Análisis de la capacidad de autorrenovación y de diferenciación de esferoides derivados del cultivo de células del tejido

Abstract

FUNDAMENTO: el cultivo de células del tejido cortical ovárico de la especie ovina, en un medio definido, permite la obtención de esferoides con características estructurales, ultraestructurales y moleculares correspondientes a neuroesferas. OBJETIVOS: el primer objetivo fue demostrar la capacidad de autorrenovación de los esferoides derivados del cultivo de células del tejido cortical ovárico de la especie ovina mediante la evaluación de la actividad proliferativa y de la formación de esferoides secundarios con identidad molecular similar durante el proceso de expansión. El segundo objetivo fue demostrar la capacidad de diferenciación de las células integrantes de los esferoides secundarios para generar células que expresasen antígenos específicos de células neurales, para confirmar la identidad de los esferoides como neuroesferas. METODOLOGIA: se establecieron cultivos de células del tejido cortical ovárico de hembra ovina prepúber, en un sistema secuencial en dos periodos. En el primero (expansión), las células se cultivaron en dos etapas sucesivas de 8 días de duración cada una, en presencia de uno de estos 3 medios definidos: M1 (medio testigo de expansión con EGF y FGF2), M2 (medio definido sin EGF, FGF2, o FSH como aditivos) y M3 (medio definido sin EGF, FGF2, pero con FSH). Al finalizar la primera etapa de expansión, los esferoides generados en cultivo (esferoides primarios) se disgregaron enzimáticamente y se subcultivaron a la misma densidad inicial, para iniciar una segunda etapa de expansión. Durante la primera etapa de expansión se evaluó la actividad proliferativa celular, en la segunda etapa la capacidad para generar nuevos esferoides y al finalizar cada una de las dos, se analizó la expresión de tránscritos característicos de pluripotencialidad (SOX2, OCT4 y Nanog), de CTN/CPN (Nestina, Pax6, p75 NTR) y de diferenciación neural (DCX, GFAP, Olig4), por RT-PCR cuantitativa. En el periodo de diferenciación, las células de los esferoides secundarios se cultivaron durante 18 días en medio de cultivo con 2% de suero y antagonistas de EGF y FGF2 durante los 8 últimos días. Al finalizar este periodo se localizaron los antígenos característicos de astrocitos (GFAP), de precursores neuronales y neuronas inmaduras (DCX) y de CPN/glía radial (Pax6) mediante inmunofluorescencia. CONCLUSIONES: los resultados demostraron la actividad proliferativa celular durante el primer periodo de expansión, con niveles máximos en el grupo M1. La formación de esferoides primarios y secundarios fue un hecho consistente que, unido a la similitud en los perfiles de expresión génica entre los mismos, permite confirmar la capacidad de autorrenovación celular. En las condiciones descritas, las células de los esferoides secundarios diferencian a células que expresan antígenos característicos de células nerviosas, por lo que podemos concluir que los esferoides son neuroesferas.