Potencial terapéutico de linfocitos T reguladores de timo (thyTreg) : vías de generación alternativas y modificación genética con un Receptor de Antígeno Quimérico Universal

Abstract

Las células T reguladoras (Treg) son una subpoblación de linfocitos T CD4+CD25+FOXP3+ con la capacidad de inhibir la respuesta inmunitaria y de regular la homeostasis. Gracias a estas propiedades, las Treg han cobrado una gran relevancia como posible tratamiento de enfermedades autoinmunes o frente al rechazo de trasplantes. Las estrategias empleadas hasta ahora han utilizado la sangre periférica como fuente de estas células, pero, debido a la escasa cantidad y/o a su fenotipo diferenciado, han demostrado una limitada eficacia. Gracias a un novedoso protocolo de obtención y expansión desarrollado por nuestro grupo, a partir del timo se consigue un producto celular indiferenciado y con una gran capacidad inmunosupresora: las thyTreg. Los objetivos de este estudio han sido: (I) Inducir células con idénticas propiedades a las thyTreg a partir de sus precursores, los timocitos. (II) Incrementar el potencial terapéutico de las thyTreg dotándolas de especificidad antigénica mediante receptores de antígeno quimérico (CAR).Para el primer objetivo, a los timocitos humanos CD25 negativos (CD25neg) se les indujo la expresión de un FOXP3 ectópico y/o fueron tratados con TGF-β1 e IL-2, estrategias que previamente demostraron una alta eficacia induciendo Treg desde células otras T CD4+ de sangre periférica. A pesar de que estos elementos consiguieron inducir una alta expresión de los marcadores asociados con las thyTreg, el fenotipo transitorio, la heterogénea funcionalidad y la inestabilidad celular resultantes hacen en que, hasta ahora, no se puedan considerar a los timocitos CD25neg como una fuente alternativa de thyTreg. Por otro lado, para lograr el segundo objetivo, se modificaron genéticamente las thyTreg con tres CAR universales basados en una estreptavidina monomérica (UniCAR-mSA2). Los resultados mostraron que la diferente combinación de los dominios de co-estimulación de cada UniCAR modulaban diferentes perfiles de activación y funcionalidad en las thyTreg. Así, las thyTreg-UniCAR41BB redujeron específica y eficazmente la viabilidad, proliferación y estado de activación de las células diana. Además, también mostraron un efecto indirecto inhibiendo la proliferación y el estado de activación de las células no diana, pero sin afectar a su viabilidad. Por lo tanto, hemos generado células con una gran especificad de antígeno y con un elevado potencial inmunosupresor. De confirmarse su eficacia en modelos in vivo, las thyTreg-UniCAR41BB podrían suponer un versátil abordaje terapéutico frente a las enfermedades inflamatorias o autoinmunes, y para evitar el rechazo de órganos trasplantados.Regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of CD4+ T cells whose ability is to inhibit the immune response and regulate the homeostasis. Due to these properties, their relevance as a possible treatment against autoimmune diseases or transplant rejection has been raised. Currently, the strategies have used peripheral blood as a source of Treg. Nevertheless, those Treg have shown a limited efficacy because of its low quantity and/or its differentiated phenotype., Using a novel obtaining and expansion protocol developed by our group, a more undifferentiated cell product with a great immunosuppressive capacity is achieved from the thymus: the thyTreg. Based on these extraordinary thyTreg, the aims of this study were: (I) Induce cells with identical properties of thyTreg from their precursors: the thymocytes. (II) Increase their therapeutic potential by providing them with antigenic specificity through chimeric antigen receptors (CAR).To reach the first objective, CD25 negative (CD25neg) human thymocytes were induced to express an ectopic FOXP3 and /or were treated with TGF-β1 and IL-2. Those strategies have previously shown high efficiency inducing Treg from peripheral conventional T cells. These elements managed to induce a high expression of thyTreg-associated markers in CD25neg thymocytes. However, the transient phenotype, the heterogeneous functionality and the cellular instability conclude that CD25neg thymocytes are not considered as an alternative source of thyTreg. On the other hand, to achieve the second aim, thyTreg were genetically modified with three universal CARs based on a monomeric streptavidin (UniCAR-mSA2). The results showed that the different combination of co-stimulation domains of each UniCAR modulates different activation and functionality profiles in thyTreg. Thus, thyTreg-UniCAR41BB specifically and efficiently reduced the viability, proliferation and cellular activation of the target cells. Furthermore, they also showed an indirect effect by inhibiting the proliferation and activation of non-target cells, without affecting to their viability. Therefore, we have generated cells with great immunosuppressive potential and with an extraordinary antigen specificity. If their efficacy was confirmed, the thyTreg-UniCAR41BB could represent a versatile therapeutic approach in inflammatory or autoimmune diseases, and prevent the rejection of transplanted organs.