RT Dissertation/Thesis
T1 Impacto del estrés térmico y del daño nuclear espermático en la viabilidad embrionaria y en la proporción de sexos en el ratón
A1 Pérez Crespo, Miriam
AB El estrés térmico y la fragmentación del ADN espermático son dos factores muy influyentesen la fertilidad de los animales domésticos. El estrés térmico afecta tanto a la calidad embrionariacomo a la calidad seminal. Sin embargo, en lo que respecta al desarrollo embrionario, no seconoce con precisión cómo afecta a los estadios tempranos de desarrollo y si los embriones dediferente sexo pueden responder de distinta forma al citado estrés. En cuanto a los gametosmasculinos, se conoce muy poco cómo el estrés térmico puede afectar la calidad espermática, ylas consecuencias que puede desencadenar en los embriones resultantes de la fecundación conestos gametos. Uno de los parámetros a tener en cuenta cuando se habla de calidad espermáticaes la fragmentación del ADN de los espermatozoides (una de las consecuencias del estréstérmico); no se conoce de forma precisa la relación existente entre este parámetro y la capacidadfecundante de los espermatozoides ni los efectos que para el desarrollo embrionario puede tener.En este trabajo se planteó, en primer lugar, conocer cuáles son las diferencias en lasusceptibilidad al estrés térmico entre embriones de distinto sexo durante el desarrollopreimplantacional y determinar cuáles son los mecanismos moleculares responsables de lascitadas diferencias; en segundo lugar, determinar cómo el estrés térmico puede alterar tanto eldesarrollo embrionario preimplantacional (in vivo e in vitro) así como la espermatogénesis,utilizando como modelo experimental el ratón; y en tercer lugar, averiguar qué condiciones puedenfavorecer un aumento en el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado y lasconsecuencias sobre el desarrollo embrionario y fetal, ya sea tras la utilización de la monta naturalo mediante una técnica de reproducción asistida, como es la inyección intracitoplasmática deespermatozoides (ICSI). Para abordar estos objetivos, se diseñaron tres ensayos.En el primer ensayo se analizó el efecto del estrés térmico sobre embriones producidos invitro e in vivo; utilizando, por una parte, embriones cultivados in vitro, y por otra parte, aplicando elestrés térmico sobre las hembras en los primeros días de gestación (in vivo). En primer lugar seanalizó la supervivencia de los embriones de sexo masculino y femenino tras la aplicación delestrés térmico in vitro, observándose un incremento en la supervivencia en los embriones de sexofemenino. Otra de las diferencias observadas entre embriones de distinto sexo cultivados in vitrobajo las citadas condiciones, fue su velocidad de desarrollo; los embriones de sexo masculino sedesarrollaron más rápidamente que los de sexo femenino. Con el fin de evaluar cuáles pueden serlas causas de la diferente supervivencia entre embriones de distinto sexo, se procedió adeterminar la concentración relativa de peróxido de hidrógeno (H2O2) en embriones en estadio demórula sometidos a estrés térmico in vitro, y posteriormente se analizó el sexo de los mismos,observándose que en los embriones de sexo masculino la concentración relativa de H2O2 erasuperior a la observada en los embriones de sexo femenino sometidos al estrés térmico. Por otraparte, otro grupo de embriones fue cultivado in vitro a 37ºC hasta el estadio de blastocisto,determinándose el sexo de los mismos y la abundancia relativa del ARNm de genes importantesResumenen el desarrollo embrionario. Se observó que la expresión de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa(G6pdx), un gen ligado al cromosoma X y relacionado con el estrés oxidativo, era mayor en losembriones de sexo femenino. Como hipótesis a contrastar, se planteó que la mayor supervivenciade los embriones de sexo femenino en estadios de desarrollo temprano, ante situaciones de estréstérmico, era debida a un aumento en la expresión G6pdx a diferencia de lo que ocurre en losembriones de sexo masculino. Para evaluar el posible efecto protector frente al estrés térmico dela actividad G6PD, se inhibió esta enzima a través de la utilización de dehidroepiandrosterona(DHEA). Se comprobó que, tras la inhibición de G6PD, las diferencias inicialmente observadasentre embriones de distinto sexo cultivados in vitro y causadas por el estrés oxidativo provocadopor el aumento de temperatura, desaparecían. Se demostró experimentalmente que G6PDinterviene en los mecanismos por los cuales los embriones de sexo femenino, en estadiospreimplantacionales, son más resistentes que los de sexo masculino ante situaciones de estréstérmico.En el segundo ensayo, se eligió también el estrés térmico como factor ambiental conimpacto sobre la fertilidad de los animales. En este caso, el estrés térmico fue aplicado de formalocal sobre los testículos de los ratones con el fin de evaluar el daño del estrés térmico sobre lascélulas germinales del testículo y los espermatozoides presentes en el epidídimo. En diferentesmomentos tras el tratamiento térmico (6 horas, 7, 14, 21, 28 días), se recogieron losespermatozoides de la cola del epidídimo y del conducto deferente y se evaluaron diferentesparámetros espermáticos. Paralelamente, se utilizó otro grupo de animales tratados paraestablecer cruces con hembras en los momentos señalados después del estrés térmico;adicionalmente, se evaluó el porcentaje de hembras gestantes, la tasa de implantaciónembrionaria y el sexo de los fetos concebidos por estos machos. Los resultados indicaron que untratamiento térmico moderado y por un corto período de tiempo afecta de diferente manera a losdistintos tipos de células germinales masculinas, produciendo un incremento de la fragmentacióndel ADN espermático en el período de 0 a 28 días después del estrés térmico. Cuando las célulasdañadas fueron espermatocitos, los animales eran subfértiles. Sin embargo, los espermatozoidesformados a partir de las espermátidas afectadas mostraron los niveles más elevados defragmentación del ADN, sin que la fertilidad de los machos se viera alterada. Cuando los afectadospor el estrés térmico fueron los espermatozoides presentes en el epidídimo, observamos unadistorsión de la proporción de sexos de la descendencia a favor de las hembras.En el tercer ensayo se persiguió como objetivo conocer los mecanismos implicados en lafragmentación del ADN espermático y a la vez, establecer las consecuencias que sobre eldesarrollo embrionario y la fertilidad del individuo tiene la utilización, mediante ICSI, de muestrasespermáticas con un elevado grado de fragmentación del ADN. Para ello, las muestras deespermatozoides recogidas de la cola del epidídimo y del conducto deferente fueron incubadas endiferentes condiciones antes de la determinación de la fragmentación del ADN espermático. Lascondiciones elegidas fueron tres: a) un medio habitualmente utilizado para la manipulación de losResumenembriones de ratón, medio M2; b) un medio llamado medio condicionado (MC), en el que seencuentran todos los componentes (p.ej. endonucleasas) liberados por espermatozoides a los quese les ha dañado su membrana plasmástica mediante congelación-descongelación, en ausenciade crioprotectores y c) el medio MC suplementado con EDTA, quelante de Ca2+ y Mg2+, cofactoresesenciales para la actividad de las endonucleasas. Observamos que el porcentaje deespermatozoides con ADN fragmentado es mayor en las muestras incubadas en MC respecto alvalor observado en el grupo control, sin embargo, este porcentaje no es diferente al del controlcuando los espermatozoides son incubados en MC suplementado con EDTA. En conclusión,existen factores presentes en los medios que contienen espermatozoides con daño en sumembrana plasmática capaces de inducir fragmentación del ADN en espermatozoides tratados.Estos factores necesitan la presencia en el medio de iones, como el Ca2+ o el Mg2+, para poderactuar. Finalmente, las muestras incubadas en MC en las que habíamos observado un incrementode la fragmentación del ADN espermático, se utilizaron para fecundar ovocitos mediante ICSI,utilizando como control espermatozoides no incubados. Tras la realización de ICSI, se observóque la incubación de los espermatozoides en MC no afectaba a la tasa de fecundación, ni alnúmero ni a la morfología de los blastocistos; sin embargo, la tasa de implantación se viosignificativamente reducida, lo que indicó un efecto negativo sobre la calidad embrionaria que semanifiesta en estadios perimplantacionales. Concluimos que los factores liberados porespermatozoides con la membrana dañada pueden, además de inducir fragmentación del ADN enlos espermatozoides tratados, reducir los porcentajes de implantación de los embrionesproducidos con dichos espermatozoides.
PB Universidad Complutense de Madrid, Servicio de Publicaciones
SN 978-84-693-1840-9
YR 2010
FD 2010-03-25
LK https://hdl.handle.net/20.500.14352/47224
UL https://hdl.handle.net/20.500.14352/47224
LA spa
NO Tesis de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria, Departamento de Medicina y Cirugía Animal, leída el 21-05-2009
DS Docta Complutense
RD 21 abr 2025