Evaluación del mecanismo de corte de RNA por la toxina bacteriana Kid y de su actividad inhibidora de la traducción

Abstract

Kid, la toxina endoribonucleasa del sistema Toxina-Antitoxina parD del plásmido R1, corta ARN en la secuencia 5́-UA(A/C)-3́ inhibiendo síntesis de proteínas, efecto atribuido a la rotura del ARNm independientemente de ribosomas. En la evaluación del modelo de unión y corte del ARN por Kid se ha analizado, por espectrometría de masas, el efecto de mutaciones en residuos claves del modelo. Las mutaciones R73H, D75E, D75N y H17P, afectando residuos del centro catalítico propuesto, inactivan la toxicidad de Kid. Ensayos de corte de los sustratos 5́-AUACA-3́ y 5́-UUACU-3́, indican que las mutaciones anulan la actividad ARNasa de la toxina sin afectar su unión al sustrato 5́-AdUACA-3́. El análisis de mutaciones en residuos implicados en unión, indica que interaccionan con el sustrato 5́-AdUACA-3́ con menor eficiencia que la proteína silvestre y que, exceptuando a T46G, conservan actividad ARNasa. Los mutantes que retenían actividad, mostraron inhibición de síntesis de proteínas in vitro y de toxicidad in vivo. Los resultados apoyan el modelo propuesto indicando que T46 está implicado en unión a ARN participando más directamente en su actividad ARNasa. El descubrimiento de mutaciones en prfA abrió la posibilidad de analizar las interacciones de Kid con componentes ribosomales. prfA codifica el factor de terminación de la traducción RF1 de E. coli. Las mutaciones afectando residuos localizados cerca del sitio de reconocimiento de codones, mostraron reducción en la eficiencia de terminación en codones UAG, sin afectar su estabilidad in vivo. Los mutantes mostraron hipersensibilidad a antibióticos aminoglicósidos y a Kid cuya actividad ARNasa es, en principio, independiente del proceso de traducción. La hipersensibilidad a Kid, dependiente de su actividad ARNasa, se suprimió al sobreproducir RF1 silvestre o la antitoxina Kis. Estos datos aportan la primera evidencia de la participación de RF1 en la ruta de toxicidad de Kid, añadiendo complejidades a la actividad de Kid.