Aplicación del ensayo neuroesfera a la producción de neuronas dopaminérgicas y células de la glía a partir de células de la corteza ovárica ovina

Abstract

Las células del tejido cortical ovárico pueden formar neuroesferas (NSF) integradas por células troncales y progenitoras neurales (CTN/CPNs) que pueden diferenciar a distintos tipos de células nerviosas de gran utilidad potencial en medicina regenerativa. El objetivo 1 fue realizar el ensayo NSF con un protocolo de diferenciación dirigida para obtener neuronas dopaminérgicas a partir de las CTN/CPNs derivadas de células del tejido cortical ovárico en un medio definido. El objetivo 2 fue determinar la influencia de la adición de hormona foliculoestimulante (FSH) al medio definido de cultivo en las etapas de expansión celular del ensayo NSF, sobre la proliferación celular y la expresión de tránscritos característicos de CTN/CPNs y de diferenciación neural. Células del tejido cortical ovárico de cordera prepúber se cultivaron en dos etapas sucesivas en condiciones de expansión (7 días/etapa) en medio definido: M1 (con EGF y FGF2), M2 (controlsin EGF, FGF2, ni FSH) y M3 (con FSH). Se realizó un test de proliferación celular al final de cada etapa, análisis morfométrico y de imagen, y análisis de expresión génica o qRT-PCR (Nestina, Pax6, Sox2, p75NTR). Tras la 2ª etapa de expansión se disociaron las NSF y las CTN/CPNs se cultivaron (30 días) con medio de diferenciación dirigida para producir neuronas dopaminérgicas, considerando el medio origen de las células. Se analizó la morfología celular, qRT-PCR (GFAP, Olig2, NeuN y TH), inmunolocalización (NeuN, GFAP, TH) y elregistro electrofisiológico (Patch-clamp). La capacidad de autorrenovación se demostró por la formación de NSF tras disgregación celular al final de la 1ª etapa y el incremento de sus diámetros especialmente durante la 2ª. Tanto el diámetro de las NSF como la proliferación celular en M1 y M3 fue superior (p<0,01) al de M2 en la 1ª etapa. En la 2ª etapa, las células en M1 habían alcanzado la confluencia en el día del ensayo y la proliferación en M3 fue superior a M2 (p<0,01). El análisis de imagen reveló la presencia de células con morfología similar a neuroblastos y neuronas. Durante las etapas de expansión, la expresión de los tránscritos fue superior en M2 respecto a M1 y M3. Durante la diferenciación, la expresión de NeuN y GFAP fue superior en M1 y M3, y la de Olig2 y TH en M1 respecto a M2. NeuN inmunolocalizó positivo en células con aparente morfología neuronal y TH en el core de las NSF. El análisis electrofisiológico reveló 3 patrones de respuestas a los estímulos predominando el potencial en meseta. En conclusión, CTN/CPNs del tejido cortical ovárico pueden diferenciar a precursores de neuronas dopaminérgicas en medio de diferenciación dirigida. Además, FSH ejerce acciones proneurogénicas estimulando la proliferación y diferenciación en células de las NSF. Palabras clave: corteza ovárica, neurogénesis, neuroesferas, hormona folículoestimulante, neurona dopaminérgica.