UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María Julia Buján Varela Madrid, 2015 © María Julia Buján Varela, 1981 Histobiología de la grasa parda. Acción de la hidrocortisona sobre el tejido adiposo pardo. Efectos cualitativos y cuantitativos Departamento de Histologia Marla Julia Bujân Varela ■lllllllllll * 5 3 0 9 8 5 5 9 9 4 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE n r HTSTOBIOLOGTA DE LA GRASA FARDA. ACCION DE LA HIDRGCORTISONA SOBRE EL TEJIDO ADIPOSO PARDO. EFECTOS CUALITATIVOS Y CüANTITATIVOS Departamento de Histologla Facultad de Medicina Universidad Complufcense de Madrid 1981 B IB L IO TEC A 0 Maria Julia Bujâu Varoia Edita e imprime la Editorial de la Universidad Complutense de Madrid, Servicio de Reprografla Noviciado, 3 Madrid-8 Madrid, 1981 Xerox 9200 XB 480 Dep6sito Legal: M-13968-1981 Autor: MARIA JULIA QÜJAN VARELA Tltulo: HIST08I0L0GIA OE LA GRASA PARDA. ACCIQN OE LA HZDRGCOHTISaNA SOBRE EL TEJIDO ADIPOSO PARDO. EFECTOS CUALITATIVOS Y CÜANTITATIVOS. Director: Prof. Dr. D. LUIS ZAMORANO SANABRA OEPARTAfcENTO OE KESTOLDQIA FACULTAD OE MEDICINA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE MADRID 1.980 Volumen I D. LUIS ZAMORANO SANABRA, DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE - MADRID. C E R T I F I C A : Que la Tesis titulada "HISTO BIOLOGIA DE LA GRASA PARDA. ACCION DE LA HIDRO- CORTISONA SOBRE EL TEJIDC ADIPOSO PARDO. EFECTOS CUALITATIVOS Y CÜANTITATIVOS", realizada por DA.MS Julia Bujan Varela, de la que soy Director, reune todas las condiciones necesarias para que su autor, pueda optar al titulo de Doctor en Medicina y Cirugia, por la Universidad Compluten se. Y para que conste, expido el présente, en Madrid, a siete de Julio de mil novecientos ochenta. OEOICATORIA A UI ESPOGO A 1115 PADRES Y ÆRMANOS R E s U M E N El objetivo de este trabajo, ha sido realizar una pues ta al dia de la Histobiologia de la grasa parda, asi como la va loraciôn de la acciôn de la Hidrocortisona sobre ella, Los parâmetros elegidos han sido: CÜANTITATIVOS (peso - corporal, peso del ôrgano interescapular, diâmetro de los adipo- ci'os y numéro de gotas/adipocito) y CUALITATIVOS (estructura, ulrraestructura, histoquimica enzimâtica y no enzim'atica) . Primeramente, realizamos un muestreo segûn las tablas - de numéros alearôrios, estableciendo dos poblaciones: Control, qu no recibia tratamiento alguno, e inyectada, con Hidrocortisona a dosis de 5 mg/Kg peso del 3- al 21 dia de vida postnatal. Estu- diantos en primer lugar, el peso corporal y el peso del ôrgano in terescapular con valoraciôn estadistica, para establecer si exis ten o no diferéncias significativas, mediante tests uni y biva_ variantes, observando que para dichos paramètres no existen dife réncias significativas.entre ambas poblaciones comparadas; y por otro lado existe una fuerte correlaciôn entre ambos parâmetros dentro de cada una de las poblaciones. En segundo lugar, realiza mos tests de comprobaciôn similares a los anteriores, para las dos variables aleâtorias diametro de los adipocitos y n& de .,o- tas/adipocitos, resultando que la hidrocortisona no tiene efec- to significative sobre el diâmetro de los adipocitos, pero s. actua sobre el n^ de gotas, causando una disminuciôn de este nu mero dentro del adipocito al aumentar el volumen de dichas go­ tas . La microscopia de luz nos confirmô la diferencia en - cuanto al n? y tamaho de las gotas lipidicas, asi como un aumen to de mastocitos con degranulaciôn patente en la poblaciôn inyec tada restecto a la control. A nivel ûltraestructural, hernos re sehado las caracteristicas mâs importantes del tejido adiposo - pardo, haciendo incapié en las diferencias anteriores, observa- do un aumento de la coalescéncia de las gotas lipidicas y la - degranulaciôn mastocitâria llamândonos la atenciôn la desapari- ciôn de glucogeno y la presencia de células de tipo mesenquima- toso de marcado caracter macrofàgico que contrasta fuertemente con la poblaciôn control. En cuanto a los patrones enzimâticos de diferentes vias motabôlicas, hallamos incrementados los enzimas comprometidos en el api'ovecliamiento de la glucosa como es la G6PDH, que junto a la disminuciôn de la actividad NADH citoplâsmica y de los depôsi_ tos de glucogeno y aumento de volumen de las gotas lipidicas, - nos indican que Ja acciôn de la hidrocortisona sobre la grasa parda es fundamentàlmente lipogénica. A nivél rnitocondrial hay una depresiôn enziinatica ge neral (SDH, MDH, Citocroino, NADH) expresiôn del bajo aprovecha iniento energético para la producciôn de calor (que es la fun- ciôn mâs especifica de TAP). La via lipolitica (lipasa tisular y Esterasas) esta ligeramente aumentada, indicando la movi1izaciôn de los âcidos grasos 1iberados Puera del adipocito para su posterior aprovecha miento por otros tejidos. Por ultimo, aunque no con resultados definitivos, con firmamos que el enzima Lipoproteinlipasa, encargado de faciii- tar la captaciôn de âcidos grasos al adipocito, se halla aumen tado, hecho que concuerda con la degranulaciôn mastocitaria - observada. De todo lo anterior se deduce que la hidrocortisona a la dosis empleada por nosotros, aumen ta fundamentalir.enla u :ipogénesis del TAP, incremen ando los depositos de IG, con - pérdida del aprovechamiento situ". Dado que esta ultiii.u funciôn mâs especifica del TAP (que lo diferencia del TAB), pc demos aiiimar que bajo la acciôn de la hidrocortisona el a c .po cito pardo vira su biologia de producciôn calorifica, para pu sar a funcionar de forma similar al adipocito blanco, es accir como depôsito y regulador energético a traves del almacenamiente y liberaciôn de âcidos grasos. I I N D I C E VOLUMEN I Pag. AGflADEdMIENTOS • H CONCEPTO HISTOflICO Y ACTUAL 1 INTRODUCCION 77 MATERIAL Y l€TODOB 91 RESULTADOS: ESTRUCTURALES Y ULTRAESTRUCTURALES 109 mSTOQUIMICOS 116 ESTADISTICOS 133 CO&ENTARIOS 197 CONCLUSIONES 234 BIBLEOGRAFIA 240 VOLUkEN II LAMINAS ICONOGRAFIA I - LXXV A Q R A O E C I M I E N T O S Ill Dado el gran dasarrollo clentlflco y la especlallzacldn tdcnlca en los momentos ectuales, el planteemlento de un trabajo de Investlgacldn abarca an general nümerosas facetas que no es poslble réunir en un solo - Departamento de Ihvestigaclân, siendo predso recurrir a los lugares Ido- neos que nos permiten el estudio qua pretendemos realizar. Por ello, a lo largo de la elaboracldn da esta tesis doctoral ha sido precise recurrir a otros Departamentos que deslnteresadamente se han ofrecldo, no solo con sus medics tdcnlcos slno con su aportacldn humane, quexiendo por tanto agrade- cer la cqlaborecldn da todas aqualias personas qua hen contzibuldo a con- - fecclonar este trabajo. Profesor ZAMDRANO SANABRA, director del Departamento da Hlstolo- gla y de esta tesis, el cual ha gulado mis pasos por el conoclmlento Blolo- glco e mstolôglco desde mis comlenzos hasta la actualldad. De slempre, dl sa ha sentldo Interesado par el tema del tejldo - adipose pardo, Inculcando an ml esta afloldn, ellglendolo desde el primer - momento objetivo de ml teslna y ahora tesis doctoral, oxientandome paso a - peso con absolute dedlcacldn y entrega. Da forma tan especial, qua no puede xoflejarse an estas Uneaa, qulero expresar ml gratltud a la Dr* SIMON HUARTE, no solo por su dedica- - ddn y entx^a en este trabajo, slno tamblen por su contxibucldn a ml forma ddn dentlflca y humane, que dia a dia me ofxoce an el leborataxio qua con ella comporto. A1 Profesor J. kERCHAN CIFUENTES, Dr# A. IBANEZ y Dr. OYA qua - con gxvn entusiasmo han dliigldo la pazte electrondcrogréflca s Interpréta tiva. A todos mis oompaneros de este Departamento de los que constante mente he soUdtado apoyo, bxindandomelo siempxe coxxllal y deslntexesadamen te y en especial a D. Joaquin RODRIGUEZ, qua tanto an la dotacldn de mate­ rial, como con su eyuda personal, ha contribuldo. A1 Profesor TAMARIT TORRES, director del departamento de Flslolo- IV gia General rue slempre:ha mostrado un gran Interes personal por el tema, asi como a sus colaboradores, en especial a 0, Af̂ TOflIO GONZALEZ, que ha sido parte fundamental en el dlseho y elaboraclân estadistica de este tra bajo y al Dr, MARTINEZ CQNDE, que deslnteresada y cordlalmenta ha colabo- rsdo en la parte bloqulmlca y puesta a punto de la Llpoproteln-llpasa, Qulero manifester aslmlsmo ml mâs profundo respeto y ceiino al Prof. JEAN VAGUE, director de la Cllnlca Endociinolôglca dsl Hospital Unlversltario La limons de Marsella, el cual me ensend los secretes del tejldo adiposo en su parte cllnlca y acHpoclmâtxica, ponlendome eislmlsmo en contacte con el Prof. Agregado de Anatomla Patolâglca de dlcha facul— tad, Dr. A. CHAMLIAM, que me Inlclâ en la disciplina Histoquimica, ha--- clendome participe de sus conoclmlentos. Tamblân qulero manifester ml gratltud a 0. Miguel MARIN OIA^ RAQUE por su contxibuclân deslnteresada en la parte mâs laboxiosa de este ti^bajo, asi como a 0> Ehcamacldn RODRIGUEZ, por la px^paracidn y obten- cldn de muestras electx-omlcxnscâplcas. r\ A. HEFEZ LtHT, D« M.'S. CAk'POS y D« M. C. GALLE GO, por: su ayuda en la transcrlpclân de este tx%bajo. A CA3AOO y OUINOFER del grupo centx^l de fotograflo del Hosp^ tal Cllnlco por su colaborecldn Iconogx^flca. Por dltlmo, al Dr. GARCIA-PUErJTE, colaborador en la confec-- clfin de estos ejemplares. C O N C E P T O A C T U A L D E L T E J I D D A D I P O S O P A R D O A peser de haber pesado més de tresclentos anos desde su primera descrlpcldn, la grasa parda slgue siendo tan desconoclda y desgrdolada- - mente tan Ignorada, sobre todo dentro dsl campo clentlflco médlco que po- demos deflnlrla de entreda como: "EL drgano mâs desocnocldo y odsterlo- - so de nuestro organlsmo”. SI blën algunos de sus aspectoe morfoldglcos y sobre todo fünclo- nales estân siendo esclareddos, todavla son tentas las lagunas, tantas - las Ideas e hlpâtesls que nos bullen en la cabeza ndentras vamos compren- dlândola, que pensâmes que en esta tesls nos quedaremos muy cortos con - nuestras aportadones, pero que ya hafaremos oonseguldo un primer objetivo - si logramos Interesamos e Interesar en su problemâtlca a la clenda mâdlca. De nues tra revlslân dbllogz^flca hemos podldo dedudr que - todavla desconocemos muchos aspectoe del compcrtamlento blolâglco del tejl do adiposo pardo, asi slgulendo el orden expuesto posterlormente en el capl ^lo slgulente, nos encontramos con los slgulentes puntos confllctlvos: 1#,- Aûn no podemos afirmar taxatlvamente la procadendia embloldgi- - ca del tejldo adlposo pardo, nl las relaclones embtioldglcas con el tejldo blenoo o la capcKd.dad de dlferenclaclân a Involucldn de una a otra vaziadad adlposa. Par otro lado, Icteas da antlguo consoUdadas como la Incepacldad mltûtlca del tejldo graso adul­ te, nuevamente esté replantaândose lo que nos hace considérer - bajo otro enfoqua los camlnqe da creclmlento y regeneraddn del drgano graso. 2*.- Aunque parses bien deflnldo que el necanlsmo de producdài cald- rlca de la grasa parda, (raego que la aleja morfoldglcamente y fun clonalmente da la grasa blanca y le da autonomla}, as preclsamente un desacoplandento entre resplracldn y fosforlUzacldn oxidative, todavla se desconocen los mecanlsmos Intlmos de tel desacoplamlen- to y sus dltimos responsables. 3B.- Por el momento pareoe roenos confllctlva qulzâs por ser menos es- tudlada la via de aprowohemlento energético para su trensfor- maddn en cal or. Todo su glare qua este aprovechamlento y conver­ sion en oalor se reedlza a tres nivelas fundamentales : ttltocan- drlal, dtoplâsffllco y en membrena plasmâtlca, siendo el oalor - resultants la suma del obtenldo an estos tres nl\^les. 40.- Pero vuelven a plantearse problemas respecte a los mecanlsmos de control an el funclonamlento del tejldo pardo. La mayor parte de las Investlgaclones se han centrado slempre an el papel qua de- sempehan la Noreplnefzina (NE), bien directamenta, bien via ner- vlosa a travée de su rlca Inervadén, pero el papel qua otras - hormones juegân, no ha sido aclarado sufIclentemente, encontrén- donos con toda una gran game de Intentes varlados en la llteratu- ra, Y as£, mientraa acclones hormonales como las de la Insuli na estân bastante estudladas, otras como las de los glucocor tlcoldes presentan todavla muchas lagunas y sobre todo, gran parte de los datos bibliogrâflcos son contradictorlos o para ddjicos. Por esta reiziSn nosotros nos hemos centrado en este tema, in- tentando valorar la accldn concrata de la Hidrocortisona en Grasa Par­ da aquellas dosis que hemos considersdo que pueden aclarar las contra- dlcciones y datos paradéjlcos, ectuales, centrdndonos edemds en ratas de edad postnatal (de 1 a 21 dlas) pensando en la apUcaclon que puede tener el presents trabajo en cllnlca humana, as declr en pedlatrla, to da ver que solo en edades Infantiles esté presents este ârgano en la - especle humana, Pero dado que el tejldo adlposo pardo en primer lugar no — suele ser nl objeto de Interés, nl bien conocldo, en la rama mâdlca; y sobre todo porque su problemâtlca supers con mucho los planteamlentos de nuestra tesls, nos ha parecldo oportuno comentar un poco ampllamen— ta en el capltulo de concepto, una revlsldn hlstdzica de este tejldo — eém a costa de alargar esta parte y de sallmos de nuestro tema estzic to, hecho que, por otro lado, nos va a parmi tir centztqrlo Idéneamente. Asi pues comenzaremos por preguntarnos: ^Qua as la Grasa Parda?, iCual es el conoclmlento qua de ella tenemos?. A lo largo de la Hlstorla, el tejldo adlposo pardo se le han ido aslgnondo numérosos papales. En el aho 1.949, Rasmussen y Johansson, reconocleron cuatro momentos estslares con respecto a la Interpretacldn del tejldo. 1#.- 1.870 - 1.817, el tejldo adlposo pardo es considérado cùmo — parte del tlmo. 2#.- 1.017 - 1.863, el tejldo adlposo pardo se Interprets como una glândula endocrine, y por algunos autores como un drgano actl VO en la formacldn de la sangre. 3®,- 1.863 - 1,902, la grasa parda es considérada como une forma modificada de grasa blanca, sirvlendo de almacen de substan cias allmenticias. 4#.- 1.902 - 1.961, en que el tejido pardo es considerado de nuevo como un érgano endocrino. Actualmente es posibla anadir un quLnto periodo: 5®.— 1.961, hasta nuestz*os dlas, en el que el tejido adiposo pardo es interpretado como un agente termogénico, esto es, un tejl do con la fimcldn de calentar la sangre cuando pasa a su tra vds y con ello contrlbulr al mantenlmlento de la temperature corporal. Smith (3), Ball y Jungas (4), fueron los prlmeros an demostrar claramente el tejldo adlposo pardo es el lugar de termogdnesls; pusleron de manlflesto la diferencia fundamental entre las propledades alslantes de calor y almacenadoras de grasa del tejldo adlposo bianco, y la capacl dad productora de calor del tejldo adlposo pardo. Su descubrimlento ha estlmulado la Investlgacldn hacla la Bio qulmlca y Flslologla del tejldo adlposo pardo. Esto se refleja en el gran ndmero de trabajos sobre varlos aspectos de este tejido. Terminologie: El térmlno tejldo adlposo pardo, as el mds comun mente usado, pero desde 1.920, sa han vanldo utlllzando diverses nombres, como: Gldndula de hlbernaclon; grasa parda; tejldo adlposo multllocular; tejldo adlposo glandular; glândula llpldlca; gldndula colesterlnlca; gldn dula embrionarla; tejldo adlposo en formacldn; grasa primitive y gldndula Interescapular. Esta profusldn de térmlnos y el hecho de que la mayoria de elloa seen descrlptivos y morfoldglcos no deja de indicarnoe un mal conocimien to de esta estructura y sobre todo incertldumbre en la evolucldn del te Jldo. Nosotros lo dasignaremos con las slglas TAP de tejido adiposo - pardo, y con los de TAB nos referimos al tejido adiposo blanco, equlvalen tes en inglôs BAT y VHAT respectivement e. El problems de su orlgen embrioldglco y ontoldglco Desde el punto de vista embrioldglco parece totalmente preesta bleddo que el tejldo adlposo, en sus variantes blanca y parda, procédé de la hoja embrionarla masoddrmlca a travée del mesdnqulma con diferencia cldn subslgulente de este, si bien no existe nlngdn trabajo embrioldglco en edades tempranas que justlflque plenamente este hecho. Par otro lado, no existe acuerdo entre los diferentes autores respecto a si el tejldo blanco y pardo, tlenen una mlsma procedencla del mesdnqulma con vlas llpogendtlcaa Independlentes, o si el tejldo adipose pardo, vlene a suponer el estudio embrlonarlo o Inmaduro de tejldo adlpo so blanco. Dado, por tanto, que nd podemos en princlplo separarlos, empe zaremos por abordar conjuntamente el desarroUo de ambos para despuds mos trar las aportadones que la llteratura nos legs de la llpogdnesls del — tejldo adlposo pardo concrets y exduslvamente. Se vlene adraltlendo que tejldo adlposo blanco y tejldo adlposo pardo derlvan del mesodermo a tiravés del masdnqulma embrlonarlo. El prime ro en plantearse el problems de su orlgen fud Flemming en el ano 1.870, y desde entonces hasta la actualldad podemos declr que se han establecldo tres hlpâtesls llpogenâtlcas, encabezadas respectivamente por Flemming - (5,6,7), Toldt (8) y Hammer (S), y los estudlos de los demâs autores, a ûn los mâs reclentes, no han venldo ipâs que a corroborer una de esas tres hlpâtesls, sln llegarse todavla a una posture clara y taxatlva, Flenmdng (1,870 - 1,879), suglrlâ que el tejldo graso dériva dlrectamente del tejldo conjuntlvo a trevés de flbroblastos alargados, - que progreslvamente Irlan cergândose de gotas lipidicas. Apoyan esta pos tura autores como Bail (lO), Foot (il), KOlllkerr (12) o como Robin L.R. Van y cols. (13), que en 1.87B reallzaron cultives de flbrocltos humenos y de rata, observando que los flbrocltos cultlvados procedentes del estr^ ma del ârgano graso se transforman en adipocitos, mientrès que los proce dentes del tejldo conjuntlvo dârmlco no acumulaban nunca grasa nl se dlfe renclaban, Clark (14), demostrâ que en el desarrollo del tejldo graso, - les célulasc germlnales o adlpoblastos se encuentran tanto en las proxlml dades de les yemas capllares como alejados de âstas, suponlendo, por teir to, que les células madrés no serlan procedentes de los vasos, slnâ que estarlan ya presentee en el esbozo orgânlco prevlamente a su vascularize clân; pensâ que muy bien podrian ser flbroblastos como habla sugerldo — Flemming.' Toldt (1,870 - 1.868), casl slmultdneemente a Flemming, demostrâ la presencia de "células mesenqulmatosas especifIcas" en algunas âreaa de tejldo mesenqulmal, suponlendo que serlan las precursoras del ârgano gr^ so a travée de un estadlo Intermedlo que deflnlâ como "Adipoblasto" : Cé lula estrellada, con acâmulos llpldlcos dlstrlbuldos en pequenas gotas. En nlngân caso vlâ, ni admltlâ, una translclân directs del flbroclto el adipoblasto, slnâ que, por el contrario, oplnâ que los flbrocltos serlan dlferenclaclones distintas de la célula mesenqulmal que jamâs acumularfan llpldos y que solamente acompanarlan estructuralmente a la grasa. od w 3 a to LU i § £ 10 Hammer (1.095) ernitld una tercera hlpdtesls y ademâs le cabe el mérlto a este autor .do diatlngulr, por vez primera, dos caminos llpogdnl cos independientes pare el tejldo adipose bianco y el tejido adiposo par do y establecer sus relaciones embrioldgicas. Para Hammer primero sucederla la formacidn de loa llamados "dr ganos grasos primitives". Estes son formaciones reticulares, mds o menos densas, constituidas por cdlulas mesenquimatosas qua van siendo invadl̂ - das por yemas vascularas, que gradualmente irlan ramificdndoso y capila rlzdndose. Dichos centres pueden ser de dos tipos. Unos altamente or^erd zados y lobulados que podemos considerarlos come les precursores del ta jldo adiposo pardo, y otros con un nivel de organizacidn manor, precurso res o esbozos del tejido adiposo bianco. Aunque las mecardLsmos lipogendticos son similares en ambos cen tros, estes difieren en su organizacidn, caminos inductores de diferencia cldn, velocidad de crecimiento y maduracidn, y al final tente la estructu ra como al sentido funcional serdn también diferentes. En embos centras el responsable de la diferenciacidn, para Hara mer, es la vascularlzacldn. Acompanando a las yemas vascularea irlan c£ lulaa madrés gresas que se liberarlan en el primitive centro adiposo. - Estas cdlulaa para Hammer serlan elementos endoteliales, y para otros - autores pericitos o cdlulas reticularea emigradasi, en suma elementos del llamado "Sistema retlculo endotelial", mientras que las cdlulas mesenqui maies sdlo serlan soporte y evolucionarlan al tejido conjuntivo circun - danta de la grasa. Los elementos precursores de la grasa o adipoblastos tienen un aspecto alargado o con groseras y cortas prolongaciones y tie nen como signe distintivo el ser vacuoladas, con escasas veslculas de - contenido graso. Cuando estas elementos asientan an un drgano primitive graso reticulado originarian cdlulas multivacuoladas del tipo pardo, si, por el contrario, asientan en un drgano poco reticulado dardn adipocitos blancos. (ver esquema l) 11 Esta teorla de Hammer ha sido apoyada mûltlples veces en la 11 teratura; Levl (15), Vtasserroan (l6), Hull (17), Hull y Segall (18) Aherne y cols. (19), Barnard (20), asl como Kolllker (l2) que contrariamente a Clark (14), observd la aparlcldn de las cdlulas madrés a lo largo de los vasos sangidneos y sus rames. Es évidents que, aunque las diferentes experienclas vengan a - confirmer una u otra posture, el problems de si la cdlula madré adipogd nlca es al fibrocito, la célula mesenquimal, o cdlulas del S.R.E., tocta v£a hoy sigue vlgente. No obstante, si algo ha quedado suficientementa claro en la 11 teratura son los cambios morfoldgicos que sufke esa hlpotdtica cdlula — primltlva hasta su maduracidn a cdlula adipose. Asf lo demuestran comuni caclones como las de Sickian (21), Simon (22), Bernard y cols. (23,24,25), Skdla y cols. (26,27), Flamark y cols (28) y Dyer (29). Quizd el trabajo mds detallado y que cubre un mayor tiempo de desarrollo ses el de Bernard y cols (30), que eatudian al desarrollo del tejido adiposo blanco, desde al 15 dfa de la gestacldn (6= prenatal) hasta el 30 despuds del nacimien to, haciendo una detenida descripcidn de los dfaa previos al nacimiento 69, 3* y 19, en el dfa dsl nacimiento y dfas siguientes a este: 59, 15 - y 30. Descripcidn que a nosotros nos interesa no sdlo desde el punto de vista embrioldgico y madurativo, sind tambisn, como punto de referencia comparativo de nuestro material, que corresponde a los tiempos del 59 al 21 dias posnatales, aunque nuestra atencidn se centre en si tejido adipo 80 pardo. En el dfa 6 previo al nacimiento se observa una estructura re ticulada, incipientamante vascularizada y cuyas cdlulas son todavla in maduras. Estas, gradualmente van aumentando de tamano y adquiriendo for ma poligonal; el nûcleo de ser hipercromdtico va evidenciando uno o dos nucleoloa, expresidn de una mayor actividad; los abondantes ribosomes y 12 polirlbosomas libres van hacldndose cade vez menos numerosos y ordendndo se en la periferla de las gotas llpldlcas; el retlculo endopldsmlco pesa de ser escaso y de varledad rugose a ser mds abondante y 11so, siendo — también nuneroso y llamativo su components vesicular; les mitocondrias - al principle relativaments escasas y alargadas van haciendose cada vez - rods abondantes, para alcanzar su mdximo desarrollo es, los dias 15 y 30 posnatales en que llegan a ocupar una parte importante del citoplasma, — el desarrollo de sus crestas es igualmente progresivo y tamblen va aumsn tando la electrodsnsldad de la matrlz, dates en suma indicatives de una gran actividad mitocondrial, ademds, es de senalar que a partir del t w car dla entes del nacimiento empiezan a aperecor en su matriz grdnulos - denses redondeados de 300 A de diâmetro interpretedos por elgunos autores (26,30) como productos de degenerecidn de las membranes mitocondrialee,y por otros autores; como de significacidn desconocida pero siempre presen tes s6lo en edades Juveniles. Finelmente, de forma mds eventual, pueden encontrarse cuerpos mayorea de disposicidn lamelar, suJetas también a con troversias en su interpretacidn. En el citoplasma y de forma precoz, pin den encontrarse depdaitos de glucdgeno que irân progresivamente aumentan do; y por ûltimo, el dato morfoldgico mâs distintivo de la diferenciacidn es la presencia de triglicdridos depositados en forma de gotas o inclusio nés citoplâsmicas, al principio de pequeno diâmetro, aumentarân en ndmero y tamano hasta llegar el nacimiento, momento en el cual se observa una de plecidn brusca coincidiendo con la presencia de vacuoles autofâgicas, que irân desapareciendo del dfa 1= al 30 del desarrollo posnatal, mientras — que si components Ifpido vuelve a incrementarse numâricamente para final mente ir coalesciendo las vesfculas lipfdicas y pasar al estadfo unilocu 1er. De todo ello podemos concluir que la cdlula grasa en su diferen ciacidn adquiere canacidad de reserve energâtica, lipldica y glucogênica, y que los datas morfoldgicos expresivos de tel diferanciacidn son: 13 - Presencia de gotas llpldlcas (triglicéridos] en principle poco nu merosas y pequenas que paulatinamente irân haciéndose mâs numéro sas y luego, tras coalescer, mayores, hecho que ûnicamente se verâ intarrumpido en el momenta del nacimiento indicando una destruc — cidn lipolitica, posiblemente para regular la temperatura basai - bruscamente afectada en el paso temperature intraùtero/temperatura ambiante. —- mitocondrias cada vez mâs abundantes y activas, indicando que es tân implicadas en los procesos lipogenéticos y lipoliticos. Y Jin to a allas un desarrollo de R.E. Liso también comprometido en la lipoliais por su secrecidn de Lipasas. — Rar ûltimo, abondantes dspâsitos de glucdgeno. Es para nosotros, en esta tesia, mâs importante dilucidar lae posiblee relaciones ontogénicas de los dos drgemos grasos: pardo y blanco y aunque Hammer desde 1.89S nos ha dejado planteado un mecanismo indepen diente de diferenciacidn en amboe, han sido muchos los autores que, apoya dos en dates expérimentales han etiquetado al tejido adiposo pardo como el estacHo embrionario de tejido adiposo blanco. Hechos como: La aparicidn de células uniloculares en âreas del tejido adiposo pardo y presencia, incluse de células con imagen transidLo nal; evolucidn de células multiloculadas a uniloculadas en experiencias de denervacidn o viceverea, de uniloculadas a multiloculadas en condicio nés de ayuno, o en adipocitos blancos de bajo contenido graso; y como no, el apoyo de datos embriolégicos que demuestran que para la formaciân del tejido blanco obligatoriamente ha de pasarse por la forma multilocular o morular. Todos estos datos han sido reiteradamente senaladoa en la liter* tura por: Aheme y Hull (19), Hull (17), Napolitano (3l)(32), Rasmussen - (l), Smalley (33), Clark (14) y Vogue (comunicacidn personal), y nos 11^ van indefectiblemente a la idea de que el tejido adiposo pardo, no séria mâs que una forma inmadura de tejido adiposo blanco, aunque tenga funcio nés propias. 14 Sugleren tamblen estas observaciones que el tejido adiposo pardo saria la forma involutiva y degenerativa del tejido adiposo blanco. No obstante, esta idea no es universalmente aceptada, mâs aùn parece que actualmente se tiende a la idea contraria; el mismo Rassmu sen no consiguid en sus experiencias encontrar la transicidn morfoldgi ca entre los dos tipos de grasa. Realizd transplantes de grasa parda - al drgano adiposo blanco, y aunque hubo transformacidn, no se pudo dilu cidar, si esta se debts a un condicionamiento diferencia1 local o a la - simple denervacidm consiguiente a la extirpacidn; Smalley (33}, en sus estudios del tejido adiposo pardo de hamster, encontrd que en zonas ha bitualmente ocupadas por grasa parda en el individuo adulto, podia ha ber células uniloculares en estadios de recién nacido y estas no proce dian de células multiloculares reconocibles, sind que derivan directe mente del mesédquiroa, esta hallazgo es sdlo aparentementa contradicto rio con los descritos en el desarrollo de la grasa blanca, y mâs bien nos viens a confirmar que ambas tienen un origan comûn y que pueden, - coBxistir en determinados momentos pero sin que, par ello, pueda presu mires la transicidn de una a otra; Asf, nunca podriamos considerar al tejido adiposo pardo como la forma embrionarfa del drgano blanco. Napolitano (3l), en su estudio ultraestructural del tejido adi poso pardo de rata en desarrollo en si ano 1.965, confirma esta idea, - al encontrar diferente estructura mitocondrial en los dos tipos de gra sa. Las mitocondrias de les células grasa blancas tiens crestas menos - numéro sas, no orientadas respecte al eje y que no ocupan to de la matz*iz a diferencia con las mitocondrias de células perdas. Igualmente les cd lulas uniloculares encontradas en la regidn de la grasa perde exhiben — diferente;mongblogfa que las del drgano blanco y por ûltimo una refie xidn sobre la funcidn altamente especifica que tiene el tejido adiposo pardo, nos impone la idea de que, desde luego, son drganos diferentes y entre los que résulta dificil admitir un intercambio. 15 Reqeneraclon y Crecimiento Fué Slmdn (1,965) (22), el primero en observer, que en el moroen to en que aparecerlan loa primeros depdsitos grasos en los adipoblastos, estos perdian su capacidad mltdtica. Apoyândose en esta observacién, y o tras subsiguientes, se ha venido admitiendo que el tejido adiposo adulto no tiene capacidad de divisidn celular y que su crecimiento se realizarfa exclusivamente por hipertrofla de un determinado nûmero de adipocitos ya existantes. Posteriores publicaciones demostraron que hasta el primer ano - de la vida puede seguir la diferenciacidn a partir de adipoblastos y en - segundo lugar que durante este tiempo conservan capacidad ndtdtica, mien tras que a partir del primer ano ûnicamente pueden acontecer mécanismes de hipertroffa. Basdndose en esta idea, incluso la patologfa médica con - temple dos tipos diferentes de obesidad (Ferreras) (34): - Obesidad hiperplésica, o infantil, o dificilmente recuperable. - Obesidad hipertrdfica, o adulte o recuperable. Recientemente vienen apareciendo publicaciones, fundamentalmen te de naturaleza autorradiogrdfica, bioquimica y funcional, a travds de - reguladores e inhibidores, que nos dan una nueva y radicalmente diferente idea del crecimiento y regeneraciûn grasa. Lewis y Hayer (1.974), mediante la utilizscidn de timidina tri tiada en el tejido adiposo pardo de ratas, , han venido a demostrar, que las mitosis en los adipocitos pueden observarse hasta en edades adultes. En su estudio, realizado en ratas de 6 a 22 semanas, hacen mediciones con isôtopos radiectivos del indice mitdtico, tanto en las células del estro ma (posible asiento de lipoblastos) como en las células parenquimatosas, observando que en edades todavia infantiles, el marcaje de las células — 16 del estroma es muy alto y medio el de los adipocitos, con el tiempo va disminuyendo en ambos, pero este des censo es aûn mâs llamativo en las células del estroma que en los adipocitos y ademâs en estos persiste el marcaJe, (aunque sea bajo) incluso en edades adultes. Frutos paralelos tiene otros trabajos con isôtopos radiactivos, en los que trâs una (mica inyecciôn de timidina tritiada se va midiendo la disminucidn de concentraciôn de los granos de marcaje por células en tiempos sucesivos, hecho totalmente sugestivo de una actividad mitôtica capaz de dilulr, por reparto, el marcaje. Es de antiguo conocido, que la sfntesis de DNA del tejido adipo so blanco se ve incrementada par la insulina, corticoïdes, suero humano, hormones placentarias de tipo lactôgeno; mientras que disminuye en condl clones de ayuno y trâs la inyecciôn de dlabetôgenos como, si Aloxân, res tituyéndose en estos casos con la inyecciôn de insulina. Oltimamente Ha yes, ha demostredo la disminucidn en la incorporacidn de timidina y por lo tanto de la sfntesis de DNA al administrer Fenfloridina. Finalmente , otros factores, como la Triiodotironine, la Melanotonina epifisaria (36) hormones sexuales y esteroideaa, pueden producir un crecimiento graso por hipertrdfia. A la vista de todas estas aportaciones, aunque autores como — Afzelius (37), no adraiten la idea y sugieren incluso fallos técnicos, pm race obvio considérer que el crecimiento y regeneracidn del tejido adipo so se hace por mecanismos de hiperplasia a los que se pueden sumar otros de hipertroffa, y dentm de la hiperplasia pueden participar en primer - término los lipoblastos persistantes en el estroma y (aunque en menor — proporcidn), los mismos adipocitos diferenciados y adultes. Siendo es te mecanismos de hiperplasia mâs acentuado en edades juveniles pero tam bién realizado en la edad adulta. 17 Evolucidn flloqenétlca y su slqnlflcado Aunque no hay Indlclos de una termogénesls /hibernante real mâs que en los mamfferos e incluso no se ha demostredo la existencia de grasa parda mâs que en estos animales, se viene considerando que esta drgano, tiene su asiento entra los homeotermos (avea y mamlferos} y que as posi ble que sus predecesores mâs remotos saan los reptiles pérmicos y algunos peces primitives como los selâceos. Incluso sa ha tratado de buscar drga nos y tejidos con similütudes morfoldgicas y/o funclonales en seres info rlores en la escala filogandtlca, como en los mismos insectes, El primer esbozo comparable funcionalmente con al tejido adiposo pardo, dentro de la escala filogendtica, ha sido descrita por Taranov y — Hess, en las AQEJAS, en el capitule relative a aspectos {dlogendticos del tejido adiposo pardo del texte de O.Lindberg (3B},^exto del cual hemos - tornade gran parts de los datos histdticos del tejido adiposo pardo, refis jados en nuestra ravisidnQque siendo animales poiquilotermos son espaces de aumentar sus procesos metabdlicos para llegar a su temperatura dptioa (20 a 24*0), pero no es conocido el métabolisme intime de esta proceso,pu diendo dabarse a una produccidn de energia muscular o a un pmceso de ter fflogdnesis no hibernante. Oe todas formas, entre los INVERTEBRAOOS, solamen ta se han descrito adipocitos en la sanguijuela (Bradbury, 1.958) (38) y en algunos insectes. Estes adipocitos tienen pocas o moderadas mitocondrias y nunca son del mismo tipo que los del tejido adiposo pardo. La existencia de sangrs calienta en peces, ha sido descrita — en 1.966 y 1.969, par Carey. Los atunes y dos especies de tiburones pueden aumentar lO^C su temperature sobre la del agua, sin embargo este se viene explicando por un mecanismo circulatorio, en el cual la especial dispos! cidn del sistema vascular y su circulacidn protege y defiende el medio in terno animal del descenso de la temperatura. Desde el punto de vista mer foldgico, el tejido adiposo de los peces, no se ha examinado al microscopio 18 slectriSnlco y una da las pocas aportaciones que nos ofrece la literatura es que los adipocitos de la zona perimenlngea de la lamprea, muestran es tructura con algunas, pocas, gotas lipfdicas y mitocondrias delgadas con crestas alternante empaquetadas (MDller (38)) que difieren tanto del teji do blanco como del pardo. En los ANFIBIOS, los Idbulos grasos perigonadales estudiados — por Barkow en 1.846 (38), recuerden al tejido adiposo pardo mâs que al - blanco a microscopfa dptica y anatdmicamenta, pero la microscopfa electz^ nico demuestra que ni se parées al blanco ni al tejido adiposo pardo, y - que ademâs sus mitocondrias son poco tipicas (Bergman (38). Los HOMEOTERMOS (Aves y mamlferos) son espaces de cambiar su — temperatura corporal en condiciones desfavorables centrando en hibernacidn y al despertar de esta, mostrar un marcado aumento de la actividad metabd lica (Koskimies 1.948 y 1.950. Marshall 1,955 y otros). Pero dentro de — las AVES, solo se conoce el caso del "vencejo", que puede aumentar en mâs de 109C su temperatura corporal durante solo 20 minutes, con un peso cor porel de 48 grs. y sdlo 7 grs. de tejido graso. El vencejo tiembla vigoro samente al despertar regulando el cambio de temperatura por caminos temo genâticos y durante el proceso, piierde sus 7 grs. de grasa. Morfoldgicamen ta el tejido adiposo de les aves ha sido estudiado al microscopio dptico en 1,930 por Clara (38)/y al electrdnico en 1.966 por Luckenbill (38), en âl los adipocitos pueden ser uni o multiloculares, pero las mitocondrias son escasas y poco tipicas. Todo ello viene a confirmer lo que al principio deciamos, que - no hay evidencia de tejido adiposo pardo fuera de los mamiferos, ni indi clos de una termogénesis hibernante mâs que en algunas clases de estos, - aunque es posible que el mismo tipo o muy parecidos fendmenos a loa que - ocurron en el tejido adiposo pardo, se den mâs o menos extensamente en — otros tipos celulares. En este sentido hay que recordar que en la hiber 19 cldn de la ardilla es en las cdlulas musculares donde aumentan mitocondri­ as y crestas, Dentro de la class Mammalia as dlstrlbuye en siete ârdenes: Chi- rdptëra, Insectlvara, Rodentla, Lagcmorpha, Artiodéctyltt, Camlvora, y Pri mates (Ramussen] (l). 20 ANATOMIA Dentro de los mamlferos, la dlstrlbucldn anatdmlca, es cas! la mlsma en todos los grupos. La mayor porcldn de tejido adiposo pardo se encuentra sltuado entra las escdpulas, en forma de una delgada Idml na romboldal. Otra porcldn del mismo se extlende alrededor de los mdscu los y vasos sangulneos del cuello y extenslones del mismo, pasando deba jo de las clavicules hacfa las '-axllas, recubrlendo los grandes vasos - del tdrax. Igualmente pueden exlstlr pequenas mesas en el médiastlno,w tre el esdfago y la trdquea, alrededor del tlmo, entorno de gangllos au tdnomos, tejido cromafln, y finalmente como una Importante locallzacldn Inguinal, Oado que nuestro trabajo se efectda en rata, nos ocuparemos de descrlblrlo mds detenldamente en este animal. Su descripcidn macros cdplca compléta, fué dada por Hammer (1.895). El cual describe una masa en abdomen entre los rlnones, penatrando por el hlllo renal, alrededor - de la aorta abdominal y a lo largo de los urdteres y regidn Inguinal. En el tdrax, la rata, tiene grandes masas de tejido adiposo pardo, sobr»: to do en la regidn Interescapular el cual va a ser el objeto de nuestro es tudlo, en este trabajo, y en menor cantldad en la axlla y porclones su - perflclales y profondes a lo largo de los grandes mdsculos de la zona; - otras veces en la aorta descendante y/o en la cavldad medlastfnlca. R;r ûltimo, tambldn se puede encontrar una pequena representacldn en la re gidn cervical. La cantldad de tejido adiposo pardo en la rata es entre 0,75 y 4,35 grs. que, segûn Hammer (9) es equivalents al 0,60 - 1,65 % del - peso corporel. Siendo la varlacldn entra los diferentes animales mds pe quena que para el tejido adlposû blanco. 21 Cuando las ratas se mantlenen entre 0> y 4>C, la cantldad de te jldo adiposo pardo aumenta mâs que el doble (39, 40, 41 y 42), estlman - que el aumento de âcldos grasos libres secos, alslados del tejido adiposo pardo, despuds de la aclimataclân al frlo, es del 70 al 80 %, El aumento an masa mitocondrial es proporclonalmente todavla mayor, segûn jSmlth y cols. (43) o alrededor del 35 % expresado en nltrdgeno mitocondrial. En ratas adaptadas a frlo, de 170 gr. de peso, es posible cüsecar entre 0,9 y 1,2 gr. de tejido adiposo pardo interescapular. Mayor Interés que los cambios por la exposlclûn a fTlo, tienen para nosotros, loa aumentos y varlaciones del tejido adiposo pardo en la rata reclen naclda, en la cual tanto la cantldad de tejido adiposo pardo como su funclonamiento termogénico, varlan de acuerdo con la temperatura ambiante a que estén mantenldas y la protecclûn materna o prlvaclûn de la mlsma. Siendo el nacimiento un momento crftlco en que el animal tiene que pasar de la temperatura de neutralldad del reclân nacido (379C), — primero a temperatura ambiante y, despuds, en el transeurso de 21 dfas — como mâxlmo, a la temperatura de 289C., o de neutralldad térmlca de la - rata adulta. Los mecanismos termogârdcos del tejido adiposo pardo cobran, por tanto, mucha Importancla en esta perlado. Estos mecanismos camblaran de acuerdo con la temperatura ambien te, como ya demostraron R.Rjrtai» y Cols. (1.978), en très grupos de ratas mantenldas a: 16, 23 y 289(7., respectlvamente, y midiendo en allas a lo - largo de 21 dias loa slgulentea parâmetros: Peso corporel de la rata, pe so del tejido adiposo pardo, nlvel de Ifpldos y agua del tejido adiposo pardo y tasa de noreplnafrlna. SI las ratas nacen y sa mantlenen a 289C., con protecclûn mat^ na, el mecanismo de termogénesis del tejido adiposo pardo serâ muy reducl 22 do. Las ratas plerden muy rdpidamante lag caractaristicas qua tenlan al nacer, alcanzando pronto la temperatura de neutralldad adulta. Sus carac terfstlcas funclonales son siempre Inferlores a las de los otros dos gru pos: El peso corporal crece llnealmente pero a una velocidad de creclnden to muy Inferior a las mantenldas a 16 y 23*0.; el peso del tejido adiposo pardo se mantiene casl constantemente; el nlvel de Ifpldos, aunque aumen ta hasta el dfa 14, es siempre superior al de loa otros grupoë y la can tldad de agua por el contraria es Inferior. Corroboran estos hechos la - tasa de norepinefrina, que alcanza los nivelas del adulto hacfa el dfa - 11. Cuando las ratas son mantenldas a 239C., con protecclûn materna, el tejido adiposo pardo, conserva las caracterfstlcas funclonales (aumen to de masa, bajo nlvel de Ifpldos y alto de agua} hasta el dfa 11. La ma sa del tejido adiposo pardo crece llnealmente hasta el dfa 11, para con tlnuar después hasta el 21; la cantldad de Ifpldos es dos veces menor que en las ratas, mantenldas a 289C., y contlnûa asf hasta el dfa 14, en que - aumenta; la cantldad de agua, superior al primer grupo al principio, des puûs baja. A partir del dfa 7, hay un Incremento notable en las tasas de norepinefrina, que alcanza su acmé llegado el dfa 11 para Ir disminuyendo paulatinamente, Indicando el tiempo de mayor actividad termogénlca. Ests y el resto de parâmetros se Igualan con las ratas mantenldas a 28=C. a - los 21 etOsB. En las ratas mantenldas a 16BC., el crecimiento pondéral de los animales es lineal y mucho mâs répldo que a otras temperaturas mâs altas; Igualmente es notable el Incremento en el peso de tejido adiposo blanco; su contenido en Ifpldos es muy bajo hasta el dfa 11 y siempre Inferior, - hasta el dfa 21, a los otros dos grupos; la cantldad de agua, aunque gra dualmente Irâ disminuyendo, superarâ a la de las ratas mantenldas a mâs - temperature, Finalmente el contenido en norepinefrina aumenta considéra - blemente en los prlmeros 14 dies, para Igualarse con los otros dos grupos 23 en el dla 21. Todo ello nos Indice que el funclonamiento termogénico - del tejlcb adiposo pardo en las ratas mantenldas a 16BC., permanece has ta los 21 dias en que se alcanzaré la temperatura de neutralldad adulta. 24 ESTRUCTURA Y ULTRAESTRUCTURA Referlda ya la dlstrlbucldn anatdmlca vamos a estudlar el aspec to macroscdplco e hlstoldglco del tejido adiposo pardo. Al efectuar la - dlseccldn , de la grasa parda de regidn Interescapular, nos encontramœ con un drgano bien delimitado, de aspecto homogdneo al corte, dlspuesto de Idbulos a su vez formadoa por lobullllos, de color pardo obscuro y - abundante vascularlzado. El estudio hlstoldglco demuestra que el drgano se encuentra rodeado por una fine cdpsula de carectar conjuntivo, de la cual parten hacla el Interior tablques cada vez mds ramlflcedos y flnos, que en principle enclnturan Idbulos y después lobullllos hasta, por fin, rodear casl 1ndlvldualmente a cada elements celular; dichos tablques - van perdlendo rlqueza en flbras colégenas conforme sa adelgazan y apro xlraan a las células, momento en el cual el principal components de los septos seré la ratlcuUna. Perforando la cépsula y acompafSando a los — tablques conjuntlvos encontramos gran cantldad de vasos y nervlos que - también gradualmente Irén ramlflcéndose y dando una red flna que termina ré en las vaclndades celulares; los capllares, slgulendo un patrdn endo crlno, rodearén a cada célula separéndose de alla ûnicamente por una mem brana basai y eventualea flbi*s de retlcullna; las termlnaclones nervlo sas; abordarén con ima flna yema terminal, los elementos celulares. Estos ûltlmos son pollgonales, multlveslculares y con nûcleo centrallzado. — (Flg. l).(Flg. 2). Empezaremos por descrlblr el tejido conjuntivo, vasos y nervlos, para después abordar el aspecto ultraestructural y microscdplco del com ponenta celular. 25 VASCULAfllZACION. DEL TEJIDO ADIPOSO PARDO La vascularlzacldn da la grasa parda as de 4 a 6 veces superior a la de la grasa blanca, an la rata (Hausberger y cols. 1.963), Smith y Horwltz (43). A nlvel dal tejido adiposo pardo Intarescapular esta vascu larlzaclon procéda de ramas del tronco cervical que a travds da la arte rla toraco dorsal alcanzan el drgano graso. El flrenaje vanoso as de doble naturaleza: Uno da los caminos supona el ratorno anatdmico del anterior, as dacir, a travds da las venas toraco dorsales la sangra retorna a la - subclavia y de aquf a la vena cava superior; en otro camino las venas del tejido adiposo pardo, confluyan en una central qua desenfaoca directamenta an al plexo vertebral a nival da T-4, para avocar despuds, junto con las venas da T-5 y T-6, a travds de la vena 4> tordcica (primitlvamenta dano mina da da Sulzer's] an la vena dci^s y posteriormente encontrar a la ca va superior. Ambos caminos da retomo tienen caractar bilateral. (Esqtê ma IX ). La gran vascularizacidn as una da las caracterfstlcas del teji do adiposo pardo que ademds contribiiya a su color pardo obscuro, por la presencia da gran cantided da hematles y hémoglobine, junto con la rique za en citocromooxidasas mitocondriales (Simon (22)]. Tambidn a esta pro fusidn de vasos se deb* el que se la haya comparado y considerado como — una gldndula endocrine. La razdn de esta riqueza vascular no es otra qua faciliter los mecanismos termogdnicos del tejido adiposo pardo, ya qua — al exponer una gran superficie capilar a los adipocitos estos calientan antes y mds fdcilments, la sangra. En los animales hibernantes, en al momento de la hibernacidn, se sabe que hay un aumento dsl flujo sangufneo a travée de los capilares del tejido adiposo pardo, cuyos mecanismos de regulacidn sdlo se conocen en parte, pero en el que participa, desde luego una vasoconstriccidn de 27 laa arteriolas o arterlas reguladoz*as que poseen una gruesa capa de tejl do muscular (Boarner-Patzel [38]). El mecanismo séria, por tanto, compe rable al qua realize el glomus cutâneo a nivel vascular terminal, princl palmante an al pulpejo de loa dados, para regular el riago distal y la - temperatura da las zonas acres. Los capjlares, como pone de manifiesto el microscopio elactrdni C O , son de tipo continue y no difieren de los que de este tipo existen - otras localizacionaa. Lae câlulas endoteliales descansan sobre una membra na basal continue y en allas llama la atencidn la riqueza de veslculas de pinocitosis y la ausencia de fenestraciones, finalmente las câlulas endote liaies vecinas se unen a travâs de uniones esenciales tipo tight Gap (38). Ademâs; de estos rasgos générales de la célula endotelial, a veces han sido descritos otros menos usuales como la presencia de lengOatas proyecténdose hacla la luz capilar la presencia de centriolos en las células endotelia - les en la rata adulta (Unahara (36)), algunas veces en relacidn con fibres que se asemejan por su disposicidn a una base ciliar; Dyer (45), en 1968 observé particules de glucdgeno en células endoteliales de ratas de dos - dias, y previamente varies autores hablàn senalado la existencia de vacuo las grasa que las llevd a considérer a la célula endotelial como preadipo cito o adipoblasto, ai bién hoy podemos interpreter estas vacuoles electra densas como pequenos lipomicrones que rare vez han sido descritos en la — célula endotelial y nunca en el espacio intersticial hasta alcanzar la mem brana de la célula grasa (46). En realidad no serlan mâs que un mecanJssmo' de absorcidn^ o paso de los quilomicronés desde la luz capilar a la célula grasa, si bien la visualizacidn de estos es extraordinariamente rare, — siendo lo normal que tras la actuacion enzimética de la lipoproteinlipasa en la luz capilar los quilomicrones dejen de ser visualizables hasta que alcancen la célula grasa y reaparezcan como pequenas gotas de lipomicro - nés. Toda la red capilar y vascular en general es perfectamente vi sualizable con técnicas enzimâticas con Fosfatasa alcaline y ATP asa, en ziroas an los que es rica la célula endotelial (Fig*3 «fb). 28 INERVACION Dubois en 1.896, llegd a la conclusidn de que la inervacidn del tejido adiposo pardo era doble: por un lado fibres de los tractos espirn les cervicales y de los 5 prlmeros segmentas tordcicos, y por otra, del sistema simpâtico ganglionar. earlier (48) demostrd an el erizo que el tejido adiposo pardo interescapular recibe una discrets inervacidn del 30, 40 y 5» nervlos In tercostaies. Sidmon y Fawcett (49), demostraron en el ratdn, 6 larges ter' minaciones del tejido adiposo pardo, entrando por la cara ventromedial - en cada Idbulo interescapular, y dado que estas termlnaclones se haliaban separadas, pensaron que cada una de elles podia derivar de los nervlos es pinales de la regidn torécica. Hull y Segall (1.965), demostraron, seccionando el simpdtico del tejido adiposo pardo, que la grasa parda de la regidn del cuello recibe fi bras simpâticas.que pasan rostreImente a lo largo del tronco cervical sim pdtico. Cortando el tronco rostral del ganglio estrellado se encontrd re tencidn grasa en los lobullllos cervicales, mientras que eliminando el - ganglio estrellado la retencidn grasa ocurre en todo el tejido adiposo — pardo cervical y en le mitad anterior del tejido adiposo pardo interescapu lar. Por tanto, es obvio que la regidn anterior de este Idbulo recibe fi — bras simpâticas via ganglio estrellado. Aunque en varias ocasiones se han descrito (49) termlnaclones pe rasimpâticas en al tejido adiposo pardo todos los autores estân de acuerdo en que el sistema de inervacidn prédominante por fibras del S.N.Simpâtico. Esto se apoya en varias evidencias como: - l) El tejido pardo contiens gran cantldad de transmisores sinâpti 29 cos de tipo norepinefrina, - 2] La respuesta del tejido a estlmulos fisioldgicos puede ser en su mayor parte estimulada por la administracidn de N,E, - 3) En condiciones en que falta la respuesta fisioldgica del tejl do adiposo pardo adn se puede obtener un evldente Incremento de descarga simpdtlca dentro del tejido, - 4} La respuesta fisioldgica del tejido adiposo pardo, puede ser deprlmlda adidnlstrando agentes blK3trdn mlcroscdoico; Johanson (52), Hausberger (53), estudiaron la inervacidn del tejido adiposo pardo y tejido adiposo blanco en el ra tdn, usando plats y azul de metlleno, describiendo flbras nerviosas a s o ciadas a todos los vasos sangulneos, mds abundantes en las arteries que en las venas, y asl mismo, la presencia de fibras nerviosas entre los - adipocitos perdas que, a microscopla dptica, parecian llegar a la superfl cie celular. Una descripcidn similar fud dada por Sidmon y Fawcett (49) - con tinciones de plata. Todos estos autores estdn de acuerdo, en que las terminaciones nerviosas son de tipo simpdtico. Fluorescencia histoqulmica: Con esta tdcnica y en el tejido — adiposo pardo se evidencian una gran cantidad de fibras nerviosas con una cantidsd relativaments alta de Norepinefrina (N.E.)(54,S5 y 56). La con - centracidn de N.E. esté en relacidn directe con el nûmero de termlnacio - nés slmpdtlcas en un tejido, encontrdndose también a lo largo de las neu ronas sdrenérgicas y en alguna extsnsidn de células cromafinas. La dater minacidn de N.E., es posible mediants técnicas de fluorescencia para cate colominas, y con su empleo puede visualizerse la inervacidn simpética de los tejidos incluyendo el tejido adiposo pardo,' En este drgano y con esta técnica se encontrd que las fibras adrenérgicas eren numerosas y se dispo 30 nlan en les paredes de las arterlas, arteriolas precapilares y ocasional mente alrededor de las venas, A mayor aumento se podia observer un fino plexo fibrllar entre los adipocitos, Wirsen (57), sugiere que estas fl - bras parenquimatosas pueden funcionar indirectamente en el control de la actividad del tejido, por regulacidn del flujo sangulneo y parmitir el - acceso de las hormones adipoquinâticas a las cdlulas. Wirsen (57), Wirsen y Hamberger (58) aplicaron la tdcnica de — fluorescencia, este autor (57), incubando el tejido en alta^etil-norepi nefrina incrementado con ello, el contenido amdnico de les fibras y ter minaciones, y asl pudieron visualizar finas fibras de naturaleza adren^ gica entre las células del tejido adiposo pardo, imposiblee de detectar en el tejido adiposo blanco. Para algunos autores, la norepinefrina, visualizada con técnicas fluorescentes ûnicamente se encontrarla en las terminaciones nerviosas— (58,59), mientras que para otros (60) alcanzarla el interior de las célu las grasas, sugieren también que esta catecolamina tendrla la funcidn de activer a la Lipasa. Finalmente son varies los autores que describen ter minaciones varicosas o "arrosariadas" en las finas fibras parenquimatosas imagen morfoldgica caracterlstica de las terminaciones simpâticas. Todos estos hechos,, como imégenes varicosas, presencia de N.E. fluorescencia, - son mucho mâs évidentes en las terminaciones de ratas aclimatadas al frio. Microscopla electrdnica: En general todos los autores que se - han dedicado a este estudio (61,62 y 63) describen los axones que alcan zan las células grasas como finos y emiellnicos, los que inervan capijp res pueden recubrirse eventuaImente de células de Schwann, siendo que nor malment» estén desnudos, y por ûltimo las ramas mâs gruesas que alcanzan les arteries inervan directamente la pared vascular, muscular. En todos los casos las mitocondrias epcdnicas son abondantes, estân también presen tes veslculas densas a lo largo del axdn y en la terminacidn, identifies 31 das como veslcula de N.E. Recientemente Bargmann y cols. (64), an un complete estudio de inervacidn del tejido adiposo pardo interescapular a M. electrdni­ ca, da ratones, rates y erizos, haca una descripcidn complets del — mismot Los hacss de fibres amiellnlcas rendflcadas a partir de tron- ccs mayores, cuyos dldmetros quedan exprasados metlculosamente en el trabajo de Flaimi (61) Linctc y cols. (62), que llegan desde la cdpsula y conjuntivo interlobular, alcanzan los espaclcs InterlobulUlares y las arterlas a nlvel da la adventlcla, se randflcan cada vez mds flna mente en torno de los 'capllares da loa cuales sa saparan ûnicamente - por una membrane basal. Durants todo este trayecto son amlellnlcos y sa envuelven por citoplasma de las câlulas de Schwann. En el Intralo- bulUlar, las finas terminaciones sdlo van forradas parcialmente per - los elementos de Schwann, hasta que desnudas alcanzan las cdlulas gra sas, separdndose tambisn da estas exclusivamente per la membrane ba­ sal celular. A lo largo da su trayecto los axones muestran un axolema con mitocondrias, naurotdbulos y veslculas densas y sdlo eventualmen- te depdsltos de glucdgeno. En su trayecto final el curso se hace tor- tuoso o varicose, aumentando el contenido vesicular en algunos puntcs, lugares que se interpretan como puntcs slndpticos, que colnciden total ment a: con las zonas da mayor brlllantez con tdcnlcas da fluorescencja Finalmente Derry y cols. (59), estudlando la inervacidn del tejido adiposo pardo interescapular an ratas Inmunoslmpatectomlzadas, llegan a la conclusidn de que existen des tipos de M.bras, ambas de - • tipo simpdtico, que Inervan al tejido adiposo pardoi Fibres proceden tea de lergaa neurones y otras de cortas neuronas. El primer grupo — procéda: de cuerpos celulares de gangllos intrlnsecos, de mayor fluo­ rescencia por su mayor contenido en N.E» y es mds abundante; mientras que el segundo tiene la situacidn opuestat menos fTecuente y con me­ ner fluorescencia por su bajo contenido en N.E. 32 TEJIDO CONJUNTIVO Es pobre en elementos celulares, con mayor abundancia de fl - bras coldgenas, en general se dispone en finas Idminas que delimitan el drgano y se introducen entre los Idgulos y lobullllos, tomando el nombre de septos o tablques Inter e intralobulillares respectlvamente, hasta que en su expresidn mds fins rodea a los elementos celulares Intimamenta se, pardndose de elles sdlo por une membrane basai, A lo largo de estas divl siones el componente celular y las fibres coldgenas se van rerlficando, - mientras que abundan mds les fibres reticularea. [Fig. 4) El componente celular estd fundamentalmente formado por escasos fibrebiastos, algunas cdlulas cebadas (Fig. 5) y elementos indiferencia - dos o lipoblastos. Los dos prlmeros tipos no muestran ningdn caracter di ferencial con los hallados en otras localizaciones conjuntivas, mientras que los segundos estdn mds sujetos a discusidn e interpretacidn. Se han descrito cuatro trabajos sobre la presencia de cdlulas indiferenciadas en tra los capilares y los adipocitos pardos, Unahara 1.968, Borgman 1.968, Sutter 1.969 y Barnard 1.970. Este tipo celular descrito por Bargmann, co mo un posible linfocito, ha sido interpretado libremente por diferentes - autores, asl Umahara lo describe como un fibroblasto de naturaleza desco noclda y Sutter y Barnard como el elemento precursor del adipocito, sien do estq dltima interpretacidn muy consistante, tanto desde el punto de - vista de su morfologla, como por su topografla, como por la evidencia con otras técnicas de este tlpocelular. Morfoldgicamente es una peuuena célu la con caractaristicas de indiferenciacidn e inmadurez, nûcleo redondeado, mitocondrias pequenas y dispersas, retlculo rugoso laminar, numerosos ri bosomas libres y como rasgo diferencial y pequenas gotas lipldicas cita — pldsmicas, Umahara, describe ademds un érea perinuclear conteniendo Golgi y centriolo, senalando la carencia de membrane basai en torno a estos ele mentos. 33 EL PARENQUIMA Los adipocitos pardos son células pollgonales que se distinguen fécilmente de laa células del tejido adiposo blanco por su menor tamano, 25 a 40 ndcras de diémetro, y por su aparlencia multivesicular, y situe - cidn nuclear. (Fig. 2). A microscopfa dptica, pressntan un nûcleo de localizacidn cen - tral, de cromatina laxa, que evidencia uno o dos nucleoloa bién manifles tos, y que sdlo excepcionalmente se presentan en mayor nûmero (Aronson - 1.954, Bazan 1.965, Boesher 1.960, cltados ^ r Robert Smith y Barbara A. Horwitz, 1.969). Su citoplasma es granular, conteniendo numerosas vacua las lipldicas cuyo tamano varia, pero siempre més pequenas que las del te jido adiposo blanco y que no parecen ester rodeadas de membranes limitari tes. (Fig. 6). Ultreestructuralmente, la membrane plasmética se caracteriza — por presenter gran cantidad de invaginaciones y ocasionalmente profundas sinuosidades o boisas, los ribetas de las invaginaciones tienen un diéira tro de 400 a 900 A, y son consideradaa como la expresidn morfoldgica da - actividad pinocitdtica. Se han descrito (Linck) (1.973, 1974), en el hams ter lesiones del tipo tight, Gap, y unos puntos de tipo Nexaus, mientras que en el ratdn y rata, no parece ser absolutamente tlpicos, aunque desde el punto de vista funcional todos estos animales se ha demostredo (Scheri dan] un acoplamiento eléctrlco entra los adipocitos pardos que solo podrla explicarse por este tipo da _wsiones. Se observa también una membrane be sal de 200  de espesor. (Fig. 7). El citoplasma tiene un fino caracter - granular, conteniendo inclusiones lipldicas y numerosos organelos que ire mos describiendo a continuacidn. (Fig. 8). Gotas lipldicas! Su multilocularidad es. Junto a la gran cantl dad de mitocondrias, une de las caractaristicas de los adipocitos pardos* 34 Aparecen como vacuoles vaclas o medlanamente dansas, Independientes o parclalments fusionadas, da un tamano da 0,2 a 0,4 tnlcras an ratas re clén nacidas y un poco mayores an ratas adultes. Las gotas se llmitan por los bordes tabuleras dal retlculo endoplâsmlco llso qua encinturan casi totalmenta a cade vaslcula, suglrlando qua al retlculo astd Iropll cado an la slntasls 11pidice; sa craâ ademâs qua asta barrera dal sis tema vacuolar supona da hacho una barrera flsica para impedir la coalas cancla da todas las gotas an una ûnlca vacuole grande. Con fracuencla - tambiân an las carcanias da las inclusiones llpldlcas, sa sitdan nil to - condrias y riboscmaa libras. Las mltocondrias domlnan la estructura general dal cltoplasma (Fig.9). Son muy plaomSrflcas tanto an su aspacto general, como an la - conflguracldn da sus creates, asl como an al tamano. En general son ma yores qua las del tajldo adlposo bianco, (0,5 mleras frenta a las 0,3- del tajldo adlposo bianco), lo cual pareca Impllcar una mayor actlvldad da âsta câlula. La estructura Interna mltocondrlal as compleja, con eras tas muy numerosas da 8 a 15/mlcras segdn Sutter 1.969. Da orlentacldn pa ralalas antra si y parpandlcularas al aja mayor mltocondrlal, estrecha - manta ampaquatada, y qua sa axtlendan complatamenta por la matrlz. En al Interior da la matrlz sa encuantran con fracuencla cuarpos alectrdnlca manta dansos, Intarpratados por muchos autoras como dapdsltos rasldualas da membranes Internas Incomplètes a Indlfarancladas (23, 26). A nival da la membrane Interna, utlll&ando tdcnicas eepaclales como tlncldn negati va o ultrasonldos, as poslbla ver las particules alamentalas, F-1 o de Fernandez Mordn. . El retlculo rugoso faite casl slempra o se halla an cantldad - minima (43) (38). El llso, aunqua no demaslado abundante astd slempra — présenta y como ya hamos Indlcado con sltuacldn preferanclal en torno - da las gotas llpldlcas. 35 Aparato de Golql; A partir de los estudios del arki 1967 se - confirmd la jresancla da un aparato da Qolgl moderadamante desarrollado, da sltuacldn perlfdrlca y cuyo santldo funclonal especlflco no sa ha In terpretado (43) (38). Los rlbosomas libras son numerosos an al cltoplasma da las ra - tas jdvenes y algunas vacas y an manor nùmaro an ratas adultas (43). Sue Ian aparacar asoclados an pollrlbosomas, an ndmaro da 5 a 10 unldos par un fllaraento da RNA y alradador da las gotas llpldlcas y prdxlmas a las mltocondrlas. Con morfologla tamblén granular y alactrodansa ancontramos tam bldn Inclusiones da glucdgano, qua puadan adopter formas an rosata y ra clmos (Fig. 10). Su presancla tamblén as superior an cdlulas da animales jdvanes, pero no por esc puada consldarersa raro esta paraplasma an ratas adultas. La axlqtencla da cuarpos dansos da manor tamaAo qua las mltocon drlas, da morfologla Ugaramanta granular y slempra anvueltos por membra na llevd a da Ouva an 1964 y 66 a Interpretarlos como Usosomas prlmarlos qua contanlan hldrolasas dcldas todavla no funclonantas. Junto a alios - puadan hallarsa, con manor ftecuancla, otras particules elactrodansas — mayoras, Incluso mayoras qua las mltocondrlas, an cuyo Interior puadan - encontrarsa Inclusiones cltopldsmlcas, rastos da organalos y mltocondrlas y qua hen sldo rapatldamante Intarpratados como autollsosomas o cltollso somas (38) (Fig. U). El ndmaro da cltollsosomas aumenta con la mayor aç tlvldad matabdllca calular, slendo uno da los momentos mas axprasivos dal naclmlento. Por ûltlmo, la presancla da cantrlolo en el tajldo adlposo par do, fud descrlto an el tajldo Interascapular pardo del conejo y an mir - clélagcs (38). Esta organalo sa encuentra carca dal nûclao y asoclado a 36 mlcrotûbulos. La presancla de este centriolo parece Indlcar, por lo n« nos, una capacidad de divisldn que con tanta fracuencla sa le nlega al tsjldo adlposo pardo, adulto, asl como una actividad rectora del hlalo plasma durants la Interfase. Aquallos autores que nlegan la actlvldad mltétlca del tejldo adlposo pardo Interpratan al cantrlolo como un ras to qua permanacarla dasda la 01time dlvlsltSn sln funclOn celular y a - los mlcrotObulos anexos como tamblén restos del aparato mltdtlco. 37 COMPOSICION UtŒMICA SI comparamos los dos tipoa de tejldo graso las dlferenclas de su composlcldn qulnlca son mds cuantltatlvas qua cualltatlvas (43), por alio sdlo comantaramoa someremanta aquellos componantes qua puadan supo ner un rasgo dlferanclal, aunqua a vacaa sdlo sea cuantltatlvo, da la grasa parda, fundamantalmanta cantrdndonos an las fracclones 11pidos, - protalnaa y dantro da estaa las da Intarda funclonal como anzlmes y coen zlmaa asl como catacolominaa y glucdgano. Dantro da la ftracddn 11 pi dos as da sanalar qua al components da FDSFDLIPIOOS supona dal 2 al 4 % dal total, mlantras qua an al tajldo bianco sdlo llegan a alcanzar al 0,2 da Upldos totales, asta hecho as td totalmenta da acuardo con la morfologla y la funcldn, Indlcando qia-- al tajldo adlposo pardo, aa mda rlco an membranes, sobre todo mltocon - drlalaa. Adn mda signlfleatlva, dantro da los fosfollpldos, as la free cldn del dcldo fosfdtldo CARNITINA, que sa ancuantra an alta concentz^ — cldn an al adlpoclto pardo, mucho mayor qua an la cdlula blanca y an can tldadaa sdlo aqulparables a las halladaa an corazdn. (Esta dcldo fosfdtl do sa encuentra locallzado an la membrane Interne mltocondrlal y slrva - como transportador da los dcldos grasoa hecle la matrlz mltocondrlal,(38) « El CGLESTERGL tambldn se presents an clfTas superloras an al tajldo adlposo pardo qua an al tajldo adlposo bianco, formando parte as tructural da las membranes, slendo mayor su propercldn, raspacto a fosfo llpldos, an la membrane externa mltocondrlal qua an la Interne, propoff' - cldn qua sa respeta tambldn an al drgano bianco. Indapandlantamenta da as ta santldo estructural, sa ha descrlto la presancla da otros llpldos derl vados da clclopantano-parhldrofanantrano como la CORTISONA, OEHIOROCORTI SONA y CORTICGSTERONA, al tajldo adlposo pardo y no en el tajldo adlposo bianco. Su slgnlflcado sarla totalmenta funclonal y régulador y nunca as tructural. 38 Todos los llpldos enumerados mds una minima fraccidn da gllcoll pldos vlenen a suponer entre el 10-22 % de los llpldos totales, slendo el resto trlgllcéridos fundamentalmente y dcldos grasos. Los TRIGLICERI DOS, suponen la fraccldn mas Importante del adlpoclto pardo, entre el - 75-90 % de los llpldos totales, y es slempre Inferior esta cantldad a ]a hallada en el tejldo adlposo bianco, su locallzacldn principal es, natu raiments, a nlvel de las gotas cltopldsmlcas, ocupando un sagundo lugar la matrlz mltocondrlal e hlaloplasma cololdal, Los ACIDOS GRASOS, son en valores absolutos mds abundantes en el tejldo pardo, vlnlendo a represen tar un ID % del total Upldlco; pero es sobre todo Interesante el hecho de que en este tejldo halla un predomlnlo de les Ac. grasos Insaturados sobre los saturados. Asl el Olelco, Llnolelco que respecta al total de — dcldos grasos se encuentran en el porcentaje : 30-70 i» el Olelco, 10-30 ^ y el Llnolelco y de los saturados el mas abundante es el Palmltlco, que se halla en un porcentaje del 30 %. La relacldn entre la funcldn del adi poclto pardo y la alta cantldad de dcldos grasos Insaturados no estd cia remente daflnlda, aunque se ha sugar1do (Fawcett y Lyman (38) que este — hecho se debe a que los dcldos grasos Insaturados y las grasas de ellos résultantes presentan un punto de fusldn mds bajo, Impldiendose asl su solldlflcacldn durante el mecanlsmo de la hlbernacidn. Podemos esquematlzar la fracclon Hplca en el slgulente cuadro; 39 Tipo y ^ de Llpldo Sltuacldm Funcldm Predomlnlo en: Al LIPIDOS CQMPUESTOS ID 1b -a) Fosfollpldos (2-4%) Membrane Cel. Superior en m. Interne mltoe. Estructural Grasa parda. -b) Ac.Fosfdtldos (Carnltlna) Membrane Inter na mltocon— drlal. Transports da ac.grasos. Grasa parda -c) Colesterol Membrane Cel» Superior en: M.Plasmdtlca y M.extr.mlto condrlal. Estructural Grasa parda -d) Glucocorticoïdes Membrane Plasm. Cltoplasma. (llgado a re- ceptores). Reguladora Grasa parda *^) Gllcolfpldos Membrane Cel» Estructurales IguBl Bl LIPIDOS SIMPLES 90 it -a) Trlgllcéridos (80%) 01 y Mono-gllcdri dos. Cltoplasma Gotas Llpldl cae. Almacdn y reserve Grasa blanca -b) Acldos grasos (10%) Cltoplasma Matrlz mlto condrlal. Grasa parda Saturadost -Aalmltlco 30% Grasa blanca In saturados: -Olelco.... 30-70 % -Llnolenlco. 10-30 % Grasa parda 40 Dantro de las protelnas. exclulremos a todas aquellas estruc turales y cuya presencia es comùn con si tejldo adlposo bianco y/o con cualquler otro tlpo celular, por lo qua nos cenlremos fundamentalmente a la freccldn enzlmdtlca qua de forma especlfica Interviens en las fun clones del tejldo adlposo pardo, o que por lo menos tlene un signifies do cuantltatlvo Importante an el drgano pardo. Para mayor senclllez tam bldn las Memos esquematlzado en clnco apartados, segdn crlterlos funclo nales. I.- Enzlmas qua actuan en la 5INTESIS DE ACIDOS GRASOS. 1".- Glucose Kinase 2®,- Glucose 6 fosfato deshldrogenasa. 3*.- Fosfohexosa Isomerada. 4®.- Enzlmas via pentosas. (Warburg. Llbman-Oliskens} 5®.— Enzlmas via Embden-Meyerhoff d gllcollsls anaerobla, 6®.— Acldo graso slntstasas (Complejo enzlmdtlco Que actda an pra sencla de NAOH, Acetll CoA y Malenil CoA a pH 6,6) H . — Enzlmas que actûan en la SINTESIS DE TRIGUCERIDOS, concretamente en el peso de acldos grasos a trlgllcéridos. - Trlgllcéridos slntetasas. (Complejo multlenzlmdtlco hecho de Acetll CoA; Sn Gllcerol-3-fosfoacllhldrolasa y Acetll CoA: Digllcerido.Acll Transferesa) 41 HI,- Enzlmas que actûan en la MOVILIZACION DE TRIGLICERIDOS. 1«.- Llpopcrotelnllpasa. Présenta en membrane plasmdtlca y capaz de incorporer al adlpoclto los dcldos grasos de la Ingesta. 2®.— ULpasa tlsular. Todas allas de caracter hldrolltlco, holoen- 3®.- Esterases Espa zlmas y espaces de movlllzar los trlgllcéridos clflcea. de las gotas llpldlcas, esclndlendolos en ac. grasos y gllcerlna. IV.- Enzlmas que actûan en la OXIDACION DE LOS ACIDOS GRASOS. 1®.- Enzlmas de la Beta-Oxldacldn o esplrel de Lynen, présentas en la matrlz mltocondrlal, aunque no es la via mds Importante en la degradacldn grasa en el adlpoclto pardo. 2®.- Tejldo adlposo pardo tloklnasa y/o GTP tloklnasa, como medlacto res para la formacldn de Acll CoA. 3®.- Enzlmas del cibla de Krebs, tlpo decarboxllase y deshldroger» sa que actuando como apoenzlmas necesltan la presencia de coen zlmas*. 4®.- Coenzlmas de la cadena resplratorla (Nad, Fad y FMN] Cltocromos. V.- Enzlmas relaclonadas con la alta VASCLLARIZACIQN DEL TEJIDO ADIPDSD pardo- . - Fosfatasa Alcaline - ATP asa.. .'etc... 42 Sobre la Itnportancia de cada uno de ellos, su significacidn - funclonal y papel concreto en cada via, haremos comentarlos posterior mente en el capltulo de flslologla, o trataremos mds dlrectamente aqua llos que, por parecernos mds Importantes para los objetlvos de esta ta sis, los hemos estudlado personalmente y los comentaremos y expondremos mds ampllamente. Las CATECOLAMINAS juegan un papel fundamental en el Tejldo adi poso pardo en los mecanlsmos de producclon de calor, fundamentalmente en los ascensos bruscos de temperature, como en los Stress, adaptacldn pots-naclmlento o despertar de la hlbernaclôn. Se encuentran en cocenzra clones de 0,5 a 1 mg/gr. de tejldo graso pardo. Ya anterlormente se hablan senalado altos nlveles de algunas - de estas substanclas como la Noreplnefrlna , Serotonlna a Hlstamlna . La funcldn de estas catecolamlnas, es la de regulacidn funclonal del te jldo adlposo pardo, slendo de hecho el principal regulador de este drga no. Par ûltlmo mereca la pena senalar la presencia de GLUCOGENO an las células del tejldo adlposo pardo, en ocaslones en clfras Importan - tea, con funcldn almacenadora y energëtlca. Ha sldo demostrado qulmlca e hlstoqulmlcamente, asl como ultreestructuralmente, y su almacenamlen to depends de los nlveles de Insullna, allmentaclon y denervacldn, dla mlnuyendo con el ayuno y adrenallna, slgulendo por tanto, en principle, un curso paralelo al depdslto de trlgllcéridos. 43 CITOFISIOLOGIA Durante muchos ados se ereyd que el tejldo adlposo pardo tenia muy poca actlvldad metabdllca, pero hoy en dla se sabe que la cdlula adi pose no as un lugar Inerte de almecenamlento de grasa, slnd que tlene un metabollsmo actlvo y se estd renovando contlnuemente. Una de las funclones del tejldo adlposo pardo, as el almacena mlento de trlgllcéridos que proceden de dos fuentes fiaidamentales de la clrculacldn a travée de la ingesta y metabollsmo çyraso.y , en segundo lu gar, de la slntesls de los mlsmos a partir de la glucosa. La otra funcldn es la movlllzacldn de esos trlgllcéridos almacenados. En ambas funclones la grasa se asemeja al tejldo adlposo blanco, pero lo verdaderamenta es psclflco del tejldo adlposo pardo, es el aprovechamlento que hace de esa movlllzacldn de los trlgllcéridos obtenlendo energla en forma caldrlca - dlrectamente, hecho que le permlte calentar la sangre y contrlbulr al — mantenlmlento de la temperature en los homeotei.'mos. I) FUNCION ALMACENADORA DE TRIGLICERIDOS: Estes trlgllcéridos como acabamos de senalar, proceden de dos fuentes: a} de la clrculaclon. las grasas que a su través son ofrecldas a los acHpocltos tlenen a su vez un doble orlgen, los trlgllcéridos de la Ingesta transportados por la sangre como qullomlcrones y los - trlgllcéridos enddgenos, slntatlzados por si hlgado y vehlcuUza dos por la sangre como llprotelnes de baja densldad. Los quilomlcronea absorbldos en la pared Intestinal pasan desde los enterocltos a la clrculacldn Hnfétlca, y de esta a la sangulnee. Al alcanzar la regidn grasa el qullomlcrdn es degradado, en la pared del ca 44 pilar, a dcldo graso libre y glicerol, por Intervencidn del enzlma pro teln-llpasa, hldrolasa segregada por el adlpoclto y normalmente llgada a la membrana plasmdtlca de este, que es capaz de 11berarse hasta la - luz capllar donde realize su accldn hldrolltlca. La accldn de esta enzl ma estd medlatlzada por la heparlna libérada desde los mastocltos vecl nos par degranulacldn, y regulada por la propla Ingesta y necesldades - orgdnices que medlante un mecanlsmo de retrocontrol estlmulan o Inhlben su produccldn en la cdlula grasa, observdndose que sus nlveles verlan — segûn el estado de nutrlcldn. Une vez que el dcldo graso libre atravla sa la membrana del adlpoclto, este volverd a unlrse al glicerol para de posltarse en forma de trlgllcéridos conw "llpomlcrones" (60). Desde el punto de vlsta funclonal la Intervencldn de la protelnllpasa, regulando el nlvel de utlllzacldn de trlgllcéridos de la dleta, estd totalmente - conflrmada. E Igualmente desde el punto de vlsta morfoléglco, puede âpre clarsa como los qullomlcrones de los capllares a adyacentes al tejldo - graso, de aspecto electrodenso, desaparecen en su peso a través de la — célula endotellal y tejldo Interstlclal, para volver a reaparecer, como llpomlcrones electrodensos nuevamente en el cltoplasma del adlpoclto, — expresando que durante el camlno luz capllar-adlpoclto, dejan de exlstlr como taies transformdndose en dcldos grasos por hldréllsls.(ver esQuema ni). b) La segunda fuenta por la que la célula grasa es capaz de alti» cenar trlgllcéridos en su slntesls directe a partir de la glu cosa que entra en la célula. Aunque en condlclones normales , la célula adlposa es Impermeable a la glucbsa, este paso es — facllltado por la Insuline que Incrementa la utlllzacién de la glucosa por parte del adlpoclto a medlda que este slnteti za trlgllcéridos. Aunque no se excluye que la glucosa pueda penetrar por plnocltosis, sln embargo exlsten requerlmientos estructurales y funclonales définidos, que confirman que las células capten la glucose medlante un mecanlsmo molecular pro o oo oo o 46 telco, utilizando receptores de membrana, Tamblen es poslbla qua ade mds la insullna aumente la superficie celular para faciliter este mo vlmlento. Una vez que la glucosa alcanza el cltoplasma celular o bien queda almacenada en forma da glucdgeno o es actlvada por la G-6-Pdeshl drogenasa pudlendo segulr dos camlnos: La via Gllcolltlca o de Embdem— Meyerhoff, o la via matabdllca de las pentosas. De estes dos vlas puede obtanerse plruvato, due entrard en la matrlz mltocondrlal donde dard - Acetll CoA que podrd ser utlllzado ensrgétlcamente como substrate an la posterior slntesls de dcldos grasos y su esterlflcacidn (ver esquema IQ}. El otro metabollto necesarlo para esta slntesls as el alfa- gllcerol-fosfato. Realmente este metabollto puede ser utlllzado por la cdlula grasa an dos sentidos: Pare la esterlflcacldn de dcldos grasos, mecanlsmo an el qua glucosa y glicerol complten, y para la formacldn de COg y dcldos grasos libres, en donde la glucosa no complte con el gll cerol, slnd que, par al contrario, facilita su metabollzacldn. El alfa- glicerol—fosfato puede ser obtenldo por clnco camlnos dlferentes: — Reeccldn de la transaldolasa (Fructasa-^-P + Gllcaraldehldo-3-P * D-Fructosa), — Por un mecanlsmo de transfosforlllzacldn entra el Glicerol y el — Fenllfosfato, — Por la unldn dlrecta de la gllcerlna con el dcldo foafdrlco, como sucade en los microsomas. (Gllcerlna 4 * Cl^Mg) pH' 5,3 - m Alfa-gllcero-fosfato. — Por la Intervencldn de una Isomerasa y el NADH^ sobre la Dlhldro xlaôetona. (Dlhldroxlacetone 4 NAOH 4 H^ » Alfa-gllcerol-P. i NAO"^ — Y flnalmente por Intervencldn de la gllcerolqulnasa. (Gllcerlna 4 ATP » Alfa-gllcerol-fosfato 4 ADP). A ( E S Q U E M A IV LIPOGENESIS GLUCOSA GLUCOSA 6 p • *, PENTOSA 5t> T . cHoscçinD FRUCTOSA 6 p ^ GLICEROL••DIHIDROXIACETONA 3P ^^GLICEROALDEHIDO 3p FQSI^ÈNOLP IRÛVÀTO- P I R U V A T O ^ OXALACETATO ACEHL CaA ( MALATO ISOCITRICO FUMARATO ol-CETOGLUTARATO % ' ' «— ►MALONIL O.A MALONIL ACP ACIL ACPV SUCCINIL CoA ^CETMCIL ACP HIDROXIACIL ACP A INSATURAOO ACP t ACIL ACP4— tACIDO GRASO f AC. GRASO ♦ O A ATP •> AC. GRASOACIL CaA ♦ AMP ♦ PP 2 AC.GRASOACIL CaA + d-GLICEROFOSFATO **AC. FOSFATIDICO t 2CaA TRIGLICERIDO ' » ac.grasoacil CaA ♦ diglicerido ♦ pp LU> <> OCou_ C/Jou_ s 3o u o CN < S tu 3 GT (D tu U oo QCca c/3C3oo gLO c/3Oca (_)<3: o c3 5ir LU OC03 U i t n OC to o- o cz:s X < CQo CL s;to UJX CO SI_lo “O a o < o3 O CO c zC3 o COo CO< a:to cj< C=3 CO h- < 1----- - q — ' h- —-q tj 1—X < £ z:X-X CL U J (vO+ to U JX « QCQ Q_ TJ UJ 62 slgnados como 1, 2 y 3,de acoplamiento, cada uno de los cuelea eataria formado por una proteina o complejo proteico transfer!doB^ de electronea que alternativamente pasarfa de la posture C inactive a la C' o activa vada durante la transferencia; si bien no sabemos cuales da las protei naa de la cadena respiretoria corresponden a estos puntos. En cualquiera de estos lugares de la cadena respiretoria, la - energla puede quedar "elmaceneda", mediante un cambio conflguracional - protëico, o bien ser transformada an energla "qulmica" (ATP) al transfe rirsK al sistema de ATP-aaas de las partlculas o elementales; tenien do que haber siempre un equilibria entra las dos formas de energla (po tencial de energla). La energla aal producida puede ser utilizada en procesos endoe nergëticoa, por la misma mitocondria, como: Slntesis de AJP, transporte de cationea, génesia de un gradiente de potencial elëctrico o tranahidro genaciones energizadas, o bien por procesos exoenergéticoa como disipa - cidn de energla calorifics, tal y como se express en el esquema VIII: Cualquier mecanismo o substancia qulmica que équilibré el nivel de H*, a través de la membrana mitocondrial colapaarë el gradiente de - potencial electroquimico y la energla liberada, tanto desde el almacen de la cadena respiratoria como por hidrolisis de ATP, serë liberada en - forma de calor. Este tipo de substancias se vienen definiendo como desa copiantes y al mecanismo de desviaciân energëtica hacla la forma calorlfi ca desaco plamiento. 63 Por ultimo, ademâs de la produccidn energëtica realizeda a nivel citoplësmi'co (glicolisie anaerobia) y a nivel mitocondrial (respiracidn - y fosforilizacidn) en desacoplamiento, el TAP tiene una tercera fuente de produccidn de energla a nivel de la membrana plasmâtica. En la mayorla de los tejidos la funcidn de la bomba Na/K de mem brana es mantener las concentraciones idnicas, utilizando en forma de tra bajo el ATP y solo una pequena parte de energla se pier de en forma de ce lor, Por el contrario en el T.A.P., el proceso, aunque el misma, es mucho mds intense y por elle al escape caldrico mucho mayor; de forma que la m yor parte del ATP utilizado en la bomba se libers en forma de calor, uti lizândose una mener cantldad en trabajo para el transporte idnico. Es de cir, que en este tipo de tejido la principal funcidn de la bomba Na/K de membrana es la produccidn y disipacidn caldrica. Este cambio en la ddLreccidn de aprovechemiento del ATP en la mem brana plasmdtica del adipocito perde estd motivado por un desajuste idnl co, que ha side demostrado por diferentes autores, tanto en condiciones - fisioldgicas del TAP, como experimentalmente mediante la adicion de subs tancias de accidn contraria. Ael: Girardier y cols, en 1.968, observaron que estimulando el adipocito pardo con N.E., sa modificaban las concentra clones de Na y K en el sentido de Incrementarse su permeabilidad. Este - mismo efeeto de aumento de la permeabilidad idnica, fud descrito por es - tos y otros autores (78-79) durants la terroogdnesis, en la que, de forma fisioldgicB, el adipocito perde es estimulado por la N.E. En embes cir cunstancias majora el flujo idnico, aumentando la entrada pasiva de Na y la salida de K, que secundarlamente provocarla un mayor funcionemiento de la bombe y del trabajo requerido en la vuelta a su lugar de origan de estos iones. En cualquier case, despues de pocos minutes de la adicidn de N.E. las concentraciones idnicas vuelven a nivel de repose, recuperdn dose el potencial de membrana (79-80). El efecto contrario fué puesto de manifiesto par Horwitz (8l), mediante la adicion de Oubaina, inhibidor de la bomba Na/K, capaz de bloquear en el 60 % el efecto de la N.E. < s UJ 3 a tn UJ Q. X N I i y UJ 3 at CO UJ CL »s N 66 Podemos considérer, por tanto, que a nivel de membrana plasmd tics estâ la tercera fuente de calor del adipocito pardo, en el mecanis mo: ATP/Trabajo con alto escape cal6rico. Esta produccidn caldrica que acabamos de describir ha sido re cientementa interpretada termodindmicamente por (Horowitz 1978), an su trabajo, formulando modelas termodindmicos en los cuales la cdlula del TAP se considéra como un "CONVERTIDOR ENERGETICO", La secuencia de su cesos celularas, como se puede ver an los esquemas IX y X, estd contra lad# por senales del Sistema Nervloso Simpdtico a travds de catecolami­ nas, en cuya interpretacidn mds adelante nos adentraramos. En el ESQUEMA IX, el limite cierra la unidad funcional del ta Jido (adipocito 4* espacio extracelular). La difusidn del Og sobre el 11 mite del sistema abierto (sale fuera del sistema). Los dcidos grasos de rivados de las vacuolas grasas son la energla que se introduce en el — tranaforraador calular. Cuando termina la transformacion se libera : COg H^O y calor. El flujo de calor atraviasa el limite del sistema y vasos capilares. Por tanto el flujo de O2, CO2 y calor esté asociado a la oxi dacidn de dcidos grasos: O2 + A.graso — — CO2 * H2O * Calor. Todo esto estdi de acuerdo con la conversion de energla qulmica en otras formas de energla que sigua la primera ley da termodindmica. Ahora este modelo lo vamos a desarrollar en el ESQUEMA X, tdr minas de un sistema no isotdrmico bajo condiciones constantes usando - rades termodindmicas, las rutas simuladas incluyen la slntesis de ATP - mitocondrial, la bomba NA/K de la membrana y la difusion idnica a travds de la membrana del adipocito, en lo que llamaremos "TRANSFDRMAOOR SECUEN CIAL". a,- Liberacidn de ac. grasos para ser oxidados an las mitocon - drias. Comprends la entrada de O2 y la salida primaria de - ATP y utilizacion de ATP AMP en la lipolisis. 67 b.— Utlllzacldn de los ac. grasos para la mitocondria para la slntesis da ATP y conversion de energla qulmica acumulada al sistema Redox. c.- El nivel de slntesis de ATP depends en parte de las deman das de la bomba Na/K de. la membrana, Aqul al utllizar ATP hay una transformacidn de una parte de energla qulmica en trabajo para el transporte idnico y conversion de otra par te de la energla qulmica en calor. d.- El ultimo components es el escape de iones a travds de la - membrana que-pueden modificar los nivelas idnicas, que-esta rdn compensados par el aumento de funcidn de la bomba Na/K. De todo esto sa desprende que la produccidn de calor total es la surne de las producciones individuales. pero Intimamente relacionadas, s * ®1 - La regulacion del transformador estd asociada a 3 hechos que ocurren en la membrana: 1.- Aumento de la permeabilidad. Se sabe que aumenta la conductivl dad tras la inyeccidn de N.E., ademds el aumento de flujo de - medido "in vitro" y el cambio de potencial de la membrana indica un movimiento altarado de algunas partlculas cargadas a travds de la membrana. 2.— La"N.E. estimula la adenilciclasa (AC} que cataliza la slntesis de AMP que va a promovar la activacidn de la hormona lipasa ca paz de lipolisis. 3.- La N.E. estimula la bomba Na/K por mécanismes. Via estimulacidn de un cambio en las concentracionas idnicas intracelulares [es æ cape Iones] y via incremento AMP^ a través de la adenilciclasa; Con lo expuesto hasta el momenta, podemos contester a la mayor parte de las preguntas planteadas en prlncipio. 1®,- La energla producida en ûltimo tôrmino en el TAP es fundamen talmente caldrica y en mener proporcidn qulmica. Al rêvés qu> en cualquier cêlula la produccidn de calor es del 90 % frente al 10 % de ATP o 8TP, 2®,— Ahora bien, esta energla calorlfica no es producida en su-tota lidad directamente, sind que en parte se debe a una transforma cidn de ATP en calor, es decir, que en este sentido la célula funciona como un "convertidor energético". 3®.- Las fuentes energéticas son très: Citoplésmica, mitocondrial y bomba Na/K en membrana plasmdtica, cada une con sus peculiar^ dades respecto a otras células. Asl a nivel citopldsmico la produccidn energética ea superior a la de cualquier célula, su produccidn es fundamentsImente en forma de ATP que después se convertiran en calor. A nivel mitocondrial los especiales mécanismes de desacoplamien to hacen que se invierta la proporcidn energética, respecta a las mitocondrias de las otras células, a favor de produccidn — caldrica, pero tambien perte del ATP producido puede ser conver tido o desviado posteriormente hacia calor. Y a nivel de membrana plasmdrica la energla qulmica es trans for mada primero en trabajo de transporte idnico, pero principeImen te en disposicidn calorlfica. 69 4 ® En cualqulera de las fuentes citadas vemos que los mécanismes por los cuales se produce la energia, son esencialmente igua les a los que suceden en cualquier otra célula: Glicolisis - anaerobia, oxidacion de écidos grasos, transporte idnico..etc. pero de tal manera "acondicionados" o modificados que hacen — desviar el balance de produccidn de energla hacia la forma de calor. 5®.— Per ûltimo, hay que entender tambien que una parte de la enw gla producida como ATP sa conserverie como tal y, sin transfer marse a calor, séria utilizada por el propio adipocito para su mantehimiento funcional, incluso en la propia activacidn de ddl dos grasos, transporte, de loe mismos... etc. 6®«— Firialmente con los datoa expueatos podemos contester, aunque - solo sea parcialmente, a la pregunta sobre los contrôles de — estos mecanismos. Como ha podido observerse los propios factores comprometides en las funciones energéticas del TAP, se comportan como reguladores In timos de las mismas. Asl el nivel de NAOH citopldsmico y de enzimas im bricedos en la glicolisis anaerobia controlan esta via energética. Los factores de desacoplamiento y reacoplamiento, como ndKvel de ATP, Pi, O2, propios écidos grasos... etc., controlan la funcidn mitocondrial del TAP. Pero sobre todos estos factores existen otros, extrinsecos - al adipocito, cepaces de regular en ûltimo término la funcidn tarmogéni ca del TAP, de caracter hormonal y nervloso fiwidamentaimente, y en cuya descripcion entraremos a continuacidn. s O S UI =3 (3 tn UI 71 Requlacldn nervlosa y hormonal del TAM y su funcidn termogénlca. Para poder responder a esta pregunta, comenzaremos por expo- ner el esquema de Horowitz y Plant (1978) : El mecanismo'integrador del ’Sistema nervioso autdnomo es el hipotdlamo, localizado en el centro de la encrucijada del llamado sis tema llmbico o visceral, y que contribuye al control del funcionamien to visceral de los vertebrados, ejerciendo un doble control nervioso y endocrine. Asi pues al hipotdlano ea el principal centro regulador de la temperature, junto con el resto de funcionea végétatives y reel biendo informacidn acerca da la temperature corporal régula la produc cidn y conservacldn del calor. Los centroa termosensitivos del hipotdlamo estd localizados en drees rostral y caudal. De ellos, los nûcleos rostrales -circundan tea al supradptlco y paraventricular- regulan la disipacidn de calor, mientras que los caudales, su generacidn y conservacldn. El estlmulo que normaImente active estas dreas as el enfrla miento o calantemisnto de la sangrs qua irriga el hipotdlamo; ante al tas temperatures, entran an funcion los centros rostrales y con tempe raturas bajas sanguineaa los caudales. Pero este mismo efecto puede - consegulrse varlando directamente la temperature del hipotdlamo o, por via perifdrlea, ante las aensaciones de calor y frio. El Sistema nervioso simpdtico, es el efector primarlo median te la liberacidn de Catecolaminas (Adrenaline, Noradrenalina, Isopropi^ noradrenaline a nival perifdrico, ademdd de otras que, como el GAGA, — actdan a nivel central) que liberadas de las terminacionss nerviosas simpdticas conducirian a la elevacidn de la temperature con produccidn de calor y conservacldn del mismo; mientras qua la disminucidn de es - 72 tas substancias o, la liberacidn de sus "antagonistes", conllevaria - a una disipacidn del calor, Ello mediante le estimulacidn de aquellos drganos comprometidos con la termogénesis, drganos efectores, de natu raleza e importancia distinta segûn los animales. En los vertebrados este sistema efector los componen principeImente: sistema vascular, - pllomotriz, sudorlparo, drganos metabdlicos como el tejido adiposo, - muscular, intestinal,,., etc,, e incluso el comportamiento del animal. En la adaptacidn al frio, para producir y conserver el ca_ lor, estos drganos efectores realizan funciones como: vaeoconstriccidn disminucidn de la sudoracidn, creacion de cdmaras de aire subpilosas, incluso comportamientoa especiales "en buses de lugares cdlidos" que - en su rodxima expresidn supondrian las emigraciones, y por dltimo, pro duciendo iwi incremento del metabolismo por estimulacidn de distintos - drganos como son: a) para la produccidn de calor a corto plazo, estimulacidn — del tejido muscular con la consecuencia de contracciones - liberedoras de energia, mecanismo conocido como termogéne sis temblorosa; b) produccidn de calor a mayor plazo estimulando el tejido — adiposo que liberaria una mayor cantidad de dcidos grasos - o combustible; c) un tercer sistema a largo plazo implicaria excitacidn del - eje Hipotlamao-Adrenal-Tiroideo, cuyo resultado séria un — incremento global de la actividad metabdlies de la mayorla de los tejidos orgénicos. Si las demandas no son extremes, tal metabolismo podrla incrementarse indefinidamente. En circunstancias especiales, como en recien nacidos, animales hibernantes, o en aquellos equipados de TAP durante toda su vida, este drgano puede realizar una alta produccidn energëtica contribuyendo al - mantenimiento de la temperature corporal (por caminos no temblorosos), 73 a alcanzar la temperatura de neutralldad adulta eh el recien nacldo, o a despertar da la hlbernaclon. Todo ello grades a su especial condiclo namlanto para la produccidn de calor, que hace a estas cëlulas espaces de una termogénesis mds efactiva que el resto de los tejidos citados, - razdn por la cual se las viene considerando como "verdaderos hornoa ca lorlgenos*!. La actividad opuesta: "disipacidn de calor o enfriamiento cor poral" se realize fundamentalmente a través de: Vasodilatacidn, sudox^ cidn, polipnea y jadeo, disminucidn del metabolismo en diferentes drga nos, y comportamientoa animales "en busca de lugares frios" o entrando en hibemacion. Predomlnando unes u otras respuestas segdn el animal, - asl la polipnea y jadeo en el perro, la sudoracidn en el hombre... etc. Como se ve la mayor parte de los drganos comprometidos en la termoregulacion son comunea para la adaptacidn al frio o al calor y sus respuestas opuestas. Esto se viene expllcando por la presencia de dos - tipos de receptores o aceptores Alfa y Beta, cuyo comportamiento se in terprêta de dos formas diferentes: 1] Las catecolaminas (E; NLE.; y I,N.E.) estimularian con di ferente signo al drgano efector segdn se uniesen a recegr tores Alfa y Beta. Si la unidn se realize en un receptor - Alfa, cauaarlan excitacidn del mdsculo Usa con vasocons - triccidn, aumento de la actividad metabdlica, contraccidn esquelética, etc, y viceversa si la unidn se realize en - receptores Beta. Esto explicarla acciones paraddjicas de - las catecolaminas en algunos di'ganos, en los que los tlpos de receptores serlan opuestos a los habltuales. 2) Sln embargo, actualmente se vienen considerando que las - catecolaminas no funcionarian como un dnico neurotransml - sor de accidn distinta dependiendo del aceptor, sind que - 74 cada una da alias tendrla su aceptor y accidn especlfica, asi la N.E., sarla Alfa excitante especifico, la isoprenalina es Beta excitante especifico, mientras que la epinefia puede ex citar ambos receptores Alfa y Beta. En el caso concrato de la N.E. mds estudiada, se considéra que se uniria al receptor de membrana, o locus de la membrana cargado nega tivamente y capaz de atraer el amonio de la N.E. cargado positivamen te, es posible que este locus no sea otra cosa que el fosfato del ATP, formando el complejo ATP-N.E., capaz de estimular a la membrana quimica mente a travds de la adenilciclasa, o eldctricamente despolarizdndola, a la vez que neutralize el neurotransmisor. Como vemos el tejido graso pardo, en esta panordmica compleja - de termogénesis, estd comprometido muy especialmente dentro de vias me tabdlicas y principeImente en el période de recien nacido en un gran nû mero de animales, entre ellos el hombre, y de manera més particular en animales hibernantes durante el despertar del sueno invernal. Su accidn calorifica estd controlada por: a) Receptores térmicoa. como pieL:. médula espinal, sus senales son transmitidaa al SNC concretamente al hipotdlamo. b) Centros hiootaldmicos. que actuarian a través de c y d. c) S.N.B., a través de catecolaminas espaces de estimular directe mente al adipocito pardo, produciendo lipolisis y aprovechamien to energético de los dcidos grasos. d) Eje adrenal-tiroideo. que mediante la liberacidn de diferentes hormones : Epinefrina, N.E., Glljcagon y Tirosina, a la circula cidn sanguines estimularia la célula adiposa, tambien en senti do lioolitico y productor de calor. 75 De todas estas substancias la que mayor accidn reguladora tie ne y por ello, la que ,ejor ha sido estudiada, son las catecolaminas y fundamentalmente la N.E., cuya accidn lipolltica se desarrollarla segûn el patrdn antes expuesto, a través de los receptores. Dichos receptores han sido particularmente estudiados a nivel del tejido adiposo, tanto - blanco como pardo, rozdn por la cual en varias ocasiones las interprets ciones de los mismos son contradictorias y todavia no unénimes. Como ya hemâs senalado, los receptores de membrana para cateco laminas, pueden tener una funcidn diferente segûn el tejido utilizado.- En el caso del tejido adiposo, en sus variantes blanco y pardo, se vie nés admitiendo desde qua Fain lo describid en 1967, que las catecoland nas a través de su interaccidn con ^receptores de la membrana del — adipocito, estimularian la lipolisis, esta idea ha sido confirmada y - ampliada por NichoUs (02); Bupns y Langley (83), han demostrado la pre sencia en el tejido adiposo pardo de o^ -receptores para distintas subs tancias de efecto lipogénico, asl como substancias K-adranoceptores - bloqueantes que estimularian la lipolisis en el tejido adiposo pardo y en el tejido adiposo humano, pero que no sa han encontrado en al tejido adiposo blanco da la rata, como demuestra Itaya (84) a través de la phen tolamina o como la fenoxlbenzamlna demostrado por Luzio y Jones o como- las hormones TSH, ACTH y glucegon (citados en el trabajo de Itaya). Por otra parte y simulténeamente otros autores como Moskowitz y Chrisna (85) han evidenciado la accidn inhibidora de la hipogénesis co mo la Prostaglandina Eĵ Insulina (85,06) y propanolol (86), que son — ^-edrenérgicos antagonistes. Todas estas substancias lipollticas citadas, como la N.E., ac tuarian aumentando el nivel AMPc, mientras que las inhibidas de la lipo lisis producirian un décrémente de este mismo. 76 La N.E. liberada por las termineciones nervioses o directamen te del sistema vascular, actuaria de la forma edmitida universaImente para la mayor parta de las hormones, produce una estimulacidn de la - membrane plasmdtica del adipocito, bien a través de receptores qufml COS para la N.E. o bien por despolarizacidn idnica, cualqulera de es tos mecanismos llevarfa a una activacidn de la Adenilciclasa proteina que empila y transmite el estfmulo o serial al ci to plasma produciendo una acumulacidn de AMPc, el cual a su vez movilizarla las lipesas de sencadenando una accidn lipolltica (87). Con ello vemos que el papel y el mecanismo regulador de-las catecolaminas sobre el tejido adiposo pardo fuera de duda y cada vez se van conociendo més hormones y sustancias capaces de potenciar o — inhibir este efecto de las catecolaminas, aunque todavia este conoci miento es muy incipiente y problemética. y/ I N T R O O U C C I O N 78 Reclentements sa ha demostrado que el tejido graso, -tanto el blanco como el pardo-, poseen receptores para glucocorticoïdes (Feldman y Loose 1977; Feldman 1978), podemos considérer, por tanto, a las dos variantes de tejido graso como drganos diana de estas hormones,Pero tan to los efectos concratos sobre el tejido adiposo blanco y menos adn sobre el tejido adiposo pardo, como los mecanismos de accidn glucococticoides nos son todavia desconocldos. Acciones de los Glucocorticoides sobre el metabolismo general y adiposo; El efecto primarlo de los glucocorticoides sobre el metaboli^ mo hidrocarbonado es una aceleracidn del proceso conocido como gluconeo génesis. La hipoglucemia y la deplecion de glucdgeno hepético tipicas - 79 que siguen a una adrenalectamla se corrigen adminlstrando un glucocorti coide potente como el cortisol. Por otro lodo, tras esta administracitfn la concentracidn de nitrdgeno urinario se increments, probando que la - fuente de glucose no serlan los H. de C. sind las proteinas. IguaImente se considéra que estas hormones tienen un efecto de finido sobre el metabolismo de los llpidos. La administracidn crdnica de Hormones glucocorticoides conduce a los animales a una hiperl^pemia e hi percolesterinemia y, en las personas, a una lipogdnesis con incremento en la cantidad total de grasas Junto a una redistribucidn centrlpeta — androidede la graaa orgénica. Otros efectos de los glucocorticoides se hallan estrechamente imbricados (con relacidn causa/efecto], con estas acciones metabdlicas, asl: - La sobredosificacidn crdnica de cortisol origine disminucidn de la proteina muscular y edema y fibrosis ael tejido muscular, y variaciones cuantitativa y de distribucidn del tejido #diposo. - Su efecto catabdlico o movilizador de proteinas se manifiesta - tambien a nivel del metabolismo dseo, produciendo una dismlnu cidn del desarroUo del cartilage, interrupcidn del crecimiento e inhibicidn de la neoformacidn deea. - Su efecto sobre las células sangulneas periféricas: Linfopenia que alcanza el 45 d 50 % y deplecidn eosindfila hasta el 90 %, a veces de aparicidn muy râpida en algunos animales. Efectos que aunque no pueden explicarse bien, pueden suponer, al menos par - cialmente, un mecanismo para dejar a disposicidn del organismo una buena cantidad de proteina que pueda utilizarse de inmediato por caminos gluconeogénicos. 80 Otras acciones glucocorticoides sin embargo no estén ligedas a su efecto metabdlico, como: - Accidn sobre el metabolismo hidrosalino, con retencion de sodio y agua, - Accidn antiinflamatoria: . disminucidn hiperhemia . disminucidn exudacidn • disminucidn extravasacidn - adoeis altaa • disminucidn de respuesta celular • disminucidn de liberacidn y produccidn de anticuerpos tras un aumento inicial por destruccidn de plasméticas - — a dosis baja» No afectan produccidn Ac, - E incluso au accidn "diabetdgena" ("Oiabetes por estoroides"), que se présenta ante una sobredosificacidn debida al antagonis mo insulinico que muestran los glucocorticoides, o que por lo menos, es habitualmente interpretada por este mecanismo, si bien con marcsje isotdpico radiactivo puede comprobarse que mayor im portancia que este camino tiene la neoglucogénesis. Pero asi como la accidn sobre H, de C, y proteinas parece suficientemen t» explicada, el efecto sobre el metabolismo graso y el tejido adiposo no ha sido demasiado estudiado, y ademds, entre los autores que se han dedicado a este tema no hay muchas veces acuerdo ni en los resultados ni en la interpretacidn de los mismos. La accidn lipogdnica de los glucocorticoides ha sido observada en grasa blancs y tambien séria lads en tejido ediposo blanco par mucho s autores (91,96), a travds de: - Aumento del peso del drgano graso y de su contenido tan to hidrico como lipidico; - Aumento del tamano del adipocito; 81 — Aumento del tamano de las gotas citoplâsmlcas; y final mente, — Aumento del depdsito de trlglicéridos por gota, tambien confirmada en hlgedo por Kiraberg (1968). Algunos de estos auto res (94,95) sin embargo, encuentran esta accidn paraddjica, ya que en condiciones normales los glucocorticoides tienen una accidn antilipogd nica. Para explicarse este hecho vienen arguyendo que los Ifpidos depo sitados en el tejido graso tienen que provenir del exterior y no a tra vds de una auténtica lipogdnssis calular. Tambien se ha intentado expli car (97), la formacidn da triglicdridos a travée del glucdgeno. Los partidarios da la accidn lipogénica en los hallazgos enzl méticos y fisioldgicos expérimentales da la célula grasa, han descrito, wi primer lugar una disminucidn de écidos grasos oxidablea y naturalmen ta da la oxidacidn da los mismos, hecho que corrobora la disminucidn d* apoenzimas deshidrogenasas mitocondriales comprometides en el ciclo da Arabe, asl como del coenzima NAOy,y de los citocromoa b y C, igualmente lo confirma la disminucidn del consuma de 0^ descrita por Kinberg' (97) en ratas tratadas con cortisol a los 10 dias, que no se normalize has ta los 30 dias, e incluso la disminucidn de formacidn de GO^ descrita por (Sk^la y cols. 91, Haatom y cols. 98 y/Dryar y cols, 99), con mar caja isotdpicos dal écido Palmltico. Los aumentos descritos en enzimae citopléemicos del tipo de la glicarofosfato deshidrogenasa NAO, dapendiente y Piruveto kinasa acti vadora dsl peso Piruvico-acatil coA, nos demostrarian ademés un posible aprovechamiento energético de la glucose, un aprovechemiento de la mis ma para produccidn de éoldos grasos. La presencia de alfa-glicarol-kinasa descrita en la célula gra sa por Mersmann (lOO) e incrementada tras la administracidn de glucocor ticoides, nos confirma una activa slntesis de Glicerol, o segundo elemen to necesario para la slntesis da triglicéridos. 02 Los estudlos sobre el enzima de membrana Protein-Lipasa y so­ bre Lipasa Tisular hechos por Hahn (lOl) y Rault (102j, han demostrado que la primera, aumenta durante el periocb de lactancia de la rata, de cayendo al instaurarsa la dieta sdlida (pobre en grasasJ hacia el d£a - 20. Su aumento tras la administracidn de Cortisone, indica la accidn fa vorecedora de esta en la incorporacidn de écidos grasos al adipocito, - accidn que siempre estarla mediatizada por la degranulacidn mastocitaria. La accidn de la Cortisona sobre la lipasa tisular, es total — mente inversa a la de la protein-lipasa, (lOl], disminuyendo su nivel y por tanto, su accidn lipolltioa. Pero junto a estos efectos de los glucocorticoides, han sido descritos en la literature otros totalmenta inversos, que podrlan solo explicarnos un efecto lipolitico de estas hormones, o por lo menos anti lipogénicos, como: Incrementos de las desidrogenasas mitocondriales corn promstidas en el ciclo de Krebs, Deplecidn de Citocromoa C y b, disminu cidn de nivel y actividad de coenzimas NAD, atrofia de la grasa blanca y del tejido adiposo blanco, con regresion del drgano graso; asl como dis minucidn en los depdsitos de glucdgeno del adipocito. Quizâ par piarte de estos datos, se explica por las diferentes dosificaciones empleadas; y quizds tambien, por causa de sobredosifica ciones que conllevarlan tdxicidad y destruccidn célular, fundamentalmen te de algunos organelos entre ellos las mitocondrias. MECANISMOS DE ACCIDN DE LOS GLUCOCORTICOIDES Asl como el mecanismo de accidn de las catecolaminas, princi pales reguladores (como comentamos anteriormente), sin embargo el mecanis mo de accidn de otros reguladores adiposos como los glucocorticoides dis ta mucho de ser totalmente interpretado y sobre todo de serlo con unanimi dad. 83 A lo largo da la hlstorla se han dado varias interpretaciones que podemos esquematizar an cuatro posturas principales: - Accidn permisiva. - A travds de la N.E, - A travds de la Insulina - Accidn directs con o sin intsrvencion del AMPc^ El efecto permisivo de los glucocorticoides. se elevd a catego rfa de mecanismo general da estas hormonas, segdn el cual muchas cdlu las sensibles a diverses estlmulos sdlo reponderlan a los mismos si as tdn expuestas a una cierta concentracidn bdsica de esteroides adrenalo corticales. Esta accidn permisiva aparece ejsmplificada en mdltiples oca siones, asl fud demostrada an el "Sindrome General de Adaptacidn" por — Engel en 1957 (l03), o por la carencia de respuesta de las arteriolas al efecto prssor de la N.E. an animales adrenalectomizados, o an la absor - cidn de glucose y calcio en el intestine de animales en iguales clrcuns tancias, entre otros varios ejemplos. En cuanto a la accidn de los glucocorticoides a travds de la - N.E.. ha sido demostrado (91,96), la Cortisona disminuye an un tezxio la accidn de la N.E., da ahl que aumenta la lipogdnesis, el nùnaro y ta mano de veslculas, incluso el tomafUj de la grasa y el peso del animal — absolute y relativamenta segdn estos autores. Esta accidn conllsvaria - tambien una inhibicidn mitocondrial y naturalmente disminucidn de la 11 polisis y de la produccidn de calor. Otros autoree sin embargo piensan que la accidn de la Cortisona y glucocorticoides, en el tejido graso, més que a une inhibicidn da la N.E., se debe a una liberacidn de Insulina o por lo menos a un mecanismo permisivo de los glucocorticoides. 04 El mecanismo de accidn de los glucocortlcoides, ha sida amplla mente tratado en un trabajo de revlsiôn por Thompson y Llppman en 1974, y partlendo de la slnapsls que el mismo aporta de todos los datos blbllo grâflcos y anadlândo los de posterior aparicidn, podria esquematlzarsa aa£: El glucocorticoida segregado por el cortex adrenal pasa a san gre donde puede ser transportado de formas: - Uni do a alfd gl'obulinas, transcortina o globulina transportado ra de Corticoïdes (CBQ) - Unldo a olbûnlnas. - Como hormona libre, slendo esta ûltlma fraccldn la mas pequena en condlclones flslolâglcas, slempre Inferior al 10 %, y adamés la ûnlca forma capaz de Jünteeacclonar con los tejldos dlana — (105,106). Como hace un momento comentdbamos, Feldman y Loose (88), hen venldo a conflrmarnos que el tejldb adlposo posed receptores cltopldsm^ COS para los glucocortlcoides y esteroldes en general, y que, por tan to, es un drgano dlana de estas hormonaa. Dlchos receptores son protel nas termolâblles cuya aflnldad por los dlferentes esteroldes slgue la slgulenta secuencla: Dexametaxona^ Cortlcoaterona^ Progesterone^ Aldosterone^ Cortexolona^ Testosterone^ Estradiol, por tanto con alŸa aflnldad y especlflcldad para los glucocortlcoides Rodemos asumlr por tanto que la fraccldn libre de los glucocortlcoides plasmëtlcos se une a estos receptores. Sln embargo los receptores alslados por Feldman se hallan en la fraccldn cltosol y no en membrane, Indlcdndonos que en este caso no 85 se segulrâ el camlno senalado antes para la N.E., Insullna y mayor parte de las hormones, slnd que dlrectamente el glucocorticoids atreveserd la membrane plasmdtica del adipocito y se unird al receptor citoplâsmico. Un problems no resuslto es si la accidn se realize dlrectamente por el complejo receptor/glucocortlcolde o si neceslta como en el caso de la N.E. y otras hormones, la Intervencldn del AMPc como “segundô mens#je ro". Las experlenclas pretendlendo aclarar este extremo son muchas y con resultados dlferentes. Algunos autores (107,108] han conflrmado que el AMPc es necesarlo pare que los glucocortlcoides reallcen su accldn atrlbuydndole el papal de mensajero. Sln embargo otros trabajos, mas nu merosos, senalan que es necesarla la Interaccldn del glucocortlcoides - con el AMPc, pero no como un eslabdn mds de la cadena de accldn slnd sim plemente porqus al AMPc reellzarla funclones especlflcas de fosforlllza cldn .... etc., sln las cuales el complejo esterolde/receptor no podria ser efectlvo, pero sln que nunca halle une accldn directe del AMPc; y fi nalmente otros autores (109,110) Interppetan que es dlrectamente el corn plejo glucocotlcolde/receptor el que entraria en el nûcleo y actuerla sln Intervencldn nlnguna del AMPc. Otra partlcülaridad de la menace de actuar los glucocortlcoides es que parece conflrmado que su accldn no se realize dlrectamente en el cltoplasma, slnd que requiers alcanzar e Informer al DMA nuclear para In- terferlr la slntesls de RNA^ que dlrlglrla la slntesls de la protelna en zlmdtlca efectlva o capeuc de desencadenar el efecto deseedo por el glu cocortlcolde. Este hecho ha sldo evldenclado por muchos camlnos: A tra vds de Inhlbldores del DMA como la Aotlnomlclna 0, (111,112,113), Radlfê clones ultravloletas, Payos X y otras substanclas Inhlbldoras de la — RNAasa pollmerasa (114), medlclones directes (115), e Incluse por la dlla cldn de tlempo que media entre la acknlnlstracldn del glucocortlcolde y la respuesta celular. 86 Se plensa, por tanto, que bien por interaccldn del AMPc o sln alla, el complejo glucocortlcolde/receptor alcanza el nûcleo. Este peso puede reallzarse en union al receptor cltopldsmico o tras un recamblo - de este por otro receptor nuclear como afirman Sekerls y cols. [116,1172 y Muck [118j, y una vez alll modlflcarlan el slstema: DfJA, RNA^, slnte sis protdlca. Esta ûltlma accldn ha sldo tamblen expllcada de dlferentes ma neras en dlstlntas experlenclas % -Para algunos, la slntesls protdlca po drla ser estlmulada o Inhlblda por alteraclones en la "cantldad" d# RW slntetlzado [119)j -Para otros, los glucocortlcoides produclrlan una In hlblcldn de la RNA pollmerasa (114); o bien, como sugleren Sajdeî^ Je cob [120), la RNA pollmerasa sufrlrla una alteracldn "alostêrlca" por el glucocortlcolde, mejorando asl su actlvldad, -Hay tamblen quieopreconi za una alteracldm del ONA, por lo tanto de los genes estructurales, para la transcrlpclom[121); o un bloquée de la transcrlpcldn de clertos ti - pos de RNAj.; pero lo mds probable parece ser que el glucocortlcolde pro voque la slntesls de nuevos tlpos de RNA^ espaces de dar las protelnaa enzlmdtlcas requerldas para la respuesta, de lo cual hay evldenclas en la cêlulas grasa [ill), tlmocltos [106,122) mûsculo [123), a través de bloqueantes como la Aotlnomlclna D. Rsdemos resumlr dlciendo como expresa textualmente el mlsmo — Thompson. esté claro el mecanismo exacte de la actuaclon de los este roides en la cdlula, lo que si se puede apreclar es que, tanto los este roides como los receptores cltopldsmicos, como, los nucleares (si exl^ ten), el DNA y RTTA, estdn Involucrados en la respuesta**. Y esta falta - de darldact sobre el mecanismo general de glucocortlcoides no sdlo es - empilable al Tejldo Adlposo Dlanco, slnd tamblen, y con mayor desconoc^ miento, al tejldo pardo principal objeto de nuestro estudio. 87 Estas son las razonas principales de que hayamos elegldo este - tema como objetlvo de nuestro estudloy proponlendonos fundamentalmente clarlflcar, en lo poslble, la accldn concrete de los glucocortlcoides - en el adipocito pardo selecclonando culdadosamente les dosls usades, to da vez que la gran varledad de las empleadas por dlstlntos autores nos ha parecldo la principal fuente de controverala en los resultados. El primer problème que se nos ha planteado ha sldo el de eleglr el momento, la dosls y la pauta de admlnlstrecldn de los glucocortlcoides. 18, Momento% _ - ^lacclonamos para la Inyeccldn ratas posnatales, eu ya edad comprendla desde el dla 5 al 20, por varias - razones. En primer lugar ee el perlodo de mayor actlvldad del tejldo adl poso pardo en la rata, toda vez que es el tlempo en que el animal ha de pasar de la temperature materna a la amblentai y flnalmente a la basai - adulte (44,45,46} mlentras que a partir del die 20, sdlo tendrla funcldn de mantenlmlento en la rata normal y en condlclones flsloldglcas. Por — otro lado, este perlodo, corresponde al de lactancla (a partir del dla - 20, el animal Inglere allmento sdlldo (Heihn, 1966], por lo que la Inges ta rlca en grasa facilita una mayor actlvldad del adipocito pardo, Ade mds este tlempo coïncide con el perlodo maduratlvo del drgano pardo en la rata (38), lo cual nos parmita medlr la Influencla del glucocortlcoi de en el mlsmo y con el estableclmlento del rltmo clrcadlano definitive - que ocurre a las cuatro semanas, slendo hasta entonces los clclos de — dos dlas de duracldn (124,125). Y por ûltlmo, y sobre todo, este tlempo - vlene a ser équivalante al perlodo de mayor actlvldad del tejldo adlposo psrdo en la especle humane , calculado en les primeras semanas de vida, - tlempo a partir del cual se atroflarfa e Involuclonarla, parmitlendonos - asl una dpllcacldn de nuestra experlencla a la cllnlca humane. Igualmente, se excluyeron los cuatro prlmeros dlas de vida de la rata porqus el nlvel de glucocortlcoides de le rata al nacer debe su con 68 centracion a la secrecliSn materna, 28, Doals y pauta ds adminlstracidn; Como antes hemos comentado, — nos parece precisamenta la do sificacidn y pauta de administracidn tan diferente y elevada, lo que ha creado mayor conflictividad en los resultados hallados por diferentes — autores. EL glucocortlcoides mds abundantamente segregado por el cortex adrenal de la rata es la Cortlcosterona, de accldn équivalente al Cortl sol, principal secrecldn del rssto de mamlferos no roedores, entre alias el hombre. Nosotros, partlendo del cdlculo de la secrecldn de la suprare nal da la rata, del dfa 1 al 20 de vida, hemos buscado una dosls y una - pauta de administracidn que fuesen el equivalents: a un tratamlento Inten so y prolongado an cllnlca humane, con el fin de conseguLr un efecto far mecoldglco mantenldo, pero huyendo de los efectos tdxlcos de las elevadl slmas dosls empleadas haste ahora por numerosos autores. De acuerdo con todos estos requlsltos, la dosls de eleccldn pe ra nosotros ha sldo 5 mg. de Hldrocortlsona por Kg de peso y dfa [eqid valante a 1,25 mg. de Prednisone por Kg. y dfa), Inyectândose dlarlamen te deade el dfa 5 al 21 de la vlda da la rata. En la mayor parte de los trabajos existantes se admlnlstran do sis sumamente elevadas, en un perlodo de tlempo muy corto, bien de 1 a - 3 dlas, o bien en Inyeccldn ûnlca, hecho que tamblen aleje estas experlen des de su poslble apllcacldn a la clfnlca humane. Asf Aronson (1954) en hamsters y ratones prepuberales vlene Inyectando 1 mg. de cortisone por - cada 4g. de peso y dfa (250 mg. por Kg. y/dfa) durante dos dlas; y Hahn y cols. (1969) admlnlstran 1 mg. de cortisone por cada 20 g. de peso y dfa (SO mg. por Kg. y dfa) durante 1 a 3 dlas, a ratas de 7 a 10 dlas de vida, es declr una dosls dlez veces superior a la empleada por nosotros. æ Parées Indudable que dosls tan elevadaa han de produclr efectos tdxl COS que invalldarlan los resultados obtenldos,Esta Impresldn vlene a conflrmarla el estudio de Klmberg (1960), Este autor admlnlstrd 5 mg, de Cortisone por dla, dlrante 6 dlas a ratas de 125 gr. de peso ( 1 mg. de Cortisone por 25 gr. de peso y dla), y estudld sus efectos sobre las roltocondrlas del tilgacb con los slgulentes resultados: a) Las mltocondrlas aumentan de tamano y dlsmlnuyen en nûmero. b) Con mlcroscopla electrdnlca, se observa una degeneracldn de - lae ml amas con aumento del tamano de la matirlz, aplanamlento - de las cresteis envolventes, Involucldn y pérdlda de las cres tas y dlsmlnuclon del nûmero de grënulos densos de la metrlz; todos ellos atrlbutos morfoldglcos tfplcos de degeneracldn nd tocondrlal e Inhlblcldn funclonal. c) Corroboran estos datos morfoldglcos la Inhlblcldn de la actlvi dad de la cltocromo B y C, asl como del coenzlma NAO. De todos estos hechos, el autor deduce que hay una Inhlblcldn mltocondrlal acompanada de desacoplamlento en los mecanismos de respira cldn/fosforlllzacldn oxidative, debldos a una degeneracldn mltocondrlal. Skala y Hanh (197D) constatan Igualmente una Incrementada f%m gllldad de las mltocondrlas de la grasa parda en las ratas de ID dlae- Inyectadas 24 h. antes, con una dosls ûnlca de 1 mg. de Cortisone por — cada 2D gr. de peso. Nosotros hemos elegldo una dosls slgnlflcatlvamente mes baja por este doble motlvo: 10.- Para evltar que cualquler efecto tdxlco enmascare el verda dero efecto farmacoldglco de los glucocortlcoides sobre la grasa parda que pretendemos Investlgar; y 90 20,- Al emplear una dosls y un perlodo de administracidn equlve lente a un tratamlento glucocortlcolde de moderada Intensl, dad en cllnlca Humana (1,25 mg. de Prednlsona por Kg, y — dla), queremos dejar ablerta la poslbllldad de una future apllcacldn de nuestros resultados al campo de la pedlatrla. Los parâmetros elegldos para valorar los poslbles efectos de los glucocortlcoides sobre la grasa parda son los slgulentes: 10.Peso corporel. 20.Peso del Tejldo Adlposo Blanco 30.Dlëmetro de los adlpocltos pardos. 49.Nùmero de gotas por adipocito. 50.Hlstoqulmlca dptlca: _ . ...- Enzlmatlca. - No enzlmdtlca. 60.Hlstoqulmlca electrdnlca: _ ^- Enzlmatlca. - No enzlmétlca. 70.Datos estructurales y ultraestructurales. La valoracldn de algunos de los resultados, como se verë en el capltulo de material y mâtodos, se llevd a cabo comparando mediants un rlguroso método estadlstlco, un grupo de animales Inyectados y otro de animales testlgos. '1 \ M A T E R I A L y M E T O O O S METOOOS HISTOLDGICOS, HI3T0QUIMIC0S ULTRAESTRUCTORALES 93 Se utlllzaron ratas blancas de raza fflstar dlstrlbuldas en - nueve camadas de 7 a 10 crias cada una. En cada camada se utllizd el sis tema de nùmeros aleatories para decldir cuales iban a ser contrôles y — cuales se iban a utilizer como reactivas, es declr se les Inyectaba acto cortlna. De elles se Iba a tomar slempre un nûmero par y si el nûmero de crias de la camada era Imper, el que le correspondlese el n> 3 quedarla sln marcaje alguno en la camada, hasta la hors del sacrlflclo. Una vez claslflcados, obtuvlmos 2 poblaclones: La poblacldn OONTROL formada por las ratas que en la tabla de nùmeros alsatorlos le - correspondlan nùmeros Impares y la poblaclon INYECTADOS a las que le - correspondlan nùmeros pares. En esas nueve camadas, obtuvlmos un total de 70 Indlvlduos, 35 de los cuales formaban la poblaclén control y 35 le poblacldn Inyectada. 94 Al qidnto dfa de vida postnatal, eran pesados todos los animales y se marcaban para poder distinguir a cada animal, estableciendo ya a los animales contrôles e inyectados, a estos ùltimos desde el dfa 5 hasta el 21 se Inyectaba diariamenta ACTOCORTINA [Léo] a dosls de 5 mg/Kg. peso, — renovando cada très dfas, la dosls segùn el peso del animal. En el dla 21 los animales eran pesado en el momento anterior al sacrlflclo daspuôs del cual se extrafa el drgano graso Interescapular por dlseccldn, pesdndose a contlnuacldn e Inmedlatamente se Inclufa segdn las tdcnlcas deseadas. Es tas tdcnlcas las podemos dlvldlr en très apartados: Mlcroscopla dptica; donde las plezas se fljaban en for ' mol al 10 %, y po sterlorment e se procesaban segûn los dlferentes métodos expuestos a contlnuacldn. Valoracldn hlstoqulmlca: para ello las plezas fueron - congeladas Inmedlatamente y otras fljadas en formol-calclo y posterlormeii te congeladas o en acetona o formol, en todos los casos, se obtuvleron — cortes de 7 mlcras con crlostato, las cuales fueron Incubados con los subs tratos correspondlentes. Oespués de Incubadas, y contrastadas y montadas - las preparaclones, la valoracldn de su actlvldad se reallzd por contaJe de granos de preclpltados par unldad de superficie celular, comparando no sd lo la dlferencla entre animales con actocortlna y contrôles, slnd con te - jldo adlposo blanco y mûsculo y actlvldad dn capllares y vasos. P o r otra - parte, slempre y en cada una de las tdcnlcas, se reallzaron las Incubaclo nés con los aubstratos correspondlentes junto a Incubaclones sln substatos (a las que hemos denomlnado testlgos), para poder demostrar la veracldad -T de la técnlca, asl como la locallzacldn especlflca de dlcha enzlma. Asf mlsmo se reallzaron tdcnlcas de hlstoqulmla apllcadas a mlcros­ copla electrdnlca, para lo cual las plezas en fresco fueron Incubadas y pas terlormente fljadas en glutaraIdehldo para su Inclusldn en mlcroscopla elec trdnlca, o eran fljadas llgeramente y posterlormente incubadas, Incluydndo 95 las despuds segùn las tdcnlcas de la mlcroscopla electrdnlca. [136] Por ûltlmo, otro de los apartados fud la Inclusldn directe para mlcznscopfa electrdnlcay utlllzando Vestopal o Araldlta y de - ahl se obtuvleron cortes semlflnos para la valoracldn estadlstlca y cortes ultrafInos para la observacldn ultraestructurel del tejldo. Se reallzaron)para cada caso las slgulentes: uiœosçpPiA _ _qpTicA Hëmatoxlllna-^slna . Suddn rojo. Sudën negro. 011 red. Acldo dsmlco para Ifpidos Insaturados. Fischler para dcldos grasos. Reaccldn de Schlff con el perfdmlco y el peracdtlco, PAS. Van) Glesofr. Retlcullna de Gomorl. Azul da toluldlna. Tdcnlcas descrltas en el Mac Manus [131]. 96 HICT0UUIM3ÇA - Glucosa-^fosfato deshidroganasa (Hess, Scarpe111 y Pearse 1958, ref. 133), — Succlncr deshidroganasa (modlflcacion de Nachlas y col. — 1957, ref. 132). - Malico y Lactico deshidrogenasas (modlflcacion del método de Nachlas y cols. 1958 y Hess y cols. 1958, réf. 132). — NAOH diaforasa (modiflcada de Scarpelli y cols. 1958 réf. 132). - Lipasa ( Pearse rrodiflcada de Gômori 1952, réf. 133 y modi flcaclones proplas).. — L-naftil esterase (Nachlas y Seligman 1948. Seligmon y cols. 1959, réf. 132). - Naftol AS Bsterasa (Burstone 1957, réf. 132). — Adenosin trifosfatasa (Wachsteln y cols. 1960, réf. 134} - Fbsfatasa alcaline (modiflcaclon de Gomori 1952, réf. 134) — Fosfatasa écida (Gomori 1949, réf. 132). — Citocromo oxidasa (Pearse modlflcacion de Nachlas 1958, réf. 133). - Lipoprotein lipasa (Korn (154) y modlficaclones proplas). 97 HISTOUUIMIA A MICROSCOPIA ELECTRONICA - Glucosa-^fosfato deshidroganasa (medio incubacion deri vado de Ogawa y cols. 1968, ref. 135). - Citocromo oxidasa (modif icacion del método da Bernard y cols. 1971, ref. 2S). - NAOH diaforasa (técnica sobre ferricianuro de Ogawa y cols. 1968, ref. 135). - Lipasa— (Negata y Murata 1972, ref, 170), - METODOS ESTADISTICÜS 99 En este apartado de nuestro trabajo, nos planteamos estudiar - en una primera parte, el peso corporal y el peso del drgano intarescapu lar de los animales objeto de nuestro estudio, con valoracidm estadisti es para establacer si existen o no diferencias significatives. El diseno del expérimente se reallzd sobre ratas de 21 dlas - de edad, a parte de las cuales se le inyectd diariamenta desde el quinfco dla de vide 5 mg/Kg de peso de Acto Cortina (leo], siendo sacrificadas - al 21 dfa. El muestreo de las ratas, se reallzd como se indice posterior - mente, segdn) la tabla de ndmeroa aleatorios estableciendo dos poblacio nés % Animales contrôles y Animales inyectados. Para efectuer la valoracldn estadlstlca, hemos planteado los - slgulentes pesosi 1®) IDefinicidn de les poblaclones]que vemos a comparer Â) Poblacldn control.- Constituida por camadas de ratas que serdn sacrificadas a los 21 dlas. b) Poblacldn f act or_cm^isona_o_po blecidn_iriyect a ^ . — Compuesta por camadas de ratas oue serdn inyectadas al quinto dla de nacimiento a razdn de S mg/Kg. de peso y sacrificadas a los 21 dlas de edad. 2®)lCriterios y formulacidn de objetivosi Escogemos caractères cuantitativos para estudiar las po blaciones, slendo los elegidos el peso del tejldo interescapular del — tejldo adlposo pardo, en poblaclones contrôles e inyectadas en el tra mento del sacrificio, y el peso de los animales en el instante anterior 100 al sacrlflclo. ' Nuestras experlenclas previas demuestran que ombos fendmenos, peso del tejldo adlposo pardo y peso corporal, son aleatorios, por tan to los objetivos son, en consecuencia; a] Someter a prueba estadlstlca el efecto de la cortisone so bre el peso dsl tejldo adlposo pardo. b) Someter a prueba el efecto de la cortisone sobre el peso - corporel de los animales inyectados, 3®)frest estadlsticol Efectuaremos, inicialmente, dos tests de comprobecidn da médias: (126, 127). a) Comprobecidn de médias de pesos del tejldo adlposo pardo en tre contrôles e inyectados. b) Comparacion de médias de pesos corporales entre contrôles e inyectados. Puesto que es poslble que baya una fuerte correlacidn entre — los pesos corporales y los pesos del tejldo adlposo pardo, tanto en con troles como en inyectados, haremos un test bivariante de comparacidn de vectores de médias que al tener en cuenta el valor del coeficiente de - correlacidn, potencia el valor de la comparacidn,(128, 129, 130) 4®)loisenos de los experimentos| a) Diseno de la comparacidn de médias de pesos del tejldo - adlposo pardo en contrôles e inyectados. Test unilate ral: Ho : - J ^ c j > / ^ e . 101 Tratândose de un expérimenta inédlto, no hay informacidn sobre el valor de la varlanza, por lo due es necesarlo efectuar un muestreo — aleatorlo previo para estimar su valor, Hemos muestreado 49 animales, - 24 contrôles y 25 inyectados, obteniendo los slgulentes resultados: Contrôles Inyectados aaSÎ 24 « a 1094019. 21713,7 nj. - 25 " 615B mg - 1611822 mĝ 2 A S ^ - 94903,5: rag2 Suna de varlanzas estimadas - 4901 mg En el siguiente diseno, las notaoiones significan: d Probabilidad de concluLr, mediante el muestreo, que existe una dlferencla entre las médias verdaderas de las poblacio nés control e inyectada, cuando en realidad las médias no difieren. 13 IVobebilidad de comluir, mediante el muestreo, que no axis te dlferencla entre las médias, cuando en realidad hay dife rencia entra allas. Beta es pues, la falta de potencia del Test, pare poner de manlfiesto una dlferencla que realmente exista entre las médias. Dlferencla de médias verdaderas en miligremos, que estamos inters sados en poner de manlfiesto con una potencia 1 102 p} Nûmero de Indlvlduos, necesarlos en cada grupo, el mismo para contrôles a inyectados, para poner de manlfiesto una diferen cia dada con valores dados de cZ , (3. La tabla siguiente contiene dlstlntos dlsenos de tests unilate raies, para valores de oC , j vtflidos exclusivamente para resid tados en que n ̂ 30. Aatencia del N® animales J. A Testt necesarios s * --- 5 % ■ 50 mg --- 95 ^ ---- — 21,22? * 5 % ■■ ' ~ ~ 5 % --- 40 mg --- 95 % ---- -- 33,16 5 % -.- '• 5 % ' ' 30 mg --- 95 % ---- — 58,94 5 % --- 2,a % --- 50 mg --- 97,5 % ---- -- 25,47 iK- 5 % ■ ■ ■■ 2,5 % --- 40 mg --- 97,5 % ---- — 39,81 5 % --- 2,5 % — — 30 mg —— 97,5 % ..— '— 70,77 2,5 % --- 2,5 % --- 50 mg --- 97,5 % ---- — 30,12 * 2,5 % — — 2,5 % --- 40 mg — - 97,5 % — — 47,07 2,5 % --- 2,5 % --- 30 mg --- 97,5 % ---- — 83,68 Los dlsenos mercados con asteriscos, dan n valores, menores de 30 indlvlduos y deben ser deshechados, pues ignorâmes si la distribu cldn' del peso del tejldo adlposo pardo es normal en la poblacldn de con troles y en la de inyectados. Nos decldlmos por el siguiente diseno: . ^ Potencia del N® indlvlduos oÇ_____________ A _______TestL 5 % 5 % 40 mg 9S % 33,16 103 La hipdteals nula es Ho -yii contra la altematlva H^ :^i ^^ c , o mds concretamente H^ ; y — — 2,5 % — — 47,07 --- 97,5 % — --- 3,61 2,5 % — — 2,5 % ■ 83,68 ' 97,5 % — --- 2,73 El diseno, acorde con la eleccldn hecha para la primera compara cldn del tejldo adlposo pardo est Potencia DiferenciaJi> n . _______________________ A 5 % 5 % 33,16 95 ^ 3,64 g Esto quiere declr, que con una muestra de 34 indlvlduos, es po sible detectar diferencias de 3,64 g. o mds, entre los pesos corporales de las dos poblaclones con una probabilidad de 95 % de ester decidiendo correctamente. La probabilidad de dejar escapar diferencias de 3,64 g. - o mës, que existen, es pequena, 5 % 5®) IDiseno del muestreol La igualacidn del nùnero de indlvlduos en los dos tests, parmi te disenar el muestreo de ambos de m a sala vez. Ademés, este muestreo — as vëlido para el test bivariante que se efectuarâ posterlormente. Por experlencla sabemos, que las camadas de ratas, tienen de 5 a 10 crias como târmino medio; para decldir que animales van a ser con - ICG troles y cuales inyectados, utilizaremos permutaciones aleatorias de 5, 6, 7, 8, 9 y 10 elementos, con el siguiente cddigo: Nûmero par, serën inyectados. Nûmeros impares, serën contrôles. Si la camada tiens un nûmero imper de crias, el animal, al - que le corresponde siempre el nûmero très, no serë marcado, ni como con trol ni como inyectado, pero permanecerë en la camada hasta la hora del sacrificio. Calculamos que quince camadas son suficientes para cubrir les 68 animales necesarios, segûn nuestro diseno: 34 contrôles y 34 inyecta dos. ^ continuaciûn damos el diseMo aleatorio para cada camada: Permutaciones aleatorias que se utilizaran. segûn el nûmero de animales de cada camada Camada n® 1 5;.: 1; 3;; 2; 4 3% 8s 7s Sr 2; 4: 1; 6 3; 4; 2; S; 6^ 1 8; Sr 2; 1; 4; 3; 9; 6f 7 3; S; 6;; 1; 4; 7% 2 6; lOf. 4;: 2; 9; 7; 3; S; 8; 1 GdmedeL.n®. 2_ 3? 2; 4; 1; 5 3; 8: 7; 2: 1; 4: 6; 5 1; 5; 3; 4; 6; 2 6;; 4; 9; S; 3;; 2|; 1; 7j: 8 3; 6; 2; 7; 1; 4; S 8; 9; 7; 10? 3; 2; S; 4; 6; 1 106 Camâ_n£ 3 2j: 5; 3;: 1? 4 3? 2; 1; 0; 4; 7; 5; 6 A i lî Si 2: 3; 6 1; 3{ 9; 8? 7? 4; 2; 5 5; 7; 1; 6; 2; 3; 4 7; 8; 5; 9f 10; 3; Z; 1; 4; 6 Çanjada_r^ 4 2; Sj 4; 3; 1 3? 2; 8s 4; 5? 1; 6;: 7 3; 4; Sj 6; 1; Z 3; 6; S; 2; 1; 7? 8? 9? 4 7; 1; 4;: 2; 6;; 5; 3 5; 6;; 10; 7; 2; 8;; 9; 4p I; 3 CBmada_^n* 5 5; 3; 1? 2; 4 2; 7: Ir 3; 8; 4 l . 6; 5 4;; 6? 2; S; 1? 3 3; 1; 6? 8; 2; 4? 9; S; 7 7; 3; 1; 6; Sÿ 2; 4 3; 8; 2;; 1; 9; 7; 10; 6; 4; 5 Cama^__n£ 6 S; 1; 3; 2;; 4 4; 6; 8; 2; 1;. 5; 3; 7 5; 4; 2; 3; 1; 6 6; 4; 3; 9; 1; 5; 7; 8; 2 2; 7r 1; S; 3; 4; 6 IOl 2; 7; 3; 8? 9: 4; 6; 1; S Camada^nJ* 7 S;; 3|; 1; 2; 41 2; 3; 1; 5; 4; 7; 6; 8 4;: 2; 5; 6; 1; 32 6; 9; 5; 1; 7; 4; 2; 3; 8 5; 6; 4; 1? 7; 3; 2 6;; 7; 8; 4; 1; 3; 10;: 2; 5; 9 C^ada_n£ 0 1;: 5; 2; 3; 4; 8? 3; 7; 2; 1; 5? 4; 6 4; 5; 2; 6; 3; 1 3; 8? 7; 2; 5; 4; 6; 1; 9 7; 2; 4; S; 6; 1; 3 9; 10; 7;: 5? 3; 8; 4; 1; 6; 2 107 Camada n® 9 3; 2; S( 4; 1 2; 8; 71 61 31 11 Si 4 l i 4; 2L-3i. 6; S 4; 6; 3l 71 Si 8; 9; 2; 1 6; 3; 2; Si 4; 7; 1 2; 31 101 61 91 41 81 Si 7; 1 gama^^n® 2P 3; 5J 4; II z 1; Si 21 31 81 7? 4l 6 Si 6} l: 2; 4; 3 Si 11 91 41 71 21 8; 61 3 7| 3; Si 4; 2; 6; 1 3| 61 41 101 Si 71 2l 91 11 8 Canada n® 11 1; 3; 4; 2? S; 2; 4l Si 81 6; 71 31 I 3; 4; i; Si 2; 6 3; 11 91 4l Si 8l 71 61 2 4; 7î 3; 1; G; 2; 5 3| 74 Si 41 61 191 II 2i :101 a Camada in® 12 2; SI 4; 3; 1 2l 31 4 1 71 6; 5; 81 1 2; Si ij 6; 3; 4 91 31 6l 11 4! 8! S1 71 2 6; 7; 1; 4; 51 21 3 3; 21 101 11 61 7l 54 81 91 4 Camada in® 15 4t i: s; 2; 3 2; 81 31 71 41 Si 61 1 2; 4; 3} 6; Si 1 m 41 81 71 9; 61 11 31 '2 7| s; l: 4; 2; 3; 6 71 21 41 11 81 61 3l Si 1019 Cama^^n» 14 is Z i 3î SI 4, 3| 74 8l 5l 6l 11 4l 2 21 a; 1: 6; 51 3 2f 11 71 Si 81 91 41 61 3 7î i; 6; Si 2i 3i 4 6? 41 3} Si 91 81 11 71 101 2 1GB Camada n® IS 31 4; 21 51 1 51 71 41 B; 6; 3î 2} 1 61 41 l! S; 2; 3 51 3; 11 4} 6} 2| 7} 9} tt 6? Il 21 3i 7; 4; 5 21 71 Si 10! Il 61 3} 4| 9| 6 Nbtat Las hlleras subrayadas correspondlentes a las 9 primeras camadas, corresponden a las obtanidas durante el période septiembre/diciem bre. Fueron nuneradas en el mismo orden an que indice la permuta cién subrayada, obteniendo ya en las 9 primeras camadas un nûmero superior de individuos. R E S U L T A O O S FE5ULTADCS ESTRUGTURAŒS Y ULTRAESTRUCTURAUES Ill RESULTAOOS ESTRUCTURALES Y ULTRAESTRUGTURALES En los cartes estudlados con tratamlento esteroldeo coma sin se puede observer la dlstribucidn en lobullllos del tejido adlposo par do (fig. 1 J» Con las tâcnlcas de ndcroscopla de luz. Memos puesto de man! fiesto la estructura de este tejido, compuesto por células poligona— lea de tamario inferior al del tejido adiposo bianco, de nucleo central ' ' - y nucleolo patenta junto al aspecto multilocular que es el patron ca- racterfstico do los adipocitos perdos (fig.2 ).Con tdcnicas de contres te lipldico se observa el alto contenido graso de las vacuoles de los adipocitos (fig»12 a 17) y con impregnaciones de plata se revelan gran cantidad de fibres de reticulina rodeando a modo de red a los adipoci­ tos pardos (fig.18 ) as£ como la presencia de mucopolisacëridos, dada por la positividad de PAS (fig,^9 ), Si utilizemos contrastes metacro^ mâticos podemos descubrir la presencia de otro tipo celular dentro — del tejido,que son los mestocitos o células cebadas (fig. 20 ) repie tas de granos metacromâticos. De l a s p o s i b l e s d i f e r e n c i a s e n t r e l a s p o b l a c i o n e s d e r a t a s — c o n t r ô l e s y b a j o l a i n f l u e n c i a d e l a c o r t i s o n e , s o l o e s p o s i b l e p o n e r d e m a n i f i e s t o l a m a y o r c o a l e s c e n c i a d e l a s v a c u o l e s l i p l d i c a s , a s f c o ­ mo e l m e n o r n ü m e ro d e g o t a s p o r a d i p o c i t o , s i e n d o e s t a s p o r e l c o n t r a - r i o m és g r a n d e s , s i e n d o e l d i d m e t r o d e l a s c é l u l a s i g u a l e n am b a s " b l a c i o n e s ( v e r e s t u d i o e s t a d f s t i c o ) y ( f i g . 2 1 a , b y 22a,b ) . o t r a d i f e r e n c i a s o b s e r v a d a s e s l a p r e s e n c i a d e u n m a y o r n ù m e ro d e m e s t^ d t e s e n l a p o b l a c i é n i n y e c t a d a r e s p e c t e a l a p o b l a c i d n c o n t r o l , a s i c ^ mo u n a m a y o r d e g r a n u l a c i o n d e d i c h o s m e s t o c i t o s d e l a s r a t a s in y e c t o e c iO T E C A d a s c o n h i d r o c o r t i s o n a ( f i g .23 ) ( v e r c o m e n t a r i o s h i s t o q u l m i c o s ) . 112 Dado que la nlcroscopia de luz, no aporta todas las posibles diferencias, por la accidn de los glucocorticoides, fué necesario hâ cer una valoracidn més fins a nivel ultraestructural. En los cortes ultrafinos observados con microscopia electi^ nica se ven los lobullllos del tejido adiposo pardo delimitados por - septos conjuntivos (fig. 4 ) con fibrocitos, fibroblast os y fi bras de colâgeno, junto a una rica vascularizacion de este tejido, cuyos va- sos penetran por los tabiques conjuntivos, los cuales se van afinando a medida que profundizamos cada vez mas hasta quedar envolvlendo fina mente a cada adipocito (fig.25 ); llamando la atencidn, la presencia - de fibras colâgenas mas numerosas que les de reticulina, hecho que con trasta con las observaclonés de microscopia de luz, en la que parece — perderse la coldgena y aumentan por el contrario las fibres de reticu lina en las proximidades celulares. Los fibrocitos y fibroblastos pre sentes (fig.26 ) se mantenian en los espacios intercelulares mayores, es declr en la confluencla de 3 6 més células. La red capilar por el contrario es abundentlsima y frecuente mente podemos observer una célula rodeada de 3, 4 (5 mës secciones ca pllares (fig.27 a,b ), estructura que se corresponde con un patrdn tf- picamente endocrino. Las células endoteliales, no presentan componen tes distintos a las de otras localizaciones y se rodean por una mem­ brane basai continua que ocaelonalmente puede ester engrosada (fig 7 ) y que siempre se sépara de la membrane basai del adipocito por un espa cio anhisto o con escasas fibres colâgenas. Eventualmente se observa el ĝ fén pericito (fig. 28 y 29 ), Hay que destacar sobre todo en el tejido adiposo pardo de — las ratas tratadas con hidrocortisona, la presencia de células de tipo histiocitario de contorno irregular con invaginaciones de membrane que pueden penetrar en el citoplasma y que en las secciones transversales 113 88 muestran como un slstéma vacuolar o tubular, con abondantes citoll sbsomas de morfologla varlada, asf como la presencia de cuerpos multi- vesiculares (fig.31 a 3^. % r Altlmo^ la presencia de mastocitos cargados de grénulos — electrodenses de morfologia variada (figes y36 ) como cuerpos en esca- rapela o dibujando figuras miellnicas caracterlsticas, aunque los m€s abondantes presentan disposicidn uniformemente electrodensa (fig.37 }, y que en el tejido adiposo normal se hallan bien delimitados por el - citoplasma celular (fig.38y 39); por el contrario bajo la influencia - de los glucocorticoides era manifiesta la presencia de mastocitos-de — morfologia mâs irregular con abondantes cavidades comunicadas con el - exterior, formadaa por repliegues més o menos profundos de la membrane plasmdtica, en cuyo seno, asf como en la soperfioie del mastocito se - ven grdnulos liberadoe no envueltos por membrana y de notable electro claridad (fig.40,41), producto de degranulacion y en cuya interpreta- cidn entraremos mas adelante, en el capitule de comentarios enzimdti- cos. Respecte al parenquima del tejido adiposo pardo, se obser- van los adipocitos de forma poligonal (fig.42 ) cuya membrane plasmd tica presents finas invaginaciones, generalmente visibles solo a gran des aumentos (fig43 ) y eventualmente podian observerse, unas unio- — nes especiales entre ellos (fig.44) asi del tipo da uniones de apertu ra. El nûcleo da los adipocitos pardos es de forma redondeada — u oval (fig. 45 ) con cromatina laxamente dispuesta con algunos espesa- mientos Junto a la membrana nuclear y con un nucleolo bien patente de tipo reticular y en el que pueden observarse perfectamente sus compo- nentes, p̂ rs fibrilar y peer amor fa (fig,46). 114 Una de las caracterlsticas mas notables de estas células es la gran profusion mitocondrial, mitocondrias pleotndrficas de matriz - electrodensa y crestas paralelas estrechaniente empaquetadas, siendo - posible observer en algunas de elles la presencia de grénulos electro denses (fig.'47 ), Estas mitocondrias se hallan en todo el hialoplasm# pero con mayor frecuencia rodeancki a las gotas lipldicas. Rellenando précticamente los espacios hialoplésmicos entre las mitocondrias se observa gran cantidad de acdmulo de glucégeno — ("flĝ aa a SCj hecho que contrasta fuertemente con las observaciones ba jo tratamiento con hidrocortisona, en las cuales se confirma la desa- paricion o no presencia de estes llamativos acûmulos de glucégeno — (fig. 51 y 52). Los adipocitos pardos son tambien llamados células multilo culares a diferencia de los adipocitos blancos o células uniloculares, esta es debido a la disposicion de sus gotas lipldicas que se presen­ tan en gran nAnero, rodeadas de réticule lise y mitocondrias, su tama- no es variable y son fuertemente electroclaras déndole el patrén carac terlstico de los adipocitos pardos (fig,42 yS3). Bajo el tratamiento - esteroideo estas gotas,que en el tejido normal se hallan bien délimita des y son muy numerosas, presentan una mayor tendencia a la coalescem cia y fusion de dichas gotas lipldicas, observando por tante un incre mento de volumen de dichas gotas, asi como un menor numéro (fig,9la58), El reste de las organelas celulnres son generalmente esca­ sas; asi se pueden observer alguna roseta ribosémica (fig,59 ] even— tualmente cuerpos multiveslculares (fig, 60 yGI) y es muy escasa o nula la presencia de retlculo endoplésmico rugoso y Golgi, Queremos, dentro de este apartado,resenar algûnas técnicas de histoqulmica aplicada a microscopia electrénica, para poner de ma— 115 nifiesto la localizaclén fina de diverses actividades enzimdticas qua nos permiten confirmer las valoraciones realizadas a microscopia dpti ca, Realizamos técnicas de enzimas de diferentes vias y localiza­ ciones, asi: Dentro de la via de la glicolisis anaerobia, la glucosa-6-fosfato. - Deshidrogenasa, observando su actividad localizada en el hialoplas- ma como lo demuestran los precipitados electroden- soa:que marcan los lugares de localizacion de dicha enzima (fig.€2,64 ) y tambien observable en cuerpos lisosdmicos, lugar donde tambien se encuentra este enzima (fig, 65 ), 5tro de los enzimas estudiados fué la Nicotinamide dinucl^ tido reducida (NAOH) cuya actividad se localize en hidoplasma y en me nor cuantia en mitocondrias (fig.SGy 67 ), Dentro de las enzimas oxidativas se estudié la - Citocromo-Oxidasa, mostrando su localizocién exubérants en las creŝ tas ndtocondriales que quedan perfectamente per— filadas enmarcando el lugar de localizacion enzi mética ( fig, 68-91 ) , Por ûltimo valoramos la LIPA3A tisular, observancto que se halla localizada fundementalmente en el retlculo liso siendo mas pronü nente su localizacién alrededor de la gota lipidica en lo que hemos de nominado la perigota (fig,72-74 ) lo cual nos confirma una vez mâ s, — que la localizacion esté relacionada con la funcidn. FÏESLLTAOOS HISTOUUIMICOS 117 RESULTAOOS HI5T0QU1MICQS La valoraclén enzlmâtlca de las diferentes enzimas estudiadas, las réunîmes en los slgulentes apartados: I Enzimas y aminés comprometidas en la captaclén de flcidos gra­ sps Dor el adipocito. - nnotein-lipQsa o factor de aclaremiento __ - Heparina mastocitarfa, H Enzimas citoplésmicas comprometidas en la lipoqénesis. * Qlucosa-^fosfatasa - Qlucosa-6-Fbsfato-4)eshidrogenasa - N A D H (Oiaforaea) m Enzimas mitocondriales a) Implicadaa en la oxidacidn de écidos grasos y Acetil CoA de otras vias en ciclo Krebs - Succino Deshidrogenasa - Ldctico Deshidrogenasa - Mélico Deshidrogenasa b) Transferidosas de hidrégenos - Oiaforasa (nAOH) c) Cadena respiratoria - Citocromo oxidasa 118 IV Enzimas comprometidas en la llpollsls — Esterasas no especlficas - L-naftil esterasa - B-naftal esterasa — Esterasas especlficas - Lipasa tisular V Enzimas no comprometidas directamente en la funcion del tejido adiposo pardo — Fosfatasa écida — Fosfatasa alcaline — Adenosin trifosfatasa Ce paces de medimos respectivamente : actividad lisosomal y los mécanismes de transporte con y sln utilizacién energé tica. 119 La valoraclén de las distintas actividades enzimâticas expre sa des en los cuadros anteriores, se han hecho siempre velorando las po sitividades sobre los cortes testigos incubados en ausencia de substra to o en presencia de inhibidores del posible substrate endégeno presen te en el tejido; dentro de esta valoracién para éliminer en lo posible intarpretaciones subjetivas, hemos seleccionado de los varies cortes - incubados con substrate varies de ellos al azar, en los cuales realizé bamos un contaje de grénulos por célula, a veces recurriendo al "obje tivo de inmersionP, pare esta empresa. De acuerdo con el némero de gza nulaciones de precipitedo del producto, hemos empleado los signes de - cruces con el siguiente gradients: ~ (-) No presencia de precipitedo, bien por carencia de substrate endégeno o por la accién de inhibidores. Como an todos los casos, la accién enzimética de los cortes incubados con subs trato superé a les de los testigos, estos tambien son valore dos con los mismos signes. (i) Signifies casos dudosos de una posible difusién enzimética o utilizacion de otros substrates compétitives para dicha enzima c bien de actividades minimas, nunca superiores a un S % respecte al testlgo. (*) Actividad superior a la del testigo en un 20 % C«) - ■ ■ - - 40 % (44+) ■ " - - 60 % (444+) - - - - 80 % (44444) • " - - - - 100 % 120 I Guadro regresantatlvo de la actividad GLUCOSA -6- FOSFATG œSHIDaOŒNASA TAP Contrôles TAP Inyectadoa Con substrato Testigo Con substrato Testlgo Citoplasma + + + + + Veslcula Ndcleo Capilares Gndotelio Vos os Mdsculo T. A. Blanco kCdsculo (Fig. 75a y bj 121 II Guadro representatlvo de la actividad Citoplasma ,(̂ ''ÛĤ }̂ CrrüPLA3WICA TAP Contrôles TAP Inyectados Con substrato Testigo Con substrato Testigo + + + + + Veslculas Ndcleo M. Plasmdtica Capilares Endotelio Vases Mdsculo T. A. Blanco + + r/dsculo (Fig. 7Sa y b) + + + + + 122 III Guadro representatlvo de la actividad SUCGINICO DESHIDROGENASA TAP Control#» TAP Inyectados Con substrato Testlgo Con substrato Testigo Citoplasma + + + + Vdsfculas Ndcleo M. Plasmdtica Capilares Endotelio Vas 03 küsculo T. A. Blanco ktdsculo (Fig. 77a y b) 123 IV Guadro representatlvo de la actividad =L\CnCO DESHIDROGENASA TAP _ControlBS_ _Inyectados 6on substrato Testigo Con substrato Testlgo Citoplasma Vaslculas Ndcleo U. Plasmdtica Capilares Vasos Endotelio K)dsculo + + + T. A. Blanco ‘/dsculo + + + + (Fig. 78a y b, 79a y b) 124 V Guadro representatlvo da la ectivldad IMOEO DESHIDROGENASA T/V» Contrôles TAP ̂ yectados_ Con substrato Testlgo Con substrato Testlgo Citoplasma + + + + + + + Veslculas Ndcleo M. Plasmdtica Capilares Endotelio Vasos Mdsculo T. A. Blanco K'dsculo (Fig. 80a y b) 125 VI Cuadro representative de la actividad OIAFORASA (NAOH) MITOCONDRIAL TAP Contrôles lAP ̂ ^çtadoa non substrato Testigo Con substrato Testigo Citoplasma + + + + Vsslculas Ndcleo M. Plasmdtica Capilares Endotelio Vasos Mdsculo T. A. Blanco + + + f.'dsculo + + + + + + (Fig. 81a y b) 126 VII Guadro representative de la actividad CITCCRaiO OXIDASA VÈsIculas iMdcleo M. Plasmdtica Capilares Endotelio Vasos Wsculo T. A. Blanco Mdsculo TAP Contrôles Con substrato Testigo Con substrato Testigo Citoplasma + + + + + + + + (Fig. 82a y b) 127 VIII Cuadro representatlvo de la actividad ALFA-NAFTIL ESTEHASA Vaslculas Ndcleo M. Plasmdtica TAP Contrôles T/f .Inyectados Con substrato Testigo Con substrato Testigo Citofîlasma + + + + + + + Cepilaras Endotelio Vasos Mdsculo + + + + + T. A. Blanco + + + + + küsculo + + + + + + + (Fig. 83a y b, 84a y b) 128 IX Cuadro representatlvo de la actividad NAFTOL-AS ESTEAASA Vsslculas Ndcleo M. Plasmdtica TAP Contrôles TAP li;^ctadœ Con substrato Testigo Con substrato Testigo Citoplasma + + + + + + + CapilerâS Endotelio Vasos Mdsculo T. A. Blanco + + Ntisculo + + + + + (Fig. BSayb) 129 X Cuadro representatlvo de la actividad L I P A S A TAP Contrôlas T W _IhyectEdoe Con substrato Testigo Con substrato Testigo Citoplasma Vbslculas Ndolao M. Plasmdtica Capilares Endotelio Vasos Mdsculo T. A. Blanco Mdsculo (Fig. 06a y b, 07a y b) 130 [ Cuadro representatlvo de la actividad FOSFATASA ACIDA \&slculas Ndcleo Capilares TAP Contrôles TAP Ipijectados Con substrato Testigo Con substrato Testigo ti Citoplasma + + Endotelio Vasos Mdsculo T. A. Blanco + + + + r.iSsculo + + + (Fig. 80a y b) 131 X U Cuadro representatlvo de la actividad ADENOSIN TRIFOBFATASA Veslculas Ndcleo (Fig, 89a y b) TAP Contrôles T f i P ^ G t B d o a Con substrato Testigo Con substrato Testigo Citoplasma + + + + + M. Plasmdtica + + + + + Capilares Endotelio Vasos Udsculo T. A. Blanco ♦ + + + + + + + + + + Mdsculo + + + + + 132 XIU Cuadro representatlvo de la actividad FOSFATASA ALCALINA TAP ControiUes T/P .Inyectados Con substrato Testigo Con substrato Testigo Citoplasma \AsIculas Ndcleo M. Plasmdtica Capilares Endotelio Vasos Mdsculo T. A. Blanco Mdsculo + + + + + + + + + + + (Fig, 90a y b, 91a y b) RESULTAOOS ESTADISTICOS 134 Resultadoa obtgnidos en las varlaclones del peso corporal y da la grasa parda Interescapular an el transcurso da la experlencla TABLA DE RATAS CONTROLES NOcamedm N* Peso a los Paso a los Peso del y orden oermutacldn 5 diasfg. 1 21 dlas fg.l BAT fmol I-IC I-3C I-4C I-7C 3 7 S 1 9,400 9,150 9,600 9,000 42,200 41,000 42,300 43,400 264.00 282.00 241,00 275,50 Ilw 90 H-llC 11-130 11-160 6.500 7,000 8,900 8.500 32.900 36.500 41.500 41.900 194.50 211,00 273,00 253.50 III-170 III-IBO IXI-190 9,150 10,410 10,200 26,300 31,500 30,700 102,50 127.00 123.00 3V-23C IV-27C IV-28C IV-30C 11,760 10,750 10,065 11,015 43.500 41,000 43,700 44.500 297.00 232.00 312.00 273.00 135 NBcamada N* Peso a los Peso a los Peso del V orden permutacldn 5 dlasfg.l 21 dlas fg.l BAT fmgl V-32C 7 Uj350 35,260 264,00 V/-33C X. 12,300 36,500 238,50 V-34C 3 10,200 47,700 261,00 VI-410 7 11,900 20,170 114,00 VI-42C 3 10,000! 16,000 125,00 VI-44C 9 7,0001 36,000 198,00 VI-47C 1 7,560 19,000 150,00 VX-48C 5 10,500 33,300 270,00 Vn-SOC 9 14,750 49,500 271,00 VU-61C 5 15,000 55,500 312,00 VII-62C 1 14,700 42,200 330,00 VII-64C 7 14,800 38,570 245,00 vin-eec 3 i4,6oo 48,soo 270,00 VIH-69C 7 15,650 53,500 312,00 Vlll-eoc 1 15,950 48,250 265,00 VIII-61C 5 16,740 51,750 310,00 IX-67C 1 8,800 34,500 213,00 IX-69C 3 6,920 20,250 100,00 IX-70C 5 7,750 22,500 135,00 136 TABLA DE. RATAS INYECTADAS NBcomada N* Paso a los y orden oermutaclon 5 dlaa fol Peso a los Peso del 21 dlas fol BAT fmol 1-21 1-61 1-61 1-61 9,000 7,700 7,500 10,300 42,500 36,400 36,600 42,000 225.00 248.00 267.00 285.00 II-lOl 11-121 11-141 11-151 9.000 9.000 9.000 7,700 35.700 39,000 39.700 37,500 221,50 228,00 221,00 341,00 IU-201 IH-211 m - 2 2 1 11,360 10,650 8,400 31.500 29.500 25,900 113.00 110,50 118.00 Itf-241 IV/-251 17-261 17-291 12,635 13,560 12,580 11,680 46,600 49,500 48,000 40,100 296.00 291.00 280.00 264,00 7-31t 7-351 7-361 7-371 2 ff 4 6 11,020 11,720 11,065 10,750 34,500 34,000 35,200 35,700 237,10 249.00 200.00 206,00 137 NBcamada N* Peso a los Peso a los Peso del y orden oermutaclon 5 dlas fal 21 dlasfol BAT fmg) VI-391 10 11,800 34,500 275,00 VI-401 2 10,800 25,000 191,00 VI-431 8 10,200 27,700 173,00 VI-451 4 11,350 33,700 285,00 VI-461 6 13,150 19,000 112,00 VII-491 6 15,300 36,500 233,00 VII-631 4 13,700 34,500 215^00 VU-651 2 13,550 33,100 243,00 VII-66L 8 15,200 49,750 315,00 VUI-671 8 17,720 49,500 262,00 VIII-621 2 15,500 49,000 265,00 VIII-631 4 16,900 49,800 280,00 VIH-641 6 18,150 53,450 274,00 IX-65tL 41 13,000 34,500 245,00 IX-661 2 8,300 34,500 267,00 DC-681 6 8,750 34,700 248,00 130 Comparacldn de los pesos medio3 a los 21 dlas. entre contrôles e Inyectados. Caracterlstlcas de las muestras» P-21 Contrôles P-21 Inyectados n a 35 n - 35 ^ - 101,0051 8^ - 65,3539 8^ - 10,0938 8^ . 8,0842 Cv - 0,2664 Cv . 0,2142 ) L - 0,05 ( Test unilateral) Los pesos corporeles da contrôles e inyectados no difleren significatiyamente en media,Aceptamos la hipdtesls da qua la cortlsona no tiene efecto sobra el peso corporal a los 21 dlas. La probabilldad da error as - 0,05, segûn al dlesno. 139 Comparacldn de los pesos medios dal 8.A.T«. entre contrôles e Inyectados. a los 21 dlas. Caracterlstlcas de las muestras. B.A.T. C0^f^R0LE8 B.A.T> INYECTADOS - 231,5829 - 236,6886 ^ - 4670,8344 8^ . 3228,3563 8^ . 68,3435 8^ - 56,8186 C - 0,2951 C - 0,2401V V )l L - 0,05 Z m 0,3399 ( ° ) Z -1,645 Los pesos de los tejidos no difleren en media significative mente. Aceptâmos la hlpdtasls de que la cortlsona no tiens efecto sobre al B.A.T., a los 21 dlas. La probabdLlldad de error,as segûn al diseno - 0,05. 140 Eatudio de les correlaclones entre al peso corporal y el peso del B.A.T., de contrôles e inyectados. Las dos comparaciones anteriores no tienen en cuenta las posl bias correlaclones entra: a) Contrôlas: Peso corporal 21 dlas — - Peso dsl B.A.T. 21 d. b) Inyectados % Peso corporal 21 dlas — — Peso del B.A.T. ,21 d. Reallzamos una transformaclon de datos por logarltmizacldn da clmal, para calculer el coeflclents da corralaclon entra contrôles e inyectados: a) CONTROLES Peso corporel (Pi Peso del B.A.T. fP.BAT) "l “ 1,5667 - 2,3586 S2 . 0,0094 - 0,0160 S - 0,0972 S - 0^1266 Cy " 6,2 % Cv 6,59 % ( P ; P.BAT) - 0, r^ - 0,8625 0179 El valor r para o( ■ 0,01 y 33 grados de llbertad es: r m 0,4290; y la hipdtesls de correlacldn nula, debe ser rechazada. 141 b) INYECTADAS Paso corporal fP) Peso del B.A.T. fP.BAT) 1,5667 «2 - 2,3586 s" . 0,0094 m 0,0160 s - 0,0972 S » 0,1266 Cv - 6,2 i Cv - 5,37 S (P; P.BAT) - 0, Fg - 0,7314 0090 Este valor {r), supera al antes refer!do r - 0,4290 — para «C " 0,01 y 33 grados da llbertad. En los animales inyectados, la hipâtesis de ausencla da correlacldn debe ser rechazada. 142 Comparacldn de correlaclones entre peso corporal y peso del B.A.T. en contrôles e Inyectados. La hipdtesls nula de Igualdad de coeflclentes da correlacldn en la poblacldn control e Inyectada es Ho x || contra la al ter native t , la efectuemos mediants la transforma cldn Z de Ficher: - 0,0625 - 1,3030 Fg - 0,7314 Zg . 0,9317 ()7= — 1/32 Z^ - 0,3713/ 0,2500 - 1,4052 Para ■ 0,05; Z - 1,960, la hipdtesls de Igualdad de correla clones no puede ser rechazada. 143 Comparacldn blvarlante da los vectorea de médias entre contrôles e Inyectados. La existencla de correlaclones tan significatives, oblige a afec tuar un tests blvarlante, que tenga en cuenta esta correlacldn entre - las médias: Test de HOTELLING, para la comparacldn de vectores de me dlas de datos transformados por logarltmizacldn decimal; a] Contrôlas b) Inyectados - 12 21 22 9 mg 9 mg Partlendo otra vez de la hlpdtasls: a] CONTROLES: "l "» 35 m^ • 'i,5æa ''i “ ’'0,6154 0,6086 2,3413 0,6086 0,8092 b) INYECTADOS: — 35 1^5667 [*0,3196 0,3060 2,3586 Ag - [o,3060 0,5440 0,0064 A » fo,93SO 0,9146 0,0173 [o,9146 1,3532 Para ■ 0,05 y 2 y 67 grados de llbertad da F67 19,48 144 Por tanto, debemos eceptar la hipdtesls de Igualdad de vectores de mediae, resultado que confirma el obtenldo medlante los dos tests — univariantes « De estas resultados expuestos, se puede deduclr que: 1 ] L a s poblaclones de animales contrôles a Inyectados en el orden de ideas, peso corporal a los 21 dlas, son equiva lentes. 2).— Oichas poblaclones en cuanto al peso de B.A.T., a los 21 dlas, tamblen son équivalantes. 3 j En la poblaclon "contrôles" hay una fuerte correlacldn en tre el peso corporal y el peso del B.A.T. 4).- Ocurre lo mlsmo en la poblacldn "Inyectada". 5 ) L o s coeflclentes de correlacldn poblaclonales, entre con troles s Inyectados, son équivalantes. 6}.- La introduccidn de estas correlaclones en un test blvarlam te no pone de manlflesto la exlstencla de dlferenclas. 7).— La probabllldad de que no hayamos puesto de manlflesto - una dlferencia, entre contrôles e Inyectados, que exista realmente, es muy pequena ( [3 - 5 %). La probabllldad de haberla descublerto, si realmente exlstlese es 1-^— 95 % Debemos aceptar, por tanto, la equlvalencla de ambas pobla clones en esos dos drdenes de Ideas. 145 La segunda parte de la valorecldn estadlstlca consistlrd en es tudlar el dlâmetro de las a«Èlpocitos y el ndmero de gotas de cada adl pocito. Para la valorecldn da dlchos pardmetros hemos recurrldo a la In elusion de las plezas de tejldo adlposo pardo, segûn el método de rutlna de mlcroscopla electrdnlca, reallzando cortes semlflnos de una tnlcra de espesor, que posterlormente eran contrastado con azul de metlleno; de - cada pleza se realizaron varies cortes, slempre separados por une dis tancla de 100 mlcras, para tener la segurldad de que no se repltlesen - los ndsmos adlpocltos, da esos cortes obtenldos se realizaron fotogra fia» slempre con el mlsmo aumento y posterlormente amplladas de modo que se nos transforroaban las mlcras en centimetres para faciliter su medi - cldn y contaje. Los adlpocltos elegldos eran aquellos que presentsban el nûcleo bien patente, para eetar seguros que slempre la valorecldn se rea llzaba en el piano ecuatorlal de la cdlula. Oe cada rata se obtenlan 10 preparaclones y de cada una se reallzaba una fotografia de modo que al — final contâbamos 10 adlpocltos, su dlâmetro y nûmero de gotas, obtenlen do las slgulentes tablas. 146 tabla de CONTROLES Cameda rata praparaclon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Médias. dlâmetro 32 40 32? 30 36 24 28 34 36 -2L. 32,3 nfl gotas 29 33) 26 31 22 21 18 16 20 20 23,6 Camada gate 3 3 3 3 3 3 3 3i 33 preparaclon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 dlâmetro 35 32 33 29 30 32 29 30 30 30 n°qotas/adloocito 28 31 32 32 26 40 36 27 28 27 Médias 31 31,7 147 Camada Rata Preparaclon Dlâmetro NOqotas/Adlpocito I à 1 3X 23 I 4 2 31 28 I 41 3 29 32 I 4 4 25 25 I 4 5 31 34 I 4 6 28 21 I 4 7 32 38 I 4 8 25 15 I 4 9 30 24 I 4 10 27 38 Madias......... 27,8 Camada sste ftreparaclon Dlametro NB ootas/Adlpoclti I 7 1 34 31 I 7 2 31 29 I 7 3 33 37 I 7 4 34 34 X 7 5 40 37 X 7 6 20 35 X 7 7/ 30 32 I 7 8 28 37 X 7 9 27 30 I 7 10 28 37 Mediae ......... 33,9 148 Camada Rata Preparaclon Dlâmetro NB gotas/Adloocito n 9 1 26 36 II 9 2 28 37 IX 9 3 25 31 II 9 4 26 27 II 9 5 32 31 II 9 6 30 32 IX ' 9 7 2Œ 32 II 9 8 23 24 n 9 9 22 23 II 9 10 31 33 Media» 30,6 Camada Rata Preoareclorr Dlametro NB ootas/ad IX n 1 36 32 IX 11 2 28 22 n 11 3 25 22 IX 11 4 22 21 n 11 5 25 18 II 11 6 20 26 n 11 7 30 29 II 11 8 30 16 II 11 9 40 37 IX 11 10 29 40 Médias . . 26,3 149 Camada Rata Proparecidn niametro N* gotas/adloocito H 13 1 26 27 H 13 2 26 28 n 13 3 27 29 II 13 4 25 27 II 13 5 29 28 II 13 6 27 30 u 13 7» 26 27 n 13 8 30 26 II 13 9 30 28 u 13 10 27 27 Médias ......... 27,7 Camada Rata Preparaclon Dlametro NB gotas/adloocito II 16 1 32 27 n 16 2 23 29 II 16 3 27 26 II 16 4 31 19 n 16 5 24 26 II 16 6 24 24 II 1@ 7 21 25 II 16 8 29 26 II 16 9 29 22 II 16 10 26 28 Médias ....... 25,2 150 Canada m III III III III ni III III m III Rata 17 17 E7 T D 17 17 17 17 17 17 Prenaraclon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Médias Dlametro NB gotas/adloocito 25 20 25 27 35 34 27 27 34 31 30 29 22? 20 27 23 25 20 ^ 23 '23 27,3 25,4: Camada ni ni in ni in ni III ni in i n Rata Preparaclon Dlametro NB gotas/adloocito 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Médias . 29 33 36 30 31 28 31 26 32 22 29,8 20 22 29 33 25 37 34 37 24 37 29,8 151 imada Rata Preparaclon Dlametro nB qotas/adloocito H I 19 1 23 26 III 19 2 31 24 III 19 3 26 28 III 19 4 30 24 III 19 5 23 30 III 19 6 27 23 III 19 7 33 21 III 19 8 24 28 H I 19 9 30 28 H I 19 lO 26 28 Itedlaa 27,3 26,0 Camada IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV Rata 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 Preparaclon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mediae ....... Dlametro 34 23 16 28 21 35 31 22 36 37 , 28,3 NB gotas/adlpoclto 25 22 31 28 34 27 31 26 26 25 27,5 152 Camada Rata Preparaclon Dlametro N® ootas/adloocltos 3V 27 1 25 21 IV 27 2 30 24 IV 27 3 25 29 IV 27 4 22 22 IV 27 5 22 23 IV 2% 6 29 33 IV 27 7 25 31 IV 27 8 26 30 IV 27 9 27 21 IV 27 10 24 Médias ........ 25,8 :amada Rata Preparaclon Dlametro N® ootas/adiooclto IV 28 1 26 30 IV 28 2 26 18 IV 28 3 30 22 IV 28 4 34 20 ivr 28 5 27 22 IV 28 6 25 34 IV 28 7 24 27 IV 28 8 27 27 IV 28 9 30 31 IV 28 lO -2S_ 27 Médias ........ 25,1 133 Camada Rata Preparaclon Dlametro N® ootas/adlpocltos ]V 3Œ 1 35 37 IV 30 2 37 23 IV 30 3 30 27 IV 30 4 24 22 IV 30 5 34 39 IV 30 6 29 21 IV 30 7 36 37 IV 30 8 29 30 IV 30 9 28 33 IV 30 m 30 34 Médias ........ 30,3 Camada Rata Preparaclon Dlametro n® qotas/adlpocltos V 32 1 26 28 V 32 2 30 27 V 32 3 28 27 V 32 4 31 31 V 32 S 22 27 V 32 6 28 32 V 32 7 28 40 V 32 8 25 33 V 32 9 31 29 V 32 10 -25. -29. Médias ....... 30,3 154 Camada Rata fVeparacion Dlametro N® ootas/ ad V 33 1 27 24 M 33 2 27 29 V 33 3 26 30 V 33 4 29 38 V 33 5 29 40 V 33 6 32 3 S? V 33 7 24 30 V 33 8 26 32 M 33 9 25 34 V 33 10 23 30 Mediae ........ 32,4 Camada Rata Preparaclon Dlametro N® ootas/add V 34 1 30 33 V 34 2 29 32 V 34 3 25 28 V 34 4 28 25 V 34 5 30 40 V 34 6 25 27 V 34 7 33 34 V 34 8 25 31 V 34 9 28 28 V' 34 10 -29. 40 Médias........ 31,8 ISS Camada V V V V V V V V V V Rata 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 Preparaclon 1 2 3 4 5 6 7 ■ 8 9 10 Dlametro 21 27 30 25 30 23 25 31 28 33 N® gotas/adlpocltos 29 29 27 28 27 28 24 24 32 30 Madlaa............ 27,3 27,8 Camada Rata Preparaclon Dlametro N® gotas/adlpocltos VI 41 1 32 35 VI 41 2 28 40 VI 41 3 29 30 VI 41 4 30 27 VI 41 5 28 30 VI 41 6 30 33 VI 41 7 31 24 VI 41 8 31 28 VI 41 9 29 27 VI 41 lO 33 30 Médias 30,3 156 Camada Rata PMaparaclon Dlametro N® gotas/adlpocltos VI 42 1 29 25 VI 42 2 31 37 VI 42 3 30 39 VI 42 4 37 40 VI 42 5 27 27 VI 42 6 34 40 VI 42 7 31 34 VI 42 8 341 31 VI 42 9 26 31 VI 42 10 -.40 "edlas ...... 34,4 Camada Rata Preparaclon Dlametro N® gotas/adloocito VI 44 1 29 25 VI 44 2 31 37 VI 44 3 24 36 VI 44 4 24 20 VI 44 5 20 24 VI 44 6 28 32 VI 44 7 25 19 VI 44 B 29 24 VI 44 9 28 25 VI 44 10 24 -32- Médias ..... 20,1 157 Camada VI VI VI VI VI VI VI VI VI VI Rata 47 47 47 47 47 47 47 47 47 47 Praparaclon 1 2 3 4 5 6 7 a 9 10 "edlaa ..... Dlametro N® qotaa/adlpocltos 30 40 25 30 20 36 25 37 29 37 30 26 24 20 23 20 27 24 25,8 29,1 Camada Rata Preparaclon Dlametro N® qotas/adlpocltoa VI 48 1 30 27 VI 48 2 22 30 VI 48 3 32 35 VI 48 4 30 35 VI 48 5 22 3@ VI 48 6 26 32 VI 48 7 29 . 29 VI 48 8 30 30 VI 48 9 28 30 VI 48 10 26 29 Vedlas........ 31,: 158 Camada VII VII VII VII VII VII VII VII VII VII 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Preparaclon 1 2 3 4 5 6 7 a 9 lO Media» Dlametro N® gotas/adlpocltos 25 28 29 30 28 30 25 30 26 16 31 28 25 3k 30 29 26 31 - 26 30 . 27,1 27,8 amada S2iS Preparaclon Dlametro N® gotas/adlpocltos VII 51 1 36 38 V U 51 2 27 22? VII 51 3 26 19 VII 51 4 31 25 VII 51 5 24 34 VII 51 6 28 25 V U 51 7 24 22 VII . 51 8 25 30 VII 51 9 29 19 VII 51 10 -25. - 2 5 Médias ........ . 27,0 25,9 159 Camada Rata Praparaclon Diametro n® aotas/adipocitos VII 52 1 30 27 VII 52 2 27 29 V U 52 3 25 20 VII 52 A 26 27 VII 52 5 30 31 VII 52 6 28 28 VII 52 7 27 27 VII 52 a 26 30 v m 52 9 25 27 - VII 52 10 36 Médias .......... 28,2 Camada Rata RrsDaracion Diametro N® ootas/adloocitos VII 50. 1 32 35 v n sa 2 28 29 v n SA 3 30 AO VII SA A 30 27 v n SA S 28 30 v n SA 6 30 33 v n SA 7 31 2A VII SA 8 31 38 v n 5A 9 29 27 v n SA 10 -33. _30_ Médias ........ 31,3 160 Camada Rata Preparacion Diametro N® ootas/adipocitos vm 58 1 29 25 vm 58 2 31 37 vm 58 3 30 39 vm 58 4 37 40 vm 58 5 27 27 vm 58 6 34 40 vm 58 7 31 34 vm 58 8 34 31 vm 58 9 26 31 vm 58 10 32 40 Médias...... 31,1 34,4 Camada Rata Areparacion Diametro N® ootas/adioocitos vm 59 1 28 18 vm 59 2 32 30 vm 59 3 30 23 vm 59 4 33 35 vm 59 5 28 26 vm 59 6 25 28’. vm 59 7 27 27 vm 59 8 31 17 vm 59 9 26 39 vm 59 10 20 Médias ....... 28,6 26,3 161 Camada Rata Areparacion Diametro N® ootas/adipocitos VIII 6Q 1 25 17 VIII 63 2 26 21 VIII 60 3 23 28 VIII 60 4 26 40 VIII 60 5 233 33 VIII 60 6 333 24 VIII 60 7 24 22 v m 60 8 19 22 VIII 60 9 31 28 VIII 60 lO 23 Médias ...... 25,5 Camada Rata Preparaclom Diametro Nf,Ootas/adipocitos v m 61 1 30 37 VIII 611 2 24 24 VIII 61 3 30 29 v m 61 4 30 31 VIII 61 5 35 29 VIII 61 6 27 27 VIII 63. 7 28 27 VIII 61 8 27 26 VIII 61 9 29 40 v m 63. 10 30 25 Médias . . ..... 29,5 162 Camada Rata Praparaclon Diametro N® qotas/adioocitos IX 67 1 21 28 IX 67 2 30 29 IX 67̂ 3 30 27 DC 67 4 25 33 DC 67 5 23 30 DC 67 6 26 28 DC 67 7 31 35 DC 67 8 24 24 DC 67 9 25 2® . _ IX 67 10 24 27 Madias ........ 28,7 Camada Rata Praparaclon Diametro N® ootas/adipocitos DC 69 1 32 35 IX 69 2 24 28 DC 68 3 26 24 DC 68 4 29 33 DC 68 5 29 31 DC 68 6 29 32 DC 68 7 30 27 IX 68 8 28 22 DC 68 9 23 28 DC 68‘ 10 -28 -29. Madias ....... 27,8 28,9 163 Camada Rata Preparacion Diametro N® ootas/adipocitos IX 70 1 • 31 22 IX 70 2 32 33 IX 70 3 35 23 IX 70) 4 33 28 IX 70 5 30 32 IX 70 6 38 30 IX 70 7 29 23 IX 70 8 28 32 IX 70 9 29 31 IX 70 lO 29 Madias.'. • • • • • . . . 28,6 164 TABLA DE I W E C T ^ S Camada Rata Praparaclon Diametro N® ootas/adipocitos I 2 1 31 24 I 2 2 27 21 I 2 3 30 16 I 2 4 28 19 I 2 5 31 22 X 2 6 29 21 X 2 7 28 13 I 2 6 27 20 I 2 9 29 19 r 2 10 32 253 Madias ..... 20,0 Camada Rata Praoaracion Diametro N® ootas/adioocitos I 5 1 34 10 r 5 2 28 17 I 5 3 32 13 I 5 4 27 14 I 5 5 27 22: I 5 6 30 21 I 5 7 29 IB I 5 8 33 IB I 5 9 34 22 I 5. 10 _2SL 21 Madias .... 17,6 les Camada Rata Preparacion Diametro N® Qotas/ad » 1 32 X7 S 2 29 IS 6 3 25 19 6 4 29 14 6 5 28 18 6 6 30 20 6 7 32 26 6 8 30 19 6 9 28 19 6 lO 27 24 Madias ...... 19,2 Camada Rata Praparaclon Diametro N® qotaa/adipocitos 8 1 25 19 8 2 26 *• 16 8 3 27 21 8 4 23 10 8 5 32 15 a 6 31 14 8 7 24 16 8 8 20 10 8 9 27 20 8 10 23 16 Médias ...... . 15,7 166 Camada Rata Praparacldn Diametro N® ootas/adipocitos n 10 1 29 24 n 10 2 30 23 n 10 3 28 25 n 30 4 30 10 n 10 5 29 19 n 10 6 32 22' n 10 7 29 r? n m 8 2S 16 II 10 9 32 n II 10 10 J lsl MecUaa ..... 18,2 Camada n n n n II II II II II II Rata 12 12 12 12 32 12 12 12 12 12 Preparacidn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Médias Diametro 30 30 29 25 29 26 29 25 26 30 27,9 N® ootas/adioocitos 14 5 6 12 12 17 23 18 318 9 13,7 167 Camada Rata Preposlclorr Diametro N® qotas/adioocitos II 14 1 25 21 n 14. 2 28 12 II 14 3 31 23 II 14 4 29 20 II m S 32 24 n 14 6 29 18 II 14 TP 30 15 n 14 • a 32. 10 n 14 9 30 15 n 14 3D 32 18 Médias ........ 17,6 Camada Rata Preposicion Diametro N® qotas/adipocitos II 15 1 26 21 n 15 2 30 23 n 15 3 25 14 n 15 4 29 18 n 15 5 25 14 II 15 6 26 25 II 15 7 30 10 II 15 a 25 20 II 15 9 24 19 II 15 ID 25 Médias ......... 18,6 iœ Camada Rata *^reparacion Diametro N® notas/adipocitos III 20 1 34 19 in 20 2 33 20 III 20 3 33 17 ni 20 4 34 14 m 20 5 26 32 in 20 6 32- 16 ni 20 7 33 15 ni 20 a 23 18 III 20 9 27 17 ’ m 20 10 32 19 Médias........ 30,7 18,7 Camada Rata Praparaclon Diametro N® qotas/adipocitos in 21 1 25 21 III 21 2 25 20 III 21 3 26 18 in 21 4 35 15 III 21 5 26 26 III 21 6 23 15 III 21 7 24 27 III 21 8 30 17 ni 21 9 23 18 in 21 10 25 15 Médias ........ 19,2 iœ amada Rata Praparaclon Diametro N® ootas/adipocitos m 22 1 28 12 n i 22 2 28 11 III 22 3 31 13 i n 22 4 29 16 III 22 5 25 20 III 22 6 25 17 i n 22 7 27 19 III 22 8 25 16 III 22 9 23 18 - m 22 10 22 13 Mediae ......... 15,5 Camada IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV Rata 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 Praparaclon 1 2 3 4 5 6 7 a 9 10 Médias Diametro 36 30 26 32 28 35 26 30 29 27 29,9 N® ootas/adipocitos 11 24 19 23 26 24 20 19 10 22 19,8 170 Camada Rata Preparacion Diametro N® qotas/adic IV 25 1 32 20 IV 25 2 28 233 IV 25 3 28 20 IV 25 4 25 16 IV 25 S 27 18 IV 25 6 27 17 IV 25 7 24 21 IV 25 a 32 18 IV 25 9 25 26 IV 25 IJO 25 14 Médias ....... 19,3 Camada Rate Praparaclon Diametro N® qotas/adipocitos IV 26 1 34 21 IV 26 2 30 30 IV 26 3 28 16 IV 26 4 27 17 IV 26 5 26 18 IV 26 6 33 15 IV 26 7 26 17 IV 26 8 28 18 IV 26 9 25 14 IV 26 lO 24 15 Médias ....... 18, 171 Camada Rata Praparaclon Diametro N» qotas/adipocitos IV 29 1 25 12 TV 29 2 35 15 IV 29 3 25 19 IV 29 4 25 19 IV 29 5 32 22 IV 29 6 25 15 IV 28 % 26 16 IV 29 8 25 14 IV 29 9 26 12 ~ IV 29 10 -23- J S l Médias ....... . 26,7 16,2 Camada Rata Preparacion Diametro N® qotas/adi V 31 1 29 18 V 31 2 24 16 V 31 3 27 17 V 31 4 22 12 V 31 S 26 13 V 31 6 29 21 V 31 7 26 13 V 31 8 26 18 V 31 9 26 16 V 31 10 3P 15, _ Médias 26,8 15,9 172 Camada Rata Preparacion Diametro N* qotas/adipocitos V 35 I 33 22 V 35 2 34 15 V 35 3 28 23 V 35 4 35 32 M 35 5 32 12 V 35 6 30 21 V 35 7 37 18 V 35 8 37 24 V 35 9 39 19 V 35 lO _22_ 10 Médias.......... 19,6 Camada Rata Preparacion Diametro N® qotas/adipocito! V 36 1 25 14 V 36 2 25 19 M 36 3 26 17 \t 36 4 29 20 M 36 5 26 16 V 36 6 23 13 V 36 7 27 12 V 36 8 24 14 V 36 9 26 13 V 36 10 - 3 ^ 15 *^edias........ 26,3 15,3 173 Camada Rata Preparacion Diametro N® ootas/adipocitos M 37 1 29 20 V 37 2 27 18 V 37 3 31 22 V 37 4 30 20 V 37 5 30 10 V 37 6 24 11 V 37 7 27 19 V 37 8 29 20 V 37 9 26 18 V 37 10) 26 _iZ_ Mediae ....... . 27,9 17,5 Camada Rata Preparacion Diametro N® qotas/adipocitos VI 39 1 26 25 VI 39 2 23 19 VI 39 3 32 14 VI 39 4 31 19 VI 39 5 27 15 VI 39 6 33 16 VI 39 7 26 22 VI 39 8 24 18 VI 39 9 29 18 VI 39 10 24 13 Médias..... 17,9 174 amada Rata Preparacion Diametro N® qotas/adipocitos VI 40 1 25 18 VI 40 2 27 20 VI 40 3 21 13 VI 40 4 26 17 VI 40 5 22 15 VI 40 6 25 20 VI 40 7 30 21 VI 40 8 26 16 VI 40 9 24 15 VI 40 10 20 12 Madias 24,6 16,7 Camada Rata Preparacion Diametro N® qotas/adipocitos VI 43 1 22 18 VI 43 2 24 20 VI 43 3 27 18 VI 43 4 22 15 VI 43 5 30 25 VI 43 6 24 9 VI 43 7 34 12 VI 43 a 23 19 VI 43 9 25 15 VI 43 10 29 15 Madias ...... 16,6 175 Camada VI VI VI VI VI VI VI VI VI VI Rata 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 Praparaclon 1 2 3 4 5 6 7 a 9 10 Médias Diametro N®qotas/adipocitos 24 18 30 23 31 12 24 14 23 11 22 16 21 17 30 19 22 20 27 14 25,4 16,4 Camada Rata FYsparacion Diametro N®gotes/adipocitos VI 46 1 24 15 VI 46 2 26 22 VI 46 3 25 18 VI 46 4 33 17 VI 46T 5 23 15 VI 46 6 26 16 VI 46 7 23 19 VI 46 8 26 17 VI 46 9 25 19 VI 46 10 27 18 Médias ....... 17,6 176 Camada Rata Preparacion Diametro N® ootas/adipocitos VII 49 1 20 14 VII 49 2 26 15 VII 49 3 23 18 vu 49 4 30 24 VII 49 5 31 16 VII 49 6 24 16 vu 49 7 26 15 vu 49 8 29 18 vu 49 9 20 10 vu 49 10 27 13 Madias ......... 25,6 15,9 Camada Rata Preparacion Diametro N® qotas/adipocitc VII 53 1 27 18 V U 53 2 23 20 vu 53 3 33 14 VII 53 4 27 23 VII S3 5 25 28 VII 53 6 30 22 vu 53 7 27 23 VII 53 8 28 22 VII S3 9 25 18 VII 53 10 28 17 Médias ........ 20,5 177 Camada Rata Preparacion Diemetro N® ootas/adipocitos V U 55 1 29 22 v u 55 2 23 15 VII 55 3 29 18 VII 55 4 28 16 VII 55 5 25 14 VII 55 6 27 23 VII 55 7 26 19 v u 55 8 24 17 v u 55 9 26 19 VII 55 10 27 14 Médias ....... . 26,4 17,7 Camada Rata Preparacion Diametro N® ootas/adipocitos VII 56 1 27 19 VII 56 2 25 13 VII 56 3 26 15 VII 56 4 25 15 VII 56 5 25) 19 VII 56 6 29 10 VII 56 7 27 15 VII 56 a 25 12 VII 56 9 30 20 VII 56 10 22 17 Médias..... 15,5 170 Camada Rata Preparacion Diametro N®aotas/adioocitos vni 57 1 24 16 VIII 57 2 23 16 VIII 57 3 29 15 VIII 57 4 24 7 vin 57 5 22 12 VIII 57 6 22 16 vin 57 7 24 17 vni 57 a 32 16 vin 57 9 25 17 vin 57 10 23 Médias ....... 15,5 Camada Rata Preparacion Diametro N®aotas/adioocitos Vin 62 1 25 17 VIII 62 . 2 27 19 Vin 62 3 26 22 vin 62 4 27 15 . vin 62 5 27 21 VIII 62 6 26 19 VIII 62 7 26 16 vin 62 8 21 13 VIII 62 9 20 16 vin 62 10 33 14 Médias ........ 18,2 179 Camada Rata Preparacion Diametro N® ootas/adipocitos VIII 63 1 29 18 VIII 63 2 25 15 v m 63 3 31 14 VIII 63 4 30 14 VIII 63 5 37 13 vni 63 6 30 17 v m 63 7 31 14 v m 63 8 29 15 VII 63 9 31 14 VII 63 10 - S - 12 Médias ........ . 30,5 14,6 Camada Rata Preparacion Diametro N® ootas/adii v m 6 4 1 - 28 16 VIII 6 4 2 26 20 v m 6 4 3 27 15 VIII 6 4 4 32 13 v m 6 4 5 26 18 v m 6 4 6 23 II VIII 6 4 7 24 15 v m 6 4 8 25 19 VIII 6 4 9 25 14 v m 6 4 10 26 13 Médias ....... 15,4 180 Camada IX IX IX IX IX IX IX IX IX IX Rata 65 65 65 65 65 66 65 65 65 65 Preparacion 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Médias .... Diametro 27 28 24 30 27 26 23 24 25 29 26,3 N® gotas/adipocitoa 14 19 16 16 13 14 18 10 17 20 15̂ 8 amada Rata Preparacion Diametro N® qotas/adipoeitos IX 66 1 30 15 IX 66 2 20 9 IX 66 3 27 15 IX 66 4 27 12 IX 66 5 24 18 IX 66 6 27 16 IX 66 7 28 9 IX 66 8 28 16 IX 66 9 30 18 IX 66 10 26 13 Médias........ 14,1 181 Camada Rata Praparaclon Diametro Nflqotas/adipocitos IX 68 1 30 14 IX 68 2 29 17 IX 68 3 25 20 IX 68 4 30 17 IX 68 5 26 18 IX 68 6 25 18 IX 68 7 26 13 IX 68 8 25 23 IX 68 9 24 18 IX 68 10 20 9 Médias............ 26,0 16,7 182 T%st de la comprobacldn de las poblaclones contrôlas e Inyecta dos, segùn dos variantes & — Didmetro de los adipocitos y - N® de gotas. Si la media poblacional de contrôles es:: A - y la de ipyeatados as % A l A 2 A l ^12 si test, someta a pruebe las — siguientes hipdtasis bivariantas: __ El muestreo aleatorio llevado a cabo en 35 contrôles con 10 preparaciones por animal, segùn los datos adjuntos, proporcionan la ma triz: 32,3 31 28,9 30,5 27,3 29,8 27,3 28,3 23,6 31,7 27,8 30,5 25,4 29,8 26,0 27,5 Cuya primera fila sa rofiere a "didmetros“ y la segunda a "N® de gotas". Para al cdlculo da la correlacidn antre los datos de la matriz de suma de cuadrados, el producto da desviaciones y al vector da médias muestral, se utilizarën en el siguiente programs, en una calculadora —. "Hewlett-Packard", HP 25: 183 Câlculo de r y de la matriz de SCO y SPQ y 1 4 13 25 RCL 3 2 14 -- 26 3 STO * 0 IS STO 5 27 CHS 4 IS RCL 6 28 RCL 0 5 17 RCL 7 29 4. Z 4- 26 18 gx 30 STO 0 7 GTO 00 19 RCL 3. 31 X _ _ 8 RCL 5 20 4 - 32 f \Tx 9 RCL 7 21 — 33 10 RCL 4 22 STO 6 34 GTO 1 13L X 23 RCL 4 35 GTO 00 12 RCL 3 24 2gx Pulsacionea Realstros A Z X [ enter] «6 Hx^ - A Rg ^ x y n - ^ x ^ y 1 PROG. n R/S A ^ y ; OLD f.PRQQ, para el 1®** par "3 n — «2 vaclo GTO 08 R/S En pantalla • r Obtenemosi 184 r - 0,3808 126,3069 69,5180 ' 28,2543 28,7800! 69,5180 263,8560 El muestreo aleatorlo llavado a cabo an el grupo da "inyecta dos", afactuado da igual modo qua an contrôlas, proporciona la sigulan ta matrlzt 29,20 30,40 29,00 26,30 29,90 20,00 17,60 19,20 15,50 19,80 Qua con el programa anterior, da: r - 0,4034 119,2469 45,3951 45,3951 106,1789 - 27,3543 17,1657 185 Estudiaremos la normalidad bivariante de "diémetro" "n^ de gotae", en contrôlas a inyectadoa, madiante la prueba grdfica an la mitad superior dal diagrema Probit relative a las distancias de Maha lanobis, calculadas con un programa en la HP - 25: fVueba grëfica de normalidad bivariante. Câlculo de distancias de Mahalanobis. Saan n Individuos - 1 - 1, . j - 1,2 SU media m "l y su matriz de SCO y SPD A m âx^ «2 - csxiû xî ) - (Sxî r El programa calcula 0 » \ j (n—l) (XiJ — Tm) A Xij) — "mi) — \/ (n—l) î IBS para cada vector XI ji de la muestra 1 sro 1 17 sro-7 33 ACL 2 2 18 1 34 X 3 sro 3 19 sro -7 35 2 4 X 20 H/S 36 X 5 21 ACL 5 37 i 6 sro 2 22 — 38 Gx^ 7 GTX^ 23 39 a — 24 ACL 4 40 9 g X - o 25 -- 41 ACL 1 10 QTO 20 26 42 X 11 sro 0 27 ffxF 43 4> 12 sro 4 -1 28 ACL 3 44 4> 13 sro 4- 3 29 X 45 sro 6 14; CHS 30 46 ACL 7 15 sro 4 - 2 31 47 X 16 32 X 48 f Vx 49 B/a 187 Pulsaclones sro 4 "2 sro 5 n IenterI “12 lENTERl “11 f PROG. R/S Reqlstroa "7 n - 2 "6 2 R_5 2 R. m.4 1 11 "3 a 12 "2 a 22 "1 a R 0 det " 4 IenterI ^ 2 GTD 21 H/S En pantalla Q Pare cada vector repetir: Ie n t e rI ^ 2 GTO 211 R/S Comprobacldn del programa: " f : : ] Se obtiens: Si D . 21,82 22 - 34 188 CONTROLES: Distancias de Mahalanobis: 3,56; 1,53; 0,62; 1,21; 1,72; 1,02; 1,46; 1,32; 1,53; 0,89; 1,78; 1,18; 0,53; 1,02; 2,16; 1,08; 1,43; 1,20; 0,61; 1,07; 0,71; 1,16; 1,16; 1,05; 1,62; 0,41; 1,31; 0,28; 1,79; 0,54; 1,35; 1,21; 0,80; 1,01; 0,51; Ordenacion y Frecuencias acumuladaa 0,28 0,80 1,16 1,43 0,71 0,41 0,89 1,18 0,51 1,46 0,74 0,51 1,01 1,20 0,54 1,53 0,77 0,53 1,02 1,21 0,57 1,53 0,80 0,54 1,02 1,21 0,57 1,62 0,83 0,61 1,05 1,31 0,60 1.72 0,86 0,62 1,07 1,32 0,63 1,79 0,89 0,71 1,08 1,35 0,69 1,87 0,91 2,16 0,97 2,16 0,97 3,56 1,00 INYECTADÛS: 189 Distancias de Mahalanobis 1,65; 1,69; 1,24; 0,99; 1,10; 2,29; 2,08; 0,75; 0,98; 1,30; 1,30; 2,87; 1,33; 0,57; 0,56; 0,72; 2,61; 1,07; 0,30; 0,43; 0,72; 1,04; 1,04; 1,01; 1,03; 0*82; 1,78; 0,72; 1,51; 1,34; 1,36; 1,79; 1,65; 0,96; 1,71. Ordenaciorry Frecuencias acunuladea; 0,30 0,89 1,24 0,54 1,65 0,77 0,43 0,99 1,30 0,57 1,69 0,80 0,56 1,01 1,30 0,57 1,71 0,83 0,57 1,03 1,3a 0,60 1,78 0,86 0,72 1,04 1,34 0,63 1,79 0,89 0,72 1,04 1,36 0,69 2,08 0,9% 0,75 1,07 1,51 0,71 2,29 0,94 0,82 1^10 0,51 1,65 0,77 2,61 0,97 0,96 2,87 1,00 Ambos diagremae probit, muestran la linealidad de las muestrae bivariantes de contrôles e inyectados y por tanto se puede aceptar la normalidad bivariante de las poblaciones que estudiamos. El problema de la igualdad de ambas matrices de varianzas y covarianzas es aqui irmecesario por ser los efectivos de les muestras iguales y relativamente elevados. 1 9 0 O N ; t R O;l f e SOlikdRÂM A i PROIDIT TA 6 S U PE R IO R /r 1 i,:j 1.4 1,5 1,7 1,91.1 I.H 2 2.1 191 2.8 ' n i 11 0.3 I »! 1 ht 4 U lit:: HU- 1.2 1.3 14 1.5 1.6 1,7 V« 1 9 2 2,1 2.21 1.1 192 En estas condlclones la comparacidn tlene el rigor exigible. El câlculo de la potencia del test, siendo » 35, 0,01, m 2 y ^ 2 - 67, es prâcticamente 100 %, asl, si la diferencia entre y es real, entonces es seguro que el test, la pondrâ de menifiesta. fture comparer las vectares de médias utilizamas el test de - HOTELLING, para el cual necesitemas la matriz: 2A5,5S38 114,9131 114,9131 370,0349 y las diferencias: m^^ » 0,9000 ; » 11,6143 entra Para el calcula de; F - ̂ can: distribu cidni p 2 utilizamas el siguiente programa para una HP 25: 67, 193 Test da Hotelling para comparaclon de vectores de médias en muestreo independiente. 1 STO 1 17 S m X 1 33 RCL 6 2 IB STO X 1 34 RCL 5 3 sro 3 IS STO X-2 3S 3 4 X 20 36 -- 5 21 STO X 3 37 X 6 sra 2 22: sro X 3 38 RCL S 7 GX^ 23 STO X 2 39 2 a — 24 2 40 x; 9 gx » o 25 STO X 2 41 4* 10 GTO 16 26 1 42 RCL 1 11 STO 0 27 4 43 RCL 2 12 STO 4" 1 28 STO 6 443 RCL 3 13 ST O -a. 3i 29 STO 5 45 4- 14 CHS 30 4 46 4- 15 sro 4- 2 31 sro % 6 47 sro 7 16 B/a 32 STO 4> 5 48 X 49 R/S 194 Pulsaclones “12 I enterI ®22 jEhfTER \ “11 f PROG. R/S (La Inversa puede ser extralda — eh ora de los reglstros) Reqlstroa .-1 "7 "6 "l"2 "s n^ + n R. vaclo 4 .11 ”3 .12 "2 22 "1 a Ro det ,-1, "1 ( ENTER I "2 [EWTER i "lir"bl I ENTER I "12- ^ QTO 17 R/S Err pantalla F Obtenemos asl el valor F - 234,18. El valor da la tabla — a 1 °/ao es 7,50, por tanto las poblaciones dlfieren muy slgnlfi catlvamente. 195 Puesto que cada poblacidn contiens dos variables aleatorias, - "didmetro", "n® de gotas", corresponde ver shore si ambos factores con tribuyen a la diferencia encontrada en el test o solamente uno da ellos. Escogiendo el vector ^ p a r a el intervalo de confianza de la diferencia de mediae "didmetroa* *"/^l tenemos: 0 .9 0 - F E " ^ O n - A i < <^o,so + V ^ 3,a. 2 - ^ x 7'= - ®'“ < T " A t < 7,81 Este intervalo contiens el origen de coordenedas y por tanto, el factor "cUdmetro" no contribuye a la diferencia encontrada en el - test. Para el factor "n® de gotas", partimos del vector , obteniendo 11,6143 X ^ 1 2 C. Quizd el capitule que nos ofrecid mayor dificultad fud la demostracidn de los dcidos grasos captados por la célula tras la hi- droliais y accidn enzimdtica. Esta dificultad émana del hecho de que no hay tdcnica iddnea para su demostracidn. 230 Un grupo de tdcnicas como el ACIOO OSMICO y la REACCXON! de SCHIFF prevlo tratamiento dcido con PERACETICO o PERFDRMICO, - (131), son descrltas en la literatura como capaces de tenir los - dcidos grasos insaturados, la primera por que el tetradxido de — osmio es capaz de romper y luego oxidar los dobles enlaces del — dcido graso, polimerizendo, a travds de los cuatro oxlgenos del - tetradxido de osmio, cuatro dcidos grasos; la senguda porque el - tratamiento dcido rompe tambien estos dobles enlaces de los dcidos grasos insaturados liberando grupos aldehidos que reaccionan des­ puds con el reactivo de Schiff, a la vez que viran la leucofuccina a color rojo. La dificultad estriba en que estas tdcnicas son^ca;^ ces de detectar cualquier otro dcido graso inaaturado existante en el tejido, ademds de cualquier otra substancia con dobles enlaces, por lo que al carecer de especificidad, es a veces imposible el e- lindnar las faises positividades aûn trabajando con bloqueantes pa ra las demds substancias, eliminado por lavados en acetona/eter — los dcidos grasos préexistantes en el tejido y aunque, naturalmen te, la valoracidn se haga sobre contrôles no incubados en substra to. Otro grupo de tdcnicas como la FISCHLER (l3l) o la sim­ ple adicidn de NITRATO DE PLOMO al 2%, tiene como principio la de tectacidn de loa grupos carboxilicos del dcido graso. En el primer caso mediants la incubacidn prolongada a 37*0, en Acetato cuprico a saturacidn, el Cu reacciona con los grupos carboxilicos prestdn— doles una tonalidad azul brillante, y en el segundo caso es el plo mo el que reacciona en saponificacldn con el grupo carboxilico ti- ndndolo de negro o pardo obscure con el sulfuro de amonio. Pero - una vez mds estas reacciones distan mucho de ser especificas para los 'cidos grasos toda vez que pueden detectarse tambien los gru— pos dcidos pcotdicos o en general cualquier grupo carboxilico del tejido. 231 Este Vadolecer" de un medio preciso para Acidos grasos y Lipidos enmascârados ha sido y es lam3ntado constantemente por to dos los autores (Barka (132), Pearse (133), Uc Manus (l31...ect), y una vez mds es la causa de que en nuestro caso no podamos excluir - los falsos positives y, por tanto, llegar a una medicidn exacts de la actividad enzimdtica de la Lipoproteinlipasa. No obstante, sun partiendo de la adicidn de otros dcidos grasos en nuestros resultados, si que hemos podido detectar parcial— mente esta actividad LR. como puede observarse en las fig. 92 y 93 - asi como valorar y criticar muchos aspectos tdcnicos de mdtodo empleo do y finalmente hallar diferencias de actividad LR_ en el tejido adi­ pose pardo con y sin tratamiento esteroideo, resultados todos ellos - que senalaremos brevemente a continuacidn, y que si no nos hemos atre vido a que figuren dentro de nuestros resultados y comentarios genera les de la Tesis es en espera de conseguir en breve una tâcnica esp»- cffica para la demostracidn del producto enzimdtico dcido graso, que excluyendo los falsos poeitivos acredite totalmente nuestros resul­ tados. De todo ello, los resultados que podemos destacar breve mente, son los sigidentes: a) Es preciso para poder eliminar enmascaramientos de la acti­ vidad, la eliminacidn de los lipidos existantes en el tejido con el peso prevlo de este por solventes lipldicos, de ellos el de eleccidn séria el de Acetona/Eter, con un tiempo entre 2 y 6 horas (Fig. :94) . b) El substrato de eleccidn es el VLOL b quilomicrones del pro- pio animal, en nuestro caso de rata, y en su defecto los qui londcrones obtenidos de la sangre del animal. En ambos casoa 232 los resultados son superlores a los obtenidos con el empleo de trlglicefldos y lipidos comerciales. (fig. 92 a 97). c) Es precise la adicidn de Proteinas y sales plasmâticas, si estas no van naturalmente unidas al substrato. d) Igualmenta si se quieren conseguir una correcte acti­ vidad LPL, es necesaria la adicidn de. die de cultivo, ya que sin elle no exists actividad ds- tactabla (Fig. 98 y 99). e) El pH dptimo es de 8 a 8*1; y aunque puede conseguiz~- se con la utilizacidn de otros tampones, ofrece resul­ tados excelentes al Tis-maleato. f ) Son activadores los iones de NH^ e inhibidores de la ao- tividad los fosfato y/o bicarbonata. g) La temperature dptima as la corporal da 37*0., y el - tiempo da incubacidn da hora y media a dos horas. h) Eh nuestra experiencia en ningdn caso pudieron eliminar se falsas positividades con el empleo de las tdcnicas para la demostracidn del producto de activida - - - enzimdtica el dcido gieso, ds tal forma que con todas ellas podria observarse una tonalidad de fondo (roja - con el reactivo de Schiff, azul con las tdcnicas cu- - prices, etc.) pero sobre ellas podian detectarse pun- tos mds intensamente positives que detectaban la acti­ vidad enzimatica. Eh nuestra opinidn, los mejores re- sultados se obtienen con la utillzacidn del reactivo de Schiff tras al tratamiento con dcido peracdtlco. 233 l) La actividad, aunque "in vivo" se realize a nivel ca- pilar, es decir que el enzima se desplaza desde la - membrana del adipocito hasta la luz capilar, donde, bajo la activacidn heparlnica es capaz de hidrolizar el complejo Triglicerido-proteina, en nuestros cases en que el substrato se ofrece directamente a la cdlu­ la la actividad se detects en citpplasma y membrana. P o r otro lado dado que su determinacidn no se realizd a microscopia electrdnica, no se pudo establer la mda o menos eatrecha conexion con la membrana, ni tampoco si pudiera tener relacidn con otros organelos celulea- res, hecho que pensamos Uevarlo a la prdctica con pos terioridad. C O N C L U S I O N E S 235 CONCLUSIONEa El objativo del presents astudio, ha side comprober quâ alte- raclones sa producan an el tajido adipose pardo da la rata an al pario do postnatal, como consacuancia da la admlnlstracldn da una dosis node radamenta alta da Hidrocortisona (5 ng/Kg/dla), durante un tlampo pro longado (diaa S. al 21 da la vlda postnatal). Da todoa loa mëtodoa da valoracitfn amplaadoa podemos axtraar - las siguiaitas conclusionest ~ 1".— Da nuastra valoracitfn astadlstlca apllcada a los pardme— — troa* Peso corporal y peso dal drgano graso interescapular, conclulmos qua: Las poblacionas cte animales contrôles a in yectados, a los 21 diaa, tiana un peso corporal y un peso del TAP aqid valantes. Obsarvdndosa ademds una fuerts corralacidm antra estos dos - pardmetros tanto an la poblacidn: control como en la poblacion inyecta da. Los coeficientas da corralacion poblacionales, antra contrôles a inyectados, son aquivalantas y la introduccion da estas corralaclo- nas an m teat bivariants no pona da manifiesto la existancia da cüfa rancias; siendo ademds la probabilidad da qua no hallamoa puesto ds:- manifiesto una diferancia, qua realmente exista, muy pequena (p » 5%) ndentras qua la probabilidad da habarla dascubiarto as Cl-P - 95%) . - Debamos acaptar per tanto la equiValencia da ambas poblacionas tanto - an al peso corporal como an al peso dal TAP. 236 2',— Con Idântlco método eatadlstlco hemos conflrmado que la — hidrocortisona no tiens efecto sobre el diâmetro- de los — adipocitos par dos, mlentras que si actüa sobre el nûmertJ — y didmetro de las gotaa intracitopldsmicas de triglicâridos, causando - disminucidn del nAnero de las mismaa y aumentando su diémetro como con secuencia de la fusidn entre allas. 3'.- EL enzima citoplésipica Glucosa-6-Fbsfato-Oeshidroganasa, compromotido an al aprovachandLento de la gluooaa, sa ha­ lle incramantado, paro simultdnaamenta hamos encontrado - tma disRdnuciôn de la actividad NAQH-Oiafbraaa citoplâsmioa, imbricada an al aprovachamiento enargâtico de esta principio. Si a allo la suma— mos al incramanto en actividad alfa-431icarol-Fosfato hallada por otroa autoras, (responsable de Qlicolisis y Lipogënesis) y nuastros datos de» disfflinuciâni de dapdsitos de glucdgano aumanto dal didmatro de las gotaa lipidicaa, as claro que la accidn de los Q.C. sobre al TAP, as fundamea talmanta: lipogënica, 4>.— Sa prockica una notable disminucidn de los enzimas mitocon drialaa implicados an el ciclo de Krabs y aprovachamiento anargético aérobic, como Oeshidroganasa Succinico y Mali­ ce, dtocrtnNooxidasa y NAOH* Oiaforesa mitocondrial, si bien al datriman to nunca as tan exagarado como al sanalado por algunos autoras an la - literature, empleando los glucocorticoides a dosis ostensiblement* mda altas. Y siendo que la degradacidn y obtancien de energia a partir de — los âcidos gresos es la funcidn mds espscifica del TAP, podemos dacir — qua los glucocorticoides disminuyen sensiblamenta esta accidn fisioldgi ca^ 5*.- Sa observa un ligaro aumento de la actividad de enzimas lipoliticas y citoplâsmicas, como Lipasa tisular y otras Estarasa* inespeclficas, capaces de hidrolozar triglicë- ridos a gliceron y âcidos grasos; y si, como acabamos de senelar, estes 237 âcidos gresos no son utilizados por la propia côlula a nival ndtoconf drial, ni tampoco son raconvertidos en glucdgeno a nival citoplâsmico como demuestra la disminucidn de depdaitos de esta azucar, podamos — concluir diciendo qua très una lipolisis ligeran»nta aumentada da los âcidos grasos libarados no sarian utilizados por al proplo adipocito, sinâ que pasarian al capilar para su posterior aprovachamiento en — otros tajidos. 6#.— Da to do lo anterior sa deduce qua los glucocorticoides, a la dosis amplaada por nosotros, aumentan fundamentalmanta la lipogânasis del TAP con al consiguienta. incramanto da - dapâsitos de triglicâridos y en manor medida la mogilizacidn da estos con libaracidn da los âcidos gresos al capilar, y sin que exista un a provachamiento anargético "in sitiT a nival mitocondrial ni citoplas­ ma de los ntLsmos. Dado qua esta dltima as la funciân mâs aspecifica dal TAP ̂ que lo difarencia dal TAB), podemos decir que bajo acciân — (T.C,, adipocito pardo vire su biologie habituai de producciân calorI% ca para peser a funcionar da forme similar a la câlula gresa blanca, — as dacir, como dapésito y regulador energôtico a través del almacena- adento y liberaciâis da âcidos gresos. Las exageredas altaraciones enzimâtices obsarvedas por — algunos autoras (los cuales tambdôn detectan grandes varia cionee en al peso y tamafk) dal TAP), parecen indudablemen te consécutives al emplao de dosis tâxicas da 6.C. (10 vecas superiores a las dosis emplaedas por nosotros). Esto produciria una cas! total anu laciân de la funcion mitocondrial forzando una excesiva lipogénesis. — As£, an nuastros estudios ultraastructurales nunca hemos hallado las al teraciones mitocondriales descritas por dichos autoresf a nival, tan — solo: hemos detectado una disminuciân da los depdsitos de glucdgano. 238 8*.- Hemos constatado la degranulaclârt mastocitaria bajo la — — accldm de la hidrocortisona, a la vez que corroboramos la < hipdtesls actual sobre el mecanismo de exocitosis o libe racidn de los grënulos, basada en una compatitlvidad de los productos libarados con al sodio extracalular, que va acompanada de una pérdida da electrodensidad granular. Finalmenta senalamos la utilidad que al estudio de esta exocitosis puede tener como medida indirecta de la ac Ëividad Lipoprotainlipasa, 9*»— Dasda al punto da vista tâcnico, sa aporta la modifica— - cidm a la tâcnica de f^arsa, para la Lipasa Tisular ÿ su posibla diferenciacion da la actividad da otras estarasa» inespeclficas, considerando que el mëtodo iddneo en el TAP, as al ad guiente: Twaen: 85, pH 7,2; Incubacidn a 37* durante 3 horas y contras ta con nitrato da plomo al 1,5 %. 10'.- Por ûltimo, se intenta, aunqua con resultados to dévia no definitivos, crear la tâcnica para la demostracidn da la actividad Lipo-protein—lipasa en cortes histoldgicos, — dnicamenta realizada en la actualidad en homogeneizados da tejido y - plasma. Para lo cual sa hace une amplia valoracidn de diferentes sute tratos activadores e inhibidores, temperature y pH dptimos, asi como dal tratamiento precio dal tajido» Considerando como iddneo: El peso previo da los cortas por Acatona/Etazr, durante 6 hors» como disclven tse da loa Ifpidos, la utilizacidn da VLOL y Quiliroicrones como aubstxa to, la adicidn de Heparina e iones NH^ como activadores anzimdticos - y la incubacidn durante 2 horas a 37'. y pH 8. Encontrandosa mucha» - mas diflcultades en la correcte determlnacidn da los âcidos grasos, — producto de la accidn enzimâtica, toda vez que con cualquiera de las técnicas empleadas se suman falsos positives confirmando que de todas allas, la que major demostracidn ofYeca es el Réactive de Schiff pr* vio tratamiento âcido con perfdrmico, capaz de damostrar dobles an— 239 laces de âcidos grasos insaturados. 0 I B L I O G H A F I A 241 B I B L I 0 G R A F I A 1.- RASMUSSEN. A.T., The so-called hibernating gland. J. 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( X 400 ampUada a 19.200) It T % Lâtilna III Fig. 3a.- Fosfataaa alcedlna mostrando actividad capllar. ( X 400} Fig. 3b.- Adenoslntrifosfatasa an la qua sa aprecia la actividad dal lacho vascular. ( X 160) A M 3 V *"î H y t i i # ;r&^ Lâmina IV Fig. 4.- RsticuUna. Dispoaicién en malla rodaendo a los adipocitos pardos. (X 400) Fig. S.- Odlulas cebadas an al tejido adiposo pardo. (X 400) ? yw S. \ n # i # % i . > % ' . » t » , f' ' ' - W < t % y ^ 0 i M T i i Lémlna V Fig. 6.- Vecuolas liplcücaa de loa adipocitos no rodeados de membranas li­ mitantes, sino del propio hialoplasoia. ( x 4CB amplificada a 19.200) & I « Lémina VI Fig. 7.- Mowbrona basal (X 28.000) Fig. 8.- Panortfadca electronicroscdpica da los adipooitos pardos, citoplas- ma con flno oaractar granular contsniendo las inclusiones lipidi- cas (X 3.000) y . V. ■ à Lânlna V U Fig. 9.- Uitocondrlas pleomorFlcas de creatas paralelas estrechamenta empe quetadas (X 19.200} il Lâroina VIH Fig. 10.- Inolusiones de glucâgeno ocxipando praoticemente el espado inter- ndtocandrial. (X 20.000) Fig. 11.- ULsosanes. (X 26.000) Lânina IX Fig. I2a.- Oontraste liplcUco ccn âddo dsmico en rata control. ( X 400) Fig. I2b.— Contraste lipictLco con âcido âsmico en adipocitos de ratas in— yectadas. Cbservese la tendencia a coalescer de las gotas. ( X 400 ) * A' . ^ w 3^, > ‘ 0 » A ^^AAa%S5iR Lânina X Fig. 13a.- Sudâi negro roostrando los Ifpidos intensamente tenidos de adi- pocitoa contrôles. ( X 400 ) Fig. I3b.— Sudâi negro para contraste lipfdico en adipocitos inyeotadcs. (X 400) "f,- ' V % 4 % 'i CIÎ-^/VP """' '"'■Li.A*-*rr, •*{ , È : A ' f f ; : ' m # ; # 4 i ' ' # -, ' '-«i* » '%'•». "J * J f ^ 9î >• _ 4: i'-cr-i S é ^ Ê Æ # 3 ? 'UA Lânina XIII Fig. 16a.- HsmotcudLlina - Eosina en adipocitos contrôles, [x 400} Fig. 1Gb.- Hematoxilina - Eosina an adipocitos inyectados. (x 400} ê ' 0 0 » Lânina XIV 17.- Van Gleson. Finoa tablques conjuntlvos dellroitando los adlpocitaa. (X 400) Fig. 18.- Ratlcullna y colâgena. Las flbras sa disponen a modo de red rodeando a los adipocitos. (X 400) 1̂4 « 4I f . 1 'f/.i.~«'■’ '^1 Lânlnq XV Fig* 19.- Presencia de mucopolisac&rldos con la tdcnica de PAS. (X 100) Fig. 20.- Itastocitos repletos de grenulaciones metacronefticas. (X 400) r î ’^ m ë - ^ - t t # * . ' Ï ^ ( . :4 % iS r t # ' » m # 1 k&f, !- & ' ( Lânina XVI Fig. 21a.- Temarâ habituai para tâcnicas de ôontajes y mediciones en rata control, (x 400, anplificada a 19.200} 4 M È S - m , k. ’'" > ' • C ^s - y ■ " ■■ I Lânina XVII Fig. 21b.- Tanano habituel para tâcnlcas de contajes y mediciones m rata Inyectada. ( X 400, emplificada a 19.200) «V"' J[ ' # L 0 ' < # r Lânina XVIII Fig. 22a.- Azül ds toluidina, panorânlcas del tejldo adipose pardo de re ta control con gran ndmero de gotas por adipoclto.(X 400] Fig. 22b.- Azül de toluidina, observese respecte a la anterior como las gotas lipldicas son raayores tendiendo a la coalescencia.(x 400) m A ' % Lânina XIX Fig. 23.- tlastocltos de tejldo adiposo pardo control. Observese su contomo bien delimitado. (X I.OOO) Fig. 23b.- klastocitos de tejido adiposo pardo inyectado. Observese su degra nulacidn. (X 1.000) m A Lânina XX Fig. 24.- Septos conjuntlvos donde sa pueden apreciar fibres colâganas - cortadas transversalmenta (a) y longltudinalments (b) (X 10.000) Fig. 25.- Flnos tablques delimitando los adipocitos (X 12.000] F a j^ i, iÊâàm'aêi» ë V' 'Ÿ#>*|W -f7"V3rvpR̂ m # 0 # ^ fe 'A # g # Lëmina XXI Fig. 2Ga.- Fibroblasto en espacio Intezreluler. (X 15.000) Fig, 2Gb.- Fibroblasto a mayor aumento. (X 20.000 ) I m Lânlna XXH ,Flg. 27a.- Aed capllar rodeando al adlpoclto pardo control. Obsarvese las æodones capUares. (c) (X 8.0CX}} Fig. 27b.- Red capllar rodeando al adlpoclto Inyectado (X 6.800) j w r : m A Lâmina XXEII Fig. 28.- Pericito envuelto par la membrana basai de la cdlula endotalial, (X 20.000) Lénina XXIV Fig. 29.- Oâlula endotalial (X 12.000} Fig. 30.- Câlula de Schwarm en tejido adiposo pardo (X 26.000} m m h a Lâmina XXV Fig. 31.- Oâlula mesenqulmal con marcado coractar macrofaglco (X 15.000} Fig. 32.- Oâlula mesenqulmal contenlendo ndmerosas vacuoles aleotroclaras, (x 12.600} k M » C m :'!'.$g ^*■"1 Lâmina XXVI Fig. 33.- Oâlula mesenqulmal con vacuolas denses y claras. (X IS.CKjO} Fig. 34.- Cuerpos Usosâmlcos de mcrfologfa varlada perteneclentes al ndsmo tlpo celular. (X 16.100) a f i "4^ Lérflna XXVH Fig. 35.- Mastodto en tejido eddpaaa perdo de ratas oontrolss oca eue t£- plcas granuladanes densas. (X 8.000) Lâmina XXVIII Fig. 36.- Anterior a mayor eumento. (X 15.000) w • t I 9 # t e m m» r Lânlna XXIX Fig. 37.- Oatalla da las granuladones mastocltArlas. Qnanos honogeneen^ ts dansoB. (x 35.000) f y A ^ m ' t r S' Lânlna XXX Fig. 38.- Mastodto Junto a câlula tlpo mesenqulmal (X 8.000) Fig. 39.- Anterior a mayor aumento mostrando las granuladones mastodta- rlas en rata control. (X 12.000) % f t : : f « w , Lâmina XXXI Fig, 40.- Mas tool to ds tsjido adiposo pardo bajo tratamiento con hldro- cortisona. Observese la presencla de cavidades comunlcadas con el exterior, signo de degranulaciân mastocitaria, (x 17.500} Fig. 41.- Observesa grdnulos mastocitarlos con pérdida de electroctensi- dad y repliegues de membrana con cavidades dpticamente vacioa, con signos de activacidn celu}ar.(x 16.000) h ê i s à i . # iiifi iiiMm HxH i m s « r ' %*' ¥ /i # m * » « \4H ...2̂ !WTv,. # Lâmina XXXII Fig. 42.- AdtLpocita poligonal conteniendo inolusiones lipfdicas perfâct»- menta dalindtadas. (x 8.000) m eî«'3 Î akït, Ldmina XXXm Fig. 43.- Limite entre dos edipocitos perdos presentando fires invaglneclo nes de membrona. (X 62.500) Fig. 44.- Desmosotna puntlforme. (X76.000) % & 11 :M^:;, ' t M A W ' y m # ; # : ' . ' Ü K LAnlna XXXIV Fig. 45.- Nûcleo adlpodto pardo, forma oval y nuoladlo aparenta (X 28.000) Fig. 46.- Ndclao adipocito pardo da crcnutlna laxa y nucledlo raticulaur. (X 31.100) ê V: A (9 m S i V f V % ,i‘* %1 s -î. Y % É * a Ldmina XXXV Fig. 47.- Ostalle de ndtocandrla con grênulo eleotrodenso (x 72. 000) Fig. 46.- Details del glucâgeno. (X 75.000} ' W A « i ML,.* -E,» y Ldmina XXXVI Fig. 49.- Gran cantldad da glucâgeno entre las mitocondrias en edipocitos contrôles. (X 40*000) Fig. 50.- Igual a la anterior. (X 35.000) - * " % ii>im ' % # t ^ : . f Ldmina XXXVII Fig. 51.- Panorândca da tejido adiposo pardo da rataa bajo tratamiento - esteroideo don da sa pueda apraciar una clara disndnucidn del glucdgono. (x 18.000) Fig. 52.- Oisminucidn da glucdgano an el hialoplasma da los adipocitos inyactados. (x 43,500) : I : ; m r r n m g si ■? # # # Ldmina XXXVHI Fig. 53.- Panordmica da un adipocito pardo mostrando ndolao (n), mitocon dries (m) y gotas Upldlcas (l) rodeadas per ratlculo andopldg mico llso y da marcada alactroolaridad. (X 12.600) % n p i s Lébnina XXXIX Fig. 54.- Adipocito pardo somatido a tratamiento con hidrocortisona mos- trando una mayor coalascenoia da las gotas lipldicas.(X 6.000] m / » - & K i vs t̂ ï 0 Ldmina XL Fig. 55.- Oatails da la coalescancia da las gotas U^idioas an al adipo— clto pardo tratado. (X 19.000) «PSI- 4-rf^ "W # «waV'A'-î m \ *^''-''' « a r 4, ■'■?-'* . ^ - a , KW-fCe Ldmina XLI Fig. 56.- Gotas lipldicaa con tandsncia a la fusidn. (X 3.000) Fig. 57.- Coalescancia lipldica. (X 6.000) t e ' tffcraWBT ISIffifl'ÎW* V̂ W W » % SI(..d̂/aA iT f ’ 4 l % \ J K *' oddaaa. (X 23.000] Fig. 71.- Microfotografia moatrando el miamo details de la actlvidad dtocromo-oxldaaa (X 22.000] S €4 Lânlna XLIX Fig. 72.- Actlvidad lipasa tisular en forma de grueace precipitadca (a) en el adipocito pardo (X 58.OCX}) Fig. 73.- Actlvidad lipasa tisular intense en la perigota (x 75.000} kl&y'' . Æ "H?-A # y ' " ' n u s i f m } % # # \ % •a M-M ■ ;,ÿfv-,v;; • y,— Lëmina L Fig. 74.- Actlvidad lipasa en el limite de la gota lipldica corresparv- diendose norfaldgicamente c m el réticule lise (X 80.000) » a l v 'à IV.. « % ? & 9 î - f * . W ' % v 8 1 1 * 1 K K . j h %' & ï © i P '/" ' -' ‘"4̂ ] f c m % Lânina LI Fig. 75a.- Actlvidad g-6-POH an rata control con escaaa actlvidad hialo plAsmica. (X 400} Fig. 75b.- Iibyor actlvidad de dicha enzima an el tejido aKiiposo pardo tratado con hidrocortisona. (X 400) & s % , % # # # # .$r " 4 , *y/^r:'sr*v' ' . : * V, Æ t " ; w X # * •X , ‘ * ■ ' •-» .-■ ^ ;r 4^' ^7n^r r^ :N '"'i.'i'. /*■ îL i ** T- * ! ' V * n f ^ i i 1 . ^ 3 Lândna LU Fig. 76a.- Actlvidad NADH en el dtoplaama de Ica adipocitas perdes de- mostrada par la presenda de granos de predpitado de color azul. (X 400) Fig. 76b.— Obsdrvese une mener actlvidad de esta enzima en las ratas — trstadas con hidrocortisona. (X 400) * II Lâtnina LI II Fig. 77a.- Ihtensa actlvidad del enzima SDH mitocondrial observado en tejido adlposQ pardo normal. (X 400} Fig. 77b.- DiandLnuoldn intenaa de esta actlvidad en el tratamiento glu> coceatlcoldeo. (X 400] #1 k % W v * . " - * * ' . ' i f > W jÿ : m € ^ w - m * LAnina LIV Fig. 78a.- Ihtensa actlvidad citopldsmica da la LDH en adipodtoa nor­ males. (X 400] Fig. 78b.- Oismunicidn de esta actlvidad en adipocitos bojo influencia da la hidrocortisona. (X l.OOO] Lâtnina LV Fig. 79a.- Testigo sin sustrato del enzima LDH donde ae apreoia la ca- renda de actlvidad de este enzima en ratas contrd (X 400) Fig. 79b.- Testigo negativo en ratas inyectadas (X 400) $3 1 dll Lâmlna LVI Fig. 60a.- Actlvidad MDH viene demostrada par la aparicidn de sales de formazana de color azul, localizéndose intsnsamente en el citcplasma de ratas contrôles. (X 400) Fig. 80b.- En las ratas sometidas a tratamiento eateroideo se obeerva una disminucidn de los depdsitos de preoipitado que indican el lugar de la actlvidad MDH (X 1.000) •"'■c VA-y- & # # N R ^ e:7fecs'V ‘0 'if!' ' i & H Lâmlna LVH Fig. 81a.- Enzima NADH mitocondrial en tejido adiposo pardo normal (400) Fig. 81b.- Diaminucidn de actividad en el tratamiento con hidrocorti­ sona. (x 400) V-.. . )>!.>■ T V , t, * :#sm# .;-A! i' # r \r2\ l%f* y LAnlna LVIU Fig. 82a.- Intense activldad dtocromo-oxidasa demos trade por los acd- fflulos de precipitados da color pardo an el dtoplasne as ten do los ndcleos contrestados con hematoxiline. (X 400] Fig, 82b.- Intense dlsminuddn de la activldad mltoc end rial da la clto cromo-oxldase en el tratamlento con glucooortlcddes. [x 400) % ■ 4 ^ ’ï'S.fti, Lâmlna LXX Fig. 83a.- -Naftil-estarasa en el oitoplasma de las adipooitos pardos. (X 1.000) Fig. 83b.- mcrernento de aotividad bajo tratsmiento esteraideo. (X 1.000) -iVr] % ^ ^ 4" ' I, Lf'. \ A Limlna LX Fig. 84a.- Tastlgo sin sustrato del «L-Naftll-Eeterasa en la observa la falta da aotlvidsd enzinétlca. (X 400] Fig. 84b.- Igual a la anterior en rata Inyectada. (X 400) m Lâmina LXI Fig. 85a.- El enzimajB-Esteraaa muestra su aotividad ténue en el ci- toplasma de los adipooitos pardos normales. (X 400} Fig. 85b.- Esta aotividad se halla incrementada en el tratandento coi hidrocortisona (X 400) ; % m • Æ , m '/X % ajW 1 ■ m @ y '"r4 v%. f ' Ba^ #4-' . Lémlna LXII Fig. 86a.- La lipasa tlsular se observa par la formaoidn de grandes aadmuloa de preoipitado de color pardo en ratas control, (X 400) Fig. 86b.- Estos animales son mayores bajo tratamiento estsroideo, lo que nos indice su incremento en dlcha aotividad. (X 400) 'ïïWÿ.rA'Tïf-’iiÇ' 0m m T t ' ^ . r > 4 ‘ ô i s3k?9t:.: fi; 1 Ti ■ s f i s - Æ " * * * ' '‘Æatiinmà (M,* Léfldna LXHI Fig. 87a.- Testlgo negativo de la aotividad lipésica en rataa control. (X 400) Fig. 67b.- Falta de aotividad en la inoubacidn sln sustrato de los adi­ pooitos inyeotados. (X 400) 1 4 * # •>» ## m # W R i s m ^ U a à 3'%^ is*»»’*5!?. Lémlna UŒV Fig. 88a.- Esoasa activldad fosfatasa âcida en adipooitos normales. (X 400) Fig. 88b.- Aumento de aotividad can respecte a la anterior en adipod- toa bajo tratamiento esterddeo. (X 400) V „. * 1^- -4 » * ' t *- ‘ N̂.*̂ i m i LAnina LXV Fig. 89a.— Intensa aotividad an al lecho vascular y discrets en el per^ qidm dal tajido «mdposo pardo normal Fig. 69b.- Aumanto da aotividad ATPasa sobre todo en el pardnquima dal tajido adiposo de estos con tratsmiento de hidrocortisona. (X 400) x î v V « lAnina LXVI Fig. 909.- La fosfatasa alcallna se localize en el endotello de los veeos dlbujando el contomo del lecho vascular. (X 400) Fig. 90b.- Llgero aumento de esta aotividad en adipooitos c m trate mlento esteraideo. (X 400) & y 3* # W - : . g # % a # M . •Si5«'̂i M # ' Lândna LXVII Fig. 91a.- Inoubaoldn sln substrato dsl enzlma Fosfatasa aloallna con aotividad totalmente nsgativa en tejido adipoeo pardo normal. (X 400) Fig. 91b.- Igual a la anterior en ratas bajo el tratamiento oon hidn>» oortisona (X 400) m N m - . &P-iR.x A 4 " . I l l # ,,t .44 m i - 3r- ' -J'•*ï*h « k ^ :m'^ LAidna LXVIH Fig. 92.- Aotividad Lipoprotaln-lipaaa contraatada con NQ^Pb, deapuia da incubaddn con lipidoa standar. (X 400} Fig. 93.- Aotividad lipoportafn-lipasa contraatada con Cü daapuaa da Inoubaoidh con lipidoa standar. (X 400) %Üt§B Ldmlna UŒX Fig. 94.- Aotivacidn Lipoprotaln-llpasa con prevlo paso par aoetona- -atar y contrastadoa los grupoe aldehidlcos da los Addas grssoa oon el raaotlvo de Schlff. (X l.OOO) % ^ h f Æ - t m # % / A m V 4 # ! i if: LAnina LXX Fig. 95a.- Aotividad lipoprotaln-lipasa Incubada con VOL an tajido adiposo pardo normal y contraatada con NO^Pb (X 1,000) Fig. 95b.— Igual an tejido con tratamiento esteroideo (X l.OOO) r d U : a t # fig ' : i . M *^‘. , A « w \ ff i # # !.. % ii. LAmina LXXI Fig. 96a.- Aotivldad LPL inoubada con quilanloranea y contrastada con Ou. (X 1.000) Fig. 96b.- Igual an tajido adiposo pardo inyaotado. (X l.OOO] ijifi'é--. A- fifei I M 3 ê^' » Lândna L X m Fig. 97a.- Activldad LPL incubada can quilondcranes y contrastada con MG^Pb. (X 1.000) Fig. 97br- Aotividad LPL incubada con quilondcranaa y contrastada con NOgPb an rata inyectada. (X l.OOO) Ill -i' if # f r- # V l î, y ^ ̂ LAidna LXXm Fig. 98.- Incubadân sin heparlna y contrastada con NO^Pb. (X 400) Fig. 99.- Ihcubaddn sin hsporlna y contrastada con Ou (X 400) y \ 1 b* Vîx m m s m r d ’ ' I i ' - y i pï'îî* a- ' 1 # # ' ■ ^ é g # # - ' P f / - i p .. s >:? # f K '■ 3 ^ /'î% ^ \ s s Lândna LXXIV Fig. 100.- Ratas de 21 diaa mementos antes del sacrificio. Los de la fila superior son inyeotedoa, y los de la inferior contrô­ les. No hay diferencias significatives entre ambos tipos. m m % : Ekï y-/ % ; 'ft't1 BP"' -vS ; # R ; ;..