Orígenes de replicación de la cadena retrasada del plásmido pMV 158

Abstract

El trabajo realizado en esta tesis se ha centrado en la caracterización física y funcional de los orígenes de replicacion de la cadena retrasada (ssoa y ssou) del plasmido de amplio espectro de huésped pmv158. En primer lugar, se acoto in vivo la función del ssoa, en un fragmento de 199 pb del plasmido y se comprobó su actividad en diferentes huéspedes. Del mismo modo, se estableció la función del ssou, en varios hospedadores bacterianos. Se determinaron los puntos desde donde se inicia la síntesis de la cadena retrasada a partir de ambos orígenes de replicacion y se analizo la influencia de mutaciones en las regiones conservadas del ssoa en la eficiencia de replicacion (in vivo e in vitro) y especificidad de inicio de esta cadena (in vitro). Para ello, se puso a punto un sistema de replicacion que utiliza extractos acelulares de pneumococos, asi como también se consiguieron las condiciones necesarias para la replicacion a partir de estos orígenes en el sistema de s. Aureus. Se pudieron determinar algunos de los factores del huésped implicados en la conversión de ss- dsdna plasmidico y al nivel en que estos actúan. Se ideo un sistema de transcripcion in vitro, que permitió la síntesis de rna cebadores a partir de sustratos de dna monocatenario del plasmido pmv158 que contenían la señal ssoa o derivadas de esta. Por ultimo y sobre la base de los resultados obtenidos, se propuso un modelo de replicacion de la cadena retrasada a partir del ssoa, donde se tuvieron en cuenta las secuencias nucleotidicas especificas del plasmido para que la replicacion de esta cadena tenga lugar y los factores del huésped implicados en dicho proceso