DEVELOPMENT OF A LENTIVIRAL TRANSDUCTION TOOL FOR THE STUDY OF miR-28 THERAPEUTIC POTENTIAL IN DIFFUSE LARGE B CELL LYMPHOMA

Abstract

- Fundamentals R-CHOP is the standard therapeutic regimen for aggressive B-cell lymphomas, which include DLBCL. However, aside from being highly toxic, a fraction of patients -about 40% with DLBCL- are refractory or relapse after treatment with this scheme, making the development of alternative therapies a necessity. Potential approaches include the administration of tumor-suppressor miRNAs, such as miR-28, in combination with targetedtherapies, among which is the BTK inhibitor ibrutinib. As the study of miR-28-ibrutinib therapeutic suitability involves preclinical testing in PDX models, we sought to develop an efficient PDX miR-28 transduction tool. - Material and methods pCDH plasmid was modified to encode for the pre-miR-28 sequence. High titer lentiviral supernatants were used to transduce the MD901 and SUDHL4 ABC-DLBCL cell lines as well as the U2932 GC-DLBCL cell line in the presence or absence of ibrutinib to subsequently perform miR-28 antitumoral and miR-28-ibrutinib synergy assays. - Results The pCDH plasmid allows the generation of high titer lentiviral supernatants which efficiently transduce DLBCL cell lines. However, pCDH-miR-28 reexpression does not reproduce previous MD901 miR-28-ibrutib synergy results from the laboratory obtained after inducible lentiviral transduction of miR-28, as pCDH-transduced miR-28 reexpression only slightly potentiates ibrutinib effect in preventing MD901 cell growth and does not exert any effect of synergy with ibrutinib in SUDLH4 and U2932 cell growth impairment. 5 - Conclusions Results from this work discard pCDH as a suitable vector for miR-28 reexpression in DLBCL therapeutic assays and raise the need to develop new strategies for this purpose. Keywords: B cell lymphoma, chemotherapy, ibrutinib, microRNAs, plasmids 6 RESUMEN - Fundamentos R-CHOP es el régimen terapéutico estándar de los linfomas B agresivos, incluyendo DLBCL. Sin embargo, además de acarrear elevada toxicidad, una fracción de pacientes -el 40% en DLBCL- son refractarios o recaen tras este tratamiento, siendo necesario desarrollar alternativas terapéuticas más eficaces y seguras. Entre los potenciales candidatos destacan los miRNAs oncosupresores, como miR-28, administrados en combinación con terapias dirigidas, como el inhibidor de BTK ibrutinib. Dado que el estudio de la idoneidad terapéutica de ibrutinib-miR-28 implica ensayos preclínicos en modelos PDX, hemos buscado desarrollar una herramienta de transducción eficiente de miR-28 para PDX. - Material y métodos Se introdujo la secuencia pre-miR-28 en el plásmido pCDH. Los sobrenadantes lentivirales de alto título se emplearon para transducir las líneas celulares de ABC-DLBCL MD901 y SUDHL4 y la línea de GC-DLBCL U2932 en presencia o ausencia de ibrutinib para posteriormente realizar experimentos de actividad antitumoral y sinergia. - Resultados El plásmido pCDH permite la generación de sobrenadantes lentivirales de alto título que transducen con eficiencia líneas celulares de DLBCL. Sin embargo, los resultados de sinergia con ibrutinib obtenidos previamente tras la transducción lentiviral inducible de miR- 28 no se reproducen con pCDH. La reexpresión de miR-28 mediada por pCDH potencia ligeramente la prevención de proliferación celular de ibrutinib en MD901, pero no sinergiza con ibrutinib en la limitación de la proliferación en SUDHL4 o U2932. 7 - Conclusiones Estos resultados descartan la utilización de pCDH como vector de reexpresión de miR- 28 en ensayos de actividad terapéutica en DLBCL, siendo preciso desarrollar nuevas estrategias para este propósito. Palabras clave: linfomas B, quimioterapia, ibrutinib, microRNAs, plásmidos 8 Abbreviation list from the abstract: - R-CHOP: rituximab, cychophosphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone - DLBCL: diffuse large B cell lymphoma - miRNAs: microRNAs - BTK: Bruton’s tyrosine kinase - PDX: patient-derived xenografts Lista de abreviaturas del resumen: - R-CHOP: rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona - DLBCL: linfoma B difuso de célula grande - miRNAs: microRNAs - BTK: tirosina quinasa de Bruton - PDX: xenografts derivados de pacientes