%0 Thesis
%A Solís González, María Teresa
%T Reprogramación del polen a embriogénesis inducida por estrés: identidad celular, muerte celular programada y papel de la metilación de DNA
%D 2012
%U https://hdl.handle.net/20.500.14352/48076
%X El desarrollo del grano de polen es un proceso estrictamente regulado a nivel génicoque conduce a la formación de un organismo haploide, el gametofito masculino ograno de polen, cuyas células poseen una alta especialización, necesaria para suimportante función en la germinación del tubo polínico y doble fecundación de lasplantas con flores. Mediante la aplicación de un tratamiento de estrés in vitro en laetapa adecuada del desarrollo, concretamente en la fase de microspora vacuolada, lamicrospora puede desviar su ruta de desarrollo gametofítico hacia una rutaembriogénica con la formación de un embrión haploide, proceso conocido comoembriogénesis del polen, que representa una importante herramienta biotecnológicaen mejora vegetal para la obtención rápida de plantas doble haploides, líneasisogénicas y nuevas variedades. Este proceso se ha puesto a punto en numerosasespecies, sin embargo, su rendimiento es muy bajo en algunas plantas de interéseconómico, ya que todavía son poco conocidos los mecanismos celulares ymoleculares que intervienen en el cambio de programa de desarrollo. El desarrolloesporofítico y gametofítico del polen en la antera está asociado al correcto desarrollodel tapetum o tejido nutricio de la antera, que una vez finalizada su función sufre unadegeneración mediante muerte celular programada (MCP).En esta Tesis se plantea el estudio de diferentes aspectos de la fisiología delproceso de embriogénesis del polen en comparación con el desarrollo gametofíticodel polen, con el objetivo de comprender los mecanismos que controlan lareprogramación celular, la adquisición de competencia embriogénica y la identidadcelular mediante tratamientos de estrés, centrándose el estudio en la identificación demarcadores de embriogénesis, la dinámica de la pared celular, la metilación del DNAy los sucesos de muerte celular programada (MCP). Por otro lado, debido a laimportancia de la MCP y la metilación del DNA durante la reprogramación aembriogénesis inducida por estrés, se plantea también el estudio de la dinámica deestos dos procesos durante la diferenciación del polen in vivo, especialmente, duranteel desarrollo y MCP del tapetum.ResumenEl material empleado para este estudio han sido diferentes sistemas vegetales, enfunción de los objetivos perseguidos en cada caso. Así, por un lado, se han utilizadoespecies herbáceas, modelos del proceso, en las cuales se han establecido eficientessistemas de cultivo in vitro como Brassica napus y Nicotiana tabacum, y por otro lado, unárbol frutal, Olea europaea, con un mayor interés aplicado, en el que los sistemas decultivo in vitro, están todavía en desarrollo. La comparación entre especies modelo yárboles, puede ser muy útil en el desarrollo y mejora de nuevos sistemas in vitro, porextensión de conocimientos entre especies.El abordaje experimental ha consistido en el desarrollo de cultivos in vitro demicrosporas aisladas y el empleo de diversas técnicas: a)citoquímicas para ladetección in situ de diferentes componentes celulares (Calcofluor White para celulosa,I2KI para almidón y Azul de Evans para detección de muerte celular),b)inmunocitoquímicas con anticuerpos específicos que reconocen pectinas condiferente grado de esterificación (Jim7 y Jim), RNA total (anti-RNA), citosinasmetiladas (anti-5mdC) y MCP (caspasa 3), c)ensayos inmunoquímicos de “Dot blot”y ”Western blot”, d)ensayos de actividad enzimática, e)estudios de expresiónmediante hibridación in situ fluorescente (FISH) y PCR semicuantitativa,f)electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) para cuantificar el grado demetilación global del DNA y g)herramientas de transformación transitoria con GFP.Para ello, se emplearon diferentes métodos de procesamiento de muestras, los cualesfueron adaptados para el material objeto de estudio en cada momento.Después del tratamiento de estrés inductor de la embriogénesis, las microsporas quereprograman su ruta abandonan su programa de desarrollo y adquieren competenciaembriogénica, sin embargo, aquellas otras que no son capaces de reprogramarse haciaembriogénesis, se paran y mueren. En esta Tesis, se ha optimizado el sistema decultivo in vitro de microsporas aisladas de Brassica napus para una mayor eficienciade inducción a embriogénesis mediante estrés a 32ºC, junto con el desarrollo de unametodología óptima para la germinación de embriones y su conversión a plantasResumenadultas. Al mismo tiempo, se ha desarrollado un nuevo sistema de cultivo in vitro enBrassica napus para la inducción eficiente de la embriogénesis a 18ºC, sistema en el quela microspora sigue dos rutas de desarrollo embriogénico diferentes y permitiráabordar el desarrollo de estudios comparativos entre ellas.Se han estudiado otras posibles respuestas al tratamiento de estrés inductor delas microsporas que no reprograman su ruta de desarrollo hacia embriogénesis,mediante el análisis de los niveles de muerte celular y marcadores de MCP durantelas primeras etapas del cultivo embriogénico, identificándose por primera vez lalocalización y actividad enzimática tipo caspasa. Los resultados muestran que lasprimeras etapas del cultivo se caracterizan por elevados niveles de muerte celular eindican que algunas de las células que no responden al tratamiento de estrés inductorde embriogénesis, siguen una ruta dependiente de “actividad caspasa 3 like”,sugiriendo que parte de los elevados niveles de muerte celular detectados en lasprimeras etapas del cultivo, podrían deberse a procesos de muerte celularprogramada (MCP), posiblemente desencadenados por el tratamiento de estrés. Laidentificación de rutas de muerte celular programada como respuesta al tratamientode estrés en cultivos de polen, serán de gran ayuda en el diseño de estrategias in vitroque puedan bloquear la MCP y que aumenten la viabilidad y la inducción deembriogénesis.Se han establecido marcadores moleculares y celulares que cambian con laidentidad celular y diferencian las células reprogramadas a embriogénesis en lasprimeras etapas del proceso, como son: la organización estructural idéntica de losnúcleos, la tabicación citoplásmica, la ausencia de almidón y la diferente composiciónde pectinas y celulosa de la pared celular.Los marcadores identificados son comunes para olivo y colza, sugiriendo que losmecanismos implicados en la reprogramación a embriogénesis son análogos enambas especies pudiendo ser empleados como herramientas para la monitorizaciónde procesos metabólicos implicados en la reprogramación y para la identificación deResumencélulas destinadas al programa de desarrollo embriogénico frente a aquellas otrascélulas que no responden al tratamiento inductor.Las pectinas son un componente principal de las paredes celulares, su modificaciónpor la enzima pectinmetilesterasa (PME) actúa regulando la estructura y la rigidez dela pared celular. En este trabajo, se ha analizado la dinámica de la esterificación depectinas y el patrón de expresión de la BnPME durante los dos programas dedesarrollo del polen, el desarrollo gametofítico y la embriogénesis de polen inducidamediante tratamientos de estrés. Los resultados obtenidos indican que las pectinasesterificadas y no esterificadas tienen patrones de distribución opuestos durante losdos programas de desarrollo, en relación a los procesos de proliferación ydiferenciación. Así, el polen maduro y las etapas más avanzadas del desarrolloembriogénico, con una mayor diferenciación celular, se caracterizan por elevadosniveles de pectinas desmetilesterificadas, así como de una alta expresión de BnPME;mientras que las microsporas inmaduras y las primeras fases de embriogénesis,asociadas con procesos de proliferación, presentan una mayor proporción depectinas altamente esterificadas y una expresión baja de BnPME. En base a estosresultados, los altos niveles de pectinas no esterificadas pueden ser consideradoscomo marcadores del desarrollo gametofítico, mientras que la presencia de pectinasesterificadas pueden emplearse como un marcador del desarrollo embriogénico delpolen, permitiendo la identificación de las microsporas inducidas y los primerosproembriones.El análisis de localización in vivo de la proteína de fusión GFP-PME en elmicroscopio confocal en hojas de tabaco transformadas transitoriamente, indica quela proteína PME es dirigida a las paredes celulares diferenciadas de las célulasepidérmicas y del mesófilo, donde presumiblemente realiza su actividad enzimáticasobre las pectinas in muro.ResumenLos mecanismos que subyacen a la reprogramación nuclear, implican cambios en laestructura de la cromatina y la expresión génica de todo el genoma. Los cambiosepigenéticos o modificaciones covalentes de los constituyentes de la cromatina, comola metilación del DNA, modulan la conformación de la cromatina y por tanto son unfactor clave de regulación de estos cambios y como consecuencia, de la actividadgénica. En este trabajo se ha analizado los niveles y dinámica de metilación delDNA durante el desarrollo y embriogénesis del polen.Se ha puesto a punto el ensayo para cuantificar el nivel de metilación de DNAgenómico mediante electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) en anteras ymicrosporas aisladas en diversas etapas del desarrollo gametofítico del polen y delcultivo embriogénico. Los resultados indican cambios en la metilación del DNA y enla arquitectura nuclear durante la diferenciación, proliferación y MCP. Así, durante elproceso de maduración del polen y MCP del tapetum, se produce un aumento delnivel de metilación, asociado a la heterocromatinización que tiene lugar durante estosprocesos. Sin embargo, tras la reprogramación a embriogénesis de las microsporas,los niveles de metilación disminuyen, en relación al proceso de proliferación que seinicia como consecuencia del cambio de programa de desarrollo. En etapasposteriores del proceso de embriogénesis, se aprecia un incremento en los niveles demetilación de DNA, asociado a la diferenciación que tiene lugar en las etapasavanzadas del desarrollo embriogénico. Además, los resultados obtenidos muestrancambios específicos en los patrones de distribución nuclear de la 5-metildeoxicitidina(5mdC), durante los programas de desarrollo estudiados, en relación alos patrones de condensación cromatínica.En este trabajo también se ha analizado la expresión del gen de la enzima DNAmetiltransferasa 1, NtMET1, principal responsable de la metilación del DNA, enetapas específicas de los cultivos embriogénicos, del desarrollo del polen y de la MCPdel tapetum. Los resultados muestran que la expresión de NtMET-1 está reguladadurante el desarrollo gametofítico y la embriogénesis del polen; los cambios de nivelResumende expresión están asociados a las variaciones de metilación global del DNA quesuceden con el cambio de programa de desarrollo y a procesos de diferenciación yproliferación, aumentando su expresión en fases de alto grado de metilación ydisminuyendo cuando la metilación global del DNA es baja.Durante la microsporogénesis y desarrollo in vivo del polen, el tapetum, tejido nutriciode la antera, tiene una función fundamental y una vez terminada inicia un proceso dedegradación mediante MCP. En este trabajo, se han analizado los cambios en núcleoy citoplasma para la caracterización de la MCP y la identificación demarcadores de apoptosis en el tapetum. Los resultados muestran por primera vez,la localización y determinación de actividad enzimática de proteínas tipo caspasa 3 enel tapetum, indicando que las células del tapetum sufren un proceso de MCP a travésde una ruta dependiente de proteínas tipo caspasa 3. El proceso se caracteriza poruna progresiva condensación cromatínica, lobulación nuclear, contraccióncitoplásmica y cambios en la distribución de RNA y segregación deribonucleoproteínas (RNPs), características propias de los procesos de apoptosis decélulas animales.También se ha analizado la metilación del DNA durante el desarrollo y MCP deltapetum, observándose un incremento de los niveles de metilación global del DNAy un cambio en el patrón de distribución de 5mdC, desde pequeños spots en etapasmetabólicamente activas hasta su concentración en grandes masas de cromatinacondensada en MCP avanzada. El análisis de expresión de NtMET1 indica unincremento de la expresión durante el desarrollo y MCP del tapetum.En este trabajo se han estudiado los niveles y distribución de marcadoresnucleares específicos implicados en la síntesis, procesamiento y degradaciónde RNA durante la diferenciación in vivo del polen y MCP del tapetum. Se haanalizado la distribución de híbridos DNA:RNA, CstF (“cleavage stimulationfactor”), RNAs poliadenilados y RNasa A. Los resultados obtenidos, muestran quedurante la diferenciación del polen in vivo tiene lugar una remodelación del dominioResumenintercromatínico que conlleva una disminución gradual de la actividadtranscripcional. El incremento de los niveles de metilación detectados en estosprocesos aparecen asociados a esta disminución de la actividad transcripcional.Durante el desarrollo y MCP del tapetum, nuestros resultados aportan nuevos datossobre la organización estructural y funcional del núcleo. La disminución de híbridosDNA:RNA, transcritos poliadenilados y de los factores de splicing como CstF encomparación con células transcripcionalmente activas, indican una disminución de laactividad transcripcional asociado al proceso de MCP, al mismo tiempo que sugierenla participación de la enzima RNasa A en la degradación de RNA en etapastempranas de la MCP del tapetum apoyando la idea de que durante el desarrollo yMCP del tapetum se produce una disminución de la síntesis y procesamiento deRNAm, acompañado de un proceso de degradación masiva de RNA.Los resultados obtenidos en esta Memoria Doctoral aportan una información clavesobre la fisiología de la reprogramación celular y la adquisición de competenciaembriogénica, procesos de gran interés básico y que además podrán ser empleados enel diseño y optimización de nuevos sistemas in vitro con mayor eficiencia, además deestablecer las bases para el diseño de estrategias de transformación.
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