Nuevos antibióticos frente a la DNA Topoisomerasa I de Streptococcus pneumoniae

Abstract

La resistencia a antimicrobianos es un serio problema clínico y de salud pública a nivel mundial desde hace años. Este problema afecta a Streptococcus pneumoniae, uno de los principales patógenos humanos y el principal agente etiológico de las neumonías comunitarias. La resistencia de S. pneumoniae a antibióticos B-lactámicos y macrólidos se ha extendido en todo el mundo en las dos últimas décadas.Actualmente, fluoroquinolonas como levofloxacino y moxifloxacino son alternativas terapeúticas para el tratamiento de estas infecciones.A pesar de que la resistencia a fluoroquinolonas en S. pneumoniae es actualmente inferior al 3%, es esperable un incremento de las mismas. La búsqueda de nuevos antimicrobianos, preferentemente para dianas diferentes. se hace imprescindible para prevenir el problema. Las DNA topoisomerasas son enzimas esenciales que controlan el mantenimiento de la topología del DNA. vital en los procesos de replicación, transcripción y recombinación. En S. pneumoniae existen dos de tipo 11 (gyrasa y topoisomerasa IV) y una de tipo 1 (topoisomerasa l,TopA). Las topoisomerasas de tipo 11 son diana de fluoroquinolonas. Sin embargo, hasta la fecha, no se habían descrito antibióticos eficaces frente a topoisomerasas de tipo 1 . La actividad enzimática de TopA se basa en la ruptura de una de las hebras del DNA para formar un intermedio covalente mediante un enlace fosfodiester entre una tirosina del dominio catalítico de la enzima y un extremo 3 ·-OH del DNA roto. Una vez modificada la topología del DNA, la enzima cambia de conformación, permitiendo la liberación del DNA del complejo y la posterior religación de sus extremos. El resultado final de esta actividad enzimática es la relajación de DNA debido a la eliminación de vueltas de superenrollamiento negativo. El presente estudio caracteriza por primera vez la topoisomerasa 1 de una bacteriapatógena Gram positiva e identifica dos alcaloides sintéticos fenantréncios como inhibidores de la DNA topoisomerasa 1 de S. pneumoniae a dosis inhibitorias del crecimiento bacteriano. Para ello se sobreexpresó y purificó la TopA tras clonar el gen topA en E. co/i, e inducir su expresión como una proteína de fusión con una cola de 6 Histidinas en su extremo N-terminal. Después se comprobó la actividad de la enzima relajando DNA plasmídico con superenrollamiento negativo y se caracterizó mediante su modelado molecular en base a la estructura cristalográfica ya conocida de su homóloga de E. co/i. Tras sintetizar 18 alcaloides aporfirínicos y fenantrénicos, se determinó su actividad antibacteriana (Concentración Mínima Inhibitoria) y se estudió su efecto sobre la actividad de TopA. Dos de estos compuestos. seconeolitsina y N -metilseconeolitisna, fueron capaces de inhibir in vitro tanto la actividad de la enzima como el crecimiento bacteriano a dosis de 17 µM. Para comprobar el papel de la TopA como diana de los dos compuestos mencionados, el gen topA se clonó en S. pneumoniae bajo el control de un promotor regulable por maltosa, y se observó cómo la inhibición ejercida por la seconeolitsina en el crecimiento bacteriano disminuía bajo condiciones de inducción. Por otra parte, se analizó el nivel de superenrollamiento de un plásmido interno después de tratamientos con seconeolitsina mediante electroforesis de geles bidimensionales de agarosa con cloroquina. La protección que confiere la sobrexpresión de TopA a la inhibición del crecimiento y el superenrollamiento negativo de plásmidos tras tratamientos con el inhibidor, confirman el papel in vivo de la TopA como diana de los compuestos analizado. Los estudios de Docking de la enzima con los inhibidores mencionados permiten sugerir que el mecanismo de inhibición se basa en fuertes interacciones entre los alcaloides y el sitio de unión de DNA de TopA cuando ésta se encuentra en conformación cerrada. Esto supone el bloqueo del mecanismo de apertura de la enzima que se requiere para la actividad enzimática .