Zonas de la superficie del Dimero de AlfaBeta-Tubulina y de los microtúbulos: proteolisis limitada y análisis de secuencias múltiples

Abstract

Se ha empleado la proteolisis limitada del dímero nativo de alfabeta-tubulina con 12 proteasas diferentes para localizar zonas superficiales de la molécula. La identificación inicial de los fragmentos se ha realizado mediante inmunoreactividad con un conjunto de 9 anticuerpos con especificidad de secuencia. La posterior microsecuenciación del extremo amino terminal de los fragmentos ha permitido localizar con precisión 18 puntos de corte. La digestión de la tubulina ocurre preferentemente en 4 regiones de la secuencia (denominadas a, b, c y d). Una nueva zona sensible a proteolisis ha sido localizada cerca del residuo alfalys-40, y alrededor de las posiciones 50-100 en la beta-tubulina. Las otras 3 regiones parecen corresponder, con menores cambios, a las zonas propuestas con anterioridad (de la viña et al. (1988) biochemistry 27:5352-5356). La región b se extiende entre las posiciones 160 a 190. La región es más extensa e incluye desde las posiciones 275 a 360. La región d se localiza en el extremo carboxilo terminal. La proteolisis limitada comparada de tubulina no ensamblada, microtúbulos inducidos por taxol y hojas inducidas por zn2+, rinde información sobre la orientación espacial de los residuos accesibles. La zona a sensible a proteolisis es accesible en alfa-tubulina ensamblada, en concordancia con la acetilación de la alfa-tubulina polimerizada en el residuo lys-40 (ledizet y piperno (1987) proc. natl. acad. sci. usa 84:5720-5724). La zona b, adyacente a la región rica en gly característica de tubulinas, es accesible también en la forma polimerizada. En la zona c, los puntos de corte que se protegen en la polimerización se localizan en dos áreas definidas: cerca del residuo 280 en alfa-y beta-tubulina y en los residuos 339-340 en alfa-tubulina. La región d se protege parcialmente en alfa-tubulina en el ensamblaje, pero no en beta-tubulina. Los resultados de proteolisis limitada introducen restricciones estructurales, que serán de utilidad para cualquier modelo estructural a alta resolución de la tubulina dimérica y de su correcta orientación en los microtúbulos