Nuevos antimicrobianos dirigidos frente a la DNA Topisomerasa I de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Mycobacterium tuberculosis es el agente causal de la tuberculosis, un problema sanitario global. Lacreciente incidencia de cepas multirresistentes requiere el descubrimiento de nuevosantimicrobianos, idealmente dirigidos a nuevas dianas. El nivel de superenrollamiento del DNA esun parámetro esencial en las bacterias, puesto que regula la replicación y la transcripción. LasDNA topoisomerasas mantienen el nivel de superenrollamiento. Estas enzimas introducen unarotura doble (enzimas de tipo II) o sencilla (enzimas de tipo I) y pasan la doble hebra, o hebrasencilla a través de la rotura inicial. Previamente, habíamos establecido la enzima TopoI comonueva diana en Streptococcus pneumoniae y descrito 2 alcaloides derivados de la boldina,seconeolitsina (SCN) y N-metil-seconeolitsina (N-SCN), que inhiben la enzima y el crecimiento deesta bacteria a concentraciones equivalentes (~10 M), sin afectar la viabilidad de células humanas(García et al., 2011, J. Biol Chem 286:6402). M. tuberculosis tiene dos topoisomerasas, una de tipoII (girasa), que es diana de las fluoroquinolonas y una de tipo I, TopoI.En este estudio hemos investigado la actividad de SCN y N-SCN frente a M. tuberculosis. Amboscompuestos inhibieron el crecimiento de la bacteria entre 1,95 y 15,6 M, dependiendo de la cepa.Dicha inhibición se correlacionó en M. smegmatis con la cantidad de Topo I en la célula,demostrando que esta enzima es la diana de los alcaloides en micobacterias. Se clonó el gen quecodifica la TopoI de M. tuberculosis en el plásmido pQE1 de Escherichia coli, se expresó con unacola de 6-His en el extremo N-terminal y se purificó mediante cromatografía de afinidad. Se analizóla inhibición por SCN y N-SCN de la actividad in vitro de MtbTopoI utilizando un ensayo derelajación de plásmido. Ambos compuestos inhibieron la actividad enzimática un 50% aconcentraciones de 5.6 (SCN) y 8.4 M (N-SCN). Otros inhibidores de MtbTopoI (amsacrina,imipramina y norclomipramina) producen la acumulación de complejos covalentes enzima–DNAque son letales. Sin embargo, SCN y N-SCN inhiben directamente la actividad de la TopoI. Sedemostró que SCN inhibió la rotura de cadena sencilla. Se evaluaron in vivo los efectos en el nivelde superenrollamiento de plásmidos replicativos de M. tuberculosis. Las densidades desuperenrollamiento fueron de −0.060 en células no tratadas o tratadas con boldina, y −0.072 a 1 xMIC en células tratadas con N-SCN. Esto indica que el plásmido tiene incrementado susuperenrollamiento negativo en presencia de N-SCN. En conjunto, estos resultados demuestranque la Topo I de M. tuberculosis es una diana adecuada y que SCN y N-SCN son compuestosprometedores para el desarrollo de nuevos antimicrobianos.