Obtención y caracterización de mutantes de la DNA topoisomerasa I resistentes a seconeolitsina

Abstract

La resistencia de Streptococcus pneumoniae (SPN) a los antibióticos ha aumentado en las últimas décadas, haciendo preciso encontrar nuevas alternativas terapéuticas. Las DNA topoisomerasas mantienen la homeostasis del superenrollamiento del DNA, que es fundamental para la viabilidad celular. Son enzimas esenciales, lo que las convierten en dianas terapéuticas idóneas. La seconeolitsina inhibe el crecimiento de SPN. El mecanismo de acción propuesto para este compuesto implica su unión al centro activo de la DNA topoisomerasa I, una nueva diana antimicrobiana, impidiendo su actividad y provocando la muerte celular. Con el objetivo de validar la DNA topoisomerasa I (gen topA) como diana de la seconeolitsina, se obtuvieron mutantes condicionales mediante mutagénesis dirigida de residuos de su centro activo. Los genes mutantes se clonaron en un plásmido bajo el control del promotor PMal y se introdujeron en una cepa con topA bajo el control de PZn. Solamente la enzima con el cambio R102A complementó la ausencia de la proteína silvestre. La enzima mutante mostró in vitro una actividad específica 8 veces inferior y una resistencia a seconeolitsina 2 veces superior a la de la proteína silvestre. Consistentemente, la sobreexpresión de la enzima mutante permitió el crecimiento de SPN, que está inhibido en el caso de sobreexpresión de la enzima silvestre. A concentraciones subinhibitorias de seconeolitsina la cepa que sobreexpresó la topoisomerasa I R102A presentó un tiempo de duplicación 7% menor que el de una cepa con la enzima silvestre. Estos datos confirman el mecanismo de inhibición de la topoisomerasa I por la seconeolitsina.