UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Augusto Silva González DIRECTOR: Manuel Ortiz de Landazuri Madrid, 2015 © Augusto Silva González, 1981 Citotoxicidad celular espontánea : caracterización de sus células efectoras : aumento de la actividad citotóxica espontánea por interferon TP Augusto Silva Gonzalez ■lllllllllll * 5 3 0 9 8 6 1 8 7 3 * UNIVERSIDAD COMPLUTENSE CITOTOXICIDAD CELULAR ESPONTANEA. CARACTERIZACION DE SU CE LU LAS EFECTORAS. AUMENTO DE LA ACTIVIDAD CITOTOXICA ESPONTANEA POR INTERFERON Departamento de Bioquimica Facultad de Ciencias Diol6gicas Universldad Complutense de Madrid 1983 Coleccl6n Teals Doctorales. NS 178/83 Auguste Silva Gonzalez Edita e imprime la Editorial de la Universidad Complutense de Madrid. Servicio de Reprografia Noviciado, 3 Madrid-8 Madrid, 1983 Xerox 9200 XB iSO Depdsito Legal: M-23I78-I983 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE BIOLOCICAS CITOTOXICIDAD CELULAR ESPONTANEA. CARACTERIZACION DE SUS CELULAS EFECTORAS. AUMENTO DE LA ACTIVIDAD CITO­ TOXICA ESPONTANEA POR INTERFERON. MEMORIA QUE PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS PRESENTA A U G U S T O S I L V A G O N Z A L E Z ENERO 1981 Agradezco la revisiôn y presentaciôn de este tra- bajo al Profesor D. Angel Martin Municio. A Maribel, a la que amo y admire. El presente trabajo ha sido realizado en el Servicio de In- munologia de la Clinica Puerta de Hierro, bajo la direcciôn del Dr. M. Ortiz de Landazuri. A los Drs M. O. de Landazuri, M. Kreisler, A. Durantez, J. Alvarez, M. Lopez-Botet, J. Rodriguez, y a la excelente labor tecnica de M. Munoz, C. Lorences, y G. Peraile; a Estela, y a todo el Servicio de Inmunologia, pasado y presente, mi total agradeci- miento, por ensenarme. S61o espero no defraudarlos. INDICE OBJETO DEL PRESENTE TRABAJO ................................ viii I. INTRODUCCION ............................................ 1* 1.1. CONCERTOS ESENCIALES DEL SISTEMA INMUNE ......... 1 1.2. LINFOCITOS B ....................................... 6 1.2.1. Funciones de los linfocitos B ................ 6 1.2.2. Estructura de las inmunoqlobulinas ........... 7 1.2.3. Marcadores de superficie del linfocito B .... 10 1.2.3.1. Inmunoglobulinas de superficie ......... 10 1.2.3.2. Receptores para el complemento ......... 11 1.2.3.3. Receptores para el Fc de la IgG e IgM ... 12 1.3. MACROFAGOS ........................................ 12 1.3.1. Marcadores del macrdfago ...................... H 1.3.2. El macrdfago y su relacidn con los linfoci­ tos T y B ...................................... 14 1.4. LINFOCITOS T ....................................... 16 1.4.1. Caracterfsticas y marcadores de superficie.... 16 1.4.2. Subpoblaciones de linfocitos T humanos ...... 18 1.4.3. Heterogeneidad funcional de los linfocitos T.. 20 1.4.3.1. Linfocitos T reguladores: Ayudadores y supresores ................................ 20 1.4.3.2. Linfocitos T efectores: MLC, CML e Hi­ per sensibil id ad retardada . - - • ........... 22 1.5. LINFOCITOS "NULL" ............................... 27 1.6. CITOTOXICIDAD CELULAR DEPENDIENTE DE ANTICUER- PO Y DE LECTINAS ................................. 28 1.7. CITOTOXICIDAD ESPONTANEA ........................ 30 1.7.1. Caracterfsticas de la cêlula efectora NK ... 30 1.7.2. Especificidad de las cêlulas NK ............ 36 1.7.3. Factores que afectan a la actividad NK ...... 37 1.7.3.1. El interferdn............................. 39 1.7.4. Papel biolôgico de las células NK ............ 41 II. MATERIAL Y METODOS .................................... 4 3 II.1. MATERIAL PARA CULTIVOS CELULARES ............... 4 3 II. 2. REACTIVOS ......................................... 4 4 II. 3. PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CÜLTIVO ............. 46 II. 4. LINEAS TUMORALES ................................ 4 6 11.5. ANIMALES USADOS ................................. 48 II. 6 . PREPARACION DE LAS CELULAS LINFOIDES .......... 4 9 11.7. ELIMINACION PARCIAL DE CELULAS ADHERENTES......... 51 11.7.1. Por pase a travês de columnas de nilon ...... 51 11.7.2. Tratamiento con polvo de hierro ........... 52 11.8 . MARCADORES DE SUPERFICIE DE LAS DISTINTAS POBLA- CIONES LINFOCITARIAS ................................. 53 II.8.1. Deteccion de células con receptores para el hematie de carnero ............................ ^3 1 1.8 .2 . Dcli'cciôn do célulns con i niminogl obul i nas de superficie................................. 55 11.8.3. DoLecci6 n do células con receptores para el fragmente Fc de la IgG .................. 55 11.8 .4. Deteccion de células con receptores para el Fc de la IgM ............................. 56 11.8.5. Detecciôn de células canaces de ingerir par ticulas de latex ............................ 57 11.8.6 Tinciôn de esterasas inespecificas para la identificacién de monocitos y macrôfagos. . . . 58 II. 9. SEPARACION DE LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFERICA EN SUS DIFERENTES SUBPOBLACIONES ............... 59 13.9.1. En funciôn de sus marcadores de superficie.. 59 11.9.1.1. Preparacién de linfocitos T y no T . . . . 59 11.9.1.2. Preparaciôn de linfocitos ^ no .. 62 11.9.1.3. Preparaciôn de células Fc(7S)^ y Fc(7S). 64 13.9.2. En funciôn de su tamano y densidad en un gradiente de Percoll ......................... 66 11.10 MONOCAPAS CELULARES PARA INMUNOADSORCION ...... 67 II. 10.1. Formaciôn de la monocapa.................... 67 11.10.2. Adsorciôn de células efectoras ............. 68 11.11. ENSAYO CITOTOXICO POR SUELTA DE ^^Cr ......... 69 II.11.1. Marcaje con el isotopo ^^Cr de las células diana ........................................ 69 II.11.2. Preparaciôn de las células efectoras y procedimiento ................................ 69 11.12. TECNICA DE FORMACION DE CONJUGADOS ............... 73 11.13. TECNICA DE CONJUGADOS CITOTOXICOS EN AGAROSA ..... 7 3 11.14. TRATAMIENTO DE LOS LINFOCITOS CON INTERFERON ...... 74 III. RESULTADOS ............................................. 75 111.1. CARACTERIZACION DE LA CELULA EFECTORA EN CITO­ TOXICIDAD ESPONTANEA ............................. 75 III.1.1. Formaclon de conjugados en las diferentes subpoblaciones linfocitarias.. ............... 75 111.1.2. Actividad citotoxica de las diferentes subpoblaciones linfocitarias.. ............... 04 111.1.2.1. Estudio de diferentes subpoblaciones de sangre periferica .................... 84 111.1.2.2. Citotoxicidad espontSnea en diferen­ tes ôrganos linfoides .................. 92 111.1.3. Demostraciôn de que la integridad del re­ ceptor Fc(7S) de la célula efectora NK, no es necesario para llevar a cabo su fun ciôn citotôxica .............................. 99 111.1.4. Linfocitos grandes granulares como célu­ las efectoras en citotoxicidad NK .............105 111.2. DEMOSTRACION DE QUE LAS CELULAS EFECTORAS EN NK PERTENECEN A LA MISMA POBLACION QUE LAS CE LULAS EFECTORAS EN ADCC ...........................113 111.2.1. Experimentos de inhibiciôn usando célu­ las diana frias .............................. 115 111.2.2. Experimentos de adsorciôn .................. 121 III.3 ACTIVACION DE LA ACTIVIDAD CITOTOXICA ESPONTA­ NEA POR INTERFERON ................................. 132 111.3.1. Aumento de la actividad citotôxica por IFN..132 111.3.1.1. El IFN no aumenta el nûmero de conju­ gados totales, aunque si el ndmero de conjugados citotôxicos ................ 133 111.3.1.2. Concentraciôn y cinetica de la acti- vaciôn por IFN ..........................135 111.3.1.3. Efecto reversible de la acciôn del IfN sobre células NK . ̂ ..................... 142 111.3.2. Aumento de la actividad NK por IFN en diferentes subpoblaciones linfocitarias...... 143 111.3.2.1. Separaciôn de subpoblaciones en fun­ ciôn de los marcadores de superficie -..143 111.3.2.2. Separaciôn de subpoblaciones en fun­ ciôn de su tamano y densidad en un gradien­ te de Percoll .............................. 14 7 IV. DISCUSION ...............................................153 V. CONCLUSlONES .......................................... 172 VI. BIBLIOGRAFIA 175 ABREVTATURAS USADAS EN EL PRESENTE TRABAJO S.I. ,. Sistema Inmune MHC. Sistema mayor de histocompatibilidad ig. InmunoglobulIna MEM Medio minimo esencial Dominios variables de la cadena pesada Dominlos variables de la cadena ligera S Dominios constantes de la cadena pesada Dominios constantes de la cadena ligera "̂ A Células T ayudadoras Células T supresoras Células T citotoxicas MLR Cultive mixto de linfocitos CML Linfocitotoxicidad mediada por células PBS Tampon salino-fosfato PCS Suero bovino fetal GA GlutaraIdehido NK Citotôxicidad espontanea ADCC Citotôxicidad dependiente de anticuerpo LICC C i totôx ic id ad mediada por lectinas PHA Fitohemaglutinina PLL Poli-L-lisina H-2 Sistema principal de histocompatibilidad en ratOn HLA Sistema principal de histocompatibilidad en humanos SRBC Hematics de carnero HRBC Hematics humanos CRBC Hematics de polio OxRBC Hematics de buey K Célula efectora en citotôxicidad ADCC Fc(7S)^ Célula con receptores para el Fc de la IgG Fc(7S) Célula sin receptores para el Fc de la IgG E Hematics de carnero Ty Linfocitos T con receptores para el Fc de la IgG Ty Linfocitos T con receptores para el Fc de la IgM AET 2-aminoetil-isotiouranio bromuro hidrobromuro INF _ Interferon BSS Tampon sa lino fosfato LGL Linfocito orande granular aa aminoacido U.L. Unidades liticas OBJETO DEL PRESENTE TRABAJO Uno de los mecanismos de defensa del Sistema Inmune, lo constituye la actividad citotôxica, llevada a cabo por cé­ lulas inmunocompetentes con capacidad para destruir, mediante diferentes mecanismos, células consideradas como "extranas". La citotôxicidad celular espontanea es uno de estos mecanismos, en el cual la célula efectora no habiendo sido previamente in- munizada, es capaz de destruir células tumorales, considerando- se por ello imbricada en los procesos de "vigilancia inmunolo- gica". Dado que esta actividad citotôxica ha sido descrita re- cientemente, se desconocen muchos aspectos de ella, taies como, mecanismos, caracteristicas de la célula efectora, modulaciôn por diferentes agentes...etc. Por ello nosotros hemos estu- diado: 1) Caracterizaciôn, mediante marcadorés de superficie, de la célula efectora que media esta citotôxicidad, en su doble ver- tiente, de formaciôn de conjugados con células tumorales y de su actividad litica. Estos estudios pueden permitir el aisla- miento y purificaciôn de la poblaciôn efectora, bien en base a sus propiedades fisicas o por su localizaciôn dentro de las di fcrontes subpoblaciones linfocitarias humanas. 2) Dado que estudios previos mostraban una gran similitud entre las poblaciones efectoras que median la citotôxicidad espontanea y la citotôxicidad celular dependiente de anticuer­ po, averiguar si ambas citotôxicidades estan mediadas por la misma poblaciôn efectora y si ambas poseen los mismos reque- rimientos para llevar a cabo sus mecanismos llticos. 3) Recientemente se ha descrito que la actividad citotôxica espontanea puede ser aumentada por el interferon. Nuestro objetivo ha sido triple: a) averiguar si este aumento se de- be a un reclutamiento de nuevas cêlulas citotôxicas o a una mayor efectividad de las ya existentes, b) si el interferôn modifica el rango de especificidades de la célula efectora, y c) investigar cual es la poblaciôn celular que se activa por interferon. I. INTRODUCCION I.l. CONCERTOS ESENCIALES DEL SISTEMA INMUNE Los vertebrados poseen un mecanismo de defensa denom_i nado "Sistema Inmune" que les protege del ataque de los mi croorganismos, tales como virus y bacterias, y de las cêlulas tumorales. El sistema inmune (S.I.) reconoce y élimina es­ pecif icamen te a aquellas sustancias extrahas al organisme que loqran penetrar la barrera exterior de los vertebrados . La protecciôn inmunitaria en estos organismos se da a traves de un sistema doble que mantiene dos tipos de defensa contra los invasores y que responden especificamente contra la mayoria de las sustancias extranas : a) el sistema humoral, que se basa en la presencia de estructuras proteicas circu­ lantes, anticuerpos, capaces de unirse al antlgeno y b) la inmunidad celular, que se basa en el propio papel efector de las células del sistema linfoide. De esta dualidad son res ponsables dos poblaciones de células linfoides, morfologica- mente indistinguibles, denominadas linfocitos. En un tipo de linfocitos, "linfocitos T", reside la respuesta de tipo celular; mientras que en los "linfocitos B" esté el inicio de la respuesta humoral. AdemSs de los linfocitos, cl S.I. depende de otros tipos de células denominadas accesorias,en­ tre las que cabe destacar a los monocitos-macrôfagos, cuyas funciones facilitan o regulan el desarrollo de la respues­ ta inmunef1-5). En esencia, el S.I., se caracteriza por el reconoci- miento de estructuras de macromoléculas que no son constitu yentes normales del organisme. Estas entidades que el S.I. reconoce se denominan antîgenos, mientras que la parte del antlgeno a la cual se une el anticuerpo, se denomina déter­ minante antigénico o epitope. Se denominan inmunôqenos a aquellas macromoléculas extranas al organisme capaces de ac tivar el S.I., aunque hay pequenas moleculas que no son in- munôgenos (haptenos) que pueden disparar esta respuesta si estSn unidas a una molecula portadora (6). También las células pueden ser antigénicas, y lo son a traves de estructuras de superficie que las diferencia de las células de otro individuo. Estas estructuras llamadas "antîgenos de histocompatibilidad" determinan el reconoci- miento y aceptaciôn o rechazo de injertos. Su estructura esté codificada por el "Sistema mayor de histocompatibilidad' (MHC), que son sistemas multialelicos de los cuales los mas importantes son el HLA en humanos y el H-2 en rat6n. Tan- to el HLA como el H-2 codifican tres tipos diferentes de moleculas: los déterminantes SD (Clase I) "serologically determined", que se ponen de manifiesto con el uso de anti- sueros; estructuras LD (Clase II) "lymphocyte determined", que solo son detectadas en reacciones linfocitarias, y otras estructuras (Clase III) que controlan la expresiôn de algunos componentes séricos inespecIficos perteneclentes al sistemà de Complemento, que también juegan un importante papel en el desarrollo del S.I.. Todas estas estructuras hacen que las células sean de por si inmunogënicas, activando tanto la re£ puesta humoral como la respuesta celular . (7-9). Las cêlulas linfoides tienen su oriqen en la cêlula ma dre (stem cell) de la mêdula osea; éstas, emigran hacia unos tejidos linfoides predeterminados denominados "primarios", que son el timo y la mëdula osea (boisa de Fabricio en aves), donde maduran por la influencia del microentorno en linfocitos T y linfocitos B, respectivamente. Esta fase de maduraciôn celular parece que es independiente del estimulo antigénico, y los linfocitos que se diferencian y maduran en estos 6 rga- nos comienzan a ser inmunocompetentes, es decir adquieren los receptores de superficie antigênicos especificos y la maquina- ria necesaria para responder al estimulo antigénico•(10-12) . Solo unos pocos linfocitos saldrSn de estos ôrganos primarios, considerados ahora como linfocitos "virgenes" (no activados por el antigeno) y éstos emigraran y viajaran a traves de los tejidos y ôrganos por dos circuitos: la sangre y el sistema linfStico. Sin embargo, los linfocitos con- tactan y responden con los antigenos inmunizantes en ôrganos linfoides especiales que poseen las estructuras y cêlulas ac- cesorias necesarias para el correcto procesamiento y presen- taciôn antigênica. Estos ôrganos denominados "secundarios" son principalmente el bazo y el sistema de gangllos linfa- tlcos donde los linfocitos T y B se distribuyen en unas po- siciones determinadas y fijas, y donde tendrS lugar la acti- vaciôn antigênica de las células linfoides.(13) Por Gltimo, la activaciôn de las células linfoides, a traves de la uniôn con el antigeno por sus estructuras de su perfide, no es todavia conocida. Probablemente, solo ague llos receptores que se unan al antigeno con una determinada avidez puedan iniciar la activaciôn( 14 ), linfocitos que 4 5pueden encontrarse uno de cada 10 6 10 células ( 14) . Tras la interacciôn antigênica, los linfocitos B se trans forman en células plasmâticas las cuales segregarén in- munoglobulinas, mientras que los linfocitos T adquieren cier- tas caracteristicas efectoras que controlarSn la respuesta vj'k IAEDuLA osea I ’ tJ fO C lT o B LlKlFoCiTO T C O o P t R A C lO H ANT i c uERPo ? L A S K M l UlUToClTO T C\TOTo7-*CO Figura 1, celular( rechazo alogonico, reacciones de injdrto contra hues ped, hipersensibilidad de tipo retardado, destrucciôn de cé­ lulas infectadas con virus... etc.) y colaborarân con los lin focitos B en la respuesta inmune a ciertos antigenos denomi­ nados timo-dependientes. 1.2. LINFOCITOS B 1.2.1.Funciones de los linfocitos B Los linfocitos B tienen como principal misiôn la de in teraccionar con el antigeno a traves de receptores de super­ ficie y activarse trasformandose en células plasmaticas ,cu ya misién es segregar inmunoglobulinas (Ig)(15). El receptor antigenico sobre la membrana de los 1 info citos B lo constituyen las moleculas de Igs (l6, 17). Estas moléculas de Igs presentan las regiones de interacciôn anti­ gênica (centres activos) hacia el exterior, mientras que an- cladas en la membrana celular estân las regiones constantes, responsables de la funciôn biolôgica de las Igs y del envio de sehales al interior de la célula. 7 . Segdn la teorîa de la selecciôn clonal, propuesta por Burnet (18), cada d o n de linfocitos P posee un ûnico recog tor especifico para un determinado antigeno (epitope o deter minante antigênico). El inmunôgeno seleccionarS a aquellos clones de linfocitos B que posean Igs de superficie especl- ficas para sus epitopes y habrâ una activaciôn celular que originarS cêlulas secretoras de anticuerpo tras la interac­ ciôn del inmunôgeno con la cêlula B especifica. Todas las Igs producidas por cêlulas provénientes de un mismo don, po seen una misma especificidad antigênica que a su vez sera a- nâloga a la que tenla el receptor de membrana del linfocito B, causante de la interacciôn con el antigeno (19). 1.2.2. Estructura de las inmunoglobulinas Las inmunoglobulinas son glicoproteinas constituidas por dos monomeros identicos, cada uno de los cuales consta de una cadena polipeptidica denominada "pesada" (cadena H) y una cadena polipeptidica denominada "ligera (cadena L) ( 20). En vertebrados superiores existen cinco isotipos diferentes de cadenas pesadas denominados ; a, y, jj, 6,y c, los cuales al combinarse con las cadenas ligeras constituyen las inmu­ noglobulinas IgA, IgG, IgM, IgD, e TgE, respectivamente. Existen dos tipos de cadenas ligeras, las denominadas "kappa" y "lambda" ( x, X), y estas se combinan con las cadenas pesa das de tal modo que una molêcula de inmunoqlobulina puede pre sentar cadenas del tipo x o del tipo A, pero nunca las dos so­ bre la misma molécula (21,22). Al comparer entre si las secuencias de aminoacidos de un mismo tipo de cadena, se vi6 que estas se podîan dividir en regiones constantes, que presentaban una identica secuen- cia de aa, y de regiones variables, en que la secuencia de aa variaba mucho entre cadenas de un mismo tipo. Aproximada- mente, la regiôn variable comprendla la mitad de las cadenas ligeras y una cuarta parte de las cadenas pesadas; en ambos casos comprenden unos 110 en las ligeras y 120 en las pesadas aa mas proximos al extremo N-terminal (23). Se comprobô que las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras cons- tituian el centro activO (paratope) de uniôn con el antigeno (epitope). La presencia de puentes disulfuro intraçatenarios originan los denominados "dominios"; los primeros de los cua­ les en la cadenas ligeras y pesadas comprenden las regiones va riables (V^ Y V^) que contienen el paratope mientras que los demas (3 6 4 para las cadenas pesadas y uno para las ligeras) pertenecen a las regiones constantes (C^ y C^), en las cuales residen las propiedades efectoras de las inmunoglobulinas(24). Las moléculas de Igs de una especie tienen propiedade antigenicas para otra especie y sus déterminantes antigéni s icos 9 . puodcn rcsidir tanto en la reqiôn constante (déterminantes isotîpicos y alotîpicos ) o en su reqiôn variable (détermi­ nantes idi o t i p i c o s ) (24), Agi, los idiotipos, estrechamente ligados al centro activo de la molécula confieren individua 1idad a las Igs (25,26). En ratones, los genes que codifican las cadenas lige­ ras K, cadenas ligeras X y las cadenas pesadas de las cadenas pesadas de las Igs, estân situadas en cromosomas diferentes(27). Las cadenas pesadas estân codificadas en el cromosoma 12, mien tras las k lo estân en el 6, siendo aun desconocido el grupo de ligamiento que codifica la cadena ligera X. Sin embargo, los genes Ĉ j de todas las posibles variedades de cadenas pe­ sadas estân muy proximamente unidos sobre un ûnico cromosoma, y esto ocurre con todas las especies estudiadas. Hoy bay tam bien evidencia del ligamiento entre los genes que codifican las regiones V y C de las cadenas de Igs, tanto ligeras como pesadas, aunque estos se encuentren separados unos de otros a nivel del DNA (28,29) . Por ultimo existen dos corrientes de pensamiento para tratar de explicar la diversidad del S.I.; La teorla de la Lfnea germinal segûn la cual en el genoma del individuo exis ten un gran numéro de genes (V^ y V^) capaces de codificar las especificidades frente a todos los antigenos posibles y la 1 n teorîa de la inutaciôn somâtica segûn la cual existe un numéro de genes (V) menor, existiendo un mecanismo de diversidad in­ dividual que darîa cuenta de la diversidad funcional del S.I. (30,31). 1.2.3. Marcadores de superficie del linfocito B 1. 2 .3.1. Inmunoglobulinas de superficie. Constituyen el marcador mas caracteristico de la estiri» celu lar B (32,33,34 ). Para la detecciôn de las Igs de superfi­ cie se han usado diferentes técnicas, de las cuales la mas û- tilizada ha sido la inmunofluorescencia. El uso de antisue- ros anti-inmunoglobulinas fluoréseeinados tine la superficie de las células que tengan Igs de superficie(35,36), las cua­ les pueden detectarse con un microscopic de fluorescencia. Con el uso de este tipo de técnicas, se observé que cuando se tenian suspensiones de linfocitos vivos con sueros anti-las fluoresceinados, los linfocitos cambiaban su patrôn de tincién con el tiempo, fe nome no conocido como "capping", y en el que las Igs de superficie se agrupan en un détermina do polo celular. Este fenomeno représenta el movimiento de las Igs sobre la superficie celular( lo que apoyaba la idea del mosaico fluido como estructura de membrana celular)(37). 1 ] La frecuencia de linfocitos con Iqs do superficie varia segûn el érqano estudiado. Uno de los principales problemas de las primeras evaluaciones de las células con Igs de superficie, es que estos fueron hechos sin tener en cuenta el receptor Fc de la IgG que presentan ciertas subpoblaciones celulares dis tintas de la poblaciôn B y que por lo tanto pueden unir Igs citofilicas a traves de dichos receptores presentando fal sas Igs de superficie. Dos grupos de investigadores ( 38, 39), usando diferentes técnicas para prévenir este tipo de artefac tos han calculado el porcentaje de células con Igs de superf^ cie en sangre (8-10%), bazo (27%), ganglio (23%) y timo (<1%) humanos ( 34) . 1. 2.3.2. RGÇggtores gara el complemento. Uhr y col (40), describieron que complejos antîgeno- anticuerpo-complemento eran capaces de unirse a algunos pero no a todos los linfocitos de cobaya, a traves de receptores de r.embranas para diverses componentes del complemento. En humanos se ha detectado la presencia de un receptor para C3d, otro para C4b ( 41) y dos receptores independientes para dis­ tintas partes del C3b (42). Parece ser que al menos en ratén, existen células B sin receptores para el complemento; por el contrario en humanos, la mayoria de los linfocitos que tienen receptores para el complemento poseen Igs de superficie (43). 1 2 . I. 2. 3. 3. EË9î)§Dt9 ?!9_‘̂ 9_l§_î95_Ç_ï9^* La presencia del receptor para el Fc de la IgG en las células con Igs de superficie, ha sido motivo de discrepan­ cies entre distintos grupos de investigadores (44-46 ); hoy en dia se tiende a pensar que a diferencia con otras poblacio nés Fc positivas, los linfocitos B presentan este receptor, aunque precisarîan una alta concentracién de IgG sobre la su perficie del hematie para former las rosetas(47). Por otra parte, una mayor unanimidad de criterios pare ce existir entre los diversos autores respecto a la expresiôn del recientemente descrito receptor para el Fc de la IgM, en las células B humanas (45). 1.3 MACROFAGOS El macrôfago es el tercer tipo de célula que esté in- timamente asociada al desarrollo y expresiôn de la respuesta inmune. A diferencia de los linfocitos T y B, los macrôfagos no estan ni clonalmente restringidos ni son antigeno especi- ficos. Entre sus funciones estan, la captaciôn, metabolismo y presentaciôn antigênica a los linfocitos T y B, la regula- ciôn de la respuesta humoral y celular bien directamente o 13. bien por la liberaciôn de mediadores solubles, secrociôn de enzimas y factores del complemento, mecanismos de fagocitosis y pinocitosis asi como su funciôn activa en los procesos de la respuesta inflamatoria(48). 1.3.1. Mafcadores del macrofago. Los macrnfaoos tienen varias caracteristicas y marcado res de superficie que hace que su identificaciôn sea relative mente facil. Quizas la mas clasica de sus propiedades sea su capacidad fagocitica, con gran facilidad para ingerir una variedad de particules marcadores que pueden Per visualizadas luego al microscopio (particules de latex, de hierro..etc); otra caracteristica, es la capacidad de adherirse a la super­ ficie del plastico o cristal, el macrofago es una célula alta mente adhérente y cuando esta en cultivo puede observarse como emite pseudopodos que se adhieren a la superficie del frasco de cultivo. Ademas el macrôfago contiene gran cantidad de vacuolas (lo que tambien ayuda para su identificacion citolo- gica) en las que contiene gran cantidad de enzimas lisogenicos; lo que permite el uso de metodos histoquimicos para su ident^ ficaciôn. La mas empleada de estas técnicas es la de estera- sas, descrita originariamente por Yan y col.(49) y modificada luego por Koski y col. ( 50), que permite su identif icaciôn del resto de las poblaciones celulares 14, Por ûltimo, otro tipo de marcadores del macrofago se encuentran tambien sobre otras células linfoides con lo que no son exclusivos de esta estirpe celular y por lo tanto no utlllzables como marcadores de diferenciacién con otras pobla clones. Entre estos estan, la presencia de receptores Fc de la IgG y de receptores para diferentes componentes del comple mento, C3b, C4b y C3d (51,52). 1.3.2. El macrofago y su relaciôn con los linfocitos T y B . Los requerimientos de 1 os macrôfagos en el desarrollo de la respuesta humoral primaria frente a antigenos T depen- dientes esté claramente demostrada (53 )» mientras que frente a estos mlsmos antigenos pero en respuesta secundaria sus re- querlmientos son menores (54). Frente a los T-lndependientes, sin embargo no parece que los macrôfagos juegen un papel tan decisive en el desarrollo y produceiôn de anticuerpos, aunque esto debe ser todavia corroborado (55,56). Los macrôfagos tienen al menos dos funciones importan­ tes en el desarrollo de la respuesta humoral a antigenos T de- pendientes, uno, relacionado con la presentaciôn del antigeno a la correspondiente célula T o B de manera que la estimula- ciôn sea eficiente para que las células puedan coopérar y pro ducir anticuerpos, y otro relacionado con el mantenimiento de 15. la viabilidad. celular de las células en cultivo "in vitro”, donde parece que el macrofago juega tambien un papel impor­ tante. En la respuesta celular, esta estirpe celular tiene tambien un papel regulador de la respuesta, tanto en la hi­ persensibil idad de tipo retardado, como de otras formas de respuesta celular, taies como el cultivo mixto de linfoci­ tos o la proliferaciôn celular frente a antigenos y mitoge nos<57-59). El como es capaz de llevar a cabo esta serie de regu- laciones no esté por ahora totalmente definido, aunque se asocian con la propiedad del macrôfago de segregar mediado­ res solubles reguladores de la respuesta inmune. Hoy se sa be que sustancias producidas por los macrôfagos actuan en los procesos de activaciôn de los linfocitos T, bien directamente o a traves de modificaciones en la 1iberaciôn de nuevas sus­ tancias, linfoquinas, que dispararîan a estas células T(60). Por ûltimo, el macrôfago tiene tambien un importante papel en las reacciones de tipo inflamatorio y en la resis- tencia del organisme a la infeccion por determinados micro- organismos. En ambas, esta respuesta la lleva a cabo en re laciôn con los linfocitos o a traves de la liberaciôn de sus- 16, tancias vasoactivas, como ciertos factores del complemento, enzimas...etc, o incluso a traves de procesos citoliticos llevados a cabo por estas propias células faqocitiodes(61,62). 1.4. LINFOCITOS T 1.4.1. Caracteristicas y marcadores de superficie. El linfocito T constituye una poblaciôn heteroqénea de células inmunocompetentes que lleva a cabo una gran variedad de funciones inmunolôgicas. Los linfocitos T poseen una serie de estructuras anti génicas propias de esta poblaciôn, aunque en humanos no estan completamente definidas. En el ratén, hay varios sistemas antigênicos propios del linfocito T, taies como los antigenos TL, el sistema Ly 1, Ly 2, Ly 3 y Ly 5 o el MSLA (mouse speci fie lymphocyte antigen)(63,64,65,66 ). El primer paso de dife renciacién de la médula 6sea al timo en un sitema murino, lo constituye la adquisicién de los antigenos Thy 1 y TL. En el timo, los timocitos mas inmaduros poseen el antigeno TL, asi como una alta concentracién del antigeno Thy 1 y estan local^ zados en el area cortical del timo. Una posterior maduracién 17 . y di fi'rcjiciacién résulta en una pérdida del antigeno TL y un doscenso del antigeno Thy 1, mientras que el timocito emigra del Srea cortical al ârea medular del timo(67 ). Estas célu las del Srea medular, que presentan un incremento de los ant^ genos de histocompatibllidad H-2, representan entre el 5 al 10% del total de la poblacién tlmica y se cree que son los pro genitores inmediatos de los linfocitos T periféricos (68). En el hombre, aunque los sistemas no estân tan estudia^ dos, ha sido posible définir con el uso de heteroantisueros, y recientemente con el uso de antisueros monoclonales,algunos de los estados de diferenciacién intratîmicos. Los timoci­ tos humanos poseen un antigeno équivalente al TL, denominado HTL ( 69) y que se pierde cuando las cêlulas emigran al exte­ rior. Una vez aqul las cêlulas HTL negativas (HTL ) son ca paces de reaccionar con antisueros monoclonales(OKTl û 0KT3) y êstos, a su vez, reaccionan con el 10% de células timicas y se asocian a timocitos funcionalmente maduros y probablemente listos para su exportacién al exterior (7q -74). A pesar de todo el ûnico marcador, universalmente reco nocido, de linfocitos T humanos es la capacidad que tienen dichos linfocitos de formar rosetas con hematies de carnero(E). La presencia de dicho marcador sobre células derivadas del t^ mo, carece hasta hoy de un significado biolégico definido. IB. aunqu G nosotros, asi como otros autores, estudlando altera- ciones en la respuesta policlonal a mitéqenos y a la produc- ci6n de factores mitogénlcos (TCGF), pensamos que puede tener alqdn tipo de relaciôn con la posible activaciôn de los linfo citos T . (75-78) Este marcador, aunque presente en todas las poblaciones linfocitarias derivadas del timo, no parece que se encuentre con igual intensidad en toda la qama de linfocitos T. Den- tro de éstos, podemos encontrar linfocitos con alta afinidad para el hematie de carnero (SRBC), detectados por su capacidad de formar rosetas, incluso en malas condiciones de ensayo (29®C, y baja concentraciôn de FCS) o aquéllos que necesitan para for mar las rosetas condiciones de ensayo muy estrlctas, como baja temperatura (4*’C), alta relaciôn hematle-linfocito y alta con­ centraciôn de FCS y que serlan linfocitos con baja afinidad pa ra el hematie de carnero. (79) 1.4.2. Subpoblaciones de linfocitos T humanos. La presencia de receptores para el fragmento Fc de las Igs,ha permitido distinguir dentro de los linfocitos T distin tas subpoblaciones. Linfocitos T^., poseen receptores para el fragmento Fc de la IqM, y constituyen airededor de un 70% de la poblaciôn T. 19. Parece que comprende la mayoria de linfocitos T con alta afinidad para el SRBC y como veremos se asocian funcional­ mente a células con capacidad "ayudadora". También, parece que estân asociados a la presencia de un antlqeno que reac- ciona con el anticuerpo monoclonal 0KT4 (79-82) Linfocitos T^., con receptores para el fragmento Fc de la IgG, constituyen un 20% de la fracciôn T total. Pa- rece que la mayoria de ellos pertenecen a las células T de baja afinidad para el SRBC, lo que obliga para su purifica- cién a trabajar en condiciones épfeimas en la formacién de rosetas E. Estas células reaccionaban con el antisueromo­ noclonal OKMl, que habia sido definido como un antisueroant^ monocitos (83) . Estos resultados y el hecho de que estas cé­ lulas careciesen alqunas funciones propias de los linfocitos T, (taies como la respuesta a mitogenos) ha puesto en duda la existencia de esta poblaciôn como perteneciente a los linfo­ citos T, aunque nosotros pensamos que, mientra se siga con- siderando el roseteo E como un marcador de las poblaciones T humanas, esta poblaciôn, como tal, existe. (84) Recientemente se han descrito tambien otras poblaciones linfocitarias en funciôn de receptores para el Fc de la IgA o de la IgE (T^ y T^ ). Estas poblaciones no claramente défi- 26. nidas constituyen un bajo porcentaje de las células T tota­ les. Se estima que la poblaciôn constituye alrededor de un 5% de los linfocitos T circulantes; mientras que los reccg tores Fc IgE, ademas de encontrarse sobre células B, se encuen tran sobre linfocitos T, algunos de los cuales pueden también poseer al mismo tiempo el receptor Fc de la IgG. (85-88) 1.4.3. Heterogeneidad funcional de los linfocitos T . Los linfocitos T pueden clasificarse bajo un aspecto funcional en dos categorias, células reguladoras y células efectoras. 1.4 . 3.1. Linfocitos T reguladores. Bajo esta denominaciôn englobâmes a aquellas células que tras las interacciôn con el antigeno intervienen modulan do la capacidad efectora de los linfocitos T y/o B. Dentro de este gran grupo de células podemos distinguir, células que regulan positivamente la respuesta inmune y que se denominan "ayudadoras"(T^) y aquellas que lo hacen de una manera nega­ tive, suprimiendo o reduciendo dicha respuesta, son las cêlu­ las "supresoras"(Tg) (34). - Linfocitos ayudadores(T^): Este termino surgiô por la par- 21 ticipaciôn del linfocito T en la respuesta humoral a deter­ minados antigenos (los timo-dcpendientes) manifestandose co­ mo una facilitaciôn de la respuesta a anticuerpos, en term^ nos de magnitud, clase, tipo y afinidad de los mismos. Séria la cooperaciôn entre los linfocitos y B. Posteriormente, este concepto de linfocitos T^, se extendiô al papel que jue gan ciertos linfocitos en la generaciôn de células T efecto­ ras, taies como la generaciôn de células T citotoxicas ...etc, Séria esta una cooperaciôn con T efectores(89-92). Estos linfocitos comprenden una poblaciôn de linfo­ citos T, que esta bastante bien definida en el ratôn como cé­ lulas con fenotipo Thy 1^, Ly 1^, Ly 2,3 , y que comprende alrededor de un 30% de los linfocitos T periféricos. En hu­ manos, la mayoria de los autores (93,94) , coinciden al situar estos linfocitos como T^ y que reaccionan con un anticuerpo monoclonal 0KT4. Sin embargo, esta poblaciôn T^, no es ex clusivamente ayudadora, sino que contiene tambien células del tipo supresor, si se estimulan con Concanavalina A (94). - Linfocitos T supresores(Tg): definidos como aquellos lin­ focitos que, bajo determinadas circunstancias, son capaces de suprimir la respuesta inmune. Este tipo de respuesta nega­ tive fué observada primero en la produceiôn de Igs tanto en sistemas murinos como humanos, lo que impiica interacciones 22. entre células Tg y linfocitos B; aunque pronto aparecieron descripciones sobre la modificaciôn de la respuesta celular lo que indicaba interacciones Tg con células efectoras (95,96) Estos sistemas fueron, exageradamente usados, para explicar muchas patologîas relacionadas con el sistema inmune En ratones, donde el sistema esté mejor estudiado, la Scélula Tp se define,fenotîpicamente, como Thy 1^, Ly 1 , Ly 2,3^, aunque también han sido descrltos linfocitos con el fenotipo Ly 1^, Ly 2,3^, como linfocitos Tg no especlf_i COS. Ademâs, sobre las Tg han sido descritos antigenos codificados por el locus I-J de la regiôn I del H-2 (97,98). Por su parte en humanos, la poblaciôn supresora Tg se encuentra tanto en la fracciôn Tg como en la T^, aunque en esta dltima poblaciôn parece que se encuentran células Tg tras la estimulaciôn con la Concanavalina A (94). Todavia esta en duda si la fracciôn Tg necesita la interacciôn pre­ via, a través de su Fc(7S), para poder llevar a cabo la fun ciôn supresora.(93) 1.4. 3.2. LinfocitosT efectores. Comprenden aquellos linfocitos que llevan a cabo fun­ ciones taies como: la respuesta proliférât!va a aloantigenos. 23 respuesta citotôxica o respuesta de hipersensibilidad del t^ po retardado. Laa respuestas alogénicas proliferativas y citotôxicas pueden ser estudiadas "in vitro" en un cultivo mixto de linfocitos (MLR), lo que se relaciona "in vivo"con la fase de reconocimiento y rechazo de las reacciones de trans plantes y de injertos (99). - Cultivo mixto de linfocitos (MLR): el MLR fué, originaria mente, descrito en 1964 por Bach v col.(lOC) v Bain y col. (lOD , e impi ica el cultivo "in vitro" de linfocitos de dos individuos que sean antigénicamente diferentes. En la practica, células de un individuo (el respondedor) se incuban con células de otro individuo (el estimulador) que han sido previamente tratadas con Mitomicina C (103 o radiaciôn (103) para prévenir su prol^ feraciôn; de esta manera la respuesta es unidireccional (a d£ ferencia de la bidireccional en caso de que las células no fue ran tratadas). Comprende dos tipos de respuesta, una proli­ ferative , que es lo que se conoce como MLR, y otra de tipo c_i totôxica, denominada también 1 infocitotoxicidad mediada por cé lulas (CML)(99). La respuesta proliferative(MLR), comienza con el reco- nocimiento de la célula estimuladora por parte de las células respondedoras,las cuales comienzan a expandirse, siendo la 24. medida de este crecimicnto lo que constituye el MLR. Los antigenos que reconocen las células proliferativas son, prin cipalmente, los denominados LD ("lymphocyte determinant"), y estan codificados en el HLA o H-2 del MHC. Diferencias de- bidas a otros antigenos como los SD, pero no LD, llevan a una débil o nula respuesta proliferativa, mientras que iden- tidad en las regiones SD y diferencias LD, dan una fuerte respuesta ( 104 ). Esta respuesta se lleva a cabo por lin focitos T, con un fenotipo idéntico en ratôn a las células ayudadoras Ly 1^, Ly 2,3 , de tal manera que serlan células ayudadoras del désarroilo de las células citotôxicas Ly 1 , Ly 2,3^ ( responsables del otro tipo de respuesta del MLR, el CML). Por ûltimo, el nûmero de células respondiendo en un MLR a una determinada combinaciôn alogénica, oscila entre el 1 y el 12%, lo cual no deja de ser sorprendentemente alto comparado con el nûmero de células reactivas a un antigeno soluble ( 99). - Linfocitotoxicidad mediada por células (CML); La segunda reacciôn del MLR es la CML, que impi ica la apariciôn de cé­ lulas citotôxicas(CTL). Podemos définir los CTL como aque llos linfocitos que tienen la capacidad de matar a otras cé lulas a través de un mecanismo lltico hasta hoy desconocido. La primera fase de esta funciôn citotôxica consiste en una aproximaciôn de la célula efectora citotôxica a la célula 25. dJ'ana que, incluye el reconoc imiento y uniôn de las mismas (i05) . Parece que es en este primer paso donde reside la especifici dad del ataque de la cêlula efectora. Una segunda fase con­ siste en la destrucciôn de la célula diana por un mecanismo inespecîfico y' todavia desconocido. Los linfocitos T citotôxicos son especificos, es decir, matan especificamente a las células diana contra las cuales hayan sido sensibilizados ( 106). La especificidad de esta reacciôn es mediada por receptores de superficie sobre la cé lula efectora CTL. Estos linfocitos aparecen "in vitro" en el MLR frente a antigenos SD, y de nuevo, combinaciones de cé lulas con idéntico SD, pero diferente LD, no originan células CTL (107) . La respuesta CML, con una cinética de apariciôn s^ milar a la del MLR, se lleva también a cabo por células T, aun que fenotipicamente diferentes a las responsables del MLR( En ratôn, las CTL son Ly 1 , Ly 2,3^, la ( el antigeno la dî ferencia fenotipicamente a las células citotôxicas de las su- presoras, la^), mientras que en humanos se asocian con aque lias poblaciones con receptores Fc(7S) o aquellas que reaccio nan con los antisueros monoclonales OKTl^, 0KT3^, y 0KT4 ,aun­ que esto debe confirmarse en posteriores estudios(107,74). Por ûltimo, hay que mencionar un fenômeno relacionado con la actividad citotôxica CTL, conocido como "restricciôn 26. H-2", y que fué descubierto por Zinkernagel y Doherty (408). Este fenômeno consiste en que cuando activamos CTL en un MI,R frente a células haptenizadas o pretratadas con virus, estas CTL solo son activas cuando la célula efectora y la célula diana presentan el mismo H-2 (la célula diana debe presenter siempre el hapteno o el virus contra el cual se haya sensib^ lizado). Esta homologla entre la célula efectora y diana debe residir en la regiôn SD del H-2. Este fenômeno ha plan teado la necesidad de un doble reconocimiento antigênico del linfocito T efector para llevar a cabo su funciôn citotôxica, uno a traves del MHC y otro que reconoceria al antigeno (ha£ teno, virus...etc.) asegurando as! la restricciôn slngénica en la estimulaciôn de las células T. (68,109,110) - Hipersensibilidad de tipo retardada (DTH): Es una forma de una respuesta inmune mediada por células T. Si a un indivi­ duo que esté sensibilizado a un agente infeccioso se le inyec ta una pequena cantidad de antigeno en la piel, las células de la memoria sensibilizadas se acumulan y atraen a otras células al lugar donde el antigeno ha sido inyectado, originando la a- pariciôn de una pSpula visible a las 48 horas (de ahl el término retardada). Esta respuesta senleva a cabo por linfocitos T (DTH), capaces de segregar mediadores activos que causan una acumulaciôn de células mononucleares y basôfilos, y un aumen- to de la permeabilidad vascular (111,112). 27. 1.5. LINFOCITOS "NULL" También llamados por algunos autores "tercera poblaciôn celular"(TRC) (II3 , se definen por la imposibilidad de atribuir a una célula determinada, alguno de los receptores de superfi cie o capadidad funcional tîpica de los linfocitos T, B, o mo nocitos. Se trata de una célula con morfologîa de linfocito, pero que carece de la capacidad de formar rosetas con SRBC(co mo el linfocito T), carece de Igs de superficie (como los lin focitos B), y no tiene la capacidad de fagocitar el latex o de tenirse con tinciôn de esterasa (como el macrofago). Estas células, por el contrario, expresan receptores para el fragmento Fc de la IgG. Morfolôgicamente, con tin­ ciôn de Giemsa, tienen en el citoplasma granules azurofilos que recuerdan y se parecen a algunos linfocitos Tg. De hecho, Ferrarini y col. (114) han descrito una gran correlaciôn entre las células "null" y Tg) una de las principales diferencias entre ambas poblaciones celulares, es que las "null" no for­ man rosetas con SRBC, aunque estas diferencias son minimas al considerar que las Tg solo forman rosetas de baja afinidad y que se ha descrito por algunos autores (115,IIQ , que las "null" pueden formar, bajo ciertas condiciones, (taies como tiempos largos de incubaciôn, tratamiento de los hematies con neura- minidasa) rosetas con SRBC. 28. 1.6. CITOTOXICIDAD CELULAR DEPENDIENTE DE ANTICUERPO O DE LECTTNAS. Otros tlpos de actividades citotdxicas, independlen­ tes de la que aparece en un CML por células CTL, son aquella£ cuya naturaleza, espec1fieidad y correiaciôn "in vivo" no es tSn totalmente definidas. Comprenden cëlulas citotdxicas que no requieren previa inmunizaciôn y que realizan sus funciones citotôxicas reconociendo, bien directamente ciertas estructu ras sobre la célula diana, como en el caso de la "citotoxic^ dad espontanea", o bien indirectamente a traves de una molë- cula-puente entre la cëlula efectora citotoxica y su célula diana. Es el caso de la "citotOxicidad celular dependiente de anticuerpo"(ADCC) y de la "citotoxicidad celular mediada por lectinas" (LICC) .(117) - Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, ADCC., En este tipo de reacciones la célula efectora, conocida como cé lula K, es capaz de matar a cëlulas dianas que esten recubier tas de anticuerpo(79 ,118,119,120). La cëlula K, tiene re- ceptores para el fragmente Fc de la IgG a traves de los cua- les se une a la cëlula diana recubierta de IgG. Si estes receptores ban sido bloqueados a travës de inmunocomplejos, hay una total inhibiciôn de la actividad citotôxica, le que hace que el ADCC sea una de las funciones mejor conocidas 29. on que se reciuiera la presencia de cëlulas con receptorea Fc(7S) intactes(i21). La especificidad en la ADCC viene dada por el anticuerpo y no por la célula efectora; es decir, es la inién del anticuerpo IgG sobre la célula diana le que da la especificidad, luego la célul^ K reconoce y mata ine£ pecificamente a toda célula diana recubierta de IgG ’(122). - Citotoxicidad celular inducida por lectinas, LICC., Es un tipo de actividad citotôxica que tampoco necesita inmun^ zaciôn previa y que se pone de manifiesto al enfrentar, en presencia de alqunas lectinas, linfocitos con células diana ( 123,124, 125). No todas las lectinas poseen la capacidad de inducir este tipo de actividad citotôxica,lo que induce a pensar que estas lectinas no actua solamente como una mo- lécula puente sino que originan algûn tipo de activaciôn celular necesaria para llevar a cabo esta citotoxicidad LICC. ( 126). Esta citotoxicidad es llevada a cabo, en humanos, por distintas subpoblaciones celulares algunas de las cuales pue den incluir a células efectoras citotôxicas de otros tipos de citotoxicidad, como la ADCC , la citotoxicidad espontanea (NK), o a las CTL(?). También se sabe que,en humanos, in- cluye a macrôfagos y polimorfonucleares cuando se usa como célula diana una célula anucleada (como las eritroides) y a linfocitos T si la célula diana es nucleada (como las tumo­ rales) (127-130), JO. 1.7. CITOTOXICIDAD ESPONTANEA También denominada citotoxicidad "natural" o NK. Se encuentra entre aquellas actividades citotoxicas cuya es pecificidad no esté totalmente definida. Se puede définir como aquella actividad citotôxica que presentan linfocitos de individuos sanos, no sensibilizados, cuando se enfrentan en un sistema "in vitro" frente a ciertas células diana (ver revision 131,132). Los estudios sobre la actividad citotôxica esponta­ nea surqieron cuando alqunos autores trabajando con células CTL observaron una alta actividad citotoxica de los linfo­ citos de los individuos sanos,usados como contrôles, frente a dichas células tumorales (133) . Comprobaron que esta act^ vidad era constante en la mayoria de los individuos y que po seia unas caracteristicas propias y diferentes de la citotô- xicidad especifica. Al mismo tiempo, similares observacio nes fueron detectadas en sistemas murinos, lo que confirmaba la existencia de un tipo de citotoxicidad especial que fué denominada "espontânea". 1.7.1. Caracteristicas de la célula efectora NK. Uno de los principales puntos sobre los que se han enfocado los estudios de la actividad citotôxica NK, ha sido 31 . fujbro g 1 tipo de célula que media dicha actividad. Seqûn distintos autores, la célula efectora NK ha sido relacionada con varios tipos celulares que incluyen a linfocitos T, B, "null" o células del tipo macrofago ( 134,135,115,136 ). Lo cierto, es que la célula efectora NK, tanto en sistemas murinos como humanos, carece de un marcador de membrana es- pecifico claramente reconocido. Muchos de los trabajos tratan de correlacionar a es­ tas células con los linfocitos T. En sistemas murinos, el problems comenzô con la evidencia clara de que tanto en rato nes timectomizados como en ratones atimicos "nude", existe e£ ta actividad citotôxica mientras que estos ratones carecen de linfocitos T tipicos( 137 ). Sin embargo, tras estos pri- meros datos, Herberman y col. (138) demostraron que usando a)̂ tas concentraciones de antisueros anti-T, un anti Thy 1, en presencia de complemento, era capaz de eliminar dicha activ£ dad citotôxica NK. Asi, parece que las células NK de ratôn, l.ienen baja densidad del antîgeno Thy 1, y la presencia de cé lulas con baja densidad para Thy 1, ha sido también descrita en ratones atimicos (137), las cuales parece que estSn rela- cionadas con células pre-timicas. Por su parte, y también en sistemas murinos, ha sido descrito sobre las células NK el antîgeno Ly 5, propio de las células T y timocitos, pero au- sente de las células B ( 139) . Es mas. Cantor y col. (140), pien 32, san que este antîgeno Ly 5 contribuye, de alguna manera a la propia funciôn initiunologica de estas células. En humanos, algunos autores piensan que todas las cé lulas NK tienen receptores para el SRBC, aunque de baja afi- nldad (14]) . Reclentemente, y conf irma ndo estos datos, Kaplan y Callewart (14 2), demostraron que tratamiento con antisueros anti-T mas complemento, eliminaban virtualmente toda la acti­ vidad citotôxica NK. El uso de aloantisueros anti-T, ha sido también usado por Herberman y col.(138) con identicos resul- tados; sin embargo, todos estos datos deben tomarse con cui- dado, estos aloantisueros estén,por lo general, poco defini- dos y en diferentes laboratories y con el uso de diferentes sueros como fuente de complemento, los resultados no son to­ talmente superponibles. Por otro lado, recientemente, y al contrario de lo que ocurre con los aloantisueros, el uso de antisueros monoclonales contra linfocitos T, como el OKTl 6 el 0KT3,no afectan a la actividad NK, mientras que el OKMl, que eslS dirigido contra macrôfagos, élimina dicha actividad citotôxica ( para otros autores (143), el OKMl, no va dirigi­ do contra macrôfagos, sino contra estructuras del receptor Fc(7S), con lo que al llevar estas células dicho marcador se eliminarîa)(82,83). Todos estos datos tienden a asociar a .las células NK con los linfocitos T. 33 . En lo que si parecen estar de acuerdo la mayoria de los autores es en la ausencia de Igs de superficie sobre las células NK( 144-146 ), ya que tratamientos con anti-inmuno qlobulinas no afectan a la actividad citotôxica. Sin emba£ go, hay trabajos esporâdicos que muestran a las células NK con Igs de superficie (147), aunque estos deben tomarse con cautela, ya que pequenas cantidades de Igs citofilicas unidas a través de los Fc, sobre las células NK pueden dar lugar a artefactos. Tampoco parece que la célula efectora sea del tipo adhérente, aunque aqui, una vez mas, hay que considerar el tipo de célula diana que se esté usando, ya que Nelson y col. (148 ), han descrito, usando células anucleadas como diana, como el macrôfago puede mediar este tipo de actividad citotô xica. Pero incluso usando células diana tumorales no adhe rentes, la célula del tipo fagocitoide no esté totalmente descartada. En humanos, ya mencionamos como un antisuero monoclonal, el OKMl, que mata en presencia de complemento a macrôfatios, es capaz de eliminar dicha actividad citotôxica. Otro problema es définir correctamentea la célula "null", que para muchos autores es considerada como responsable de dicha citotoxicidad espontânea. Esta célula no-T, no-B, pue de tener cierto tipo de analogies con el macrofago, con lo que de nuevo se vuelve a relacionar al macrofago con las NK. (ver revisiôn 114). 3 4 . Uno de los marcadores que parece ser mas caracteris tico de las células NK, en todas las especies estudiadas, es la presencia del receptor Fc de la IqG (131,141, 149- 151 ). Este marcador es mas dificil de detectar en sistemas murinos, lo que puede significar una baja afinidad del receptor por el Fc. En humanos, donde el ’marcador es mas facilmente detecta ble, se asocia, generalmente, a todas las células efectoras NK, aunque algunos autores consideran que solo lo lleva una fraccion de las mismas (152). En general, eliminando las células con receptores Fc(75), se élimina la actividad NK (153 ). Otro marcador a considerar es el receptor para el complemento. Mientras que algunos autores no han encontrado este receptor sobre las células NK(144,145,154,155), otros lo consideran como un marcador caracterfstico de estas células (151»156). Sin embargo, en humanos, hoy este marcador esté mas asociado a células con Igs de superficie y no a cé­ lulas citotoxicas (43 ). Por éltimo, hay una serie de laboratories que han in tentado buscar la presencia de una estructura antigénica ca- racterfstica y propia de las células NK. Hasta ahora, y so lo es sistemas murinos, se han descrito dos sistemas que re- conocen especificamente a estas células efectoras. Glimcher 35. y col.(157) usando un aloantisuero antitimocito, vi6 que este rcaccionaba especificamente con células NK, y fué lia mado anti-NK-1. Este antisuero que en presencia de Comple mento mataba a células NK, fué probado en diferentes labora­ tories con diferentes resultados; aunque si mataba a cierto tipo de células, la reduccion de la actividad citotôxica NK nunca era total (132 ). Por otro lado, recientemente, di­ verses autores han encontrado un glicoesfinqolipido asocia­ do a la membrana de las células NK, es cl denôminado "asialo GMl". El tratamiento con un antisuero anti-asialo GMl, era capaz de eliminar totalmente la actividad citotôxica NK( 158,159) Para finalizar la caracterizaciôn de la célula efec­ tora NK, hay que mencionar algunos aspectos sobre la morfo- logia de esta célula. Saskela y col.(160) usando una tin- ciôn clasica de Giemsa, conprcÆaron que las células que se uni an a las diana K562 (célula diana sensible a NK),presentaban una morfologia constante y particular, se trataba de linfocitos grandes que presentaban un nucleo con aspecto arrihonado, en cuya oquedad se observaban granules azurôfilos densos (161). Estas células denominadas LGL ("large granular lymphocyte") parece que son las responsables, al menos en parte, de la ac tividad citotôxica espontânea (162). 36. 1.7.2. Especificidad de las células NK. Ha sido siempre objeto de controvorsias, y actual- mente se tiende a pensar en células con un amplio margen de especificidades. Se comprobô que la actividad citoté- xica espontanea no posee ningün tipo de restriccién a través’ de antigenos de histocompatibilidad y que no hay barrera es pecie especifica; es decir, células efectoras del ratôn son efectivas frante a células humanas como diana (163,164). Esta actividad NK no esté tampoco restringida frente a célu las tufnorales, asî, células normales como fibroblastos, ma­ crof agos.. etc. , pueden ser susceptibles de ser lisadas por NK (165) . Con el fin de encontrar contra que tipo de estructu ras iban dirigidas las células NK, se tratô de localizar un antigeno comun sobre todas las células diana sensibles a NK. La presencia de proteinas asociadas al virus C fué considéra da en un principio aunque pronto quedô descartado. Recien­ temente, Hatzteld y col.(166 ), han detectado la presencia de una glicoproteina, la gp70, sobre dichas células diana; es mas células gp70 negativas no eran susceptibles de ser lisadas, mientras que tras la aparicion de esta glicoproteina, la cé­ lula diana adquiere la susceptibilidad de ser lisada por las células N K . 37, 1.7.3. Factores que afectan a la actividad citotoxica NK. La actividad citotôxica espontânea puede ser aumcn- tada o disminuida por el tratamiento con determinadas sustan cias, tanto en sistemas murinos como humanos. Entre los sistemas que reducen la actividad NK, se encuentra el tratamiento de las células efectoras con cier­ tas drogas como la ciclofosfamida y la hidrocortisona (167,168). Inhibidores de la sfntesis de proteinas como la emetina, que no alteran la ctividad NK, si son capaces de inhibir su po- sible aumento-por posteriores tratamientos con sustancias aumentadoras (como la poli I:C). En ratones y ratas, la actividad citotôxica es moderadamente sensible a la acciôn de los rayos X, aunque altas dosis originan un apreciable des censo de dicha actividad (168). Por su parte, hay muchos estudios sobre sistemas que aumentan la actividad NK. Lo primero a destacar es el com- nente genético ligado a dicha actividad NK; hay cepas de ra­ tones que poseen alta actividad citotôxica mientras que hay cepas de baja actividad (169 ), es mas, combinaciones de ce­ pas de baja actividad NK resultan individuos que tienen niveles normales de actividad, lo que nos indica que los ge nes que codifican dicha actividad son de caracter recesivo (170 ). En humanos, donde los sistemas estân peor estudia- 38 dos, se observa un amplio rango de actividades entre indivi­ duos normales, lo que se puede asociar de nuevo a un compo- nente genético.(171) Otra cuestiôn a considerar, es el diferente grado de actividad en funciôn de la edad del individuo. En ratones, la actividad es maxima entre la 5 y 8 sémanas de edad, sien- baja la actividad en ratones de mSs de 12 semanas(131). El tratamiento de ratones con virus o adyuvantes in- munologicos como el BCG {"Bacillus-Calmette-Guerin) o el"Co- rynebacterium parvum" causan un rapido incremento de la ac­ tividad NK (172-174). Cuando es estudiô que este mis­ mo incremento ocurrla también tras la inoculaciôn con "poli I:C", un fuerte inductor del interferôn (INF), se comenzô a considerar al propio I como causante directe del aumento en la actividad citotôxica (175) . Se descubriô, como tras la inoculaciôn "in vivo", en sistemas murinos, de IHF, este era capaz de inducit un fuerte aumento de la actividad citotôxica NK; este efector era anulado tras la inyecciôn de un antisue ro anti-INF, lo que demostraba un efecto directe del INF sobre dicha actividad NK. Ultimamente, ensayos también "in vivo", han demostrade como,tanto en ratones normales como atimicos, hay un aumento de los niveles de INF en la sangre de los ra- 39. tones cuando cstos son inoculados, tanto con células tumo­ rales como con ciertos virus, lo que parece indicar que el INF pmede jugar un papel importante "in vivo" en el desarro 1lo de la actividad citotôxica espontânea (176,177,178,179). Por ûltimo, un similar aumento de la actividad NK, fué obser vado en ensayos "in vitro" cuando los linfocitos eran prein- cubados con INF (180-182). I.7.3.1 El Interferon Fué en 1957 cuando Issacs y Lindeman (183) definierôn a una sustancia, el interferôn, como capaz de conferir pro- tecciôn a membranas en cultivo, del ataque de ciertos virus; asi, el I fué definido como una sustancia antiviral. Pos­ teriores estudios, comprobaron que existian una familia de interferones y que todos eran glicoproteinas(184). Estos tipos pueden ser clasificados en base a sus diferentes espe cificidades antigenicas, tipos designados como Il4F-a(alfa) ; INF -6 (beta) e INF-y(ganma), y que correspondian a la desig- naciôn previa de INF de leucocitos (Le); INF de fibroblastos (F)(estos dos tipos a su vez clasificados como INF tipo I 6 "clasico") e INF tipo II 6 inmune, respectivamente(l85)• Los INF-a yp son usualmente acido-estables, a diferencia del INF-y que es acido-labil(se destruye a pH 2)(184 ). 40. Los estudios sobre el INF han sido enfocados en una doble vertiente, por un lado los estudios sobre su aislamien to, purlficaciôn y genetica, y por otro lado su papel e impor tancia biolôgica. Con respecto al primer punto, recientemen te, el uso de antisueros monoclonales ha permitido la purify caciôn de grandes cantidades de INF, y a su vez su empleô y secuenciaciôn; ademas, estudios usando ingenieria genética han permitido la localizaciôn de una gran variedad de genes que co difican el INF ( 185,186), aIguno de los cuales han sido clonados^ construyendo cepas de bacterias que conteniendo estos genes, pueden producir INF (187) activo biolôgicamente ( 188).. Por otro lado, el papel biolôgico del INF ha sido tre mendamente impulsado, no solo por su importante misiôn anti­ viral, sino por los recientes estudios que otorgan al INF un importante papel anti-tumoral(l89). En su relaciôn con el sistema inmune, el INF présenta dos facetas opuestas; a) una actividad inmunosupresora, tanto en la producciôn de anticuerpos ( ya sean para antigenos timo dependientes como timo independientes) como en la inhibiciôn de la respuesta a mitôgenos tanto de T como de B, y b) una actividad aumentado ra de todo tipo de actividades citotôxicas, tanto especificas (CTL), como NK ô ADCC.(190) 41 1.7.4. Papel biolôgico de las células NK. Uno de los principales papeles que se atribuyen a las células NK es la de ser la célula responsable de lia "vigilan- cia initiunologica". Este término acunado por Erlich (191) , in£ cialmente, y ampliado por Burnet (19^, suguiere la idea de un control interno sobre las células que pueden alterarse espon- taneamente y transformarse en células neoplâsicas. Siempre, segûn la hipôtesis, ciertas células circulantes destruirîan a aquellas otras que se transformasen en células de tipo tu­ moral, mientras que los tumores aparecerîan cuando las célu las origen de los mismos escapasen de esta vigilancia inmuno- lôgica. Pronto se atribuyo a los linfocitos T la capacidad de llevar a cabo este fenomeno, aunque el hecho de que los ratones atimicos ("nude") no tuvieran una mayor incidencia en desarrollar tumores espontâneos parecîa que eliminaba esta po- sibilidad. Sin embargo, con los estudios sobre citotôxici- dad espontanea, en los que los ratones atimicos presentaban esta actividad NK, surge la idea de la célula NK como respon­ sable de este fenômeno. Estudios en los que hibridos de ratones déficientes en células T, pero con alta actividad NK, resisten el crecimiento de tumores transplantados, mejor que aquellos con baja actividad NK, favorece esta hipôtesis. A- demSs, en estudios con ratones déficientes en actividad NK, los ratones "beige", se comprobô un aumento en la velocidad 42 de crecimiento, una inducciôn mas râpida y un mayor aumento en las metastasis de tumores sôlidos transplantados, asi co mo una mas baja resistencia a leucemias inducidas transplan- tadas en estos ratones comparados frente a ratones control. Todos estos experimentos suguieren un importante papel de las células NK en el control y desarrollo de ciertos sistemas tu­ morales. (193-197) Estos ratones "beige", que tienen una mutaciôn en cl cromosoma 13, con una baja o nula actividad NK, tienen su e- quivalente huma no en el sindrome de "Chédia)c -Higaéhi" . Pa- cientes con este tipo de desôrdenes presentan también una ba­ ja actividad citotôxica NK y ADCC (198-200) y suelen cursar con ciertos desôrdenes proliferativos que pueden ser malignos(200) lo que de nuevo relaciona, en humanos, la deficiencia de las células NK con una mayor incidencia en enfermedades tumorales malignas. POr 01timo, mencionar el papel del INF como agente anti-tumoral y su relaciôn con las células NK. El INF que, en si mismo, es un potente citostético, ejerce, como vimos, ciertas acciones sobre el S.I. y principalmente sobre la NK; no solo activandolas, sino alterando y aumentando el rango de especificidades frente a un mayor numéro de células tumorales lo que permite una mayor defensa contra los sistemas tumorales •n, II. MATERIALES Y REACTIVOS II.1. MATERIAL PARA CULTIVOS CELULARES - Plaças esteriles de cultivo de 9^ pocillos fondo U - Frascos esteriles de cultivo de 25 cm^. 2- Frascos esteriles de cultivo de 250 cm . - Plaças de Petri 10 x 35 mm. pertenecientes indistintamente a las siguientes casas : * Falcon Oxnard, Ca. USA. * Sterilin. Teddington, Inglaterra. * Nunc. Dinamarca. * Costar. Cambridge, Ma. USA. * Greiner. Soria-Greiner. Madrid. Espana. - Colector de sobrenadantes de cultivo. SKATRON AS. Flow. Flow Lab. Lierbyen. Noruega. - Colector de sobrenadantes. TITERTEK. Flow Lab. Irvine. USA. - Camara de flujo laminar. Telstar SA. Tarrasa. Espana. - Estufa de cultivo de CO^. Forma Scientific. Marietta. USA. - Contador Ganma 4000. Beckman Ins. Inc. Irvine. Ca. USA 44 . II.2. REACTIVOS - Medio RPMI 1640. Microbiological Associates. Md. USA. - L-Glutamina. Flow Lab., Irvine. USA. - Penicilina-Estreptomicina. Difco Lab. Detroit. Mi. USA. - Medio MEM Autopow. Flow Lab. Irvine. USA. - Suero Bovino fetal. Gibco. Grand Island. NY. USA. - Lymphoprep. Ficoll-Hypaque. d.l077. Nyegaard&Co. Oslo. Noruega - HEPES IM. Flow Lab. Irvine. USA. - Fitohemaglutinina. Difco Lab. Detroit, Mi. USA. - Poli-L-lisina. No. Cat. 1886. Sigma. St. Louis. Mo. USA. - Percoll. T.M. Pharmacia Fine Chemicals. Uppsala. Suecia. - Antisueros antiinmunoglobulinas totales fluoresceinados. Operon. Zaragoza. Espana. - Antisueros antihematîes bovinos IgG. Cappel Lab. Inc. Cochranville. Pa. USA. - Antisueros antihematîes bovinos IgM Cappel Lab Inc. Cochranville. Pa. USA. - AET . Sigma . St. Louis. Mo. USA. - Cromato sodico. ^^Cr. Amerhsam. Inglaterra. - Hanks medio. Difco Lab. Detroit. Mi. USA. - Medio TC 199. Difco Lab. Detroit. Mi. USA. - Bactolatex. Difco Lab. Detroit. Mi. USA. lloparina. Laboratorio Leo. Madrid. Espana. Giemsa. Merck Lab. Darmstadt. Alemania. Solucion de Pararosanilina. Sigma . No. 3750. St.Louis. USA. Soluciôn de -naftil butirato. Sigma. St. Louis. Mo. USA. Dimetil Formamida. Merck. Darstadt. Alemania. V rde Metilo. Fisher. No. 76110. USA. Azul Tripan. Fluka. AG. Chemische Fabrick, CH-9470. Buchs.SG. 4€. 11.3. PREPARACION DE LOS MEDICS DE CULTIVO En el presente trabajo se han utllizado los siguientes me dios de cultivo: 1) RPMI 1640, suplementado con distintas concentraciones de suero bovino fetal (FCS), glutamina 2mM, HEPES lOmM, 100 U.I. de penicilina y 100 yg/ml de estreptomicina. Al medio asi pre- parade lo denominaremos "RPMI completo". 2) MEM autopow., esterilizado en autoclave al que se le anadiô glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U.I. de penicilina y 100 vg/ml de estreptomicina. Segun los diferentes sistemas em- pleados, diferentes concentraciones de FCS fueron empleadas. Al medio asi preparado se denominô MEM-FCS. 11.4. LINEAS TUMORALES Las diferentes lineas tumorales usadas en este trabajo (% bla 1 ) fueron mantenidas, in vitro por pases sucesivos con medio de cultivo RPMI completo con el 10% de FCS, en frascos de cultivo de plastico y mantenidos en estufa a 37®C con el 5% de CO2 . La linea P815, mastocitoma de DBA/2, fué mantenida en forma ascitica por pases semanales de 1x10 ̂ células en la cavidad peri­ toneal de ratones singenicos DBA/2. La linea de rata (C58NT)D, leucemia inducida por el virus Gross, fué donada generosamente por TABLA 1 LINEAS TUMORALES EMPLEADAS 4 7 NOMBRE MANTENIDAS EN; SENSIBILIDAD NK ORIGEN K562 "in vitro" + + + + Leucemia Mieloide E-14 "in vitro" + + + CHANG " in vitro"{*) + Cel. Hepatica HSB " in vitro" + Carcinoma de vejiga ALAB "in vitro"(:*) + Cancer de mama G-11 " in vitro"{*) + Ccincer de mama MOLT-4 "in vitro" + + + Leucemia LLA.Tipo T T-24 "in vitro"(:*) + Carcinoma de vejiga P815 "in vivo"(DBA/2) Mastocitoma de ratôn (*) Lineas tumorales adhérentes al plastico, 48. el Dr R. B. Herberman y mantenida en forma ascitica en ratas Wis- tar/Furth. Las celulas eran recogidas, bien del frasco de cultivo, bien de la cavidad peritoneal con suero salino, lavadas dos veces con MEM y transferidas de nuevo a un frasco de cultivo para mantener su creceimiento 6 usadas en el ensayo como celulas diana. Cuando las celulas crecian adhérentes al plastico, han de ser tratadas con una soluciôn de tripsina. El metodo en sinte- sis es el siguiente; Se quita el medio de cultivo del frasco, se lava con 2 ml de una soluciôn al 0.25% de tripsina en 0.01 M de citrato, dejandose por espacio de 1 a 2 min. en estufa a 37®C,tras lo cual se agita la botella de forma que se vayan desprendiendo las celulas. Se anade 2 ml de FCS, con el fin de neutralizar la acciôn digestiva de la tripsina y todo se pasa a un tubo. Tras dos lavados con medio MEM-FCS a 1000 rpm se resuspenden en RPMI comple to con el 10% de FCS. II.5. ANIMALES USADOS Se utilizaron ratones de la cepa congenica DBA/2 de 8-16 semanas, que fueron obtenidos de Charles River Breeding Lab. Mo.. Ratas singenicas Wistar/Furth fueron obtenidas de Microbiological Associates Md. USA. 49. 11. 6 . PREPARACION DE I .AS CELULAS L INFO IDES Se obtuvieron a partir de los siguientes organos linfoides: Bazo, amigdala, timo y sangre periferica. Celulas del timo fueron obtenidas de pacientes jovenes ope rados a corazon abierto. Las amigdalas fueron obtenidas en pacien­ tes jovenes tras amigdalotomia. En estos casos fueron siempre re- chazadas aquellas amigdalas de aspecto muy inflamado 6 purulentes. En estos casos, las celulas se dispersan en suero salino, descartan dose el sedimento depositado a Ix g durante 5 min.. La suspensiôn celular asi obtenida, se lav6 tres veces con suero salino a 4“C y se resuspendieron finalmente en el medio de cultivo apropiado. Linfocitos de sangre periferica (PBL), fueron obtenidos siguiendo el metodo de Boyum y col(201)de sangre heparinizada de donantes voluntarios sanos. Treinta mililitros de sangre diluida con igual volumen de suero salino fué puesta en tubos Falcon-50 ml lentamente sobre 10 ml de Lymphoprep (Ficoll-Hypaque) y centrifu- gada a 1700 rpm furante 40 min. En el tubo queda, al finalizar la centrifugaciôn, una interfase celular conteniendo principalmente los linfocitos y un sedimento donde se depositan los hematies. La interfase celular se lava dos veces con MEM y se resuspenden en el medio de cultivo. Un 90-95% de las celulas eran viables (por tin- ci6n con un colorante vital, Azul Tripan) y consistia en 80-90% de 50 MARCADORHS DE SUPERFICIE DE CELULAS DE SANGRE m B "null” m 101 81 51 65-75 % Esterasa IgsS Receptores para SRBC Fc(7S) Figura 2 51 . linfocitos, 10-15% de monocitos-macrofagos y un 1-2% de celulas 1 irnorfonuclcares . Las celulas del bazo fueron obtenidas tras su dispersion en medio de cultivo, pasadas a traves dd un gradiente de Ficoll y siguiendo luego el mismo metodo que el empleado para los linfocitos de sangre periferica. II.7. ELIMINACION PARCIAL DE CELULAS ADHERENTES Pertenecen principalmente a las celulas del tipo monocito- macrofago y algo, pero menos, a las celulas linfoides B. II.7.1. Por pase a traves de columnas de nylon. Segun el metodo de Berke y col(202). Seiscientos miligramos de fibre de Nylon (Leukopack) pretratado con una soluciôn 1 N de CLH, fué lavada repetfdamente con un tampon fosfato (PBS) hasta recuperar el pH 7.3. Luego incorporada a una jeringa de 15x50 mm, e incuba- da a 37®C durante 30 min.. 20-25x10® linfocitos fueron anadidos a la jeriga conteniendo el Nylon caliente e incubada por 1 h. a 37®C, Las celulas no-adherentes fueron eluidas con exceso de medio y la­ vadas dos veces. La recuperacién celular era aproximadamente de un 50%. 52 11 .7.2 Tratamiento con polvos de hicrro. 1 mg/ml de polvo de hierro, fuë anadido a la sangre total heparinizada, e incubada por media hora a 37"C. Luego la sangre es diluida y pasada por el Ficoll siguiendo el mismo sistema que para la sangre Ain tratar. Las células que hubiesen captado las particules de hierro, asî como el hierro en suspensiôn, irân al sedimento con los hematîes, mientras que en la interfase quedaran aquellas células que no hayan fagocitado el polvo de hierro. Como control, se puede pasar ttn potente iman sobre la soluciôn celular con el fin de eliminar las posibles partîculas que se hayan podido recoger con la interfase. Ambos mêtodos, el pase a través de columnas de nylon ô el tratamiento con polvo de hierro, eliminan en mayor o menor grado células adherenteg, aunque en ningûn caso la eliminaciôn es total, encontrando una contaminaciôn de células con tinciôn de esterasas entre un 2-3% tras el empleo de cualquiera de estas têcnicas. 11.8. MARCADORES DE SUPERFICIE DE LAS DISTINTAS POBLACIONES LIN- FOC I TARI AS. II.8.1. Detecciôn de células con receptores para e 1 hematie de ceumero En 1972. Jondal y col(203) describieron la capacidad que 53. tionen los linfocitos humanos de formar rosetas de una mane- ra Gspontânea con hematles de carnero (SRBC o E); esta pro- pi edad ha permitido identificar a la poblaci6n linfocltaria procesada por el timo. Noso^ros hemos generalmente empleado la uniôn direc ta, sin ningûn tipo de tratamiento, de los linfocitos con los hematles E, usando una alta proporcidn de FCS, 40%, y una re- laciôn de 100:1 de eritrocitos-linfocitos. Linfocitos mSs eritrocitos se centrifugan y el sedimento se mantiene a 4 ° C durante una hora; luego se resuspenden con mucho cuidado y se calcula el porcentaje de linfocitos rodeados de hematles (roseta) por contaje de al menos 200 linfocitos en una cSma- ra de contaje Neubauer. Se consideran rosetas, linfocitos con mâs de très hematles. Para una mejor lectura a la hora de con tar las rosetas, se le ahade unas gotas de naranja de acridi- na (colorante que tine fluorescente el nûcleo celular) y se cuenta en un microscôpico de fluorescencia. Modificaciones en la temperatura y en los tiempos de incubaciôn llevan a una variaciôn en el nümero de rosetas apa- reciendo como hemos visto en la Introducciôn têrminos como "linfocitos de alta densidad** o "linfocitos de baja densidad". Con la técnica descrita arriba, se forman las rosetas con lin­ focitos tanto de alta como de baja afinidad. » 54 . Con el fin de potenciar la estabilidad de las rose­ tas, pueden emplearse en algunas ocasiones la formaciôn de rosetas con eritrocitos tratados con AET (2-aminoetil-isotio- « uranio bromuro hidrobromuro). El procedimiento en detalle es el siguiente;(204) 1600 mg de AET se disuelven en 15 ml de agua destila- da; el pH se lleva a 8,2 con NaOH al 50%. A continuacidn este voluraen se lleva a 20 ml con agua destilada; esta soluciôn AET por no ser muy estable debe usarse en 30 min. Tratamiento de los hematles de carnero con AET: 4 volumenes de la solucifin AET, pH 8,2, se mezclan con un volu­ me n de hematles apelmazados, manteniëndose la mezcla en un ba- no a 37® durante 20 min. con agitacidn ocasional. Las células se lavan 4-5 veces con MEM hasta que se observa lisis de los hematles. Estos se resuspenden entonces al 2% en MEM y se gua£ dan a 4®C (pueden ser utilizados hasta pasados 5 dlas). Formaciôn de rosetas: 0,1 ml de cëlulas (lOxlO^/rol) se mezclan con 0,1 ml de los AET al 2%; se centrifugan a conti- nuaciôn a 1000 rpm y se dejan durante una hora a 4®C. El sedi­ mento es entonces resuspendido contSndose el nûmero de rosetas al microscôpio. 55, 11.8.2. Dctocciôn de côlulas con inmunoglobulinas de super­ ficie . Para la identificaciôn de las células portadoras de inmunoglobulina de superficie, 0,05 ml de un antisuero fluo- resceinado de cabra anti-inmunoglobulina Humana se anade a 0,2 ml de la suspensiôn celular (5x10^ células/ml) a ensayar; tras 45 minutes de incubaciôn, a 4®C para evitar el "capping", se lava 3 veces a 4"C, 1400 rpm durante 10 min., con 1 ml de Hanks y al sedimiento resuspendido se le anade una gota de una mezcla glicerina-Hanks al 50%, leyéndose a continuaciôn en un microscépio de fluorescencia. 11.8,3. Detecciôn de las células con receptores para el frag­ mente Fc de la IgG. El nûmero de células con este receptor es valorado contabi1izando el nûmero de células capaces de formar rosetas con hematles de buey sensibilizados con inmunoglobulinas anti- buey (7S-EA). Para elle, hemos empleado el procedimiento de£ crito por Moretta y col. (84): una suspensiôn al 5% de hema­ tles de buey frescos se mezcla con un volûmen igual de una di- lucién al 1/32 de IgG anti-hematles de buey obtenida en conejo. 5é. El anti-suero ha de ahadirse gota a gota agitando; a conti­ nuaciôn se incuba esta mezcla a 30®C durante 15 min. y tras très lavados a 2000 rpm, 5 min. a 4®C, se resuspenden los 7S-EA al 2,5%. 0,1 ml de linfocitos (3xlO^/ml) se mezclan con 0,1 de la mezcla 7S-EA, se centrifugan durante 5 min. a 4®C y 1200 rpm, tras lo.cual, se incuban durante 30 min. y se cuenta el nûmero de rosetas en un microscopio de fluores­ cencia, anadiendo una gota de naranja de acridina al sedimen to resuspendido. II.8 .4. Detecciôn de células con receptores para el Fc de la IgM. En 1975, Moretta y col. (80) describieron la presen- cia de este tipo de receptores en una subpoblaciôn de células T humanas, y mâs recièntemente ha sido demostrada su existen- cia en células B (45). Este receptor permanece oculto en la superficie de los linfocitos recien extraîdos y sôlo es posible su detecciôn tras incubaciôn a 37"C en atmôsfera de COg por un tiempo de 18 horas. Nosotros hemos seguido el procedimiento de Moretta, el cual incuba durante toda la noche una mezcla formada p>or 0,1 ml de células (10x10^ células/ml), 0,2 ml de FCS y 0,7 ml 57 de medio TC 199, glutamina y Hopes. Tras la incubaciôn, las células se lavan en medio TC 199 y se resuspenden a 3x10^ cé­ lulas/ml, mezclândose a continuaciôn 0,1 ml de estas células preincubadas con 0,1 ml de la mezcla EA-19S. Esta mezcla,EA-19S, era preparada incubando hematles frescos de buey al 2% con un volumen igual de una diluciôn 1/16 de un antisuero de conejo IgM (19S), con actividad anti-hema- tle de buey. La incubaciôn tiene que realizarse a 4“C durante 30 min., tras lo cual se lava 3 veces con PBS a 2000 rpm, 5 min. a 4®C, resuspendiéndose el sedimento en PBS al 0,5%. Una vez realizada la mezcla, linfocitos-EA-19S, se centrifugan 5 min. a 4®C, 1200 rpm, y se pone en hielo durante 45 min., leyéndose en un microscopio de fluorescencia tras la adiciôn de una gota de naranja de acridina. Dado que estas rosetas EA-19S son tremendamente frâgiles, ha de evitarse tras la incubaciôn en hielo toda manipulaciôn violenta que las haga romperse. II.8 .5. Detecciôn de células capaces de ingerir particules de Latex. Las células fagoclticas de la estirpe monocito-macrô- 58 . fago, son capaces de ingerir bolas de Latex, levaduras, parti culas de hierro, etc., que quedan incluîdas en las vacuolas citoplasmâticas y por tanto pueden visualizarse mediante el uso de un microscopio o de autoradiografla. Nosotros hemos empleado la técnica de las partlculas de Latex para distinguir a estas células fagoclticas. Para ello, 2x10^ células en 1 ml de RPMI-10% FCS se Incuban con 10 A de Bactolatex a 37®C durante 2 horas. Se lavan repetidamente para eliminar el Latex no fagocitado, y a continuaciôn se euen tan en un microscopio el nûmero de células que presentan este­ ras en el interior de su citoplasma. II.8 .6 . Tinciôn de esterasas inespeclficas para la identifi- caciôn de monocitos y macrôfagos. El alto contenido en enzimas llsosômicos de los mono­ citos y macrôfagos, ha permitido emplear una serie de técnicas histoqulmicas para la detecciôn de esta poblaciôn leucocitaria. Nosotros hemos empleado la tinciôn de esterasas inespeclficas segûn el método descrito por Koskl y col. (50). Para ello, se realizan extensiones de la suspensiôn celular cuyo contenido en macrôfagos se quiere determiner (conviene que las células estén en presencia de suero para obtener una mejor morfologla)• 39. Las extensiones se fijan durante 30 min. sumergiéndolas en liquide fijador, tras lo cual se lavan 4 veces en agua des­ tilada y se sccan al aire durante 30 min. A continuaciôn, se sumergen en una soluciôn (formada por 4 5 ml de tampôn fosfa- to M/15 de Sorensen, 0,25 ml de una soluciôn de para-rosanil_i na hexazohizada v/v con nitrate sôdico al 4%, y 3 ml de una soluciôn de alfa-naftil-butirato) , poniéndose en un bano a 37°C durante 4 5 min.; nuevamente se lavan cuidadosamente con agua destilada y se tinen con una soluciôn al 0,5% de verde metilo como soluciôn de contraste. Finalmente, se secan al aire durante 30 min. y se miran al microscopio. Las células que contiene esterasas se distinguen facilmente por la presen­ cia de mûltiples grSnulos rojos en el citoplasma, lo que con­ trasta con el color verde de las células esterasa negativas. II.9. SEPARACION DE LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFERICA EN SUS DIFERENTES SUBPOBLACIONES. II.9.1. En funciôn de los marcadores de superficie. II.9.1.1. 60. Fue seguida una modificaciôn del método de Dean y col. (205) . Linfocitos liumanos fueron resuspendidos en medio RPMI completo. La suspensiôn celular (1x10^ células/ml) con teniendo una media de 40x10^ células fueron mezcladas con )ie matles de carnero frescos en una proporciôn de 100:1, en 40% de FCS; centrifugado a 1200 rpm durante 5 min., e incubado durante una hora a 4“C en hielo picado. Después de una sua­ ve resuspensiôn del sedimento, las rosetas fueron separadas en un gradiente de Ficoll (1200 rpm durante 30 min.). Las células formando rosetas (E-RFC) quedan en el sedimento, m i ^ tras que en la interfase se encuantran los linfocitos que no forman rosetas (no E-RFC). La interfase se recoge y tras resuspender suavemente el sedimento sobre medio fresco, se cuenta el porcentaje de rosetas de cada fracciôn. Para obte­ ner un mayor enriquecimiento, cada fracciôn fue roseteada de nuevo con SRBC siguiendo los misroos pasos que los descritos arriba. Al final del segundo pase, el sedimento contenîa en tre el 91-97% de células E-RFC (linfocitos T) y la interfase 0-2% E-RFC (células no T). Los hematles formando rosetas fue ron soltados de las células T por tratamiento del segundo se­ dimento con 2 ml de una mezcla de varies sueros humanos fres­ cos e incubados 30 min. a 37®C siguiendo el método de Pelle­ grino y col, (206). Las células scxi lavadas dos veces en medio RPMI y resuspendIdas luego a la concentréeiôn deseada. 61 SEDIMENTO il.UCOClroS DE SANGRE ♦ HEMATIES DE CARNERO Ficoll INHiRPASE ♦ SRBC Ficoll 2® SEDIMENTO LINFOCITOS T 2' INTERFASE LINFOCITOS no-T Figura 3 62. II. 9.1.2. PrGgaraciôn de linfocitos T ganma (T̂ )̂ y T mu iDO-Tci- Linfocitos obtenidos tras dos pases por Ficoll con SRBC segûn el método anteriormente descrito, fueron rosetea- dos con hematles de buey recubiehrtos de anticuerpos 7S (EA- 7S) para obtener linfocitos o no T^, siguiendo el método descrito por Ferrarini y col. (^^). EA-7S fueron preparados sensibilizando una suspensiôn del 5% v/v de hematles de buey a 37®C durante 20 min. con un volumen igual de una diluciôn en PBS 1:32 de un antisuero de conejo IgG anti-hematles de buey que tenla una concentraciôn de protelna final de 2 mg/ ml. Para formar las rosetas, 3,6 ml de la suspensiôn al 2,5% v/v de EA-7S) fue mezclado en un tubo côhico de 50 ml con 30-40x10® de células en un volumen total de 40 ml de medio RPMI completo con un 10% de FCS; centrifugado a 1200 rpm durante 5 min. a temperatura ambiente e incubado luego a 37®C durante media hora. Después de la incubaciôn el sedimento fue suave­ mente resuspendido, 10 ml de Ficoll fueron inyectadas al fondo del tubo y las células que estén roseteadas (Tg) separadas de las no roseteadas (no Tg) tras la centrifugaciôn a 1400 rpm, 10®C durante 35 min. La interfase ÿ el sedimento fueron resus- 63 SI:PAR.\CinN DE LINTOCJ JOS T y no-T IJNTOC] JOS T 4 EA(7S) JJKPnCJTOS no-T Interfase LINFOCITOS no-Tj (T „ ) SJDIMENJO 2® Sedijnento LINFOCITOS T,n Fiqura 4 64 pcndidos y el numéro de rosetas HA(7S) contadas. Para obte­ ner unmayor enriquecimiento en células T g , el sedimento fue pasado de nuevo por un segundo gradiente de Ficoll, durante 30 min. a 37 ®C.; el sedimento es resuspendido, contado el nu mero de rosetas y las células liberadas de los hematfes de buey por incubaciôn con suero humano normal tal como se hade^ crito previamente. La interfase del primer pase por Ficoll constituye la poblaciôn no T^, y el sedimento del segundo pa se forma la poblaciôn Tg. 11.9.1.3. Preparaciôn de células Fç(7S)* y células Fc(7s) 20 ml de una suspensiôn de sangre per iferica conten ien do 40x10^ de células en RPMI completo con 101 de FCS, fueron mezclados con 3.6 ml de una suspensiôn al 2.5% de hematies de buey sensibilizados con una IgG de conejo anti-hematies de buey. La mezcla fué centrifugada a 1200 rpm durante 5 min. a tempera tura ambiente y posterîormente incubado a 37®C durante 30 min. Tras este tiempo, se resuspende el sedimento y 10 ml de Ficoll son inyectados al fondo del tubo; este se centrifuga a 1450rpm durante 20 min. a temperatura ambiente. La interfase (noFc(7S)) y el sedimento (Fc(7S) ) son resuspendidos y se calcula el por centaje de rosetas. Para obtener una mayor pureza, el sedi­ mento fué pasado una segunda vez por Ficoll y las células del 65, l.liUCOCriOS DE SANr.HE ♦ iniMATlHS IA (7S) Sedimento Ficoll mniRFASE CELULAS Fc(7S) 2® Sedimento CELULAS Fc(7S) Figura 5 66. segundo sedimento consideradas como las células Fc(7S) . De nuevo los hematies lisados por l^incubacion del sedimento con suero humano fresco, 30 min. a 37“C, lavando luego la suspen­ siôn en suero salino y resuspendiendolas en el medio apropia- do: Esto constituye la poblaciôn Fc(7S)^ y la interfase del primer pase por Ficoll constituye las Células no-Fc(7S) ô FcC7S)‘. II.9.2. En funciôn de su tamano y densidad en un gradiente discontinue de Percoll. Leucocitos humanos, desprovistos de células adhérentes, por pase a traves de una columna de nylon, fueron separados por centrifugaciôn sobre un gradiente discontinue de Percoll (207). La soluciôn base, de la cual parten las demas solucio nés para formar el gradiente, consistia en 92 partes de Percoll pure (comercial) y 8 partes de una soluciôn 10 veces concentra^ da de un buffer fosfato (PBS) pH 7.4. A partir de aqui, se prepararôn siete diferentes concentraciones de Percoll en me dio RPMI completo con 10% de FCS. Estas preparaciones con- tenian el 40% (fraccion 1), 43.3% (fr. 2), 45.8% (fr. 3), 48.3% (fr. 4), 50.3% (fr. 5), 53.3% (fr. 6) y 66.6% (fr. 7) de la so luciôn base de Percoll. Despues de poner cuidadosamente el gradiente en un tubo de cristal de 15 ml, se afiadieron sobre el mismo 5-7x10^ células en 1 ml, y el tubo fué centrifugado 67 . a temperatura ambiente a 3000 rpm durante 5 min. Las células de las diferentes frace i ones fueron recojidas con una pipeta Pasteur y lavadas en medio RPMI con 10% de FCS. La recupe- racion total de las células era de un 80% y con una viabilidad detectada por Azul Tripan de un 95%. 11.10. MONOCAPAS CELULARES PARA INMUNOADSORCION 11.10.1. Formaciôn de la monocapa. 1 ml de poli-L-1isina ((PLL) peso molecular 30.000, 50 yg/ml en PBS) fué anadido a cada plaça Pétri de plastico de po licstireno de 35x10 mm. Despues de una hora a temperatura am biente, las plaças fueron lavadas très veces en un vaso de pre cipitado con PBS (pH 7.3) para eliminar la PLL no unida al pla£ tico y se anadiô 1 ml de una soluciôn al 1% v/v de hamaties de polio (CRBC), que habian sido previamente lavados en PBS. Tras 60 min de incubaciôn a temperatura ambiente, las plaças fueron lavadas très veces en PBS para eliminar los CRBC sobrantes que no se habian adherido. Luego, las plaças se incuban 10 min con 0.2% de glutaraldehido (GA) en PBS, seguido de lavado y de una segunda incubaciôn de 10 min con 0.1 M de glicina en PBS (206 ). Las monocapas de hematies fueron lavadas con PBS y almacenadas a 4 ®C hasta su uso.(209) 6 8 . Antes de vol ver a user las plaças con los hcmatfes, se lavaron en PBS, luego se les afiade 1 ml de una soluciôn 1/50 >le PHA y se incuban durante 30 min a 37 ®C en atmôsfera de CO^ . Al final de la incubaciôn, las plaças se lavan très veces en PBS para eliminar la PHA sobrante, con lo que nos queda una pe licula de PHA unida a la monocapa de hematfes. Sobre esta se ahaden ahora entre 25-30x10^ células diana en 1 ml de medio, se incuban durante media hora a 37®C y se lavan de nuevo para eli­ minar las células que no se hayan adherido. Finalmente, 1 ml de una suspensiôn al 1 % v/v de hematfes humanos fueron afiadidos para cubrir los intersticios que pudiesen quedar entre las c é­ lulas diana formando las monocapas, evitando asi las adsorcio- nes inespecificas, e incubados a 37 ®C durante media hora, la­ vados en PBS y usados para adsorber las células citotoxicas. 11.10.2. Adsorciôn de celulas efectoras sobre monocapas célu- lares. 1 ml de células efectoras conteniendo alrededor de 5x10^ células/ml en medio RPMI completo con el 10% de FCS, fueron a - fiadidos a las monocapas y despues de una suave agitaciôn incu­ bados durante diferentes périodes de tiempo a 37 ®C. Luego, las plaças son vigorosamente agitadas durante 10 seg con el fin de soltar las células no adhérentes y el medio con células en suspensiôn es recogido. Se lavan las células dos veces en 69. mi'dio fresco y se usan en cl cnsayo citotoxico. 11.11. ENSAYO CITOTOXICO POR SUELTA DE ^^Cr, II.11.1. Marcaje con el isotopo ^^Cr de las células diana. 1-2 X 10^ células diana se ponen en un tubo en 0.1ml de volûmen, con 0,1 ml de FCS y 150 pCi de cromato sôdico (^Vr). Esta mezcla se pone en estufa a 37®C por espacio de una hora con agitaciôn ocasional. A continuaciôn se lavan 2 veces con MEM-FCS 10%, a 1000 rpm y 4 “C , tras lo cual se resuspenden en MEM-FCS 10% supleme^ado con 1% de glutamina. Cuando se cromaban las células diana a utilizar en ADCC, se anadîa a la mezcla Chang-FCS-^^Cr, 0,1 ml de un anti­ suero ant i Chang obtenido en conejo. Procediendose después de la incubaciôn igual que con otras células diana. II. 11.2. Preparac iôn de las células efectoras y procedimiento. Los linfocitos a utilizar en los ensayos citotoxicos se lavan repetidamente a 1000 rpm con medio MEM-FCS 10%, y se resuspendîan a la concentraciôn deseada en MEM-FCS . 5 X 10^ células diana marcadas con ^^Cr fueron mezcla das con las células efectoras en distintas proporc iones efec- P 70. tora/dinna (100:1 a 6:1), en 0,2 ml de medio MP,M+10% de FCS. El cnsayo fué hecho, bien en tubo de cristal de 12x75 mm 6 bien en plaças de cultive de 96 pocillos. En los expérimentes de LICC, se afiadia a la mezcla de células efectoras-diana diluciones de la lectina PHA obtenida del laboratorio Wellcome. Todos los expérimentes de citotoxicidad se realizarSn durante un tiempo de 4-6 horas de incubaciôn a 37®C y atmosfe ra de carbonico (5% CO^). Tras este période de tiempo, se anadia a cada tubo 1 ml de una solucion salina fria con el fin de detener la reacciôn. A continuaciôn, los tubes eran cen trifugados 5 min a 1500 rpm y los sobrenadantes eran decanta - dos sobre otros tubes de 12x75 mm, determinandose en elles la liberaciôn del isotopo radioactive en un contador ganma. En case de usar la plaça de 96 pocillos, se utilizaba un sistema semiautomatico de recojida de sobrenadantes. Un filtre encaja ba en cada une de los 96 pocillos, tras el cual una fibra absor bia el sobrenadante que era luego contado en un contador ganma. Todas estas combinaciones ensayadas eran realizadas por tri - plicado. Siempre incluiamos en los distintos expérimentes, contrôles en los que en lugar de células efectoras se anadîan células autôlogas a la diana cromada. Esto permitîa medir la suelta espont ânea de isôtopo de las células diana, que sol la 71 oscilar entre un 10-15% del total de isotopo incorporado por las células. El porcentaje de citotoxicidad se calculaba de acuerdo con la siguiente formula: (A-B) - (C-B) % = ---------------------- X 100 (T-B) en la que A= cpm de la media de los tubos problema B= cpm fondo del contador C= cpm del control con células autôlogas a la diana T= maxima liberaciôn de isotopo, obtenida por acciôn de un detergente sobre las células diana. Para calcular el % de citotoxicidad en los ensayos de ADCC y LICC, teniamos que sustraer el % de lisis obtenido en ausencia de lectina o de anticuerpo, es decir, la citotoxicidad espontanea. En ocasiones, la actividad citotoxica era expresada en Unidades Liticas (U.L.). Una unidad lîtica se define como el numéro de linfocitos requeridos para obtener un 30% de lisis, a un numéro f ijo de células diana ( en nuestro ca so 5 x 10^) y un determinado tiempo de incubaciôn. Se détermina represen tando los valores de la citotoxicidad especifica frente a la relaciôn de células efectora:diana, este valor representado en 72. cscala logaritmica, usando para ello un papel semilogaritmi- CO. Hay una curva lineal entre los valores del 20 y 60% de lisis, zona esta donde se determinan las U.L.. Usando este valor, se puede calcular el numéro de U.L. presente en 10^ 6 10^ células. En ensayos de competiciôn, se siguio una modificaciôn del metodo de de Landazuri y Herberman (210). Brevemente se siguio el siguiente protocole: La inhibiciôn fué llevada a cabo en tubo de cristal de 12x75 mm colocados en posiciôn ho­ rizontal, y nunca en las plaças de 96 pocillos, para evitar la inhibiciôn inespecifica que puede originar el gran numéro de células frias usadas como inhibidoras. 5 x 10^ células diana maracadas con ^^Cr, fueron incubadas con 2,5 x 10^ linfocitos en 1 ml de medio en los tubos de cristal. A esta mezcla se afiadieron diferentes cantidades de células no mar­ cadas radioactivamente (células frias)(desde 5 x 10^ hasta 36 X 10^) variando la relaciôn de células frias a marcadas de 1:1 hasta 7:1, con una proporciôn final de-células efectora: células diana totales ( suma de frias mas marcadas) de 25:1 a 6:1. "Los tubos fueron incubados durante 4 lioras a 37-“C en 5% COg sobre una plataforma movil. ■ Déspues' së sigiiîb él m e ­ todo descrito anteriormente. En todos los experimentos de inhibiciôn iempleamos “como contrôles positives, o' bien K562 nb marcado o bien Chang-anticuerpo j para los ensayos fJK y ADCC. 73 . 11.12. TECNICA DE FORMACION DE CON.JUCADOS Memos seguido una modificaciôn del método de Grim y Bonavida (211). 2.5 X 10^ células efectoras e igual numéro de células diana fueron centrifugadas en un tubo de cristal de 12x75 mm a 1000 rpm, durante 5 min., incubados luego durante 10 min a 37®C. Todo el medio, excepto un volumen aproximado de 0.3 ml es aspirado, el sedimemto es ahora resuspendido violentamente por pipeteo repet ido con una pipeta Pateur y la suspensiôn c e ­ lular contada en un hemocitometro Neubauer. Un conjugado se define como una célula efectora (linfocito) unida a una celui a tumoral (de mayor tamafio). Se calcula ahora el porcentaje de conjugados sobre 200 linfocitos. 11.13. TECNICA DE CONJUGADOS CITOTOXICOS EN AGAROSA Esta técnica fué ensayada siguiendo el método de Grim y Bonavida (211). Se basa en la formaciôn de conjugados entre la célula efectora y la célula diana. Una vez formados los conjugados, tal como se describe en el apartado anterior, se le anade a los 74 . misinos ya cn suspension, 1,5 ml de ngarosa al 1% fundida. Esta agarosa al 1% se prépara anteriormente en medio RPMI, calentan dose luego a una temperatura de 42®C, donde se fundirâ; antes de afiadirla a la suspension celular de conjugados conviene en- friarla ligeramente por repetidos pipeteos. Alicuotas de 0,5ml de las células en agarosa son rapidamente repartidas’en plaças de Petri de 35 x 100 mm antes de que la agarosa se solidi f i que. Despues de que la agarosa se haya solidificado, 1 ml de medio RPMI completo con 10% de FCS se afiade lentamente a la plaça, para evitar que la agarosa se seque durante el posterior perio do de incubaciôn. Las plaças son incubadas en estufa de CO^ durante deter minados périodes de tiempo. Tras cada periodo de incubaciôn, las plaças son sacadas del incubador, el medio aspirado y se le afiade ahora 1 ml de Azul Tripan. Despues de 5 min el colorag te se recoge lavando luego las plaças dos veces con MEM. Al final 1 ml de formaldehido se anade para fijar las células. Contaremos, el porcentaje de células que forman conjugados en los cuales el linfocito haya matado a su célula diana (conju­ gados citotoxicos) que aparecera ahora tefiida de azul y el porcentaje de conjugados totales. 11.14. TRATAMIENTO DE LOS LINFOCITOS CON INTERFERON 75 llt-mos cnsayaJo dos linos ilc InteiToroncs (INF), un INF de fibroblastos, regalo del Dr. R. Herbcnnan y un INF de leu­ cocitos regalo de 1 Dr B. Bonavida, ambos proven i entes del Institute of Allergy and Infectious Disease, NIH, con una actividad de 20.000 U ./ml. En ensayos de citotoxicidad de conjugados citotoxicos (Resultados III.3.2.) el INF provenia de leucocitos humanos y usamos un rango de dosis entre 5 y 20 U. de INF. En ensa­ yos de citotoxicidad por liberaciôn de ^^Cr, usamos INF de fibroblastos con un rango de dosis de 100 a 1000 U./ml. 1 ml conteniendo 5 x 10^ células es incubado con dis tintas concentraciones de INF, durante un periodo de tiempo variable (ver Resultados). Luego las células eran lavadas con un medio fresco y ensayadas en el ensayo citotoxico. 76 III. RESULTADOS 111.1. CARACTERIZACION DE LA CELULA EFECTORA EN CITOTOXICIDAD ESPONTANEA. Para estudiar y caracterizar la célula que media la ci­ totoxicidad esponténea (NK), usamos principalmente linfocitos de sangre periférica de donantes voluntaries sanos purificados por el método de Boyum y col. en un gradiente de Ficoll (201). 111.1.1. Formaciôn de conjugados en las diferentes subpoblacio- nes linfocitarias. El primer paso en la lisis de una célula tumoral es el reconocimiento y la unién de la célula efectora con la célula diana (211). Este paso se realize râpidamente y puede ser vi- sualizado al microscopio éptico como la formaciôn de un conju gado, que comprende una célula pequena linfoide unida a una cé­ lula tumoral. Lo primero que observamos fue que el nûmero de conjuga­ dos de linfocitos de sangre periférica variaba ligeramente se­ gûn la célula diana usada. Como vemos en la Tabla 3, alrededor de un 10% de linfocitos de sangre periférica formaban conjugados con la lïnea K562, mientras que se velan alrededor de un 6% de 77. TABLA FORMACION DE CONJUGADOS DE LINFOCITOS CON CELULAS TUMORALES CELULA DIANA PORCENTAJE DE CONJUGADOS K562 * 11.2 ± 1.4 MOLT-4 * 5.7 ± 0.2 G-11 ** 6.8 ± 4.8 CHANG ** 5.8 i 3.1 media de 10 expérimentes media de 6 experimentos. En estos casos, dado que las cé­ lulas eran adhérentes es muy dificil evaluar el porcentaje real de conjugados, de ahi la gran variabilidad entre los diferentes experimentos. 78. conjugndos \isando la lînea MOLT-4 o la G-11. Dado que la formaciôn de conjugados constituye un pr^ mer paso para la lisis celular, era interesante tratar de ca- racterizar qué subpoblaciôn de linfocitos de sangre periférica era capa? de formar dichos conjugados, lo que nos acercarîa a conocer en qué fracciôn se hayan las células efectoras en ac- tivldad cltotéxica espontSnea. ’̂ ara ello separamos los linfocitos en; a) células con receptores para el hematle de carnero (linfoci- to T) o células que no poselan este receptor (linfocito no T) . Estas poblaciones fueron obtenidas tras dos pases se- cuenciales de purificacién con rosetas E(SRBC) a través de un gradiente de Ficoll (vease esquema Fig. 3); b) células que tuviesen receptores para el fragmente Pc de la IgG (Fc(7S)^) o células que no tuviesen ese receptor (no Fc (7S)). Esta separacién se lleva a cabo por un roseteo con hematies de buey sensibilizados con anticuerpos IgG (EA-7S) y separados a través de un gradiente de Ficoll. La primera interfase constituye la poblacién ho Fc(7S), mientras que el sedimento se vuelve a pasar a través de un gradiente de Ficoll y su sedimento constituye la poblacién Fc(7S)^ (vea­ se esquema Fig. 5 ). 79. Linfocitos totales o pertenecicntcs a cada una de es­ tas fracciones, fueron usados para formar conjugados con la lînea mSs sensible a la actividad NK, la lînea K562. En la Tabla 4, vemos que aproximadamente la cëlula que forma conju­ gados con K562 esté repartida en la misma proporcién entre los linfocitos T y no T (aprox. 11% ) , mientras que la mayorîa per tenecen a la fracciôn Fc(7S)^ (aprox. 25%), con algunos conju gados en la fracciôn no Fc(7S) (<4%) . Ya que encontramos conjugados en la fracciôn no T, es- tudiamos si las células con inmunoglobulinas de superficie (lin focito B) formaban conjugados. Para ello, sobre linfocitos mar cados con un antisuero antiinraunoglobulinas humanas- fluores- ceinado, se hicieron conjugados con K562. Como se muestra en la Tabla 5, ninguna de las células formando conjugados se tenîan con el antisuero ni viceversa, con lo que demostramos que los linfocitos B no forman conjugados con las células diana NK. Del mismo modo, los macrôfagos son contaminantes de la fracciôn no T y poseen receptores Fc(7S). Al enriquecer en cé lulas con receptores Fc(7S), el macrôfago también se encontra- rla enriquecido en dichas poblaciones, con lo que era necesario comprobar si este tipo celular forma parte o no de las células que forman conjugados. 80. TABLA 4 PORCENTAJE DE CONJUGADOS EN DISTINTAS FRACCIONES LINFOCITARIAS % de células con receptores Poblacién celular % Conjugados E Fc(7S) Leucocitos totales 11.2 + 1 72.0 ± 4 27.7 ± 2 Células T 11.3 ± 1.5 95.2 ± 6 12.4 + 3 Células no T 12.3+1.1 2.5 ± 0.8 38.2 + 6 Células Fc(7S)^ 27.5 ±2.1 27.7+2 79.9+4 Células Fc(7S)“ 3.2 ± 0.5 79.4+5 2.0 + 1 Leucocitos totales no adhérentes fueron separados en base a la presencia de receptores para SRBC o para el Fc(7S) en, cé lulas T, no T, Fc(7S)^ y Fc(7S) , respectivamente. Células totales o cada una de las fracciones fueron usadas pa ra formar con jugados con la linea K562. 81. TABLA 5 LAS CELULAS QUE FORMAN CONJUGADOS NO POSEEN IgS DE SUPERFICIE MARCADORES EXP. 1 EXP. 2 KCP. 3 EXP. 4 Células con Igs de superficie 6 9 10 12 'k'kcélulas formando conjugados 10 11 13 16 ***Células formando conjugados que lleven Igs de superficie 0 0 0 0 Células de sangre fueron incubadas con antiinmunoglobulinas fluoresceinadas y el numéro de células tenidas evaluado so bre 200 células. * * La células diana fué la K562 * * * Células previamente tenidas con antligs totales fueron usa­ das para formar conjugados con K562. Se calculo en la pre parecién el porcentaje de células tenidas con Igs de super­ ficie *, el porcentaje de células formando conjugados **> y células con ambos marcadores ***. Para comprobar esto, nos basamos en la identificacién citolégica de los macrôfagos usando la tinciôn de esterasa. Esta tinciôn claramente visible al microscopio y propia de los macrôfagos (50), nos permitîa diferenciar a la cëlula for mando el conjugado. Como se ve en la Tabla 6, alrededor de un 13% de macrôfagos son contaminantes de los linfocitos totales; al comprobar los conjugados vemos que sôlo un 1% del 11% de c6 lulas totales que forman conjugados tienen tinciôn de esterasa. Con todos estos resultados podemos descartar a los lin focitos B como células causantes de la formaciôn de conjugados. Los macrôfagos aunque en pequeno porcentaje (aprox. 10%) forman conjugados, yaunque estos no tengan demasiada importancia al eva luar células totales de sangre periférica, en la cual la conta- minaciôn de macrôfagos es de un 10%, debe tenerse en cuenta cuan do enriquesemos poblaciones por el receptor Fc(7S), y en los cua les los macrôfagos se encuentran en mayor proporciôn. Por lo tan to, la Onica fracciôn que nos queda y que mayoritariamente for- maré los conjugados, seré la poblacién "null", células que ade- mSs poseen receptores Fc(7S). Para corroborar los resultados de la separacién de las poblaciones celulares, quisimos comprobar qué tipo de marcador presentaba la célula efectora en el moroento de estar formando el conjugado; esto es, la detecciôn simultSnea del conjugado y de 83 TABLA 6 No. DE CELULAS FORMANDO CONJUGADOS CON TINCION DE ESTERASA MARCADORES Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 Células con tinci&i de esterasa 13 16 15 13 Células formando conjugados 11 12.5 12.5 10.9 Células formando ccwijugados que se tinen con esterasas 1 1.2 1.2 1.1 Células de sangre formando conjugados son fijadas en un porta y tenidas por tinciôn de esterasas; luego se cuentan el porcentaje de células tenidas, formando conjugados y con ambos marcadores a la vez. 84 diferentes marcadores del linfocito por formaciôn de rosëtas del tipo E, EA(7S) o EA(19S). En la Tabla 7 vemos como las células que hacen conju gados: a) la mitad de ellas forman rosetas E mientras que la otra mitad carece de dicho receptor; b) la mayorfa forman ro setas EA(7S), indicSndonos de nuevo la presencia del receptor Fc(7S) en estas células y c) casi todas ellas carecen de re ceptores para el fragmente Fc(19S). Tornados en conjunto todos estos datos y los anterior- mente citados, nos aproximamos al définir a la célula que fo£ ma conjugados como célula Fc(7S)^ siendo la mitad del tipo T (E^) y la otra mitad del tipo "null" (no T, no B, Fc(7S)^). 111.1.2. Actividad citotôxica de las diferentes subpoblaciones linfocitarias. 111.1.2.a . Estudio de diferentes subpoblaciones de sangre péri- férica. Aunque ya poseemos cierta informaciôn sobre cuél es el tipo de células que forman conjugados, los propios conjugados no constituyen en si la célula efectora NK. Ademâs, recientes TABLA 85 DOBLES MARCADORES DE SUPERFICIE : CONJUGADOS K562 Y ROSETAS PBL + K562 adleion de: EA(7S) EA(19S) Linfocitos solos 12.5± 1 Linfocitos + rosetas 73.3 1 8 Linfocitos + K562 + rosetas 6.6 1 1 Linfocitos + rosetas 6.3 1 1 75.31 5 23.6 ± 10 15.61 3 65.01 19 8.512 0.81 0.5 2.51 0.5 12.61 6 Los numéros representan el porcentaje de la media de 5 diferentes expérimentes ( ds). Los linfocitos se usa- ron para formar conjugados con K562, luego se incubaron con E, EA(7S) 6 EA(19S) y se resuspendieron, contandose en 300 células el numéro de linfocitos solos, formando conjugados o con ambos marcadores. 86. datos de otros autores han demostrado (162) que no todos los linfocitos formadores de conjugados poseen capacidad citotô- xica. Por ello, era indispensable estudiar bajo un aspecto citotôxico la localizaciôn de la célula efectora NK. Para ello, células de sangre periférica purificadas en un Ficoll, se subdividieron en las diferentes fracciones de acuerdo con los diferentes marcadores de superficie que poseen (vease Fig. 2) . Poblaciones celulares enriquecidas en linfocitos T y no-T, fueron obtenidas tras dos pases secuenciales de purifi- cacién con rosetas E a través de un gradiente de Ficoll (vease Fig. 3). De acuerdo con los datos de Moretta y col. (84), las células T humanas pueden subdividirse en dos subpoblaciones en base a la presencia de receptores para el fragmente Fc de la IgG en linfocitos y linfocitos (Fig. 4). Para ello, lin focitos T fueron roseteados con hematies de buey recubiertos de anticuerpo IgG, EA(7S) y separados en un gradiente de Ficoll. La primera interfase constitula la poblacién no (o T^), mien tras que el sedimento tras un nuevo gradiente de Ficoll consti­ tula la poblacién T^. Por otro lado, leucocitos totales fueron separados de acuerdo con la presencia o no de receptores Fc(7S) en células Fc(7S)^ o células no Fc(7S). Esta separacién celular se reali- 8 7 . 7,a del minmo modo que el descrito previamente (Fig. 5 ). En la Tabla 8 , indicamos un detallado estudio de los marcadores de superficie mâs importantes de las distintas sub­ poblaciones linfocitarias estudiadas. Leucocitos sin purificar o cada una de las fracciones obtenidas (T^, Fc(7S)^ o no Fc(7S)) fueron incubadas en di­ ferentes proporciones con células diana K562 marcadas radioact^ vamente con ^^Cr en un ensayo citotôxico de 4 horas de duraciôn Dado que las células que forman conjugados son Fc(7S)^, nosotros ensayamos primero la actividad citotéxica de poblacio­ nes Fc(7S)^ y no Fc(7S). En un experimento representative se observa una normal actividad citotéxica de la poblacién con células Fc(7S)^, mientras que hay una ausencia total de dicha actividad en la fracciôn no Fc(7S) (Fig. 6). Otros très expe- rimentos presentan el mismo patrén de actividades. Por su parte en la Fig. 7 vemos el resultado de un ex­ perimento tipo en el que se muestra la actividad citotéxica de los linfocitos totales o de sus diferentes subpoblaciones: lin­ focitos T, células no T, linfocitos T^ y linfocitos no T^. Co­ mo podemos observer, todas las fracciones ensayadas tienen ac­ tividad citotéxica menos las células no T^, destacando una mar- r4 in in +1 +1 +1 D' o CM VO PC ft A PiM z z Z Zrsi O T—4dP rH in tH r- r+ o> rH < +( +1 +1 +1 +1 +1 +1 K in in in o in o p m CM ro o m CM W .—4 ro + rN CM mw tH f-H VO r-cr> +1 +1 +1 +1 +1 d r~ 00 VO r~ .H k Pi U Z Z k a\ o o\ ro O -f VD CM CM l~ + in cn fN o> ro 1—I o Cl +1 -M +1 +1 +1 u ro CM r- in k in CM O o o> (C tr* f-3 btf > w Ci wX o M > s > > pw 3: isi M z z >(D o o Ci Q o o►1 3 o w oH- C* > M M3 3 H H firo (B > 25 ÜJ3 Mrt O o oO 01 H M01 aM M ÜJa> a►o 'üM M(B S0) fi(B M3 vo w w o\ ort o ^ NJ M M HO' 1 1 ^ ^ 1 w3 Ü)en vo l/l ui g o< G w01 oh-* nO wM . f(B c0) r>(B ÜJX rt- ro ro "9 wM O z(B 1 1 13 ur r-* w -O DO to M tn H0) ÜJti(B H3 ZO HO O3 ÜJrtn O01 H» l*> M H »a Cio 1 1 1 1 01 >0) V-* to *»■ M zt-" Cl 00 01 o(B c ÜJ3 •o fD. MH*- zH,(B oM Mn> o M M a3 1 Z I Z &» Mrt M » tü 50 H üi(B M01 X 95. La amîgdala que como vemos en la Tabla 10 carece de cé lulas con receptores Fc(7S), también tiene una ausencia total de la actividad citotôxica NK, Incluso usando relaciones altas de células efectoras: células diana (200:1). Esta ausencia de actividad citotôxica aparece también al estudiar la citotoxici­ dad dependiente de anticuerpo (ADCC) que como sabemos necesita células con el receptor para el Fc de la IgG: células K (Tabla 10) . Sin embargo, la falta de actividad NK y ADCC en la amlg- dala no era debida a un artefacto dado que los mismos experimen tos eran capaces de ejercer actividad citotôxica mediada por lec tinas (LICC) (Tabla 10). El tlmo, no posee células con receptores Fc(7S) (Tabla 9) y carece de todo tipo de actividad citotôxica en ninguno de los sistemas citotôxicos estudiados: NK, ADCC y LICC (Tabla 11). El bazo, posee un alto porcentaje de células con recep­ tores Fc(7S) y de linfocitos T (Tabla 9). Al estudiar la ca­ pacidad citotôxica del bazo, vimos que tenîa un comportamiento muy similar al de leucocitos de sangre total, con fuerte acti­ vidad citotôxica en los sistemas estudiados (Tabla 12). Todos estos estudios sobre diferentes ôrganos linfoides nos ayudan a corroborar que realmente la célula efectora NK es una célula con receptores F c (7S), ya que ôrganos linfoides con co Q C H m m) •d JC »—4 u 10 1 • 1 C c tH r- M 3CM fH fN ♦ fN o VO •d in M c X O 10 *—4 in fH in CN m in 3 r-l O 00 m * 0) C in m m r i Hi O 1 (d u XVD fH r~ *0 M V3 (N 1 • 1 • fd «0 -P in O in 00 >1 E O(N ro fH fd 4J CL 0) •H Xc U Mtu Idf—1 O (0o tH fH ̂ in 00 c O >1 o0 m 10 iHtH (N fH fH o o u (0 1 1 tu (T c C3 C 0) tuMH 10Si »—1 otu u 10 O u fH tr o VD \ c •H fH O IN 00 vo ,o ICo a 10 fH M fd Q) 0) a r-4 3 10 X «3 ü MbH CD TT IN Tf fH •o •H Cr ■P fH O O fH O fH •H C 0) 1 1 E lO nt u C 0) u 0) o> •o M •d Om fH m 4J •a \ ni u 10 fH O O O O rH 0) •d O O 3 •H •H c fH fH fH fH r4 .Q > VD VI) 3 •H •Hu u S) U1 k to m 10 c O o k O >1* I* m rH V3¥ n) C X •O m z rH r4 o id o 0) O u +J O S CM O *—1 tH k c tAH 1 1 id 0) E-t e G ■ri CM k o VO 0) o in a rH K X \ 0) rH vo M ro xT xr m Id fH m o ü CM CM CM CM rH rH < Z CM Tf ro xT in CO 2 < Û4 B a 10 0) Id c * rH o« 0) u u +> O u c o Q 0) rH « < k u«H 0) uvo in 00 •o M o m hi S O r-4 o o o 10 IdH 1 1 1 ’ü c E-< id Id id >i •H 10 u id ? d) ■ri m 4J «M c « c VH 0) k Id O O *3 0) c k m a W o u 0) m P5 r~ vo in vo k 0) k 0) O 0) «w Z in r~ Tf 00 3 0) n "d < r4 CM ro t—4 r4 •W o id co n -p •d O id c ■H E rH 0) u•H 3 G ■rH U k rH •H X o VI) k vo H O ü Q) -P hi a 0 0) 0) X k k T3 0) •H 00 in xr rH tr u c C (0O tH o rH id VO o Id 1 1 m •H rH u 0) id c •o rH 0) C 0) Id n k rH ■p id c '—1 id o 0) 3 c in co rH 3 0) VU 0) k u id TJ a a t—C xr in * X * * M * * * W 1 CH im X* m c >1 z r- 00 VD rt < tH • rsi rH U) tn c d) c o u X d) z 3 o «hH o m vo f ' rH rHo d) \ N Xf O k O rH < rH ro m m c rH rt d) rt 0) 73 <>0 D z a o Mw N o a CM 00 rH rt d) ü X» 73 (0 z ro O o < ro ro ro rH C a \n d) VO k »o rl d) ü 3o <0 rt üN rt rH •rl < u rH (U k ta u 3 k C Q rH rt < VU rt hi o C c M r- rH r~ 3 o(N Q O u rH uo m vo in rt < rH rsi 1 Q z UO ir> CD « rt < < rH rH B C U Q ÜJ a rt u H k •rl Q > U) 73 < H U ri Eh u (0 m rt U H rt k < hi 0) rH rt d) 3 ao VO rH k rH N C vd> < O O OV d) u m rsi ro rH k vo d) m UO «M 3 X -rl 10 73 c X m o zO u rt 10 k c rt rtw 73 a rH f-4 o ro c O M C t-4 M 0 o 2 O u w O O Q) 0) H 3 04 U CO O '«W O •o 1 1 CM r-4 1 m n 00 in x: H Q Q (N rH t) Id CO O 01 *4 O O o Cr Q 3 VD m c 01 < 2 T-4 in C TJ H 1 f-H 3 5 E-* O 00 VD 4 CO *1 2 *—4 (N r-4 CM Id 01 o 2 O u r4 TJ tr O U in O CO o 3 c Ü Ol to Id H m CM r- in Vfl) 0) M ÏM D »— 4 CM O c o •H Id u W to Ü •H u H fO o\ 0) Ü TJ 2 H O < Z m Q W r-4 CD 2W U < o 3 2 o 3 r-4 M GO Q 2 1 r-4 r-4 M t4 r-4 V « X r-4 r-4 2 VD V ►J< O Tf r-4 U U inH K r-4 X CQo CM Eh in O U MEh Q kQH O uU «£ DEh üJ 2U M Cm M< Q U m1 3(0 r4u r-4 vuH4 r-4 uOC ü U)O tH (Uu 0) p •H(U ü o>H C •H >1(U 3 X Idx: o co•o C p Cid V o 0)p o « •H ’ cc 0) o 3 Cm o c C0) •H (U (Ut—1 u«0 o (0p Id Id P o *H TJ Up vh Id ,—1 >1 m m U) IdO 0) 10 CP p c O•H c lU OO 0) o M (0 COu 0) Id Id 3 VH r-4 TJ0) •H r-4 Id p) TJ (U o 110. lulares, lo que dificultaba grandemonte la posible y correcta evaluaciôn del nûmero de conjugados. Estas células, quizâ por el hecho de que baya que soltarlas del plâstico con tratamien- tos de tripsina, o quizâs por sus propias caracterlstlcas en membrana, son muy adhérentes, principalmente las llneas tumo­ rales ALAB y T-24; y ésta es la razôn de no poder Incluir en la Tabla 14 el nûmero de conjugados de las distintas fracciones de Percoll usando estas células como diana. El mismo problems, aunque en menor grado, le ocurrla a la llnea G-11 y asl como puede verse en la Tabla 14, vimos una amplia variacién en el nûmero de conjugados de los diferentes expérimentes realizados. Con respecte a la actividad citotéxica NK, hablamos visto como las fracciones con células con un alto porcentaje en LGL, presentaban también una alta actividad citotéxica fren te a todas las células diana ensayadas con nula actividad cito téxica en fracciones de Percoll de alta densidad y bajo porcen taje de LGL (Tabla 14 y 15). Como en las fracciones de alta densidad el porcentaje de conjugados aunque bajo no es despre ciable, aunque si su actividad citotéxica, quisimos comprobar si con mayores tiempos de incubacién del ensayo citotéxico po drlamos detectar una actividad citotéxica en dichas fracciones. Experimentos realizados con 18 horas de incubacién frente a todas las células diana marcadas con ^^Cr, nos indican que aun que los niveles de citotoxicidad son mayores con respecto a los I l l . observados en ensayos cortos de 4 horas, seguimos sin detec- tar ninguna actividad citotéxica en aquellas fracciones de alta densidad y bajo porcentaje de LGL (Tabla 16). Estos ex perimentos no pudieron realizarse usando la llnea tumoral MOLT-4, debido a la alta suelta espontSnea en el ensayo de 18 horas. De todos estos experimentos podemos concluir: a) que la célula que principalmente forma conjugados con todas las llneas tumorales estudiadas tiene morfologla de LGL ya que si£ temas que enriquecen en estas células también enriquecen el porcenta je de c'élulas formando conjugados y b) la célula LGL también es la célula efectora citotéxica ya que los mismos si£ temas de enriquecimiento en LGL aumentan grandemente en su ac­ tividad lltica frente a células diana. Es decir, la célula efectora en citotoxicidad espontânea es en su mayorla un lin­ focito grande y granular. Por ûltimo, cabla la posibilidad de que la alta ac­ tividad en las fracciones de baja densidad y muy ricas en LGL fuese debido a que de alguna manera hubiéramos eliminado una poblacién que interfirese negativamente sobre la actividad ci­ totéxica NK. Para probar esta posibilidad, las células de las fracciones de baja densidad fueron mezcladas con células de las fracciones de alta densidad y de esa manera ensayadas en su actividad NK. En dos experimentos representativos de la g Hu I § i § I04 MQ § gI % C4fHTfes (M1 tH tH tHEh CM SS ss V r- r~orH M o>1 mX tH 0: « tH tHen < O z z V d HT tHHEhH tnM tH 00q C4tH 1o tH H m HH 1 tH tH rH 2 O en ro 3 o ro o m o tHtH o roro tH tH o 11 in tHes en tH 04 Vvo tH rHin vo O es VX tH VOen o 04 tH04 tH m0)tH m)p Oc Eho•H MU 10 ro VOU •Hn) 3M 1-4 k 1 o O e0 ou 0)10 C enw eu 10«M TJen 10c 10 ü o tH PM tH (0(U eu E3«p eu 10TJ C1010 •HUl C TJ4) 3tH en(0 e0 10P TJ tHO ■0 3p O tHVU0) >1 ü10 rH iH en3 rH eu rH o p CVU o c vou p eu •Heu p Oen Pt eu 10(U «p PP eu H 3c T) TJ TJ0)M O en eu (U 3 <0 TJ jC CTJ H en10 p 10 10c P PO O p 0 C ü C x:en o01 •ri o 00eu TJ tH tH X(0 eu 2 euP p TJO C TJP eu 10 0 H TJ > m TJ ■ri 10 o 10 o enp P •H c H tr X euü • VOO c P Cü 3 O 33 Peu C C4-J eu O eu tir 1 ! 3 Tabla 17, se observa que no existe ningûn tipo de inhibicién de la actividad citotéxica en las fracciones de baja densidad tras mazclarlas con células de las fracciones de alta densi­ dad, lo que élimina cualquier efecto supresor de estas células sobre la actividad NK. III.2. DEMOSTRACION DE QUE LAS CELULAS EFECTORAS EN NK PER- TENECEN A LA MISMA POBLACION QUE LAS CELULAS EFECTORAS EN ADCC. Las células efectoras que median la actividad citotô xica NK y ADCC tienen gran cantidad de caracteristicas comunes (132) ya que ambas tienen: a) receptores Fc(7S),con baja afi- nidad para los hematîes de carnero (células "null" y T^) y b) una misma distribucién a través de los distintos ôrganos lin- foides: érganos como el bazo o la sangre periférica presentan actividades citotôxicas NK y ADCC mientras que ambas activi- dades estSn ausentes en timo y amîgdalas. La similitud entre las células efectoras de ambos si£ temas nos 1levé a investigar si la poblacién efectora en NK y ADCC podrîa ser la misma, aunque llevando a cabo la citotoxi- C o o O rH tH H X X m rH O in m 0) 04 O r- <0 rH 1 (d M >1 p o■f UH vo 0) x: «M 1 (d C 10 P 00 Et rH 00 o 04 rH 0) ü S ü rH P r- r̂ rH 1 *d 01 u 10 p 0) vp 0) â < Id

r- O 01 •H 0 tH VQ) O p o t7 vp M rH C > 01 O ro H vo 04 rH O P Et 04 01 tH ü U H m in 04 Id 01 X tH < •H 1 rH rH rH 10 TJ tn tn M Ü C 10 tH C Q o tH O t T 04 o> p U o rH E3z BDijpadsg pepixo jo jjo % Figura 13 121 lulas competidoras. Células competidoras llevando receptores Fc(7S) pued^ unirse a las células diana marcadas y por lo tan to protegerlas de la posible posterior unién de la célula efec tora. Asl nosotros examinamos la presencia de receptores Fc(7S) en las diferentes células células competidoras empleadas. Mien tras que el lOOJI de las células K562 tenlan estos receptores, la llnea E-14 carecla de ellos (Tabla 18). Esto nos indica que aunque la inhibicién de ADCC por K562 pueda ser debido a la in teraccién a través del receptor Fc(7S), la inhibicién p6 r E-14 no puede ser debida a este mecanismo. Finalmente, si las células efectoras que median ambos tipos de citotoxicidad fuese las mismas, es de esperar que cé­ lulas diana que compitan en ambos sistemas lo hagan induciendo similares porcentajes de inhibicién. Como se ve en la Tabla 19, similares p>orcentajes de inhibicién son obtenidos en sistemas NK y ADCC después de la adicién de diferentes cantidades de E-14 III.2.2. Experimentos de adsorcién. Si las células efectoras en NK y ADCC fuesen la misma poblacién celular, adsorcién de células NK sobre monocapas de células diana sensibles a NK resultaria en una simultSnea eli­ minacién de células K, efectoras del sistema ADCC (Fig. 14). Sin 122, no OL < JO Figura 14 123 . TABLA 18 PRESENCIA DE RECEPTORES Fc(7S) SOBRE LAS CELULAS TUMORALES EMPLEADAS COMO CELULAS COMPETIDORAS Células % de células formando rosetas K562 100 CHANG 0 E-14 0 ALAB 0 MSB 0 124 . TABLA 19 CAPACIDAD INHIBITORIA DE LAS CELULAS E-14 EN LOS SISTEMAS NK y ADCC Exp. N®de células anadidas % de NK inhibicién ADCC 1 5 20.3 24 .6 15 25.1 24 .7 36 42.3 46.3 2 5 25.1 21.2 15 38.8 41.4 36 53.5 55.7 3 5 16.4 9.3 15 25.7 20.2 36 34 .4 36.8 4 5 32.3 38.2 15 44.4 38.2 36 63.5 76.3 Cantidades crecientes de células (desde 5x10^ hasta 36x10^) competidoras frias E-14 fueron anadidas a un n® constante de células efectoras (2.5x10^) y células diana marcadas con ^^Cr (5x10^) variando la proporcién de las células efectoras sobre el total de las células diana desde 25:1 hasta 6:1. La celula citotéxica del ensayo NK es la K562 y en el ADCC es la Chanq con anticuerpos. El % de Inhibicién se calculé como: % citotéxicidad especifica en presencia de células diana frias/ % citotoxicidad especifica sin células competi­ doras) X 100 125. embargo, el primer problema con que nos encontramos fue la ne- cesldad de obtener monocapas reslstentes y confluyentes de cé­ lulas diana sensibles a NK dado que ninguna de estas células crecen adhérentes al plSstico o vidrio. Para ello desarrollamçs una técnica de formacién de mo­ nocapas de células tumorales no adhérentes unidas a un soporte sôlido (209). Como puede observarse en la Fig. 15, las células diana K562 se unlan a través de una lectina, como la PHA, a un soporte constltuido por hematîes de polio previamente pegados al plSstico con poli-L-llsina y glutaraldehido. De esta manera, se formaban monocapas de células diana lo suficientemente estables y confluyentes para poder adsorber, sin grandes pérdidas inespe- cfficas, células efectoras. Una vez resuelta la formacién de monocapas, buscamos las condiciones éptimas para la eliminacién de células efecto­ ras en NK. Como puede verse en la Tabla 20, linfocitos humanos fueron adsorbidos sobre K562 o sobre monocapas contrôles (cé­ lulas de ratén P815) y la adsorcién fue monitôrizada por el nû mero de células recobradas y por la actividad NK en la fraccién no-adherente. Monocapas de K562, pero no de P815, son efectivas en la eliminacién de la actividad NK, con mayor eficiencia cuan do la plaças son centrifugadas (5 min. a 900 rpm) e incubadas por cortos perîodos de tiempo. En estas condiciones, la activi- 126 o < < Jw z X < oQ < a. X D.cuQ w< u J Qtx tn Q W< < Q WU J z WO =) -) W t-iZ J H Ho w a, cc ^z u O oz Cu wo O Xz Fiqura 15 127 o (N in 00 m\D If» VO O vo 00 00 00 00 O» in 00 co vo VO 0\ oo co en Ov CO 00 00 o« 'c 2 2 'c *c 2 2 2 •H H •H •H ■H H •H ■riE E E E E E E E o o o o Q o o Vf» n vo OV 0-4 m C c c C C C C Cc o o <0 o o o <5 Oo •H •H •H H •H •H •H ■ri •H U U U u U u U U O •0 10 10 <0 10 3 3 3 Vt Si Si Si Si J3 JQ Si J3o 3 3 3 3 3 3 3 3 « U O U ü ü U U ü *0 C c c C C C C C10 C c C •H H •H •H •ri •H •H ■H •H ■H •H 0) e E E + + + + + + + + u o o o C c C C C C C Co n vo o> O o o o o o o K> 4J •H H ■H •H -H H H ■ric U ü u ü u U U U 0) C c C 10 10 10 ■0 10 3 3 3 •H O O «o 3' 3 3 3 3 3 3 3E -ri •H H 3 3 3 3 3 3 3 3-H U U U «M «M VM «H «M «M•o iO 10 10 •H •H •H ■H •H •H •H •H 0) Si J3 4 M M M V4 M W P Pu 3 3 3 4J 4J ■p ■P 4J ■Po U U u C C C 3 c C C C M C C c (U 1 r4 ^ 1 1 in 1 o Qi to If) a r i c 13 to 0) o4J c tr D •H oin fN u in O: to m 0-4 — O - CO 0Q.1 2 ̂ o *- O Ioco -ï”o CM I O SO DJXOlO ' . I Q S O p s 3 n [ u O Q ^ Figura 17 137 » (fi (D X "O •o M (fi m M (0 H (V 3 3 (fi rt 3 D) rt O n> 01 M • 3 f 3 W H- ft (fi O H U) p) z (-• ? P* t» X o in fi- as M (O < O 01 0, m H* rt O rt P* t-" CL n> »-• (fic oo o H rt O o> r-* r i Kl M \ o M ro w O 3 (fi ’O (fi (fi M o M 01 C rt (-* *0 C pl 0 p. 01 M H- O Pl CL (fi P. (fi 3 0 M M M rt 01 01 M O M PI pl 1 (fi 3 M 00 OI (fi 3 -Q » 1+ 1 1+ 1 1+ o M ro M M o CL CL (fi z (fi H- o OI ro L» Ml 3 c O n O O M 3 (fi (0 M M H 3 CL o H* M o C rt 3" H to «q (fi (fi 1 Ol 1 O 1 00 z pi D> M 1+ H- 1+ y o, (fi r-* H M 0 "P 3 01 (fi rt in ro •ta M (fi o M- 01 H- O rt P. Ml O O c M Kl I-* M rt 0» (fi Kl M 00 en OI ro O M X a O 00 Kl lO •ta 00 en H (fi 3 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1 n O ■K A. lo Kl M o M o 0 rt M- '9 o 0) K 3 O •ta. Kl •ta 00 o z (fi O (-13 C o G c •P & W eo w eu X oo O Pl 00 (jj o o ro M > 0) CL o o (fi pl 1 iK o 00 M o H o o 3 (-• 01 1+ 1+ 1+ rt 1+ Z (o tn C lia. w en •ta M td 3 T3 o (fi O O O os M ro M M 3 O O 01 (fi H* 3 O M rt G o (fi PI ro ro ro H* o O 'O 1 M (fi a OI (-* ~j Kl (fi (fi ■K en vo 00 00 VO G 01 CL M (fi (fi H w Z 3 z 8 rt o 9 8 o PI O o 3 3 CL Hc 1 w eu eu O ►9I-* C M M O pi UQ 3 en en ro Z to pi 3 eu 3 a rt (fi o (fiCL 0)H- Ul PI rt G I G G KJ 138. con 10 U. de IFN, un tiempo mînimo de 30 min. es necesario de contacte entre la cëlula y el IFN para que la activaciôn tenga lugar. Para estudiar si con tiempos mâs cortos de contacto de la célula con IFN logramos activaciôn NK, incubamos las células durante sôlo 5 min. con el IFN, dejândolas luego en incubaciôn a 37®C durante diferentes périodes de tiempo (post incubaciôn). En la Fig. 18, mostramos como tras la preincu- baciôn con 10 U. IFN durante 5 min. y una postincubaciôn de las células durante una hora, logramos un aumento de la actividad espontfinea. Este tiempo de incubaciôn tras el tratamiento de la célula con IFN, puede ser mayor o menor segûn la concentra ciôn usada. Asî, cuando la concentraciôn de IFN se aumenta, tiempos de postincubaciôn mSs cortos (15 min.) son suficientes para obtener un aumento de la actividad citotôxica NK. Es de- cir, a mayor concentraciôn de IFN, menor tiempo de postincuba- ciôn es necesario y viceversa (Fig. 19). Por éltimo, estudiamos si era posible la activaciôn de la célula NK por IFN una vez que la formaciôn de conjugados ha bîa tenido lugar. Para comprobar esto, anadimos IFN a conjuga dos que ya habîan sido formados, estudiando luego si veîamos un aumento del némero de conjugados citotôxicos. La Fig. 20 claramente indica que en estas condiciones no habîa aumento en 1 3 9 . . Om 1 “ «o o Q o p olO ^ co M B3i|iDads3 pBpixojojîo ^ fO c.2 Q *2 o+-» u Q .1 O j2 0) oco T OCM -ro jf 01 lO p-o *- o - ro so3ixo|o^|0 sopBBnfuoo% Figura 18 Figura 19 ■ CO 3 k— 0 0 0 4 O -o omo -(O m CM O - o o -coo. CM U. lOc>o« - o o o oo r-\ %n (0 oQ. Ea> co es *- so3ixo)o^ig sopeBnfuoQ Oy 1 4 1 4o 0 0 5 3.5 figura 20 142 el porcentaje de conjugados citotôxicos, comport5ndose las côlulas como contrôles no tratados. Esto parece indicar que la formaciôn del conjugado puede prévenir la posterior acti­ vaciôn del linfocito por concentraciones bajas de IFN. III.3.1.3. Efecto reversible_de_la_acciôn_del_IFN sobre çë- lulas_NK. Para estudiar si el fenômeno de la activaciôn por IFN era reversible, los linfocitos fueron tratados de tal modo que les inducîamos un aumento de la actividad NK por IFN, con 10 U. IFN durante 60 min., y luego lavados e incubados durante lar­ gos perîodos de tiempo a 37“C en medio de cultivo. Tras 3, 6 6 9 horas de cultivo, las células eran ret_i radas del incubador y ensayadas usando la técnica de conjugados citotôxicos o por suelta de ^^Cr, para comprobar en qué momento dejaban de estar activadas por IFN, En las Flgs. 21 y 22, vemos como mientras que a 0 6 3 horas hay diferencias entre las célu­ las contrôles y las células tratadas con IFN, éstas dejan de existir cuando la incubaciôn se mantiene por 6 ô mfis horas, lo que nos dice que los linfocitos han dejado de actiyarse por IFN. Si estas células que tras activarse por IFN han vuelto a su II- nea base, fuesen de nueyo incubadas con una segunda incubaciôn 143 con IFN, verlamos, como nos muestra en la Fig, 23, que de nue- vo se mantiene la capacidad de aumentar la actividad citotôx^ ca en NK y que una vez mSs este aumento es reversible. III.3.2. Aumento de la actividad NK por IFN en diferentes sub­ poblaciones linfocitarias. Ill.3.2.1. Sgparaçiôn de subgoblaclgnesen funclôn de los mar- Dado que la poblaciôn efectora en citotoxicidad NK se encuentra repartida entre diferentes fracciones celulares segûn se separen, bien por marcadores de superficie (T^, "null"), bien por diferentes densidades de las células (fracciones 3 y 4 de Percoll), investigamos si la activaciôn por IFN era llevada a cabo por alguna fracciôn determinada o si por el contrario en todas las fracciones donde se encuentraba dicha actividad cito­ tôxica se podla detectar activaciôn por IFN. Para ello separamos los linfocitos de sangre periféri­ ca de acuerdo con sus marcadores de superficie en células T y no T, siguiendo la esquema de la Fig. 3 , o en base a la presen- cia de receptores Fc(7S) en células Fc(7S)^ y Fc(7S)~. I'iA (/>OU Xo o oT3 (0D) .2 **E* o ü IFN30- 20- 10- 0 0.5 3 30- 20- IFN 10 0.5 IFN r n0 0.5 IFN 0 0.5 3 T ie m p o (h ) Figura 22 145, 30- IFN 20- 10-CL 12:1 25:1 501 30 IFN20- 10 IFN 12.1 25:1 50:1 12:1 25:1 50:1 Relacion E !D IFN 12.1 25:1 Figura 23 14 % Conjugados Citotoxicos -A K)o o_J____ L_ 0 01 (O- I CD pr \ T1 Z ' I 3T3 O 3- O“t0)(/> W -* roo o —I_________L_ COO _JL_ O i o Ü1 ►► w 00 r r 2 *nz I o> 3* O_JU_ roo _ l_ W fko o _1_______ !U O Ü1 CO \ o 3" roo o COo o 0-1 o Ü1 — ►*- >■ CO 00 rr Ficmra 2 3 147. Cada una de las subpoblaciones asî como los linfoci­ tos totales fueron tratados o no con IFN y ensayados frente a K562 marcado con ^^Cr en un ensayo citotôxico de 4 horas. En la Fig. 24, puede observarse como en très diferentes experi­ mentos la actividad NK de las poblaclones T y no T aumenta tras su incubaciôn por IFN. Esto nos indica que en ambas frac clones hay células que se activan por la acciôn del IFN. Cuando estudiamos las fracciones Fc(7S)^ y Fc(7S) , vemos como la fracciôn Fc(7S)^, ônica que tiene actividad cito tôxica, es también la ûnica que se activa por la acciôn del IFN (Fig, 25), mientras que la fracciôn Fc(7S) , que carece de di­ cha actividad NK, no adquiere esta capacidad tras el IFN. III.3.2.2. Separaciôn de subpoblaciones en funciôn del tama- no y densidad en un gradients de Percoll. Hemos separado también los linfocitos en base a su di- ferente tamano y densidad en un gradients discontinue de Percoll (Fig. 11 ). En esta situaciôn veîamos como habîa un aumento en el nûmero de células L6L, de conjugados y de actividad NK en aquellas fracciones de Percoll de baja densidad, mientras que en fracciones de mayor densidad, la actividad citotôxica NK era nula. Pues bien, tomando células de cada una de las fracciones T?— p — ro es T ~ O to n ro 00 lOij'rn 148. - H o I c z U. z U. ffl Figura 25 149. OOO oo o T' 'ü- (/) — N UI Z ^ _l CQI Û - oco in CM o CM in in zoi / 1 n Figura 24 150. de Percoll, las tratamos o ’no con IFN y las estudiamos en un ensayo citotôxico de 4 horas trente a células marcadas K562. Vemos en la Tabla 24 como todas aquellas fracciones que tenîan actividad citotôxica NK aumentaban su actividad tras el tratamiento con IFN, mientras que aquellos linfocitos de fracciones como las 6 y 7 que carecîan de actividad NK no eran capaces de adquirirla tras el tratamiento con IFN. El conjunto de todos estos experimentos nos indica que el IFN actûa aumentando la actividad citotôxica espontSnea en todas aquellas poblaciones que presentaban actividad cito­ tôxica previa, mientras que en poblaciones que carecîan de di­ cha actividad citotôxica, el IFN no era capaz de inducirla. 152, TABLA 24 CITOTOXICIDAD ESPONTANEA DE LAS DISTINTAS FRACCIONES DE UN GRADIENTE DISCONTINUO DE PERCOLL INCUBADAS O NO CON INF Fracciôn Unidades litlcas x 10 cel. Total 22.0 (4-87) Total + INF 112.1 (18-400) 3 154.7 (60-250) 3 + INF 484 .8 (134-1300) 4 44.7 (11-120) 4 + INF 171.2 (106-600) 5 1.6 ( . HEK/ENBERG y L.A. HERZENBERG (1978) En: "Handboolc of Experimental Immunology". Ed. D.M. Weir, Blackwell Pub. 24. J.A, GALLY (1973) En: "The Antigens" Vol. I, pp. 162, Ed. M. Sela, Acad. Press, N.Y. J. OUDTN (1966) Proc. Roy. Soc. Ser, B166, 207. '6. J. Oil) JN y p . A . CAZENAVE (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA r - ? , 2 ( > ' . . 177, 27. H. HF.NGARTNER y T. MEO (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75» 4494. 28. N. HOZUMI y S. TONEGAWA (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 3629. 29. P. GOTTLIEB (1980) Molec. Immunol. 17, 1423. 30. A.J. CUNNINGHAM (1976) En; "Generation of Antibody Di­ versity". Acad. Press, N.Y. 31. M. COHN (1974) Progress. Immunology 1 ^ , 261. 32. G . MOLLER (197 3) Transplant. Rev. 14. 33. J.J. MARCHALONIS (1975) Science 190, 20. 34. D. KATZ (1977) En: "Lymphocyte Differentiation, Recog­ nition and Regulation". Eds. F.J. 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