Design and biomedical applications of functionalized biomaterials based on bacterial polyesters.

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Universidad Comlputense de Madrid
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In this PhD Thesis we obtained added-value PHA using two strategies: i) in vivo bacterial production of functionalized nano-beads; ii) production of functionalized biopolyester. Using BioF system, based on N-terminal of Pseudomonas putida KT2442 PhaF phasin that binds granule and serves as affinity tag to anchor proteins to a biodegradable support, we immobilized recombinant proteins to PHA granule. To optimize the yield of protein fused to the granule, we studied the process of tag-granule binding and physiological functions of PhaF and PhaI phasins, determining their coordinated functioning in the granule segregation during cell division and their uniform distribution. Two different functions of PhaF C- and N-terminal domains were identified (C-terminal binds DNA and has function similar to histon-like proteins, while N-terminal is responsible for granule binding). Furthermore, optimal conditions for production of recombinant protein fused with BioF were determined. Therefore, it was concluded that the simultaneous production of low dosage of PhaF phasin and PhaI or BioF is crucial to obtain the best recombinant protein yield. In addition, we determined new properties of PHACOS, PHA obtained by fermentation that contains tioester grups in side chain. We demonstrated its antimicrobial activity specifically against Staphylococcus aureus strain, including MRSA clinical isolates. Decrease in S. aureus biofilm formation was observed on PHACOS when compared with PHO. Using fluorescent dye (H-ICG) we demonstrated both PHO y PHACOS biocompatibility and antimicrobial activity of PHACOS in vivo in BALB/c mice. This result indicates the suitability of PHACOS for biomedical applications.
En esta Tesis Doctoral mediante dos estrategias se obtuvo PHA con valor añadido: i) producción bacteriana de nano-partículas funcionalizadas in vivo; ii) síntesis del polímero funcionalizado. Mediante el uso de sistema BioF, basado en la N-terminal de fasina PhaF de Pseudomonas putida KT2442 que se une al gránulo y sirve como etiqueta de afinidad para anclar proteínas recombinantes, se inmovilizaron proteínas recombinantes al gránulo de PHA. Para obtención de mejor rendimiento de la proteína fusionada al gránulo de PHA, se estudio el proceso de unión de la etiqueta al gránulo y las funciones fisiológicas de las fasinas PhaF y PhaI, determinándose su función coordinada en la segregación de los gránulos durante la división celular y su uniforme distribución. Se identificaron dos funciones diferentes de los dominios C- y N-terminal de la fasina PhaF (C-terminal se une a ADN y realiza una función parecida a la de “histon-like” proteínas, mientras N-terminal es responsable de unión al gránulo). Se determinaron las condiciones óptimas para la producción de proteína recombinante fusionada al BioF y los factores imprescindibles para la formación de gránulos y síntesis de biomasa. Se ha concluido que la baja producción de la fasina PhaF junto con PhaI o BioF es crucial para obtención de mejor rendimiento de proteína recombinante. Además, se determinaron nuevas propiedades de PHACOS, PHA obtenido por fermentación que contienen grupos tioéster en la cadena lateral. Se demonstró su actividad antimicrobiana tanto frente la cepa tipo Staphylococcus aureus como las MRSA cepas de S. aureus. Se demonstró la disminución de la formación de biopeliculas de S. aureus en PHACOS comparado con PHO. Mediante el uso de una sonda fluorescente (H-ICG), se demostró tanto la biocompatibilidad de PHO y PHACOS como la actividad antimicrobiana de PHACOS in vivo en BALB/c ratones. Este resultado indica la posibilidad de uso de PHACOS para aplicaciones biomédicas.
Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, leída el 24/09/2013