Terapia génica ex vivo para hemofilia B mediante vectores no virales y células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano

Abstract

Introducción. El tratamiento actual de la hemofilia tan solo es paliativo y no curativo, con un elevado porcentaje de pacientes que desarrollan anticuerpos, que hacen del todo ineficaz el tratamiento. La terapia génica no viral asociada a células madre podría ser representar una alternativa curativa de la enfermedad. Objetivos. Establecer un protocolo de terapia génica ex vivo no viral para hemofilia B utilizando células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ASCs). Métodos. Las ASCs se aislaron a partir de lipoaspirados humanos. Se evaluaron varios sistemas de transfección: liposomas de DOTAP, polímeros de PEI, PAMAM y EPA, ICAFectin™441, nanopartículas magnéticas (MATra-A) y nucleofección. Las ASCs se transfectaron eficazmente mediante nucleofección con un plásmido con el gen de la EGFP y el gen del factor IX humano (FIX). Se analizó la expresión de FIX y su secreción in vitro. En los estudios in vivo en ratones inmunodeficientes, se indujo un daño hepático agudo antes de la administración intravenosa de las ASCs transfectadas, para asegurar el anidamiento celular. Resultados. Se obtuvieron poblaciones homogéneas de ASCs. La nucleofección representó el método de transfección no viral más eficaz y reproducible. El FIX se expresó en las ASCs y fue secretado al medio de cultivo. In vivo, se demostró el daño hepático y el anidamiento de las células EGFP-FIX positivas en pulmón, hígado, bazo y riñón, y se observó expresión de la proteína del FIX humano en plasma durante los 5 días estudiados. Conclusiones. Se ha optimizado un método reproducible de obtención de ASCs humanas a partir de lipoaspirados. Las ASCs se han logrado transfectar mediante nucleofección, obteniendo expresión y secreción de factor IX humano tanto en los medios de cultivo celular, como en el plasma de los ratones tratados con las células transfectadas.

Introduction. The current treatment for haemophilia, although safe and efficient, is only palliative and not curative, with many patients developing antibodies that render treatment inefficient. Stem cell-mediated gene therapy with non-viral vectors would represent an alternative to cure this disease. Objectives. The aim of this study was to establish a non-viral ex vivo gene therapy protocol for haemophilia B using adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs). Methods. ASCs were isolated from human lipoaspirates. Several transfection strategies were evaluated: a lipid-based system (DOTAP), cationic polymers including polyethilenimine (PEI), polyamidoamine (PAMAM) and N-ethyl pyrrolidine methacrylamide (EPA), a commercial transfection reagent (ICAFectin™ 441), magnetic nanoparticles (MATra-A) and nucleofection. ASCs were efficiently transfected by nucleofection with a plasmid encoding an enhanced green fluorescent protein (EGFP) and human factor IX (FIX). In vitro human FIX expression and secretion were analyzed. Subsequently, in vivo studies were performed in immunodeficient mice (NSG) with acute liver injury induced by acetaminophen overdose before intravenous injection of nucleofected ASCs to achieve cell engraftment. Results. Homogeneous populations of ASCs were obtained from human lipoaspirates. Nucleofection was the method of choice for transfection of this cell type. Both in vitro and in vivo, FIX was efficiently expressed in nucleofected ASCs and was secreted to the cell culture media. In vivo, EGFP positive cells expressing FIX were detected in lung, liver, spleen and kidney of NSG mice after cell transplantation and FIX protein levels were sustained in mouse plasma for at least 5 days. Conclusions. A reproducible and convenient method was optimized to obtain specifically characterized adipose-derived mesenchymal stem cells from human lipoaspirates. ASCs were efficiently transfected by nucleofection to produce and secrete coagulation factor IX both in vitro and in vivo, since it was detected in several treated mice tissues and plasma.