Person:
Solís González, María Teresa

First Name

María Teresa

Last Name

Solís González

URI

https://hdl.handle.net/20.500.14352/74327

Affiliation

Universidad Complutense de Madrid

Faculty / Institute

Ciencias Biológicas

Department

Genética, Fisiología y Microbiología

Area

Fisiología Vegetal

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Inhibition of histone H3K9 methylation by BIX-01294 promotes stress-induced microspore totipotency and enhances embryogenesis initiation.
(Frontiers in Plant Science, 2017) Berenguer, Eduardo; Bárány, Ivett; Solís González, María Teresa; Perez-Perez, Yolanda; Testillano, Pilar
Microspore embryogenesis is a process of cell reprogramming, totipotency acquisition and embryogenesis initiation, induced in vitro by stress treatments and widely used in plant breeding for rapid production of doubled-haploids, but its regulating mechanisms are still largely unknown. Increasing evidence has revealed epigenetic reprogramming during microspore embryogenesis, through DNA methylation, but less is known about the involvement of histone modifications. In this study, we have analyzed the dynamics and possible role of histone H3K9 methylation, a major repressive modification, as well as the effects on microspore embryogenesis initiation of BIX-01294, an inhibitor of histone methylation, tested for the first time in plants, in Brassica napus and Hordeum vulgare. Results revealed that microspore reprogramming and initiation of embryogenesis involved a low level of H3K9 methylation. With the progression of embryogenesis, methylation of H3K9 increased, correlating with gene expression profiles of BnHKMT SUVR4-like and BnLSD1-like (writer and eraser enzymes of H3K9me2). At early stages, BIX-01294 promoted cell reprogramming, totipotency and embryogenesis induction, while diminishing bulk H3K9 methylation. DNA methylation was also reduced by short-term BIX-01294 treatment. By contrast, long BIX-01294 treatments hindered embryogenesis progression, indicating that H3K9 methylation is required for embryo differentiation. These findings open up new possibilities to enhance microspore embryogenesis efficiency in recalcitrant species through pharmacological modulation of histone methylation by using BIX-01294.
Reprogramación del polen a embriogénesis inducida por estrés: identidad celular, muerte celular programada y papel de la metilación de DNA
(2012) Solís González, María Teresa; Sánchez Testillano, Pilar; Risueño Almeida, María del Carmen; Díez Sánchez, Manuel
El desarrollo del grano de polen es un proceso estrictamente regulado a nivel génico que conduce a la formación de un organismo haploide, el gametofito masculino o grano de polen, cuyas células poseen una alta especialización, necesaria para su importante función en la germinación del tubo polínico y doble fecundación de las plantas con flores. Mediante la aplicación de un tratamiento de estrés in vitro en la etapa adecuada del desarrollo, concretamente en la fase de microspora vacuolada, la microspora puede desviar su ruta de desarrollo gametofítico hacia una ruta embriogénica con la formación de un embrión haploide, proceso conocido como embriogénesis del polen, que representa una importante herramienta biotecnológica en mejora vegetal para la obtención rápida de plantas doble haploides, líneas isogénicas y nuevas variedades. Este proceso se ha puesto a punto en numerosas especies, sin embargo, su rendimiento es muy bajo en algunas plantas de interés económico, ya que todavía son poco conocidos los mecanismos celulares y moleculares que intervienen en el cambio de programa de desarrollo. El desarrollo esporofítico y gametofítico del polen en la antera está asociado al correcto desarrollo del tapetum o tejido nutricio de la antera, que una vez finalizada su función sufre una degeneración mediante muerte celular programada (MCP). En esta Tesis se plantea el estudio de diferentes aspectos de la fisiología del proceso de embriogénesis del polen en comparación con el desarrollo gametofítico del polen, con el objetivo de comprender los mecanismos que controlan la reprogramación celular, la adquisición de competencia embriogénica y la identidad celular mediante tratamientos de estrés, centrándose el estudio en la identificación de marcadores de embriogénesis, la dinámica de la pared celular, la metilación del DNA y los sucesos de muerte celular programada (MCP). Por otro lado, debido a la importancia de la MCP y la metilación del DNA durante la reprogramación a embriogénesis inducida por estrés, se plantea también el estudio de la dinámica de estos dos procesos durante la diferenciación del polen in vivo, especialmente, durante el desarrollo y MCP del tapetum. Resumen El material empleado para este estudio han sido diferentes sistemas vegetales, en función de los objetivos perseguidos en cada caso. Así, por un lado, se han utilizado especies herbáceas, modelos del proceso, en las cuales se han establecido eficientes sistemas de cultivo in vitro como Brassica napus y Nicotiana tabacum, y por otro lado, un árbol frutal, Olea europaea, con un mayor interés aplicado, en el que los sistemas de cultivo in vitro, están todavía en desarrollo. La comparación entre especies modelo y árboles, puede ser muy útil en el desarrollo y mejora de nuevos sistemas in vitro, por extensión de conocimientos entre especies. El abordaje experimental ha consistido en el desarrollo de cultivos in vitro de microsporas aisladas y el empleo de diversas técnicas: a)citoquímicas para la detección in situ de diferentes componentes celulares (Calcofluor White para celulosa, I2KI para almidón y Azul de Evans para detección de muerte celular), b)inmunocitoquímicas con anticuerpos específicos que reconocen pectinas con diferente grado de esterificación (Jim7 y Jim), RNA total (anti-RNA), citosinas metiladas (anti-5mdC) y MCP (caspasa 3), c)ensayos inmunoquímicos de “Dot blot” y ”Western blot”, d)ensayos de actividad enzimática, e)estudios de expresión mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) y PCR semicuantitativa, f)electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) para cuantificar el grado de metilación global del DNA y g)herramientas de transformación transitoria con GFP. Para ello, se emplearon diferentes métodos de procesamiento de muestras, los cuales fueron adaptados para el material objeto de estudio en cada momento. Después del tratamiento de estrés inductor de la embriogénesis, las microsporas que reprograman su ruta abandonan su programa de desarrollo y adquieren competencia embriogénica, sin embargo, aquellas otras que no son capaces de reprogramarse hacia embriogénesis, se paran y mueren. En esta Tesis, se ha optimizado el sistema de cultivo in vitro de microsporas aisladas de Brassica napus para una mayor eficiencia de inducción a embriogénesis mediante estrés a 32ºC, junto con el desarrollo de una metodología óptima para la germinación de embriones y su conversión a plantas Resumen adultas. Al mismo tiempo, se ha desarrollado un nuevo sistema de cultivo in vitro en Brassica napus para la inducción eficiente de la embriogénesis a 18ºC, sistema en el que la microspora sigue dos rutas de desarrollo embriogénico diferentes y permitirá abordar el desarrollo de estudios comparativos entre ellas. Se han estudiado otras posibles respuestas al tratamiento de estrés inductor de las microsporas que no reprograman su ruta de desarrollo hacia embriogénesis, mediante el análisis de los niveles de muerte celular y marcadores de MCP durante las primeras etapas del cultivo embriogénico, identificándose por primera vez la localización y actividad enzimática tipo caspasa. Los resultados muestran que las primeras etapas del cultivo se caracterizan por elevados niveles de muerte celular e indican que algunas de las células que no responden al tratamiento de estrés inductor de embriogénesis, siguen una ruta dependiente de “actividad caspasa 3 like”, sugiriendo que parte de los elevados niveles de muerte celular detectados en las primeras etapas del cultivo, podrían deberse a procesos de muerte celular programada (MCP), posiblemente desencadenados por el tratamiento de estrés. La identificación de rutas de muerte celular programada como respuesta al tratamiento de estrés en cultivos de polen, serán de gran ayuda en el diseño de estrategias in vitro que puedan bloquear la MCP y que aumenten la viabilidad y la inducción de embriogénesis. Se han establecido marcadores moleculares y celulares que cambian con la identidad celular y diferencian las células reprogramadas a embriogénesis en las primeras etapas del proceso, como son: la organización estructural idéntica de los núcleos, la tabicación citoplásmica, la ausencia de almidón y la diferente composición de pectinas y celulosa de la pared celular. Los marcadores identificados son comunes para olivo y colza, sugiriendo que los mecanismos implicados en la reprogramación a embriogénesis son análogos en ambas especies pudiendo ser empleados como herramientas para la monitorización de procesos metabólicos implicados en la reprogramación y para la identificación de Resumen células destinadas al programa de desarrollo embriogénico frente a aquellas otras células que no responden al tratamiento inductor. Las pectinas son un componente principal de las paredes celulares, su modificación por la enzima pectinmetilesterasa (PME) actúa regulando la estructura y la rigidez de la pared celular. En este trabajo, se ha analizado la dinámica de la esterificación de pectinas y el patrón de expresión de la BnPME durante los dos programas de desarrollo del polen, el desarrollo gametofítico y la embriogénesis de polen inducida mediante tratamientos de estrés. Los resultados obtenidos indican que las pectinas esterificadas y no esterificadas tienen patrones de distribución opuestos durante los dos programas de desarrollo, en relación a los procesos de proliferación y diferenciación. Así, el polen maduro y las etapas más avanzadas del desarrollo embriogénico, con una mayor diferenciación celular, se caracterizan por elevados niveles de pectinas desmetilesterificadas, así como de una alta expresión de BnPME; mientras que las microsporas inmaduras y las primeras fases de embriogénesis, asociadas con procesos de proliferación, presentan una mayor proporción de pectinas altamente esterificadas y una expresión baja de BnPME. En base a estos resultados, los altos niveles de pectinas no esterificadas pueden ser considerados como marcadores del desarrollo gametofítico, mientras que la presencia de pectinas esterificadas pueden emplearse como un marcador del desarrollo embriogénico del polen, permitiendo la identificación de las microsporas inducidas y los primeros proembriones. El análisis de localización in vivo de la proteína de fusión GFP-PME en el microscopio confocal en hojas de tabaco transformadas transitoriamente, indica que la proteína PME es dirigida a las paredes celulares diferenciadas de las células epidérmicas y del mesófilo, donde presumiblemente realiza su actividad enzimática sobre las pectinas in muro. Resumen Los mecanismos que subyacen a la reprogramación nuclear, implican cambios en la estructura de la cromatina y la expresión génica de todo el genoma. Los cambios epigenéticos o modificaciones covalentes de los constituyentes de la cromatina, como la metilación del DNA, modulan la conformación de la cromatina y por tanto son un factor clave de regulación de estos cambios y como consecuencia, de la actividad génica. En este trabajo se ha analizado los niveles y dinámica de metilación del DNA durante el desarrollo y embriogénesis del polen. Se ha puesto a punto el ensayo para cuantificar el nivel de metilación de DNA genómico mediante electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) en anteras y microsporas aisladas en diversas etapas del desarrollo gametofítico del polen y del cultivo embriogénico. Los resultados indican cambios en la metilación del DNA y en la arquitectura nuclear durante la diferenciación, proliferación y MCP. Así, durante el proceso de maduración del polen y MCP del tapetum, se produce un aumento del nivel de metilación, asociado a la heterocromatinización que tiene lugar durante estos procesos. Sin embargo, tras la reprogramación a embriogénesis de las microsporas, los niveles de metilación disminuyen, en relación al proceso de proliferación que se inicia como consecuencia del cambio de programa de desarrollo. En etapas posteriores del proceso de embriogénesis, se aprecia un incremento en los niveles de metilación de DNA, asociado a la diferenciación que tiene lugar en las etapas avanzadas del desarrollo embriogénico. Además, los resultados obtenidos muestran cambios específicos en los patrones de distribución nuclear de la 5-metildeoxicitidina (5mdC), durante los programas de desarrollo estudiados, en relación a los patrones de condensación cromatínica. En este trabajo también se ha analizado la expresión del gen de la enzima DNA metiltransferasa 1, NtMET1, principal responsable de la metilación del DNA, en etapas específicas de los cultivos embriogénicos, del desarrollo del polen y de la MCP del tapetum. Los resultados muestran que la expresión de NtMET-1 está regulada durante el desarrollo gametofítico y la embriogénesis del polen; los cambios de nivel Resumen de expresión están asociados a las variaciones de metilación global del DNA que suceden con el cambio de programa de desarrollo y a procesos de diferenciación y proliferación, aumentando su expresión en fases de alto grado de metilación y disminuyendo cuando la metilación global del DNA es baja. Durante la microsporogénesis y desarrollo in vivo del polen, el tapetum, tejido nutricio de la antera, tiene una función fundamental y una vez terminada inicia un proceso de degradación mediante MCP. En este trabajo, se han analizado los cambios en núcleo y citoplasma para la caracterización de la MCP y la identificación de marcadores de apoptosis en el tapetum. Los resultados muestran por primera vez, la localización y determinación de actividad enzimática de proteínas tipo caspasa 3 en el tapetum, indicando que las células del tapetum sufren un proceso de MCP a través de una ruta dependiente de proteínas tipo caspasa 3. El proceso se caracteriza por una progresiva condensación cromatínica, lobulación nuclear, contracción citoplásmica y cambios en la distribución de RNA y segregación de ribonucleoproteínas (RNPs), características propias de los procesos de apoptosis de células animales. También se ha analizado la metilación del DNA durante el desarrollo y MCP del tapetum, observándose un incremento de los niveles de metilación global del DNA y un cambio en el patrón de distribución de 5mdC, desde pequeños spots en etapas metabólicamente activas hasta su concentración en grandes masas de cromatina condensada en MCP avanzada. El análisis de expresión de NtMET1 indica un incremento de la expresión durante el desarrollo y MCP del tapetum. En este trabajo se han estudiado los niveles y distribución de marcadores nucleares específicos implicados en la síntesis, procesamiento y degradación de RNA durante la diferenciación in vivo del polen y MCP del tapetum. Se ha analizado la distribución de híbridos DNA:RNA, CstF (“cleavage stimulation factor”), RNAs poliadenilados y RNasa A. Los resultados obtenidos, muestran que durante la diferenciación del polen in vivo tiene lugar una remodelación del dominio Resumen intercromatínico que conlleva una disminución gradual de la actividad transcripcional. El incremento de los niveles de metilación detectados en estos procesos aparecen asociados a esta disminución de la actividad transcripcional. Durante el desarrollo y MCP del tapetum, nuestros resultados aportan nuevos datos sobre la organización estructural y funcional del núcleo. La disminución de híbridos DNA:RNA, transcritos poliadenilados y de los factores de splicing como CstF en comparación con células transcripcionalmente activas, indican una disminución de la actividad transcripcional asociado al proceso de MCP, al mismo tiempo que sugieren la participación de la enzima RNasa A en la degradación de RNA en etapas tempranas de la MCP del tapetum apoyando la idea de que durante el desarrollo y MCP del tapetum se produce una disminución de la síntesis y procesamiento de RNAm, acompañado de un proceso de degradación masiva de RNA. Los resultados obtenidos en esta Memoria Doctoral aportan una información clave sobre la fisiología de la reprogramación celular y la adquisición de competencia embriogénica, procesos de gran interés básico y que además podrán ser empleados en el diseño y optimización de nuevos sistemas in vitro con mayor eficiencia, además de establecer las bases para el diseño de estrategias de transformación.
Epigenetic changes accompany developmental programmed cell death in tapetum cells
(Plant and Cell Physiology, 2014) Solís González, María Teresa; Chakrabarti, Nandini; Corredor, Eduardo; Cortés-Eslava, Josefina; Rodríguez-Serrano, María; Bioggiogera, Marco; Risueño, María; Testillano, Pilar
The tapetum, the nursing tissue inside anthers, undergoes cellular degradation by programmed cell death (PCD) during late stages of microspore-early pollen development. Despite the key function of tapetum, little is known about the molecular mechanisms regulating this cell death process in which profound nuclear and chromatin changes occur. Epigenetic features (DNA methylation and histone modifications) have been revealed as hallmarks that establish the functional status of chromatin domains, but no evidence on the epigenetic regulation of PCD has been reported. DNA methylation is accomplished by DNA methyltransferases, among which DNA methyl transferase 1 (MET1) constitutes one of the CG maintenance methyltransferase in plants, also showing de novo methyltransferase activity. In this work, the changes in epigenetic marks during the PCD of tapetal cells have been investigated by a multidisciplinary approach to reveal the dynamics of DNA methylation and the pattern of expression of MET1 in relation to the main cellular changes of this PCD process which have also been characterized in two species, Brassica napus and Nicotiana tabacum. The results showed that tapetum PCD progresses with the increase in global DNA methylation and MET1 expression, epigenetic changes that accompanied the reorganization of the nuclear architecture and a high chromatin condensation, activity of caspase 3-like proteases and Cyt c release. The reported data indicate a relationship between the PCD process and the DNA methylation dynamics and MET1 expression in tapetal cells, suggesting a possible new role for the epigenetic marks in the nuclear events occurring during this cell death process and providing new insights into the epigenetic control of plant PCD.
Differential expression patterns of arabinogalactan proteins in Arabidopsis thaliana reproductive tissues
(Journal of Experimental Botany, 2014) Pereira, Ana Marta; Masiero, Simona; Nobre, Margarida Sofia; Costa, Mário Luís; Solís González, María Teresa; Testillano, Pilar ; Sprunck, Stefanie; Coimbra, Sílvia
Arabinogalactan proteins (AGPs) are heavily glycosylated proteins existing in all members of the plant kingdom and are differentially distributed through distinctive developmental stages. Here, we showed the individual distributions of specific Arabidopsis AGPs: AGP1, AGP9, AGP12, AGP15, and AGP23, throughout reproductive tissues and indicated their possible roles in several reproductive processes. AGP genes specifically expressed in female tissues were identified using available microarray data. This selection was confirmed by promoter analysis using multiple green fluorescent protein fusions to a nuclear localization signal, β-glucuronidase fusions, and in situ hybridization as approaches to confirm the expression patterns of the AGPs. Promoter analysis allowed the detection of a specific and differential presence of these proteins along the pathway followed by the pollen tube during its journey to reach the egg and the central cell inside the embryo sac. AGP1 was expressed in the stigma, style, transmitting tract, and the chalazal and funiculus tissues of the ovules. AGP9 was present along the vasculature of the reproductive tissues and AGP12 was expressed in the stigmatic cells, chalazal and funiculus cells of the ovules, and in the septum. AGP15 was expressed in all pistil tissues, except in the transmitting tract, while AGP23 was specific to the pollen grain and pollen tube. The expression pattern of these AGPs provides new evidence for the detection of a subset of specific AGPs involved in plant reproductive processes, being of significance for this field of study. AGPs are prominent candidates for male-female communication during reproduction.
Changes in histone methylation and acetylation during microspore reprogramming to embryogenesis occur concomitantly with BnHKMT and BnHAT expression and are associated to cell totipotency, proliferation and differentiation in Brassica napus
(Cytogenetic and Genome Research, 2014) Rodriguez-Sanz, Héctor; Moreno-Romero, Jordi; Solís González, María Teresa; Köhler, Claudia; Risueño, María; Testillano, Pilar
In response to stress treatments, microspores can be reprogrammed to become totipotent cells that follow an embryogenic pathway producing haploid and double-haploid embryos which are important biotechnological tools in plant breeding. Recent studies have revealed the involvement of DNA methylation in regulating this process, but no information is available on the role of histone modifications in microspore embryogenesis. Histone modifications are major epigenetic marks controlling gene expression during plant development and in response to environmental changes. Lysine methylation of histones, accomplished by histone lysine methyltransferases (HKMTs), can occur on different lysine residues, with histone H3K9 methylation being mainly associated with transcriptionally silenced regions. In contrast, histone H3 and H4 acetylation is carried out by histone acetyltransferases (HATs) and is associated with actively transcribed genes. In this work, we analyzed 3 different histone epigenetic marks: dimethylation of H3K9 (H3K9me2) and acetylation of H3 and H4 (H3Ac and H4Ac) during microspore embryogenesis in Brassica napus by Western blot and immunofluorescence assays. The expression patterns of histone methyltransferase BnHKMT and histone acetyltransferase BnHAT genes have also been analyzed by qPCR. Our results revealed different spatial and temporal distribution patterns for methylated and acetylated histone variants during microspore embryogenesis and their similarity with the expression profiles of BnHKMT and BnHAT, respectively. The data presented suggest the participation of H3K9me2 and HKMT in embryo cell differentiation and heterochromatinization events, whereas H3Ac, H4Ac, and HAT would be involved in transcriptional activation, totipotency, and proliferation events during cell reprogramming and embryo development.
A new microspore embryogenesis system under low temperature which mimics zygotic embryogenesis initials, expresses auxin and efficiently regenerates doubled-haploid plants in Brassica napus
(BMC Plant Biology, 2012) Prem, Deepak; Solís González, María Teresa; Bárány, Ivett; Rodríguez-Sanz, Héctor; Risueño, María del Carmen; Testillano, Pilar
Microspore embryogenesis represents a unique system of single cell reprogramming in plants wherein a highly specialized cell, the microspore, by specific stress treatment, switches its fate towards an embryogenesis pathway. In Brassica napus, a model species for this phenomenon, incubation of isolated microspores at 32°C is considered to be a pre-requisite for embryogenesis induction.
EstuPlan: Methodology for the development of creativity in the resolution of scientific and social problems
(5th International Conference on Higher Education Advances (HEAd’19), 2019) Astudillo Calderón, Sergio; de Diez de la Torre, Laura; García Companys, Marina; Ortega Pérez, Nora; Rodriguez Martínez, Victor; Awad Alzahrani, Sabah; Alonso Valenzuela, Raquel; Ávalos García, Adolfo; Cifuentes Cuencas, Blanca María; Esteban Carrasco, Alberto; Gómez Garay, Aranzazu; Martín Calvarro, Luisa; Martín Gómez, María Soledad; Pérez-Urría Carril, Elena; Pintos López, Beatriz; Solís González, María Teresa; Torres Muñoz, Margarita
Creative thinking is necessary to generate novel ideas and solve problems. "EstuPlan" is a methodology in which knowledge and creativity converge for the resolution of scientific problems with social projection. It is a training programme that integrates teachers, laboratory technicians and PhD students, master and undergraduate students which form working groups for the development of projects. Projects have a broad and essential scope and projection in terms of environmental problems, sustainable use of natural resources, food, health, biotechnology or biomedicine. The results show the success of this significant learning methodology using tools to develop creativity in responding to scientific and social demand for problem-solving to transfer academic knowledge to different professional environments. Bioplastics, Second Life of Coffee, LimBio, Algae oils, Ecomers, Caring for the life of your crop and Hate to Deforestate are currently being developed.
Early markers are present in both embryogenesis pathways from microspores and immature zygotic embryos in cork oak, Quercus suber L
(BMC Plant Biology, 2014) Rodríguez-Sanz, Héctor; Manzanera, José Antonio; Solís González, María Teresa; Gómez-Garay, Aranzazu; Pintos López, Beatriz; Risueño, María C.; Testillano, Pilar S.
Background: In Quercus suber, cork oak, a Mediterranean forest tree of economic and social interest, rapid production of isogenic lines and clonal propagation of elite genotypes have been achieved by developing in vitro embryogenesis from microspores and zygotic embryos respectively. Despite its high potential in tree breeding strategies, due to their recalcitrancy, the efficiency of embryogenesis in vitro systems in many woody species is still very low since factors responsible for embryogenesis initiation and embryo development are still largely unknown. The search for molecular and cellular markers during early stages of in vitro embryogenesis constitutes an important goal to distinguish, after induction, responsive from non-responsive cells, and to elucidate the mechanisms involved in embryogenesis initiation for their efficient manipulation. In this work, we have performed a comparative analysis of two embryogenesis pathways derived from microspores and immature zygotic embryos in cork oak in order to characterize early markers of reprogrammed cells in both pathways. Rearrangements of the cell structural organization, changes in epigenetic marks, cell wall polymers modifications and endogenous auxin changes were analyzed at early embryogenesis stages of the two in vitro systems by a multidisciplinary approach. Results: Results showed that early embryo cells exhibited defined changes of cell components which were similar in both embryogenesis in vitro systems, cellular features that were not found in non-embryogenic cells. DNA methylation level and nuclear pattern, proportion of esterified pectins in cell walls, and endogenous auxin levels were different in embryo cells in comparison with microspores and immature zygotic embryo cells from which embryos originated, constituting early embryogenesis markers. Conclusions: These findings suggest that DNA hypomethylation, cell wall remodeling by pectin esterification and auxin increase are involved in early in vitro embryogenesis in woody species, providing new evidences of the developmental pattern similarity between both embryogenesis pathways, from microspores and immature zygotic embryos, in woody species.
Proteases with caspase 3-like activity participate in cell death during stress-induced microspore embryogenesis of Brassica napus.
(The EuroBiotech Journal, 2019) Berenguer, Eduardo; Solís González, María Teresa; Pérez-Perez, Yolanda; Testillano, Pilar
Microspore embryogenesis is a model system of plant cell reprogramming, totipotency acquisition, stress response and embryogenesis initiation. This in vitro system constitutes an important biotechnological tool for haploid and doubled-haploid plant production, very useful for crop breeding. In this process, microspores (cells that produce pollen grains in planta) are reprogrammed toward embryogenesis by specific stress treatment, but many microspores die after the stress. The occurrence of cell death is a serious limiting problem that greatly reduces microspore embryogenesis yield. In animals, increasing evidence has revealed caspase proteolytic activities as essential executioners of programmed cell death (PCD) processes, however, less is known in plants. Although plant genomes do not contain caspase homologues, caspase-like proteolytic activities have been detected in many plant PCD processes. In the present study, we have analysed caspase 3-like activity and its involvement in stress-induced cell death during initial stages of microspore embryogenesis of Brassica napus. After stress treatment to induce embryogenesis, isolated microspore cultures showed high levels of cell death and caspase 3-like proteolytic activity was induced. Treatments with specific inhibitor of caspase 3-like activity reduced cell death and increased embryogenesis induction efficiency. Our findings indicate the involvement of proteases with caspase 3-like activity in the initiation and/or execution of cell death at early microspore embryogenesis in B. napus, giving new insights into the pathways of stress-induced cell death in plants and opening a new way to improve in vitro embryogenesis efficiency by using chemical modulators of cell death proteases.
Pectin De-methylesterification and AGP Increase Promote Cell Wall Remodeling and Are Required During Somatic Embryogenesis of Quercus suber
(Frontiers in plant science, 2019) Pérez Pérez, Yolanda; Carneros, Elena; Berenguer, Eduardo; Solís González, María Teresa; Bárány, Ivett; Pintos López, Beatriz; Gómez-Garay, Aranzazu; Risueño, María C.; Testillano, Pilar S.
Somatic embryogenesis is a reliable system for in vitro plant regeneration, with biotechnological applications in trees, but the regulating mechanisms are largely unknown. Changes in cell wall mechanics controlled by methylesterification of pectins, mediated by pectin methylesterases (PMEs) and pectin methyl esterase inhibitors (PMEIs) underlie many developmental processes. Arabinogalactan proteins (AGPs) are highly glycosylated proteins located at the surface of plasma membranes, in cell walls, and in extracellular secretions, with key roles in a range of different processes. In this study, we have investigated changes in two cell wall components, pectins and AGPs, during somatic embryogenesis in Quercus suber, a forest tree of high economic and ecologic value. At early embryogenesis stages, cells of proembryogenic masses showed high levels of esterified pectins and expression of QsPME and QsPMEI genes encoding a PME and a putative PMEI, respectively. At advanced stages, differentiating cells of heart, torpedo and cotyledonary embryos exhibited walls rich in de-esterified pectins, while QsPME gene expression and PME activity progressively increased. AGPs were detected in cell walls of proembryogenic masses and somatic embryos. QsLys-rich-AGP18, QsLys-rich-AGP17, and QsAGP16L1 gene expression increased with embryogenesis progression, as did the level of total AGPs, detected by dot blot with β-glucosyl Yariv reagent. Immuno dot blot, immunofluorescence assays and confocal analysis using monoclonal antibodies to high- (JIM7, LM20) and low- (JIM5, LM19) methylesterified pectins, and to certain AGP epitopes (LM6, LM2) showed changes in the amount and distribution pattern of esterified/de-esterified pectins and AGP epitopes, that were associated with proliferation and differentiation and correlated with expression of the PME and AGP genes analyzed. Pharmacological treatments with catechin, an inhibitor of PME activity, and Yariv reagent, which blocks AGPs, impaired the progression of embryogenesis, with pectin de-esterification and an increase in AGP levels being necessary for embryo development. Findings indicate a role for pectins and AGPs during somatic embryogenesis of cork oak, promoting the cell wall remodeling during the process. They also provide new insights into the regulating mechanisms of somatic embryogenesis in woody species, for which information is still scarce, opening up new possibilities to improve in vitro embryo production in tree breeding.