Diseño de herramientas bioquímicas para la ingeniería molecular de derivados inmovilizados de Renina y Beta-Galactosidasa

Abstract

En esta tesis se han abordado los problemas relacionados con la preparación de derivados de renina y lactasa que pudieran ser útiles como catalizadores en tecnología de la leche. Es decir, derivados donde todas las enzimas estén muy fuertemente unidos al soporte para que no se produzca liberación de las enzimas ni de sus subunidades en el alimento, derivados de la renina muy activos frente a un substrato macromolecular como la k-caseina y derivados de diferentes -galactosidasas (glicosiladas, dimericas, tetramericas) muy activos y altamente estabilizados. Se desarrollaron nuevos métodos bioquímico físicos de modificación de proteínas vía fase sólida. Es decir, modificaciones para modular la actividad y estabilidad de la enzima íntimamente asociados a su proceso de inmovilización: modificaciones de las enzimas durante y después de la inmovilización e incluso modificaciones previas pero siempre dirigidas a optimizar la inmovilización y la modificación posterior. Los resultados más significativos son los siguientes: i.- la utilización de soportes que promovían pocos impedimentos estéricos y la inmovilización de la renina a través de sus cadenas glicosiladas como brazos espaciadores pudimos obtener derivados inmovilizados que conservaban el 33% de su actividad caseinolítica, ii.- la combinación de un proceso de animación controlada de la -galactosidasa de aspergillus y el diseño de procesos de unión multipuntual y entrecruzamiento con cadenas glicosiladas nos permite estabilizaciones de 1000 veces con respecto a la enzima aminada y de más de 20 veces con respecto a la enzima nativa y iii.- la estabilización conjunta de estructura cuaternaria y estructura terciaria que hemos logrado por inmovilización multipuntual de la -galactosidasa de kluyveromices fragilis sobre geles de agarosa nos permitió preparar derivados mas de 1000 veces mas estables que la enzima nativa