Vitrificación de espermatozoides caninos : aplicación en el lobo ibérico (Canis lupus signatus)

Abstract

La aparición de nuevos recursos aplicados a las técnicas de reproducción asistida, y su creciente aplicación para la conservación de especies amenazadas es el origen de la presente tesis doctoral. Así, el objetivo fue profundizar en la fisiología reproductiva del lobo ibérico (Canis lupus signatus) así como optimizar los procesos de criopreservación de los espermatozoides en esta especie en condiciones de campo, con metodología fácil, aplicable y repetible con el fin de ampliar los bancos de recursos zoogenéticos disponibles para la preservación de esta especie. En el primer artículo se comparó la congelación convencional, con diluyentes basados en yema de huevo, glicerol y rampa de congelación lenta, con la vitrificación, empleando el mismo diluyente con yema de huevo pero sin glicerol, y con 250 mM de sucrosa como crioprotector no penetrante. Se evaluaron los cambios producidos por los distintos métodos de criopreservación en los parámetros morfométricos de la cabeza del espermatozoide y en las distintas subpoblaciones morfométricas del eyaculado canino. La congelación convencional produjo una disminución de las dimensiones de la cabeza en la mitad de las subpoblaciones definidas, mientras que la vitrificación determinó un incremento del área de la cabeza del espermatozoide. Asimismo, se realizó una evaluación con microscopia electrónica de transmisión y barrido para describir y evaluar las lesiones ultraestructurales aparecidas en los diferentes compartimentos del espermatozoide y su relación con los distintos procesos de criopreservación. Se observó vacuolización de mitocondrias con ambos métodos y vesiculización de la membrana plasmática y desplazamiento lateral de los microtúbulos con mayor frecuencia en los espermatozoides vitrificados. Dichos hallazgos sugieren que la vitrificación previene la formación de cristales de hielo en el interior de la cabeza, debido a su alto contenido en macromoléculas solubles, pero no en otras regiones espermáticas...

The development of new resources applied to assisted reproduction techniques, and their increasing application for the conservation of threatened species is the origin of this PhD thesis. Thus, the purpose was to deepen the reproductive physiology of the Iberian wolf (Canis lupus signatus) as well as to optimize the cryopreservation processes of spermatozoa in this species under field conditions, with an easy, applicable and repeatable methodology in order to expand the genetic resources banks available for the preservation of this species.In the first chapter, a conventional freezing procedure using diluents based on egg yolk, glycerol and slow freezing ramp, was compared with the vitrification method based on the same diluent but using 250 mM sucrose as a non-penetrating cryoprotectant instead of glycerol. We investigated the effect of these cryopreservation methods on sperm head morphometric variables and subpopulations of the canine ejaculate. A decrease in head dimensions was observed in half of the subpopulations with conventional freezing and, conversely, an increase of the sperm head area after vitrification was noted. Likewise, an evaluation with transmission and scanning electron microscopy was carried out to describe the ultrastructural lesions in the different compartments of the canine spermatozoa. Both cryopreservation methods produced vacuolization of mitochondria. Vesiculization of the plasma membrane and lateral displacement of microtubules were more frequently observed in vitrified spermatozoa. These findings suggest that vitrification prevents the formation of ice crystals inside the head due to its high content of soluble macromolecules, but not in other cellular regions...