciales de las sinapsis analizadas, pudiéndose descartar a partir de esto que el efecto observado hasta aquí en lo relativo a los botones con baja eficacia de reciclamiento sea un artefacto de la normalización matemática. Estos resultados nos llevan a la conclusión de que la maduración artificial del cultivo también lleva asociada   249    Discusión incrementos en las eficacias de reciclamiento. Por tanto, proponemos que la maduración sináptica es un fenómeno indisociable de la eficacia de reciclamiento vesicular. 10- Marcadores presinápticos y eficacia de reciclamiento Mediante técnicas de inmunocitoquímica post-hoc (Bartolome-Martin et al., 2012; Ramirez-Franco et al., 2013) se trató de establecer una relación entre características intrínsecas de las distintas sinapsis (en términos de expresión de proteínas), y sus eficacias de reciclamiento. Se observó que las mayores eficacias de reciclamiento estaban asociadas a una mayor expresión de una serie de proteínas sinápticas al estudiar sinapsis individuales. Encontramos que en las sinapsis con alta eficacia de reciclamiento existían mayores niveles de: la forma fosforilada de la sinapsina (no existiendo cambios en la expresión total de sinapsina); el factor preparador de vesículas Munc13-1; la fosfatasa calcineurina y la proteína de citomatriz bassoon. Los mayores niveles de estas proteínas son coherentes, desde un punto de vista amplio, con la hipótesis de que el desarrollo está asociado a la regulación de la eficacia de reciclamiento. El aumento de expresión de la calcineurina en aquellas sinapsis con una alta eficacia de reciclamiento es coherente con los resultados obtenidos tras su inhibición farmacológica. Sin embargo, los mayores niveles de Munc13-1 y la forma fosforilada de la sinapsina hacen pensar en que una regulación de los pools de vesículas también podría explicar un parte de los efectos observados en experimentos funcionales (Rizzoli y Betz, 2005; Kim y Ryan, 2010; Alabi y Tsien, 2012). No se observaron diferencias en los niveles de expresión de la dinamina, el transportador vesicular de glutamato de tipo 1 (VGluT-1) ni los niveles totales de sinapsina. Como se ha comentado, la dinamina participa en ambos tipos de endocitosis, por tanto no cabe esperar una expresión diferencial de esta   250      Discusión  enzima en las distintas subpoblaciones de sinapsis. Sin embargo, observamos bajos niveles de expresión de la subunidad GluA3 de los receptores AMPA en las postsinapsis que estaban en íntima aposición a sinapsis de reciclamiento eficaz. Esta subunidad se ha propuesto en dos estudios como una subunidad característica de sinapsis inmaduras (Condorelli et al., 1993; Incontro et al., 2011). Este dato corrobora la hipótesis de que la eficacia de reciclamiento puede ser entendida como un marcador de maduración neuronal. 11- Receptores presinápticos y maduración neuronal Con objeto de analizar el papel de los receptores metabotrópicos en la regulación de la maduración neuronal, se diseñaron experimentos en los que se bloqueó la señalización por proteínas G inhibitorias mediante la toxina pertúsica (PTx) durante las 24 horas previas a la realización del cultivo. Se observó un aumento de la eficacia global de reciclamiento en experimentos funcionales, acompañada de un aumento en el número de botones por la unidad de longitud y una disminución de las fluorescencias iniciales. El incremento de botones en la unidad de longitud se interpreta como un efecto homeostático que en cierto modo sería opuesto al que media la TTx, un inactivación sostenida de la señalización por proteínas G inhibitorias conlleva finalmente un descenso en la probabilidad de liberación, esto se manifiesta en un menor número de vesículas exocitadas durante la fase de incorporación de la sonda y, por tanto, en una reducción de las fluorescencias iniciales. Entendemos que esta reducción de las fluorescencias iniciales subyace a la mejoría observada en lo que se refiere a las eficacias de reciclamiento. Sin embargo, la aparición de un mayor número de botones sinápticos en estas condiciones sugiere que la PTx actúa promoviendo la sinaptogénesis.   251    Discusión Teniendo en cuenta que hay un mayor número de sinapsis con un contenido vesicular menor, no podemos descartar que estas se hayan originado a partir de difusión de vesículas desde sinapsis adyacentes (Darcy et al., 2006; Fernandez-Alfonso y Ryan, 2008; Staras et al., 2010), lo cual explicaría en parte las menores fluorescencias iniciales, la mayor eficacia de reciclamiento (por no llegar a saturarse la maquinaria endocitótica) y el mayor número de sinapsis. Uno de los receptores metabotrópicos acoplados a proteínas G inhibitorias más abundantes en el encéfalo de mamíferos y, en concreto, en neuronas granulares de cerebelo, es el receptor CB1 (Kano et al., 2009; Stephens, 2009). Por este motivo decidimos emplear el receptor CB1 como diana farmacológica para tratar de emular los efectos farmacológicos de la PTx, para lo que se empleó el antagonista del receptor CB1 SR141716. Observamos una mejoría evidente de las eficacias de reciclamiento; sin embargo, al contrario de lo que sucedió con la PTx no se observó un aumento en el número de botones ni en las fluorescencias iniciales. Nuestra hipótesis es que la inhibición de la señalización mediada por cannabinoides no es suficiente para promover un efecto homeostático; sin embargo existe un efecto neto sobre la exocitosis monitorizada durante el experimento. Estas observaciones dieron lugar a la segunda parte de esta disertación, pues nuestro siguiente objetivo fue caracterizar en qué medida el SR141716 podía llegar a tener un efecto durante la exocitosis monitorizada en el experimento de imagen, lo que sugeriría la función crucial del receptor CB1 en la regulación de la exocitosis de estas neuronas.   252      Discusión  12- Regulación de la liberación vesicu lar por el recep tor CB1. Silenciamiento sináptico La expresión de este receptor, así como su correcta localización en presinapsis se corroboraron en experimentos de western blot e inmunocitoquímica, respectivamente. Se detectó expresión del receptor a 3, 7 y 14 DIV y su correcta localización a 7DIV, por co-localización con el marcador vesicular sinaptofisina, de forma contraria a lo descrito por otros grupos en estas condiciones de cultivo (Vallano et al., 2006). Para disecar exclusivamente los efectos que la activación de este receptor mediaba sobre la exocitosis vesicular, se diseñaron una serie de experimentos en los que se incubaron las células con un agonista cannabinoide, el HU-210, durante los 10 minutos posteriores a la fase de carga. Se llevaron a cabo protocolos secuenciales de estimulación constituidos por una estimulación corta (10 segundos) seguida de un intervalo en reposo y una estimulación final larga (2 minutos). El objeto de las estimulaciones secuenciales fue detectar una inhibición calcio dependiente de la liberación que pudiese ser contrarrestada mediante periodos de estimulación sostenida. Observamos que las incubaciones prolongadas con HU-210 daban lugar a un defecto de la liberación vesicular que no podía ser contrarrestado mediante periodos de estimulación prolongada, lo que indicaba que, posiblemente, un fenómeno parcialmente calcio independiente subyacía a la inhibición mediada por este receptor. Encontramos que se requerían tiempos prolongados de estimulación del receptor para inducir una reducción exocitótica en nuestras condiciones experimentales, ya que, a tiempos cortos de incubación (40"), no se observó ningún cambio en el comportamiento cinético de las sinapsis en experimentos de FM1-43. La principal limitación metodológica de la sonda FM1-43 es la necesidad de una estimulación previa para introducir la sonda en el interior de las vesículas sinápticas, lo que podría poner en marcha la síntesis de   253    Discusión cannabinoides endógenos (Devane et al., 1992; Di Marzo et al., 1994) que ocluyese parcialmente los efectos observados. Con objeto de eludir esta limitación se llevaron a cabo experimentos con un indicador de exo/endocitosis codificado en una proteína modificada por técnicas de biología molecular que se introduce por electroporación en las células de interés, la VGluT1-pHluorina (Voglmaier et al., 2006). Además, esto nos permitió llevar a cabo un pulso control previo a la incubación con HU-210, del que se puede extraer un control interno para cada una de las respuestas individuales para su posterior comparación. Como esperábamos se observó una reducción dramática de la exocitosis tras una incubación de 10 minutos con el agonista cannabinoide que no pudo ser reproducida en tiempos cortos de incubación con el agonista. Se observó que la abolición de la exocitosis era total en una subpoblación de botones, esto se identificó como una respuesta inferior a los niveles de ruido. A estos botones se les denominó botones silentes, por ser este un término recientemente acuñado en la bibliografía del campo para definir a aquellos botones que no muestran respuesta exocitótica alguna ante la estimulación a pesar de contener un número de vesículas normal y de mostrar una composición similar a la de los botones activos (Moulder et al., 2004; Moulder et al., 2006; Cousin y Evans, 2011; Crawford et al., 2012; Crawford y Mennerick, 2012). Tras una incubación de 10 minutos con HU-210, aproximadamente un 30 % de las sinapsis presentes en el campo de observación, mostraron este comportamiento. En experimentos de triple pulso se encontró que únicamente las incubaciones prolongadas con el agonista daban lugar a esta reducción exocitótica.   254      Discusión  13-Independencia de calcio del fenómeno de silenciamiento Dado que el efecto sobre la liberación vesicular inducido por el agonista cannabinoide no pudo contrarrestarse con periodos prolongados de estimulación, decidimos analizar en qué medida dicho fenómeno era calcio independiente. En primer lugar, decidimos llevar a cabo un análisis de la calcio independencia de la exocitosis en nuestro sistema de cultivo. Para ello se diseñaron experimentos de doble pulso en los que se estimuló mediante perfusión hipercalémica a distintas concentraciones de calcio. Se observó una relación directamente proporcional entre la concentración de calcio y el porcentaje de fluorescencia normalizada (fracción de vesículas liberadas) exhibido por las distintas sinapsis. También se observaron diferencias de las constantes temporales de endocitosis, siendo este fenómeno más rápido a menores concentraciones de calcio, lo que probablemente se deba a la saturación de la maquinaria endocitótica a altas concentraciones de calcio (Dittman y Ryan, 2009). No observamos diferencias relativas a la velocidad de exocitosis, probablemente por estar saturados los sensores de calcio para este fenómeno incluso a bajas concentraciones de calcio, al emplear estimulación hipercalémica, que conlleva un flujo constante de este ión en el interior de los terminales. Posteriormente, se diseñaron experimentos tratando de reproducir los resultados obtenidos a concentraciones fisiológicas de calcio en presencia de 5mM CaCl2 en el medio extracelular. El porcentaje de botones susceptibles de ser silenciado en estas condiciones experimentales fue de aproximadamente un 25 %, no mostrando diferencias significativas con el porcentaje encontrado a concentraciones fisiológicas de calcio. Puesto que habíamos encontrado una cierta tendencia a la reducción exocitótica en experimentos de doble pulso a altas concentraciones de calcio, llevamos a cabo este experimento en ausencia del primer pulso de estimulación. Se observó una marcada reducción de la exocitosis neuronal y un grado de silenciamiento similar al observado   255    Discusión en experimentos de doble pulso, lo cual pone de manifiesto la parcial calcioindependencia de este fenómeno. Se observó además una reducción de las constantes temporales de endocitosis (aceleración del proceso) tras la activación del receptor CB1, probablemente explicable porque a estas concentraciones de calcio existe una saturación de la capacidad de carga del proceso endocitótico en condiciones control, que no se alcanza al tratar con HU-210, por el defecto exocitótico previo que ello conlleva (Dittman y Ryan, 2009; Hosoi et al., 2009). Mediante experimentos de imagen de calcio con el indicador ratiométrico FURA-2 AM, se constató que la activación del receptor CB1 durante periodos cortos (1 min) fue capaz de inducir una reducción de la entrada de calcio en los terminales presinápticos que no era paralela a una reducción exocitótica. El tratamiento prolongado con HU-210 (10 min) también generó una inhibición de la entrada de calcio en el terminal presináptico. En estas condiciones, dicha reducción sí se acompañaba de una reducción en la fracción de vesículas liberadas, siendo este el argumento definitivo que nos permite disociar la inhibición de la entrada de calcio de la reducción exocitótica mediada por la activación del receptor CB1. Es posible que, debido a la intensidad de la estimulación hipercalémica, la cooperatividad de la exocitosis esté ya saturada a concentraciones fisiológicas de calcio en nuestras condiciones experimentales, lo que sería otro argumento a favor de la calcio-independencia parcial de la reducción exocitótica mediada por HU-210. Existe descrito un efecto de oclusión sobre la potenciación mediada por PDBu a concentraciones de calcio e intensidades de estimulación que saturen la cooperatividad del proceso exocitótico (Lou et al., 2005); a priori, este tipo de condiciones experimentales serían óptimas para evaluar el fenómeno de silenciamiento, pues este no   256      Discusión  se vería enmascarado por una baja probabilidad de liberación. Para corroborar este hecho, se diseñaron experimentos de doble pulso a 0,25mM y a 1,33mM CaCl2. Se observó que las concentraciones fisiológicas de calcio ocluían el efecto potenciador del PDBu, indicando que las concentraciones fisiológicas de calcio y la estimulación con potasio son un estímulo suficientemente fuerte para evaluar el fenómeno de silenciamiento sináptico (Cousin y Evans, 2011). Se observó potenciación del PDBu a concentraciones de calcio inferiores a las fisiológicas; esto se manifestó en el hecho de que los botones con menor probabilidad de liberación experimentaron una respuesta virtualmente silente en estas condiciones de estimulación, que pudo ser potenciada tras la aplicación de PDBu. Estos fenómenos de reclutamiento de botones previamente inactivos es coherente con un aumento en el número de vesículas competentes para el proceso de fusión, probablemente inducido por la activación de la proteína Munc13-1 (Rhee et al., 2002) y es acorde a los resultados previos de otros grupos (Chang et al., 2010). De estos resultados se concluye que la estimulación hipercalémica a concentraciones fisiológicas de calcio (1,33mM) es una aproximación experimental válida para el estudio farmacológico posterior del fenómeno del silenciamiento sináptico, pues una disminución en la probabilidad de liberación vesicular no debería enmascarar el fenómeno de silenciamiento sináptico en estas condiciones de estimulación (Cousin y Evans, 2011).   257    Discusión 14-Análisis ultraestructural del fenómeno de silenciamiento sináptico Puesto que se observó una persistencia del fenómeno de silenciamiento a concentraciones suprafisiológicas de calcio, decidimos llevar a cabo un análisis ultraestructural de los terminales sinápticos tras el tratamiento con HU-210, para detectar posibles modificaciones en la distancia de las vesículas sinápticas a la membrana de la zona activa. Esta aproximación se llevó a cabo en dos modelos experimentales distintos. Se observó una retracción de las vesículas más cercanas a la membrana de la zona activa tras el tratamiento de 10 minutos con HU-210. Esta retracción se observó tanto en células granulares de cerebelo en cultivo, como en sinaptoneurosomas que provenían de ratones silvestres, pero no en sinaptosomas provenientes de ratones carentes del receptor CB1 (cnr1-/-). Este defecto posicional de las vesículas sinápticas podría subyacer, al menos parcialmente, al efecto inhibitorio del HU-210. La ausencia de efecto en sinaptoneurosomas carentes del receptor CB1 sugiere que la potencial señalización vía CB2 del HU-210 no está implicada en este fenómeno. El número de vesículas en la cercanía de la membrana presináptica se encontró ligeramente aumentado en los ratones carentes del receptor CB1, lo que podría estar indicando un papel de la señalización tónica por endocannabinoides en condiciones fisiológicas (Foldy et al., 2013). Estas observaciones se asemejan a las llevadas a cabo en mutantes de proteínas relacionadas con el proceso de preparación y anclaje de las vesículas sinápticas (Gracheva et al., 2008; Siksou et al., 2009; Kaeser et al., 2011), lo que sugiere un posible efecto de los cannabinoides sobre la maquinaria de liberación vesicular (Castillo et al., 2012).   258      Discusión  15-Redistribución de los pools de vesículas sinápticas mediada por la activación de CB1 Los experimentos llevados a cabo en presencia de bafilomicina, un inhibidor de la V- ATPasa y por tanto de la re-acidificación vesicular tras la endocitosis, permiten hacer estimaciones de la fracción de vesículas pertenecientes al pool de reciclamiento. Se observó que el HU-210 producía una reducción del número de vesículas susceptibles de ser exocitadas a todas las concentraciones de calcio ensayadas (0,25mM; 1,33mM y 5mM), lo que sugiere que el mecanismo por el que la activación del receptor CB1 disminuye el número de vesículas competentes para el proceso de fusión es parcialmente disociable de la disminución de la entrada de calcio en los terminales. El número de botones silentes también aumentó tras el tratamiento con HU-210 a todas las concentraciones de calcio ensayadas, este aumento fue mucho mayor a concentraciones bajas de calcio, probablemente porque a estas concentraciones, la inhibición de la entrada de calcio tenga un efecto más drástico sobre la probabilidad de liberación. 16- Farmacología del fenómeno de silenciamiento En primer lugar se decidió corroborar que la activación del receptor CB1 daba lugar a una disminución de los niveles de cAMP en nuestras condiciones experimentales. Se observó una reducción de aproximadamente un 40% de los niveles de cAMP tras un tratamiento prolongado con HU-210, estos resultados están en discrepancia con lo previamente descrito para estas células en estas condiciones de cultivo, probablemente por variaciones en el protocolo de cultivo (Vallano et al., 2006). Posteriormente se decidió trasladar estas observaciones a los experimentos funcionales. En primer lugar observamos una prevención del efecto del HU-210, por la incubación con forskolina, un   259    Discusión activador de la adenilato ciclasa; este resultado pone de manifiesto que la reducción exocitótica observada tras la activación sostenida del receptor CB1 es inducida por una disminución en los niveles de cAMP (Chevaleyre et al., 2007; Mato et al., 2008). La prevención del silenciamiento se observó al llevar a cabo estos mismos experimentos en presencia de H-89, un inhibidor de la PKA, lo que sugiere que la reducción en los niveles de cAMP inducida por cannabinoides tiene efectos disociables de la disminución de la actividad de PKA. Es importante destacar que los efectos sobre la fracción vesicular exocitada en respuesta a la estimulación no pudieron ser revertidos totalmente en presencia de H-89. Posteriormente, decidimos usar un activador selectivo de la PKA tratando de contrarrestar el defecto exocitótico inducido por la activación del receptor CB1; el activador de la PKA no fue capaz de disminuir el número de botones silentes encontrado tras el tratamiento con HU-210 y sólo revirtió parcialmente los efectos exocitóticos, sugiriendo que el mecanismo por el que la forskolina disminuye el número de respuestas que muestran este comportamiento tras el tratamiento con HU- 210 es parcialmente independiente de la PKA. Además de la PKA, existen otras dianas moleculares reguladas por las concentraciones de cAMP (Kawasaki et al., 1998; Bos, 2006; Efetova et al., 2012). La proteína EPAC, un factor intercambiador de nucleótidos de guanina activado por cAMP, ha sido propuesta como candidata en la regulación de la fusión de vesículas en numerosos sistemas secretores (Schmidt et al., 2001; Branham et al., 2009) así como en terminales presinápticos (Sakaba y Neher, 2003; Gekel y Neher, 2008; Ferrero et al., 2013). La activación de esta proteína con su activador selectivo, el 8-pCpt, revirtió los efectos del HU-210 en lo que al silenciamiento sináptico se refiere. Estos resultados nos llevan a concluir que el silenciamiento sináptico opera por una ruta mecanísticamente distinta a la inhibición de la PKA y dependiente de la disminución de los niveles de actividad de la proteína EPAC. En un estudio previo se encontró que el   260      Discusión  8pCpt promovía el reclutamiento de neuronas previamente inactivas; sin embargo, en este estudio se atribuyó esta activación a efectos inespecíficos de este compuesto sobre la actividad de la PKA (Cousin y Evans, 2011). Se ha descrito que la proteína EPAC podría estar formando un complejo con piccolo y RIM 2 (Ozaki et al., 2000; Kashima et al., 2001; Fujimoto et al., 2002); por otro lado, la interacción entre RIM y Rab3 puede regularse por el tipo de nucleótido de guanina unido a Rab3 (Wang et al., 1997; Dulubova et al., 2005) y se ha descrito que la proteína EPAC puede promover la forma Rab3-GTP (Branham et al., 2009). En este escenario molecular, una disminución de los niveles de cAMP podría tener un impacto crucial en la regulación de la forma Rab3- GTP, lo que conllevaría un defecto en el posicionamiento y la preparación de las vesículas sinápticas. 17-Reversibilidad del proceso de silenciamiento. Implicaciones en la plasticidad Para distinguir entre un fenómeno de plasticidad y un fenómeno de eliminación definitiva de sinapsis funcionales, decidimos realizar experimentos para comprobar si, una vez silenciadas, las sinapsis podían recuperar su funcionalidad tras varios minutos en ausencia de activación del receptor CB1. Se observó que el fenómeno de silenciamiento revertía de forma espontanea tras un periodo de 10-20 minutos en reposo. Esta es una observación importante, pues disipa dudas acerca de la localización subcelular de estas regiones fluorescentes, demostrando que son sinapsis inactivadas, y no orgánulos de la vía secretora, que pudiesen rendir fluorescencia tras la alcalinización química. Además, los resultados que se derivan de esta tanda de experimentos demuestran que el silenciamiento que algunas sinapsis experimentan tras periodos prolongados de exposición a un agonista cannabinoide constituye un proceso de   261    Discusión plasticidad dinámico, pudiendo ser modulado bidireccionalmente en periodos de tiempo relativamente cortos; esto añade un valor adicional al estudio, pues también se puede descartar una pérdida de funcionalidad de la preparación. Se observó que a tiempos inferiores a los 10 minutos de recuperación, la mayoría (70% aproximadamente) de las sinapsis silenciadas por el agonista cannabinoide permanecían aún inactivas, lo que nos permitió diseñar una aproximación farmacológica con el objeto de comprobar si el activador de la proteína EPAC era capaz de revertir este proceso a tiempos cortos, de forma posterior a su inducción. La activación de la proteína EPAC produjo una reversión del fenómeno de silenciamiento en los 4 minutos posteriores a la incubación con el agonista cannabinoide. Estos resultados indican que la disminución de los niveles de cAMP, operando mediante la reducción en la actividad de la proteína EPAC, induce un tipo de depresión profunda y transitoria mediada por endocannabinoides en sinapsis glutamatérgicas de neuronas de cerebelo en cultivo. El comportamiento que muestran estas sinapsis en respuesta a una estimulación de gran intensidad, en este caso por perfusión hipercalémica, es acorde con la definición de sinapsis silentes aunque en este caso el fenómeno no muestra la persistencia descrita por otros autores (Moulder et al., 2004; Moulder et al., 2006; Crawford et al., 2011). Esto es explicable, porque, aunque se puedan definir ambos como aquellos botones que muestran una ausencia de fusión vesicular en respuesta a la estimulación, probablemente los protocolos empleados por otros grupos lleven a una eliminación definitiva, no plástica, de sinapsis funcionales (Moulder et al., 2004), mientras que el fenómeno que aquí se describe probablemente subyazca a mecanismos de plasticidad modulables bidireccionalmente.   262      Discusión  Para entender la relevancia de este proceso debemos acudir al contexto fisiológico en que esta sinapsis se encuadra. Los modelos empleados para estudiar el cerebelo se basan en el concepto de filtro adaptativo. Estos dispositivos, empleados en ingeniería, se definen como dispositivos que intentan modelar la relación entre señales, en tiempo real y de forma iterativa. A diferencia de otros dispositivos, los algoritmos que rigen los coeficientes (pesos sinápticos al hacer la analogía en el cerebelo) de un filtro adaptativo son dinámicos, es decir, varían en función del tiempo, intentando ajustar la señal de salida del sistema en función de un error, que, en el caso del cerebelo, parece ser codificado por las fibras trepadoras (Porrill y Dean, 2008; Dean et al., 2010). Esta es la razón por la que es un modelo adaptativo, porque en función de la entrada de información por la fibra trepadora, puede ajustar los pesos sinápticos (coeficientes) de este dispositivo, codificados en este caso en la sinapsis existente entre la fibra paralela y la célula de Purkinje (Fujita, 1982; Dean et al., 2010). Siguiendo la predicción de la regla de aprendizaje de la covarianza (Sejnowski, 1977) una activación de una sinapsis de una fibra paralela sobre una célula de Purkinje, que dé lugar a una activación concomitante de la fibra trepadora (componente de error), experimentará un proceso de depresión a largo plazo; lo que es lo mismo, la activación de un determinado comando motor que dé lugar a un error sensitivo (la acción se ha ejecutado de forma poco precisa), conllevará una distribución a la baja del peso sináptico de esta conexión; esta predicción se ha demostrado experimentalmente (Ito, 1989; Safo y Regehr, 2005). Teniendo en cuenta la unidad de procesamiento del cerebelo, la información aferente paralela a la ejecución de un determinado comando motor ha de venir codificada en varias fibras paralelas. Eventualmente, algunas de estas fibras paralelas pueden contener información irrelevante para la ejecución de la orden motora deseada, lo que conllevaría una reducción del peso sináptico de la citada conexión, pues su activación sería   263    Discusión coincidente con la de la fibra trepadora. ¿Qué mecanismos celulares podrían subyacer a esto? Ha de tenerse en cuenta que la activación de ambas fibras sobre la neurona de Purkinje, conllevará una mayor despolarización de esta neurona, lo que podría guardar relación con una mayor síntesis de endocannabinoides tras una activación concomitante de ambas sinapsis (Hashimotodani et al., 2005; Maejima et al., 2005; Hashimotodani et al., 2007); por tanto la inactivación total de determinadas sinapsis (silenciamiento) de las fibras paralelas podría tener implicaciones cruciales en el aprendizaje motor (Isope y Barbour, 2002; Dean et al., 2010). Curiosamente, el estudio post-mortem de pacientes autistas revela una pérdida de neuronas de Purkinje en el cerebelo de estos pacientes (Bailey et al., 1998; Abrahams y Geschwind, 2010) que se ha relacionado con los déficits motores de estos pacientes (Fatemi et al., 2012). Recientemente se ha postulado que mutaciones del gen de la neuroligina 3, que producen un fenotipo de autismo en ratones, están asociadas a un defecto de la señalización tónica por endocannabinoides (Foldy et al., 2013). En este contexto un fallo en la señalización tónica por endocannabinoides podría subyacer a una elevada probabilidad de liberación en sinapsis entre la fibra paralela y la célula de Purkinje, con las consecuentes limitaciones en aprendizaje motor y las posibles implicaciones en la muerte neuronal del mencionado tipo celular, que podrían guardar relación con la etiología de síntomas motores en el autismo (Krueger y Brose, 2013). Otra de las implicaciones importantes de la transitoriedad de este fenómeno es su paralelismo con la LTD inducida por endocannabinoides en las sinapsis entre la fibra paralela y la neurona de Purkinje (Kreitzer y Regehr, 2001; Safo y Regehr, 2005; Carey et al., 2011). Como se ha demostrado, la activación del receptor CB1 no es suficiente per se para el mantenimiento de la LTD en esta sinapsis, y sin embargo es una   264      Discusión  condición indispensable para su inducción (Safo y Regehr, 2005; Carey et al., 2011). La aplicación de un agonista del receptor CB1 en rodajas de cerebelo, genera una disminución pronunciada de los EPSCs (del inglés Excitatory Post-Synaptic Currents) registrados en las células de Purkinje tras la activación de un fascículo de fibras paralelas por estimulación de campo en la capa molecular que es revertida al co-aplicar un antagonista del receptor (Safo y Regehr, 2005). Teniendo en cuenta la baja probabilidad de liberación de estas células in vivo (Dittman et al., 2000), es plausible concebir que la inducción de la LTD mediada por cannabinoides venga determinada por una reducción en la exocitosis, que llegue a implicar en algunos casos el silenciamiento sináptico (Safo y Regehr, 2005; Qiu y Knopfel, 2009; Carey et al., 2011). Es difícil definir una ausencia total de exocitosis mediante experimentos de electrofisiología, pues, dadas las características anatómicas de estas sinapsis las medidas de los EPSCs en la célula de Purkinje suelen provenir de más de un punto de contacto entre varias fibras paralelas y una célula de Purkinje (Safo y Regehr, 2005). Sin embargo, en un estudio se llevaron a cabo medidas de sinapsis unitarias entre las fibras paralelas y las células de Purkinje (Isope y Barbour, 2002). Se encontró que, en ratas adultas, la gran mayoría de las conexiones no eran capaz de inducir una respuesta medible; los autores atribuyen este hecho a un fenómeno postsináptico, pues la transmisión del potencial de acción así como la probabilidad de liberación de las sinapsis activas eran normales; el papel de la señalización por calcio no es analizado en este trabajo (Isope y Barbour, 2002). Sin embargo, conceptualmente, los autores proponen que las propiedades de esta sinapsis posibilitan, mediante el aprendizaje, que una determinada célula de Purkinje pueda "decidir las entradas de información (fibras paralelas) que puedan inducir en ella una respuesta" (Isope y Barbour, 2002). Si el aprendizaje cerebelar se basa en una inactivación de determinadas sinapsis de la fibra paralela sobre determinadas células de   265    Discusión Purkinje (Porrill y Dean, 2008; Dean et al., 2010) el fenómeno de silenciamiento sináptico mediado por cannabinoides podría subyacer a las fases iniciales del aprendizaje motor mediado por el cerebelo, lo que podría explicar los efectos comportamentales encontrados tras la aplicación de un agonista cannabinoide a animales vivos (DeSanty y Dar, 2001; Patel y Hillard, 2001; Skosnik et al., 2008) y las observaciones hechas en consumidores humanos (Roser et al., 2009; Batalla et al., 2013). 18- Determinantes presinápticos de la susceptibilidad al silenciamiento Como última parte del estudio, se llevó a cabo un análisis para intentar determinar si existían características intrínsecas a las sinapsis que nos permitieran diferenciar entre las distintas susceptibilidades de estas al fenómeno de silenciamiento. Haciendo uso de la técnica de inmunocitoquímica post-hoc (Ramirez-Franco et al., 2013), se detectó que las sinapsis susceptibles de ser silenciadas eran aquellas con una mayor proporción de receptor CB1 y una menor proporción de la proteína RIM1α (expresado como un menor cociente entre la inmunorreactividad normalizada de RIM1α y la del receptor CB1). Esta relación solo era válida para la proteína RIM1α, no encontrándose asociación entre la susceptibilidad al silenciamiento y el cociente entre las IR de Munc13-1 y el receptor CB1. Esto es compatible con una posible relación entre los niveles de cAMP y el contenido de Rab3A-GTP, ya que cuanto menor sea el contenido de RIM en una sinapsis, más evidente, en lo que al número de vesículas disponibles para ser liberadas se refiere, sería el efecto de un descenso en los niveles de Rab3A-GTP. Se ha demostrado, en sistemas neuronales y no-neuronales, el vínculo entre la activación de EPAC y el contenido Rab3A-GTP (Branham et al., 2009; Ferrero et al., 2013). Las   266      Discusión  funciones de Munc13-1 son dependientes de su estado de activación. Esta proteína se regula por su interacción con diacilglicerol (Rhee et al., 2002), así como por calcio (Shin et al., 2010) y calmodulina (Junge et al., 2004). Además, la proteína RIM interfiere en el estado de activación de Munc13, por disociación del homodímero de Munc13-1, que no es activo (Kaeser et al., 2011). Nuestra interpretación de este resultado negativo es que los niveles totales de esta proteína (estimada en este caso como una medida de inmunorreactividad), no dan cuenta de la fracción de esta proteína que es efectiva, por la existencia de múltiples mecanismos reguladores. 267 268 269 VI- Conclusiones "No es bueno repetir lo que está dicho. Después de haber hablado, de haber vertido lágrimas, silencio y sonreid: nada es lo mismo. Habrá palbras nuevas para la nueva historia y es preciso encontrarlas antes de que sea tarde" Ángel González 270   271 Conclusiones VI-Conclusiones 1.1- Endocitosis y reciclamiento a) Las estimulaciones de alta intensidad ponen en marcha mecanismos de recuperación de membrana cuya función principal no es la regeneración de vesículas sinápticas dispuestas a su liberación sino la disminución del área de la membrana presináptica. A consecuencia de ello, estos mecanismos están asociados a un reciclamiento sináptico ineficaz y a la aparición de estructuras endosomales. b) Los mecanismos de endocitosis masiva persisten tras la estimulación y son independientes de la actividad catalítica de la dinamina, pero requieren su localización en la membrana plasmática. c) La inhibición de la calcineurina desplaza las formas de endocitosis hacia formas de reciclamiento ineficaz. d) Los mecanismos ineficaces de endocitosis están regulados durante el desarrollo siendo predominantes en estadios inmaduros de los cultivos neuronales y estando asociados a los terminales con una menor inmunorreactividad de determinadas proteínas sinápticas. 272 Conclusiones 1.2 Exocitosis e) La activación persistente del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1R) desencadena una reducción drástica de la exocitosis que implica el silenciamiento sináptico de una subpoblación de terminales. f) El mecanismo que subyace al silenciamiento mediado por cannabinoides es independiente de la inhibición de la entrada de calcio, pero dependiente de una reducción en los niveles de cAMP. g) Los mecanismos de silenciamiento son independientes de la reducción de los niveles de actividad de la proteína quinasa A (PKA) pero dependientes de la disminución de la actividad de la proteína EPAC. h) El silenciamiento sináptico mediado por cannabinoides cursa con una retracción de las vesículas más cercanas a la membrana de la zona activa. i) La susceptibilidad al silenciamiento sináptico viene determinada por características intrínsecas a las distintas sinapsis en lo que a composición de proteínas se refiere. 273 274 275 VII- Bibliografía "Leer es pensar con el cerebro ajeno en lugar de hacerlo con el propio" A. Schopenhauer 276 277 Bibliografía VI-Bibliografía Abrahams, B.S. & Geschwind, D.H. (2010) Connecting genes to brain in the autism spectrum disorders. Arch Neurol, 67, 395-399. Adermark, L. & Lovinger, D.M. (2007) Retrograde endocannabinoid signaling at striatal synapses requires a regulated postsynaptic release step. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 20564-20569. Aihara, Y., Mashima, H., Onda, H., Hisano, S., Kasuya, H., Hori, T., Yamada, S., Tomura, H., Yamada, Y., Inoue, I., Kojima, I. & Takeda, J. (2000) Molecular cloning of a novel brain-type Na(+)-dependent inorganic phosphate cotransporter. J Neurochem, 74, 2622-2625. Al-Hayani, A. & Davies, S.N. (2000) Cannabinoid receptor mediated inhibition of excitatory synaptic transmission in the rat hippocampal slice is developmentally regulated. Br J Pharmacol, 131, 663-665. Alabi, A.A. & Tsien, R.W. (2012) Synaptic vesicle pools and dynamics. Cold Spring Harb Perspect Biol, 4, a013680. Alabi, A.A. & Tsien, R.W. 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BMC Neuroscience 2013, 14:127 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 METHODOLOGY ARTICLE Open Access Studying synaptic efficiency by post-hoc immunolabelling Jorge Ramírez-Franco, Beatris Alonso, David Bartolomé-Martín, José Sánchez-Prieto* and Magdalena Torres* Abstract Background: In terms of vesicular recycling, synaptic efficiency is a key determinant of the fidelity of synaptic transmission. The ability of a presynaptic terminal to reuse its vesicular content is thought to be a signature of synaptic maturity and this process depends on the activity of several proteins that govern exo/endocytosis. Upon stimulation, individual terminals in networks of cultured cerebellar granule neurons exhibit heterogeneous exocytic responses, which reflect the distinct states of maturity and plasticity intrinsic to individual synaptic terminals. This dynamic scenario serves as the substrate for processes such as scaling, plasticity and synaptic weight redistribution. Presynaptic strength has been associated with the activity of several types of proteins, including the scaffolding proteins that form the active zone cytomatrix and the proteins involved in presynaptic exocytosis. Methods: We have combined fluorescence imaging techniques using the styryl dye FM1-43 in primary cultures of cerebellar granule cells with subsequent post-hoc immunocytochemistry in order to study synaptic efficiency in terms of vesicular release. We describe a protocol to easily quantify these results with minimal user intervention. Results: In this study we describe a technique that specifically correlates presynaptic activity with the levels of presynaptic markers. This method involves the use of the styryl dye FM1-43 to estimate the release capacity of a synaptic terminal, and the subsequent post-hoc immunolabelling of thousands of individual nerve terminals. We observed a strong correlation between the release capacity of the nerve terminal and the levels of the RIM1α but not the Munc13-1 protein in the active zone. Conclusions: Our findings support those of previous studies and point out to RIM1α as a crucial factor in determining synaptic efficiency. These results also demonstrate that this technique is a useful tool to analyse the molecular differences underlying the heterogeneous responses exhibited by neuronal networks. Keywords: Post-hoc immunocytochemistry, FM1-43, Synaptic vesicle exocytosis, RIM1α, Munc13-1 Background Presynaptic active zones (AZ) are specialized axonal sites of fusion that mediate neurotransmitter release into chemical synapses. A complex network of proteins is assembled at axonal sites that generate the so-called cytomatrix at the active zone (CAZ). These proteins interact with other proteins located either at the presynaptic plasma membrane or at vesicular membranes that regulate Ca2+- dependent fusion of synaptic vesicles. The different stages of the synaptic vesicular cycle (docking, priming, exocytosis and compensatory endocytosis) are orchestrated by distinct subsets of proteins, and the amount and interaction of * Correspondence: jsprieto@vet.ucm.es; mitorres@vet.ucm.es Departamento de Bioquímica, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense, Madrid 28040, Spain © 2013 Ramírez-Franco et al.; licensee BioMed Creative Commons Attribution License (http:/ distribution, and reproduction in any medium these different proteins are thought to be crucial in determining presynaptic strength. The capacity of a given synapse to efficiently reuse synaptic vesicles has been proposed as a hallmark of maturation, and differences in vesicular reuse appear to underlie the enormous variability of responses observed in cultured neuronal networks [1]. Remodelling of the active zone through changes in protein content or post-translational modifica- tions has been linked with several crucial mechanisms involved in synaptic physiology, including presynaptic potentiation/depression, homeostatic synaptic scaling, synaptic silencing and synaptic weight redistribution [2-7]. In the present study, we focused on RIM1α as this protein is a key organizer of the active zone and it interacts directly or indirectly with all other known Central Ltd. This is an open access article distributed under the terms of the /creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, , provided the original work is properly cited. mailto:jsprieto@vet.ucm.es mailto:mitorres@vet.ucm.es http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 2 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 active zone proteins, including Rab3A and Munc13 [8]. Indeed, the RIM proteins are required for synaptic vesicle priming and both short- and long-term synaptic plasticity [9-12]. These RIM’s tether Ca2+ channels to the presynaptic active zone [13] and activate vesicle priming by reversing the autoinhibitory homodimerization of Munc13 [14]. Moreover, the RIM1/2 content is linearly associated with release probability and the size of the active zone [7]. Consistent with this central role, Rim deletion prevents neurotransmitter release [13]. In addition to RIM1α, we also analyzed Munc13-1, given the key role of Munc13 proteins in priming synaptic vesicles to a fusion-competent state [15] and in short-term poten- tiation of transmitter release [15-17]. Post-hoc immunocytochemistry and immunohistochem- istry have previously been used to study synaptic and neuronal function [1,18-20], yet to date, no detailed method to perform and analyse these experiments has been described. Here, we present a method that combines the assessment of presynaptic function in primary cultures of cerebellar granule neurons by monitoring synaptic vesicle recycling using the styryl dye FM1-43 with sub- sequent post-hoc immunocytochemistry. In addition, we describe a semi-automated protocol to easily quantify the data obtained, which enables the levels of immuno- reactivity (IR) to be correlated with synaptic efficiency. Methods FM1-43 live cell imaging To assess presynaptic activity we used cultures of cerebellar granule neurons that are largely populated by glutamatergic neurons [21-23]. All experiments were carried out in accordance with the guidelines established by the National Council on Animal Care and were approved by the local Animal Care Committee of the Universidad Complutense de Madrid (UCM, Madrid, Spain) following European Communities Council Directive of 22 September 2010 (2010/63/EU). Every possible effort was made to minimize animal suf- fering and the number of animals used. Cultures were prepared as described previously [1] and the cells were seeded at a final density of 3 × 105 cells per coverslip. Syn- aptic efficiency was assessed after 7 days in vitro (DIV: Figure 1, step 1) as follows. Briefly, cells were incubated for 10 minutes at 37°C in a calcium-free, low- potassium buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 1.2 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 10 mM glu- cose, 10 mM HEPES [pH 7.4]), and then for 90 seconds at 37°C with 10 μM FM1-43 (Invitrogen) in high-potassium buffer (95 mM NaCl, 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM NaHCO3, 1.2 mM NaH2PO4, 1.33 mM CaCl2, 10 mM glu- cose, 10 mM HEPES [pH 7.4]). The coverslips were then mounted in a PH5 perfusion chamber (Warner instru- ments) and the surface-bound dye was removed by perfusion of a calcium-free low-potassium buffer for 10 minutes. For subsequent immunocytochemical ex- periments we did not use any kind of vacuum grease as the superficial tension of the remaining aqueous inter- phase of the coverslip was sufficient to prevent solution leakage. Perfusion into the chamber was performed using a VC6 perfusion system (Warner instruments) and all solutions were maintained at 37°C using a TC-344B temperature controlling system (Warner instruments). Baseline measurements were acquired over 30 seconds while perfusing low-potassium medium, after which the cells were stimulated for 10 seconds with the high- potassium medium, resulting in dye unloading. Short stimulation periods were chosen to minimize the unre- liable homogeneity of responses that can occur during overstimulation of neuronal networks. During the ex- periment images were acquired at a rate of 1 Hz using a Nikon Eclipse TE2000-S microscope equipped with a Nikon CFI Plan Apo VC 60× Oil objective 1.4 (NA) and a CCD camera (iXonEM +DU885, Andor Technol- ogy). A 479 nm monochromator was used for excitation and the emitted light was collected using a fluorescein isothiocyanate (FITC) filter. Once the imaging period was over, the cells were maintained at rest by perfusing low-potassium buffer and several phase contrast images were acquired at different magnifications (60×, 40× and 20×) to serially reconstruct the exact field used in the experiment at a lower magnification (Additional file 1: Figure S1). This serial reconstruction allowed us to lo- cate the corresponding field after performing immuno- cytochemical experiments. The protocol used is described below and corresponds to step 2 in Figure 1; 1 Accommo- dation period: Maintain the cells for 10 minutes in low- potassium buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 1.2 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 10 mM glu- cose, 10 mM HEPES [pH 7.4]) at 37°C; 2 Loading step: Incubate the cells with the loading solution in high- potassium buffer in order to stain the synaptic vesicles (95 mM NaCl, 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM NaHCO3, 1.2 mM NaH2PO4, 1.33 mM CaCl2, 10 mM glu- cose, 10 mM HEPES [pH 7.4] and 10 μM FM1-43 [Invitrogen]) at 37°C; 3 Mounting: Mount the coverslip in the perfusion chamber. It is important to do this rapidly to prevent the coverslip from drying. For a scheme to clarify this step, see Cheung and Cousin, 2011 [24]. Several different commercial and custom-built chambers can be used; 4 Wash-out period: Once mounted in the chamber, wash the excess of externally bound dye from the coverslip by perfusion of a low- potassium, calcium-free buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 1.2 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES [pH 7.4]) at 37°C for 10 minutes at a constant flow of 1 ml/min; 5 Imaging of the SV cycle: Image acquisition can be performed at -Background subtraction -Alignment (FM1-43 as reference) -FM1-43 experiment analysis. -Bergsman routine in IgorPro software, ref. [46] -Post hoc immunolabelling -Field search KINETICAL DATA -IR images analysis -Use previously generated mask IR VALUES IR VALUES 1 2 CORRELATION BETWEEN FUNCTIONALITY AND IMMUNOLABELLING 3 4 5 -Cultured rat Cerebellar Granule Cells (CGCs) -Synaptic function assessed at 7DIV 5’ 6 -F M 1- 43 p se ud oc ol or ( bl ue ) A le xa 5 94 A le xa 4 88 Figure 1 (See legend on next page.) Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 3 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 (See figure on previous page.) Figure 1 Graphical abstract of FM1-43 experiments and subsequent post-hoc immunolabelling. Each number represents a different step in the protocol detailed throughout the paper. Briefly, 7DIV cultured cerebellar granule cells (1) were used to assess synaptic efficiency by means of FM1-43 experiments (2). Then, experiment analysis (3) was performed using the routine described in [46]. Cells were then labelled with antibodies against different presynaptic proteins (4). After alignment and analysis of the acquired images (5) the immunoreactivity measurements were correlated with the data obtained in the functional experiment (6). Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 4 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 different frequencies. In this protocol we recorded at a rate of 1 frame per second (1 Hz), with the excitation wave- length set at 479 nm, and we collected the emitted light through a FITC filter (520/540 nm). We acquired 30 frames to define the baseline period (a shorter baseline period can also be used but is less optimal to ensure baseline stability) and then stimulated for the desired period by perfusing with a high-potassium solution. Shorter stimulation periods are associated with greater heterogeneity in the whole population of responses. The images were acquired with a CCD camera operating at 14 bits (iXonEM +DU885, Andor Technology). Once image acquisition has ended, several images of the exact field imaged in the experiment and of the surrounding regions are collected at lower magnifica- tion. This is useful to build a serial reconstruction that helps define the exact field visualized during the experi- ment; 6 Coverslip removal: Remove the microscope adapter without disassembling the perfusion chamber and extract the upper coverslip from the chamber. Then, un- screw the chamber from the microscope adapter and press the lower coverslip gently onto one of its edges with fine- tip surgical tweezers while pulling the entire chamber away from the platform. In this way it is possible to re- trieve the coverslip almost intact from the slot in the plat- form. The subsequent immunocytochemical experiment should be commenced immediately and the collected data stored in a multidimensional *.TIFF file. Post-hoc immunocytochemistry Antibodies The following antibodies were used in the present study: a mouse monoclonal anti-Munc13-1, (1:1000; ref. 126 111 Synaptic Systems); a rabbit polyclonal anti-RIM1 (1:400; ref. 140 003 Synaptic Systems); and a guinea pig polyclonal anti-CB1R (1:300; ref. CB1-GP-Af530, Frontier Institute Co., Ltd.), the latter used exclusively as a presynaptic marker to obtain a positive linear relationship between the channels. To check for the specificity of the antibodies we performed western blot experiments as previously described [1]. Both antibodies recognized a single band with the expected molecular weight for both proteins (Additional file 2: Figure S2). The western blot protocol is described in Additional file 3. Labelling procedures To study the potential relationship between vesicular release efficiency and the levels of presynaptic proteins involved in neurotransmitter release, we selected two pro- teins with well-established roles in neurotransmitter re- lease: Munc13-1 [16,25] and RIM1α [13,26]. Even when the amount of protein and the intensity of immunoreac- tivity are not linearly related [27], immunocytochemical analysis is the only possible means of exploring the diffe- rences in protein content in subcellular compartments and relating these to functional parameters (in this case vesicular release). Moreover, several studies have used IR intensity as a means of estimating relative amounts of synaptic proteins [2-4,28,29], although some changes in synaptic protein composition that can be demonstrated by proteomic techniques can also be detected by semi- quantitative analysis [30]. After removing the coverslips from the platform they were rinsed once in PBS at 37°C in order to detach the cell debris that might have formed during the experiment. The coverslips were then fixed in 4% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature (RT), washed twice for 5 minutes in PBS and then per- meabilized for 6 minutes with PBS-0.2% Triton X-100 at RT. Before immunostaining, the cells were blocked for 1 hour at 37°C in a solution containing PBS-0.05 Triton X-100, 5% donkey serum and 5% goat serum (both from Jackson ImmunoResearch). The cells were then incubated overnight (o/n) at 4°C with the primary antibodies. Double immunocytochemistry for presynap- tic markers is recommended even when only one marker will be used for further analysis, and staining in two different channels is useful to obtain a linear rela- tionship between markers. Positive slope values (close to 1) for this relationship and strong correlation values are bona fide indicators of the validity of individual experiments (see section FM1-43 experiment and post- hoc immunocytochemistry and Figure 2). After expos- ure to the antibodies the cells were washed 5 times for 5 minutes each, and they were then incubated with Alexa (Molecular Probes, Invitrogen)-labeled secondary antibodies (alexa fluor 488 anti-mouse, goat 1:200; alexa fluor 488 anti-rabbit, goat 1:200 and alexa fluor 594 anti-guinea pig, goat 1:200) for 1 hour at 37°C. After washing, the coverslips were mounted with Prolong Antifade with DAPI (Invitrogen). The protocol used is described below: 1 Fixation and blocking: After the removal of the coverslip, rinse it thoroughly in PBS at 37°C and fix by immersion in 4% paraformaldehyde for 15 minutes. Wash twice in PBS and permeabilize the cells for 6 minutes in r2= 0.76342 Slope= 0.99061 r2= 0.76342 Slope= 0.85264 Whole boutons’ subpopulation IR≤0.5 fold mean A B C D E F (RIM1α IR) (C B 1R IR ) (Normalized RIM1α IR) (N or m al iz ed C B 1R IR ) (RIM1 α) (CB1R) (RIM1 α) (CB1R) IR≥2 fold mean Figure 2 Alignment of the different channels used for post-hoc ICC. Measured IR values for two presynaptic markers in each one of the individual ROIs: channel 1 (Alexa 488, anti-RIM1α in this case) and channel 2 (Alexa 594, anti-CB1R in this case) are shown in a.f.u (arbitrary fluorescence units) (A) or normalized to their mean IR value (B). Distribution of IR values of channel 1 (black bars) and channel 2 (red bars) in arbitrary fluorescence units (C) and normalized to mean levels (D). E) Graphical representation of the distribution of normalized IR values (<0.5 and >2 fold mean in blue and red, respectively) through the whole population of synaptic boutons. F) Normalized FM1-43 unloading kinetics of the three groups of synaptic boutons according to their RIM1α IR levels, means ± S.E.M. are plotted. Data from a single experiment (n = 671 boutons for the whole population trace; n = 96 boutons for IR levels >2, red trace and n = 231 boutons with IR levels < 0.5 mean value). Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 5 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 PBS-0.2% Triton X-100 if immunodetection of intracellu- lar epitopes is required. Wash for 5 minutes in PBS and using a P100 pipette, gently apply 90–100 μl of blocking solution (PBS + 0.05% Triton ×100, 5% goat serum, 5% donkey serum) onto the coverslip and incubate for 1 h at 37°C. It is helpful to leave the coverslips on a Parafilm- covered surface during the blocking and subsequent incu- bations to avoid spillage of the solution from the coverslip; 2 Labelling with primary and secondary antibodies: Incubate o/n at 4°C with the desired primary antibodies diluted in PBS containing 0.05% Triton X-100 and 2.5% donkey serum. Wash 3 times in PBS containing 0.1% Triton X-100 and twice in PBS alone. Subsequently, incu- bate the cells with the specific Alexa-conjugated secon- dary antibodies for 1 h at 37°C. Wash 5 times in PBS and rinse the covers in MilliQ water to remove excess salts. FM1-43 experiment and post-hoc immunocytochemical analysis To carry out a semi-automated and unbiased assay of synaptic efficiency on populations of thousands of indi- vidual nerve terminals and to specifically correlate each Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 6 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 individual response with a given IR value, we employed a routine previously described by Bergsman et al. 2006 [46]. This processing technique is extremely useful to avoid manual data selection and analysis, thereby facili- tating the statistical analysis of large populations of indi- vidual nerve terminals. This routine can be applied using IgorPro software and the data was analyzed as de- scribed previously [1]. Briefly, to ensure a minimum quality of the defined/selected regions of interest (ROIs), this routine uses three parameters to classify the re- sponses: the slope of the baseline, the extent of dye unloading, and the coefficient of variation of the base- line. This routine also renders a mask that can be used for further analysis and it provides a set of images in which background subtraction has been performed automatic- ally. The protocol used is described below in detail, and corresponds to step 3 in Figure 1; 1 Data Processing: Collect the data and save the multidimensional “*”.TIFF file as an image sequence in ImageJ (File > Save as > Image Sequence). Process the image sequence as indicated in Bergsman et al. 2006 [46]. The specific parameters used in this analysis are described in Additional file 4: Figure S3A; 2 Data Transfer: Once the analysis has finished check “leave folder alone” when prompted, which will save the processed (background subtracted) images in the same folder in which the experimental data is stored. Next, se- lect Data > Browse Waves and save the QualitySegment. ibw file. This file is an Igor Binary Wave (“.”.ibw) file that can be imported as an 8-bit image into ImageJ software (File > Import > Raw), and it is a binary drawing of the mask used for ROI analysis during the experiment. The settings for importing should be adjusted according to the size of the images acquired during the experiment (1004 × 1002 in this protocol: Additional file 4: Figure S3B); 3 Serial Reconstruction: Build a serial reconstruction of the lower magnification (20×) images acquired at the end of the FM1-43 experiment (step 5 in section FM1-43 live cell im- aging and Additional file 1: Figure S1). This operation can be performed automatically with Adobe Photoshop CS3 by loading the cell phase contrast images (File > Auto- mate > Photomerge), although other software packages can also be used to this end; 4 Image localization: Visu- ally search for the exact field examined in the functional experiment by manually surveillance with minimal clear light intensity to avoid photobleaching of the labelled sec- ondary antibodies. This may take several minutes, depend- ing on the expertise of the investigator; 5 Image acquisition: Once the field has been found, acquire im- munofluorescence images of the field monitored during the experiment at the same magnification (60× in the present protocol). Characteristic hallmarks of the field are useful to help manually align the coverslip before acquiring the immunofluorescence images, taking the FM1-43 experiment as a reference. This operation minimizes the subsequent digital alignment and reduces the number of lost (non-matching) ROIs during digital processing (step 4 in Figure 1); 6 Background Subtrac- tion: Perform a rolling ball background subtraction on the images acquired using a 12-pixel ball radius [31]. Take the FM1-43 image as a reference and after merging the chan- nels (Image > Color >Merge Channels), align the images using the Image J Align RGB planes plug-in (http:// www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html). Once aligned, split the channels (Image > Color > Split channels) and save the aligned images for posterior ana- lysis (steps 5 and 5′ in Figure 1); 7 Establish ROIset: Generate a ROIset in ImageJ from the “.”.ibw file (Additional file 4: Figure S3B). Import the mask and render a binary drawing (Process > Binary >Make binary). After alignment, some of the edges are usually missing from the immunofluorescence images and the corresponding ROIs must be removed from the binary image. This can be done easily by selecting the missing area in the immunofluores- cence image and restoring that selection to the binary drawing. Finally, render the ROIset (Analyze > Analyze par- ticles; tick the options appearing in Additional file 4: Figure S3C) and save this ROIset as a “.”.zip file; 8 Data Acquisition: Obtain the data from the different images, for which we recommend using the automatically gener- ated background-subtracted images obtained from the IgorPro analysis in order to minimize user manipulation of the images. This is achieved by automatically importing the images generated from the folder in which the experi- ment was saved (follow the steps indicated in Additional file 4: Figure S3D). After superimposing the ROIset over the images to be analysed, go to the ROIset menu and click More >Multi measure. In the present analysis, integrated densities were used to provide a cumulative measure of the immunoreactivity for each individual ROI [1]. List the re- sults obtained and copy them into a different worksheet (OriginPro 8.0 was used in the present study). Ensure that the same naming system is used for the columns in each worksheet so that the immunoreactivity values will match the kinetic values of each of the ROIs. Subsequently, you can check that the three images are properly aligned by plotting IR in channel 1 (Alexa 488, corresponding to RIM1α immunolabelling in this example) versus IR in channel 2 (Alexa 594, corresponding to CB1R immunolabelling in this case: Figure 2B and 2D). Generate a merged image in which the alignment can also be checked by eye; a line plot of the three channels is also helpful to assess the alignment (Additional file 5: Figure S4A and B); 9 Normalization: Normalize the IR values by dividing by the mean IR value of each of the channels. Although immunoreactivity levels are not linearly related to the amount of protein [27], by normalizing it is possible to perform a comparative analysis between the edges of the distribution in a given population of synapses (Figure 2E). http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 7 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 Moreover, this data processing allows the kinetic responses obtained during the FM1-43 experiment to be sorted blindly into different groups according to the intensity of IR. Microsoft Excel can be used to generate logic value codes (0 and 1) to blindly sort the functional responses (step 6 in Figure 1). In the present study we sorted the re- sponses into three groups: the whole population of re- sponses; the responses of ROIs with IR intensity more than twice the mean value; and the responses of ROIs in which IR intensity was less than half the mean value. The mean values of the three groups can then be plotted. An example of an individual experiment with a positive kinetic segrega- tion is shown in Figure 2F (see also Figure 3E and 3F). For multiple comparisons, we used ANOVA followed by a Bonferroni test to compare the means. Results and discussion The intensity of RIM1α, unlike that of Munc13-1, is a bona fide indicator of synaptic efficiency Although for decades primary neuronal cultures have been used to study various aspects of synaptic physiology, including pre- and postsynaptic function [6,13,22,32,33], synaptopathies and intersynaptic trafficking [34-37], the relationship between certain parameters of synaptic acti- vity and protein content remains unclear. While it is widely accepted that different proteins carry out specific activities (e.g., exo- and endocytic proteins mediate exo- and endocytic processes, respectively), few studies have demonstrated a quantitative correlation between synaptic function and protein content. Several aspects of presy- naptic function have recently been correlated with protein levels at a given release site [7], and interference with the dynamics of protein synthesis/degradation has been shown to modulate synaptic strength [4,6,38]. For example, RIM1α levels are linearly related to the release probability (Pr) of local axon collaterals of CA3 [7], and presynaptic efficiency can be bidirectionally modulated by modifying RIM1α levels [38]. To determine the extent to which differences in the magnitude of responses between individual nerve terminals are caused by variations in pro- tein content, we developed a method in which post-hoc immunolabelling is combined with (but not limited to) optical tracking of the synaptic vesicle (SV) cycle with FM1-43, this is a powerful tool to study the correlation between protein content and synaptic function, in this case vesicular release, a relationship that has remained un- defined for decades in studies of synaptic function. Using the extensive body of published data relating to the exo- cytotic steps of the SV cycle (for review see [39]), we in- vestigated whether the levels of two key proteins involved in the formation of exocytic complexes (Munc13-1 and RIM1α) are correlated with presynaptic activity, as mea- sured by vesicular release. Our results demonstrate that synaptic levels of RIM1α are positively correlated with FM1-43 unloading, which is a direct measure of vesicular reuse and release (Figure 3E and 3F). In this context we have found that those synaptic boutons whose RIM levels are higher than 2 times the mean IR value yielded by the whole population of boutons, are more efficient in terms of FM1-43 release. The opposite effect was found in the subpopulation of boutons with RIM1α levels lower than 0.5 times the mean IR value (Unloaded fraction; Whole population: 33.95 ± 0.27%, N = 4, n = 3666; RIM1α IR > 2: 36.41 ± 0.53%, N = 4, n = 502, **p < 0,01; RIM1α IR < 0.5: 30.18 ± 0, 47%, N = 4, n = 1300, **p > 0,01; ANOVA followed by Bonferroni’s Test for means comparison). These results are consistent with previous findings [4,7,13,29] and they validate the use of this technique. Based on these findings, it is possible to classify the functional responses of the FM1-43 experiment blindly into categories of increasing efficiency by sorting the ROIs according to the intensity of RIM1α IR. RIM1α is a pivotal protein in the arrangement of presynaptic active zones [26] and it participates in a complex interaction network along with other presynaptic proteins, such as the vesicular protein Rab3 [40] and the priming factor Munc13-1 [8]. Another important role of RIM1α is to tether calcium channels to presynaptic active zones via its PDZ domain [13,29,41], a function that may be critical in coupling exocytosis to calcium influx. RIM1α also undergoes PKA-dependent phosphorylation [42] and ubiquitin-dependent degradation via the E3 ubiquitin- ligase SCRAPPER [38]. Low levels of RIM are associated with low mEPSC frequencies and low calcium sensitivity [38], while high levels are linked with an increased Pr [7]. These data support the hypothesis that RIM levels can dictate the release properties of different synapses, serving as a source of variability among populations of synapses. Another important protein involved in the formation of exocytic complexes is the mammalian homologue of UNC13, the multidomain Munc13-1 protein, although we were unable to detect a positive correlation between Munc13-1 levels and synaptic efficiency (Figure 4E and 4F, Unloaded fraction; Whole population: 33.51 ± 0.20%, N = 4, n = 4431; Munc13-1 IR > 2: 33.37 ± 0,47%, N = 4, n = 701, non significant; Munc13-1 IR < 0.5: 33.15 ± 0.31%, N = 4, n = 2269, non significant). While unexpected, this result adds further weight to the positive correlation between RIM1α levels and FM1-43 unloading, indicating that the differences observed were not due to image processing or analysis. However, mechanistic differences between these two proteins could account for the failure to identify a correlation between Munc13-1 levels and vesicular release. Munc13-1 exists as a homodimer that must heterodimerize with RIM1α to carry out its priming function [14]. Moreover, it can also be regulated by diacylglycerol [16], calmodulin [43] and calcium [44]. ** ** ** A B C D E F a b cc d N=4; N=4; N=4; Figure 3 RIM1α levels correlate with synaptic efficiency. A) Post-hoc immunocytochemical images of FM1-43 loaded boutons in green and anti-RIM1α in red. B) Binary mask of the field imaged in A) obtained using IgorPro software for processing the experiments. C) Higher magnification detail of the boxed area in A) showing FM1-43 staining (a), RIM1α labelling (b), the merged image (c) and phase contrast image (d). Arrowheads indicate different synaptic boutons. Scale bar = 5 μm. D) Area boxed in A after superimposition of the detail boxed in B. Note the absence of “dead” pixels in the different ROIs in both channels (FM1-43 and RIM1α). E) Mean FM1-43 unloading values of the whole population of synaptic boutons (black), the subpopulation of synaptic boutons whose RIM1α content is higher than 2 (red) and the subpopulation of those ROIs which RIM1α content is lower than 0.5 (blue). F) Normalized FM1-43 unloading according to RIM1α IR values: whole population in black, subpopulation of synaptic boutons with IR > 2 in red and subpopulation of synaptic boutons with IR value lower than 0.5 in blue. Unloading fractions in E and traces in F are means of 3666 synaptic boutons from 4 covers (whole population), 502 boutons from 4 covers (>2) and 1300 boutons from 4 covers (<0.5). Scale bar = 25 μm. One way ANOVA followed by Bonferroni’s test for means comparison was performed. Significance was considered when p < 0.05. Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 8 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 Diacylglycerol binding to Munc13-1 translocates the pro- tein to the membrane, where it can carry out its priming function [45]. Hence, activation of the priming function of Munc13-1 involves several regulatory steps. We propose that the total levels of Munc13-1 (as determined by IR measurements) do not allow us to distinguish between active and inactive pools of this protein, which might ex- plain the lack of a correlation between Munc13-1 IR and A B C D E F a b c d N=4; N=4; N=4; Figure 4 Munc13-1 levels do not correlate with synaptic efficiency. A) Post-hoc immunocytochemical images of FM1-43 loaded boutons in green and anti-Munc13-1 in red. B) binary mask of the field imaged in A) obtained using IgorPro software for processing the experiments. C) Higher magnification detail of the boxed area in A) showing FM1-43 staining (a), Munc13-1 labelling (b), the merged image (c) and phase contrast image (d). Arrowheads indicate different synaptic boutons. Scale bar = 5 μm. D) Area boxed in A after superimposition of the detail boxed in B. Note the absence of “dead” pixels in the different ROIs in both channels (FM1-43 and Munc13-1). E) Unloading fraction values of the whole population of synaptic boutons (black), the subpopulation of synaptic boutons whose Munc13-1 content is higher than 2 (red) and the subpopulation of those ROIs which Munc13-1 content is lower than 0.5 (blue). F) Normalized FM1-43 unloading according to Munc13-1 IR values: whole population in black, subpopulation of synaptic boutons with IR > 2 in red and subpopulation of synaptic boutons with IR value lower than 0.5 in blue. Unloading fractions in E and traces in F are means of 4461 synaptic boutons from 4 covers (whole population), 761 boutons from 4 covers (>2) and 2261 boutons from 4 covers (<0.5). Scale bar = 25 μm. One way ANOVA followed by Bonferroni’s test for means comparison was performed. Significance was considered when p < 0.05. Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 9 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 vesicular release. Moreover, we cannot rule out the possi- bility that poor antibody sensitivity or specificity accounts for the absence of a correlation between global Munc13-1 levels and synaptic efficiency. However, both antibodies identified a single band of the expected molecular weight when assessed in immunoblots (Additional file 2: Figure S2). In the present study, we present a method that can be used to correlate a functional parameter of synaptic phy- siology (SV release) with the levels of different proteins Ramírez-Franco et al. BMC Neuroscience 2013, 14:127 Page 10 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2202/14/127 present at a given release site. The main advantage of this technique is the reduced user intervention during data processing, as manual selection and drawing of the diffe- rent ROIs is avoided. In most studies assessing synaptic function using image techniques, ROIs are user-defined and as such, they represent a source of potential bias. This bias is not only due to the poor sensitivity of the human eye compared with processing software but also, because the ROI shape does not exactly match that of the synaptic boutons, resulting in the inclusion of dead pixels in the ROIs defined, which can in turn affect the numerical data obtained. Moreover, manual selection usually renders fewer ROIs, which is not optimal for high-level statistical tests. In our protocol we employed an automated routine [46] to generate a mask that includes several hundred ROIs per experiment, the shape of which exactly matches that of the FM1-43 puncta and the IR puncta in the post-hoc images. This routine also generates a set of im- ages in which the background is subtracted automatically and that can be used for analysis. The validity of this method is corroborated by the correlation observed between RIM1α levels and the effectiveness of vesicular release, consistent with previous data [4,7,38]. Moreover, the responses are blindly sorted according to their IR in- tensity, thereby eliminating another source of bias. This protocol is not limited to the assessment of synaptic acti- vity using FM1-43, and it can be used to correlate semi- quantitative IR data with the calcium influx, measures of the exo/endocytic cycle with pHluorins, or electrophysio- logical recordings. This technique could also be further improved by incorporating super-resolution microscopy techniques such as STED [47,48] or STORM [49]. Conclusions Altogether, our results indicate that nerve terminal con- tent of RIM1α strongly correlates with the release capacity of the nerve terminal measured with FM1-43, while no such a correlation was found with Munc13-1. This finding point out to RIM1α as a crucial factor in determining synaptic efficiency and demonstrate the usefulness of this technique to analyse the molecular differences under- lying the heterogeneous responses exhibited by neu- ronal networks. Additional files Additional file 1: Figure S1. Serial reconstruction of the imaged field. A) Synaptic boutons loaded with FM1-43 dye before (to) and after (tend) stimulation with potassium chloride; contrast phase images of the same experiment field (white box) at different magnifications: 60× (B), 40 × (C) and 20× (D). E) Serial reconstruction of 20× cell phase images of the field monitorized during the experiment (white box) and surrounding areas. F) Contrast phase image al 20× magnification showing the field where the experiment was performed after fixing and labelling with the different antibody (matching field). Note the presence of distinctive hallmarks. Additional file 2: Figure S2. Western blot of RIM1α and Munc13-1 confirmed specificity of both antibodies. A) Western Blot of Munc13-1 (top green), β-Tubulin (bottom, red) and synaptophysin (bottom, green), showing a single band for Munc13-1 with the expected molecular weight. B) Western blot of RIM1α (green, top) and β-Tubulin (green, bottom) showing that both antibodies recognize a single band with the expected molecular weight. Additional file 3: Supplementary methods. Additional file 4: Figure S3. FM1-43 experiment analysis routine using IgorPro software and ImageJ. A) Parameters used in IgorPro interface to automatically analyze the FM1-43 experiment. This software renders the mask and a set of background subtracted images. B) Import of the QualitySegment.ibw file in ImageJ software to draw a binary mask. The size of the image has to fit with the original images acquired during the experiment. C) Generation of the ROIset with ImageJ software by analyzing particles present in the mask. D) Import of the set of background-subtracted images for further analysis of the experiment with OriginPro. Additional file 5: Figure S4. Alignment of FM1-43 with IR puncta after post-hoc ICC. A) Immunocytochemical images of FM1-43 in blue (pseudo colour), Alexa 488 (green) and Alexa 594 (red). Upper panels show ROIset superimposition and lower panels show line plot along a fiber. Note that the different ROIs are well fitted to the puncta in the different channels, this step is useful to visually check the alignment of the three channels. B) Arbitrary fluorescence units plot over the three channels of the ROIs indicated in A). Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors’ contributions JRF, JSP and MT conceived the study. JRF, BA and DBM designed experiments, and were responsible for collect, analyse and interpret the data; JRF and JSP wrote the manuscript. MT and JSP acquired funding necessary for the completion of the study. All authors read and approved the final manuscript. Acknowledgements We thank María del Carmen Zamora for her excellent technical assistance. This work was financed by grants from the Spanish MINECO (BFU2010-16947 to JS-P and BFU2012-32105 to MT), the ‘Instituto de Salud Carlos III’ RD06/ 0026 and the ‘Comunidad de Madrid’ (CAM-I2M2 2011-BMD-2349 to J S-P and MT). We thank Dr. M Sefton for editorial assistance. Received: 16 April 2013 Accepted: 10 October 2013 Published: 18 October 2013 References 1. 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En los paneles inferiores: Detalle de botones sinápticos mostrando la superposición de los dos canales en botones sinápticos individuales; Distribución de probabilidad acumulada mostrando la segregación de inmunorreactividades en función de la tasa de descarga de FM1-43; Ejemplos cinéticos de terminales individuales cuya inmunorreactividad se recoge como gráfico tridimensional en los paneles adyacentes. Proteínas estudiadas: A-Sinapsina B- Fosfo-sinapsina C- Calcineurina D-GluA3 B A C D a 1 2 IR d. débil: 71 a.u. 1 2 c IR d. fuerte: 412 a.u. IR d. débil: 456 a.u. IR d. fuerte: 753 a.u. 1 2 IR d. fuerte: 218 a.u. IR d. débil: 36 a.u. 1 2 IR d. fuerte 24 a.u. IR d. débil: 266 a.u. FM 1- 43 (V er de ) Si na ps in a( Ro jo ) FM 1- 43 (V er de ) Fo sf o- Si na ps in a( Ro jo ) FM 1- 43 (V er de ) Ca lc in eu rin a (R oj o) FM 1- 43 (V er de ) G lu A 3 (R oj o) p ac um ul ad a p ac um ul ad a p ac um ul ad a p ac um ul ad a Inmunorreactividad Inmunorreactividad Inmunorreactividad Inmunorreactividad Inmunorreactividad Fl uo re sc en ci a (N ) Fl uo re sc en ci a (N ) Fl uo re sc en ci a (N ) Fl uo re sc en ci a (N ) In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad T (min) T (min) T (min) T (min) Anexo II n.s. ** ** ** vii viii Anexo III Se muestra, para cada proteína: En los paneles superiores: En verde, el marcaje de FM1-43; En rojo, el marcaje contra la proteína de interés; La superposición de los dos canales. En los paneles inferiores: Detalle de botones sinápticos mostrando la superposición de los dos canales en botones sinápticos individuales; Distribución de probabilidad acumulada mostrando la segregación de inmunorreactividades en función de la tasa de descarga de FM1-43; Ejemplos cinéticos de terminales individuales cuya inmunorreactividad se recoge como gráfico tridimensional en los paneles adyacentes. Proteínas estudiadas: A-Bassoon B-Dinamina C-Munc13-1 D-VGluT1 B A C D IR d. fuerte: 147 a.u. IR d . débil: 59 a.u. IR d. débil: 27 IR d. fuerte: 329 IR d. débil: 152 a.u. IR d. débil: 178 a.u. 1 2 1 2 1 2 2 1 IR d. fuerte: 191 a.u. IR d . fuerte: 591 a.u. p ac um ul ad a FM 1- 43 (V er de ) Ba ss oo n (R oj o) p ac um ul ad a p ac um ul ad a p ac um ul ad a FM 1- 43 (V er de ) D in am in a (R oj o) FM 1- 43 (V er de ) M un c1 3 (R oj o) FM 1- 43 (V er de ) VG lu T- 1 (R oj o) Inmunorreactividad Inmunorreactividad Inmunorreactividad Inmunorreactividad Fl uo re sc en ci a (N ) Fl uo re sc en ci a (N ) Fl uo re sc en ci a (N ) Fl uo re sc en ci a (N ) T (min) T (min) T (min) T (min) In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad In m un or re ac tiv id ad Anexo III n.s. n.s. ** ** ix x Anexo IV Se muestra un resumen gráfico de las vías de endocitosis puestas en marcha ante estimulaciones de alta intensidad en los distintos estadios de maduración del cultivo. Se ilustran las principales proteínas implicadas en cada una de las rutas de endocitosis, así como el efecto de los distintos fármacos empleados para el estudio de estos mecanismos. Obsérvese la coexistencia de mecanismos eficaces e ineficaces de reciclamiento a 7DIV y ante estimulaciones de alta intensidad. Anexo IV XI xii Anexo V Se muestra un resumen gráfico de las vías de endocitosis puestas en marcha ante estimulaciones de baja intensidad en los distintos estadios de maduración del cultivo. Se ilustran las principales proteínas implicadas en cada una de las rutas de endocitosis, así como el efecto de los distintos fármacos empleados para el estudio de estos mecanismos. Obsérvese la inexistyencia de mecanismos de reciclamiento ineficaz al estimular a bajas concentraciones de CaCl2 y en estadios maduros del cultivo. Anexo V XIII xiv Anexo VI Esquema de la inhibición mediada por la activación del receptor CB1 con HU-210. Se muestra la inhibición de los canales de calcio, la inhibición de la adenilato ciclasa y la activación de los canales de potasio. La inactivación de EPAC podría conducir a un defecto en la preparación de las vesículas. 1-Acercamiento y preparación de las vesículas sinápticas. 2-Fusión calcio dependiente de las vesículas sinápticas. Anexo VI XV Tesis José Jorge Ramírez Franco PORTADA AGRADECIMIENTOS SUMMARY ABREVIATURAS INDICE I- INTRODUCCIÓN 1-Regionalización, estructura y función del cerebelo 2-La sinapsis glutamatérgica 3- El sistema endocannabinoide 4-Sinapsis silentes II-OBJETIVOS 1-Endocitosis 2-Exocitosis III- MATERIAL Y MÉTODOS 1-Materiales 2-Métodos 3-Procesamientos informáticos IV- RESULTADOS 1-Diferencias en la eficacia de reciclamiento subyacen a la heterogeneidad derespuestas sinápticas en neuronas granulares de cerebelo en cultivo 2- La magnitud del evento exocitótico determina la eficacia de reciclamiento 3- Bajas concentraciones de FM1-43 marcan selectivamente las vías dereciclamiento ineficaz 4-El reciclamiento ineficaz de las vesículas sinápticas está asociado a formas lentasde endocitosis 5-Papel de la dinamina en las distintas formas de reciclamiento vesicular 6- Contribución diferencial de la calcineurina a las distintas formas dereciclamiento 7- El fenómeno de "Kiss&Run" no está implicado en las formas ineficaces dereciclamiento 8- Análisis ultraestructural del ciclo vesicular sináptico: las formas ineficaces dereciclamiento están asociadas a endocitosis en masa 9-La eficacia de reciclamiento como marcador de la maduración neuronal 10-Marcadores presinápticos asociados con la eficacia de reciclamiento 11-Receptores presinápticos y eficacia de reciclamiento 12- Regulación de la eficacia de liberación vesicular por el receptor decannabinoides de tipo 1 (CB1R) e inducción de silenciamiento sináptico 13- Indepencia de Calcio del fenómeno de silenciamiento sináptico 14- Efectos ultraestructurales asociados a la activación del receptor CB1 15- La activación del receptor CB1 induce una reducción del pool de reciclamiento 16- La inducción de silenciamiento es atribuible a una disminución en los nivelesde cAMP 17-La activación de la vía del cAMP previene, de forma PKA-independiente yEPAC-dependiente, la inducción de silenciamiento sináptico mediada por CB1R 18- La activación de la proteína EPAC es capaz de revertir el fenómeno desilenciamiento sináptico 19- Marcadores presinápticos de la susceptibilidad al silenciamiento mediado porCB1R V- DISCUSIÓN 1-Diferencias en la eficacia de reciclamiento y heterogeneidad de respuestassinápticas 2- La magnitud de la exocitosis determina la eficacia de reciclamiento 3- Concentraciones de FM1-43 y eficacia de reciclamiento 4- Las formas de endocitosis poco eficaces persisten tras la estimulación.Coexistencia de rutas de reciclamiento 5- Papel de la dinamina en las distintas formas de reciclamiento 6- Papel de la calcineurina en ambas formas de endocitosis 7-Posible implicación de los fenómenos de "Kiss&Run" en el reciclamientoineficaz 8-Análisis ultraestructural de terminales sinápticos 9- La eficacia de reciclamiento como marcador de maduración 10- Marcadores presinápticos y eficacia de reciclamiento 11- Receptores presinápticos y maduración neuronal 12- Regulación de la liberación vesicular por el receptor CB1. Silenciamientosináptico 13-Independencia de calcio del fenómeno de silenciamiento 14-Análisis ultraestructural del fenómeno de silenciamiento sináptico 15-Redistribución de los pools de vesículas sinápticas mediada por la activación deCB1 16- Farmacología del fenómeno de silenciamiento 17-Reversibilidad del proceso de silenciamiento. Implicaciones en la plasticidad 18- Determinantes presinápticos de la susceptibilidad al silenciamiento VI-CONCLUSIONES VII- BIBLIOGRAFÍA VIII- ANEXOS Anexo I Anexos II y III Anexo II Anexo III Anexo IV Anexo V Anexo VI folder.joboptions << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /PageByPage /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Error /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /DetectCurves 0.1000 /ColorConversionStrategy /LeaveColorUnchanged /DoThumbnails true /EmbedAllFonts true /EmbedOpenType false /ParseICCProfilesInComments true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams true /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveDICMYKValues true /PreserveEPSInfo true /PreserveFlatness true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts true /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /CropColorImages true /ColorImageMinResolution 300 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 300 /ColorImageDepth -1 /ColorImageMinDownsampleDepth 1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages true /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 300 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages true /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages true /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False /CreateJDFFile false /Description << /ARA /BGR /CHS /CHT /CZE /DAN /DEU /ESP /ETI /FRA /GRE /HEB /HRV /HUN /ITA /JPN /KOR /LTH /LVI /NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken voor kwaliteitsafdrukken op desktopprinters en proofers. 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