An optimized method for high-quality RNA extraction from distinctive intrinsic laryngeal muscles in the rat model

Abstract

Los desafíos relacionados con la extracción de ARN de alta calidad a partir de tejido post mortem han limitado la aplicación de la secuenciación de ARN (RNA-seq) en ciertos grupos de músculos esqueléticos, incluidos los músculos laríngeos intrínsecos (ILM). El presente estudio identificó factores críticos que contribuyen a la extracción deficiente de ARN de los ILM y estableció un método adecuado que permitió un análisis de alto rendimiento. Aquí, se adaptaron las técnicas estándar para el procesamiento de tejidos y se determinó un medio eficaz para controlar los efectos de confusión durante la preparación de la muestra. El procedimiento experimental proporcionó de manera constante suficiente ARN total intacto (N = 68) y RIN que oscilaban entre 7,0 y 8,6, lo que no tenía precedentes utilizando protocolos estándar de purificación de ARN. Este estudio confirmó la reproducibilidad del flujo de trabajo a través de ensayos repetidos en diferentes puntos temporales posnatales y en los distintos ILM. Los diagnósticos de alto rendimiento de 90 muestras de ARN no indicaron puntuaciones de alineación de secuenciación por debajo del 70%, lo que validó la estrategia de extracción. Las diferencias significativas entre las condiciones estándar y experimentales sugieren desafíos evitados y una amplia aplicabilidad a otros músculos esqueléticos. Esta investigación continúa en curso dada la perspectiva de obtener conocimientos terapéuticos para trastornos de la voz, la deglución y las vías respiratorias. La metodología actual respalda investigaciones pioneras sobre el transcriptoma global en la laringe que anteriormente no tenían fundamento en la literatura.