DEPARTAMENTODE GENÉTICA FACULTAD DE BIOLOGÍA UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID 5309562202* IJNIVERSIDAD COMPLUTENSE CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS DE LA VARiABILIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES ESPAÑOLAS DE TENCA M~ ANTONIA ELORRIETA .JOVE 1993 Trabajoparaoptaral gradode Doctoren CienciasBiológicas por la UniversidadComplutensedeMadrid realizadopor M~ AntoniaElorrietaJove Autora: M~ AntoniaElorrietaJove V0 B0 del Directorde la Tesis:CésarBenitoJiménez ‘fo ~ft> Madrid, Mayo 1.993 ji Amu/dnrnta iii AGRADECIMIENTOS Deseoexpresarmi agradecimientoal Dr. J. R. Lacadena,Directordel Departamento de Genéticade la Facultadde Biología de la UniversidadComplutensede Madrid, por las facilidadesconcedidasparala realizaciónde estetrabajoen el Departamento. Quiero agradecera CésarBenito Jiménezsu direcciónen estetrabajo, sin la cual no sehabriarealizado. De forma muy especia]quieroagradecerlea Ana MargaritaFigueirasMerino, que me brindó toda la ayuda y consejosnecesariosen el desarrollodel trabajo, su infinita pacienciay confianza. igualmenteagradezcoaJuanLuis SantosColomasu ayuday valiosos consejos,así como el apoyoquemeha ofrecidodurantetodosestosaños. A Jose Manuel Franco Zorrilla le agradezcosu firme colaboracióny constante trabajoen estainvestigacion. Debo mi agradecimientoaGuillermo ThodeMayoral,del Departamentode Genética de la Facultadde Cienciasde Málaga,quienme ha introducidoen el conocimientode las técnicascitogenéticasde peces,asi comomehaofrecidosus consejossiemprequeha sido necesario Igualmentedeboagradecera LauraSánchezy a todo el grupode investigacióndel Departamentode Genéticade la Facultad de Cienciasde Lugo el habermeenseñado algunastécnicascitogenéticasde peces. A Gonzalo Martinez le agradezco,apartede la amistadincondicional que me ha brindado, sus valiosos consejos y comentariossobre las técnicas electroforéticasde isoenzimas. A D. JoséManuelCampo,del Centrode InvestigacionesAgropecuarias“Dehesón del Encinar’ (Oropesa,Toledo)de la Comunidadde CastillaLa Mancha,y a D. Eduardo Diez de la Lastra,por la ayudaaportadaen la localizacióny obtenciónde las poblaciones lv estudiadas,y al primeroademásporel aportecontinuoy desinteresadode ejemplarespara su estudio. A D. JoséManuelPérezde la piscifactoría“Vega del Guadiana”(Badajoz),D. Ángel CasanuevaMadrazode la “Laguna del Cristo” (Salamanca),a la Consejeríade Medio Ambiente de la Comunidad de Navarra (“Embalse de Cintruénigo”) y a los porpietariosde las charcasde “La Generala” (Cáceres)y de Oropesa(Toledo), por la aportaciónde las poblacionesde tencaestudiadasen estetrabajo. Mi agradecimientotambiéna todos mis compañerosdel Departamentode Genética por la ayuda y colaboraciónque en todo momentome han ofrecido, y en particulara CarlosZaragoza,JavierGallegoy JuanCarlosdel Pozo, En especialdebo agradecerlea JoséBarriosla frecuentey valiosaayudaprestadaen estetrabajo. Porúltimo, quiero agradecerde formamuy especialla ayuday el apoyorecibido por partede todami familia, quieneshancolaborado,de unau otra forma, en la realizaciónde estetrabajo. y INDICE INTRODUCCIÓN 1 1. BIOLOGÍA DE LA TENCA 2 2. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICAY CULTIVO 4 3. ICTIOGENÉTICA PROBLEMÁTICA ACTUAL 5 3. 1. Conservaciónde la variabilidadgenética 7 3.2. Identificacióny preservaciónde “stocks 9 4. ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA 11 4. 1 Caracteresmorfológicos ti 4.2. Caracterescitogenéticos 12 4.3. Caracteresbioquímicos 13 4.4. Caracteresmoleculares 15 a) Polimorfismosparafragmentosde restriccción(RFLPs) 1 5 b) Reacciónen cadenade la polimerasa 16 OBJETIVOS 20 MATERIAL Y METODOS 22 1 MATERIAL 23 II MErODOS .. . . . . . . .. 28 1. MÉTODOS PARA EL ESTUDIODE CARACTERESCITOGENETICOS 28 2 MÉTODOSPARA EL ESTUDIO DE CARACTERESBIOQUÍMICOS 29 2. 1. Preparaciónde los extractostisulares 29 2.2. Electroforesis .. 29 2.3. Sistemasenzimáticos 30 3. METODOSPARA EL ESTUDIODE CARACTERESMOLECULARES 32 3.1. Aislamientodel ADN genómico 32 3.2. Amplificación del ADN genómico 32 3.2.1. Amplificación medianteoligonucleótidosde secuenciaal azar 33 3.2.2. Amplificación medianteparejasde oligonucleótidosde secuencias específicas(PCR) 35 3.3. Electroforesis 36 4. ANALISIS ESTADÍSTICO . 37 vi 4.1. Estimade las frecuenciasgénicasy genotipicas.Ligamientoal sexo 37 4.2. Estimade la variabilidadgenéticaintrapoblacional:índicede polimorfismoy heterocigosidadgénicamedia 37 4.3. Estimade la variabilidadgenéticainterpoblacional:Identidad y distanciagenética 38 RESULTADOS 40 1 ANÁLISIS DE CARACTERESCITOGENÉTICOS 41 LI. Cariotipo . 41 1.2. Patrónde bandeoC 46 .3. Regionesorganizadorasnucleolares 48 1.4. Tinción con cromomicinaA3 50 2. ANÁLISIS DE CARACTERESBIOQUíMICOS 52 2.1. INTERPRETACIÓNDELOSPATRONESELECTROFORETICOS 52 2.1.1. Enzimasmonoméricas 52 2. 1 . 1 . 1. Aconitasa(ACO), 3-hidroxibutiratodeshidrogenasa (HBDH) y fosfoglucomutasa(PGM) 52 2 1 1 2. Esterasas(EST) 55 2. 1.1.3. Peroxidasas(PER).. 60 2.1.2. Enzimasdiméricas . . 61 2.1.2.1,Aspartatoamino transferasa(AAT) 61 2.1.2.2.Fosfatasasácidas 62 2 1 2 3. Alcohol deshidrogenasa 64 2. 1,2.4. Isocitratodeshidrogenasa 65 2.1.2.5,a-Glicerofosfatodeshidrogenasa(ct-GPDH) y 6-fosfogluconatodeshidrogenasa(PGD) 67 2.1.2.6. Superóxidodismutasa(SOD) 68 2.1.2.7 Fosfoglucosaisomerasa(POI) 69 2.1.2.8Málico deshidrogenasa(MDH) 71 2.1.3. Enzimastetramerícas 73 2. 1.3.1. Lácticodeshidrogenasa 73 2.1.3.2. Enzimamálica 75 vii 2.2. ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD ISOENZIMATICA INTRA E INTERPOBLACIONAL 77 2,2.1. Distribuciónde frecuenciasgenotípicasy génicas 77 2.2.2. Análisis de ligamientoal sexo 80 2.2.3 Estimade la variabilidadgenéticaintrapoblacional 80 2.2.3,1. Indicede loci polimórficos 81 2.2.3.1Heterocigosidadgénicamedia 82 2.2.4. Estimade la variabilidadgenéticainterpoblacional: I)istanciasgenéticas.Dendrogramas 83 3. ANALISIS DE CARACTERESMOLECULARES 86 3.1. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO 86 3.2. PATRONESELECTROFORETICOS 86 3.2.1. Productosde amplificaciónporR.APDs 86 3.2,2. Productosde amplificaciónporPCR 88 3,3. ESTIMA DE LA VARIABILIDAD GENETICAMOLECULAR INTRA E INTERPOBLACIONAL 88 3.3.1. Frecuenciade la ausenciade las bandas 88 3.3.2. Análisis de ligamientoal sexo 90 3.3.2. Cuantificaciónde la variabilidadgenéticaintrapoblacional: indice de polimorfismo 91 3.3.3. Estimade la variabilidadgenéticainterpoblacional: Distanciagenéticay árbolesfilogenéticos.... 92 4. ANALISIS CONJUNTODE LOS CARACTERES BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES 94 Dl SCUSIÓN 96 1 CARACTERIZACIÓN CITOGENETICA 97 1 1 Cariotipo 97 1 2 BandeoC. Tinción Argéntica.Tinción con cromomicinaA3 98 1.3. Regionesorganizadorasnucleolares 100 1.4. Cromosomassexuales 102 2. CARACTERIZACIÓN BJOQUIMICA . . 103 3. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR 106 viii 4. ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA... 108 4.1. Variabilidadgenéticaintrapoblacional:indice de polimorfismo, Heterocigosidadgénicamedia 108 4.1 Identificaciónde poblaciones 112 4.3. Variabilidadgenéticainterpobiacional: Distanciasgenéticas.Dendrogramas 113 RESUMEN 116 CONCLUSIONES 119 BIBLIOGRAFÍA 122 ix INDICE DE FIGURAS Figura 1. .. 2 Figura2 3 Figura 3 18 Figura 4 23 Figura 5 24 Figura 6 25 Figura 7 34 Figura 8 36 Figura 9 41 Figura 10 42 Figura 11 47 Figura 12 49 Figura 13 51 Figura 14 53 Figura 15 55 Figura 16 56 Figura ¡7 60 Figura 18 61 Figura 19 63 Figura20 .. 64 Figura 21 66 Figura22 67 Figura23 69 Figura 24 70 Figura25 72 Figura26 74 Figura27 75 Figura 28 85 Figura 29 87 Figura 30 87 Figura31 89 Figura32 89 Figura33 93 Figura 34 95 x ÍNDICE DE TABLAS TaMal . 26 Tabla2 31 Tabla 3 33 Tabla4 34 TablaS 35 Tabla 6 44 Tabla 7 45 ‘fabla 8 46 Tabla 9 49 Tabla 10 76 Tabla II 79 Tabla 12 80 Tabla ¡3 81 Tabla 14 82 Tabla 15 84 Tabla 16 .85 Tabla 17 .88 Tabla 18 92 xl INTRODUCCIÓN El crecimientode los alevineseslento: el primeraño su pesoestácomprendidoentre5 y lO g; el segundoentre50 y 100 g y el terceroentre250 y 300 g, alcanzandola madurez sexuala partir del tercerverano.Las hembrasponenentre150.000-200.000huevos/Kgde animal, en una puestafraccionadaque sueleser fecundadapor más de un macho, Esta especierequiereelevadastemperaturasparasu reproducción(20 0C mínimo), por lo que la épocade la frezatienelugaren Españaa partir de Mayo o Junio (Huet, 1983). 2. DISTRIBUCIÓN GEOGRAFíCA Y CULTIVO Segúnindican Lucowicz y Proske(1979>, la tencaestáampliamentedistribuidapor Europay SiberiaOccidental,Además,ha sido introducidaen Africa, Australia, Surestede Asia y Norteamérica,donde parece estar adaptandosebien a las nuevas condiciones ambientales. Estaespecieesfrecuenteen lagosy charcasdel centroy surde España,encontrándose en diversaslocalidadesde las Comunidadesde Extremadura,Castilla-La Mancha,Castilla- I.~eón, Aragón,Navarrae incluso,Cataluña. El interéseconómicode la tenca como especiede consumohumanoha aumentado progresivamenteen las últimas décadas,si bien su cultivo intensivo sólo se realiza en determinadospaises centroeuropeos.En nuestro país, esta especieestá cobrando gran importanciaen las Comunidadesantesmencionadas.Por otra parte, el cultivo extensivode tenca,practicadotradicionalmenteen charcasy lagunas,se ha incrementadocon otro tipo de cultivos más racionales e intensivos en los que hay un control de la alimentación, reproducción,etc. (Campoet a],, 1991). 4 3. ICTIOGENÉTICA: PROBLEMÁTICA ACTUAL El abusivo aprovechamientode los recursosnaturalespesqueros,la contaminación,las alteracionesde los sistemasfluviales, etc.; están dando lugar a que muchas especies desaparezcano presentenunadrásticareducciónde su diversidadgenética. Esteabusivoaprovechamientode los recursospesquerosnaturales,junto con el gran crecimientode la poblaciónmundial y la escasezde alimentosbaratosy ricos en proteinas, ha sido la causade un gran desarrollode la acuiculturaen las últimas décadas(Claver, 1983). Hastaahora,los esfuerzosde mejoraen acuiculturasehancentradoen aspectosfisicos de los cultivos, talescomo la construcciónde tanques,alimentación,temperaturay salinidad óptimas,disponibilidadde oxígeno,corrientesde agua,etc. Sin embargo,en la actualidad,la atenciónsecentraen aspectosbiológicosfundamentalesqueposibilitenuna posteriormejora del cultivo, basadaen aspectosgenéticosdel mismo. El conocerlas basescromosómicasde la determinaciónsexual, la variabilidad bioquímica, etc., puedecontribuir a determinarlas posibilidadesde mejorade los cultivos (Wilkins, 1981;Pérez,1987). La FAO. (1984)elaboróun informe en el cual señalóla necesidadde conservarlos recursosgenéticosde los peces,especialmenteen lo relativo a la “sobreexplotaciónde las poblacionesnaturales,a los efectosde las alteracionesa gran escalade los sistemasfluviales y a la domesticaciónde las especiesa travésde la acuicultura”. Estosrecursosgenéticos,cuya basees la variabilidadgenética,segeneranen primera instanciapor mutacióny, posteriormente,son transformadospor distintos fenómenostales comola selecciónnatural,migración,derivagenética,endogamia,etc. La aplicación de la Genéticaa la producciónde organismosacuáticoscultivables puedeoriginar un progresosimilar al obtenidoen mamíferosy avesdomésticos.Dado que los organismosacuáticosestántodavía sin domesticary que se sabe relativamentepoco sobresu constitucióngenéticabásica,seesperaque los estudiosgenéticoscíue se realicen 5 den óptimosrendimientoscuandolos resultadosobtenidosse apliquena la mejorade peces (Pérez, l.cj. Dentro de esteenfoque,un primer paso seria la determinacióndel nivel de variabilidadgenéticapresenteen laspoblacionesnaturales(Wilkins, 1981). La adaptaciónde las poblacionesnaturalesal medio ambienteen que viven se deriva de una combinaciónde muchoscaracteresheredables,que seha desarrolladodurantemucho tiempo a travésde un conjunto complejo de procesosselectivosnaturales.La variabilidad genéticaque existe entre y dentro de las poblacionesconstituye la fUente genéticaque capacitaa las especiesa sobrevivir y adaptarsea los cambiosambientales(Phillip et al., 1986). La importanciade la variabilidadgenéticase detectaen muchassituacionescomo, por ejemplo, es el hechode que poblacionescon un alto grado de variabilidad genética tengan mayor capacidadde respuestaa las variacionesambientalestales como cambios térmicos,osmóticos,o bien agentespatógenos(Allendorf y Leary, 1986). Ciertostrabajos muestranla especificidadadaptativade las poblacionespiscícolas(Raleigh, 1971; Raleighy Chapman, 1971; lhsseny Tait, 1974). En ellos se llega a la conclusiónde que, en los programasde producciónque buscanla mayor productividadde las pisicifactorias,se debe teneren cuentala procedenciade la poblacióny las característicasdel aguade dondeseva a tomardichapoblación(Phillip et al., 1986). Además,la introducciónen aguasnaturalesde razasgenéticasde pecesno adaptadosa ese ambiente,podría ser una amenazagenéticairreversible para las poblacionesnaturales propiasde dichasaguas(Phillip et al., l.c.). Por lo tanto, paraconseguiruna mejorproducciónpiscícolay defenderel patrimonio natural, hay dos problemasbásicos: uno de ellos es conservarla variabilidad genética existenteen las poblacionesnaturalesy el otro, conocer la estructurade las diferentes poblacionesparaasí determinarlos “stocks” que interesaexplotary preservar,definiendo “stock” como ‘grupo intraespecíficode individuos que se apareanal azar, con integridad espacialy temporal” (Ihssenet al., 1981). 6 3.1 Conservaciónde la variabilidad genética La conservaciónde las poblacionespiscicolas,tanto de las amenazadaspor el peligro de extincióncomode las queno lo están,deberíasercompatiblecon los siguientesobjetivos de preservación(SouLé, 1980): 1,-Mantenerla poblaciónviable a cortoplazo(esdecir, evitar su extinción). 2,-Conservarla capacidadde los pecesparaadaptarsea los posiblescambios ambientalesy en consecuenciapoderevolucionar. Evitar la extinción es, lógicamente,el objetivo primario, pero esto no es suficiente. Losprogramasde conservacióndebenbuscarel mantenimientode la capacidadde los peces paraadaptarsea los cambiosambientales(últimamentemás frecuentesdebido a la acción humana).El problemacentral de la conservacióngenéticaesque la pérdidade la variación genéticapuedellevar aparejadaunadisminuciónde la flexibilidad evolutiva(Meife, 1986). El cultivo de pecespuedejugarun papelimportanteen la conservacióny rehabilitación de las poblacionespiscicolasen explotacióno en peligro de extinción (Gile y Ferguson, 1990). Paraunacorrectaconservaciónde estaspoblaciones,los programasestablecidospara conseguirlodebentenercomo objetivo prioritario la preservaciónde la variación genética (Frankely Soulé, 1981; N4efl’e, 1986; Allendorf y Ryman, 1987; Nelsony Soulé, 1987), sin olvidar que cuandose habla de la protecciónde las característicasgenéticasasociadas,se hacereferenciaa los genesespecíficos,a las combinacionesgénicasy a los conjuntosde poblacionesgenéticamentediferenciadas(Altukhov, 1981;Frankel, 1983). Por otro lado, el cultivo de pecespuedeserunaamenazaparala preservaciónde esta variacióngenéticasi no serealizaun control adecuadode los mismos.De hecho,una crítica queactualmentesehacea la gestiónquerealizanlos piscicultoreses la pérdidadel sustrato necesariopara la innovación de cultivos de pecesy de programasde determinacióno constituciónde “stocks” (Phillip et al., 1986). Tanto la FAO. (1984)comonumerososautores(Meife, 1986;Davidsonet al., 1989) señalanque la pérdidade variación genéticapor cualquiercausa (selecciónprolongada, endogamia,etc.) daríalugar a la pérdidade la capacidadde adaptaciónde la población,así como de su riquezapotencialparaobtenerunamejorexplotaciónde susrecursosa travésde la selecciónartificial. La variación genéticaestimadapor heterocigosidadpara genesenziniáticosse ha correlacionadoen algunostrabajoscon ciertoscomponentesde la eficaciabiológica (Mitton y Grant, 1984; Allendorf y Leary, 1986; Zouros y Foltz, 1987). La baja heterocigosidad enzimáticaha sido asociadaa efectosdeletéreosen piscifactorías(Leary et al,, 1985). Además, ciertos estudiosde consanguinidaden pecesparecenindicar que la pérdida de variabilidad genéticapuede estar asociadaa una disminución de la supervivencia,del crecimiento,de la eficaciaen la conversiondel alimentoy a un aumentoen las desviaciones morfológicas(Kincaid, 1983; Learyet al., 1985). Recientemente,algunos autores han señalado el efecto de la reducción de la variabilidad genéticaen poblacionescriadasde mamíferos(Ralís y Ballou, 1983; O’Brien et al. 1985) y peces(Allendorf y Phelps, 1980; Ryman y Stabl, 1980; Crossy King, 1983; Leary el al., 1985). U no de los factoresmás importantesque influyen en la cantidadde variabilidad genéticay en la estabilidadde las frecuenciasgenotipicasen las poblaciones cultivadas es el tamaño efectivo de la población. Poblacionescon tamaños efectivos pequeñospresentan,normalmente, una elevadatasa de consanguinidad.Esta tasa iría asociadaauna mayor manifestaciónde los efectosde los genesdeletéreos(Gile y Ferguson, 1990). El mantenerun tamaño efectivo adecuadoes uno de los principales problemas genéticoscon los que se encuentrala acuiculturaya que, normalmente,dada la elevada capacidadreproductivade los peces, seutiliza un bajo número de reproductores(Gile y Ferguson,l.c.). 8 Todo lo mencionadoanteriormenteapoya a Winans (1989), quien señalaque es importantesaber la cantidadde variación genéticapresenteen las poblacionespiscícolas parapoderdiseñarun apropiadoprogramade conservacióny producciónpiscícola. 3.2 Identificacióny ureservaciónde “stocks ” Durantela última décadasehanrealizadoun gran númerode trabajoscon marcadores genéticos para poder estimar a partir de ellos las relacionesgenéticasexistentesentre diferentesgrupos de peces: poblaciones,subespecies,especies,etc. El interésde estos trabajos se centra en la identificación de “stocks”, entendidos éstos como grupos intraespecificoscon característicasgenéticascomunes,y en la constitucióndeotrosnuevosa partir de poblacionesnaturalesy cultivadas(Hallermanny Beckmann,1988; Kapuscinskiy Philipp, 1988). Paralos empresariosdel campode la acuiculturaesvital determinarsi los “stocks” que estánsiendoexplotadosen una piscifactoríason tales, o si, por e] contrario, comprenden miembrosde másde una poblacióngenéticamentediferenciada(Larkin, 1 972; Mc. Lean y Evans,1981, (iranÍ y Utter, 1984). Esto es especialmenteproblemáticosi las poblacionesdifieren en característicastales como crecimientoy maduración, ya que los sistemasde cultivo de estaspoblacionesde pecesseestablecenen funciónde suscaracterísticasvitales(Crozier, 1987). Es tan importante el mantenimiento de la cantidad de variabilidad genética intrapoblacional como de la diversidad genética interpoblacional, la cual se ve frecuentementeamenazadacomo consecuenciade unagestiónde protecciónerrónea. En numerosos casos, la protección de las especies piscícolas consiste en la propagaciónartificial de las mismas,seguidade una liberación masivade alevinesen las aguas naturales La destrucción de las zonas de desove,causadaprincipalmentepor la construccionde plantashidroeléctricas,la contaminacióny la pescamasiva, han obligado a desarrollarprogramasde cria cuyo objetivo esminimizar el peligroo la amenazaecológicay 9 económicaoriginada por la drástica reducción numérica o completa erradicación de poblacionespiscícolas.Esto hacenecesarioproyectarprogramasde liberaciónde alevinesde piscifactorías,pero con un controladecuadode los mismos (Moav et al., 1978) Frecuentemente,un “stock” cultivado es el único remanenteque existe de una poblacióncuyasbasesecológicasparala supervivenciahansido amenazadas.En estoscasos, una piscifactoríafuncionacomo un banco de genes,conservandoy multiplicandorecursos biológicos únicos. Esto es de fUndamentalimportanciaparapreveniren los programasde mejorael peligro inadvertidodela pérdidade acervosgenéticos(Rymany Stahl, 1981>. Al pasarde la reproducciónnatural a la propagaciónartificial existee] Jiesgo de que aparezcanciertoscambiosgenéticos,ya que las presionesde selecciónno sonlas mismasen el medio natural queen el ambientealtamenteprotegidode la piscifactoria. Además,la gran capacidadreproductivade muchospeces,quepotencialmenteproducenun gran númerode descendientespor parental,puededar lugar a que se produzcaun cierto deterioro como consecuenciade la existenciade consanguinidad(Rymany Stahl, j.c.). Por otra parte, el continuo establecimientode “stocks” de cultivo a partir de poblacionesnaturalesy cultivadas,dalugar, en muchoscasos,a “stocks” bastantediferentes de las poblacionesoriginales. En consecuencia,la resiembrade estaspoblacionescultivadas en áreasde reproducciónnatural;por ejemplo,parapescarecreativa,afectaa la diversidad genéticade las poblacionesnativas(Bergy Galí, 1988) Estos problemashan sido reconocidosy discutidospor varios autorescomo Ryman (1970), Kincaid (1976a,b) y Allendorfy Utter (1979). Sin embargo,sehan aportadopocos datosque describanel gradode diferenciacióngenéticaen la mayoríade las poblacionesde peces(Reisenbichlery Phelps, 1989) o entre poblacionescultivadasy naturales(Rymany Stahl, 198?). Berg y CalI (1988) señalanque en la situaciónactual “es prioritario obtener unaapreciaciónde la distribución de la variabilidadgenéticadentroy entrepoblacionespara 1 ci aseguraruna conservaciónefectiva,una productividadcontinuaday unafUtura diversidadde la acuicultura” 4. ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA Un primer pasoen la investigacióna nivel genéticode las especiespiscícolases la detección de la variabilidad genética existente en las diferentes poblaciones y su cuantificación. La conservaciónde la variabilidadgenéticapuederealizarsecon éxito si se partedel conocimiento de la estructuragenéticade las especiesen cuestión(Allendorf y Phelps, 1981). Igualmente, el conocimientodel patrón de distribución de la variabilidad genética entre las diferentespoblacionesde una especiepuedepermitir una correctagestiónde las poblacionesde cultivo. Por ello, a lo largo de las últimas décadassehan probadodistintos métodosparaanalizary cuantificardichavariabilidadgenética. Una correctaevaluaciónde la variabilidadgenéticaexistenteen las poblacionesdebe reunir las siguientespremisas(Lewontin, 1974): -El número de individuos estudiadosdebe ser suficiente y representativode la poblaciónnaturalde la queprocedan. -El número de marcadoresgenéticosanalizadosdebe ser lo suficientementegrande como paraconstituir unamuestrarepresentativadel genoma. El análisis de la variación genéticapuede realizarsea través de caracteresmuy diferentescomo son los morfológicos,citogenéticos,bioquímicosy moleculares. 4.1 Caracteresmorfológicos Los intentos tradicionales de estimar la variabilidad genética y de discriminar poblacioneshan estado basadosen el análisis comparativo de caracteresmerísticosy morfométricos(Crozier, 1987). 11 Estoscaracteresson de fácil medicióny análisis. Sin embargo,los gruposdelimitados por talesmétodospuedenno representarunidadespoblacionales,ya que se desconocenlas basesgenéticas de los caracteresmorfológicos (Grant y Utter, 1 980). Además, una considerableporción de la variabilidad encontradaen los caracteresmorfológicos está determinadapor factoresno genéticosy estoconlíeva,en muchoscasos,a sobreestimarla varianzagenética,al incluir en la estimaun valor de la variaciónexclusivamenteatribuibleal ambiente(Falconer,1960). Por todo ello, la valoraciónde las relacionesevolutivasy la estimaciónde la cantidady distribuciónde la variacióngenéticade las poblacionesno se puedebasarsólo en el análisis de caracteresfenotípicostalescomo: tamañocorporal,coloración,númerode vértebras,etc. (Rymany Stahl, 1981). En muchos casos,los estudios morfológicos han ayudadoa explicar la diversidad intraespecifica(Svárdson,1979),pero la mayoría de los análisisde variaciónfenotípicahan sido, estadisticamentehablando,inadecuados.Estafalta dedatosrealesha llevadoa errar,a menudo,en la identificaciónde poblaciones,subespecies,etc., y a sobreenfatizarel control genéticode caracteresmorfológicosque estáninfluidos por el ambiente(Rymany Stahl, 1981). Por lo tanto, como señalanMessiahy Tibbo (1971), para poder diferenciar con seguridadunidadespoblacionalesintraespecíficasse requiere una demostracióna nivel genético. 4.2 Caracterescitogemiéticos Existen pocos estudios cariotipicos poblacionales cuyo objetivo sea estimar la variabilidad genética,a estenivel, entrepoblacionesde especiespiscícolas.La mayoriade los estudioscitogenéticosse han centradoen la posibleexistenciade polimorfismos intra e interindividuales,sobretodo en lo referenteal númerode cromosomasy númerode brazos cromosómicos, buscando un posible origen tetraploide y su posterior proceso de 12 diploidización(fenómenofrecuenteen salmónidosy ciprinidos) (Zenzesy Voiculescu,1975; Hartleyy Horne, 1984, Martínez et al., 1991). Hasta la fecha hay muy pocos estudios acercade las diferenciascariotípicasentre formasecológicasy geográficas,quizásprincipalmentedebidoa quelos cariotiposobtenidos y los tamañosmuestralesde estosestudiosno permitíanun análisisprecisode la variación encontrada(Martínezet al., 1991). Aun así, sehan detectadopolimorfismoscromosómicos importantesen poblacionesde salmónidos(Hartleyy Horne, 1984;Hartley, 1987)y gobios (‘Ehode cÉ al., 1985a, Giles et al., 1985) que señalanla posible utilidad de los estudios citogenéticosen la diferenciaciónde poblacionesy morfos. El heteromorfismointra e interespecíficoparalas regionesorganizadora.snucleolares (NORs)ha sido documentadoenvarios gruposde peces.La mayoríade estasvariacionesse refierenal númeroabsolutode NORsporgenoma, a su localizacióncromosómica,tamaño relativo y númerode NORs activosporcélula(GoId, 1984; Amemiyay GoId, 1988, 1990a, b). Estos autores han puesto de manifiesto la utilidad de esta región cromosómicaen estudiostaxonómicos. 4.3 Caracteresbioquímicos Unaherramientapoderosaen los estudiosde identificaciónpoblacionalesel análisisde la variación genéticabasadoen el estudio de isoenzimaso proteínaspor electroforesís (Ferguson, 1989). Los datos electroforéticospermiten realizar estimas detalladasde variabilidad genéticaintra e interpoblacional, asi como calcular indices de similaridad genética(Wright, 1969; Nei, 1972). Según Market y Móller (1959), las “isoenzimas” son distintasformasmolecularesde una misma enzima, que presentanespecificidadporel mismo sustratoy seobservanen el mismoindividuo, En general, las enzimas y proteínasson productosde genes individuales, aunque algunasseanel resultadode polipéptidoscodificadospordos o másgenes.El hechode que ‘3 la información genéticacodificada en una secuenciade nucleótidos(gen estructural)se traduzca a la secuencia de aminoácidos que constituye la cadena polipeptídica correspondiente,implica que la variación en la secuenciade aminoácidosde una proteína conlíevaunavariaciónalélicaen el geno los genesquecodificanparaella. La técnicade electroforesispermitedetectardistintasisoenzimasy portanto, variantes alélicasdel mismo locus o de diferentesloci. No todas las variantesaléjicasson detectadas por electroforesis.Generalmente,sólo las sustitucionesque alteren la carga neta de la proteínacambiaránsu movilidad electroforética.Si se considerala flexibilidad del código genéticoy las propiedadeseléctricasde los aminoácidosse calculaque sólo un tercio de todoslos cambiosaminoacídicossondetectablesporelectroforesis(Lewontin, 1974). A pesardel inconvenientede no detectarsetodaslas variantesisoenzimáticasporesta técnica, las isoenzimaspresentannotablesventajaspara estudiarla variabilidad genética, comopuedenser: -La expresiónde los alelos que las controlan sueleser codominantey sin efectos epistáticos.Como excepciónpodemoscitar el que algunos cambios en el ADN llevan consigola supresióno interrupciónde la transcripcióno traducciónde modo que ocasionan la apariciónde un alelo nulo o amorfo (recesivo)no detectableen heterocigosis. - La expresiónde los alelos no está, en general, sujeta a variacionesdebidasal ambiente. -La movilidad electroforéticade las proteinasenzimáticasesun fenómenorepetitivo queproporcionadiferenciasclarasy discretasentregenotipos. La variaciónproteica,al estarlibre de efectosambientales,ha aportadounagranayuda a la determinaciónde la estructurapoblacionalen muchasespeciesde pecestalescomo el salmónatlántico, d~a iv (Stahl, 1983), arenqueatlántico, ¿~a k~ (Kornfield et al., 1982), bacalao, 144 tft14jÁJ. (Cross y Payne, 1978) y merluza europea, (Manglayy Jamieson,1979). 14 A pesar de ser técnicasque proporcionandatosparacaracterizargenéticamentelas poblacionesde la misma especie,se hallan limitadas al número de tincioneshistoquimicas conocidas. Además, el análisis con marcadores enzimáticos no detecta aquellas modificacionesnucleotídicasproducidasen regionesno codificadorasdel genoma. 4.4 Caracteres moleculares Varios motivos avalan que el nivel de estudio ideal para cuantificar la variación genéticaseala moléculade ADN (Bartletty Davidson,1991): - El ADN esel mismo en todoslos tipos celularesde un organismomientrasque, por ejemplo,las proteínaspuedenpresentarvariacióntisular. - El ADN esconsiderablementeestabley la cantidadde informaciónaportableparael análisisdecrecedel nivel de ADN al de proteínas. - En el A[)N es dondeseproducela auténticavariacióngenética. En la última década,el desarrollo de técnicaspara la manipulación de fragmentos específicosde ADN ha permitido el descubrimentode un gran número de marcadores, virtualmenteilimitados, basadosen los polimorfismosparasecuenciaso fragmentosde ADN (Hallermany Bekcmann,1988),con la ventajaadicionalde estudiardirectamenteel material hereditarioy no unamanifestaciónfenotipicadel mismo. Dentrodeestastécnicaspodríamos señalar el análisis de polimorfismos para las longitudes de fragmentos de restricción (RFLPs>, bien de ADN genóniico o de ADN mitocondria), y otra técnicade reciente apariciónllamadaPCR(reacciónencadenade la polimerasa). a) Polimorfismosparafragmentosde restricción(RFLPs) El análisis de variabilidad genéticaen poblacionesmediantela técnicade análisis de RFLPs es, en la actualidad, uno de los estudiosmás desarrolladospara la estima de la variacióngenéticapoblacional. 15 El análisisde los RFLPsgenómicospresenta,apartede lasventajasya mencionadasde no estarafectadospor factoresambientales,el hechode que virtualmenteesanalizabletodo el genoma,con susregionescodificadorasy no codificadoras. Sin embargo, también presentainconvenientes,como es lo largo y costoso del proceso, ya que aparte de la extracción del ADN, éste tiene que ser digerido con endonucleasasde restricción,separadoen gelesde agarosa,desnaturalizado,transferidoa membranasy posteriormentehibridadocon sondasradiactivas.Por otro lado, la cantidadde genes donadospara ser utilizados como sondasde hibridación, de momento, es muy limitada en todaslas especiesy másaunen las piscícolas(Hallermany Beckman,1988) El estudiode RFLPs en el ADN mitocondrial (ADNmt) constituye actualmentela técnicaprincipal paraanalizarrelacionesfilogenéticasen variosgruposde peces(Lansmanet al., 1981; Avise y Lansman,1983)debidoa que la rápidatasade evolución de estetipo de ADN permitedetectarfácilmentediferenciasentregruposfilogenéticamentemuy próximos, o incluso entre poblacionesde una especie. Además, esta molécula presentaherencia materna(no existe recombinación)y, aparentemente,la mayoría de los cambios que se producenen la moléculason evolutivamenteneutros(Bematchezy Dodson, 1990). Entre los inconvenientesde estatécnicapodemoscitar el dificil aislamientodel ADN mitocondrial asícomo,en algunoscasos,el requerimientode ejemplaresde un tamañosuperiora aquellos cuya capturaesposible. b) Reacciónen cadenade la polimerasa La técnicade la reacciónen cadenade la polimerasa(PCR) constituyeun importante pasoen Biología Molecular (Mullís et al., 1986). Esta técnica, basadaen la síntesis enzimáticade secuenciasde ADN comprendidasentre unosoligonucleótidosque actúan como cebadores,permiteamplificarel númerode copiasde dichassecuenciashastaun nivel visualizableen electroforesis,sin necesidaddel empleo de marcadoresradiactivos. Es un procesosimple en el queel ADN genómicosedesnaturaliza(90-950C) y seuneaun parde 16 oligonucleótidos especificos (renaturalización)que suministran extremos 3’•-OH a una polimerasatermoestablecapaz de replicar el segmentode ADN comprendidoentre las secuenciasdianade los oligonucleátidos.(Saiki, 1989) (Fig. 3). Estatécnicaha abiertonuevasperspectivasen los estudiospoblacionalespuespermite amplificar genes, tanto nucleares como mitocondriales, y facilitar así su posterior comparacióny secuenciación(Kochery White, 1989). Un inconvenientede la técnicaes,al igual queen el casode RFLPsgenómicos,el que hay un bajo númerode genessecuenciadosque permitandiseñaroligonucleótidosutilizables comocebadoresparaamplificar dichassecuencias. Esteproblemaha sido solventadoparcialmenteporWilliams et al. (1990), quieneshan introducidouna variaciónen la técnicaconsistenteen la amplificacióndel ADN genómicoa partir de oligonucleótidosde secuenciaarbitrariaque permitenamplificar regionesde ADN al azar. Por ello, a estatécnicamodificadase le denominaRAPDs (Random Amplified PolymorphicDNA). Fin estaúltima técnica,el hechode que los cebadoresutilizadosseancortosy que las condicionesde anillamiento seanrelajadas(Williams et al., l.c.) permitela amplificación de un mayor número de segmentosde ADN y, por tanto, la probabilidad de detectar polimorfismosgenéticosaumentaconsiderablemente. La técnicade la PCR, independientementedel tipo de oligonucleótidocebadorque se emplee,permiteademásestudiarun gran númerode individuos en poco tiempo, reduciendo considerablementecon respectoa los RiFLPs la complejidady el costedel proceso. Sin embargo,presentael inconvenientede que los fragmentosamplificadosse comportancomo dominantes. 17 5. 4 1. Desnatunlizacián 3 “““‘T1—”1—~’r—’ 5. 3. 5. 3. 4 2 Amllamie jito 3. 4 3. Polinerizari6n 3’ 5’ 4áó444 .1.1 1 .1.1.1.1. II 1~11.1~ 5’ 5. 3. 5. 3. 5. 3. 4 1. Desnatunlizaciám 3’ .. 5’ 5’ •••••• IJlWLL*J3.J~..I..l.... 4 2.Aniflamiento 3. 5. 5’ 6é6á4á~ 3 999999 5’5’ 3. y , oooooo 5a’ 6óÉ4áá ~ 3•999999 5~ 5•IIhIh,Ihh’I’’,’h’,’’’, ’ 4 3.Polimerizaciñn 1.. LI 1, [3 ‘‘1 i 999999 AnNuolde ADN desnniralin¡loOligonucleátidos uiddos al AUN molde AUN i~olniterizado AUN molde ADN nuevasíntesis AUN nuevasíntesis AUN molde Oligonurfrálidos unidos alAflNmolde y AUN nuevasíntesis ADNpolimerizada 1 “u” ciclossucesivos de lospasas1,2yS AUN molde AUNpolimerizada Oligornwleátido 1 Oligomueleótido U Figura 3: Representaciónesquemáticadel procesode amplificaciónde un fra~enLode ADN. 18 A pesarde todo lo dicho anteriormenterespectoa la importanciadel estudiode la variabilidad genéticaexistenteen las poblacionespiscícolasy de su conservación,apenasse dispone de datos genéticosreferentesa la tenca, los cuales estánademásrestringidos exclusivamenteal nivel citogenético(Hafez et al., 1 978a,b;1-lafez et al., 1979; Mayr et al., 1986). Dadoel augeactualdel cultivo de la tenca en Españay el desconocimientoabsoluto que setiene acercade la estructuragenéticade las poblacionesespañolas,consideramosla necesidadde iniciar un estudio genéticode las poblacionesautóctonasde tencaa nivel citogenético,bioquímicoy molecular. 19 OBJETIVOS Los objetivospropuestosen estetrabajoson: - Estudio de la variabilidad genéticaexistenteen varias poblacionesespañolasde tenca a nivel: a) Citogenético: Obtencióndel cariotipo. Análisis de los patronesde bandeoC y fluorescenciacon cromomicinaA3 y de las regionesorganizadorasnucleolares(NORs). b) Bioquímico: Estudio del control genético, estructuracuaternariay especificidad tisular de variossistemasenzimáticos. c) Molecular: A nivel de ADN, mediantetécnicasde amplificaciónpor la reacciónen cadenade la polimerasa(PCR),empleandocebadoresespecíficos(PCR propiamentedicha) y oligonucleótidosde secuenciaal azar(RAPDs). 2.- Estima de las distanciasgenéticasentre las diferentespoblacionesestudiadasy establecimientode sus correspondientesdendrogramasa partir de los datosobtenidoscon los marcadoresbioquímicosy moleculares, 21 MATERIAL Y MÉTODOS 1] MATERIAL Los pecesanalizados en estetrabajo Rieron recolectadosen siete poblacionesde tenca, cuyalocalizacióngeográficaaparecerepresentadaen la Figura 4: - “Embalsede Ci.truénigo” (NC) (Navarra). - Charca de “Las BárdenasReales” (NB) (Navarra) - “Laguna deJCrisie” (CR) (Salamanca)(Fig. 5). - Charcade ‘Oropesa” (ORO)(Toledo). - Charcade “La Generala’(GRL) (Cáceres). - Piscifactoría Vega del Guadiana”(VG) (Badajoz). - Charcasdel Centrq de InvestigacionesAgropecuarias“Dehesón del Encinar” (DEH) (Toledo) (Fig 5). Figura 4 Localizacióngeográficade las diferentespoblacionesmuestreadas. • La I~w*’ flni~ * Sn*.k. 4. CIt.sóaIr La LAgs.~.4.I Cd.’. A e o’—... La B.nIt u Ver SI •S.SI.S 23 En la Tabla 1 aparecenlas diferentespoblacionesanalizadasjunto con la fecha de captura y el número de individuos estudiados por población para los caracteres citogenéticos,bioquimicosy moleculares. Los individuos analizadosa nivel bioquímico son los mismos que los empleadospara los estudiosmoleculares.Los estudioscitogenéticosse realizaron con otros pecesque frieron mantenidosvivos en acuarioshastael momentode seranalizados. Tabla l~ Individuos analizadosparael estudiode los diferentescaracteres. Población Fecha de captura Caracteres Citogenéticos Bioquímicos * Moleculares Caracterización enzimas Análisis ooblacional PCR RAPDS NC Agosl.o 1991 15 -- 33 14 32 NB Agosto 991 ¡2 -- 22 -- -- ORO Julio 1989 15 -- 44 14 32 CR Julio 1989 Julio 99! 1 10 -- 107 14 32 —— CRL Noviembre 988 20 -- 170 14 32 VG Noviembre 988 ¡ )ie,embre 199(1 15 It) 21 26 118 —— 14 —— 32 —— DEH Septiembre 1988 Julio 1989 Julio 990 20 5 20 40 —— —— 94 —— —— -- —— —— -- —— —— *Bioquinlicos: Caracterizaciónenzimas:númerode individuos estudiadosparaladeterminacióndelcontrol genéticoy estructuracuaternariadc las enzimas.Análisis poblacional:númerode individuos utilizadoscn los estudios dc poliniorfisnio. NG: “EínbaJsede (iitménigo”. NR: “Las BárdenasReales”.ORO: “Oropesa”, CR: “Laguna del Cristo”, GRL: “La Generala” yO: “Vega del Guadiana”, DEH: “DehesóndelEncinar Las placasmetafásicasmitóticasseobtuvierona partir de riñón. Además,en el casode la poblaciónde Salamancarecogidaen 1989, se obtuvieronplacasmetafásicasmeióticasa partir de las gónadasmasculinas. 26 Parala interpretacióndel control genético,la estructuracuaternariay la especificidad tisular de los diferentessistemasisoenzimáticosestudiados,se han analizadohasta ocho tejidos u órganosdiferentes:ojo, músculo,hígado,riñón, bazo, corazón,cerebroy gónada. Para el análisis de la variabilidad genéticapoblacional sólo se estudiaronel hígadoy el corazón,porser los dosórganosque presentabanactividadparaun mayornúmerode loci. La técnicade la PCR,ya seacon oligonucleótidosde secuenciaal azar(RAPDs) como con cebadoresprocedentesde genesconcretos(PCR), se ha realizadocon AI)N genómico obtenidoa partir de músculodorsal, en cantidadesque oscilanentre0,5 y 3 g de músculo, manteniéndoseestetejido a -80 0C hastael momentode la extraccióndel AiDN. Una vez realizadadichaextracción,el ADN se conservódisueltoa -4 0C y precipitadoa -20 0C. 27 11] MÉTODOS 1. MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE CARACTERES CITOGENÉTICOS Las placasmetafásicasmitóticasy meióticasseobtuvieronapartir de riñón y testiculo respectivamente,segúnel métododescritoporAlvarezet al. (1980). Los individuos,que habíanpermanecidoen acuariosdesdeel momentode su captura, fUeron inyectadosintraperitonealmentecon una soluciónde colchicinaal 0,0075%en una proporción de 1 ,4cc/lOOg de peso del animal, 2 horas antes de la disección, La homogeneizacióndel tejido se realizócon unasoluciónhipotónicade KCI 0,083M. Una vez obtenidas las placas metafásicasmitóticas se realizaron diferentes tratamientos: a) Tinción convencional: Para el estudio del cariotipo se realizó una tinción convencionalcon Giemsaal 10% (Alvarez et al., 1980). Las placasmetafásicasrneióticasse tiñeronde la mismaforma. b) BandeoC: Con el objeto de obtenerel patrónde bandeoC, seaplicó la técnicade tinción paraheterocromatinaconstitutivadescritaporGiráldez y Orellana (1979). c) Tinción con nitrato de plata: Las placasmetafásicasmitóticas frieron teñidascon nitrato de plata segúnel método de Thode et al. (1983a), para caracterizarlas regiones organizadorasnucleolares. d) Tinción con cromomicinaA3: Esta tinción de fluorescenciase realizó segúnla técnicade Schweizer(1 98 1), paracaracterizarregionesricasen paresG-C. Parala determinacióndel númerodiploide de la especiese han contadocomo mínimo diez placasmetafásicaspor individuo (Tabla 1). En el cariotipo, los cromosomasse han clasificadoinicialmenteen fUnción de su morfología y despuésse han ordenadode mayora menor. 28 La morfologiacromosómicaseestableciósegúnla clasificaciónde Levanet al. (1964), por la que los cromosomasse clasifican,atendiendoa los valores resultantesde dividir la longitud del brazolargo por la del corto, en: -Cromosomasmetacéntricos:Aquellos en los que la relaciónentreel brazo largoy el corto no essuperiora 1,7. -Cromosomassubmetacéntricos:Aquelloscuya relaciónestácomprendidaentre 1,7 y 3. -Cromosomasacrocéntricos:Aquellosen los quela relaciónentrebrazosesmayorde 3. Parala determinaciónde la relaciónentrebrazosy las longitudescromosómicasen las diferentes poblaciones, se ha medido la longitud y los brazos de todos los pares cromosómicosen al menos cinco metafasespor individuo y en cinco individuos por población. Las mediaspoblacionalesse han comparadoentre sí por medio de una t de Student. 2. MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE CARACTERES BJOOUIMICOS 2.1. Preparación de los extractos tisulares Los diferentesmaterialesempleadospara el estudio electroforético(ojo, músculo, hígado,riñón, bazo, corazón,cerebroy gónada),son diseccionadosy almacenadosa -80 0C hastael momentoen que seva a realizarla electroforesis.Las muestrasdescongeladasse homogeneizancon la solución tampón Tris-CIH 0, 1 M pH 7 medianteun rotor del tipo Ultraturrax T-25 . El extractoobtenidoseabsorbecon un papel Whatman3MM. 2.2. Electroforesis Parael análisisde los distintos sistemasisoenzimáticosseha empleadola técnicade electroforesishorizontal discontinua a voltaje constante,en geles de almidón al 10% (Piguciraset al., 1985). Se hanutilizado tres sistemastampóndiferentes:Poulik, Histidina y Ridway, cuyacomposiciónse describea continuación: 29 - TampónPoulik (Poulik, 1957): Tampóndel gel: 0,01SM Tris; 0,0035M Ácido Cítrico, pH 7,75. Tampónde los electrodos:0,1M Hidróxido Sódico,0,3M Ácido Bórico, pH 8,6. -TampónHistidina (Brewer y Sing, 1970): Tampóndel gel: 0,OOSM L-Histidina HCI, pH 7,0 con Hidróxido Sódico IN. Tampónde los electrodos:0,135M Tris; 0,043M Acido Cítrico pH 7,0 -Tampón Rídgway (Ridgway et al., 1970): Tampóndel gel: 0,03M Tris; 0,005M Acido Cítrico, pH 8,5. Tampónde los electrodos:0,06MHidróxido de Litio; 0,3M Ácido Bórico, pl-] 8,1. Los gelessepreparancon un 99%del tampónparael gel y un 1% del tampónpara los electrodos. Paralos sistemasPoulik y Ridway, la electroforesisserealizóa un voltajeconstantede 250 V durante3 horas,mientrasque parael sistemaHistidina sehizo a 150 V durante5 horas.La temperaturafue de 4 0C en todoslos casos. 2.3. Sistemasenzimát¡cos Las enzimas analizadasse indican en la Tabla 2, en la que también aparecesu abreviaturay código internacional,así como las referenciascorrespondientesa los sistemas de tinción histoquimicosutilizados, La nomenclaturaenzimáticaseguidaen estetrabajo es la propuestapor Allendorf y Utter (1979), pero basadaen las recomendacionesde Shakleeet al. (1989, 1990a). Una abreviaturaen mayúsculasdesignalas distintasenzimasy, en minúsculas,salvo la primera letra, representael gen o locusque codificaparala proteína.En el casode foímasmúltiples de la misma enzimase añadeun número,de tal forma que ala de menormigración anódica se le asignaun 1, a la siguienteun 2 y así sucesivamente.Las variantesalélicassedesignan de acuerdocon la movilidadelectroforéticarelativa. A un alelo, generalmenteel máscomún, se le denominaarbitrariamente100. En el caso de que la movilidad sea haciael cátodose indica con un signo menos.Estaunidadrepresentala distanciade migraciónde la isoenzima codificadapor estealelo desdeel punto dondese realizó la inserción.Al restode los alelos 30 se les asignaun valor numérico que representasu movilidad relativa con respectoa esta unidadde distancia. Tabla 2 Sistemasisoenzimáticosanalizados. Enzima Abreviatura Código de enzima (E.C.)* Referencia Aconitasa ACO 4.2.1.3 l-larrisy Hopkinson(1977> Fosfatasas ácidas ACPH 3.1.3.2 Sbawy Koen (¡968) Alcohol deshidrogenasa ADH 1,1.1.1 Brewcry Sing (1970) Aspartatoaminotransferasa AAT 2.6.1.1 Selandcretal, (1971) Esterasas EST 3.1.1, Shaw y Kocn (1968) (L-GlicCrofosfato deshidrogenasa a-GPDH 1.1.1.8 Brcwery Sing (¡970) 3-Ilidroxihut¡rato deshídrogenasa HBDH 1.1.1.30 Brewer y Sing (1970) Isocitrato deshidrogenasa IDH 1.1.1.42 BrewerySing (¡970) L-Lactato deshidrogenasa LDH 1.1.1.27 BrewerySing(¡970) Malato deshidrogenasa MOH ¡.1.1.37 Brewcry Sing (1970) Enzima málico ME 1.1.1.40 Brewery Sing(1970) Peroxídasas PER 1.11.1.7 Brewery Sing (1970) 6-Fosfogluconato deshidrogenasa PGD 1.1.1.44 Brcwcry Sing (1970) Fosfoglusoa isomerasa PGI 5,3.1.9 Brewcry Sing(1970) Fosfoglucosa mutasa PGM 5.4.2.2 Erewer y Sing (1970) Superóx¡do dismutasa SOD 1.15.1.1 Brewery Sing (1970) * Los códigosdc enzimassiguenlas recomendacionesdeIUBNC (¡984>. 31 3. MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE CARACTERES MOLECULARES 3.1. Aislamiento del ADN 2enom¡co La obtencióndel ADN genómicoserealizó segúnel métododescritoporDellaportaet al, (1983)con modificaciones. El tejido muscularse homogeneizaen tampónde extracción(Tris-CIH 1 OOmM, pH 8; EDTA SOmM, pH 8 y NaCí 500mM) con un rotor del tipo Ultraturrax T-25. Tras un tratamientocon SDS 20% a 65 0C se añadeAcetatoPotásicoSM incubandoa O 0C. Tras centrifUgar a 25.000 xg, el ADN se purifica con Alcohol Isopropilico durantetoda una nochea -20 0C. Se precipitael ADN a 20.000xg paraeliminar el sobrenadante.El ADN sedimentadoseresuspendecon Tris SOmM, EDTA lOmM. Se centrifliga una vezmás para eliminar las impurezasque puedanquedary seprecipitadespuésel ADN contenido en el sobrenadantecon Acetato Sódico 3M pH 5,2 y CTAB 1% (Bromuro de Cetil Trimetil Amonio). Se eliminan las sales del ADN lavando con Etanol 70% y posteriormentese resuspendecon TE 10:1 pH 8 (Tris lOmM, EDTA lmM). Esta solución se precipita con AcetatoSódico3M y dosvolúmenesde Etanolabsoluto,manteniendosea -20 0C. Parala determinaciónde la concentraciónde ADN semide la densidadóptica a 260 nmde longitud de ondasegúnel métodoespectrofotométricode Sambrooket al. (1989),Se obtuvo una estimade la purezadel ADN mediantela estimade la relaciónde la densidad ópticamedidaa 260 y 280 nm de X. 3.2 Amplificación del ADN ~enóm¡co Paralas reaccionesde polimerizaciónen cadenase utilizó la enzima“ADN polimerasa ReplithermTermoestable”(EpicentreTechnologies). Aunquela técnicade la reacciónde polimerizaciónen cadena(PCR), realizadatanto con oligonucleótidosde secuenciaal azarcomo con oligonucleótidosseleccionadosa partir de genesespecificos,es básicamentela misma, nosotrosla diferenciaremoscomo RAPDs parael primer casoy comoPCRparael segundocon el fin de simplificar la lecturade este 32 trabajo. Los distintoscomponentesempleadosen la reacciónde amplificaciónfiguran en la Tabla3, Tabla 3: Composiciónde las mezclasde reacciónde amplificaciónporRAPDsy PCR RAPDs PCR dATP 0,40 mM 40 mM de 70 Kd. 626 ph. Rathniikant ci al. (1984) MAE-IO1i NIAE~1O1. IcitiITCA¡LtiGcY¡Tc,Gc (iA(RRRR&(.i(iXIAGLTC ADNe de! gen del componente e-ii deprotan,ii,a. 547 ph. 5tates~I al. (¡982) Las reaccionesde amplificaciónserealizaronen el termocicladorDNA ThermalCycler 480 (Perkin- Elmer Cetus). La mezclade reacciónfigura en la Tabla 3 y los programas empleadosson los siguientes(Fig. 8). -Un ciclo de 4 minutosa 94 0C. -35 ciclos con trespartescadauno: a> Desnaturalizacióna94 0C durante1 minuto. 1,) Anillamiento a 45 0C, 1 minuto. c) Polimerizacióna72 0C, 2 minutos. 35 -Ciclo de terminacióna 72 0C, 4 minutos. Figura 8. Representaciónde los programasde amplificaciónporPCR 3.3 Electroforesis La separaciónde los productos de amplificación se realizó por electroforesis horizontal en gel de agarosaal 1,4% (Sambrooket al., 1989). El sistematampón empleadopara las electroforesises TAE (Tris-Acetato 0,04M, EDTA O.OOIM) Las condicionesde electroforesisson de 3-4 V/cm (medido como la distancia entre los electrodos) durante 2-3 horas. La detección de los productos de amplificaciónse hizo portinción con Bromurode Lidio. Los gelesse fotografiaroncon una cámaraPolaroidDS-34y peliculaPolaroid667. El tamañode los fragmentosseparadospor electroforesisse calculó con el programa GEL, que comparalos fragmentosde tamañodesconocidocon la migracióny tamañode un 36 ADN de alto pesomolecular,queen nuestrocasoesel ADN del bacteriófagoL, tratadocon la endonucleasade restricciónl-lindIII. 4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 4.1 Estima de las frecuenciasgenotípicasy ~énicas.Ligamiento al sexo . En aquelloscasosen los que se observaronpolimorfismos cromosómicosse han analizadolas frecuenciasde los distintoscariomorfos. En los caracteresbioquímicos, las frecuenciasgénicas y genotípicas se infieren directamenteapartir de las fenotipicasen aquelloscasosen que los alelossoncodominantes. En el caso de loci polimórficos con dominanciacompleta,las frecuenciasgenotipicasy génicasseestimansuponiendola existenciade equilibrio de Hardy-Weinberg. En el estudio de polimorfismos para fragmentosde amplificación sólo se puede determinarJafrecuenciade presenciao ausenciade bandasen electroforesis.Dado que se desconoceel origende los fragmentosamplificados,y esimposiblediferenciarlos individuos heterocigotosde los homocigotospara la presenciade las bandas, el análisis de estos polimorfismosseha basadoen la frecuenciadepresenciao ausenciadel fragmento. Además, se hizo un análisis de ligamiento al sexo mediante una prueba de independencia X2 paratodoslos caracterespolimórficos. 4.2 Estima de la variabilidad penética intrapoblacional: indice de polimorfismo y beterocisosidad pellica media Como parámetrosrepresentativosde la variabilidad genéticaa nivel isoenzimáticoen las poblaciones,consideraremosel “indice de loci polimórficos” (P) y la “heterocigosidad génica media” (Hm). El indice de loci polimórficos se define, en esteapanado,como la proporciónestimadade loci que son variables,y viene dadopor el cocienteentreel número de loci polimórficosy el númerototal de loci analizados.Se admiteque un locus esvariable 37 cuandola frecuenciadel alelo más común es inferior a 0,99 (criterio del 99O/~) o a 0,95 (criterio del 95%). El índice de polimorfismo (P) se definepara fragmentosde amplificación como la proporciónestimadade fragmentosque sonvariables. Secalcula como el cocienteentreel número de fragmentos amplificados polimórficos y el número total de fragmentos analizados.Los criteriosempleadossonlos mismosqueparalos caracteresbioquímicos. Laheterocigosidadmediaparacaracteresisoenzimáticosse definecomo la proporción de individuos heterocigotosobservadospor locusen el total de los loci estudiados. Estaestimade la variabilidadgenéticano puedeobtenerseparacaracteresmoleculares dadoqueno esposibledistinguir a los individuosheterocigotos. 4.3 Estimade la variabilidadgenética¡nterpoblac¡onal:Identidady distanciagenética Estos parámetrosse empleanparaestimar el grado de diferenciacióngenéticaentre poblaciones.La identidadgenética(1) se definecomo la proporciónde genesidénticos en estructuraentredos poblacionesy secalculaa partir del indice de identidadde Nei (1972>, cuya fórmulaes: rEx~Y1 1~— S1x1 2 zrí¿ La distanciagenética(D), definidaporel mismoautor,seexpresacomo: D= -Ln] La estima de la diversidadgenéticaentre poblacionesmediante el análisis de los fragmentosde amplificaciónse ha determinadoaplicandoestosmismosindicesen los que se ha consideradola proporciónde fragmentosidénticosentrelas poblaciones. 38 La elaboraciónde los dendrogramascorrespondientesa los valoresestimadosde D, tanto para caracteresbioquímicoscomo moleculares, entrelas diferentespoblaciones,se realizó segúnel método UPGMA (unweighted-pairgroupmethod)(Sneathy Sokal, 1973). Los erroresde los puntosde ramificaciónsecalcularonsiguiendoel métodode Nei (1985). La estimación de los valoresde distanciagenéticaasí como la construccióndel árbol filogenético, se ¡~ealizó con la ayuda del programainformático NTSYS-PC (Numerical Taxonomyand Multivariate Analysis System;Rohlf, 1990). 39 RESULTADOS No sehan observadodiferencias,ni inter ni intraindividuales,en la morfologíade los cromosomasy por lo tanto en el número fUndamental, que sugieran la existencia de polimorfismos cromosómicosestructuraleso numéricos en las poblacionesanalizadas, exceptoparala región organizadoranucleolar,polimorfismoquesecomentarámásadelante. Las placasmelafásicasde la primeradivisión meiótica analizadasen la población CR mostraron24 bivalentes.En ningún casose observóla existenciade bivalentesheteromorfos (Fig. 9). Dado que no se han observado polimorfismos cromosómicosestructuraleso numéricos,asi como bivalentesheteromorfoso univalentes,no hay evidenciade que existan heterocromosomassexualesquesepuedanidentificarmediantetinción convencional. Las mediaspoblacionalesobtenidaspara la Longitud de cada uno de los 24 pares cromosómicosaparecenen la Tabla 6. La comparaciónde estasmediasentresi no mostró diferenciassignificativasal 99% en ningún caso,por lo que se ha empleadola mediaglobal paraordenarlos cromosomasdentrode cadauno de los gruposestablecidosen el cariotipo. Además,se ha calculadola longitud de los cromosomasen u, que estácomprendidaentre 2,3 y 0,8 g (Tabla6). Las mediaspoblacionalesobtenidasparala relaciónentrelas longitudesde los brazos cromosómicosse dan en la Tabla 7. Los valores medios correspondientesa los pares cromosómicosacrocéntricosno secalcularon,ya que la pequeñalongitud del brazo corto haceimposible su medición en numerosasocasiones.Tampoco seobservarondiferencias significativasentrelas mediaspoblacionales. El hecho de haberagrupadolos cromosomaspor su morfologia sedebea que no se han podido establecergrupos de cromosomasde diferente]ongitud, ya que todos ellos tienen entre 2,3 y 0,8 y¡. Además, estesistema de clasificación es el mismo que se ha empleadoen todoslos cariotiposestablecidoshastael momentoparaestaespecie. 43 Tabla6: Mediaspoblacionalesde las longitudesde los 24 parescromosómicos.. Pat cromosómico’ UEII VG GRL CR ORO NC X Ú’) 1 6,46±0,07 6.48±0,05 6,51±0,09 6,52+0,11 6.38±0,12 6 79.0 1 ¡ 6 52+003 2.3±0,01 2 5,37±0,07 5,38±0.07 538±0,06 5,46+0,11 5,53±9,12 5,58±0,10 5,43±0.03 2,0±0.0! 3 499±0¡0 4.80±0,08 465+009 4,7340,08 474+009 4 79+0 ¡1 4,79±0,04 1,7±0,01 4 4.26±0.06 439+005 423+003 4,36+0,12 4,42±0,10 4,35±0,10 4.36±0,03 1,5±0.01 5 4.04±0.06 400+004 3 90+005 408+0.05 4,00±0,07 3 90+007 3.99±0,02 1 4+001 6 3.76-0,05 382+005 367+008 3,81+0,06 3,74±0.10 3,65±0,07 3,74±9,03 1,3±0,0! 7 3.37+0,04 3.42±0.01 3,36±0,07 3,48+0,08 3,31±0,06 3.39±0,08 3,39±0,02 ¡ 2*00! 8 3,lR±0,05 3.21±0,05 3,08±0,06 3,23.0,10 342±0,07 3,03±040 3,15j0,03 1,1±0,0! 9 582±006 5.85±0,07 5.96±0,06 5,99+0,09 5,79±0,12 5,80±0,16 5,8740,03 2 1-001 10 4,96±0,04 5,03+0,06 5,07±0,05 5,10+0,13 5,07±0,10 5,20±0,12 5064003 1,8±0,01 11 4 50>004 445±007 4,52±0,05 4,38>0,08 4,33±0,07 4,47±0.07 4,44±0,03 16+001 12 4 31+004 4,27:0,05 429*004 4,32+0,05 432+0 07 4,27±0,09 4,30~~0,02 I,5¿0.01 13 1 14+004 4,07j0,04 447+0,01 4,06~0,06 4>1+006 4.l6±0,07 4,22±0,02 ¡.5±0,02 14 3,98+0,0:3 3,9310.03 398*004 3,91>0,05 3,83±0,04 3,98±0,04 3,9210,02 ¡.4±0,01 15 3 89+003 3,88±0,04 3 89+004 3,84+0,06 3,90±0,05 3 96+006 3,89±0.02 ¡.4>0.0! 16 3,80±0.03 3 80~003 3,77±9.04 3,74±0,05 3,75±0,04 3,78±0,05 3,78+0,02 13:0.01 17 3.680,03 368+003 3,6J±0,03 3,53+0,06 363+0 07 349+004 3,61*0,02 IYO.01 18 348-004 356-005 3,51±0,04 3,37+0,07 3,45±0,07 3.38±0,06 3,50±0,02 1.2:0.01 19 320-007 3,29~0,05 3,28±0,05 3,15+0,06 323+010 3,14±0,08 3,20±9,03 3.! :0.0! 20 5.50 0.08 529±009 5,52±0,09 5,29’0,14 5.43±0,16 5,37±0.16 5,40±0,04 1.9.0.01 21 414±007 4.20>0,05 4,13±0,06 4,27+0,09 4,29±0,14 426+0 08 4,200.03 1.’ 0.0! 22 3,73*0.06 3.69:0,07 3,78±0,05 3,80*0,08 3,90±0,12 394+0 JO 3.81>0.03 ¡ 40.0! 23 307+009 3,12-0,06 323+009 3,19+010 3,27±0,15 319+012 318+004 1 lo (JI 24 2,300,06 2,47±0,05 242+0 06 2,55+0,09 2,44±0,16 2.25±0,08 2,40:0,04 OIt, Ql *Paresmetacéntricos:1-8. Paressubmetacéntricos:9-19.Paresacrocéntricos:20-24. DEH: “Dehesóndel Encinar”. VO: “Vega de! Guadiana’,GRL: “La Generala”,CR: “La Lagunadc! (ns*o”. ORO: “Oropesa”,NG “Embalsede Citménigo”, NB: “Las HárdenasReales”. 44 Tabla 7: Medias poblacionales de la relación entre las longitudes de los brazos cromosómicos. Par cromosómíco* DEll VG «RL Cli ORO NC X 1 I,03±(1,0L ¡ 02+001 103+001 ¡ 03+0 02 1,01±0.0! 1,01±0,01 1.02±0,01 2 1,! 1±0.01 ¡ 07*002 !,09±«~02 ¡¡0+003 1,06±0,02 1,06±0,02 1,08+00! 3 1.14±0,03 ¡.20±0,04 ¡.20±0.05 1,10±0,03 129+0,07 1,07+003 1 ¡7+002 4 1.26±0,03 ¡ 25+004 1,24±0,04 1,23±9,05 ¡,26±0,05 1,19±0,04 ¡.24±0,02 5 1,54±0,03 146+002 1,47±0,03 143+001 ¡53±0,04 ¡.49±0.03 1,49±0,01 6 1.16±0,02 ¡ 15+0 03 ¡,¡8+0,04 113±6.02 1,12±0,03 1,16±0,03 í,¡5±0.01 7 ¡ 43+004 ¡51±0,03 1,51±0,03 ¡ 51+004 144+0,03 1,48*003 ¡ 48±0,0! 8 ¡¡9±0.02 119+004 ¡.20±0,02 1,¡6x0,04 1,13±0,03 1,15+-O 03 ¡ 17+0 03 9 2 59’-0 07 2,39±0,06 251+005 2,46±0,07 2,47±0,07 2,57+008 250:0,03 10 2.3.5:0.06 2,39±005 2,3940,05 2,40±9.09 2,39±0,!¡ 2,54*006 241+003 11 2,70+0.07 264+0 08 2,76±0,07 2,86±0,09 2,77±0,06 2.68+0 07 2 74±0.03 ¡2 2.08±0,05 2 21+007 2,14±0,05 2,07±6,06 2.00±0,03 2,03+007 209+002 13 2,45 ±0(16 2.51±9.06 2,53±9,07 244+007 2.35±0,04 2,54±0.07 2,47±0.02 14 2,91±0,05 289+006 289+0 06 294*0 05 2,88±0,03 2,95±0.05 2,92±0,02 ¡5 1.92±0.04 1,88+0,03 1 84+008 1.84±0,05 1,85±0,07 1.88+005 1 87+0 (>2 16 2,70±0,06 2,52±0,04 261+0 06 2,58±6.04 264+0,¡0 2,60±0,12 2,60±0,03 17 299 ~008 297*008 2,99±0,03 299*-O 03 2,94±0,07 2.92±0,07 297+004 18 2,20¿0.05 2,03±0.06 215+007 2 04+004 2,1¡±0,07 2,04+0 08 209*0 03 19 ¡.93±0,03 1,8810,04 195+005 1,84±0.04 ¡.82±0,05 ¡,80+0,04 ¡.87±0,02 *Paresmetacéntricos:¡-8. Paressubmetacéntricos:9-19. DEH: “Dehesórídel Encinar”.VG: “Vega del Guadiana”,GRL: “La Generala”,CR: “La Lagunadel Cristo”. ORO: “Oropesa”,NG: “Embalsedc Citruénigo”,NR “Las BárdenasReales”. 45 1.2. Patrón de bandeo C El patrón de distribución de la heterocromatinaconstitutiva se analizó en las poblacionesDEH, VG, GRL, NC y Cli., encontrándoseque su localizaciónes- básicamente centroméricay telomérica(Fig. 11). Las bandascentroméricasestánpresentesen todos los pares cromosómicosy las teloméricasseobservanen el brazolargo de casi todos ellos. Ademásse observanbandas intersticialesen los parescromosómicos3, 9, 10, 12, 20, 21 y 22. Porotro lado, los pares2, 6, 8, 1 1, 15 y 19 presentangrandesbloques heterocromáticos.En el caso del par 2 se localizan pericentroniéricanientey en el resto abarcanla prácticatotalidad de uno de sus brazos.Si los cromosomasson submetacéntricos,el bloque selocalizaen el brazocorto de los mismos.Los cromosomasacrocéntricos,exceptoel par 24, presentansus brazoscortos como heteropicrióticospositivos. La región organizadoranucleolar se comporta como heteropicnóticanegativa(Fig. 11). El análisisdel patrónde bandeoC muestrala existenciade un polimorfismo paralos bloquesheterocromáticosde los pares6 y 8 (Fig. 11). Estospolimorfismosse han analizado en las poblacionesDEH, VG y NC por tenerun mayornúmerode individuos en los quese obtuvieron buenasplacasmetafásicascon bandeoC. Los resultadosobtenidosson muy similares en las tres poblacionessalvo para la bandapresenteen el cromosoma8 de la poblaciónNC, cuya frecuenciade aparición(0,77)esmayorqueen las otrasdos (0,50). Tabla8: Frecuenciade bloquesheterocromáticosen los parescromosómícos6 y 8. Parcromosómico6 Parcromosómico8 Población N ++ +- — p N 4* +- -- DEH 18 0,61 0,22 0,17 0,72 13 0.31 0.38 0,31 0,50 VG II 0.64 0,27 0,09 0,77 10 0,30 0,40 0,30 0.50 NC 9 0,56 0,33 0,11 0,72 9 0,67 0,22 0.11 0.77 N: Número de individuos analizados;++: frecuenciade individuos homocigáticospara la presenciadel b¡oqueheterocroníático.±- heicrocigóticos,--: homocigóticospara laausenciade! bloqueheterocromático. p; frecuenciade! b¡oquc heterocromático.DEN: “Dehcsón del Encinar”; VG: “Vega del Guadiana”,NG: “Embalsedc Citruénigo”. 46 1.3. Re2ionesorganizadorasnucleolares Mediantela técnicade impregnaciónargénticaseha podidodeterminarla existenciade un único par cromosómicoorganizadornucleolar,que secorrespondecon el par 3, el cual presentabaunaconstricciónsecundariaintersticialdetectablepor tinción convencional(Figs. 9 y lO). La existencia de un único par cromosórnicoorganizadornucleolar se manifiesta tambiénpor la presenciade un par de nucleolosen los núcleos interfásicos. Se ha observadola existenciade polimorfismo parael tamañoy la localizaciónde la región organizadoranucleolar (Fig. 12). Estasvariacionessemanifiestanmediantetinción convencional por la modificación del tamañode la constricciónsecundariaasí como de su posició¡i. Estasmodificacionessoíi la causade que la morfologíadel par cromosómico3, podadorde dichaconstricción, seavariable. Este par cromosómico,que esmetacéntrico, aparecepor ello frecuentementecomo submetacéntrico.Estasvariacionessehan observado tanto en heterocigosiscomohomocigosis.Los resultadosobtenidoscon la tinción argéntica permitenexplicar, en algunasocasiones,estadiferenciaen la longitud relativade los brazos cromosómicosy en el tamaño de la constricción secundariacomo el resultadode la duplicaciónde la región organizadoranucleolar(Fig. 1 2b, c). En otrasocasiones,el tamaño de la región organizadoranucleolar teñida con nitrato de plata es el mismo para ambos homólogos,pero su posiciónen el cromosoma(Fig. 1 2d). Varios procesospodríanexplicar estavariación, tales como una inversión, aunque con los datos obtenidosno se puede determinarcuál esel responsablede dichamodificación. Se realizó unaestimade la frecuenciade los individuosque presentabanalgúntipo de polimorfismopara la región organizadoranucleolarcon respectoal fenotiponormal (Tabla 9). Dichas frecuenciasse estimarona partir del análisissimultáneode los datosobtenidos con tinción convencionaly tinción argéntica. En dicha Tabla se puedeobservarque el porcentajede individuos que presentanpolimorfismo paradicharegión cromosómicaen el total de las poblacionesanalizadases del 52%, sin tener en cuenta ni el origen del 48 1.4. Tinción con cromomicina A3 El patrónde fluorescenciaobtenidomedianteestatinción sólo permitela identificación de los pares cromosómicos3, 11 y 15. En el par cromosómico3 se observauna banda fluorescenteen la región cromosómicacorrespondientea la región organizadoranucleolar. Los pares II y 15 presentandiferencialmenteteñido el brazocorto(Fig. 13) al igual que lo observadomediantela tinción de bandeoC. En Me 1 seobservanbandasfluorescentesen tres bivalentes,que podríancorrespondersa dichospares.Por otra parte, tambiénparecen observarsebandastenuesen las regionescentroméricasde algunosparescromosómicos. 1~os núcleos en interfase teñidos con cromomicina A3 mostraron siempre dos nucleolos, lo que está de acuerdo con la existencia de un único par cromosómico organizadornucleolar Los resultadosobtenidoscon cromomicinaA3 estánde acuerdocon los de tinción argéntícaen cuanto a las diferenciasde tamaño de la región organizadoranucleolarasí como en lo que a su posicióncromosómicarespecta.Dado que la tinción con plata tiñe proteínasasociadasa dichasregiones,y estefenómenoseproduceen aquellaszonasque han sido activas en la interfaseprevia, parte de las diferenciasobservadasen el tamañode la región organizadoranucleolar mediante la tinción con plata podrian justificarse como diferenciasfuncionales. Sin embargo, las diferenciasobservadascon fluorescenciaen el tamaño de dichas regiones sólo pueden ser estructurales,ya que esta técnica tiñe directamenteel ADN. 50 2. ANÁLISIS DE CARACTERES BIOOUÍMICOS 2.1. INTERPRETACIÓN DE LOS PATRONES ELECTROFORETICOS Se ha obtenido el patrón electroforéticode los 1 6 sistemasenzimáticossiguientes: AAT. ACO, ACPH, ADH, HIBDH, EST, cí-GPDH, IDH, LDH, MDH, ME, PER, PUD, PCI, PUM y SOD Con los sistemastampónprobados(Ridway, Poulik, e Histidina) se obtuvieronbuenos resultadosen Poulik paralas enzimas:ACPH, AAT, EST, a-GPDH,PER, PUI, PUM y 500; en Histidina para ACO, ADH, HBDH, IDH, LDE-I, MDH y PUD y en Ridway para ME - A continuación se describenlos patronesobtenidospara cada sistema enzimático analizado,agrupadosen función de su estructuracuaternariaen enzimas monoméricas, diméricasy tetraméricas. 2.1.1. Enzimasmonoméricas 2.1.1.1. Aconitasa - a- , y los loci Ú$~n y n controlaríanlas isoenzimasPUM— 1 y PGM-2, respectivamente.A veces aparecenunas bandas adicionales para la enzima fosfoglucosamutasaque correspondena modificacionespostranscripcionalesde las bandas PUM- 1 y PGM-2, al igual quese ha descritoen 2úm§LwÁÁ- í%nús (Anderssonet al., 1981). Estos resultadosno permitensabercon certezacuál es la estructuracuaternariade ninguno de los sistemas isoenzimáticos mencionados. Sin embargo, proponemosla estructuramonoméricade estasenzimasde acuerdocon la mayoríade los datosprocedentes de otrasespeciespiscicolas,tanto de ciprinidoscomo de teleósteosen general (Allendorfet al., 1977; Ferrisy Whitt, 1977a;Buth, 1983; Anderssonet al., 1983; Buth, 1984; Woodsy Ruth, 1984; Rainboth et al., 1986; Crabtreey Buth, 1987; Machordom, 1992). Los resultadosobtenidosen estos trabajos en cuanto al número de loci que controlan los sistemasIsoenziniáticosanalizadoscoincidencon los aqui descritos. La aconitasaesla únicaenzima,de las trescomentadashastaahora,queno ofreceuna buenaresoluciónpara ser estudiadaen el análisis poblacional.En el caso de las enzimas HBDI-I y PUM seestudiarontodoslos loci. 54 2.1.1.2.Esterasas(EST) En el patrón electroforético de esta enzima se pueden diferenciar cinco zonas anódicas,denominadas1, II, 111, IV y y, en las que se observan,como mínimo, diezbandas (Figs 15 y 16) Las zonas1, III y y estánrepresentadaspor las bandasinvariablesEST-l, EST-5 y EST- 10, respectivamenteEstasbandasestaríancontroladas,como mínimo, por un locus cada ) Los dos primerosloci se expresanen todos los extractos una ( analizados,mientrasque el locos 0 no esactivo en ojo ni r¡non. La zonaII no siemprese resuelvecon claridad,pero se puededecir que al menosse observantres bandasdiferentes,La bandaEST-2. que estariacontroladapor el locus se detectaen riñón y bazc El control genéticodc las bandasEST-3 y EST-4, que se observanen hígado. riñó¡i y bazo,corresponderíaa los loci y e — — — — — — n: IB !56 (luí — — Efl9 (1BO~ — Es:: 151 7 Efl.6 (>00) 151 9 (ID> — — — — — ¡5! 5 ¡51.3 !fl 2 — — — ¡ST 1 EST .4 LnV Lx. TV Lu..fl1 Zn.fl1$ Yana ¡ 4 , O M II R E Co Ce 6 Figura 15: riñón. B bazo. Co- corazón.Ce: cerebro,U; gónada. Patrónelectroforéticode esterasas(EST). O ojo, M músculo,H higado, R. 55 La zona IV de esterasaspresentaseis bandas,una de las cualeses exclusiva de riñón (EST-8), mientrasque el restose observapreferentementeen hígado (Figs. 15 y 16). Esta zona,analizadaa nivel poblacionalen hígado,resultóservariable(Fig. 1 6c). La variabilidad detectadasebasaprincipalmenteen la presenciao ausenciade bandas.No aparecenformas heterodiméricasentre las mismas, por lo que su estructuracuaternariaseria monomérica, coincidiendocon lo señaladoen otrasfamilias de pecestalescomo ciprinidos (Machordom, 1992)y salmónidos(Anderssonet al., 1983). El control genéticode la zonaIV en la queen hígadosehan llegadoa observarlas cinco bandassimultáneamente,requierecomo mínimo la existenciade tres loci, pero dado que puedehaberalelosnulos y secarecede cruzamientosque permitandilucidar claramentecuál es el númerode locí implicados,vamosa considerarla posibleexistenciade tres, cuatro,o cinco locí Además,en el capítulo correspondientea los análisisde variabilidadpoblacional se haráun estudiode la frecuenciade apariciónde dichasbandas,sin asignarlesningún tipo decontrolgenético. a) Tresloci codificanparala zonaIV de esterasasen hígado. El númeromínimo de loci que explican la existenciasimultáneade cinco bandas, suponiendouna estructuracuaternariamonomérica,estres. Paradeterminarqué isoenzimas podr¡an estar codificadas por alelos del mismo locus, se analizarontodas las posibles combinacionesposiblesde las cinco bandastomadasde dosen dos. De estascombinaciones se rechazaronaquellasquemostrabanen todaslas poblacionesun excesomuy significativo de heterocigotos,ya que paraexplicarlashabríaqueconsiderarque en todaslas poblaciones hay una mayor frecuenciade cruzamientosentre machoshomocigóticospara un alelo y hembrashomocigóticasparael otro y, porlo tanto, no existiríapannnxía. Además,en la elecciónde québandaspodríanestarcontroladaspor el mismolocus se supusoque los loci sólo tienendosalelos,bien los dosactivos,o bienuno activo y otro nulo debidoa que: 57 - no puedenexistir loci con tresalelosactivos,ya que sehanobservadoindividuoscon todaslas combinacionesposiblesde tresbandas. - en las combinacionesanalizadasque podíanserexplicadaspor el control de un locus con dosalelosactivosy uno nulo, seha observadoquelas intensidadesrelativasobservadas entre las bandasno se correspondencon las esperadaspara isoenzimascontroladaspor alelosde un mismolocus. - aquellas combinacionesexplicablespor la existenciade un locus con dos alelos activosy uno nulo, el másfrecuente,y en muchaspoblacionesel único, seriaeJ nulo. Deacuerdocon estossupuestos,la explicaciónmásfactibleparael control genéticode estazonaseriala siguiente: El locus SJ—¿tendríadosalelosactivos, -LV &; «‘ÑU) y ¿11/ 0 - , que codificarian paralas isoenzimasEST-6 (100) y EST-6 (115), respectivamente. Dicho locusseexpresapreferentementeenhígado,aunquea vecestambienlo haceen nilón, El locus ~, que seexpresaúnicamenteen higado,tendríaun alelo activo y otro nulo, apareciendosólo la banda EST-7. Por otra parte, el locus >v. tendría dos alelos activos,vJ > 1 y ~~,í’7)porlos loci , >~ ,>., ». y o.— U Figura 17: Patrónelectroforéticode peroxidasas(PER). O: ojo, M músculo, H: hígado;R: riñón; 8: Bazo,Co: corazón, + PER 4’ — PER-6 — PER-5 — PER-4 — — PER.3 — PER-2 — PER-1 O U.U R B Co 60 2.1.2. Enzimas dímérícas 2.1.2.1.Aspartatoamino transferasa(AAT) La enzimaAAT muestrados zonasde actividad,una catódicao zona1 y otra anódica o zonaII (Fig 18), al igual que lo descritoen otrosciprínidos talescomo ~¿- #~-. ~ a <>4 ».,>u., “il, ». x p u~ >,-v>í. en los que se relacionanlas zonascatódicasy anódicas con las fraccionessubcelularescitosólicasy mitocondriales,respectivamente(Ferrisy Whitt, 19/Ya,Woodsy Buth. 1984) La zonade actividadcatódicase expresaentodos los tejidos y órganos,perodebidoa que no se obtuvo una correctaresoluciónno se analizó en estetrabajo, aunquese puede dccii que al menoshay una banda(AAT-l) controladacomo mínimo por un locus (Fig. 18). La zonaanódicapresentaun patróninvariableconstituido por tresbandasen músculo e higado Tambiénse observauna débil actividaden riñón y cerebro(Hg 18). Figura 18: Patrónelectroforéticode aspartatoamino transferasa (AAT) M músculo,H: hígado; R: riñón; Ce: cerebro, AAT 4 AA.T-3 — Hetercdnten 2,3~ Zona II — ~$ — AAT-2 AAT-1 Zonal U II R Ce 61 En músculoy cerebroseobservaquelas tresbandaspresentandiferentesintensidades entre si, siendo la más intensala situadamás cerca de la inserción(banda AAT-2), y la menos intensala más alejadade la misma (banda A.AT-3). El riñón presentaun patrón similar al anterior, pero con las intensidades distribuidas de manera inversa a la anteriormentedescrita. En el hígado, la mayor intensidadcorrespondea la bandacentral, siendo el doble que la de las bandasextremas(Fig. 18). El patrón obtenido para los diferentesextractossemantieneconstanteen todoslos individuosanalizados. Debido a los diferentespatronesde intensidadesobservadosen estazonaanódicaen los distintos extractos analizados,el control génico más probable corresponderíaa la expresiónde dos loci monomórficos, A~í 2 y 4 - Ó, que codificaránpara doscadenas polipeptidicasdistintaslas cualesse asocirianal azarparaformar dimeros,siendolas bandas AAT-2 y AAT-3 homodimerosy la bandaintermediaun heterodimeroformadopor dichas cadenaspolipeptídicas (Fig. 18). También podría pensarse que ibera una enzima monomérica,en cuyo caso estazona estaríacontroladapor tres loci, pero esto es poco probabledebido a que tanto las intensidadesrelativas de las bandas como los datos existentesal respectoen otras especiesde teleósteos,confirman la estructuradiméricade éstaenzima(Ferr¡sy Whitt, 1977a,b, c; Buth, 1979;Woodsy Buth, 1984). 2.1.2.2. Fosfatasasácidas(ACPR) Las fosfatasasácidas(ACPH) frieron analizadasen ojo, músculo e hígado. El ojo mostró, al igual que el patrón de la enzima AAT en hígado, tres bandasanódicas equidistantes,siendo la central de una intensidadsuperior a las dos extremas,que eran iguales. El hígadosólo mostró la bandade mayor migración, mientrasque el músculono presentóuna actividadclaraparaestaenzima(Fig. 19). Estepatrón.que sematienede forma constanteparatodos los extractosen todos los individuos analizados,se puedeexplicar, al igual queen el casode la enzimaAAT, como el resultadode la actividadde una enzimadimérica. En el ojo seexpresaríandos loci: 62 y ~ 4 , los cuales codificarían para las cadenaspolipeptídícasque dan lugar a los homodímerosACPH-1 y ACPH-2, respectivamente;correspondiendola bandaintermediaa la forma heteíodimérícaEn cambio,en el hígadosólo se expresaríael locus ti - . Esta enzima ha sido tambiénseñaladacomo diméricaen otros ciprínidos(Ferris y Whitt, 1977a, b: Buth y Eurr, 1978. Crabireey Buth, 1981),en los quese ha observadoun solo locus. Figura 19: Patrónenzimáticode fosfatasasácidas(ACPH) O: ojo; H: hígado. Estosdos sistemasisoenzimáticos,AAT y ACPH, no se consideraronadecuadospara los análisis de variación genética poblacional ya que, al ser muy lábiles, frecuentementeafectados por la congelación del material para su conservación, procedimientoque causasu inactivacíon ACPH + A — ACPH-2 — 12 ‘U O H se ven 63 patrónisoenzimáticoencontradoprovienede la expresiónde dosloci. En otrosciprínidos se ha observadoactividadexclusivamenteparaun locus (Ferrisy Whitt, 1 977a, b; Buth, 1979; Woodsy Buth, 1984) lo quenos hacesuponerqueseguramenteestaenzimaestécodificada comomáximo por los dosloci descritos. Con los resultadosobtenidosparaestaenzima,no es posibleestablecersu estructura cuaternaria, si bien numerososestudios realizadosen otras especies,entre los que se incluyen los arribamencionados,sugierenunaestructuradiméricade la misma. Sólo seha consideradoadecuadaparael análisispoblacionalla isoenzimaADH-2, ya que la ADH- 1 presentamuy pocaactividady no siempreesdetectable. 2.5.2.4. Isocitrato desfúdrogenasa(1DB) La isoenzimaIDH sólo ha mostradouna clara actividad en corazóne hígado. En corazón se observa la zona 1 de actividad y en hígado la zona II. Estas zonas pueden correspondera la forma citosólica y mitocondrial del sistemaenzimático, tal y como han señaladoalgunosautoresen otrasespeciespiscicolas(Ferrisy Whitt, 1977a,b, c; Woodsy Ruth, 1984; Crabtreey Ruth, 1987) (Fig. 21). En el corazónseobservaunabandaanódica,IDIuÍ- 1, normalmenteasociadaa una, dos y hastatres bandasadicionales(Fig. 21 a, b), al igual que ocurría en el patrónelectroforético de hígado para la isoenzima ADH-2, por lo que podrían ser modificaciones postranscripcionaleso postraduccionalesde dichabandaIDH-1. El patrónpodríaexplicarse por la existenciade al menosun locusmonomórfico,-9J1-- 1• En el hígadose observan,en la zonaII, tresbandasanódicasequidistantes,de mayor migración que la banda IDH- 1, y con distintas intensidades,de tal forma que la banda intermediapresentauna intensidaddoble que la de las bandasextremas(Fig. 21a). Este patrónse puedeexplicarporel control genéticode dosloci monomórficos, A» -- Y e Sil - , quecodificaríanparalas cadenaspolipeptidicasque conformanlas bandashomodiméricas IDH-2 e IDH-3, respectivamente,mientrasquela bandade migraciónintermediaentreestas 65 dos sería el heterodimerocorrespondiente.Este patrónapoya la estructuradiméricade Ja enzima descritaen otros ciprinidos (Woodsy Ruth, 1984) en los que se ha detectadola actividadde dos loci 2.1.2.5. ct-Glicerofosfato deshídrogenasa (a-GPDH) y 6-fosfogluconato deshidrogenasa (PGD) La enzimact-GPDHmostróactividaden músculopresentandouna bandade migración anódica,que estariacontroladapor el locusa-Ñdt. , con un solo alelo ya que su patrón ifie invariable en todos los individuos analizados (Fig. 22). Esta banda aparece generalmenteacompañadade otrasdos, queprobablementecorrespondena modificaciones postranscripcionales,al igua! queen el casode la enzimaADH Figura 22: Patrón electroforético de cí-glicerofosfato deshidrogenasa(ct-GPDH) y 6- fosfogluconatodeshidrogenasa(PGD) O. ojo, M: músculo,H- hígado. a>-GPDH 6-PGD + ji. — a-GPDH-l — — — d-PGD-I ‘II M o M H 67 La enzimaPUD ha sido estudiadaexclusivamenteen ojo, músculo,hígadoy ¡Ilión. En todos los extractos exceptoen el de riñón, que no mostró ninguna actividad, apareció únicamenteuna banda anódica, PGD-1, con mayor actividad en el hígado (Fig. 22). Siguiendola pautamarcadaporAllendorf et al. (1977), estepatróninvariableesexplicable por un solo locusmonomórfico, («uf 1. Los resultadosobtenidosno ponen de manifiesto la estructuracuaternariade estas enzimas,las cualesseríandiméricasde acuerdocon lo observadoen otros ciprínidos, en los que tambiénseha descritola existenciade un solo locus para cadauna de ellas (Ferrisy Whitt, 1977a, b; Ruth, 1983; Woodsy Ruth, 1984; Machordom,1992). 2.1.2.6. Superóxidodismutasa (SOD) La enzima SOD, al igual que las enzimasADH en higado e IDI-1 en corazón, se expresaen todos los tejidoscomo unabandainvariable,que puedepresentarasociadasotras tenues, que probablementeson modificacionespostranscripcionaleso postraduccionales. Esta banda, a la que llamaremosSOD-1, estarácontrolada por al menos un locus monomórfico,» .i (Fig. 23). Además,en músculoy a veces también en riñón pareceobservarseal menosotra banda adicional, SOD-2, que nos permite considerarla existenciade un segundolocus, >4 »., aunqueno seobtuvieraunabuenaresoluciónparala misma. La estructuracuaternariadimérica de esta enzimaha sido descritapreviamenteen otrasespeciesde teleósteos(Allendorfet al., 1977; Ferris y Whitt, 1977 a ,b, c; Ruth, 1979; Woodsy Ruth, 1984; Machordom,1992). Segúnlo descritoen otros ciprinidos, existendos loci que controlan una forma citosólica que se observa en todos los tejidos y otra mitocondrial,exclusivade músculo,quepodríancorrespondera las bandasSOD-] y SOD-2, respectivamente. 68 suponerla existenciade dos locí, 6$¿ 1 y ¿u-- 2, que codificarían para las cadenasque forman las bandasPGI-l y PGI-2. Estaexplicación, que se correspondecon una enzima diméricaque forme heterodímerosentre las cadenascodificadaspor diferentesloci, es la misma que se ha presentadoen generalparaestaenzimaen las otrasespeciesde teleósteos analizadas,talescomo ciprínidos (Ferrisy Whitt, 1977a,b; Ferriset al., 1982; Ruth, 1982; Machordom, 1992), catostómidos(Ruth, 1979), cobítidos (Ferris y Whitt 1 977c), salmónidos(Allendorfet al., 1977; Okazaki, 1986),etc.. Las bandasque acompañana PCI- 1 serian el resultado de modificaciones postranscripcionaleso postraduccionales,y las bandasobservadasen la zonade migraciónintermediaserianel resultadode la combinación heterodiméricade las cadenascodificadas por ambos loci y de sus modificaciones postranscripcionales(Fig. 24). 2.1.2.8Mático deshidrogenasa (MDH) En estaenzimapodemosdiferenciardoszonasde actividadanódica (zonas1 y II) que seobservanen todos los tejidos(Fig. 25). La zona 1 estárepresentadapor una bandainvariable, MDL-I-1, controladapor al menosun locus denominado>0/JA> . Esta bandainvariable estásiempreacompañadade otrasbandasquecorrespondena modificacionespostranscripeionaleso postraduccionalesde la misma (Fig. 25) al igual que lo descritoen barbos(Berrebi et al., 1988; Machordom, 1992). En la zona11, si bienconpocaresolución,sedistinguendosbandasmuy juntas,MDH- 2 y N4DH-3. En ojo y corazónse observacasi exclusivamentela bandaMDH-3, en músculo la bandaMDI-I-2 y en el resto de los órganoslas dos bandas.El control genéticode esta zonacorresponderiaa los loci >/hJ. > y >lPnilc 1~ (Fig. 25). En estazona,dadoquelas bandas MDH-2 y MDH-3 tienenuna migraciónmuy parecida,no es posibledistinguir si se forman heterodímerosentreellas. 71 Con los resultadosobtenidosen estetrabajo, los cualescoincidencon los obtenidos paraotras especiesde cíprínidos (Ferrisy Whitt, 1 977a, b; Woodsy Ruth, 1984), no se puedeconocerla estructuracuaternariade estaenzima,aunquesu estructuradiméricaha sido demostradaen otrasespeciespiscícolas(Anderssonet al., 1983; Rainboth et al., 1986: Berrebiet al,, 1988, Machordom, 1992). Parael análisispoblacionalsólo seconsideraronlos locí 7??Jí; y 7Ñl~ 4 que son los quepresentabanunamayorresoluciónelectroforéticaen corazón(Fig. 25). 2.1.3. Enzimas tetrainéricas 2.1.3.1.Láctico deshidrogenasa(LDH) En estaenzima se observandos zonas de actividad, una catódica(zona 1) y otra anódica(Zona II) (Fig. 26). La zona1 tieneunaúnicabandaque aparecesólo en músculo,y estaríacontroladapor el locus LIII 1. En la zona 11 hay cinco formas isoenzimáticas anódicasinvariables, que se observanen todos los tejidos pero con diferente intensidad (Figs. 26). En el casode estaenzima,hay trabajosen otrasespeciespiscícolasque describenla existenciade tres bel y una estructuratetraméricade la enzima(Allendorf et al., 1977; Anderssonet al., 1983; Heinonen,1988; Brulé, 1989; Van der Bank et al., 1989; Rennoet al., 1989). Dadoquelas cinco formasanódicasde la zonaII se expresanen todoslos tejidos con un patrón invariable paratodos los individuos analizados,nosotrossugerimosque la enzimaLDH de tencaestambientetraméricay que hay dosloci parala zonaanódica:£4 A y >14 . La combinacióntetraméricade las mismasgeneralas cinco formas enzimáticas diferentes(Figs. 26) 73 2.1.3.2. Enzima málica (ME) Esta enzima sólo mostró buenaresoluciónen ojo, músculoe higado, observándose una sola banda,ME-l, en todos ellos, con mayor intensidaden el hígado(Hg 27)- De acuerdo con A]lendorf et al. (1977), este patrón puedeexplicarse con un solo locus monomórfico, Al observarseuna sola banda invariable, no se puede saber cuál es la estructura cuaternariadeestaenzima,que segúnnumerososautoresseríatetramerica(Allendorf 1977; Anderssonet al,. 1981. 1983; Rennoet al., 1989; Shakleet al., 1990b).Paraestaenzima se ha descrilola existenciadedosloci en otroF ciprinidos (Woodsy Ruth, 1984), Su empleo en el análisis poblacionalno es recomendabledebido a que estesistema isoenzimáticono siemprese tífie correctamente. Figura 27: Patrónelectroforéticode ME. O:ojo, M: músculo,H: higado En la Tabla 10 se resumenlos resultadosestablecidosparalas distintasisoenzimasen cuantoa su estructuracuaternaria,control genético,tipo de migración (catódicao anódica) y tejidos u órganosen los que se expresan.También se indican aquellosloci que se han utilizado en los análisispoblacionales. ME + Ah — — — fr~ 1 ‘U o 1W 75 Tabla 10: Resultadoselectroforeticosde los diferentessistemasisoenzimáticos. Enzima Estructura Locus Migración Tejidos Utilizado en el análisis pohiacional AAT Diniérica 2 3 Monoinérica 1 2 2 2 2 2 3 4 5 6 .7 8 9 10 2 3 Tctruiitiérica 1 2 3 7~ 2 4 6 2 2 2 LIEDH Mononiérica Monomérica a-GJ’DH Díníenca ¡DLI Duncrica Tetraniérica Monornérica Dimérica Diniérica Di C A A A A A A c A A A A A A A A A A A A A A A A A C A A A A A A A A A A A A A c A A A A A O,M,1LR,B,Co.Cc,G M.I-¡,R, Ce M,H,R, Ce ¡-1 E o OH 1-1 1-1 ¡-1 E O,M,H,R,B,Co,Cc,G R,B H,R,H H,R,B O,M,H,R,B.Co,Ce.G t-LR E R l-I,R,B,Co,Ce,G M,H,B.Co.Cc,G Nl Co E FI M O,M,E,R,B.Co.Cc,G O,M,HJtB,Co,Cc,G O,M,H,R,B,Co,Cc,G M.H,R,B,Cc.G O,H,R.B,Co.Ce.G O,M,H O,M.H,B.Co O,M.H,B,Co O,E,Co 13,Co O,M,H,R,Co OCo O,M,E O,M,Co O,M,H,R,B,Co,Ce,G M.H,R.B,Co,Cc O.H,RB,Co,Cc,G O.M.E,RB,Co,Cc,G M,R O: Ojo. M: Músculo. E: Hígado. A: anódica.C: catódica. R: Riñón, B: Bazo; Co: Corazón,Ce: Cerebro,G: Gónada. ACO ACPI-I Dírnénca ADII Diniérica EST LDII MDII Diniéríca No No No No No No No No Sí Sí Si Si No No No Sí Si Sí No Sí Sí No Sí No No No Sí Si Si No Si No Si Sí Sí Si No Sí No Sí Si Sí Si Sí No ME PER ¡‘CD PCI PGM Monornérica son 76 2.2 ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD ISOENZIMÁTICA INTRA E INTERPOBLACIONAL 2.2.1. Distribución de frecuenciaseenOtiDicasy 2énicas El análisis de la variabilidad isoenzimáticapoblacional se realizó únicamenteen muestrasprocedentesde hígado y corazón, ya que son las que presentanuna mayor resolucióny expresiónenzimática.De los diez sistemasisoenzimáticosestudiadosen el análisispoblacional(Tabla 1 0), sólo uno, el de esterasas,presentóvariabilidad. Como ya se indicó en el apartado correspondiente,la variabilidad se observó únicamenteen la zona IV de esterasas.Las cinco bandasque aparecenen estazona en higado podrían ser el productode la expresiónde: a) tres loci dialélicos; b) cuatro loci, siendo uno de ellos monomórfico;c) cinco loci, de los cualescuatro seríanvariables.En el casode considerarla primerahipótesis,los loci analizadosen total en el analisispoblacional serían24. Si seconsiderala segundahipótesis,se habránanalizado25 y si seconsiderala tercera, 26 loci. Los análisis hechosen los casosanteriores fueron realizadostambien considerandola presenciao ausenciade las bandasde la zonaIV de esterasas,sin teneren cuentael control genéticode las mismas.Los resultadosobtenidosno seexpondránen este trabajoya queson muy similaresa los de cinco loci y las diferenciasque se hanobservadose debenexclusivamenteal tratamientomatemáticode los datos. A continuaciónsedescribenlos resultadosobtenidossegúnla hipótesisconsideradas en cadacaso. a) Tresloci dialélicos: En las TablasII y 12 se muestranlas frecuenciasfenotipicasy génicasde los loci -IV-- -Si - y > II - ~, en las distintaspoblacionesanalizadas.En el casodel locus ¿~>1-- ~, no se puedendiferenciarlos heterocigotosde los homocigotosparael alelo activo, por lo que las frecuenciasseestimansuponiendola existenciade equilibrio de 1-Iardy-Weinberg.Todaslas poblacionesestabanen equilibrio de Hardy-Weinbergparael locus tú> >~, ya que la prueba 77 de ~2 realizadano mostró diferenciassignificativasen ningún caso. En el casodel locus <>/ <- estapruebano se pudo realizar ya que en todas las poblacionesse obteníanvalores esperadosinferioresa 5. b) Cuatroloci, uno de ellos monomórfico: En estecaso,comoya seindicó anteriormente,el locus Ii ~ esel que semodifica, de tal forma que ahora las bandasEST-6 (100) y EST-6 (115) serían el resultadode la expresiónde diferentesloci. El primero, Si-- (IQO), seria monomórfico para un alelo activo, ya quetodoslos individuospresentanJabanda.El segundo, ¿-~/ « ,<, tendríaun alelo activo y otro nulo. En esteúltimo caso, las frecuenciasgénicasy fenotípicas,que aparecenreflejadasen las TablasII y 12, seestimansuponiendola existenciade equilibrio de Hardy-Weinberg. c) Cinco Ioci, uno de ellos monomórfico: Si sesuponeque los responsablesdel control génicode esterasasson cinco loci, hay que considerarque las bandascontroladaspor el locus ¿1 ‘-1, que anteriormenteera un locus con dos alelos activos,pasanahoraa ser productosde dos loci separados,ti Y ¡<¡< y y> >> -, cadauno de elloscon un alelo activo y otro nulo. Los alelosactivosse corresponderíancon las bandasEST-9 (100)y EST-9(80), respectivamente.Parala estima de las frecuenciasgénicasy genotípicasde dichos loci seha consideradola existenciade equilibrio de Hardy-Weinberg(TablasII y 12). En las Tablas 1 1 y 12 seindican ademáslas frecuenciasfenotipicasasí comolas de la ausenciade las bandasen el casode no considerarel controlgenéticode estazona. 78 Tabla II: Frecuenciasfenotípicasparalas esterasasde la zonaIV segúnexistantres, cuatroo cinco Ioci. Hipótesis Locus Fenot¡po Población DEH N=40 VG N=76 GRL N=129 CR N=97 ORO N=43 NC N=22 NR N=16 ¿4. ~ 100,100 1,000 0,987 0,992 0,938 0,837 1,000 1,000 100,115 0,000 0,015 0,008 0.062 0,163 0.000 0,000 115,115 0,000 0,000 0.000 0,000 0,000 0,000 0,000 3 Inri ¿4. / 100* 0,625 0,631 0,752 0,969 0,907 0.954 0,437 - , - 0,375 0,369 0,248 0,031 0.093 0.046 0,563 ¿t/. 9 100,100 0,975 1,000 0,318 1,000 0.535 0,636 0,750 100,80 0,025 0,000 0,442 0,000 0.442 0.273 0,250 115,8<> 0.000 0,000 0,240 0,000 0,023 0,125 0,000 ¿4 ~ (¡it) 115* 0,000 0,013 0,008 0,062 0.163 0,000 0.000 -, - 1,000 0,987 0,992 0,938 0.837 1.000 1.000 4 Inri ¿>4 -/ 100’ 0.625 0,631 0,752 0,969 0,907 0,954 0,437 0,375 0,369 0,248 0.031 0,093 0,046 0,563 ¿4. 9 100,100 0.975 1,000 0,318 1,000 0,535 0,636 0.750 100,8<> 0,025 0,000 0,442 0,000 0,442 0,273 0.250 115,80 0(100 0,0(10 0,240 0,00(1 (1,023 (1.125 0,000 >4 (ti ú) 1>5* 0,000 0,013 0,008 0.062 0,163 0.000 0,000 1.000 0,987 0,992 0,938 0,837 1,00<> ¡.000 5 Inri ¿4. 1 100* 0,625 0,631 0,752 0.969 0.907 0.954 0,437 5 (bandas)0 - , - 0,375 0,369 0,248 0.031 0,093 0,046 0,563 ¿4. ¼ (lOO) 1(1(1* 1,00(1 1(100 0.760 0.000 0.977 0,909 1 ,000 0,000 0,000 0.240 1.00<) 0.023 0.091 0.00<) >4 ¼ (SO) 80’ 0,025 <),000 0,682 0.000 0.465 0,364 0,250 - , - 0,075 1,000 0,318 1.000 0,535 0.636 0,750 * Genotiposheterocigóticosy homocigóticosparael aleloactivo. o Fenotiposenel casodc no asignarcontrol génicoa las esterasasde la zona IV. N: número de individuosanalizados. DEH: “Dehesóndel Encinar”, VO: Vega dcl Guadiana”,GRL: “La Generala”, ORO: “Oropesa”. NC: “Embalsedc Citruénigo”, NIB: “Las flárdenasReales”. CR: “Laguna dcl Cristo”. 79 Tabla 12: FrecuenciasgénicasdeJasesterasasde lazonaIV segúnexistantres,cuatroo cincoloci. Hipótesis Loc¡ Aletos (bandas) Población DEH N=40 VG N=76 GRL N=129 CR N=97 ORO N=43 NC N=22 NR N=16 ¿4. ~- ¡15 0,000 0,007 0,004 0,031 0.081 0.000 0,000 3 Inri >4 -7 0,612 0,607 0,498 0,176 0,305 0,214 0.750 >4 ¼ 0,013 0,000 0,461 0,000 0,244 0,227 0,250 >4 C (íco) 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0.000 4 Inri >4 £ (¡It) 1,000 0,993 0,996 0,969 0.915 1,000 1,000 >4 7 0,612 0,607 0,498 0,176 0,305 0.214 0,750 >4 ¼ ¿SO 0,013 0,000 0,461 0,000 0.244 0.227 0,250 ¿x. e (-‘Cc) 0.000 0,000 0,000 0,000 0,000 0.00(1 0,000 >4 e Q n) 1,4)00 0,993 0,996 0.969 0,915 1.00<) 1.000 5 Inri >4 / 0,612 0,607 0,498 0.176 0,305 0,214 0,750 >4 <4 (¡Do) 0,000 0,000 0,490 0,000 0,152 0.302 0,000 >4 ¼(¿50) 0,987 1,000 0,564 1,000 0,731 0,797 0,866 Est—6 (¡00) 0.000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,0<1<) (1,000 Est-6 (115) 1,000 0,987 0,992 0,938 0,837 1,000 1,000 5 bandas Est-7 0.375 0,369 0,248 0,031 0,093 0,046 0.563 Est—9 (1 4>4>) 0,000 0,000 0,240 0,00<) 0,023 0,091 0,000 Est-9 (84>) 0,975 1,000 0,318 1,000 0,535 0,636 0.750 - Alejo nulo o ausenciade banda.N: númerototal de individuosanalizados.DEH: “Dehesóndel Encinar”, VG: “Vega dcl Guadiana”.GRL: “La Generala”,CR: “Laguna del Cristo”, ORO: “Oropesa”. NC: “Embalse deCitruén¡go”.NR “Las BárdenasReales”. 2.2.2Análisis de li2amniento al sexo Seha realizadounapruebade x2 de independencia,paraestudiarla posiblerelación de estosloci con el sexo,considerandolas hipótesisde un controlgenéticode tres,cuatro o cinco loci para la zona IV de esterasas.En ningún caso se han observadorelacionesde 80 ligamiento significativas,por lo que podemosconsiderarque estosloci se comportancomo independientesdel sexo. 2.2.3Estima de la variabilidad 2enéticaintrapoblacional 2.2.3.1 Indice dc latí poiimórflcos (1’> Comoestima de la cantidadde variaciónexistenteen cadapoblaciónhemoscalculado el indice de locí polimórficos según los criterios del 95% y el 99%, segúnlas distintas posibilidadesdecontrolgénicodeestazona. Los valoresde polimorfismoobtenidossegúnamboscriterios aparecenen la Tabla 13. Independientementede la hipótesisqueseconsidere,laspoblacionesDEH, VG y CR son las que mostraronun valor de 1’ inferior, alrededorde un 4% según el criterio del 95% y aproximadamenteun 8% para el criterio del 99%, excepto para la población “Vega del Guadiana”(VG), en la queel valor deL 4% permaneceinvariable.La poblacióncon un mayor nivel de polimorfismoesla de “Oropesa” (ORO):entre12% y 15,4%segúnlas hipótesis. Tabla13: Indicede loci polimárficosen en el casode tres,cuatroy cinco lcd. Hipótesis Índice DEll VG GRI. CR ORO NC NR X 3 Inri P095 4.2 4,2 8,3 4,2 12,5 8,3 8,3 7.1 (irZ4) P099 8.3 4,2 8,3 8,3 12,5 8,3 8,3 8.3 4 loci P<>95 4,0 4,0 8,0 4,0 12.0 8,0 8,0 6.9 (rn25) P099 8.0 4.0 8,0 8,0 12.0 8.0 8,0 8,0 5 Ion ~O.95 3.8 3,8 11,5 3,8 15,4 11,5 7,6 8,2 (n=z26) P099 1.6 3,8 11.5 7,6 15,4 11,5 7,6 9.3 n: número total de loci analiiados. DEH: “Dehesóndel Encinar”. yO: “Vega del Guadiana”. GRL: “La CR: “Laguna del Cristo”, ORO: “Oropesa”. NC: “Embalse de Citniénigo”. NB: “Las BárdenasGenerala”,, Reales”- 81 En términos generalespodríamos decir queel valor de polimorfismo para la especiese hallaentre6,9 y 8,2%parael criterio del95%y entre 8 y 9,8%parael del 99%. 2.2.3.2. Heterocigosidadgénicamedia La heterocigosidadgénicamedia, entendidacomo la mediadel númerode individuos heterocigóticosobservadospor loci, en el conjuntode todos los loci analizados,es unade las estimasmás frecuentementeempleadaspara analizar la variabilidad genéticaexistente entre las poblaciones.En todos aquelloscasosen los que no se podian diferenciar los individuos heterocigóticosde los homocigóticospara los alelos activos, se supuso la existencia de equilibrio de Hardy-Weinbergy por Jo tanto, la heterocigosidadgénica consideradaeslaheterocigosidadgénicaesperada. Los valoresobtenidosparatodas las poblacionesson muy similaresaunquesepuede resaltar que la población de la “Laguna del Cristo” (CR) tiene los valores de heterocígosidadgénicamediamásbajos(1,4%),mientrasque las poblacionesde “Oropesa” (ORO) y “La Generala” (GRL) sedanlas más variables (Tabla 14). Tabla 14: Heterocigosidadgénicamediaen % suponiendola existenciadetres, cuatroy cinco loci. 3 Inri (n=24) 4 md (n=25) 5 Inri (n26) DEll 2,08+1 97 1,99±1,89 1,93±1,83 VG 2,04±271 1,96±1,89 1 83+1 82 GRL 3,96±271 3,80±2,59 5.77±3,15 CR 1.46+1 22 140+1,17 1 34±1 13 ORO 4,29±2,53 405+2,43 4,74±2.36 NC 2,53±1,71 2,44±1,64 4,13±2,24 NB 2.59±1,81 2 50+1,77 233+1 70 Total 2,71±0,76 2,59±0,73 3,140,79 n: númerototal dc loci analizados. DEll: “Dehesóndel Encinar”. VG: “Vega del Guadiana”,GRL: “La Generala”.CR: “Laguna del Cristo”, ORO: “Oropesa”. NC: “Embalsede Citruénigo”. NB: “Las Bárdenas Reales”. 82 2.2.4. Estima dc la variabilidad eenética intcrpoblacional: Distancias 2cnéticas . Dendro2ramas Utilizandoel indice de Nei (1972> seha calculadola distanciagenéticaentretodaslas poblacionesparacadauna de las hipótesispropuestassobreel control genéticode la zona IV de esterasas(Tabla 15), Los resultadosobtenidosen los casosde considerarla existenciade treso cuatroloci parala zonaIV de esterasasson muy similares, observándosealgunasdiferenciascuandose comparancon los resultadosobtenidosparacinco íoci o en el caso de no asignarningún controlgenéticoa la zonaIV de esterasas. Todas las distanciasobtenidasson en general muy pequeñas,siendo nula entre el “Dehesón del Encinar” (DEH) y “Vega del Guadiana” (yo), en todos los casos. Las distanciasmayores obtenidasen todos los casosestánpróximas a 0,01. Las distancias mediassondel ordende 0,004ó 0,005. En la Figura 28 están representadoslos dendrogramasobtenidosa partir de las distanciasestimadas.En el casodequetreso cuatroJoci controlenla zonaIV de esterasasel dendrograniafue el mismo. En el caso de cinco loci sealtera la posición ‘La Generala” (GRL). Aunque todas las poblaciones son muy similares, hemos de destacar que independientementede la hipótesisconsiderada,hay dosgruposdefinidosy separadosentre si queson los formadosporVG, DEH y NB porun ladoy ORO y NC por otro (Fig. 28). 83 Tabla 15: Distanciasgenéticasinterpoblacionalesestimadassuponiendoque tres, cuatro o cinco loci controlanJazonaIV deeslerasas. Hipótesis 3 Inri DEll VG GRL CR ORO NC NB DElL 0.0000±0.0000 0.0000±0.0000 0,0050±0,0002 0,0045±0.0002 0,0036±0,0001 0,0048t0,0002 0,0017±0,0001 VG 0,0000±0,0000 0.0053±0,0002 0.0044±0,0002 0,003710,0001 0,0048±0.0002 0,0019±0,0001 GRL 0,0000±0,0000 0,0074±0,0003 0,0021±0,0001 0,0032±0,0001 0,0025±0,0001 CR 0,OOOOjO,0000 0,0019±0,o00I 0.0013±0,0000 0,0092t0,0004 ORO 0,0000+00000 0,0004±00000 0,00474-00002 NC 00000±0,0000 00067+00003 NB 0,000010.0000 X = 0,0638+0,0605 4 Inri DEI! ~ GaL CR ORO NC NB DEll 0.OOOOt.0,0000 0.0000±0.0000 0.0048±0.0002 0.0043±0.0002 0.0035±0.000l 0.004610,0002 0.00I7t0,000I VG 0,0000±0,0000 0,0050+0,0002 0,0042±0,0002 0.0035±0,0001 0,0046±0,0002 0,0018±0,000l GRL 0,0000±0,0000 0,0071±0,0004 0,0020±0,0001 0,0030±0,000I 0,002410,0001 CR 0,0000±0,0000 0,0018±0,0001 0,0012±0,0000 00087+0,0004 ORO 0,0000±0,0000 0,0004±0,0000 0,0045±0,0002 NC 0,0000±0,0000 0,0064±0,0003 NB 0,0000±0,0000 X= 0,0036+0,0004 5 Inr¡ DEll ~ GRL CR ORO NC NR DEll 0.0000±0.0000 0.0000~0.0000 0.0093±0,0003 00041±0.0002 0.0040±0,0002 ().0061Á10002 0.0007±0.0000 VG 0,0000±0,0000 00096+00004 00040-’-00002 0.0040=0.0002 0.006210,0002 0,0008+0,0000 GRL 0,0000±0.0000 0.0117±0,0005 00041+00002 0.0037±0,0001 0,0085±0,0003 CR 0 0000+0,0000 0.0025±0,000I 0,0029±0,0001 0,0075±0,0003 ORO 0,0000±0,0000 0,0009+00000 0,0052±0,0002 NC 00000±0,0000 0.0083±0,0003 NB 00000400000 X = 0,0650+0,0607 DEH: “Dehesóndel Encinar”. VG: “Vega del Guadiana”,GRL “La Generala”, CR: “Laguna del Cristo”, ORO: “Oropesa”.NG: “Embalsede Citniénigo”, NB “Las BárdenasReajes”. 84 a) 0,00’? 0,006 0,005 + --4 + 0,004 0,003 0,002 0,001 0,000 + + + ‘1 DEll VG NB GRL ORO NC it) 0,00’? 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0,000 DEll VG NB CR ORO NC GRL Figun 28: Dendrograinasobtenidospor el métodoUPOMA, enel casodequetazcna[V cte esterasas estécontroladapor: a) tresy cuatro lcd, b) cincolcd. DEH: ‘Dehesóndel Encinas”,VO: “Vega del Guadiana”,C}RL: “LaQenera1a~’,CR:“LagunadelCñsto” ORO: “Oropesa”, NO: ‘EmbalsedeCitxuénigo”,NR “Las HérdenasReales”. 85 3. ANÁLISIS DE CARACTERES MOLECULARES 3.1. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO La extracciónde ADN genómicosegúnel métodode Dellaportaet al, (1983)ha dado buenosresultados,ya que la cantidadde ADN obtenidaesdel ordende 0,6-1,4>iglml y su purezadel ordende 2, valorbastantepróximoal de purezaideal que es de 1,5, 3.2. PATRONESELECTROFORETICOS 3.2.1.Productosdc amplificación por RAPDs Los patroneselectroforéticosde los productosde amplificación obtenidoscon los oligonucleótidos 10-A, 1 -B y 1 8-F fueron invariablesen todas las poblacionesanalizadas. Con el restode los cebadores(5-B, 1 3-B y 7-F) los patronesfueronvariablesparaal menos unabanda.Estospatronesaparecenen lasFiguras29 y 30. El oligonucleótido 10-A proporcionala amplificación de ocho fragmentosdefinidos con tamañoscomprendidosentre2,400y 650 pb. Con el oligonucleótido1-B seobtienen12 fragmentos,de los que ocho, de 1.975 a 750 pb, ofrecen una buena resolución. La amplificación con el oligonucleótido1 8-F porporcionahastasietefragmentos,de los que se analizarontresporpresentarunamayorresolución(Figs. 29 y 30). Con el oligonucleótido5-B se han obtenido nuevefragmentosdefinidos,presentando variabilidadúnicamentelabanda6 de 1.275 pb (Figs. 29 y 30). El oligonucleótido13-B sirve de cebadorparala amplificaciónde al menos14 bandas, aunquesólo ocho de ellasofrecieronunabuenaresolución,con tamañoscomprendidosentre lSOOy IDO pb (Figs. 29y30). En estecasofueronvariableslas bandas2,3,5 y 8 de 1.700, 1 625, 1.400y 1 000 pb, respectivamente. De todos los fragmentos obtenidos con el oligonucleótido 7-F, sólo se han consideradolos de 1550, 1.275, 1.200 y 900 pb. La banda2, de 1.275 pb, resultó igualmentevariable(Figs. 29 y 30). 86 32.2 Productos de amplificación por PCR De la serie de bandaselectroforéticasoriginadascon la pareja de oligonucleótidos MAE í U- 1 L (ADNc del componenteC9 del complemento)se analizaronlas sieteque mostraronuna mayor resolución. Se ha observadola existenciade polimorfismo en las poblacionesde “Oropesa”(ORO) y “Embalsede Citruénigo” (NC) paralos fragmentos1, 2, 3 y 4 de 780, 700, 650 y 600 pb, respectivamente(Figs. 31 y 32). El empleode la parejade oligonucleótidosMA.E 6U-6L (ADNc de la proteína“heat shoek” de 7CKd) ha originadocuatrofragmentosdefinidospresentesen todoslos individuos de las cincopoblacionesanalizadasy porlo tanto, monomórficos(Figs. 31). En el casode los oligonucleotidosMAE LOU-10L (ADNc del gen del componentee-ii de la protamina)sehan obtenidoseis fragmentosde tamañoscomprendidosentrelos 850 y los 420 pb quefueron resultaroninvariablesen todaslas poblaciones(Figs. 31). La parejade cebadoresMAE SU-SL (ADNc de la proteínaHMG-T) no dio lugar a unaamplificación apreciablede ningún segmentode ADN por lo que fue desestimadapara esteestudio. 3.3. ESTIMA DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA MOLECULAR INTRA E INTERPOBLACIONAL 3.3.1 Frecuenciade la ausenciade las bandas Las frecuenciasde ausenciade los diferentesfragmentospolimórficos amplificadospor RAPDs y PCR semuestranen la Tabla 16, Como ya se mencionópreviamente,los patronesobtenidosparalos oligonucleótidos 10-A, 1 -B y 1 8-F son invariables,mientras que para los tres restantesse ha observado variaciónen algunosfragmentos.En total sonvariablesseisregionesde ADN con respectoa las 40 estudiadas. 88 Respectoa los fragmentosamplificadosporPCR, sólo se ha observadovariabilidaden cuatro de los 1 7 analizados,dándosela circunstanciade que todos ellos provienende la amplificaciónobtenidaa partir del ADNc del componenteC9 del complemento. Tabla 16: Frecuenciadc ausenciade los fragmentosamplificadospolimórficos porRAPDsy PCR. Oligonucleotido N0 fragmento Tamaño (pb) VG GRL CR ORO NC 5-B 6 1.275 0,8<) 0,49 0,75 0,62 0,20 13-B 2 1.700 0,29 0,36 0,28 0,21 1,00 3 1.625 0,08 0.04 0,31 0,29 1.00 5 1.41>0 0,04 0.14 0.24 0,00 0.81 8 1.000 0,00 <1,04 0,00 0,04 0,06 7-E 2 1.275 0,07 0,27 0,00 0,10 0,15 MAE IU—IL 1 780 0,00 0,00 0,00 0,54 0,15 2 700 0,00 0,00 0,00 0,54 0, 15 3 650 0,00 0,00 <).00 0,54 0,15 4 600 0.(>0 0,0<) 0,00 0,39 0.08 VG: “Vega del Guadiana”, GRL: “La Generala”, CR: “La Laguna del Cristo”, ORO: “Oropesa”. NC: “Embalsede Citruénigo”. 3.3.2. Análisis de ligamiento al sexo Se ha estudiadosi el polimorfismo paralos fragmentosde amplificaciónseencuentra relacionado con el sexo de los individuos analizados mediante una prueba x2 de independencia.Los valores de ~2 que se obtuvieronen todos los casosresultaronno significativos para un valor de p-A 0,0 0,0 0,0 0.0 0,0 0.0 1—B 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0 0,0 5—11 [1.3 11,3 11,1 11.1 11.1 11,1 13-B 25,0 25,0 37,5 25,0 25,0 27.5 *(375) *(500) *(375) *(375) (25.0) *(37,5) 7-F 25.0 25,0 0,0 25.0 25,0 20.0 184 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0 0,0 P 10,0 10,0 t0,<) 10,0 10,0 10,0 *(12,5) *(15,0) *(10,0) *(12,5) *(10,0) *(12,<)) PCR MAE IU-IL 0.0 0,0 0,0 57,0 57,0 22,8 MAE 6U-6[ 0,0 (~O (LO (LO 0$) 0,0 MAE 101J—IOL 0,0 0,0 0,0 0.0 0,0 0.0 P <>,0 0,0 0,0 23,5 23,5 9,4 PCR ~ Todos 7,<) 7,0 7,0 14,<> 14,0 9,8 RAPDs *(8,g) *(10,5) *(7,<>) *(15,g) *(144>) *(11,2) * Porcentajedc fragmentospolimórficosal 99%. 3.3.3 Estima de la variabilidad 2enética interpoblacional. Distancias 2CflétiCSS y árboles filo2enéticos Como medida de la variabilidad genética interpoblacional se han estimado las distanciasgenéticaspor medio del índice de Nei (1972) considerandolos resultadosdel conjunto (PCRy RAPDs) de los 58 fragmentosamplificados(Tabla 18). Las distanciasobtenidasvan desde0,0011 a 0,0258, con una media de 0,0129.Estos valoresson, engeneral,mayoresa los obtenidoscon marcadoresisoenzimáticos. Según estos resultados,la población másalejadaes la del “Embalse de Citruénigo” (NC) y las máspróximas“Vega del Guadiana”(VG) y la “Lagunadel Cristo” (CR) (0,0011) (Fig. 33), 92 Tabla 18: Distancias genéticasobtenidaspor el indicede Neí parafragmentosdeamplificación VG GRL CR ORO NC VG 0.0(>00±OÁ)00() GRL 0.0(117±0.00000.0000±0,0000 CR 0.0011±0,00000.0025±0,00000,0000±0,0000 ORO (>0116±0,00020.0123±0,0002 0,0116±0,00020.0000±0,0000 NC 0.0246±0,0004 0,0199±0,0003 00176+00003 0,0258±0.0005 00000+00000 X = O4>129+0,O(>29 VO: “Vega dcl Guadiana”. “Embalsc de Cilménigo” 0,021 GRL: “La Generala”, CR “Laguna del Cristo”, ORO “Oropesa”. NC. 0,004 0,003 0,002 0,001 0,0000,012 0,011 VG CE GEL ORO NC Figura 33 Dendrograma obtenido por el método amplifícacrnn. UPGMA para los fragmentosde 93 4. ANÁLISIS CONJUNTO DE LOS CARACTERES BIOOUIMICOS Y MOLECULARES Con la finalidad de obtenerunavisión del conjuntode los resultados,sehancalculado las distancias genéticas considerandotodos los marcadoresanalizadostanto a nivel bioquímico como molecular. Tanto las distancias genéticascomo los dendrogramas obtenidos,segúnlas diferenteshipótesisconsideradaspara la zona IV de esterasas,han resultadomuy similares,por lo que sólo presentamosuna tabla de las distanciasgenéticas obtenidas,asi como su dendrogramacorrespondiente(Tabla 19, Fig. 34). Las poblaciones del “Dehesóndel Encinar” (DEH) y “Las BárdenasReales” (NB) no han sido consideradas en esteapartadodebidoa que no fueronanalizadascon caracteresmoleculares. Los resultadosobtenidosen esteapanadoson parecidosa los obtenidossólo con RAPDs. Las distanciasgenéticasvan de 0,0021 a0,0186.La distanciamediaestimadaesdel orden de 0,0100. Las poblacionesmás próximas son “Vega del Guadiana” (VG) y la - “Laguna del Cristo” (CR), que a su vez estánmáspróximasa “La Generala”(GRL) que al resto. La población del “Embalse de Citruénigo” (NC) es la que presentauna mayor distancia al resto de las poblaciones.Estas relaciones son claremente visibles en el dendrogramade la Figura34. Tabla19: Distanciasgenéticasobtenidasconel indicedeNei paratodos los caracteresisoenzimáticos x molecularesanalizados,en el casode uncontrol génieodetres Ioci parala zonaIV deesterasas. 110 GRL CR ORO NC VG 0.0000±0,0000 GRL 0,0028±0.00000,0000+00000 CR 0,0021±0.00000,0040±0,00000,0000±0,0000 ORO 0,0092±0,000l0,0092±0,00010,0087±0,0001 0,0000±0,0000 NC 0.0186±0,00020,0149±0,00020,0127±0,0001 0,0181±0,00020,0000±0,0000 X = o,o100+o,ooi1 VG: “Vega del Guadiana”,GRL: “La Generala”, CR: “Laguna del Cristo”. ORO: “Oropesa”, NG: “Embaisede Citruénigo”. 94 Figura 34: Dendrogramaobtenido por el método ITPGMA parael conjunto de los caracteres tsoenñmáticosy molecularesen el caso de un controlgénicode tres loci para la zonaTV de esterasas 0,016 0,009 0,008 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0,000 - -— * - ‘--—~ - £ VG CR GEL ORO NC 95 DISCUSIÓN 1. CARACTERIZACIÓN CITOGENÉTICA 1.1. Cariotino Los resultadosobtenidosen estetrabajo indican que el número cromosómicode la especiees 2n=48 (Fig. 9) coincidiendocon lo señaladopor otros autores(Nygren et al., 1975;Cataudellaet al,, 1977; Herberovicetal., 1978;Hafez etal., 1978a). El número fundamental(NF=~86) y la morfologíade los cromosomas descritos(8 paresmetacéntricos,1 1 submetacéntricosy 5 acrocéntricos)no coincidencon los de otros autores.Sehan estimadovaloresde NF quevan desde90 (Mayr et al., 1986)hasta80 (Wolf et al., 1969). 1-lafez et al. (1978a) estimanun númerode brazoscromosómicosde 86 en un cariotipo que, salvo en la clasificaciónde un par cromosómico, esidéntico al de estetrabajo. Variosautoresjustifican estascontradiccionesen los cariotiposde las especiespiscicolaspor la dificultad de obtener buenas placas metafásicas,ya que suelen tener números cromosómico elevadosy cromosomasde pequeñalongitud (Gold, 1984; Hafez et al., 1978a). La poliploidía es un fenómeno raro en vertebradossuperiores, pero no en los inferiores, sobretodo en peces,donde se ha observadouna gran diversidaden cuantoal tamañodel genoma(Ohno et al., 1967; Wolf et al., 1969). Hay especiespoliploides en ciprínidos, cipriniformes(que incluyen a los anteriores)y teleósteosen general. Todos los datosexistenteshastael momento,tanto cariotipicoscomo de apareamientomeiótico y de análisis cuantitativossobreel contenidonuclearde ADN, permitenclasificar los cariotipos con lOO cromosomascomo tetraploides,mientrasque los diploides muestran,en general, 48-SO cromosomas(Ohnoet al., 1967; Schmídtkeet al., 1975).Todosestosdatospermiten asumirque la tencaperteneceal grupode las especiesdiploides de la familia (igv;ÁÁLÚk. La naturalezadiploide de la tencaestáavaladaademáspor los valoresdel contenidonuclearen ADN obtenidosporWolfet al. (1969)y Hafezet al. (1978b). 97 La ausenciade polimorfismoscromosómicosnuméricoso estructurales,sobretodo de fusioneso fisionescéntricas,observadaen estaespecie,coincidecon lo descritoen otros ciprínidos. Amemiyay GoId (1988, 1990)observanque, en contrastecon la gran diversidad morfológicaque presentanlos ciprinidos, los cambiosen el cariotipo sonmínimos. Estetipo de polimorfismoscromosómicosson,sin embargo,un procesofrecuenteen otrosteleósteos como los salmónidos,familia en la que,junto con la poliploidia, jueganun importantepapel evolutivo (Hartley, 1987).El monomorfismoobservadoen tencapuededeberse,entreotras razones,a una gran proximidad o similitud genéticaentrelas poblacionesanalizadas,como ya sediscutiráen los apartadosdedicadosalos caracteresbioquímicosy moleculares. 1.2. BandeoC. Tinción areéntica.TinciénconcromonúcinaA3 El patrónde bandeoC de la tenca muestrauna gran uniformidad, con una distribución de la heterocromatinafundamentalmentecentroméricay telomérica.Tambiénseobservaen posición intersticial en unos pocosbrazoslargos cromosómicos,así como algunosbrazos cortos completamenteheterocromáticos(Fig. 11). La región organizadoranucleolar es heteropienóticanegativa,como en otrasespeciespiscícolas(Admeida-Toledoet al., 1981; Moreira- Filho et aL, 1984) El patrón de distribución de la heterocromatinaobtenido en este trabajo es básicamenteel mismo que el descritopor Hafez (1979) y ademáscoincide con el patrón generalde vertebradosestablecidoporGoId et al. (1986).Paraestosautoresla mayoríade las especiesde peces poseencantidadesrelativamente pequeñasde heterocromatina, principalmentecentroméricay tambiéntelomérica.El patrónobtenidopor nosotrosmuestra pequeñasvariacionescuantitativasy cualitativascon respectoal de Hafez (l.c.), variaciones que pueden ser el resultadode la elevadavariabilidad que presentala heterocromatina constitutivaentodos los seresvivos estudiadoshastael momento(John, 1988). Sólo se ha observadovariaciónen el patrónde bandeoC parala presenciadel bloque heterocromáticode los pares cromosómicos6 y 8 (Fig. 11). Como era de esperar,las 98 frecuenciasde los distintos cariomorfos fueron muy similares en las poblacionesde “El Dehesóndel Encinar” (DEH) y “Vega del Guadiana” (VG), ya que la primera es una muestrade la segunda. La población del “Embalsede Cintruénigo’ (NC) presentóuna frecuenciagénica similar a la de estasdos poblacionesparael bloque heterocromáticodel par 6, estandoen todos los casospróximaaun valor de 0,75. Sin embargo,parael bloque del par cromosómico8, las poblacionesDEH y VG presentabanuna frecuenciade 0,5 mientras que en NC era 0,77 (Tabla 8). La población NC es diferente tambiéna niveJ bioquimicoy molecular La tinción argénticasólo ha teñido diferencialmentela región organizadoranucleolar localizadaen el par cromosómico3, comoya sediscutiráen el siguienteapartado. La tinción con cromomicinaA3 sólo permite identificar tres parescromosómicos:3, II y 15. La bandadel par 3 se correspondecon la región organizadoranucleolar. Esta diferenciaciónde la región organizadoranucleolarcon cromomicina A3 es frecuenteen peces,a diferenciade lo que sucedeen mamíferos(Amemiyay GoId, 1986). Las bandasde los pares II y 1 5 erantambiénheteropicnóticasparael bandeoC. Esto,junto con el hecho de que algunos centrómerosmostrarontambién pequeñasbandasfluorescentes,está de acuerdocon la similitud existenteentre algunospatronesde bandeoC y cromomicinaA3 (Schmidy Guttenbach,1988). La cromomicinaA3 se liga preferencialmentea regionescromosómicasricas en pares de basesG-C. El hecho de que sólo se hayanobservadotres parescromosómicoscon una bandafluorescentepodríaindicar quelos paresG-C estánhomogéneamentedistribuidospor el genoma,como se ha observadoen numerosasespeciesde pecesy anfibios (Schmid y Guttenbach,1 .c. ) - Se ha dadomuchaimportanciaal hechode que la cromomicinaA3 permiteel estudio de las regionesorganizadorasnucleolaresya que, a diferenciade la tinción argénticaque sólo tiñe aquellasregionesque hayansido activasen la interfaseprevia, la cromomicinatiñe 99 directamentela moléculade ADN y portantoesmásrepresentativadel númeroy tamañode dichasregiones. 1.3. Re2ionesoreanizadorasnucleolares Con las diferentestécnicasde tinción empleadasen estetrabajo, sólo ha aparecidoel par 3 como organizador nucleolar (Figs. 9, lO, 12 y 13), situándosela región NOR intersticialmente,como ya señalaronMayr et al. (1986)con tinción argénticay cromomicina A3. La observaciónde un par de nucleolos en núcleosinterfásicos, tanto con la tinción argénticacomode fluorescencia,esotro indicio de la existenciade un único par organizador nucleolar.Mayr et al. (1986)observaronun bajo porcentaje(1,5%) de núcleos interfásicos con tresnucleolos,explicándolopor la apariciónpocofrecuentede célulaspoliploides. Amemiya y GoId (1986) consideranque el que haya un único par cromosómico organizadornucleolaresuna condiciónprimitiva en el grupode los ciprinidos, de la que se ha derivado,en ciertasocasiones,la presenciade algún par adicional.Estahipótesiscoincide con la de Schmid (1978),para quienun único par organizadornucleolaresuna condición primitiva en la mayoríade los vertebrados, El polimorfismo observadoen cuantoal tamañoy la localizaciónde la regiónNOR se ha puesto de manifiesto con las técnicas de tinción convencional, argéntica y de fluorescencia,lo queindica que son modificacionesestructuralesy no funcionales;es decir, que no son variacionesdebidasa quese expreseun mayor o menornúmerode cistronesde la región organizadora nucleolar. Estas variaciones, que se pueden presentar en heterocigosisu homocigosis, a diferenciade lo señaladopor otros autores,paralos que estasmodificacionesse observansólo en heterocigosis(Thodeet al., 1985b; Martínezet al., 1991), puedentenersu origen en una duplicaciónde dicha región y/o en otro tipo de modificaciones,como pudieraserunainversióno unatranslocación.En cualquiercaso,son necesariosal menos dos fenómenospara explicar las variacionesobservadastanto en el tamaño del NOR (Figs. 12 b,c) como en su posición (Figs. 12 d). La frecuenciade 100 individuoscon unaconstituciónnormal en el par 3 esdel 48%. El 52%restantepresentanun fenotipodiferenteal establecidocomonormal e incluyen todos los tipos de modificaciones observadasparaestaregión, tanto si estánpresentesen heterocigosiscomo en homocigosis (Tabla 9t En otras especiesse han estimadofrecuenciasde individuos polimórficos para estalegión incluso máselevadasque las presentadasen estetrabajo, por ejemploun 69% para SÚ+,. /v.-Í~ y Jn.~ /r+v (Martínezet al., J991). La poblaciónquepresentóun mayor porcentajede individuos con polimorfismospara estaregión fue la de “Oropesa” (ORO) (75%), población que ademásresultó ser la más variable para caracteresisoenzimáticosy moleculares. La población con un menor porcentajefue la de “Las BárdenasReales”(NB) (25%) que tambiénpresentóun nivel de variabilidadbajo paracaracteresisoenzimáticos.En general,los porcentajesobtenidosen las distintas poblaciones se correspondencon los valores de variabilidad obtenidos para caracteresbioquímicos y moleculares,excepto en el caso de la población “Vega del Guadiana”(VG) que presentóun elevadoporcentajede individuos polimórficos para esta región,cuandoparalos otroscaracteresla estimade variabilidadfije baja. Este polimorfismo para la región organizadoranucleolar, que no ha sido descrito anteriormenteen estaespecie,pareceser un fenómenofrecuenteen peces. Actualmente existen datos suficientes como para apreciar la existencia de un comportamiento heterogéneode estasregionesen peces(Moreira-Filhoet al., 1984; Phillips e Ihssen,1985a; Sánchezet al., 1990; Lozanoet al., 1991).Las variacionesobservadassuelenseren cuanto al número de dosis, como se ha visto en xtL~Úmwí- (Morelli, 198 1); tamañode la región, género~~‘i>~-~ (Galetti et al., 1984) y localizacióndel NOR, comoocurreen &ftmkrm-úu- y wwt (Foresti et al., 1981). En ciprínidos no ha sido un fenómeno muy estudiadoy de hecho sólo existen referencias a dichos polimorfismos en ciprinidos norteamericanos(Amemiyay GoId, 1986, 1988, 1990a,b). lo’ Ritossaet al. (1966) consideranquela redundanciagenéticade las regionesde ADNr las hace más susceptiblesa que se produzcan sobrecruzamientosdesiguales y en consecuencia,duplicacionesy delecionesespontáneas,de tal manera que la cantidadde ADNr presenteen estas regiones puede sufrir modificaciones. La tendencia de los cromosomasportadoresde las regionesNOR a asociarseparaorganizarel nucleolo, puede facilitar el que se produzcansobrecruzamientosdesigualescontribuyendoa la variabilidad numéricaobservadaen estoscistrones(Ruiz, 1982). 1.4. Cromosomassexuales Los resultadosobtenidosen estetrabajono han mostradola diferenciaciónde ningún par eromosómicocomo par sexual, tanto en células mitóticas como meióticas.No hay ningún indicio de la presenciade parescromosómicosheteromórficos,tanto a nivel de la morfología cromosómicacomo de los patronesde bandeode los mismos, que permitan apuntar la existenciade cromosomassexuales.La ausenciade bivalentesheteromorfoso univalentes en metafase 1 es una confirmación adicional respecto a la ausencia de heterocromosomassexuales. En numerosasespeciespiscícolasla determinacióndel sexoparecesercompletamente poligénica, sin evidenciagenéticani citológica de heterogamiaen cromosomassexuales (GoId, 1979). El sistemade determinismo sexual poligénico en el que los genessexuales estánrepartidosen los autosomas,pareceser el másfrecuenteen ciprínidos (Hafez et al., 1978a). Aunqueno se ha determinadola presenciade heterocromosomassexualesmediantelas técnicas de tinción cromosómicaempleadasen este trabajo no se puede descartarsu existencia.De hecho,con las técnicasde bandeocromosómicosehan podido detectar,en algunoscasos,pequeñasdiferenciasestructuralesentrecromosomassexualesaparentemente homomórficos, como ha ocurrido en: i/<&ÚA. (Bertollo et al., ¡978), dpa~ñL~tíj~%ií~ (Moreira-Filhoet al., 1980)o q~ma~úI (Phillips y Lhssen,1985b), etc.. 102 2. CARACTERIZACiÓN BIOOUÍMICA SegúnNei (1973).Nei y Roychodhury(1972, 1974) y Lewontin (1974),la obtención de unaestimafiable de la variabilidadgenéticapresenteen las poblacionesnaturalesrequiere el análisis de un elevadonúmerode loci de una muestratomadaal azardel genoma. Por esto, uno de los objetivos de estetrabajo ha sido describire interpretargenéticamenteel mayor número posible de loci detectableselectroforéticamente,así como evaluar su capacidadpotencialde serutilizadosen análisispoblacionales. Dada la imposibilidadde realizarcruzamientosque nos permitan analizarla herencia de las diferentesbandas, la base genéticade los sistemasenzimáticosestudiadosdebe inferirse de los patronesobservados.Para su interpretaciónse usarontres criterios: 1) comparaciónde la expresiónde los loci en diferentesórganosy tejidos; 2) análisis de los datospoblacionales;3) comparaciónde los patronesde bandasobtenidoscon la estructura cuaternariay control génicodeproteínasanálogasdescritasen otrosteleósteos. En la determinaciónde la estructuracuaternariade los sistemasisoenzimáticos se ha tenido en cuenta que la presenciade bandasheterodiméricas,constituidaspor cadenas polipeptidicascodificadaspor diferentesloci, pone de manifiestola estructuradiméricade una enzima.Sin embargo,la ausenciade formasheterodiméricasno determinala estructura monoméricade la enzima, ya que el hecho de que no se detectenheterodímerospuede debersea quela enzimaseamonoméricao tambiéna que, aun siendodimérica, no seunan las cadenaspolipeptidicasde diferentesloci por tenerdiferente localizaciónsubcelular,o porqueel heterodímero,aunqueexista,no seafuncional. Tanto el control genéticoconjmo la estructuracuaternariade los diferentessistemas isoenzimáticosanalizados,coincidencon lo descritoen ciprinidos y teleósteosen general, exceptoparaAAT, ACPH, ADH, EST, IDH y ME, Los resultadosobtenidosparala enzimaAAT con respectoala existenciade una zona catódicay otraanódica(Fig. 18) son bastantesimilaresa los de otros ciprínidos, en los que 103 se relacionanlas zonascatódicasy anódicascon las fraccionessubeelularescitosólicasy mitocondrialesrespectivamente(Ferris y Whitt, 1977a, b; Woods y Buth, 1984). Estos autoresdescribenla existenciade un locus parala zonaanódicaen ciprínidos diploides, a diferencia de los dos loci descritos en tenca. Sin embargo, en numerosasespecies tetraploidesde la familia ~i4tÑí¿ÚL¿(del mismoordenque los ciprínidos), seobservanhasta tres loci para estazonaanódica(Buth, 1979). Según esteautor, la existenciade estostres loci en todas las especiesdel género J/S¿w’Én¿n puede representarla expresiónde una duplicación en tándem sobre uno de los loci duplicados previamentepor poliploidía, duplicación que puede habersedado en un ancestrocomún de la tribu Moxomastini y persistiren variaslineas. Dada la proximidad de las familias C~¡pírá½y U0k vúbi-, podemossuponerque la existenciade dos loci en la zona anódicade AAT en tencaprovengade una duplicación, directamenteen dicha especie,o derivadade una que se haya producido en un ancestro comúna estasdosfamiliasy que permanezcaen algunasespeciesde las mismas. Las fosfatasasácidasde la tenca parecenestar codificadaspor dos loci segúnlos resultadosobtenidosen estetrabajo (Fig. 19). En otros ciprinidos sólo se ha observado actividad para un locus (Ferris y Whitt, 1 977a, b; Buth y Burr, 1 978; Crabtreey Buth, 1981). Sin embargo,sehan descritodosloci en otraespeciediploide, 7-qníw~A~¿Ls. U9PflÚtdtit, cuyafamilia perteneceal mismoordenque los ciprinidos(Rainbothet al., 1986). La enzima ADH ha sido descrita como dimérica y con un control genético caracterizadopor la existenciade un único locusen la mayoríade los cipriniformes( Ferrisy Whitt, 1977a,b, c; Buth, 1979; Woodsy Buth, 1984),a diferenciade lo observadoen este trabajo,dondese han descritodos loci paraADH. En el género% seha observado un patrónde ADH similaral descritoen tencaparaestaenzima(Van der Banket al., 1989). Cruz et al. (1982) encuentranparaestasespeciesdel género(t2Úck’wá una granactividad ¡04 de la alcoholdeshidrogenasay atribuyena estola adaptaciónde las mismasa aguascon muy bajasconcentracionesde oxígeno. Una situaciónsimilar podríaestarocurriendoen tenca, especieadaptadatambiéna aguascon bajosnivelesde oxigeno. La enzima isocitrato deshidrogenasatiene dos zonas de actividad con diferente expresióntisular en tencaLa zonamáslenta, predominanteen corazón,estácodificadapor un locus. La zona másrápida, especificade hígado, estacodificadapor dos loci (Fig. 21). Estas dos zonas pueden correspondersecon las formas mitocondriales y citosólicas señaladasen otros ciprinidos, tales como en el que se ha descritola existenciade un solo locusparacadazona(Woodsy Buth, 1984). El hechode quese hayan descritodos loci parala zonaanódicade tencapuededeberse,al igual que en el casode la enzimaAAT, a que sehayadadouna duplicaciónen estaespecie,o bien a que existauna duplicaciónancestralque semanifiestesolo en algunasespeciesde la familia. Los resultadosobtenidosen estetrabajoparala enzimaME, sólo permitendecirque al menosexiste un locus para estaenzima. En otros ciprinidos se han descritodos zonas codificadasporun locus cadauna(Woodsy Buth, 1984). La diferenciaentreestosdatosy los nuestrospuede debersea haber obtenido una mala resolución para este sistema isoenzimáticoo bien a que realmentesólo hayaun locusactivo en tenca. Las esterasasson un sistema isoenzimático con baja especificidad de sustrato constituido por al menos diez isoenzimas,que se han agrupadoen cinco zonas, siendo variableslas correspondientesa la zonaIV. Estepatrónno se diferenciaen granmedidade lo descrito anteriormentepara estaenzima, si se tiene en cuentaque debido al elevado númerode bandasy zonasque presentaestesistemaisoenzimático,la mayoríade los autores sólo interpretanuna o dos zonasde las tres o cuatroque suelencitarse en otros trabajos sobre peces como barbos(Machordom, 1992) o salmónidos(Andersson et al., 1983). 105 Además,convieneseñalarquenosotroshemosteñido simultáneamentelas a y f3 esterasas, mientrasqueen muchosdeestostrabajosúnicamentesetiñe uno delos dossistemas. Respectoa la variabilidaddetectadaen la zonaIV de esterasas,en estetrabajosehan consideradovariasexplicacionesposiblesrespectoa sucontrolgenético,entreotrosmotivos para comprobarcomo puedeinfluir el que se de unau otra interpretaciónen las estimas finales de la variabilidad genéticatanto intra como interpoblacional.Aun en el caso de considerarla hipótesisdel númeromenor de loci que puedaexplicar la variación de esta zona(tresloci), hay queconsiderarla existenciade un alelo nulo, lo queno se ha descritoen otrasespeciesde peces,bien porquerealmenteno los hay, bien porquecorrespondena los loci quecontrolanaquellaszonasde esterasasqueno hansido interpretadas. 3. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR El análisisde los productosde amplificacióndel ADN genómicoha permitidoestudiar un total de 57 fragmentos(40 con RAPDs y 17 con PCR).De estos57 fragmentos,sólo 10 resultaronvariables,correspondiendoa fragmentosamplificadoscon los oligonucleótidos5- 8, 13-8, 7-F y MAE 1 U-IL. Estavariabilidadsedetectacomopresenciao ausenciade los fragmentosamplificadosanalizados. Las ventajasde la amplificaciónpor RAPDsparacuantificar la variabilidad genética serían:el númeroilimitado de oligodecámerosde secuenciaaleatoriaque se puedenemplear asi como el quelos fragmentosdeADN amplificadosseránunamuestramásrepresentativa del genoma,ya que corresponden,en principio, a cualquierregión del genoma,sea o no codificadora, secuenciasúnicaso repetidas,debido a que los oligonucleótidosempleados comocebadoresamplificarántodasaquellasregionesque presentenuna secuenciabastante homóloga,si bienpresentael inconvenientede comportarsecomocaracteresdominantes., Las parejasde oligonucícótidosde genesespecificoscorrespondena secuenciasde genesestructuralesde J1~h.-¿ <)víhwÑ. Evidentemente,el fragmentode ADN amplificadoen 106 tencano tiene por qué serhomólogoal de trucha arcoiris,dado que pertenecena taxones diferentes,Además,dadaslas condicionespocorestrictivasde anillamientode los cebadores (45 o(’) se puedenamplificar fragmentosde ADN no necesariamentehomólogos,porlo que la identificaciónde la secuenciade truchacomo uno de los fragmentosobtenidosde tencase hacemásdificil. Esto nos permiteconsiderarla posibilidad de que el comportamientoen la amplificacióndel ADN a partir de estoscebadoressepuedaasimilaral de los “RAPDs”, ya quealgunosde los fragmentospuedencorrespondera genesde secuenciaespecíficay otros ser fragmentosde cualquierregión del genomaque presentenuna secuenciasemejantea la del cebadorempleado,aunquetambiénpuedesucederque estosgenesestructuralestengan másde unacopia. Aun asi, podríamos considerar la posibilidad de que el fragmento 2, de aproximadamente700 pb, obtenidoa partir de la parejade oligonucleótidosMAE 1 U- 1 L se correspondaa una secuenciahomólogaa la detruchaarcoiris,dadala similitud de longitud y el que seael fragmentomásamplificado. Igualmente,el fragmentode 620 pb obtenido con la pareja de cebadoresMAE 6U-6L, podría tener una secuenciahomóloga a la correspondienteal ADNc de la proteínade choquetérmico de 70 Kd de truchaarcoiris.Una situación similar se daría para la banda 5, con un tamaño aproximadode 600 pb, y procedentede la amplificación con MAE 1 OU-IaL. No obstante,para confirmar la homologíaserianecesariorealizarpruebasde hibridacióny secuenciación. En los patroneselectroforéticosde los fragmentosamplificadosde ADN que hemos consideradoválidos para el análisis genético, se ha observadovariación en cuanto a la presenciao ausenciade determinadosfragmentos.Es probable que esta variación se produzcaen la secuenciahomólogaa la del cebadory no en la zonainternadel fragmento amplificado. Es de esperarque aquelloscambiosque se produzcandentro del fragmento amplificadono afectenal procesode reconocimientode la región homólogaal cebador,Sin embargo,podrían ser detectables,por ejemplo, aquellasmodificacionesque se den en la 107 región interna del fragmentoy que afecten a su tamaño. En estecaso se observariala aparición de un fragmento amplificado con un tamaño mayor o menor que el original (variación que no se ha detectadoen estetrabajo), o también la desapariciónde la banda debidoa que el tamañodel fragmentoiberalo suficientementegrandecomo parano poder ser amplificado con la técnica empleada.Las modificacionesque se den en la región homóloga a la del cebadorpodrían debersea delecioneso insercionesque afecten a la secuenciadiana del ADN molde, a la sustitución de algunabase o incluso también a la existenciade algunatranslocacióno inversiónque afectea dichazona, aunqueestaúltima posibilidad no estanprobabledebidoa su pequeñalongitud (10 ó 17 pb). 4. ANÁLISIS DE LA VARIABILiDAD GENÉTICA 4.1. Variabilidad ilenéÉiCa intrapoblacional: Indice de nolimorfismo. Heterociposidad 2énícamedia . Los resultadosobtenidosen estetrabajoa nivel bioquímicomuestrancomode los diez sistemasisoenzimáticosestudiadosen el análisis poblacional(Tabla 10), sólo uno, el de esterasas,presentóvariabilidad. El hecho de que sólo haya variaciónpara estesistemaha sido descritoen otrasespeciespiscícolas,como ~&iá&¿ ~u/vÑÉt&iwc¿%,(Berrebiet al., 1988) y v~(’t4’fhtl¿1 dp kw>. (Ferguson,1981).Además,estesistemaisoenzimáticosueleservariableen la mayorpartede las especiesen las que seha analizado(Kornfield et al., 1981; Andersson et al., 1983: Hallermanet al., 1986; Hindar et al., 1986; Seebet al., 1987; Ammermany Morizot, 1989). El que las esterasasconstituyanun sistemaenzimático normalmentepolimórfico se explicapor su naturalezay actividad.En general,las restantesenzimasanalizadastienenuna actividadcatalíticamuy especifica,fundamentalparala vida del organismo,correspondiendo a rutasbioquímicasconcretase importantesy además,suelenestarcontroladaspor un bajo número de loci. Sin embargo,las esterasaspresentanuna baja especificidadde sustrato, ios actúanen ciclos muy variadosy dadasu gran versatilidadestáncontroladaspor un gran númerode loci. En cierto modo es lógico queestesistema,u otros similares, presentenmás frecuentementevariantesalélicasneutraspara el organismo.El hecho de que haya unos sistemas isoenzimáticos muy variables y otros monomórficos pone de manifiesto la necesidadde realizar las estimasde la variabilidad genéticacon el mayor número de loci posible (Nei, 1973; Lewontin, 1974), para disminuir el error que se puedetener en el muestreode estossistemasisoenzimático. Respectoa los caracteresmoleculares,de los seisRAPDs, tresmostraronvariabilidad mientrasqueen el casode las tresparejasde cebadoresusadasen PCRsólo dio fragmentos polimórficosunade ellas, MAE IU-IL (Tabla 16). Los loci isoenzimáticosy los fragmentosde ADN examinadosen el presenteestudio no fueron seleccionadosde acuerdocon ninguna información previa respectoa si son sistemasvariableso no, por lo que sepuedeconsiderarque proporcionanunaestimafiable de la variabilidadgenéticapresenteen poblacionesespañolasde tenca. Los valores de polimorfismo obtenidos en este trabajo para los caracteres isoenzimáticosy moleculares(Tablas13 y 17) son,engeneral,bastantesimilares. A la vistade los resultados,podríadecirseque los indicesde polimorfismo obtenidos con RAPDs son algo superioresal resto. Esto es lógico ya que, apartede considerarun númeromayor de marcadores(40 fragmentos),éstospuedencorrespondera secuenciasno codificadoras(intrones,secuenciasaltamenterepetidas,etc.) y por lo tanto seruna muestra más representativadel genomay, en consecuencia,ofreceruna estima de la variabilidad genética más real. A pesar de esto, las diferencias observadasentre las estimas de polimorfismoobtenidasporRAPDseisoenzimasson pequeñas,lo quepodríadebersea: - la variabilidadgenéticaexistenteen las poblacionesestudiadasse correspondecon la estimaobtenidaen estetrabajo, lo que implicaríaque el aumentarel númerode marcadores estudiadosno conlíevariaun aumentode las estimas. 109 - con RAPDs sólo se detectan aquellas variaciones que afecten a la secuencia homólogaal cebador(1 Opb) o al tamañodel fragmentoa amplificar, mientrasque con las isoenzimasse detectantodas las variaciones que puedan encontrarseen la secuencia codificadoray que afectena la carganetade los aminoácidos. En el caso de las estimasobtenidaspor PCR, es importantedestacarque hubo dos poblaciones(ORO y NC) que presentaronun indice de polimorfismo muy elevado(22%) mientrasquedichovalor fue nulo (0%) en el restode las poblaciones,de tal formaque para las primeraspoblacionesel valorestimadofue superioral de RAPDs e isoenzimasy paralas últimas, inferior. Esta técnicaamplifica teóricamentefragmentosque se correspondencon genes de secuenciaúnica, de tal forma que se esperaríaobtenerestimas similares a las calculadascon isoenzimas,e incluso inferiores, debido al tipo de variacionesque permite detectar (indicadas en el párrafo anterior). Esto justificaria que con las parejas de oligonucleóticosMAE ÓU-6L y MAE IOU-1OL todaslas poblacionesseaninvariablesy que para el par MAE i U- i L hayatres poblacionestotalmentemonomórficas.De hecho,si se haceuna estima del polimorfismo considerandosimultáneamentelos fragmentosobtenidos por RAPDs y PCR, el resultadoes prácticamenteigual al obtenido por isoenzimas.Sin embargo,hay que teneren cuentaque todoslos fragmentosobservadosparaPCRno tienen por qué correspondera genes de secuenciaúnica, ya que puede habersedado algún anillamientoinespecíficode los cebadoresa otrasregionesdel ADN, y portanto, comoya se indicó anteriormente,comportarsede formaparecidaa los ‘RAPDS”, con lo quepartede la variabilidaddetectadano corresponderíaa los genesde secuenciaunica. El queparaPCR hayadospoblaciones(ORO y NC) con un alto nivel de polimorfismo (22%) esexplicable por serdos poblaciones,sobretodo ORO, que mostraronun elevado valor de variabilidad genéticaparatodoslos caracteresanalizados,inclusocuandoseestima laheterocigosidadgénicamediaparacaracteresisoenzimáticos. 110 botella”, favorecidospor el hábitat restringido de estaspoblaciones.Lagunasde tamaño finito, aisladasde los sistemas de drenaje, son hábitat inestables, tendentesa sufrir desequilibriosecológicos,tantonaturales(sequía)como artificiales(pescamasiva). Las estimasobtenidasen estetrabajo, tanto paralos indicesde polimorfismo como parala heterocigosidadgénicamedia, soninferioresa las descritasparaestetaxón: un índice de loci polimórficosdel 15,2%y una heterocigosidadgénica media de 5,13% (Nevo, 1978) ó 5,4% (Avise y Aquadro, 1982). Sin embargo,los valores observadospara tencaestán dentrodel rango descritoen ciertasespeciesde teleósteos,sobretodoen las de aguadulce: entre un O y un 4% en variasespeciesde ciprínidos (Avise, 1 977a, b); un 12% en (Machordom, 1992) y entre el O y el 9% en varias poblacionesfrancesasde {3Ñ4k¡£ ~-rtiia’,~h (l3errebi et al., 1988). Respectoa la heterocigosidadgénica, Avise (197/a,b) estima en ciprinidosunaheterocigosidaddel O al 15,4%con unamediadel 5,2%. Cataudella et al. (1986)observanunaheterocigosidadgénicadel 2% en ¿‘~gi,trwñ mnpk~ y Crossy Ward (1980) del 3% en poblacionesnorteamericanasde salmones,estimaque segúnAnderssonet al, (1981)esdel ordendel 1 ó 2% en el nortede Europa. Además, en estetrabajo no se han encontradodiferenciasmuy marcadasentre el indice de polimorfismo al 95% y al 99 %, a diferenciade lo observadoen otras especies (‘i’Kp¡~ &r<*’tyac), dondeel porcentajede polimorfismovariadel 13,9%a 38,9%. (Andersson etal., 1981) 4.2. Identificación de poblaciones Entre todos los loci isoenzimáticosy fragmentosde ADN amplificadosno se ha podidoidentificarningún marcadorqueestéexclusivamenteen algunapoblación,pero si hay caracteresque al menos permiten rechazarla pertenenciade los individuos a algunas poblaciones,como es el caso de la bandaEST-9 (80), que no aparecenunca en las poblacionesVG y CR, mientrasqueen el restolo hacecon unafrecuencialo suficientemente 112 grande como para considerarque si se estudia una muestrade estas poblacionesse detectaríadichabanda. Respectoa los caracteresmoleculares,la presenciaen algún individuo de los fragmentosde 1 700 y 1625 pb obtenidoscon el oligonucleótido 13-B, permiterechazarla posibilidad de que la población sea la del “Embalsede Cintruénigo” (NC). Asimismo, aquellasmuestrasde poblacionesen las que seobservela ausenciade las bandasde 780 a 600 pb del oligonucleótidoMAE 1 U- 1 L permiterechazarla posibilidad de que pertenezcan a las poblaciones“Vega del Guadiana” (VG), ‘La Generala” (GRL) o “La Laguna del Cristo” (CR). La ausenciade la bandade 1400 pb del oligonucleótido13-B indicaríaque la muestrano perteneceala poblaciónde “Oropesa”(ORO). Estoscaracterespuedenservir de diagnósticoparapoderdiferenciarunaspoblaciones de otras, lo que esde gran importanciaen la determinaciónde si la poblaciónque seestá estudiandoperteneceo no adiferentes“stocks”. 4.3. Variabilidad 2enét¡cainternoblacional: Distancias 2enéticas.Dendrogramas En este trabajo se han obtenido las estimas de las distancias génicas medias interpoblacionalesparacaracteresisoenzimáticos(Tabla 1 5), moleculares(Tabla 18) y para el conjuntode todos los marcadores(Tabla19). En el primercasoseobtieneuna mediadel ordende 0,003 ó 0,005 segúnla hipótesisconsideradaparalas esterasas,en el segundocaso de 0,0 129 y en el tercerode 0,0100. En el caso de las distanciasgenéticasestimadaspara los caracteresisoenzimáticos, los valoresglobalesobtenidossegúnlas diferenteshipótesisde control genéticode la zona IV de esterasasson, en general,muy similares, siendo del ordende 0,0000 a 0,0127 como máximo. Sin embargo,existendiferenciasrespectoa cuálesson las poblacionesque están másdistanciadas,lo que se observamásclaramenteen los dendrogramas.Del mismo modo seobservaquelasdistanciasobtenidascon isoenzimaso fragmentosdeADN no son iguales, siendoademás,en el último caso,mayores. 113 Estosresultadosponende manifiestolas diferenciasque puedenobtenersecon un tipo de marcadoresu otrO. Porestoconsideramosqueel resultadomásfiable esel que considera el conjunto de todos los caracteresanalizados,ya que las distanciasy los dendrogramas obtenidosno varían con las distintas hipótesisconsideradaspara las esterasas.Se podría pensar,que al teneren cuentatodos los marcadoresse reduceel error que conlíevauna interpretaciónerrónea del control génico de las enzimas así como el considerarunos carateresque realmenteno constituyanuna muestraal azar del genoma.Además, las distancias y el dendrogramafinal son muy parecidosa las obtenidaspara caracteres moleculares,lo que indica que cuantomayor seael númerode marcadoresestudiados(57 fragmentos de ADN frente a unos 24 loci isoenzimáticos), aparte de su mayor representaciónde una muestradel genoma,el error que se puedetener en las estimas confirma lo señaladopor Nei (1987)respectoa que pararealizarunaestimacorrectade las diferenciasgenéticasentrepoblacionesmuy relacionadasesnecesarioexaminarun elevado númerode marcadores. Las distanciasgenéticasestimadaspara caracteresisoenzimáticosestán,en general, dentrodel rango(0,002a 0,065) indicadopor Shakleeet al. (1982)parapoblacionesde un gran númerode especiespiscícolas,tanto de aguadulcecomo salada.Pordebajode este rango, las poblacionespuedenserconsideradasde un mismo “stock”. En cualquiercaso,las estimasobtenidasen estetrabajopuedenserconsideradasbajas,ya que,en general, estánen el limite inferior de estasdistancias.No sepuederealizaruna comparaciónsimilar con las estimasobtenidaspara caracteresmoleculares,ya que estos rangosse han establecidoa partir de los estudiosbioquímicosexistenteshastael momento,estudiosque no existenpara fragmentosde amplificación de ADN genómico en peces. Aun así, y a la vista de los resultadosobtenidosen estetrabajo, podríamosdecir que las poblacionesDEH, VG, NB, GRL y CR pertenecena un mismogruporeproductoro “stock” mientrasquelas poblaciones 114 NC y ORO, que puedenperteneceral grupo anterior, por precauciónno deberíanser consideradascomoun mismo “stock” de cultivo. Distanciassimilaresa las obtenidasen estetrabajo paraloci isoenzimáticoshan sido descritasen otrasespeciesde teleósteos:0,003 en lÚLitkwt a4Á¡raz¿ (Anderssonet al., 1981) 0,001 en .4½-Á¿ ¡-?tx (Rymany Stahl, 1981),0,002 en rrnrv+ (Okazaki, 1986); ~,t.:/tíL1 ‘>-t~ 0/1 ~iw= (Crozier, 1987), bijrnúni¿t¿ pL- 1ft14u. (Brulé, 1 989) y ¿t4i.~t« ) Experientia,37: 953-954. ALT(JKHOV, Y.P. (1981). “Ihe stock concept ftom the viewpoint of population genetics”. Can. J. Fish. Aquat. Sri., 38: 1.523-1.538. ALVAREZ, Mt.; CANO, .1. y THODE, G. (1980). ‘DNA content and chromosome complementof (i-~.-n.~uí-> --t-~<ñá ((?rn.mw ,JoAak,Perciformes).Caryologia,33: 267-274. 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