Optimización de ensayos de recrudescencia de malaria: Comparación de qPCR y citometría de flujo en ratones NSG humanizados

Abstract

La malaria es una de las enfermedades más prevalentes y mortales del mundo, y es causada por protozoos del género Plasmodium, siendo Plasmodium falciparum el responsable de su forma más grave. Aunque existen numerosos tratamientos, las resistencias amenazan su eficacia, generando la necesidad de desarrollar nuevos medicamentos. Un desafío significativo en su tratamiento es la recrudescencia, donde el parásito reaparece en la sangre varios días después de su eliminación inicial, debiendo considerarse en los ensayos in vivo de nuevos medicamentos. Esto generalmente implica cuatro días de tratamiento, seguidos por un mínimo de 28 días de observación, con muestreos periódicos de sangre para detectar al parásito mediante citometría de flujo (FACS). Este estudio buscó optimizar estos ensayos evaluando si la PCR cuantitativa (qPCR) puede detectar la recrudescencia antes que la citometría de flujo. Esto podría refinar el modelo animal al reducir la frecuencia de muestreo y permitir una intervención más temprana. Además, optimizaría los recursos al reducir la duración del mantenimiento de los ratones cuando el tratamiento provoca recrudescencia. Se utilizó un modelo de ratón humanizado en ratones NSG (NOD scid gamma), que fueron transfundidos con sangre humana e infectados con P. falciparum. Posteriormente, se administraron dosis subterapéuticas de medicamentos antimaláricos (dihidroartemisina, atovacuona, mefloquina, cloroquina y DSM265). Durante 28 días, se extrajo periódicamente sangre para su análisis con qPCR y FACS. Las muestras biológicas humanas se obtuvieron de manera ética, y su uso en la investigación se llevó a cabo conforme a los términos de los consentimientos informados bajo un protocolo aprobado por un IRB/EC. Todos los estudios con animales fueron revisados éticamente y realizados de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/EEC y la Política de GSK sobre el Cuidado, Bienestar y Tratamiento de Animales. El criterio para recrudescencia con FACS es claro: detección de parásitos tras un período negativo. Sin embargo, el ADN parasitario fue detectado por qPCR por al menos 31 días después de la infección (probablemente por parásitos muertos), necesitándose otro criterio para la qPCR. Una opción podría ser un aumento en la detección respecto al tiempo anterior. Sin embargo, hubo cuatro aumentos ocasionales que no resultaron en recrudescencia. La causa de esto es desconocida, requiriéndose investigación adicional. Considerando estos casos, un criterio adecuado podría ser un aumento de más del 100% o dos aumentos consecutivos. Con este enfoque, ninguna técnica detecta recrudescencias antes que la otra, por lo que la selección debería basarse en otros factores. FACS es un método más rápido y requiere menos muestra. Por otro lado, la qPCR es más accesible y fácil de automatizar. Además, existen técnicas de qPCR que amplifican exclusivamente ADN de células vivas. Este enfoque podría ser prometedor para la detección temprana de la recrudescencia.Malaria is one of the most prevalent and deadly infectious diseases in the world, caused by protozoa of the genus Plasmodium, with Plasmodium falciparum being responsible for the most severe form of the disease. Although numerous treatments exist, resistance threatens their efficacy, highlighting the need for new drug development. A significant challenge in the treatment is recrudescence, where the parasite reappears in the bloodstream several days after initial clearance. This must be considered in in vivo trials for new drugs, which typically involve four days of treatment followed by a minimum of 28 days of observation, with periodic blood sampling to detect the parasite using flow cytometry (FACS). This study aimed to optimize recrudescence assays by evaluating whether quantitative PCR (qPCR) could detect recrudescence earlier than flow cytometry. This could refine the animal model by reducing the frequency of blood sampling and allowing an earlier intervention. Furthermore, it would optimize resources by reducing the duration of mouse maintenance when the treatment causes recrudescence. A humanized mouse model using NSG mice (NOD scid gamma) was employed, transfused with human blood and infected with P. falciparum. Afterwards, they were administered subtherapeutic doses of antimalarial drugs (dihydroartemisinin, atovaquone, mefloquine, chloroquine and DSM265). During a 28-day period, periodic blood extractions were performed for analysis using qPCR and FACS. The human biological samples were sourced ethically, and their research use was in accord with the terms of the informed consents under an IRB/EC approved protocol. All animal studies were ethically reviewed and carried out in accordance with the European Directive 2010/63/EEC and the GSK Policy on the Care, Welfare and Treatment of Animals. The criterion for recrudescence with FACS is clear: parasite detection after a negative period. However, parasite DNA was detected by qPCR for at least 31 days post-infection (probably due to dead parasites), therefore another criterion is needed for qPCR. One possible option could be an increase in DNA detection compared to the previous time. However, there were four occasional increases that did not result in recrudescence. The cause of these increases is unknown, necessitating further investigation. Considering these cases, an appropriate criterion could be an increase of more than 100% or two consecutive increases. With this approach, neither technique detects recrudescences earlier than the other. Therefore, the selection of the technique should be based on other factors. FACS is a faster method and requires a smaller sample volume. On the other hand, qPCR is more accessible and easier to automate. Additionally, there are qPCR techniques that exclusively amplify DNA from live cells. This approach could be a highly promising option for the early detection of recrudescence.